CN102766258A - 一种白藜芦醇的亲水性结合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的亲水性聚合物与白藜芦醇组成的结合物、包含该结合物的药物组合物、以及它们的制备方法和在制备治疗肿瘤、糖尿病和心脑血管疾病药物中的用途。其中，所述的亲水性聚合物选自由聚乙二醇、聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉、聚乙二醇-氨基酸寡肽以及它们的共聚物所组成的组。通过亲水性聚合物的改性可对结合药物提供保护，提高结合物的稳定性和水溶性，延长其在生物体内的活性周期。

Description

一种白藜芦醇的亲水性结合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新型的亲水性聚合物与白藜芦醇的结合物、包含该结合物的药物组合物、以及它们的制备方法和在制备治疗肿瘤、糖尿病和心脑血管疾病药物中的用途。 

背景技术

白藜芦醇(Resveratrol，RES)是一种含有芪类结构的天然非黄酮类多酚化合物，化学名为3，4’，5-三羟基-反式二苯乙烯(3，5，4′-trihydroxystilbene)，于1940年首次从白藜芦(毛叶藜芦Veratrum grandiflorum O.Loes)根中分离获得，此后陆续从其他70多种植物中发现，其中包括葡萄科的葡萄属，豆科的落花生属、决明属，百合科的藜芦属，以及虎杖、越桔等。 

示1白藜芦醇(RES)的化学结构式 

白藜芦醇被称为植物抗毒素(抗菌剂)，具有广泛的有益于健康的生理活性。几十年来大量的研究结果表明，白藜芦醇可以阻止或延缓多种疾病，包括癌症、心血管病、糖尿病和缺血性损伤，同时能提高抗逆性，并延长从酵母菌到脊椎动物的各种生物体的寿命【Baur JA，Sinclair DA.Therapeutic potential of resveratrol：the in vivo evidence.Nat Rev Drug Discov(2006)5：493-506；Bradamante S，et al.Cardiovascular protective effects of resveratrol.Cardiovasc.Drug Rev(2004)22：169-188；Wang Q，et al.Resveratrol protects against globalcerebral ischemic injury in gerbils.Brain Res(2002)958：439-447；Sinha K，et al.Protectiveeffect of resveratrol against oxidative stress in middle cerebral artery occlusion model of stroke inrats.Life Sci(2002)71：655-665；Howitz KT，et al.Small molecule activators of sirtuins extendSaccharomyces cerevisiae lifespan.Nature(2003)425：191-196.】。红葡萄酒的消费直接导致法国的心肌梗死发病率较其他同类国家低40％，白藜芦醇被公认为是红酒对心脏保护作用的主要有效成分【Siemann EH，Creasy LL.Concentration ofthe phytoalexin reseratrol in wine.AmJ Eno Vitic(1992)43：49-52.】。作为一种心脏保护剂，白藜芦醇可通过多种作用达到防止动脉粥样硬化和冠心病的效果，其中包括抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化，抑制血小板 聚集和人主动脉平滑肌细胞的增殖，同时呈剂量依赖关系的促进肿瘤抑制基因P53、热激蛋白质、醌还原酶(QR1和QR2)的表达，并改变一氧化氮合酶和凋亡诱导因子的亚细胞分布【Joseph M W，Hsieh TC.Resveratrol：a cardioprotective substance.Ann N YAcad Sci Issue：Resveratrol and Health(2011)1215：16-21.】。对于糖尿病等代谢性疾病，白藜芦醇亦显示十分有益的预防和治疗作用【Tomasz S，Katarzyna S.Anti-diabetic effects ofresveratrol.Ann N YAcad Sci Issue：Resveratrol and Health(2011)1215：34-39】。白藜芦醇可降低血糖水平，诱导对β细胞的保护，并通过控制肥胖、改变相关基因表达及有关酶的活性而提高胰岛素的活性，同时可降低胰岛素的分泌和血中胰岛素的水平，并有效抑制细胞因子的作用，降低胰腺组织的氧化损伤【Frojdo S，et al.Metabolic effects of resveratrol in mammals-a link betweenimproved insulin action and aging.Curr Aging Sci(2008)1：145-151；Szkudelska K，SzkudelskiT.Resveratrol，obesity and diabetes.EurJPharmacol(2010)635：1-8；Palsamy P，SubramanianS.Resveratrol，a natural phytoalexin，normalizes hyperglycemia in treptozotocinnicotinamideinduced experimental diabetic rats.Biomed Pharmacother(2008)62：598-605；Palsamy P，Subramanian S.Modulatory effects of resveratrol on attenuating the key enzymes activities ofcarbohydrate metabolism in streptozotocin-nicotinamideinduced diabetic rats.Chem Biol Interact(2009)179：356-362；Palsamy P，Subramanian S.Ameliorative potential of resveratrol onproinflammatory cytokines，hyperglycemia mediated oxidative stress，and pancreatic beta-celldysfunction in streptozotocin-nicotinamide-induced diabetic rats.J Cell Physiol(2010)224：423-432；Kennedy A，et al.Conjugated linoleic acid-mediated inflammation and insulin resistancein human adipocytes are attenuated by resveratrol.JLipid Res(2009)50：225-232.】。在治疗肿瘤方面，Jang等在1997年首次报道了白藜芦醇可通过抑制环氧化酶的表达发挥抗肿瘤活性【Jang M，et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol，a natural product derived fromgrapes.Science(1997)275：218-220.】。此后众多的研究结果显示，白藜芦醇是一种具有多靶点特征的天然肿瘤化学预防及治疗剂，可通过调节与肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润及新生血管生成的相关基因实现抗肿瘤作用，对肿瘤癌变的三个阶段均有很强的防治效果，因而可能成为肿瘤预防和治疗非常有前景的候选药物【Thomas S，et al.Chemopreventive effects ofresveratrol and resveratrol derivatives.Ann N Y Acad Sci Issue：Resveratrol and Health(2011)1215：89-95；Subash CG，et al.Chemosensitization oftumors by resveratrol.Ann N YAcad Sci Issue：Resveratrol andHealth(2011)1215：150-160.】。 

