KR20080091829A - 유방암, 대장암, 췌장암, 난소암 및 폐암 치료용 7―에틸―10―히드록시캄포테신의 다분지형 고분자 접합체 - Google Patents

유방암, 대장암, 췌장암, 난소암 및 폐암 치료용 7―에틸―10―히드록시캄포테신의 다분지형 고분자 접합체

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KR20080091829A
KR20080091829A KR1020087021163A KR20087021163A KR20080091829A KR 20080091829 A KR20080091829 A KR 20080091829A KR 1020087021163 A KR1020087021163 A KR 1020087021163A KR 20087021163 A KR20087021163 A KR 20087021163A KR 20080091829 A KR20080091829 A KR 20080091829A
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Abstract

본 발명은 하기 화학식(1)과 같은 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜-7-에틸-10 히드록시캄포테신 접합체를 규명하였다:
<화학식(1)>
.
또한, 상기 접합체를 제조하는 방법 및 상기 접합체를 이용한 포유류를 치료하는 방법을 규명하였다.

Description

유방암, 대장암, 췌장암, 난소암 및 폐암 치료용 7―에틸―10―히드록시캄포테신의 다분지형 고분자 접합체{MULTI―ARM POLYMERIC CONJUGATES OF 7―ETHYL―10―HYDROXYCAMPTOTHECIN FOR TREATMENT OF BREAST，COLORECTAL，PANCREATIC，OVARIAN AND LUNG CANCERS}
본 발명은 7-에틸-10-히드록시캄포테신(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin)의 다분지형 고분자 전구약물(multi-arm polymeric prodrug)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 접합체(four-arm polyethylene glycol conjugate) 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 출원 청구항은 2006년 2월 9일 제출된 미국 가출원 번호 60/772,464, 2006년 6월 9일 제출된 미국 가출원 번호 60/804,391, 2006년 9월 15일 제출된 미국 가출원 번호 60/844,938 및 2006년 11월 6일 제출된 미국 가출원 번호 60/864,516의 우선권을 이용하며, 이들의 내용은 참고로 본 명세서에 포함되어 있다.
수년 동안, 생물학적으로 유효한 물질을 포유류에 투여하는 다양한 방법들이 제시되었다. 문제는 원하는 약제가 수용성 용액에 불용성일 때 발생한다. 특히, 알칼로이드(Alkaloid)는 종종 용해되기 어렵다.
캄포테신(Camptothecin)은 중국에서 자생하는 캄포테카 아큐미나타(Camptotheca accuminata) 나무 및 인도에서 자생하는 노타포디트 포에티다(Nothapodytes foetida) 나무에 의해 생산되는 수용성 세포독성 알칼로이드이다. 캄포테신 및 이의 유도체는 잠재적인 항암제로 알려져 있고, 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 치료적 활성이 증명되었다.
캄포테신 및 이의 유도체는 DNA 토포아이소머라제(topoisomerase) Ⅰ 억제자로 알려져 있다. 예를 들어, 캄포테신 유도체 중 하나는 DNA 토포아이소머라제 Ⅰ 억제자이고 항암 활성을 보여주는 이리노테칸(Irinotecan)(CPT-11, Camptosar®)이 있다. 7-에틸-10-히드록시캄포테신은 CPT-11의 활성 대사 산물(active metabolite)이다.
도 1은 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산(four-arm polyethylene glycol acid)을 제조하는 반응 개요도를 나타내는 그림이다.
도 2는 실시예 3 내지 7에 기재된 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산-글리신-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)[4arm-PEG-Gly-(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin)]을 제조하는 반응 개요도를 나타내는 그림이다.
도 3은 실시예 8 내지 12에 기재된 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산-알라닌-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)[4arm-PEG-Ala-(7-ethyl-10-hydroxycamptotheci -n)]을 제조하는 반응 개요도를 나타내는 그림이다.
도 4는 실시예 13 내지 16에 기재된 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산-메티오닌-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)[4arm-PEG-Met-(7-ethyl-10-hydroxycamptothe -cin)]을 제조하는 반응 개요도를 나타내는 그림이다.
도 5는 실시예 17 내지 21에 기재된 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산-사르코신-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)[4arm-PEG-Sar-(7-ethyl-10-hydroxycamptothe -cin)]을 제조하는 반응 개요도를 나타내는 그림이다.
도 6은 실시예 26에 기재된 큰 MX-1 유방암(breast tumor)이 이종 이식된 마우스에 1회 투여 및 수회 투여 효율을 보여주는 그래프이다.
도 7은 실시예 27에 기재된 HT-29 대장암(colorectal tumor)이 이종 이식된 마우스에 1회 투여 효율을 보여주는 그래프이다.
도 8은 실시예 28에 기재된 HT-29 대장암이 이종 이식된 마우스에 수회 투여 효율을 보여주는 그래프이다.
도 9는 실시예 29에 기재된 MiaPaCa-2 췌장암(pancreatic tumor)이 이종 이식된 마우스에 1회 투여 효율을 보여주는 그래프이다.
도 10은 실시예 30에 기재된 MiaPaCa-2 췌장암이 이종 이식된 마우스에 수회 투여 효율을 보여주는 그래프이다.
도 11은 실시예 31에 기재된 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산-글리신-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 시험관내(in vitro) 대사를 보여주는 그래프이다.
도 12는 실시예 33에 기재된 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산-글리신-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 안정성(stability)를 보여주는 그래프이다.
도 13은 실시예 33에 기재된 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산-글리신-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 안정성에서 pH를 보여주는 그래프이다.
도 14는 실시예 33에 기재된 4개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜산-글리신-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 약물 동력학적 분석(pharmacokinetic profile)을 보여주는 그래프이다.
상기 문제를 극복하고, 페그화(PEGylation)를 통한 약물 전달 기술을 개선하기 위하여, 다분지형 PEG(multi-armed PEG)를 직접 이용하여 적합한 링커(linker)를 통하여 약물 분자에 접합시키는 새로운 방법을 제공한다. 상기 방법에서는, 공들이는 PEG에 번거로운 분지 부분을 포함할 필요가 없다. 게다가, 상기 약물 분자들은 서로 다르다. 따라서, PEG에 대한 접합 효율은 매우 증가한다. 또한, PEG 접합체의 용해성은 말단 분지화된 접근을 통해 개선된다.
본 발명에서는 하기 화학식(1)의 화합물을 제공한다:
여기서,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 OH 또는 (L)m-D이다;
L은 이중기능성 링커(Bifunctional linker)이다;
D는 하기 화학식과 같은, 캄포테신(camptothecin) 또는 캄포테신 유도체(analog)의 잔기(residue)이다:
;
m은 0 또는 양의 정수이다;
n은 양의 정수이다; 및
R1, R2, R3 및 R4는 모두 OH가 아니다.
본 발명에 있어서, 캄포테신 또는 캄포테신 유도체는 고분자(polymer)와 반응하여 상기 캄포테신 또는 캄포테신 유도체의 20-OH기가 4개의 분지형 고분자와 접합체를 형성한다.
