CN101420963B - 用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌的7-乙基-10-羟基喜树碱的多臂聚合轭合物 - Google Patents

用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌的7-乙基-10-羟基喜树碱的多臂聚合轭合物 Download PDF

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Abstract

公开了四臂-聚乙二醇-7-乙基-10-羟基喜树碱轭合物，如式(I)；公开了制备轭合物的方法和利用该轭合物治疗哺乳动物的方法。
Figure D2007800127903A00011

Description

用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌的7-乙基-10-羟基喜树碱的多臂聚合轭合物
相关申请的相互参考 
本申请要求享有美国临时专利申请，2006年2月9日提交的序列号60/772,464，2006年6月9日提交的序列号60/804,391，2006年9月15日提交的序列号60/844,938和2006年11月6日提交的序列号60/864,516的优先权，以上各申请的内容在此引入作为参考。 
技术领域
本发明涉及7-乙基-10-羟基喜树碱的多臂聚合前药。特别的，本发明涉及7-乙基-10-羟基喜树碱的四臂聚乙二醇轭合物(conjugates)及其用途。 
发明背景 
近几年来已经提出了一些将生物学有效原料向哺乳动物给药的方法。而问题在于所需治疗剂不能溶于水性液体中。通常生物碱尤其难以溶解。 
喜树碱是产自生长于中国的旱莲木属树(Camptotheca accuminata)和印度生长的臭味假柴龙树(Nothapodytes foetida)的不溶于水的细胞毒素生物碱。喜树碱及其相关的类似物是已知的潜在抗癌剂并已被证实具有体内和体外治疗活性。 
喜树碱及其类似物是已知的DNA拓扑异构酶I抑制剂。例如，喜树碱的一种类似物伊立替康(CPT-11，)也是DNA拓扑异构酶I抑制剂并显示出抗癌活性。7-乙基-10-羟基喜树碱是CPT-11的活性代谢产物。 
发明概述 
为克服上述问题并改进通过聚乙二醇(PEG)化的药物递送技术，本发明提供了直接应用多臂PEGs通过合适的连接基于药物分子轭合的新方法。通过该方式，不需再引入繁多的分支部分到PEG上。此外，药物分子彼此相对远离。因此结合到PEG上的效率大大增加。通过末端分支的方法也提高了PEG轭合物的溶解度。 
一方面，本发明提供式(I)化合物：
Figure G2007800127903D00021
其中 
R1、R2、R3和R4独立为OH或(L)m-D； 
L是双官能连接基； 
D是喜树碱或喜树碱类似物残基，例如 
Figure G2007800127903D00022
m是0或正整数，和 
n是正整数， 
条件是R1、R2、R3和R4不全为OH。 
在本发明的一方面中，喜树碱或喜树碱类似物与聚合物反应这样其20-OH与四臂聚合物形成轭合物。 
在本发明的一个优选方面中L是氨基酸残基。在本发明的某些优选方面中，n是大约28到大约341，并优选大约227。 
本发明还提供了制备轭合物的方法和使用本发明化合物的治疗方法。 
以下描述和附图显示出本发明的优点。 
本发明中，术语“残基”应理解为化合物(即指喜树碱类似物、7-乙基-10-羟基喜树碱、氨基酸等)在经过被另一化合物取代反应后剩余的部分。 
本发明中，术语“含聚合物的残基”或“PEG残基”应各自理解为聚合物或PEG在与含喜树碱或喜树碱类似物的化合物反应后剩余的部分。 
本发明中，术语“烷基”应理解为包括直链、支链、取代的(例如卤素-、烷氧基-、硝基-)C1-12但优选C1-4烷基、C3-8环烷基或取代环烷基等。 
本发明中，术语“取代”应理解为包括加入一个或多个原子或将在包含在官能团或化合物中的一个或多个原子中替换为一个或多个不同的原子。
本发明中，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基和巯基烷基；取代的烯基包括羧基烯基、氨基烯基、二烯基氨基、羟基烯基和巯基烯基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羟基炔基和巯基炔基；取代的环烷基包括基团例如4-氯环己基；芳基包括基团例如萘基；取代的芳基包括基团例如3-溴苯基；芳烷基包括基团例如甲苯基；杂烷基包括基团例如乙基噻吩；取代的杂烷基包括基团例如3-甲氧基噻吩；烷氧基包括基团例如甲氧基；和苯氧基包括基团例如3-硝基苯氧基。卤素应理解为包括氟、氯、碘和溴。 
本发明的术语“有效量”和“充足量”指达到本领域普通技术人员所理解的所需效果或治疗效果的量。 
附图说明
图1图示说明了制备四臂聚乙二醇酸的反应流程。 
图2图示说明了制备实施例3-7所述的4臂-PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的反应流程。 
图3图示说明了制备实施例8-12所述的4臂-PEG-丙氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的反应流程。 
图4图示说明了制备实施例13-16所述的4臂-PEG-蛋氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的反应流程。 
图5图示说明了制备实施例17-21所述的4臂-PEG-肌氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的反应流程。 
图6显示了实施例26所述的大MX-1乳腺肿瘤异种移植小鼠中的单剂量和多剂量效果。 
图7显示了实施例27所述的HT-29结肠直肠肿瘤异种移植小鼠中的单剂量效果。 
图8显示了实施例28所述的HT-29结肠直肠肿瘤异种移植小鼠中的多剂量效果。 
图9显示了实施例29所述的MiaPaCa-2胰腺肿瘤异种移植小鼠中的单剂量效果。 
图10显示了实施例30所述的MiaPaCa-2胰腺肿瘤异种移植小鼠中的多剂量效果。 
图11显示了实施例31所述的4臂-PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的体外代谢。
图12显示了实施例33所述的4臂-PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的稳定性。 
图13显示了实施例33所述的pH对4臂-PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)稳定性的影响。 
图14显示了实施例34所述的4臂-PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)药代动力学曲线。 
发明详述 
在本发明的一个具体实施方案中，提供式(I)的化合物： 
Figure G2007800127903D00041
其中 
R1、R2、R3和R4独立为OH或(L)m-D； 
L是双官能连接基； 
D是喜树碱或喜树碱类似物残基，例如 
Figure G2007800127903D00042
m是0或正整数，优选大约1到大约10，更优选1；和 
n是正整数，优选大约28到大约341，更优选大约227； 
条件是R1，R2，R3和R4不全为OH。 
A.喜树碱和相关的喜树碱类似物 
喜树碱是产自生长于中国的旱莲木属树(Camptotheca accuminata)和印度生长的臭味假柴龙树(Nothapodytes foetida)的不溶于水的细胞毒素生物碱。喜树碱及相关化合物和类似物是已知的潜在抗癌剂或抗肿瘤剂且已在实验室动物的体内和 体外显示出这些活性。 
喜树碱和一些相关类似物具有以下结构： 
Figure G2007800127903D00051
从该母核结构已经制备了若干已知类似物。例如，A环的10-和11-位的任一个或一起被OH取代。A环还可以被直链或支链C1-30烷基或C1-17烷氧基取代，任选地通过杂原子(即-O或-S)连接到环上。B环可以在7-位上被直链或支链C1-30烷基(优选C2烷基)，C5-8环烷基、C1-30烷氧基、苯基烷基等、烷基氨基甲酸酯、烷基卡巴肼、苯基肼衍生物等取代。C、D和E环上也可发生其它取代。如参见美国专利5,004,758；4,943,579；RE32,518，以上内容引入作为参考。技术人员能够理解的是，10-羟基喜树碱、11-羟基喜树碱和10，11-二羟基喜树碱类似物作为孜然芹(C.Acuminata)和其亲缘植物的微量成分天然存在。这些化合物的其它取代，即7-烷基喜树碱、7-取代烷基喜树碱、7-氨基喜树碱、7-氨基烷基喜树碱、7-芳烷基喜树碱、9-烷基喜树碱、9-芳烷基喜树碱等衍生物可以使用已知合成技术来制备，而不用过多的实验。一些喜树碱生物碱具有下示结构： 
(II) 
Figure G2007800127903D00052
在上示结构中，R7是NO2，NH2，N3，氢，卤素(F、Cl、Br、I)，COOH，OH，O-C1-8烷基，SH，S-C1-3烷基，CN，CH2NH2，NH-C1-3烷基，CH2-NH-C1-3烷基，N(C1-3烷基)2，CH2N(C1-3烷基)，O-CH2CH2N(CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2N(CH2CH2OH)2和S-CH2CH2N(CH2CH2OH)2，O-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2和S-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2，O-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2和S-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2， O-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2、NH-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2和S-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2，O-CH2CH2N(C1-3烷基)2、NH-CH2CH2N(C1-3烷基)2和S-CH2CH2N(C1-3烷基)2，O-CH2CH2CH2N(C1-3烷基)2、NH-CH2CH2CH2N(C1-3烷基)2和S-CH2CH2CH2N(C1-3烷基)2，CHO或C1-3烷基之一。 