然而，白藜芦醇的生理活性存在明显的体内外差异【Gescher AJ，Steward WP.Relationship between mechanisms，bioavailability，and preclinical chemopreventive efficacy ofresveratrol：a conundrum.Cancer Epidemiol Biomark.Prev(2003)12：953-957.】。目前只有少数针对动物体内的抗肿瘤作用研究显示阳性实验结果，而且通常要在给药后15-20周后才可以看出；而白藜芦醇对于人体的抗肿瘤作用，尚未有有说服力的研究报道【Tessitore L，et al.Resveratrol depresses the growth of colorectal aberrant crypt foci by affecting bax and p21CIPexpression.Carcinogenesis(2000)21：1619-1622；Li ZG，Hong T，Shimada Y，et al.Suppressionof nitrosomethylbenzylamine(NMBA)-induced esophageal tumorigenesis in F344rats byresveratrol.Carcinogenesis(2002)23：1531-1536；Banerjee S，et al.Suppression of7，12-dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary carcinogenesis in rats by resveratrol：role ofnuclear factor-κB，cyclooxygenase 2，and matrix metalloprotease 9.Cancer Res(2002)62：4945-4954.】。药代动力学的研究结果提示，白藜芦醇的口服生物利用度不足1％。在可能靶点很难蓄积到发挥药效作用的浓度，很可能是白藜芦醇在人体内以及动物模型上不能起到抗肿瘤效果的一个重要原因，尤其是口服给药【Thomas W.Bioavailability ofresveratrol.AnnNYAcadSciIssue：ResveratrolandHealth(2011)1215：9-15.】。增大剂量和重复给药是增加药物在人体内生物利用度的常规方法，但对于白藜芦醇，剂量增大和多次给药并不能改变这种现象。单剂量口服给予相当于饮用适量红酒量的白藜芦醇(25mg)，在外周血中很难测出白藜芦醇的原形药物，血浆药物浓度在0.5～2h达到最高，但低于10ng/ml；即使将剂量增大到5000mg，血浆中白藜芦醇的峰值浓度也只有约500ng/mL。而重复给药则很可能导致代谢饱和，进而导致血浆和组织白藜芦醇浓度偏离，从而产生不良反应【Boocock DJ，et al.Phase I dose escalation pharmacokinetic study in healthy volunteers of resveratrol.a potentialcancer chemopreventive agent.CancerEpidemiolBiomarkPrev(2007)16：1246-1252；AlmeidaL，et al.Pharmacokinetic and safety profile of trans-resveratrol in a rising multiple-dose study inhealthy volunteers.MolNutr FoodRes(2009)53：S7-S15.】。 

白藜芦醇的低生物利用度与代谢有关。研究表明，白藜芦醇在体内存在严重的首过效应，在肠道和肝脏被快速地广泛代谢。以至无论口服或注射给药，白藜芦醇都无法达到持续有效的血药浓度。这也是白藜芦醇受到科学家和医药企业如此多的关注(目前，PubMed上收集的研究论文已超过4000篇)但尚不能成为治疗药物的主要原因【Baur JA，Sinclair DA. Therapeutic potential of resveratrol：the in vivo evidence.Nat Rev Drug Discov(2006)5：493-506.】。 