본 발명에 있어서, L은 아미노산의 잔기인 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, n은 약 28 내지 341인 것이 바람직하고, 약 227인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 접합체를 제조하는 방법, 및 본 발명의 화합물을 이용한 치료방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 상세한 설명 및 도면을 통해 상세히 설명한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "잔기(residue)"는 다른 화합물과 치환 반응이 진행된 후 남는 캄포테신 유사물, 7-에틸-10-히드록시캄포테신 및 아미노산 등과 같은 화합물의 일부를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "잔기 함유 고분자(polymeric containing residue)" 또는 "PEG 잔기"는 캄포테신 또는 캄포테신 유도체-포함 화합물과 반응이 진행된 후에 남는 고분자의 또는 PEG의 일부를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "알킬(alkyl)"은 직쇄, 분지된 또는 치환된, 예를 들어 할로(halo)-, 알콕시(alkoxy)-, 니트로(nitro)-, C1 -12, 더 바람직하게는 C1-4 알킬, C3 -8 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "치환된(substituted)"은 작용기(functional group) 또는 화합물 내에 포함된 하나 이상의 원자를 하나 이상의 다른 원자로 추가 또는 대체하는 것을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 치환된 알킬(substituted alkyl)은 카르복실알킬(carboxyalkyl), 아미노알킬(aminoalkyl), 디알킬아미노(dialkylamino), 히드록시알킬(hydroxyalkyl) 및 머캅토알킬(mercaptoalkyl)을 포함하고; 치환된 알케닐(substituted alkenyl)은 카르복시알케닐(carboxyalkenyl), 아미노알케닐( aminoalkenyl), 디알케닐아미노(dialkenylamino), 히드록시알케닐(hydroxyalkenyl) 및 머캅토알케닐(mercaptoalkenyl)을 포함하고; 치환된 알키닐(substituted alkynyl)은 카르복시알키닐(carboxyalkynyl), 아미노알키닐(aminoalkynyl), 디알키닐아미노(dialkynylamino), 히드록시알키닐(hydroxyalkynyl) 및 머캅토알키닐(mercaptoalkynyl)을 포함하고; 치환된 사이클로알킬(substituted cycloalkyl)은 moieties such as 4-클로로사이클로헥실(4-chlorocyclohexyl) 등의 작용기를 포함하고; 아릴(aryl)은 나프틸(napthyl) 등의 작용기를 포함하고; 치환된 아릴(substituted aryl)은 3-브로모 페닐(3-bromo phenyl) 등의 작용기를 포함하고; 아랄킬(aralkyl)은 톨릴(tolyl) 등의 작용기를 포함하고; 헤테로알킬(heteroalkyl)은 에틸티오펜(ethylthiophene) 등의 작용기를 포함하고; 치환된 헤테로알킬(substituted heteroalkyl)은 3-메톡시-티오펜(3-methoxy-thiophene) 등의 작용기를 포함하고; 알콕시(alkoxy)는 메톡시(methoxy) 등의 작용기를 포함하고; 및 페녹시(phenoxy)는 3-니트로페녹시(3-nitrophenoxy)를 포함한다. 할로(Halo)는 플루오르(fluoro), 클로로(chloro), 아이오도(iodo) 및 브로모(bromo)를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "유효한 양(effective amount)" 및 "충분한 양(sufficient amount)"은 효과가 당업계에 일반적인 기술에 의해 이해되는 것으로 원하는 효과 또는 치료적 효과를 달성하는 양을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명은 하기 화학식(1)의 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
여기서,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 OH 또는 (L)m-D이다;
L은 이중기능성 링커(Bifunctional linker)이다;
D는 하기 화학식과 같은, 캄포테신(camptothecin) 또는 캄포테신 유도체(analog)의 잔기(residue)이다:
;
m은 0 또는 양의 정수이다;
n은 양의 정수이다; 및
R1, R2, R3 및 R4는 모두 OH가 아니다.
A. 캄포테신(CAMPTOTHECIN ) 및 관련된 캄포테신 유도체
캄포테신(Camptothecin)은 중국에서 자생하는 캄포테카 아큐미나타(Camptotheca accuminata) 나무 및 인도에서 자생하는 노타포디트 포에티다(Nothapodytes foetida) 나무에 의해 생산되는 수용성 세포독성 알칼로이드이다. 캄포테신 및 관련된 화합물, 및 이의 유도체들은 잠재적인 항암제 또는 항종양제로 알려져 있고, 시험관내(in vitro) 및 실험동물 내인 생체내(in vivo)에서 치료적 활성이 보여졌다.
캄포테신 및 특정 관련된 유도체는 하기의 구조를 공유한다:
상기 코어구조(core structure)로부터, 몇 개의 공지된 유사물을 제조하였다. 예를 들어, A 고리에 10- 및 11- 위치 중 어느 하나 또는 둘 모두가 OH로 치환될 수 있다. 또한, A 고리는 직쇄 또는 분지형 C1 -30 알킬 또는 C1 -17 알콕시로 치환될 수 있고, 선택적으로 - O 또는 -S 등의 헤테로원자(heteroatom)에 의해 고리에 연결될 수 있다. B 고리는 7- 위치에 직쇄 또는 분지형 C1 -30 알킬(바람직하게 C2 알킬), C5 -8 사이클로알킬, C1 -30 알콕시, 페닐 알킬(phenyl alkyl) 등, 알킬 카르바메이트(alkyl carbamate), 알킬 카르바지드(alkyl carbazide), 페닐 히드라진 유도체(phenyl hydrazine derivative) 등으로 치환될 수 있다. 다른 치환들이 C, D 및 E 고리에서 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 5,004,758; 4,943,579; RE 32,518에서 보는 바와 같고, 이는 본 발명의 참고문헌으로 통합된다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 10-히드록시-캄포테신(10-hydroxy-camptothecin), 11-히드록시캄포테신(11-hydroxycamptothecin) 및 10,11-디히드록시캄포테신(10,11-dihydroxycamtothecin) 유도체는 캄포테카 아큐미나타(C. Acuminata) 및 이의 동족체에서 최소의 성분 중 하나로서 자연적으로 발생한다. 상기 화합물에 7-알킬-, 7-치환된 알킬-, 7-아미노-, 7-아미노알킬(aminoalkyl)-, 7-아랄알킬(aralkyl)-, 9-알킬-, 9-아랄알킬- 캄포테신 유도체 등의 추가적인 치환은 과도한 실험 없이 알려진 합성 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 일부 캄포테카 알카로이드(camptotheca alkaloid)는 하기 화학식(2)의 구조를 가진다:
상기 화학식(2)에 있어서, R7은 NO2, NH2, N3, 수소, 할로겐(halogen)(F, Cl, Br, I), COOH, OH, O-C1 -8 알킬, SH, S-C1 -3 알킬, CN, CH2NH2, NH-C1 -3 알킬, CH2-NH-C1-3 알킬, N(C1 -3 알킬)2, CH2N(C1 -3 알킬), O-, NH- 및 S-CH2CH2N(CH2CH2OH)2,, O-, NH- 및 S-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2, O-, NH- 및 S-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2, O-, NH- 및 S-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH2)2, O-, NH- 및 S-CH2CH2N(C1 -3 알킬)2, O-, NH- 및 S-CH2CH2CH2N(C1-3 알킬)2, CHO 및 C1 -3 알킬 중 어느 하나이다.