结构式(II)中的R8可以是H或C1-8烷基(优选C2烷基)或CH2NR9R10’其中 
(a)R9和R10各自独立是氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-6烷基、C2-6烯基、羟基-C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基；或 
(b)R9可以是氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-6烷基、C2-6烯基、羟基-C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基，和R10可以是-COR11其中R11是氢、C1-6烷基、全卤代-C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-6烷基、C2-6烯基、羟基-C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基；或 
(c)R9和R10与氮原子一起形成饱和3-7元包含O、S或NR12的杂环，其中R12是氢、C1-6烷基、全卤代-C1-6烷基、芳基、由选自以下一个或多个基团取代的芳基：C1-6烷基、卤素、硝基、氨基、C1-6烷基氨基、全卤代-C1-6烷基、羟基-C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基和-COR13其中R13是氢、C1-6烷基、全卤代-C1-6烷基、C1-6烷氧基、芳基、由选自以下一个或多个基团取代的芳基：C1-6烷基、全卤代-C1-6烷基、羟基-C1-6烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基； 
R110-R111各自独立选自氢；卤素；酰基；烷基(例如C1-6烷基)；取代烷基；烷氧基(例如C1-6烷氧基)；取代烷氧基；烯基；炔基；环烷基；羟基；氰基；硝基；叠氮基；酰胺基；肼基；氨基；取代氨基(例如单烷基氨基和二烷基氨基)；羟基羰基；烷氧基羰基；烷基羰基氧基；烷基羰基氨基；氨基甲酰基氧基；芳基磺酰氧基；烷基磺酰氧基；-C(R117)＝N-(O)j-R118其中R117是H、烷基、烯基、环烷基或芳基，j是0或1，和R118是H、烷基、烯基、环烷基或杂环基；和R119C(O)O-其中R119是卤素、氨基、取代氨基、杂环基、取代杂环基；或R120-O-(CH2)k-其中k是1-10的整数和R120是烷基、苯基、取代苯基、环烷基、取代环烷基、杂环基或取代杂环基；或 
R7与R110或R110与R111一起形成饱和或非饱和亚甲基二氧基、亚乙基二氧基或亚乙基氧基；和
R112是H或OR′，其中R′是烷基、烯基、环烷基、卤代烷基或羟基烷基。 
优选的芳基是苯基和萘基。当R9和R10与氮原子一起形成合适的杂环时，该杂环包括：氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、六亚甲基亚胺(hexamethyenimine)、咪唑烷、吡唑烷、异噁唑烷、哌嗪、N-甲基哌嗪、四氢氮杂
Figure G2007800127903D0007143616QIETU
、N-甲基四氢氮杂
Figure 2007800127903100002G2007800127903D0007143616QIETU
、噻唑烷等。在轭合之后，剩下的喜树碱类似物指未轭合化合物的残基。 
为便于说明而非限制，本文中7-乙基-10-羟基喜树碱作为喜树碱类似物的优选和示例性的化合物。可以理解的是本发明包括所有这些衍生物和类似物，只要具有OH例如20-OH连接到聚合物的类似物。喜树碱或喜树碱类似物可以是外消旋混合物或光学纯的异构体。优选的，基本上纯的和活性形式的例如20(S)喜树碱或喜树碱类似物应用于多臂聚合物前药。 
B.双官能连接基 
在本发明的一个优选方面，L是氨基酸残基。所述氨基酸可以选自任何已知天然存在的L-氨基酸，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸和/或其结合，仅指出小部分。另一方面，L可以是肽残基。肽的大小可以变化，例如从大约2到大约10个氨基酸残基。 
天然存在的氨基酸的衍生物和类似物，以及多种本领域已知的非天然存在的氨基酸(D或L)、疏水的或非疏水的，也在本发明考虑的范围之内。简单举例，氨基酸类似物和衍生物包括 
2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、 
2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、 
2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、 
2-氨基庚二酸、2，4-氨基丁酸、锁链素(desmosine)、2，2-二氨基庚二酸、 
2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、3-羟基脯氨酸、 
4-羟基脯氨酸、异锁链素(isodesmosine)、别异亮氨酸(allo-isoleucine)、N-甲基甘氨酸或肌氨酸、 
N-甲基-异亮氨酸、6-N-甲基-赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸以及其它不胜枚举，罗列在63Fed.Reg.，29620，29622，引入 作为参考。一些优选的L基团包括甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸或肌氨酸残基。更优选的，本发明的化合物包含甘氨酸残基作为连接基(L)。 
在本发明的另一方面，连接在喜树碱类似物和聚合物之间后的L选自： 
-[C(O)]vNR21(CR22R23O)t-， 
-[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24R25)yO-， 
-[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24R25)y-， 
-[C(O)]vNR21(CR22R23)tO-， 
-[C(O)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR25O)yNR26-， 
-[C(O)]vO(CR22R23)tNR26-， 
-[C(O)]vO(CR22R23)tO-， 
-[C(O)]vNR21(CR22R23)tNR26-， 
-[C(O)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR25O)y-， 
-[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24CR25)yNR26-， 
Figure G2007800127903D00081
和 
Figure G2007800127903D00082
其中： 
R21-R26独立选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基； 
R27选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧 基和C1-6杂烷氧基、NO2、卤代烷基和卤素； 
t和y独立地选自大约1到大约4的正整数；和v是0或1。 
在本发明的一些优选方面，化合物包括一个双官能连接基单元且因此m是1。 
其它的连接基参见Greenwald等人(Bioorganic & Medicinal Chemistry，1998，6:551-562)的表1，其内容在此引入作为参考。 
C.多臂聚合物 
在NOF Corp.Drug Delivery System catalog，Ver.8，April 2006中描述了多臂PEG’s，其公开内容在此引入作为参考。一个特别优选的多臂PEG结构如下： 
其中n是正整数。 
在本发明的一个优选实施方案中，聚合物的聚合度(n)为大约28到大约341以使得聚合物具有大约5,000Da到大约60,000Da的分子量，且优选大约114到大约227使得聚合物具有大约20,000Da到大约40,000Da的分子量。聚合度表示聚合物链重复单元的数目，且其取决于聚合物的分子量。在本发明一个特别优选的实施方案中n是大约227。 
D.前药的合成 
通常，本发明的前药通过一或多个当量的活化多臂聚合物与例如一或多个当量的喜树碱-氨基酸轭合物的每个活性部位反应制备，反应条件足以有效引起氨基与聚合物的羧酸反应并形成连接。 
更特别的，本方法可以包括： 
1)提供一当量包含可用的20-羟基的喜树碱或喜树碱类似物和一当量或更多的包含可用的羧酸基的双官能连接基； 
2)在惰性溶剂例如DCM(或DMF、氯仿、甲苯或其混合物)中在偶联剂 例如1，(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)，(或1，3-二异丙基碳二亚胺)(DIPC)，任何适宜的二烷基碳二亚胺，Mukaiyama试剂(例如2-卤-1-烷基吡啶鎓卤化物)或丙烷磷酸环酐(PPACA等)和适宜的碱例如DMAP存在下使两种反应物反应形成喜树碱-双官能连接基中间体；和 