和其他天然多酚类化合物相似，白藜芦醇的代谢主要发生在酚羟基上，生成二氢白藜芦醇、白藜芦醇的葡萄糖醛酸和硫酸结合物及其他极性增大的代谢产物，从而导致口服给药不能满足治疗所要求的血药浓度。这一点已经为诸多的动物和人体药代动力学评价所证实【YuC，et al.Human，rat，and mouse metabolism of resveratrol.Pharm Res(2002)19：1907-1914；Miksits M，Maier-Salamon A，et al.Sulfation of resveratrol in human liver：evidence of a majorrole for the sulfotransferases SULT1A1 and SULT1E1.Xenobiotica(2005)35：1101-1119.】。因此，本发明针对白藜芦醇分子结构中的活性代谢位点——酚羟基，以提高代谢稳定性的结构修饰为目标，设计缓慢释放原形药物的注射给药系统，从而保持合适的血药浓度和治疗时间。这将是实现白藜芦醇成为临床治疗药物的重要有效途径【Walle T，et al. Improving metabolicstability of cancer chemopreventive polyphenols.Expert Op Drug Metab Toxicol(2007)3：379-388.】。 

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰即PEG化(pegylation)，是一种将聚乙二醇活化后链接到药物分子或表面的技术。1977年，Abuchowski等首次将甲氧基聚乙二醇(methoxy polyethyleneglycol，mPEG)共价连接到蛋白质上，获得疗效优于未修饰原型药物的mPEG-蛋白质复合物【Abuchowski A， et al.Alteration of immunological properties ofbovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol.J Biol Chem(1977)252(11)：3578-3581.】。此后，PEG修饰技术逐渐受到重视，目前已成为药物化学修饰的研究热点【Inada Y，et al.Biomedical and biotechnological applications of PEG2and PM2modifiedproteins.TrendsBiotechnol(1995)13(3)：86-91.】。对于小分子药物，PEG在修饰时可以将它的许多优良性质赋予所形成的复合物，如提高被修饰药物的水溶性，增加生物相容性，改善组织分布，降低毒性作用，延长循环半衰期和增强疗效等，这使得许多疗效显著但由于其疏水性和毒性大等缺陷而限制临床应用的小分子药物有了新的发展前景。PEG本身水溶性极好，在很多制剂中作为助溶剂使用，利用PEG作为载体修饰药物，通常可在解决药物水溶性的同时提高生物利用度。此外，小分子药物与PEG的连接方式使药物能够缓慢释放或者需在一定的pH或酶存在的条件下才能释放，具有很好的缓释控释作用，因此可以改善药物分子的体内药代动力学性质，使血药浓度维持或接近目标浓度的时间延长，保持药效的充分发挥【Zhang J，etal.Synthesis of poly(ethylene glycol)-metaxalone conjugates and study of its controlled release in vitro.Int JPharm(2007)332(1-2)：125-131；Choi HK，et al.In vitro and invivo study of poly(ethylene glycol)conjugated ketoprofen to extend the duration of action.Int JPharm(2007)341(1-2)：50-57；Zhao YJ，et al.Poly(ethylene glycol)prodrug for anthracyclinesvia N-Mannich base linker：design，synthesis and biological evaluation.Int J Pharm(2009)379(1)：90-99.】。 

PEG化技术已经广泛应用于多肽和蛋白质药物的修饰，以改善其药理学和药代动力学性质。第一种经PEG修饰的蛋白质类药物PEG-腺苷脱氨酶于1997年获FDA批准上市，用于治疗严重的儿童免疫缺陷症；2001年，聚乙二醇修饰的干扰素PEG-INTRON获FDA批准上市，用于治疗慢性丙型肝炎。PEG化技术在医药领域的应用，仅在美国就创造了近60亿美元新药的销售额，带动了一个新型制剂领域的蓬勃发展。随着大量聚乙二醇新型衍生物的不断研制成功，PEG化技术不仅可以用于蛋白质、多肽等大分子药物性质的改良，也逐渐被人们用于小分子的增溶减毒以及提高疗效作用方面。 

发明内容

本发明提供了亲水性聚合物与白藜芦醇的结合物。其中，所述的亲水性聚合物选自由聚乙二醇、聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉、聚乙二醇-氨基酸寡肽以及它们的共聚物所组成的组。 

按照本发明的一个方面，所提供的亲水性聚合物-白藜芦醇结合物具有以下通式： 

其中： 

P为亲水性聚合物，所述的亲水性聚合物选自由聚乙二醇、聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉以及它们的共聚物所组成的组； 