상기 화학식(2)에 있어서, R8은 H, C1 -8 알킬(바람직하게 C2) 또는 CH2NR9R10가 될 수 있고, 여기서
(a) R9 및 R10은 각각 수소, C1 -6 알킬, C3 -7 사이클로알킬(cycloalkyl), C3 -7 사이클로알킬-C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 히드록시-C1 -6 알킬, 또는 C1 -6 알콕시-C1 -6 알킬일 수 있다; 대안으로
(b) R9는 수소, C1 -6 알킬, C3 -7 사이클로알킬(cycloalkyl), C3 -7 사이클로알킬-C1-6 알킬, C2 -6 알케닐, 히드록시-C1 -6 알킬 또는 C1 -6 알콕시-C1 -6 알킬일 수 있고, R10은 -COR11일 수 있으며, 여기서 R11이 수소, C1 -6 알킬, 퍼할로(perhalo)-C1 -6 알킬, C3-7 사이클로알킬, C3 -7 사이클로알킬-C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 히드록시-C1 -6 알킬, C1-6 알콕시 또는 C1 -6 알콕시-C1 -6 알킬일 수 있다; 또는
(c) R9 및 R10은 질소원과 함께 O, S 또는 NR12기를 포함하는 포화된 3-7원 헤테로고리(heterocyclic ring)를 형성하고, 여기서 R12는 수소, C1 -6 알킬, 퍼할로-C1 -6 알킬, 아릴(aryl), 또는 C1 -6 알킬, 할로겐, 니트로(nitro), 아미노(amino), C1 -6 알킬아미노(alkylamino), 퍼할로-C1 -6 알킬, 히드록시-C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, C1 -6 알콕시-C1 -6 알킬 및 COR13로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기로 치환된 아릴이며, 여기서 R13은 수소, C1 -6 알킬, 퍼할로-C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, 아릴, 또는 C1 -6 알킬, 퍼할로-C1 -6 알킬, 히드록시-C1 -6 알킬 및 C1 -6 알콕시-C1 -6 알킬기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기로 치환된 아릴이다;
R110-R111은 각각 독랍적으로 수소, 할로(halo), 아실(acyl), 알킬(예를 들어, C1-6 알킬), 치환된 알킬, 알콕시(예를 들어, C1 -6 알콕시), 치환된 알콕시, 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 사이클로알킬(cycloalkyl), 하이드록실(hydroxyl), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아지도(azido), 아미도(amido), 히드라진(hydrazine), 아미노, 치환된 아미노(예를 들어, 모노알킬아미노 및 디알킬아미노), 히드록시카르보닐(hydroxycarbonyl), 알콕시카르보닐(alkoxycarbonyl), 알킬카르보닐옥시(alkylcarbonyloxy), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 카르바모일옥시(carbamoyloxy), 아릴설포닐옥시(arylsulfonyloxy), 알킬설포닐옥시(alkylsulfonyloxy), -C(R117)=N-(O)j-R118, R119C(O)O- 및 R120-O-(CH2)k-로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 여기서 R117은 H, 알킬, 알케닐, 사이클로알킬 또는 아릴이고, j는 0 또는 1이며, R118은 H, 알킬, 알케닐, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클(heterocycle), R119C(O)O-이며, R119는 할로겐, 아미노, 치환된 아미노, 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클이며, k는 1-10의 정수이고, R120은 알킬, 페닐(phenyl), 치환된 페닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클이다; 또는
R7와 R110이 함께, 또는 R110와 R111이 함께 치환 또는 비치환된 메틸렌디옥시(methylenedioxy), 에틸렌디옥시(ethylenedioxy) 또는 에틸렌옥시(ethyleneoxy)를 형성한다; 및
R112은 H 또는 OR'이고, 여기서 R'는 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 할로알킬(haloalkyl) 또는 히드록시알킬(hydroxyalkyl)이다.
바람직한 아릴기는 페닐(phenyl) 및 나프틸(naphthyl)이다. R9 및 R10이 질소원과 함께 적합한 헤테로고리환을 형성할 때, 이는 아지리딘(aziridine), 아제티딘(azetidine), 피롤리딘(pyrrolidine), 피페리딘(piperidine), 헥사메틸렌이민(hexamethylenimine), 이미다졸리딘(imidazolidine), 피라졸리딘(pyrazolidine), 이소옥사졸리딘(isoxazolidine), 피페라진(piperazine), N-메틸피페라진(N-methylpiperazine), 테트라하이드로아제핀(tetrahydroazepine), N-메틸-테트라하이드로아제핀(N-methyl-tetrahydroazepine) 또는 티오아졸리딘(thiazolidine) 등을 포함한다. 접합 후, 남은 캄포테신 유도체는 비접합된 화합물의 잔기로 여겨진다.
설명의 용이함을 위해, 본 발명은 바람직한 실시예의 화합물로서 캄포테신 유도체로서 7-에틸-10-히드록시캄포테신(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin)을 언급하나, 본 발명의 내용이 이에 한정되지 않는다. 본 발명은 모든 유도체, 및 고분자(polymer)에 대한 접합지점에 20-OH 등의 OH기를 가지는 동족체라면 모든 동족체를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 캄포테신 또는 캄포테신 유도체는 라세미 혼합물(racemic mixture) 또는 광학적 순수 이성체(pure isomer)가 될 수 있다. 바람직하게, 20(S) 캄포테신 또는 캄포테신 유도체 등의 상당히 순수하고 활성이 있는 제형은 다분지형 고분자 전구약물에 적용된다.
B. 이중기능성 링커( BIFUNCTIONAL LINKERS )
본 발명의 바람직한 측면에 있어서, L은 아미노산의 잔기이다. 알려진 자연 발생 L-아미노산으로부터 선택될 수 있는 상기 아미노산은 예를 들어 알라닌(alanine), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 트립토판(tryptophan), 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 라이신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 프롤린(proline), 및/또는 이의 조합이다. 대안적인 측면에서, L은 펩티드 잔기(peptide residue)가 될 수 있다. 상기 펩티드의 크기는 예를 들어 약 2 내지 10개의 아미노산 잔기의 범위일 수 있다.
당업계에 알려진 비-자연 발생적인 아미노산(D 또는 L), 소수성 또는 비-소수성뿐만 아니라 자연 발생적인 아미노산의 유도체 및 동족체도 역시 본 발명의 범위 내일 수 있다. 간단한 예시로서, 아미노산 유도체 및 동족체는 2-아미노아디픽산(2-aminoadipic acid), 3-아미노아디프산(3-aminoadipic acid), 베타-알라닌(beta-alanine), 베타-아미노프로피온산(beta-aminopropionic acid), 2-아미노부티르산(2-aminobutyric acid), 4-아미노부티르산(4-aminobutyric acid), 피페리딘산(piperidinic acid), 6-아미노카프로산(6-aminocaproic acid), 2-아미노헵타논산(2-aminoheptanoic acid), 2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid), 3-아미노이소부티르산(3-aminoisobutyric acid), 2-아미노피멜릭산(2-aminopimelic acid), 2,4-아미노부티르산(2,4-aminobutyric acid), 데스모신(desmosine), 2,2-디아미노피멜릭산(2,2-diaminopimelic acid), 2,3-디아미노프로피온산(2,3-diaminopropionic acid), N-에틸글리신(N-ethylglycine), N-에틸아스파라긴(N-ethylasparagine), 3-히드록시프롤린(3-hydroxyproline), 4-히드록시프롤린(4-hydroxyproline), 이소데스모신(isodesmosine), 알로-이소류신(allo-isoleucine), N-메틸글리신(N-methylglycine), 사르코신(sarcosine), N-메틸-이소류신(N-methyl-isoleucine),6-N-메틸-라이신(6-N-methyl-lysine), N-메틸발린(N-methylvaline), 노르발린(norvaline), 노르류신(norleucine), 오르니틴(ornithine), 및 본 발명의 참고문헌으로 통합된 63 Fed. Reg., 29620, 29622에 기재된 다른 많은 것들을 포함한다. 바람직한 L기는 글라이신(glycine), 알라닌(alanine), 메티오닌(methionine) 또는 사르코신(sarcosine)의 잔기를 포함한다. 더 바람직하게, 본 발명의 화합물은 링커기(linker group)(L)로서 글리신 잔기를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 캄포테신 유도체 및 고분자(polymer) 사이 접합 후 L은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
-[C(O)]vNR21 (CR22R23O)t- ,
-[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24R25)yO- ,
-[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24R25)y- ,
-[C(O)]vNR21(CR22R23)tO- ,
-[C(O)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR25O)yNR26- ,
-[C(O)]vO(CR22R23)tNR26- ,
-[C(O)]vO(CR22R23)tO- ,
-[C(O)]vNR21(CR22R23)tNR26- ,
-[C(O)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR25O)y- ,
-[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24CR25)yNR26- ,
,
,
및
,
여기서:
R21-R26은 각각 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐(alkynyl), C3 -19 가지난 알킬(branched alkyl), C3 -8 사이클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2-6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬(aralkyl), C1 -6 헤테로알킬(heteroalkyl), 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 페녹시(phenoxy) 및 C1 -6 헤테로알콕시(heteroalkoxy)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다;
R27은 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 분지 알킬, C3 -8 사이클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 페녹시, C1 -6 헤테로알콕시, NO2, 할로알킬(haloalkyl) 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다;
t 및 y는 각각 약 1 내지 4에서 선택된 양의 정수이다; 및
v는 0 또는 1이다.