3)使一当量或更多所得具有氨基中间体的每个活性位点(例如2当量)与一当量活化的聚合物(如PEG酸)反应，所述反应在惰性溶剂例如DCM(或DMF、氯仿、甲苯或其混合物)中在偶联剂例如1，(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)，PPAC(或1，3-二异丙基碳二亚胺)(DIPC)，任何适宜的二烷基碳二亚胺，Mukaiyama试剂(例如2-卤-1-烷基吡啶鎓卤化物)或丙烷磷酸环酐(PPACA)等和适宜的碱例如DMAP存在下进行，所述试剂可以从SigmaChemical购得或使用已知技术在0℃到22℃的温度间合成。 
在一个优选方面，7-乙基-10-羟基喜树碱的10-羟基在步骤1)之前被保护。 
用于喜树碱或喜树碱类似物的OH基例如7-乙基-10-羟基喜树碱的10-羟基的芳香保护基是优选的，因为其7-乙基-10-羟基喜树碱中间体具有更好的溶解度并可以有效力和有效地纯化为高纯度形式。例如，包含硅烷基的保护基例如叔丁基二苯基氯硅烷基(TBDPSCl)、叔丁基二甲基氯硅烷基(TBDMSCl)和三甲基氯硅烷基(TMSCl)可用于保护喜树碱和喜树碱类似物的10-羟基。 
活性聚合物，即包含1-4末端羧酸基的聚合物可通过例如使用本领域技术人员已知的标准技术将NOF Sunbright类型或其它具有末端OH基的支链聚合物转化为相应的羧酸衍生物而制备。参见实施例1-2以及共同转让的(commonly assigned)美国专利5,605,976，在此引入作为参考。 
第一和第二偶联剂可以是相同或不同的。 
优选的双官能连接基的例子包括甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、肌氨酸等，其合成见实施例。替换物和具体合成见实施例。 
例如，本发明的化合物包括：
和 
Figure G2007800127903D00122
一个特别优选的化合物是 
Figure G2007800127903D00123
其中聚合物的所有四臂都通过甘氨酸与7-乙基-10-羟基喜树碱通过甘氨酸轭合。根据本发明该方面制备的化合物的HPLC分析显示平均四个7-乙基-10-羟基喜树碱分子与一个PEG分子轭合(4％以重量计)。 
E.组合物/制剂 
包含本发明聚合物轭合物的药物组合物可以通过本领域已知方法制备，例如使用多种已知的混合、溶解、制粒、研磨、乳化、胶囊化、加入或冻干方法。组合物可与一种或多种包含赋形剂和辅料的生理可接受载体一起制剂，所述载体有助于将活性化合物加工成可用于医药的制剂。适宜的制剂取决于所选的给药途径。本发明的许多方面中优选胃肠外途径。 
对于注射，非限制性地包括静脉内、肌内和皮下注射，本发明化合物可以在水溶液中配制，优选在生理相容的缓冲液例如生理盐水缓冲液或极性溶剂，包括但不限于吡咯烷酮或二甲亚砜中。 
化合物还可配制为用于胃肠外给药，例如通过大量推注或连续输液。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中。有用的组合 物包括但不限于在油性或水性媒介中的悬浮剂、溶液或乳剂，还可包括填充剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。用于胃肠外给药的的药物组合物包括水溶形式的水溶液，例如但非限制的为活性化合物的盐(优选)。另外，活性化合物的悬浮液可以在亲脂性媒介中制备。适宜的亲脂性媒介包括脂肪油例如芝麻油、合成脂肪酸酯例如油酸乙酯和三酸甘油酯，或材料例如脂质体。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠盐、山梨糖醇或者右旋糖酐。任选的，悬浮液还可包含适宜的稳定剂和/或增加化合物溶解度的试剂以制备高浓度溶液。或者，活性成分可以是粉末形式以在使用前与适宜的媒介，例如无菌、无热原的水配制。 
对于口服给药，化合物可通过将活性物质与本领域已知的药学可接受的载体组合配制。这些载体能使本发明化合物配制为片剂、丸剂、锭剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、糊剂、浆液、溶液、悬浮剂、浓溶液和用于稀释在患者饮用水中的悬浮剂、用于稀释在患者食物中的预混合剂等，用于患者口服摄取。用于口服的药物制剂可以使用固体赋形剂、可选地研磨所得混合物，和将混合物制粒，随后如果需要加入其它适宜辅料得到片剂或糖衣芯而制备。特别的，有用的赋形剂是，填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉和马铃薯淀粉及其他原料例如明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、羧基-甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，还可加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者海藻酸。还可使用盐，例如海藻酸钠盐。 
对于吸入给药，本发明化合物可以使用加压包装或喷雾器和适宜的推进剂，以气雾剂喷雾形式方便地递送。 
化合物还可以使用例如常规栓剂基质例如可可脂或其它甘油酯，配制为直肠组合物例如栓剂或灌肠剂。 
除了前述制剂，化合物还可制剂为长效制品。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或肌肉注射给药。对于这一给药途径，本发明的化合物可以与适宜的聚合的或疏水材料(例如在乳剂中与药理学上可接受的油)、与离子交换树脂配制或作为微溶衍生物如非限制性的微溶盐。 
还可使用其它的递送体系例如脂质体和乳剂。 
另外，化合物可使用持续释放(sustained-release)系统，例如包含治疗剂 的固体疏水聚合物的半渗透基质。已经制备出多种持续释放材料，且为本领域技术人员所熟知。持续释放的胶囊可以根据其化学性质，持续数周至超过100天释放化合物。根据特定化合物的化学性质和生物稳定性，还可采用其它的稳定策略。 
F.剂量 
治疗有效量指有效预防、减轻或改善易被喜树碱或相关类似物(即7-乙基-10-羟基喜树碱)影响的病症的化合物的量。治疗有效量的确定是本领域技术人员所具有的能力，尤其是在本文所公开内容的基础上。 
对于本发明的方法使用的任何化合物，治疗有效量可以由体外试验开始推定。随后可以配制供动物模型使用的剂量以实现包括有效剂量的循环浓度范围。这样的信息随后可用于更加精确地确定用于患者的剂量。 
本文描述的化合物的毒性和治疗效力可以使用本领域熟知的方法通过在细胞培养或实验动物中的标准药学方法来测定。当然剂量也可以根据剂型和给药途径而变化。医师根据患者的情况可选择具体的制剂、给药途径和剂量。然而通常，用于全身递送的本发明化合物的优选剂量范围是大约1到大约100mg/kg/周且优选大约2到大约60mg/kg/周。 
组合物可以每天给药一次或分成多剂量作为多周疗程的一部分给药。精确的剂量将取决于病症的阶段和严重性，肿瘤对聚合物-前药组合物的敏感性，以及被治疗的患者的个体特征，这是本领域技术人员所能够理解的。 
G.治疗方法 
基于以上所述，还提供治疗哺乳动物的方法，包括向需要的患者给药有效量的本发明的式(I)化合物，其中D是生物活性基团，即喜树碱类似物。在本发明的一个优选方面，D是7-乙基-10-羟基喜树碱残基。 
本发明的另一方面提供治疗哺乳动物多种医学病症的方法。组合物用于治疗哺乳动物的新生瘤疾病，减少肿瘤负担，预防瘤转移和预防肿瘤/新生瘤生长的复发等。在另一个方面，治疗的癌可以是以下一种或多种：实体瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、胰腺癌、恶性胶质瘤、卵巢癌、胃癌等。 
组合物的给药量，例如作为前药使用，取决于其中包含的母体分子。通 常，用于治疗方法的前药的量是有效实现哺乳动物所需治疗作用的量。自然的，多种前药化合物的量会根据母体化合物、体内水解速率、聚合物分子量等而多少有所变化。通常，给药喜树碱的聚合物酯衍生物和相关组合物的量为大约1到大约100mg/kg/周，且优选大约2到大约60mg/kg/周。且上述范围是说明性的，本领域技术人员基于临床经验和治疗指示能够确定所选前药的最佳剂量。 
在本发明另一个方面，治疗方法包括向有需要的哺乳动物或患者给药有效量的本发明所述化合物，所述哺乳动物或患者所患症状可以通过拓扑异构酶干扰而治疗。 
实施例 
下面的实施例对本发明提供进一步的理解而不是以任何方式限制本发明的有效范围。实施例中出现下划线和黑体的数字对应于图1-5所示。 
一般方法.所有反应在干燥氮气或氩气氛中进行。市售试剂直接使用而不进一步纯化。所有PEG化合物在使用前真空干燥或从甲苯中共沸蒸馏。除非另有说明，使用Varian 
Figure G2007800127903D00151
 300 NMR波谱仪和氘化氯仿和甲醇作为溶剂在75.46MHz得到13C NMR光谱。以四甲基硅烷(TMS)为标准在低磁场以百万分之一(ppm)为单位报道化学位移(δ)。 
HPLC方法.反应混合物和中间体和最终产物的纯度通过BeckmanCoulter System 
Figure G2007800127903D00152
 HPLC仪器监测。其使用
Figure G2007800127903D00153
 300SB C8反相柱(150×4.6mm)或Phenomenex 
Figure G2007800127903D00154
 300A C18反相柱(150×4.6mm)和多波长UV检波器，使用含0.05％三氟乙酸(TFA)的10-90％梯度乙腈，且流速为1mL/分钟。 
实施例1 40k四臂-PEG-叔丁酯(化合物2)： 
将40k四臂-PEG-OH(12.5g，1当量)与220mL甲苯共沸除去35mL的甲苯/水。溶液冷却到30℃并加入1.0M溶于叔丁醇(3.75mL，3当量×4＝12当量)的叔丁氧化钾。混合物在30℃搅拌30分钟然后加入溴乙酸叔丁酯(0.975g，4当量×4＝16当量)。在30℃反应1小时然后冷却到25℃。缓慢加入150mL乙醚使产物沉淀。所得悬浮液冷却到17℃并静置半小时。过滤粗产物并以乙醚冲洗湿饼两次(2×125mL)。分离的湿饼溶于50ml的DCM中，且以350ml 乙醚沉淀产物并过滤。以乙醚冲洗湿饼两次(2×125mL)。产物在40℃真空干燥(收率98％，12.25g)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ27.71，68.48-70.71(PEG)，80.94，168.97. 