L为连接基团，与白藜芦醇的羟基连接，所述的连接基团L选自但不限于：O(CH₂)_kCO、O(CH₂)_kOCO、O(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kOCO、NR(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kCO，k为0～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基； 

n是1-3的整数，最大不超过RES上的羟基总数； 

RES为白藜芦醇。 

优选地，用以下通式表示亲水性聚合物聚乙二醇-白藜芦醇的结合物： 

P′代表H或M，但不同时为H； 

M代表以下结构： 

其中： 

R₁是一个中心分子，含有多个活性基团，通过这些基团衍生出的线性聚乙二醇最终形成多叉分支的聚乙二醇，R₁可以是多羟基分子、多氨基分子、多羧基分子； 

R₁可以是一个多羟基分子，与线性聚乙二醇通过醚键连接； 

R₁也可以是一个多氨基分子，与线性聚乙二醇通过氨基，酰胺基连接； 

R₁也可以是一个多羧基分子，与线性聚乙二醇通过酯基，酰胺基连接。 

m为任何整数，表征其聚合度，选自3～2000 

L是连接基团，连接多叉分支的聚乙二醇的端基与白藜芦醇的羟基，选自于但不限于： 

O(CH₂)_kCO、O(CH₂)_kOCO、O(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kOCO、NR(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kCO， 

k为0～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基。 

更具体地，用以下结构式表示聚乙二醇与白藜芦醇的结合物： 

其中： 

P″为H或者以下结构，但不同时为H； 

所用聚乙二醇分子量为5000、10000。 

按照本发明的另一个方面，提供了以通式(II)表示的亲水性聚合物——多羧基寡肽-白藜芦醇结合物： 

其中： 

P是亲水性聚合物，所述的亲水性聚合物选自由聚乙二醇、聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉以及它们的共聚物所组成的组； 

m是2～12的整数； 

j为1～6的整数； 

R_i为选自于以下组中的基团：H、C_1-12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基、和取代烷基； 

X是连接基团，所述的连接基团X是(CH₂)_k、(CH₂)_kOCO、(CH₂)_kNHCO、或(CH₂)_kCO，而k是0～10的整数； 

Z是连接基团，所述的连接基团Z是O、O(CH₂)_hCOO、或NH(CHR)_hCOO，而h是1～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基； 

RES为白藜芦醇。 

优选地，用以下这个通式表示亲水性聚合物聚乙二醇-氨基酸寡肽和白藜芦醇的聚合物： 

其中： 

R₁是一个中心分子，含有多个活性基团，通过这些基团衍生出的线性聚乙二醇最终形成多叉分支的聚乙二醇，R₁可以是多羟基分子、多氨基分子、多羧基分子； 

R₁可以是一个多羟基分子，与线性聚乙二醇通过醚键连接； 

R₁也可以是一个多氨基分子，与线性聚乙二醇通过氨基，酰胺基连接； 

R₁也可以是一个多羧基分子，与线性聚乙二醇通过酯基，酰胺基连接。 

m为任何整数，表征其聚合度，选自3～2000 

f是0～12中的一个整数； 

i是1～30中的一个整数，表征分叉数； 

j为1～6的整数； 

R₂为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基； 

X是连接基团，连接多叉分支的聚乙二醇的端基与氨基酸寡肽的氨基，选自于但不限于：O(CH₂)_kCO、O(CH₂)_kOCO、O(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kOCO、NR(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kCO，k为0～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基； 

Z是连接基团，所述的连接基团Z是O、O(CH₂)_hCOO、或NH(CHR)_hCOO，而h是1～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基。 

RES为白藜芦醇。 

本发明的实施方案中，所述的氨基酸为天然氨基酸和合成氨基酸，优选为谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、胱氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、酪氨酸或丝氨酸。 

本发明的实施例中，所述的中心分子R₁为季戊四醇或甘油及多聚甘油。通过季戊四醇衍生出的多叉分支的聚乙二醇为四叉分支的聚乙二醇，通过甘油衍生出的多叉分支的聚乙二 醇为三叉分支的聚乙二醇，通过六聚甘油衍生出的多叉分支的聚乙二醇为八叉分支的聚乙二醇。 

本发明的亲水性聚合物-白藜芦醇结合物可以以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药，还可采用任何可接受的给药方式或用于类似用途的试剂进行。因此，本发明的另一个方面是提供包含所述结合物的药物组合物。 

采用的给药方式可选择通过口、鼻内、直肠、透皮或注射给药方式，其形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药，例如，片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂等，优选采用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。 

通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约1至约99重量％的本发明结合物、以及99至1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量％的本发明结合物，其余为适宜的药用赋形剂。 

优选的给药途径是注射给药，采用常规日剂量方案，该方案可根据疾病的严重程度进行调整。本发明的结合物或其药学上可接受的盐也可配制成注射用剂，例如使用约0.5至约50％的活性成分分散于可采用液体形式给药的药用辅剂中，实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。 

可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物(约0.5至约20％)和选择性存在的药用辅剂溶解、分散于载体中，载体的实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。 

如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如：柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。 