본 발명의 바람직한 측면에 있어서, 상기 화합물은 1 단위(unit)의 이중기능성 링커를 포함하고, 따라서 m은 1이다.
추가적인 링커들은 Greenwald 등(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1998, 6:551-562)의 표 1에서 발견되고, 상기 내용은 본 발명의 참고문헌으로 통합된다.
C. 다분지형 고분자( MULTI - ARM POLYMERS )
다분지형(Multi-arm) PEG는 NOF Corp. Drug Delivery System catalog, Ver. 8, April 2006에 기재되어 있고, 상기 기재는 본 발명의 참고문헌으로 통합된다. 특히 바람직한 다분자형 PEG는 하기의 구조를 가진다:
,
여기서 n은 양의 정수이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 고분자(polymer)에 대한 중합도(n)는 약 5,000 Da 내지 60,000 Da의 총 분자량을 가지는 고분자를 제공하기 위해 약 28 내지 341이고, 바람직하게는 약 20,000 Da 내지 40,000 Da의 총 분자량을 가지는 고분자를 제공하기 위해 약 114 내지 227이다. 이는 고분자 사슬에서 반복되는 단위의 수를 나타내고, 고분자의 분자량에 의존한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, n은 약 227이다.
D. 전구약물의 합성( SYNTHESIS OF PRODRUGS )
일반적으로, 본 발명의 전구약물은 활성화된 다분지형 고분자 1 당량 이상과, 아미노기(amino group)가 고분자의 카르복실산(carboxylic acid)과 반응하여 연쇄(linkage)를 형성하는 것을 효율적으로 유발시키기에 충분한 조건하에서 캄포테신-아미노산 접합체의 활성 부위 1 당량 이상을 반응시킴으로써 제조된다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 하기를 포함할 수 있다:
1) 유용한 20-하이드록실기(20-hydroxyl group)를 포함하는 캄포테신 또는 캄포테신 유도체 1 당량, 및 유용한 카르복실산기(carboxylic acid group)를 포함하는 이중기능성 링커 1 당량 이상을 제공하기;
2) 1,(3-디메틸 아미노프로필) 3-에틸 카르보디이미드[1,(3-dimethyl aminopropyl) 3-ethyl carbodiimide(EDC)] 또는 PPAC{또는 1,3-디이소프로필카르보디이미드(1,3-diisopropylcarbodiimide)(DIPC), 적절한 디알킬 카르보이미드(dialkyl carbodiimide), 무카이야마 시약(Mukaiyama reagent)[예를 들어, 2-할로-1-알킬-피리디늄 할라이드(2-halo-1-alkyl-pyridinium halides)] 또는 프로판 포스포늄산 고리형 무수물(propane phosphonic acid cyclic anhydride(PPACA) 등}와 같은 커플링 시약(coupling reagent), 및 DMAP와 같은 적절한 염(base)의 존재하에, DCM[또는 DMF, 클로로포름(chloroform), 톨루엔(toluene) 또는 이의 혼합물]과 같은 불활성 용매(inert solvent)에서, 캄포테신 이중기능성 링커 중간체(intermediate)를 형성하도록 상기 1)의 두 반응물을 반응시킴; 및
3) 0 ℃ 내지 22 ℃의 실온에서, 시그마 케미컬(Sigma Chemical)과 같은 상업적 제조업자로부터 이용가능하거나 알려진 기술을 이용하여 합성되는 1,(3-디메틸 아미노프로필) 3-에틸 카르보디이미드(EDC) 또는 PPAC{또는 1,3-디이소프로필카르보디이미드(DIPC), 적절한 디알킬 카르보이미드, 무카이야마 시약(예를 들어, 2-할로-1-알킬-피리디늄 할라이드) 또는 프로판 포스포늄산 고리형 무수물(PPACA) 등}과 같은 커플링 시약, 및 DMAP와 같은 적절한 염의 존재하에, DCM[또는 DMF, 클로로포름, 톨루엔 또는 이의 혼합물]과 같은 불활성 용매에서, PEG-산과 같은 활성화된 고분자 1 당량과 아민기를 가지는 상기 2)의 결과물인 중간체의 각각의 활성 부위(실시예에서, 2 eq.) 1 당량 이상을 반응시킴.
바람직한 측면에 있어서, 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 10-하이드로일기(hydroyl group)는 상기 단계 1) 이전에 보호된다.
7-에틸-10-히드록시캄포테신의 10-히드록시기와 같은 캄포테신 또는 캄포테신 유도체의 OH기에 대한 방향족 보호기(Aromatic protecting group)는 7-에틸-10-히드록시캄포테신 중간체가 보다 높은 용해도를 가지고, 효과적이고 유효하게 고도로 순수한 형태로 정제될 수 있기 때문에 선호된다. 예를 들어, TBDPSCl, TBDMSCl 및 TMSCl와 같은 실릴-포함 보호기(silyl-containing protecting group)는 캄포테신 또는 캄포테신 유도체의 10-히드록시기를 보호하는데 사용될 수 있다.
1-4 말단 카르복실산기(1-4 terminal carboxyl acid group)를 포함하는 고분자 등의 활성화된 고분자는, 예를 들어 당업계에 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 말단 OH기를 가지는 NOF Sunbright형 또는 다른 분지형 고분자를 대응하는 카르복실산 유도체로 전환함으로써 제조될 수 있다. 이는 본 발명의 참고문헌으로 통합된, 미국 등록특허 5,605,976뿐만 아니라 본 발명의 실시예 1-2에 기재되어 있다.
상기 첫 번째 및 두 번째 커플링시약은 같거나 다를 수 있다.
이중기능성 링커기의 예시로는 보여주는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 메티오닌(methionine), 사르코신(sarcosine) 등을 포함하고, 이의 합성(synthese)은 실시예에서 보여준다. 대안적이고 특이적인 합성은 실시예에서 제공된다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 하기 중 어느 하나와 같다:
특히 바람직한 화합물은 하기와 같다:
여기서, 4개의 분지형 고분자는 모두 글리신을 통해 7-에틸-10-히드록시캄포테신에 접합된다. 본 발명과 관련하여 제조된 화합물의 HPLC 분석은 평균적으로 4개의 7-에틸-10-히드록시캄포테신 분자가 한 개의 PEG 분자에 접합된다(분자량의 4%).