实施例2 40k四臂-PEG酸(化合物3)： 
将40k四臂-PEG叔丁酯(化合物2，12g)溶于120mL的DCM中然后加入60mL的TFA。混合物在室温下搅拌3小时然后在35℃真空除去溶剂。所得油状残留物溶于37.5mL的DCM中。以375mL乙醚沉淀粗产物。湿饼溶于30mL的0.5％NaHCO3中。产物以DCM萃取两次(2×150mL)。合并的有机层经2.5g的MgSO4干燥。溶剂在室温下真空除去。所得残留物溶于37.5mL的DCM中以300mL乙醚沉淀产物并过滤。以乙醚冲洗湿饼两次(2×125mL)。产物在40℃真空干燥(收率90％，10.75g)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ67.93-71.6(PEG)，170.83. 
实施例3 TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物5)： 
向7-乙基-10-羟基喜树碱(化合物4，2.0g，5.10mmol，1当量)的100mL无水DCM的悬浮液中加入Et3N(4.3mL，30.58mmol，6当量)和叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)(7.8mL，30.58mmol，6当量)。反应混合物加热回流过夜，然后以0.2N的HCl溶液(2×50mL)、饱和NaHCO3溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤。有机层经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。残余物溶于无水DCM中并加入己烷沉淀。以DCM/己烷重复沉淀以去除过量TBDPSCl。过滤固体并真空干燥得到2.09g产物(收率65％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.90(3H，t，J＝7.6Hz)，1.01(3H，t，J＝7.3Hz)，1.17(9H，s)，1.83-1.92(2H，m)，2.64(2H，q，6.9Hz)，3.89(1H，s，OH)，5.11(2H，s)，5.27(1H，d，J＝16.1Hz)，5.72(1H，d，J＝16.4Hz)，7.07(2H，d，J＝2.63Hz)，7.36-7.49(7H，m)，7.58(1H，s)，7.75-7.79(4H，m)，8.05(1H，d，J＝9.4Hz).13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ7.82，13.28，19.52，22.86，26.48，31.52，49.23，66.25，72.69，97.25，110.09，117.57，125.67，126.57，127.65，127.81，130.02，131.69，131.97，135.26，143.51，145.05，147.12，149.55，149.92，154.73，157.43，173.72. 
实施例4 TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Gly-Boc(化合物6)
向0℃的TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物5，3.78g，5.99mmol，1当量)和Boc-Gly-OH(1.57g，8.99mmol，1.5当量)的100mL无水DCM溶液中加入二氯乙烷(EDC)(1.72g，8.99mmol，1.5当量)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(329mg，2.69mmol，0.45当量)。反应混合物在0℃搅拌直到HPLC显示起始原料完全消失(大约1小时45分钟)。以0.5％NaHCO3溶液(2×50mL)、水(1×50mL)、0.1N的HCl溶液(2×50mL)和盐水(1×50mL)洗涤有机层，经MgSO4干燥。过滤并真空浓缩得到4.94g粗产物(定量收率)。粗产物固体不进行进一步纯化而直接用于下步反应。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.89(3H，t，J＝7.6Hz)，0.96(3H，t，J＝7.5Hz)，1.18(9H，s)，1.40(9H，s)，2.07-2.29(3H，m)，2.64(2H，q，7.5Hz)，4.01-4.22(2H，m)，5.00(1H，brs)，5.01(2H，s)，5.37(1H，d，J＝17.0Hz)，5.66(1H，d，J＝17.0Hz)，7.08(1H，d，J＝2.34Hz)，7.16(1H，s)，7.37-7.50(7H，m)，7.77(4H，d，J＝7.6Hz)，8.05(1H，d，J＝9.4Hz).13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ7.52，13.30，19.50，22.86，26.45，28.21，31.64，42.28，49.14，67.00，76.65，79.96，95.31，110.13，118.98，125.75，126.45，127.68，127.81，130.03，131.54，131.92，135.25，143.65，144.91，145.19，147.08，149.27，154.75，155.14，157.10，166.98，169.17. 
实施例5 TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Gly·HCl(化合物7) 
向TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Gly-Boc(化合物6，1g，1.27mmol)在5mL无水二噁烷的溶液中加入5mL4M的HCl的二噁烷溶液。反应混合物在室温下搅拌直到HPLC显示起始原料完全消失(1小时)。向混合物中加入50mL乙醚并过滤所得固体。将固体溶于50mL的DCM中并以盐水洗涤(通过加入饱和NaHCO3溶液调节pH到2.5)。有机层经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。残余物溶于5mL的DCM中并加入50mL乙醚使其沉淀。过滤得到770mg(收率84％)终产物。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.84(3H，t，J＝7.6Hz)，1.05(3H，t，J＝7.3Hz)，1.16(9H，s)，2.15-2.30(3H，m)，2.59(2H，q，7.6Hz)，4.16(1H，d，J＝17.9Hz)，4.26(1H，d，J＝17.9Hz)，5.13(2H，s)，5.46(1H，d，J＝17.0Hz)，5.60(1H，d，J＝17.0Hz)，7.11(1H，d，J＝2.34Hz)，7.30(1H，s)，7.40-7.51(6H，m)，7.56(1H，dd，J＝2.34，9.4Hz)，7.77(4H，dd，J＝7.6，1.6Hz)，7.98(1H，d，J＝9.1Hz).13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ8.09，13.72， 20.26，23.61，26.94，31.83，41.01，50.71，67.62，79.51，97.03，111.65，119.69，127.13，128.97，128.99，129.11，131.43，131.96，133.00，133.03，136.51，145.62，145.81，147.24，148.29，150.58，156.27，158.68，167.81，168.34. 
实施例6 40k四臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-TBDPS(化合物8) 
向40k4臂-PEGCOOH(化合物3，1.4g，0.036mmol，1当量)在14mL的无水DCM溶液中加入TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Gly·HCl(化合物7,207mg，0.29mmol，每个活性位点2.0当量)，DMAP(175mg，1.44mmol，10当量)和PPAC(0.85mL的50％EtOAc溶液，1.44mmol，10当量)。反应混合物在室温下搅拌过夜，然后真空蒸发。所得残余物溶于DCM，且以乙醚沉淀产物并过滤。所得物以DMF/IPA重结晶得到产物(1.25g)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ7.45，13.20，19.39，22.73，26.42，31.67，40.21，49.01，66.83，95.16，110.02，118.83，125.58，126.40，127.53，127.73，129.96，131.49，131.76，131.82，135.12，143.51，144.78，145.13，146.95，149.21，154.61，156.92，166.70，168.46，170.30. 
实施例7 40k四臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物9) 
向化合物40k四臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-TBDPS(化合物8，1.25g)中加入四丁基氟化铵(TBAF)(122mg，0.46mmol，4当量)溶于1:1的THF和0.05M的HCl溶液(12.5mL)的混合物的溶液。反应混合物在室温下搅拌4小时然后以DCM萃取两次。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤和真空蒸发。残余物溶于7mL的DMF(二甲基甲酰胺)并以37mL的IPA(异丙醇)沉淀。过滤固体并以IPA洗涤。以DFM/IPA重复沉淀。最后所得物溶于2.5mL的DCM并加入25mL乙醚沉淀。过滤固体并在40℃真空干燥过夜(860mg)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ7.48，13.52，22.91，31.67，40.22，49.12，66.95，94.82，105.03，118.68，122.54，126.37，128.20，131.36，142.92，144.20，144.98，147.25，148.29，156.44，156.98，166.82，168.49，170.39.NMR数据显示没有PEG-COOH信号，这表明所有的COOH都反应了。荧光检测负载为3.9，聚合物的四个分支全部为7-乙基-10-羟基喜树碱。以大得多的规模重复该实验得到相同结果。
实施例8 叔丁氧羰基(Boc)-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物10) 
室温下在氮气氛中向7-乙基-10-羟基喜树碱(化合物4，2.45g，1当量)在250mL的无水DCM中的溶液中加入焦碳酸二叔丁酯(di-tert-butyldicarbonate)(1.764g，1.3当量)和无水吡啶(15.2mL，30当量)。悬浮液在室温下搅拌过夜。浑浊溶液以硅藻土(10g)过滤并以0.5N的HCl洗涤滤液三次(3×150mL)以及NaHCO3饱和溶液洗涤(1×150mL)。溶液经MgSO4(1.25g)干燥。30℃真空除去溶剂。产物在40℃真空干燥(收率82％，2.525g)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ173.53，157.38，151.60，151.28，150.02，149.70，147.00，146.50，145.15，131.83，127.19，127.13，124.98，118.53，113.88，98.06，84.26，72.80，66.18，49.33，31.62，27.73，23.17，13.98，7.90. 