该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员公知的或者显而易见的，例如可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences第18版，(Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。无论如何，按照本发明的技术，所使用的组合物将含有治疗有效量的本发明结合物，以用于治疗相应的疾病。 

本发明的一个优点是通过亲水性聚合物的改性可对结合药物提供保护，提高结合物的稳定性和水溶性，延长在生物体内的活性周期。 

附图说明

图1表示BL-09大鼠i.v.原形药物血浆药时曲线(以BL-00计)。 

图2表示BL-09大鼠i.v.代谢产物BL-00血浆药时曲线。 

具体实施方式

本发明的结合物按如下方法制备：对亲水性聚合物进行改性，引入活性官能团，然后再与白藜芦醇上的羟基结合。 

现在以聚乙二醇作为亲水性聚合物的例子进行说明。但应理解的是，本发明的亲水性聚合物也包括水溶性聚合物，并且不仅限于聚乙二醇或其共聚物，还可使用例如聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉以及它们的共聚物。 

实施例1： 

mPEG-CH₂COOH(5000)30g溶于二氯甲烷中，加入白藜芦醇13.695g，1-羟基苯并三氮唑(HOBT)0.4106g，4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.466g，加入30mL DMF及N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)1.476g。室温反应，过夜。过滤，浓缩，加入异丙醇(IPA)300mL，过滤，得白色产品27.5g。收率91.67％。 

实施例2： 

4arm-PEG-CH₂COOH(10000)25g溶于二氯甲烷中，加入白藜芦醇11.42g，1-羟基苯并三氮唑(HOBT)0.851g，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.4434g，加入80mL DMF及N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)2.1266g。室温反应，过夜。过滤，浓缩，加入异丙醇(IPA)200mL，过滤，得白色产品19.3g。收率77.2％。 

实施例3： 

mPEG-OCH₂CH₂COOH(10000)1g溶于二氯甲烷中，加入白藜芦醇228mg，1-羟基苯并三氮唑(HOBT)6.5mg，4-二甲氨基吡啶(DMAP)14.5mg，加入2mL DMF及N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)212mg。室温反应，过夜。过滤，浓缩，加入异丙醇(IPA)10mL，过滤，得白色产品0.74g。收率74％。 

实施例4： 

mPEG-CONHCH₂CH₂COOH(5000)7.5g溶于二氯甲烷中，加入白藜芦醇3.42g，1-羟基苯并三氮唑(HOBT)103.1mg，4-二甲氨基吡啶(DMAP)166mg，加入15mL DMF及N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)318mg。室温反应，过夜。过滤，浓缩，加入异丙醇(IPA)10mL，过滤，得白色产品5.8g。收率77.3％。 

实施例5： 

mPEG-Glu-Glu-Glu-COOH(20000)1g溶于二氯甲烷中，加入白藜芦醇264mg，1-羟基苯并三氮唑(HOBT)18mg，4-二甲氨基吡啶(DMAP)28mg，加入2mL DMF及N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)62.5mg。室温反应，过夜。过滤，浓缩，加入异丙醇(IPA)10mL，过滤，得白色产品0.86g。收率86％。 

实施例6： 

mPEG-Glu-Glu-Glu-COOH(30000)1g溶于二氯甲烷中，加入白藜芦醇264mg，1-羟基苯并三氮唑(HOBT)18mg，4-二甲氨基吡啶(DMAP)28mg，加入2mL DMF及N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)42.5mg。室温反应，过夜。过滤，浓缩，加入异丙醇(IPA)10mL沉淀，过滤，得白色产品0.825g。收率82.5％。 

实施例7： 

mPEG-NH₂(5000)5g溶于二氯甲烷中，加入三乙胺30μL，搅拌。固体三光气溶于溶于二氯甲烷25mL中，搅拌5min。将mPEG-NH₂(5000)的二氯甲烷溶液加入到三光气二氯甲烷溶液中，搅拌10min。反应液加热回流2h，冷却至室温。加入白藜芦醇0.1015g，搅拌3h。过滤，浓缩，加入异丙醇(IPA)20mL，过滤，得白色产品4.63g。收率92.6％。 

实施例8： 

mPEG-NH₂(10000)5g溶于二氯甲烷中，加入三乙胺20μL，搅拌。固体三光气溶于溶于二氯甲烷25mL中，搅拌5min。将mPEG-NH₂(10000)的二氯甲烷溶液加入到三光气二氯甲烷溶液中，搅拌10min。反应液加热回流2h，冷却至室温。加入白藜芦醇0.203g，搅拌3h。过滤，浓缩，加入异丙醇(IPA)20mL，过滤，得白色产品4.19g。收率83.8％。 