E. 조성물( COMPOSITIONS )/제형( FORMULATIONS )
본 발명의 고분자 접합체를 포함하는 약학적 조성물은 예를 들어, 많은 잘 알려진 혼합(mixing), 용해(dissolving), 과립화(granulating), 갈기(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화(encapsulating), 포획화(entrapping) 또는 감압하 동결건조화(lyophilizing) 공정와 같은 당업계에 잘 알려진 공정에 의해 제조될 수 있다. 상기 조성물은 활성 화합물을 약학적으로 이용될 수 있는 것으로 제조하는 공정을 촉진하는 첨가제 및 보조제를 포함하는 생리학적으로 허용가능한 담체를 하나 이상 함께 제형될 수 있다. 적합한 제형은 선택한 투여 경로에 의존한다. 비경구 투여는 본 발명의 많은 측면에서 바람직하다.
정맥, 근육 내 및 피하 주사를 포함하나 이에 한정되지 않는 주사의 경우, 본 발명의 화합물은 수용액으로, 바람직하게 생리 식염수 완충용액 또는 피롤리딘(pyrrolidone) 또는 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 포함하나 이에 한정되지 않는 극성 용매와 같은 생리학적으로 호환가능한 완충 용액으로 제형될 수 있다. 또한, 상기 화합물은 예를 들어, 볼루스(bolus) 주사 또는 연속적인 인퓨전(infusion) 등의 비경구 투여용으로 제형될 수 있다. 주사용 제형은 예를 들어, 앰플(ampoule) 또는 수회 사용 가능 용기(multi-dose container) 등의 단위 투여량 형태로 존재된다. 유용한 조성물은 유성 또는 수성 부형제에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼(emulsion)를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 침전 방지제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 부가물이 포함될 수 있다. 비경구 투여용 약학적 조성물은 활성 화합물의 염(바람직함)과 같은 수용성 형태의 수성 용액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가적으로, 상기 활성 화합물의 현탁액은 지방 친화성 부형제로 제조될 수 있다. 적절한 지방 친화성 부형제는 참기름과 같은 지방성 오일, 에틸올레이트(Ethyl Oleate)와 같은 합성 지방산 에스테르 및 트리글리세리드(triglyceride)를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 카르복시메틸셀룰로오스나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 솔비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점성(viscosity)을 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 또한, 선택적으로 현탁액은 적절한 안정제, 및/또는 고농도의 용액을 제조하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 대안으로, 활성 성분은 사용 전에 살균 및 발열성 물질 무함유 물(pyrogen-free water) 등의 적절한 부형제와 함께 구성하는 분말 형태일 수 있다.
경구 투여용으로, 화합물은 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 결합함으로써 제형될 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 화합물이 환자에 의한 경구 섭취용으로, 정제(tablet), 환약(pill), 마름모꼴 정제(lozenge), 당의정(dragee), 캡슐(capsule), 액제(liquid), 젤(gel), 시럽(syrup), 페이스트(paste), 슬러리(slurry), 용액, 현탁액, 농축액, 및 환자의 음료수에 희석하기 위한 현탁액으로 제형될 수 있다. 경구용 약학적 조성물은 타블렛 또는 드라제 코어(dragee core)를 획득하기 위해, 원하면 다른 적절한 보조제를 첨가한 후, 고형 첨가제, 선택적으로 분쇄 결과 혼합물(grinding resulting mixture), 및 미립(granule)의 공정 혼합물이 제조될 수 있다. 유용한 첨가제는 락토오즈(lactose), 슈크로즈(sucrose), 만니톨(mannitol) 또는 솔비톨(sorbitol)을 포함하는 당과 같은 충전제(filler), 옥수수 전분, 밀가루 전분, 쌀 전분 및 감자 전분과 같은 셀룰로오즈 조제품(cellulose preparation), 및 젤라틴(gelatin), 껌트래거캔스(gum tragacanth), 메틸 셀룰로오즈(methyl cellulose), 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈(hydroxypropyl methylcellulose), 나트륨 카르복시 메틸셀룰로오즈(sodium carboxy methylcellulose), 및/또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone; PVP)과 같은 기타 물질을 포함한다. 원한다면, 가교결합된(cross-linked) 폴리비닐피롤리돈, 아가(agar), 또는 알긴산(alginic acid)과 같은 붕해제(disintegrating agent)가 첨가될 수 있다.
흡입(inhalation)에 의한 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 가압된 팩(pressurized pack)을 이용하여 에어로졸 스프레이(aerosol spray), 분무기(nebulizer) 및 적절한 추진제(propellant)의 형태로 용이하게 전달될 수 있다.
또한, 화합물은 코코아 버터(cocoa butter) 또는 기타 글리세리드(glyceride) 등을 이용한 좌약(suppository) 또는 관장약(retention enema)와 같은 직장 투여 조성물로 제형될 수 있다.
상기 기재된 제형에 추가적으로, 화합물은 데포(depot) 제제로서 제형될 수 있다. 이런 장시간 활성 제형(long acting formulation)은 이식(예를 들어, 피하로 또는 근육 내로) 또는 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 예를 들어 약리학적으로 허용가능한 오일을 포함한 유제에서 고분자(polymeric) 또는 소수성(hydrophobic) 물질로, 이온 교환 수지로, 또는 약간의 용해성 염과 같은 약간의 용해성 유도체로서 상기 투여 경로용으로 제형될 수 있다.
또한, 리포솜(liposome) 및 유제(emulsion)와 같은 다른 전달 시스템이 이용될 수 있다.
추가적으로, 화합물은 치료제를 포함하는 고형 소수성 고분자(solid hydrophobic polymer)의 반영구적 매트릭스(semi-permeable matrix)와 같은 서방형 시스템(sustained release system)을 이용하여 전달될 수 있다. 다양한 서방형 물질은 공지되어 있고, 당업자에게 잘 알려져 있다. 서방형 캡슐은 이들의 화학적 특성에 의존하고, 몇 주 내지 100일에 걸친 동안 화합물을 분비할 수 있다. 특정 화합물의 화학적 특성 및 생물학적 안정성에 따라, 추가적인 안정성 전략이 적용될 수 있다.
F. 투약량( DOSAGES )
치료학적으로 유효한 양은 본 발명의 화합물이 캄포테신 또는 관련 유도체인 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 영향을 받기 쉬운 상태를 경감 또는 개선하기에 유효한 양을 의미한다. 치료학적으로 유효한 양의 결정은 특히 본 발명과 관련된 당업자의 능력 내에서 능숙하다.
본 발명의 방법에 사용된 화합물에 관하여, 치료학적으로 유효한 양은 생체 내(in vitro) 분석으로부터 추정될 수 있다. 그때, 투약량은 유효한 투약량을 포함하는 순환 농도 범위(circulating concentration range)를 획득하기 위하여 동물 모델에서의 사용을 위해 제형될 수 있다. 상기 정보는 환자에서 유용한 투약량을 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 물론, 투약량은 투약 형태 및 투약 경로에 따라 다양할 수 있다. 정확한 공식, 투약 경로 및 투약량은 환자의 상태에 비추어서 각 의사에 의해 선택될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 본 발명의 화합물의 전신 전달(systemic delivery)을 위한 현재 바람직한 투여량 범위는 약 1 내지 100 mg/kg/week일 수 있으며, 바람직하게 약 2 내지 60 mg/kg/week일 수 있다.
조성물은 하루에 한 번, 또는 여러 주 치료 프로토콜(multi-week treatment protocol)의 일부로서 주어질 수 있는 수 회 투약으로 나누어질 수 있다. 정확한 투약량은 당업자에 의해 통찰되는 바와 같이, 건강 상태의 단계 및 심각성, 고분자 전구약물 조성물에 대한 종양의 감수성, 및 치료받는 환자의 개별 특성에 의존할 것이다.