实施例9 Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Ala-Bsmoc(化合物11) 
在0℃向Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物10，0.85g，1.71mmol)和Bsmoc-Ala(0.68g，2.30mmol)在无水CH2Cl2(20mL)的溶液中加入EDC(0.51g，2.67mmol)和DMAP(0.065g，0.53mmol)。混合物在氮气氛中0℃搅拌45分钟然后加热到室温。通过HPLC确定反应完全，反应混合物以1％NaHCO3(2×50ml)，H2O(50mL)和0.1N的HCl(2×50mL)洗涤。有机层经无水MgSO4干燥并过滤。减压除去溶剂。所得固体低于40℃真空干燥过夜得到1.28g产物，收率95％。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ：171.16，166.83，157.16，154.78，151.59，151.33，149.82，147.17，146.68，145.35，145.15，139.08，136.88，133.60，131.83，130.45，130.40，130.33，127.40，127.08，125.32，125.14，121.38，120.01，114.17，95.90，84.38，77.19，76.64，67.10，56.66，53.45，49.96，49.34，31.7，27.76，17.94，14.02，7.53.ESI-MS，786.20[M+H]+. 
实施例10 Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Ala(化合物12) 
将Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Ala-Bsmoc(化合物11，4.2g，5.35mmol)和4-哌啶并哌啶(1.17g，6.96mmol)在无水CH2Cl2(200ml)中的溶液在室温下搅拌5小时。混合物随后以0.1N的HCl(2×40mL)洗涤，有机层经无水MgSO4干燥。过滤溶液，真空蒸馏除去溶剂得到2.8g产物，以HPLC检测纯度为93％。该产物以乙醚(3×20mL)研磨，然后以乙酸乙酯(4×20mL) 研磨以进一步纯化，得到1.52g(2.70mmol)纯度97％的产物。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ168.39，166.63，156.98，151.20，151.15，149.69，146.67，146.56，145.37，144.53，131.66，127.13，124.99，119.80，113.82，96.15，84.21，77.67，67.16，49.48，49.06，31.56，27.74，23.14，15.98，13.98，7.57. 
实施例11 40k四臂-PEG-Ala-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-Boc(化合物13) 
室温下向无水CH2Cl2(100ml)中加入Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Ala(化合物12，1.50g，2.5mmol)和4臂PEG-COOH(化合物3，10.01g，1.0mmol)。溶液冷却到0℃，随后加入EDC(0.29g，1.5mmol)和DMAP(0.30g，2.5mmol)。混合物在氮气氛中在0℃搅拌1小时。室温静置过夜。减压蒸馏去除溶剂。残余物溶于40mL的DCM，用乙醚(300mL)沉淀粗产物。将过滤所得湿固体于65℃溶于DMF/IPA(60/240mL)的混合物中。溶液在2-3小时内冷却到室温，沉淀产物。过滤固体，并用乙醚洗涤固体(2×200mL)。湿饼在低于40℃下真空干燥过夜得到产物8.5g。 
实施例12 40k四臂-PEG-Ala-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物14) 
室温下向30％TFA的无水CH2Cl2溶液中加入40k四臂-PEG-Ala-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-Boc(化合物13，7.98g)。混合物搅拌3小时，或直到HPLC确定起始原料消失。在35℃真空下尽量去除溶剂。所得物溶于50mL的DCM中，用乙醚(350mL)沉淀粗产物并过滤。湿固体65℃下溶于DMF/IPA(50/200mL)混合液中。溶液在2-3小时内冷却到室温，沉淀产物。然后过滤，并用乙醚洗涤固体(2×200mL)。湿饼在低于40℃真空干燥过夜得到产物6.7g。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ：170.75，169.30，166.65，157.00，156.31，148.36，147.19，145.03，144.29，143.00，131.49，128.26，126.42，122.47，118.79，105.10，94.57，78.08，77.81，77.20，71.15，70.88，70.71，70.33，70.28，70.06，69.93，69.57，66.90，49.14，47.14，31.53，22.95，17.78，13.52，7.46. 
实施例13 Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Met-Bsmoc(化合物15) 
0℃下向Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物10，2.73g，5.53mmol) 和Bsmoc-Met(3.19g，8.59mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中的溶液中加入EDC(1.64g，8.59mmol)和DMAP(0.21g，1.72mmol)。混合物在0℃下氮气氛中搅拌45分钟，然后温热到室温。HPLC确定反应完全，以1％NaHCO3溶液(2×100mL)、水(100mL)、0.1N的HCl溶液(2×100mL)洗涤反应混合物。有机相以无水MgSO4干燥并过滤。减压除去溶剂。在低于40℃下真空干燥所得固体过夜得到4.2g产物，收率88％。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ：170.3，166.8，157.1，155.2，151.4，151.2，149.7，147.0，146.6，145.3，145.1，138.9，136.6，133.5，131.7，130.5，130.3，130.2，127.3，127.0，125.3，125.1，121.2，119.8，114.1，96.1，84.3，76.7，67.0，56.7，53.5，53.4，49.3，31.6，31.0，29.7，27.7，23.1，15.4，13.9，7.4；ESI-MS，846.24[M+H]+. 
实施例14 Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Met-NH2·HCl(化合物16) 
Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Met-Bsmoc(化合物15，4.1g，4.85mmol)和4-哌啶并哌啶(1.06g，6.31mmol)在无水CH2Cl2(200ml)中的溶液在室温下搅拌5小时。混合物随后以0.1N的HCl(2×40mL)洗涤，然后有机层经无水MgSO4干燥。过滤溶液，真空蒸馏除去溶剂得到2.8g产物，以HPLC检测纯度为97％。该产物以乙醚(3×20mL)研磨，然后以乙酸乙酯(4×20mL)研磨以进一步纯化，得到1.54g纯度97％的产物。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ：167.2，166.5，156.9，151.12，150.9，149.8，146.3，145.9，145.8，144.9，131.3，127.2，127.0，125.1，119.6，113.8，96.7，84.3，78.2，67.0，60.4，52.2，49.4，31.4，29.6，29.1，27.7，23.2，15.1，13.9，7.7. 
实施例15 40k四臂-PEG-Met-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-Boc(化合物13) 
室温下向无水CH2Cl2(80ml)中加入Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Met(化合物16，1.48g，2.25mmol)和4臂PEG-COOH(化合物3，9.0g，0.9mmol)。溶液冷却到0℃，随后加入EDC(0.26g，1.35mmol)和DMAP(0.27g，2.25mmol)。混合物在氮气氛中0℃搅拌1小时。然后室温静置过夜。减压蒸馏去除溶剂。反应混合物以70mL的CH2Cl2稀释，用30mL0.1N的HCl/1M的NaCl水溶液萃取。有机层经MgSO4干燥后，减压下蒸发溶剂。残余物溶 于40mL的CH2Cl2，并用乙醚(300mL)沉淀粗产物。将过滤所得湿固体于65℃溶于270mL的DMF/IPA中。溶液在2-3小时内冷却到室温，沉淀产物。然后过滤固体，并用乙醚洗涤固体(2×400mL)。重复上述在DMF/IPA中的结晶方法。湿饼在低于40℃真空干燥过夜得到产物7.0g。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ：169.8，169.6，166.5，156.9，151.2，151.1，149.9，147.0，146.6，145.0，131.7，127，1，126.8，124.9，119.7，113.8，95.5，84.1，70.1，69.9，66.9，50.7，49.2，31.5，31.2，29.6，27.6，23.1，15.3，13.9，7.5. 
实施例16 40k四臂-PEG-Met-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物18) 
室温下向30％TFA的无水CH2Cl2溶液(100mL)中加入二甲亚砜(2.5mL)和四臂-PEG-Met-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-Boc(化合物17，6.0g)。混合物搅拌3小时，或直到HPLC确定反应原料消失。在35℃真空下尽量去除溶剂。所得物溶于50mL的CH2Cl2中，且用乙醚(350mL)沉淀粗产物并过滤。湿固体于65℃下溶于DMF/IPA(60/300mL)混合液中。溶液在2-3小时内冷却到室温，沉淀产物。然后过滤固体，并用乙醚(2×200mL)洗涤固体。湿饼在低于40℃真空干燥过夜得到产物5.1g。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ：169.7，166.6，157.0，156.3，148.4，147.3，145.0，144.4，142.9，131.5，128.3，126.4，122.5，118.7，105.2，94.7，78.1，67.0，50.7，49.2，31.6，31.3，29.7，23.0，15.3，13.5，7.5；7-乙基-10-羟基喜树碱与PEG的比为：2.1％(wt). 