实施例9：PEG-白藜芦醇在大鼠体内的血浆药动学 

供试药物：按实施例7方法制备，样品编号BL-09，批号YF067P110，白藜芦醇载药量0.645％。 

实验动物：雄性SD大鼠，体重220±20g，由山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供。 

给药方式：取BL-09适量，加注射用水溶解，制成500mg/ml的水溶液，经大鼠尾静脉注射给药。 

给药剂量：500mg/kg(以PEG化物计)。 

血浆样品采集与测定：在给药前及给药后一定时间间隔经眼眶静脉丛取血。每一时间点 采血～300μL于肝素化EP管中，立即置于冰盒，12000rpm离心10min。取血浆100μL，立即加入甲醇100μL，涡旋60s，超声5min，12000rpm离心10min，取上清40μL进行HPLC分析，分别测定BL-09原形药物(以白藜芦醇计)及代谢产物白藜芦醇的血浆药物浓度。结果：见图1、2和表1。 

表1SD大鼠i.v.给予BL-09后原形药物及代谢产物白藜芦醇血浆药动学参数(n＝6) 

结论： 

(1)白藜芦醇PEG修饰产物BL-09经静脉给药入血后，在大鼠血浆中可同时检出原形的PEG化物及代谢产物白藜芦醇(BL-00)，表明PEG化白藜芦醇BL-09在大鼠体内可以释放出白藜芦醇。 

(2)从代谢产物BL-00的血浆浓度来看，大鼠i.v.给予BL-09(以PEG化物计为500mg/kg)，BL-00的C_max接近6μg/mL，且BL-00可在给药后9h内维持1μg/mL以上水平，血浆中代谢产物BL-00的AUC在各种形式(包括PEG化物及BL-00)白藜芦醇AUC总量中所占的比重为30.5％，表明BL-09i.v.给药在大鼠体内有较高的BL-00释放率。 

(3)在血浆药物动力学参数上，BL-09在体内的清除率CL为0.026L/h/kg，原形在大鼠体内的平均驻留时间为1.729h，而代谢所得BL-00的平均驻留时间在4.1h以上，体内清除速度显著降低，有效药物成分白藜芦醇在体内的滞留时间明显延长，有利于药效作用的持续发挥。 

实施例10：PEG-白藜芦醇对SD大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用 

试剂与仪器 

供试药物：按实施例7方法制备，样品编号BL-09，批号YF067P110，白藜芦醇载药量0.645％。使用时加入生理盐水配成低、中、高3个给药浓度。 

氯化三苯基四氮唑(TTC)：Sigma公司，批号2115B96，用PBS配成1％溶液。 

伊文斯兰(Evanse blue)：Sigma公司，批号SE03220816，生理盐水配成1％溶液。 

戊巴比妥钠：Genview分装，批号76I10203。 

氯化钠注射液：石家庄四药有限公司，批号100226110。 

CK、LDH试剂盒：均为南京建成生物科技有限公司产品。 

ALC-V8动物呼吸机：上海奥尔科特生物技术有限公司。 

HH-S11-1型恒温水浴仪：北京长安科学仪器厂。 

WD-IIA型恒温操作台：西安万东仪器有限公司。 

C-5050ZOOM数码相摄机：OLYMPUS。 

BIOPAC Systems MP150心电记录仪：美国BIOPAC公司。 

ALC-IP900型微量注射泵：上海奥尔科特生物技术有限公司。 

圆3/83×104/0线长90cm带线缝合针，上海医用缝合针厂。 

实验动物：SD大鼠，雄性，体重240-300g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXL(京)2010-0001。动物分为正常组、模型对照组、PEG-白藜芦醇2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg(以白藜芦醇计)剂量组，每组10只，于试验前禁食12小时。 

造模与给药：SD大鼠，称重，45mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定，气管插管，呼吸机辅助呼吸：频率80，呼吸比1∶2，潮气量8-13(视胸廓起伏度而定)。插上心电图记录针(左下肢VIN+，右上肢VIN-，左上肢GND)，记录心电。大鼠左腋下缘3-4肋或4-5肋间开胸，圆3/83×104/0带线缝合针左冠状动脉前降支穿线，进出线间置一静脉输液针软管，将缝合线剂系上，第二道打活结以方便再灌时解开，观察心电图变化，出现ST段抬高心梗指征即表明造模成功，根据实验设计控制梗塞时间为90分钟，梗塞后70分钟第一次尾静脉给药，微量注射泵10分钟内给完，再灌时松开线，拔除软管，留下缝合线，关胸，缝合，于再灌后60分钟尾静脉再次给药。再灌4.5小时后麻醉，腹主动脉取血，肝素抗凝，3000转，离心10分钟，分离血浆，分装，-20度冻存，以备血浆肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测之用。取血后于下腔静脉输入4ml Evanse blue 3分钟后取出心脏，生理盐水清洗，剪去左右心房，磨具切6片，TTC 37℃恒温染色6分钟。剪去右心室，滤纸吸干残余液体，正反面摄像。采用Adobe Photoshop 7.0软件统计正反面缺血区像素及左心 室像素，取平均值。依照试剂盒说明书对血浆CK和LDH活性进行检测。数据统计：所有测定结果用 