G. 치료 방법( METHODS OF TREATMENT )
본 발명에 있어서, D가 캄포테신 유도체 등의 생물학적 활성 부분인 화학식(1)의 본 발명의 화합물을 원하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 포유류를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 측면에 있어서, 상기 D는 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 잔기이다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류에서 다양한 의학적 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 다른 것들도 있지만, 포유류에서 종양의 질환(Neoplastic disease)의 치료, 종양 존재량(tumor burden)의 감소, 종양의 전이 예방, 및 종양/신생물의 성장의 재발 방지에 유용하다. 대안적인 측면에서, 상기 치료되는 암은 하기 중 하나 이상일 수 있다: 고형암(solid tumor), 림프종(lymphomas), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia(ALL)), 췌장암(pancreatic cancer), 교아세포종(glioblastoma), 난소암(ovarian cancer) 및 위암(gastric cancer) 등.
투여되는 전구약물 등으로 사용되는 조성물의 양은 이에 포함된 모분자(parent molecule)에 의존할 것이다. 일반적으로, 치료 방법에 사용되는 전구약물의 양은 포유류에서 원하는 치료적 결과를 효과적으로 달성하는 양이다. 당연히, 다양한 전구약물 화합물의 투약량은 모(parent) 화합물, 생체 내 가수분해의 비율, 고분자의 분자량 등에 의존한다. 일반적으로, 캄포테신의 고분자 에스테르 유도체 및 관련된 조성물은 약 1 내지 100 mg/kg/week, 바람직하게는 약 2 내지 60 mg/kg/week 범위의 양으로 투여된다. 상기 기재된 범위는 예시적이고, 당업자는 임상적 경험 및 치료 지표를 기초로 선별된 전구약물의 최적의 투약량을 결정할 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서는, 치료 방법은 본 발명에 기재된 화합물의 유효한 양을 토포이소머라제 간섭(topoisomerase interference)에 의해 치료될 수 있는 상태로 고통받는 포유류 또는 원하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
하기의 실시예는 본 발명의 더 나은 이해를 위해 제공되나 본 발명의 유효한 범위를 한정하는 것은 아니다. 실시예에서 기재된 밑줄쳐지고 굵은 글씨체의 숫자는 도면 1 내지 5에서 보여주는 것에 상응하는 것이다.
일반적인 절차. 모든 반응은 건조한 질소 또는 아르곤의 대기하에서 수행되었다. 상업적 시약은 추가적인 정제 없이 사용되었다. 모든 PEG 화합물은 사용 전에 진공 하에서 또는 톨루엔 유래 공비증류(azeotropic distillation)에 의해 건조되었다. 13C NMR 분광(spectra)은 명세서에 다른 기재가 없다면, Varian Mercury ®300 NMR 분광계(spectrometer)를 이용하여 75.46 MHz에서 획득되었고, 용매로서 크로로포름 및 메탄올이 중수소화되었다. 화학적 이동(Chemical shift)(δ)은 테트라메틸살린(tetramethylsilane; TMS)으로부터 다운필드된 100만(ppm) 당 부분으로 보고되었다.
HPLC 방법. 반응 혼합물, 및 중간 및 최종 산물의 순도는 Beckman Coulter System Gold® HPLC 기구에 의해 모니터되었다. 상기 기구는 다중파장 UV 검출기(multiwavelength UV detector)를 포함한 ZOBAX® 300SB C8 역상 컬럼(150 x 4.6 mm) 또는 Phenomenex Jupiter® 300A C18 역상 컬럼(150 × 4.6 mm)을 이용하고, 1 mL/min의 흐름률에서 0.05 % 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)에서 아세토니트릴(acetonitrile)의 10 내지 90%의 농도구배를 이용한다.
실시예 1. 40 k 4arm - PEG - tBu 에스테르(화합물 2):
40k 4arm-PEG-OH(12.5 g, 1 eq.)를 35 mL의 톨루엔/물을 제거하기 위해 220 mL의 톨루엔과 공비혼합물화 하였다. 상기 용액을 30℃에서 냉각하였고, t-부탄올(3.75 mL, 3eq x 4 = 12 eq.)에서 1.0 M 칼륨 t-부톡시드(potassium t-butoxide)를 첨가하였다. 상기 혼합물은 30분 동안 30℃에서 교반한 다음, t-부틸 브로모아세트산(t-butyl bromoacetate)(0.975 g, 4 eq. x 4 = 16 eq.)을 첨가하였다. 상기 반응은 1시간 동안 30℃에서 방치한 다음, 25℃로 냉각하였다. 150 mL의 에테르(ether)를 산물을 침전시키기 위해 천천히 첨가하였다. 상기 결과물인 현탁액을 30분 동안 17℃로 냉각하였고, 30분 동안 17℃에서 방치하였다. 조생성물(crude product)을 여과하였고, 웨트 케이크(wet cake)를 에테르로 두 번(2 x 125 mL) 세척하였다. 상기 분리된 웨트 케이크를 50 ml의 DCM에 용해시켰고, 산물은 350 ml의 에테르로 침전시킨 후, 여과하였다. 상기 웨트 케이크를 에테르로 두 번(2 x 125 mL) 세정하였다. 상기 산물을 40℃에서 진공 하에서 건조하였다(수율 = 98%, 12.25 g). 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3): δ27.71, 68.48-70.71(PEG), 80.94, 168.97.
실시예 2. 40k 4 arm - PEG 산(화합물 3):
40k 4arm-PEG-tBu 에스테르(화합물 2, 12 g)를 120 mL의 DCM에 용해시킨 다음, 60 mL의 TFA를 첨가하였다. 상기 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반한 다음, 용매를 35℃에서 진공 하에서 제거하였다. 상기 결과물인 오일 잔류물을 37.5 mL의 DCM에 용해시켰다. 조생성물을 375 mL의 에테르로 침전시켰다. 웨트 케이크를 30 mL의 0.5% NaHCO3에 용해시켰다. 상기 산물을 DCM으로 두 번(2 x 150 ml) 추출하였다. 화합된 유기층(organic layer)을 2.5 g의 MgSO4 상에서 건조하였다. 용매를 실온에서 진공 하에서 제거하였다. 상기 결과물인 잔류물을 37.5 mL의 DCM에 용해시켰고, 산물을 300 mL의 에테르로 침전시킨 다음 여과하였다. 웨트 케이크를 에테르로 두 번(2 x 125 ml) 세척하였다. 상기 산물을 40℃에서 진공 하에서 건조하였다(수율 = 90%, 10.75 g). 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3): δ67.93-71.6(PEG), 170.83.