实施例17 Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Sar-Boc(化合物19) 
向Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物10,750mg，1.52mmol)在75mL的DCM中的溶液中加入Boc-Sar-OH(432mg，2.287mmol)并冷却到0℃。向反应混合物中加入DMAP(432mg，2.287mmol)和EDC(837mg，0.686mmol)并从0℃到室温搅拌1.5小时。以0.5％NaHCO3溶液(75mL×2)、水(75mL×2)、0.1N的HCl溶液(75mL×1)洗涤反应混合物。以无水MgSO4干燥二氯甲烷层并真空蒸馏除去溶剂并干燥。收率0.900mg(89％)。结构通过NMR确定。 
实施例18 7-乙基-10-羟基喜树碱-(20)-Sar·TFA(化合物20) 
将Boc-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Sar-Boc(化合物19,900mg， 1.357mmol)加入到4mL的TFA和16mL的DCM溶液中，室温下搅拌1小时。反应混合物在30℃以甲苯蒸发。残余物溶于10mL的CHCl3中并以乙醚沉淀。过滤并干燥产物。收率700mg(1.055mmol，78％)。13CNMR(67.8MHz，CDCl3)δ168.26，167.07，158.84，158.71，148.82，147.94，147.22，146.34，144.04，131.18，130.08，128.97，124.46，119.78，106.02，97.23，79.84，79.34，66.87，50.84，49.86，31.81，23.94，15.47，13.84，8.08. 
实施例19 TBDMS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Sar·HCl(化合物21) 
以200mL无水DCM稀释7-乙基-10-羟基喜树碱-(20)-Sar·TFA(化合物20，2.17g，3.75mmol，1当量)的无水DMF(30mL)溶液。加入Et3N(2.4mL，17.40mmol，4.5当量)，然后加入TBDMSCl(2.04g，13.53mmol，3.5当量)。反应混合物在室温下搅拌直到HPLC显示起始原料消失(大约1小时)。有机层以0.5％NaHCO3洗涤两次，水洗一次和盐水饱和的0.1N的HCl溶液洗涤两次，然后经MgSO4干燥。过滤和真空浓缩溶剂之后所得物溶于DCM。加入乙醚，以细或中等布氏漏斗过滤得到固体沉淀(2.00g，87％收率)。HPLC显示固体纯度为96％。1H NMR和13C NMR确证结构。1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ0.23(6H，s)，0.96(9H，s)，0.98(3H，t，J＝7.3Hz)，1.30(3H，t，J＝7.6Hz)，2.13-2.18(2H，m)，2.67(3H，s)，3.11(2H，q，J＝7.6Hz)，4.10(1H，d，J＝17.6Hz)，4.22(1H，d，J＝17.6Hz)，5.23(2H，s)，5.40(1H，d，J＝16.7Hz)，5.55(1H，d，J＝16.7Hz)，7.32(1H，s)，7.38-7.43(2H，m)，8.00(1H，d，J＝9.1Hz).13C NMR(75.4MHz，CD3OD)：δ-4.14，8.01，14.10，19.30，23.98，26.16，31.78，33.52，49.46，50.95，67.66，79.80，97.41，111.96，119.99，127.75，129.28，129.67，131.57，145.24，146.86，147.16，148.02，150.34，156.69，158.72，167.02，168.27. 
实施例20 40k四臂-PEG-Sar-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-TBDMS(化合物22) 
向40k4臂-PEG-COOH(化合物3，10g，0.25mmol，1当量)在150mL的无水DCM溶液中加入TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-Sar·HCl(化合物21，1.53mg，2.5mmol，2.5当量)溶于20mL无水DMF的溶液并冷却混合 物到0℃。向溶液中加入EDC(767mg，4mmol，4当量)和DMAP(367mg，3mmol，3当量)并使反应混合物缓慢温热到室温并于室温下搅拌过夜。反应混合物随后真空浓缩，残余物溶于最少量的DCM。加入乙醚后生成固体，并真空过滤。残余物溶于30mL无水CH3CN并加入600mL的IPA使沉淀。过滤并以IPA和乙醚洗涤固体得到产物(9.5g)。结构以NMR确定。 
实施例21 40k四臂-PEG-Sar-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物23) 
方法A40k四臂-PEG-Sar-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-TBDMS(化合物22)溶于50％的TFA在水中(200mL)的混合物中。室温下搅拌混合物10小时然后以100mL水稀释并以DCM(2×300mL)萃取。合并的有机相以水洗涤(2×100mL)，经MgSO4干燥，过滤，并真空蒸发。残余物溶于100mL无水DMF中并以热风器略微加热，缓慢加入400mL的DMF使共沉淀。将固体过滤，以20％DMF在IPA中的溶液和乙醚洗涤固体。所得固体溶于DCM中并以乙醚沉淀(6.8g)。结构以NMR确定。 
方法B40k四臂-PEG-Sar-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-TBDMS(1g)溶于10mL 1N的HCl溶液中。反应混合物室温下搅拌1小时(以HPLC检测)然后以DCM(2×40mL)萃取。有机层经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。所得明黄色残留物溶于10mL的DMF(以热风器略微加热)随后加入40mL的IPA。过滤所得固体，在40℃真空箱中干燥过夜。结构以NMR确定。 
生物学数据 
实施例22 毒性数据 
使用裸小鼠研究四臂PEG轭合(conjugated)的7-乙基-10-羟基喜树碱的最大耐受量(MTD)。当裸鼠体重的减少为预处理时体重的20％时监测其死亡率以及疾病和死亡的信号持续14天。 
表1显示了各个化合物单一剂量和多剂量给药的最大耐受量。多剂量给药的各剂量为隔一天给药，持续10天，再观测小鼠4天，因此总共14天。
表1.裸小鼠的MTD数据 
Figure G2007800127903D00251
对于四臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物9)的MTD，单剂量时为30mg/kg，多剂量时为10mg/kg(q2d×5)。 
实施例23.体外数据 
表2中，细胞毒性(产生IC50各化合物的μM)显示了各化合物的体外抗肿瘤能力。该研究用于确定四臂PEG化7-乙基-10-羟基喜树碱轭合物的PEG化效果。使用MTS试验测定PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)、7-乙基-10-羟基喜树碱和CPT-11的体外细胞毒性。细胞在37℃与药物孵育72小时。孵育后，加入MTS染料，在490nm处测量着色产物(甲
Figure G2007800127903D0025144720QIETU
)的形成。 
四臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)和CPT-11的IC50值显示四臂-PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)对所有检测的肿瘤细胞具有较CTP-11高得多的体外抑制。此外，四臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)对于除了HT29肿瘤细胞外的待测肿瘤细胞具有较天然7-乙基-10-羟基喜树碱明显更高的体外抑制。 
PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物比的效应高大约10到600倍。PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物对COLO 205、HT-29和OVCAR-3细胞株的敏感性比Pegamotecan(喜树碱的PEG化前药)高8到16倍。
表2.IC50(μM)数据 
Figure G2007800127903D00261
四臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物9)的IC50以7-乙基-10-羟基喜树碱的当量表示 
所示值是平均值±SD(n＝3)；当没有显示SD时，所示值是两次重复的平均值 
如表3所概括，包含多种氨基酸的PEG-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物对一系列癌细胞株具有潜在体外细胞毒性。所有的PEG-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物显示出有力的体外抗肿瘤活性，其超过了小分子前药CPT-11和Pegamotecan。 
表3.多种PEG-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物的IC50(μM)数据 
Figure G2007800127903D00262
Figure G2007800127903D00271
实施例24.体内数据-对乳腺肿瘤异种移植的小鼠的单剂量效应 
四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物(化合物9)抗裸小鼠皮下人乳腺癌细胞(MX-1)的效应通过如下方式测定。在适应环境至少一周后，通过将来自供体小鼠的小肿瘤碎片移植到裸小鼠左肋腹区域的单个皮下位点而形成肿瘤。肿瘤移植位点每周观察两次并触摸测量一次。通过测径器测量两个尺寸以确定各鼠的肿瘤体积并使用公式计算：肿瘤体积＝(长度×宽度2)。当肿瘤达到大约100mm3的平均体积时，将小鼠分到各试验组，其包括未处理对照组、如本文实施例7制备的四臂PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)组、如Conover等人(Anti-Cancer Drug Design，1999，14:499-506)所述制备的PEG-Ala-CPT(其内容在此引入作为参考)组，和CPT-11组。药物通过尾静脉以20mg/kg小鼠体重的单剂量静脉给药。轭合物的剂量指相当于7-乙基-10-羟基喜树碱的数量。在研究开始时和单剂量给药第31天测量小鼠体重和肿瘤尺寸。 
表4显示了测量单剂量静脉注射20mg/kg体重后第31天小鼠异种移植瘤MX-1乳腺肿瘤细胞的肿瘤缩小。肿瘤的全部生长以肿瘤体积(TV)计算。还计算了治疗组相对于对照组的百分比(T/C)。肿瘤退化的百分比表示各化合物的体内活性。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物显示出显著的抗肿瘤活性，小鼠存活率100％，治愈率100％。CPT-11和盐水对照组显示出无保护性，存活率0％。所有数据如表4所示。 