表示，组间进行T-test检验。 

结果：见表2、3和4。 

表2PEG-白藜芦醇对大鼠6h心肌缺血-再灌注梗死面积比的影响( 

n＝10) 

与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。 

表3PEG-白藜芦醇对大鼠6h心肌缺血-再灌注损伤血浆中CK活性的影响( 

n＝10) 

与正常组比，^#p＜0.05。与模型组比较，Wp＜0.05，^**p＜0.01 

表4PEG-白藜芦醇对大鼠6h心肌缺血-再灌注损伤血浆中LDH活性影响( n＝10) 

与正常组比，^##p＜0.01；与模型组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。 

结论：与模型组(缺血面积比为39.6±6.28％)相比，PEG-白藜芦醇在2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg剂量下可显著降低梗塞6小时后大鼠心肌缺血-再灌注损伤梗死面积比值。统计学分析表明，与模型组相比，PEG-白藜芦醇5mg/kg、10mg/kg剂量组具有非常显著性差异(p＜0.01)，其中2.5mg/kg剂量组具有显著性差异(p＜0.05)。在血浆酶学方面，模型组大鼠血 浆中CK与LDH活性显著升高，各给药组能显著降低血浆中的CK和LDH活性。 

实施例11：PEG-白藜芦醇抗肿瘤作用 

供试药物：按实施例7方法制备，样品编号BL-09，批号YF067P110，白藜芦醇载药量0.645％。使用时加入生理盐水配成低、中、高3个给药浓度。 

方法：取Lewis肺癌传代小鼠的瘤细胞悬液，生理盐水稀释至5.0×10⁶/ml瘤细胞悬液，每只小鼠腋部皮下接种0.2m1。次日按体重随机分成5组，即生理盐水组、环磷酰胺组和PEG-白藜芦醇高、中、低剂量组(以白藜芦醇计分别为50mg/kg，25mg/kg和12.5mg/kg)。连续给药10天，剥瘤，称重，计算抑瘤率。 

结果：见表5。 

表5PEG-白藜芦醇对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用( n＝10) 

与模型组比较：*p＜0.05；**p＜0.01。 

结论：PEG-白藜芦醇高、中、低剂量组的抑瘤率分别为53.2％(p＜0.01)、43.3％(p＜0.05)和37.1％(p＜0.05)，表明PEG-白藜芦醇对小鼠移植性Lewis肺癌具有较强的抑瘤活性。 

实施例12：PEG-白藜芦醇对糠尿病大鼠的治疗作用 

供试药物：按实施例7方法制备，样品编号BL-09，批号YF067P110，白藜芦醇载药量0.645％。使用时加入生理盐水配成低、中、高3个给药浓度。 

方法：取体重为300g的雄性大鼠100只，用30mg/kg的链尿佐菌素(STZ)尾静脉注射加高脂高糖饲料造成糖尿病模型，7天后筛选血糖在24-28mmol/L的糖尿病大鼠60只，按血糖值和体重分成5组，即模型对照组、PEG-白藜芦醇高、中、低剂量组(以白藜芦醇计分别为10，5，2.5mg/kg)，阳性药组(盐酸罗格列酮，5mg/kg)，每组12只，另取12只正常大鼠作为正常对照组。 

高、中、低剂量组分别静脉注射给予相应剂量白藜芦醇PEG衍生物，阳性对照组灌胃给予5mg/kg盐酸罗格列酮，模型对照组和正常对照组灌胃给予生理盐水10ml/kg，每日给药一次，连续给药8周，每两周测定空腹血糖(GLU)，糖化血清蛋白(FMN)，实验结束后测定血液流变学。 

结果：见表6。 

表6各试验组的全血粘度测定结果( 

n＝12) 

与正常对照组比较，^##p＜0.01；与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。 

结论：糖尿病模型大鼠的血液粘滞性和红细胞流变性异常，静脉注射给予PEG-白藜芦醇可显著降低糖尿病大鼠在低切、中切、高切三种状态下的全血粘度。与正常对照组比较，糖尿病组的血糖及糖化血清蛋白持续显著升高，虽然白藜芦醇PEG衍生物在降糖作用要弱于阳性对照组，但是连续给药8周，高、中剂量白藜芦醇PEG衍生物使大鼠血糖明显降低，并呈一定的剂量关系。 

Claims (14)

1.通式(I)所示的亲水性聚合物-白藜芦醇的结合物：

其中：

P为亲水性聚合物，选自由聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、聚丙烯吗啉、聚乙二醇-氨基酸寡肽以及它们的共聚物所组成的组；