실시예 3. TBDPS -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )(화합물 5):
100 mL의 무수 DCM 내 7-에틸-10-히드록시캄포테신(화합물 4, 2.0 g, 5.10 mmol, 1 eq.)의 현탁액에 Et3N(4.3 mL, 30.58 mmol, 6 eq.) 및 TBDPSCl(7.8 mL, 30.58 mmol, 6 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류를 위해 밤새 가열한 다음, 0.2 N HCl 용액(2 x 50 mL), 포화된 NaHCO3 용액(100 mL) 및 식염수(100 mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조하였고, 여과한 후, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔유물을 무수 DCM에 용해시켰고, 헥산의 첨가에 의해 침전시켰다. DCM/헥산에 의한 침전은 과다한 TBDPSCl의 제거를 위해 반복하였다. 고체를 2.09 g의 산물을 획득하기 위해 여과 및 진공 하에서 건조하였다(65% 수율). 1H NMR(300 MHz, CDCl3): δ 0.90(3 H, t, J = 7.6 Hz), 1.01(3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.17(9H, s), 1.83-1.92(2H, m), 2.64(2H, q, 6.9 Hz), 3.89(1 H, s, OH), 5.11(2H, s), 5.27(1H, d, J = 16.1 Hz), 5.72(1H, d, J = 16.4 Hz), 7.07(2 H, d, J = 2.63 Hz), 7.36-7.49(7 H, m), 7.58(1 H, s), 7.75-7.79(4H, m), 8.05(1 H, d, J = 9.4 Hz). 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3): δ7.82, 13.28, 19.52, 22.86, 26.48, 31.52, 49.23, 66.25, 72.69, 97.25, 110.09, 117.57, 125.67, 126.57, 127.65, 127.81, 130.02, 131.69, 131.97, 135.26, 143.51, 145.05, 147.12, 149.55, 149.92, 154.73, 157.43, 173.72.
실시예 4. TBDPS -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(20)- Gly - Boc (화합물 6): 100 mL의 무수 DCM 내 TBDPS-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)(화합물 5, 3.78 g, 5.99 mmol, 1 eq.) 및 Boc-Gly-OH(1.57 g, 8,99 mmol, 1.5 eq.)의 0℃ 용액에 EDC(1.72 g, 8.99 mmol, 1.5 eq.) 및 DMAP(329 mg, 2.69 mmol, 0.45 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 HPLC가 개시 물질의 완벽한 소실을 보여줄 때까지 0℃에서 고반하였다(약 1시간 45분). 유기층을 0.5% NaHCO3 용액(2 x 50 mL), 물(1 x 50 mL), 0.1 N HCl 용액(2 x 50 mL) 및 식염수(1 x 50 mL)로 세척하였고; MgSO4 상에서 건조하였다. 여과 및 진공 하에서 증발시킨 후, 4.94 g의 조생성물을 획득하였다(정량적 수율). 조고체(crude solid)는 추가적인 정제 없이 다음 반응에 사용하였다. 1H NMR(300 MHz, CDCl3): δ0.89(3 H, t, J = 7.6 Hz), 0.96(3 H, t, J = 7.5 Hz), 1.18(9H, s), 1.40(9H, s), 2.07-2.29(3H, m), 2.64(2H, q, 7.5 Hz), 4.01-4.22(2H, m), 5.00(1 H, br s), 5.01(2H, s), 5.37(1H, d, J = 17.0 Hz), 5.66(1H, d, J = 17.0 Hz), 7.08(1 H, d, J = 2.34 Hz), 7.16(1H, s), 7.37-7.50(7 H, m), 7.77(4H, d, J = 7.6 Hz), 8.05(1 H, d, J = 9.4 Hz). 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3): δ7.52, 13.30, 19.50, 22.86, 26.45, 28.21, 31.64, 42.28, 49.14, 67.00, 76.65, 79.96, 95.31, 110.13, 118.98, 125.75, 126.45, 127.68, 127.81, 130.03, 131.54, 131.92, 135.25, 143.65, 144.91, 145.19, 147.08, 149.27, 154.75, 155.14, 157.10, 166.98, 169.17.
실시예 5. TBDPS -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(20)- Gly · HCl (화합물 7):
5 mL 무수 디옥산(dioxane) 내 TBDPS-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(20)-Gly-Boc(화합물 6, 1 g, 1.27 mmol)의 용액에 디옥산 내 4 M 용액의 HCl 5 mL를 첨가하였다. 반응 혼합물을 HPLC가 개시 물질의 완벽한 소실을 보여줄 때까지 실온에서 교반하였다(약 1시간). 반응 혼합물을 50 mL의 에틸 에테르에 첨가한 후, 결과물인 고체를 여과하였다. 상기 고체를 50 mL DCM에 용해시켰고, 식염수(pH는 포화된 NaHCO3 용액의 첨가에 의해 2.5로 조절하였다)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조하였고, 여과 및 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔유물을 5 mL의 DCM에서 용해시켰고, 50 mL의 에틸 에테르에 첨가하여 침전시켰다. 여과는 770 mg(84% 수율) 최종 산물을 획득하였다. 1H NMR(300 MHz, CDCl3): δ0.84(3 H, t, J = 7.6 Hz), 1.05(3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.16(9H, s), 2.15-2.30(3H, m), 2.59(2H, q, 7.6 Hz), 4.16(1H, d, J = 17.9 Hz), 4.26(1H, d, J = 17.9 Hz), 5.13(2H, s), 5.46(1H, d, J = 17.0 Hz), 5.60(1H, d, J = 17.0 Hz), 7.11(1 H, d, J = 2.34 Hz), 7.30(1H, s), 7.40-7.51(6 H, m), 7.56(1H, dd, J = 2.34, 9.4 Hz), 7.77(4H, dd, J = 7.6, 1.6 Hz), 7.98(1 H, d, J = 9.1 Hz). 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3): δ8.09, 13.72, 20.26, 23.61, 26.94, 31.83, 41.01, 50.71, 67.62, 79.51, 97.03, 111.65, 119.69, 127.13, 128.97, 128.99, 129.11, 131.43, 131.96, 133.00, 133.03,136.51, 145.62, 145.81, 147.24, 148.29, 150.58, 156.27, 158.68, 167.81, 168.34.
실시예 6. 40k 4 arm - PEG - Gly -(20)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(10)- TBDPS (화합물 8):
14 mL의 무수 DCM 내 40k 4arm-PEGCOOH(화합물 3, 1.4 g, 0.036 mmol, 1 eq.)의 용액에 TBDPS-(10)-(7-에틸-10-하이드록시캄포테신)-(20)-Gly·HCl(화합물 7, 207 mg, 0.29 mmol, 활성 부위당 2.0 eq.), DMAP(175 mg, 1.44 mmol, 10 eq.) 및 PPAC(EtOAc 중 0.85 mL의 50% 용액, 1.44 mmol, 10 eq.)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 결과물인 잔류물을 DCM에 용해시킨 후, 산물을 에테르에 침전시킨 다음, 여과하였다. 상기 잔류물을 DMF/IPA로 재결정하여 그의 산물(1.25 g)을 획득하였다. 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3): δ7.45, 13.20, 19.39, 22.73, 26.42, 31.67, 40.21, 49.01, 66.83, 95.16, 110.02, 118.83, 125.58, 126.40, 127.53, 127.73, 129.96, 131.49, 131.76, 131.82, 135.12, 143.51, 144.78, 145.13, 146.95, 149.21, 154.61, 156.92, 166.70, 168.46, 170.30.
실시예 7 40k 4 arm - PEG - Gly (20)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )(화합물 9):
화합물 40k 4arm-PEG-Gly-(20)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(10)-TBDPS(화합물 8, 1.25 g)에 THF 및 0.05 M HCl 용액(12.5 mL)의 1:1 혼합물 내 TBAF(122 mg, 0.46 mmol, 4 eq.)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, DCM으로 두 번 추출하였다. 화합된 유기상(organic phase)은 MgSO4 상에서 건조한 후, 여과한 다음, 진공 하에서 증발시켰다. 잔유물을 7 mL의 DMF에 용해시켰고, 37 mL IPA로 침전시켰다. 고체를 여과한 후 IPA로 세척하였다. DMF/IPA로의 침전을 반복하였다. 최종 잔유물을 2.5 mL의 DCM에 용해시켰고, 25 mL의 에테르의 첨가에 의해 침전시켰다. 고체를 여과한 후, 밤새 진공오븐(vacuum oven)에서 40℃로 건조하였다(860 mg). 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3): δ7.48, 13.52, 22.91, 31.67, 40.22, 49.12, 66.95, 94.82, 105.03, 118.68, 122.54, 126.37, 128.20, 131.36, 142.92, 144.20, 144.98, 147.25, 148.29, 156.44, 156.98, 166.82, 168.49, 170.39. 상기 NMR 데이타는 반응한 모든 COOH를 나타내는 PEG-COOH의 신호가 없음을 보여주었다. 형광 검출(fluorescence detection)에 의해 측정된 로딩(loading)은 고분자의 각 4개의 분지에서 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 전체 로딩과 일치하는 3.9가 되는 것을 발견하였다. 보다 큰 범위에서 상기 실험의 반복된 수행은 동일한 결과를 얻었다.