表4.在MX-1乳腺肿瘤异种移植小鼠模型中的单剂量效果对比 
  
化合物 平均 TV±SD (mm3) 中值 TV (mm3) F/I (％) TV±SD 的改变 (Chg) (％) TGI (％) 消退 (％) 治愈率 (％) 存活率 (％) T/C (％)
对照 1136± 686 785 1259 1399± 658 0 0 0 0 ---
[0216]   
化合物9 7±9 3 7 -94±10 99 100 100 100 0.3
PEG-Ala-CPT 43±41 40 42 -40±93 96 50 33 100 5
CPT-11 845±50 845 843 1424± 432 26 0 0 0 108
结果显示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)在乳腺癌治疗中较之PEG-Ala-CPT或CPT-11具有明显更好的效果。 
在乳腺MX-1肿瘤模型中，以四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)治疗使得几乎100％的肿瘤生长受到抑制和所有动物完全治愈。在相当的剂量水平，CPT-11的治疗产生26％的肿瘤生长抑制。 
实施例25.体内数据-在乳腺肿瘤异种移植小鼠中的多剂量效应 
测定了一系列四臂PEG-氨基酸(衍生物)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物抗裸小鼠中人乳腺癌细胞(MX-1)生长的效应。小鼠分组接受四臂PEG-Ala-(7-乙基-10-羟基喜树碱)、四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)、四臂PEG-Met-(7-乙基-10-羟基喜树碱)、四臂PEG-Sar-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(各化合物通过本发明方法制备)、CPT-11或盐水对照。给药剂量为连续六天5mg/kg/天(每两天[q×2d]×6))。监测小鼠体重和肿瘤尺寸直至首剂量给药和随后给药的第31天。 
表5显示了在以5mg/kg/天静脉注射6天(q2dx6)后的第31天测量到异种移植MX-1乳腺肿瘤细胞的小鼠中肿瘤的缩小。所有的四臂PEG-氨基酸(衍生物)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物显示出显著的抗肿瘤活性，小鼠存活率100％，治愈率100％。CPT-11和盐水对照显示出无保护性，存活率0％。所有数据如表5所示。 
表5.在MX-1胸腺肿瘤移植瘤鼠模型中的多剂量效果对比 
  
化合物 平均数 TV±SD (mm3) 中值 TV (mm3) F/I (％) TV±SD的 改变 (％) TGI (％) 消退 (％) 治愈率 (％) 存活率 (％) T/C (％)
对照 1136±686 785 1259 1399±658 0 0 0 0 ---
化合物12 (Ala) 10±11 9.6 10 -91±11 99 100 67 100 1.2
[0224]   
化合物9 (Gly) 12±18 6.6 14 -91±10 99 100 100 100 0.8
化合物18 (Met) 8±9 5.6 7.8 -94±7 99 100 100 100 0.7
化合物23 (Sar) 12±10 14.6 13 -87±12 99 100 100 100 1.9
CPT-11 632±698 340 594 423±243 44 0 0 0 43
数据显示(7-乙基-10-羟基喜树碱)的四臂PEG-氨基酸衍生物在乳腺癌治疗中较之CPT-11具有明显更好的效果。 
实施例26.在小和大乳腺肿瘤异种移植的小鼠中的体内效应 
在具有小(大约100mm3)或大(大约450mm3)人乳腺MX-1肿瘤的小鼠中评价四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的抗肿瘤效应。单剂量和多剂量方案的抗肿瘤治疗活性都进行测定。在移植小乳腺肿瘤的小鼠中，单剂量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(20mg/kg)导致100％TGI。多剂量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(20mg/kg q2d×5)也导致100％TGI。单剂量(20mg/kg)给药CPT-11没有抑制肿瘤生长，多剂量(20mg/kg q2d×5)CPT-11在第31天导致44％TGI。 
在有大乳腺肿瘤的小鼠中，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(30mg/kg)的单独MTD治疗导致96％TGI。六只小鼠中的四只在第54天治愈。CPT-11的单独MTD治疗(80mg/kg)在第13天导致70％TGI。所有动物在第20天因肿瘤负荷过量而死亡。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)以其MTD的多剂量治疗(10mg/kg q2d×5)也导致96％TGI，六只小鼠中的五只在第54天治愈。CPT-11的多剂量MTD治疗(40mg/kg q2d×5)导致在第13天～95％TGI。然而，六只小鼠中的四只在～5周后肿瘤复发。当以与四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的等剂量水平(10mg/kg q2d×5)给予CPT-11时，其具有有效的TGI直到治疗中止，然后肿瘤再生长。结果见图6A和6C。抗癌效应并不是因为一般的毒性效应，因为四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)或CPT-11当以MTD给药治疗时，在治疗期间都没有显著减少动物体重，如图6B和6D所示。
在单剂量或多剂量注射的MX-1乳腺肿瘤模型中，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)有效抑制小(100mm3)或大(450mm3)块肿瘤的生长。在MX-1乳腺肿瘤异种移植的小鼠中肿瘤尺寸在大约75mm3到大约450mm3的都被成功治疗。 
实施例27.体内数据-对结肠直肠肿瘤异种移植小鼠的单剂量效应 
在本实施例中，在异种移植HT-29结肠直肠肿瘤细胞的小鼠中，在单剂量静脉注射30mg/kg四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)或CPT-11后的第4、8、11、15、18和22天测量到肿瘤缩小。CPT-11剂量仍是80mg/kg。结果如图7所示。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物显示了显著的抗肿瘤活性。盐水对照显示没有保护性，存活率0％。结果显示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)在结肠直肠癌治疗中较之CPT-11具有明显的效果。 
实施例28.体内数据-对结肠直肠肿瘤异种移植小鼠的多剂量效应 
在异种移植瘤HT-29结肠直肠肿瘤细胞的小鼠中，在静脉注射10mg/kg/剂量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)或CPT-11持续5天后，在第4、8、11、15、18和22天测量到肿瘤缩小。CPT-11剂量仍是40mg/kg/剂量，持续5天。结果如图8所示。多剂量给药得到相似结果。此外，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的多剂量给药显示出较之CPT-11更为显著的治疗效应。结果显示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的多剂量给药在结肠直肠癌治疗中较之CPT-11具有明显更好的效果。当观察MX-1肿瘤异种移植的小鼠时，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)或CPT-11的治疗在治疗期间没有显著降低小鼠体重。 
实施例29.体内数据-对胰腺肿瘤异种移植小鼠的单剂量效应 
在本实施例中，在异种移植MiaPaCa-2胰腺肿瘤细胞的小鼠中，在单剂量静脉注射30mg/kg四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)或CPT-11后的第4、8、11、15、18和22天测量到肿瘤缩小。CPT-11剂量仍是80mg/kg。结果如图9所示。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物表现出明显的抗肿瘤活性。盐水对照和CPT-11没有保护作用。结果显示四臂PEG-Gly-(7- 乙基-10-羟基喜树碱)在胰腺癌治疗中较之CPT-11具有明显的效果。单剂量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)治疗导致71％TGI，而CPT-11单剂量注射治疗导致0％TGI。 
实施例30.体内数据-对胰腺肿瘤异种移植小鼠的多剂量效应 
在异种移植MiaPaCa-2胰腺肿瘤细胞的小鼠中，在静脉注射10mg/kg/剂量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)或CPT-11持续5天后，在第4、8、11、15、18和22天测量到肿瘤缩小。CPT-11剂量仍是40mg/kg/剂量，持续5天。结果如图10所示。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的多剂量给药显示出较之CPT-11显著的治疗效应。结果显示四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的多剂量给药在胰腺癌治疗中较之CPT-11具有更好的效果。多剂量四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)治疗导致95％TGI，而CPT-11治疗导致34％TGI。 
实施例31.体外代谢 
在大鼠肝细胞中观测PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物的体外代谢。PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)与大鼠肝细胞在37℃，pH7.5孵育2小时。如图11所示，确定7-乙基-10-羟基喜树碱和7-乙基-10-羟基喜树碱-葡糖苷酸(7-乙基-10-羟基喜树碱-G)是主要的代谢产物，这与7-乙基-10-羟基喜树碱的已知体内代谢途径一致。 
实施例32.PEG轭合物的性质 
图6显示了四种不同PEG-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物在盐水溶液中的溶解度。所有四种PEG-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物显示了良好的溶解度，达到相当于7-乙基-10-羟基喜树碱的4mg/mL。在人血浆中，7-乙基-10-羟基喜树碱从PEG轭合物中以22到52分钟的倍增时间稳定释放，且该释放明显是pH和浓度依赖性的，如随后的实施例33所述。
表6.PEG-7-乙基-10-羟基喜树碱轭合物的性质 
Figure G2007800127903D00321
a7-乙基-10-羟基喜树碱在盐水中不溶. 