L为连接基团，所述的连接基团L选自O(CH₂)_kCO、O(CH₂)_kOCO、O(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kOCO、NR(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kCO，k为0～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基；

n是1～3的整数，最大不超过RES上的羟基总数；

RES为白藜芦醇。

2.根据权利要求1所述的结合物，其特征在于所述的亲水性聚合物为聚乙二醇，其分子量在300～80,000之间。

3.根据权利要求1所述的结合物，其特征在于所述的亲水性聚合物聚乙二醇与白藜芦醇的结合物结构如通式(I-1)：

P′代表H或M，但不同时为H；

M代表以下结构：

其中：

R₁是一个中心分子，含有多个活性基团，通过这些基团衍生出的线性聚乙二醇最终形成多叉分支的聚乙二醇；

R₁可以是一个多羟基分子，与线性聚乙二醇通过醚键连接；

R₁也可以是一个多氨基分子，与线性聚乙二醇通过氨基，酰胺基连接；

R₁也可以是一个多羧基分子，与线性聚乙二醇通过酯基，酰胺基连接；

m为任何整数，表征其聚合度，选自3～2000；

L是连接基团，所述的连接基团X选自O(CH₂)_kCO、O(CH₂)_kOCO、O(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kOCO、NR(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kCO，k为0～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基。

4.根据权利要求3所述的结合物，其特征在于所述的R₁为甲醇、季戊四醇、甘油、甲基葡萄糖

甙、蔗糖、二甘醇、甘油、多聚甘油结构。

5.根据权利要求3所述的结合物，其征征在于所述的结合物为亲水性聚合物聚乙二醇与白藜芦醇通过酯键连接。

6.根据权利要求3所述的结合物，其特征在于所述的聚乙二醇与白藜芦醇的结合物结构式为下式(I-2)：

其中：

P″为H或者以下结构，但不同时为H；

所用聚乙二醇分子量为5000、10000。

7.通式(II)所示的亲水性聚合物-氨基酸寡肽与白藜芦醇的结合物：

其中：

P是亲水性聚合物，所述的亲水性聚合物选自由聚乙二醇、聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉以及它们的共聚物所组成的组；

f是2～12的整数；

j为1～6的整数；

R_j为选自于以下组中的基团：H、C_1-12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基；

X是连接基团，所述的连接基团X是(CH₂)_k、(CH₂)_kOCO、(CH₂)_kNHCO、或(CH₂)_kCO，而k是0～10的整数；

Z是连接基团，所述的连接基团Z是O、O(CH₂)_hCOO、或NH(CHR)_hCOO，而h是1-10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基。

RES为白藜芦醇。

8.根据权利要求7所述的结合物，其特征在于所述的亲水性聚合物是聚乙二醇，其分子量在300-80,000之间。

9.根据权利要求7所述的结合物，其特征在于所述的亲水性聚合物聚乙二醇-氨基酸寡肽与白藜芦醇的结合物结构如通式(II-1)：

其中：

R₁是一个中心分子，含有多个活性基团，通过这些基团衍生出的线性聚乙二醇最终形成多叉分支的聚乙二醇，R₁可以是多羟基分子、多氨基分子、多羧基分子；

R₁可以是一个多羟基分子，与线性聚乙二醇通过醚键连接；

R₁也可以是一个多氨基分子，与线性聚乙二醇通过氨基，酰胺基连接；

R₁也可以是一个多羧基分子，与线性聚乙二醇通过酯基，酰胺基连接；

m为任何整数，表征其聚合度，选自3～2000；

f是0～12中的一个整数；

i是1～30中的一个整数，表征分叉数；

j为1～6的整数；

R₂为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基；

X是连接基团，连接多叉分支的聚乙二醇的端基与氨基酸寡肽的氨基，选自O(CH₂)_kCO、O(CH₂)_kOCO、O(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kOCO、NR(CH₂)_kNHCO、NR(CH₂)_kCO，k为0～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基；

Z是连接基团，所述的连接基团Z是O、O(CH₂)_hCOO、或NH(CHR)_hCOO，而h是1～10的整数；R为选自于以下组中的基团：H、C_1～12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基和取代烷基；

RES为白藜芦醇。

10.根据权利要求9所述的结合物，其特征在于所述的R₁为甲醇、季戊四醇、甘油、甲基葡萄糖

甙、蔗糖、二甘醇、甘油、多聚甘油。

11.含有如权利要求1～10的结合物以及药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物通过口、鼻内、直肠、透皮或注射方式进行给药。

13.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物为片剂、栓剂、丸剂、软或硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂、气雾剂或注射剂。

14.权利要求1-13所述结合物或组合物在制备治疗肿瘤、糖尿病和心脑血管疾病药物中的应用。

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