bPEG轭合物半衰期 
c7-乙基-10-羟基喜树碱从轭合物的形成率 
PEG-7-乙基-10-羟基喜树碱轭合物在室温下和长达24小时中在盐水和其它水性介质中显示了良好的稳定性。 
实施例33.浓度和pH对稳定性的作用 
基于我们以前的工作，20-OH位的酰化保护内酯环为非活化形式。使用基于UV的HPCL方法观测在大鼠和人血浆中的水稳定性和水解性质。四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物与每个样品在室温下孵育5分钟。 
PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物在缓冲液中的稳定性取决于pH值。图12显示了四臂PEG-甘氨酸-(7-乙基-10-羟基喜树碱)在多种样品中的稳定性。图13显示7-乙基-10-羟基喜树碱从PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)中的释放率随pH增加而增加。
实施例34.药代动力学 
无肿瘤Balb/C小鼠注射单剂量20mg/kg四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物。在不同时间点处死小鼠并以HPLC分析完整轭合物和释放的7-乙基-10-羟基喜树碱。使用非房室分析(WinNonlin)完成药代动力学分析。具体见表7。 
表7.药代动力学数据 
  
参数 化合物9 从化合物9释放的7-乙基 -10-羟基喜树碱
AUC(h＊μg/mL) 124,000 98.3
最终t1/2(Hr) 19.3 14.2
Cmax(μg/mL) 20,500 13.2
CL(mL/hr/kg) 5.3 202
Vss(mL/kg) 131 3094
如图14所示，7-乙基-10-羟基喜树碱的PEG化产生长周期的半衰期和对于天然7-乙基-10-羟基喜树碱的高暴露。观测到了四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物的肝肠循环。PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)在小鼠中的药代动力学曲线为两相，在开始的2小时为快速血浆分布相，随后是对于轭合物的18-22小时最终消除半衰期和对于7-乙基-10-羟基喜树碱的18-26小时的最终消除半衰期。 
此外，观测了四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物在大鼠中的药代动力学曲线。在大鼠中，使用的剂量水平为3，10和30mg/kg(相当于7-乙基-10-羟基喜树碱)。药代动力学曲线与小鼠中一致。 
在大鼠中，四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)显示以12-18小时消除半衰期的从大鼠循环中的两相清除。7-乙基-10-羟基喜树碱从四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物释放具有21-22小时的表观消除半衰期。最大血浆浓度(Cmax)和曲线下的面积(AUC)以大鼠中剂量依赖方式增加。从小鼠或大鼠中四臂PEG-Gly轭合物释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的表观半衰期明显长于从CPT-11释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的表观半衰期，且从四臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)轭合物释放的7-乙基-10-羟基喜树碱显著的暴露明显高于从报道的CPT-11释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的暴露。大鼠中母体化合物的清除率为0.35mL/hr/kg。评估的母体化合物在稳态下的分布体积(Vss)为5.49mL/kg。大鼠中释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的清除率为131mL/hr/kg。大鼠中释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的评定的Vss为2384mL/hr/kg。大鼠和小鼠中都观察到了释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的肝肠循环。因此，本发明还涉及下述方面， 
[1]下式化合物在制备用于治疗癌症，尤其是乳腺癌的药物中的用途 
[2]上述[1]的用途，其中所述化合物的给药量为5到20mg/kg/剂量，基于7-乙基-10-羟基喜树碱的重量。 
[3]下式化合物在制备用于治疗结肠直肠癌的药物中的用途， 
Figure DEST_PATH_GSB00000366904200012
[4]上述[3]的用途，其中所述化合物的给药量为10到30mg/kg/剂量，基于7-乙基-10-羟基喜树碱的重量。 
[5]下式化合物在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途， 
Figure DEST_PATH_GSB00000366904200013
[6]上述[5]的用途，其中所述化合物的给药量为10到30mg/kg/剂量，基于7-乙基-10-羟基喜树碱的重量。 

Claims (21)

1.式(I)的化合物
Figure FSB00000829059000011
其中
R1、R2、R3和R4独立为OH或(L)m-D；
L是双官能连接基，其中L是甘氨酸残基、丙氨酸残基、蛋氨酸残基或肌氨酸残基；
D是7-乙基-10-羟基喜树碱
Figure FSB00000829059000012
m是正整数，和
n是28到341的正整数，以使得化合物的聚合部分具有5,000到60,000道尔顿的分子量，
条件是R1、R2、R3和R4不全为OH。
2.根据权利要求1的化合物，其中m为1到10。
3.根据权利要求1的化合物，其中m是1。
4.根据权利要求1的化合物，其中n是114到227，以使得化合物的聚合部分具有20,000到40,000道尔顿的分子量。
5.根据权利要求1的化合物，其中n是227，以使得化合物的聚合部分具有40,000道尔顿的分子量。
6.根据权利要求1的化合物，选自
Figure FSB00000829059000021
Figure FSB00000829059000031
7.根据权利要求1的化合物，具有下式
Figure FSB00000829059000032
8.权利要求1的化合物在制备用于治疗哺乳动物中癌症的药物中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中所述癌症为实体瘤。
10.根据权利要求8的用途，其中所述癌症选自：淋巴瘤、肺癌、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、卵巢癌和胃癌。
11.根据权利要求8的用途，其中所述癌症选自：淋巴瘤、小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、卵巢癌和胃癌。
12.根据权利要求9、10或11的用途，其中所述癌症为转移性疾病。
13.根据权利要求10或11的用途，其中所述癌症是乳腺癌且所述权利要求1的化合物是
Figure FSB00000829059000041
14.根据权利要求13的用途，其中所述化合物的给药量为5到20mg/kg/剂量，基于7-乙基-10-羟基喜树碱的重量。
15.根据权利要求10或11的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌且所述权利要求1的化合物是
Figure FSB00000829059000042
16.根据权利要求15的用途，其中所述化合物的给药量为10到30mg/kg/剂量，基于7-乙基-10-羟基喜树碱的重量。
17.根据权利要求10或11的用途，其中所述癌症是胰腺癌且所述权利要求1的化合物是
Figure FSB00000829059000043
18.根据权利要求17的用途，其中所述化合物的给药量为10到30mg/kg/剂量，基于7-乙基-10-羟基喜树碱的重量。
19.根据权利要求8的用途，其中所述化合物以1mg/kg/周至100mg/kg/周的量给药，基于7-乙基-10-羟基喜树碱的重量。
20.根据权利要求8的用途，其中所述化合物以2mg/kg/周至60mg/kg/周的量给药，基于7-乙基-10-羟基喜树碱的重量。
21.制备多臂聚合前药的方法，包括
(a)提供一当量包含可用的20-羟基的喜树碱或喜树碱类似物和一当量或多当量的包含可用的羧酸基的双官能连接基；
(b)在惰性溶剂中使两种反应物在偶联剂和适宜的碱的存在下反应形成具有可用的氨基的喜树碱双官能连接基中间体；和
(c)相对于下式活化聚合物的每个活性位点，使一当量或多当量的所得中间体与一当量的下式的活化的聚合物反应，
Figure FSB00000829059000051
在有效形成具有以下结构的多臂聚合前药的条件下反应
Figure FSB00000829059000052
其中
R1、R2、R3和R4独立为OH或(L)m-D；
L是双官能连接基，其中L是甘氨酸残基、丙氨酸残基、蛋氨酸残基或肌氨酸残基；
D是7-乙基-10-羟基喜树碱；
m是正整数；和
n是28到341的正整数，以使得化合物的聚合部分具有5,000到60,000道尔顿的分子量；
条件是R1、R2、R3和R4不全为OH。
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