실시예 8. Boc -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )(화합물 10):
N2 하에 실온에서 250 mL의 무수 DCM 내 7-에틸-10-히드록시캄포테신(화합물 4, 2.45 g, 1 eq.)의 현탁액에 디-테르트-부틸-디카보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)(1.764 g, 1.3 eq.) 및 무수 피리딘(pyridine)(15.2 mL, 30 eq.)를 첨가하였다. 상기 현탁액은 밤새 실온에서 교반하였다. 혼탁(hazy) 용액을 셀라이트(celite)를 통해 여과하였고(10 g), 여과액을 0.5 N HCl로 세 번(3 x 150 mL) 및 NaHCO3 포화 용액(1 x 150 ml)으로 세척하였다. 상기 용액을 MgSO4 상에서 건조하였다(1.25 g). 용매는 30℃로 진공 하에서 제거하였다. 상기 산물을 40℃로 진공 하에서 건조하였다(수율 = 82%, 2.525g). 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3): δ 173.53, 157.38, 151.60, 151.28, 150.02, 149.70, 147.00, 146.50, 145.15, 131.83, 127.19, 127.13, 124.98, 118.53, 113.88, 98.06, 84.26, 72.80, 66.18, 49.33, 31.62, 27.73, 23.17, 13.98, 7.90.
실시예 9. Boc -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(20)- Ala - Bsmoc (화합물 11):
0℃에서 무수 CH2Cl2 (20 mL) 내 Boc-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)(화합물 10, 0.85g, 1.71 mmol) 및 Bsmoc-Ala(0.68g, 2.30 mmol)의 용액에 EDC(0.51g, 2.67 mmol) 및 DMAP(0.065g, 0.53 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 N2 하에서 45분 동안 0℃에서 교반한 다음, 실내 온도까지 데웠다. 반응의 완료가 HPLC에 의해 확인되었을 때, 반응 혼합물을 1% NaHCO3(2 x 50 ml), H2O(50 mL) 및 0.1 N HCl(2 x 50 mL)로 세척하였다. 유기상을 무수 MgSO4 상에서 건조한 후 여과하였다. 용매를 감압하에 제거하였다. 상기 결과물인 고체를 95%의 수율로 1.28 g의 산물을 획득하기 위해 밤새 40℃ 이하 진공 하에서 건조하였다. 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3) δ: 171.16,166.83, 157.16, 154.78, 151.59, 151.33, 149.82, 147.17, 146.68, 145.35, 145.15, 139.08, 136.88, 133.60, 131.83, 130.45, 130.40, 130.33, 127.40, 127.08, 125.32, 125.14, 121.38, 120.01, 114.17, 95.90, 84.38, 77.19, 76.64, 67.10, 56.66, 53.45, 49.96, 49.34, 31.7, 27.76, 17.94, 14.02, 7.53. ESI-MS, 786.20 [M + H]+.
실시예 10. Boc -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(20)- Ala (화합물 12):
무수 CH2Cl2(200 ml) 내 Boc-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(20)-Ala-Bsmoc(화합물 11, 4.2 g, 5.35 mmol) 및 4-피페리디노피페리딘(piperidinopiperidine)(1.17g, 6.96 mmol)의 용액을 5시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물을 0.1 N HCl(2 x 40ml)로 세척한 다음, 무수 MgSO4 상에서 유기층을 건조하였다. 상기 용액을 여과한 후, 93%의 수율로 2.8 g의 산물을 획득하기 위해, 용매를 밤새 40℃ 이하 진공 증류에 의해 제거하였다. 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3) δ: 168.39, 166.63, 156.98, 151.20, 151.15, 149.69, 146.67, 146.56, 145.37, 144.53, 131.66, 127.13, 124.99, 119.80, 113.82, 96.15, 84.21, 77.67, 67.16, 49.48, 49.06, 31.56, 27.74, 23.14, 15.98, 13.98, 7.57.
실시예 11. 40k 4 arm - PEG - Ala -(20)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(10)- Boc (화합물 13):
실온에서 무수 CH2Cl2(100 mL)에 Boc-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(20)-Ala(화합물 12, 1.50 g, 2.5 mmol) 및 4armPEG-COOH(화합물 3, 10.01g, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 0℃로 냉각한 후, EDC(0.29g, 1.5 mmol) 및 DMAP(0.30g, 2.5 mmol)가 첨가하였다. 상기 혼합물을 N2 하에서 1시간 동안 0℃에서 교반한 다음, 밤새 실온에서 방치하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 잔유물을 40 mL의 DCM에서 용해시켰고, 조생성물(crude product)을 에테르(300 mL)로 침전시켰다. 여과시킨 결과물인 고체 습윤물(wet solid)을 65℃에서 DMF/IPA(60/240 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 상기 용액을 2 내지 3시간 동안 실온으로 식힌 후, 산물을 침전시켰다. 그런 다음, 고체를 여과한 후, 에테르(2 x 200 mL)로 세척하였다. 웨트 케이크를 8.5 g의 산물을 획득하기 위해 밤새 40℃ 이하 진공 하에서 건조하였다.
실시예 12. 40k 4 arm - PEG - Ala -(20)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )(화합물 14):
실온에서 무수 CH2Cl2 내 30% TFA 용액에 40 k4arm-PEG-Ala-(20)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(10)-Boc(화합물 13, 7.98 g)를 첨가하였다. 용매를 35℃ 진공 하에서 가능한 많이 제거하였다. 잔유물을 50 mL의 DCM에 용해시켰고, 조생성물을 에테르(350 mL)로 침전시킨 후, 여과하였다. 고체 습윤물을 65℃에서 DMF/IPA(50/200 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 상기 용액을 2 내지 3시간 동안 실온으로 식힌 후, 산물을 침전시켰다. 그런 다음, 고체를 여과한 후, 에테르(2 x 200 mL)로 세척하였다. 웨트 케이크를 6.7 g의 산물을 획득하기 위해 밤새 40℃ 이하 진공 하에서 건조하였다. 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3) δ: 170.75, 169.30, 166.65, 157.00, 156.31, 148.36, 147.19, 145.03, 144.29, 143.00, 131.49, 128.26, 126.42, 122.47, 118.79, 105.10, 94.57, 78.08, 77.81, 77.20, 71.15, 70.88, 70.71, 70.33, 70.28, 70.06, 69.93, 69.57, 66.90, 49.14, 47.14, 31.53, 22.95, 17.78, 13.52, 7.46.
실시예 13. Boc -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(20)- Met - Bsmoc (화합물 15):
0℃에서 무수 CH2Cl2(50 mL) 내 Boc-(10)-7-에틸-10-히드록시캄포테신(화합물 10, 2.73 g, 5.53 mmol) 및 Bsmoc-Met(3.19 g, 8.59 mmol)의 용액에 EDC(1.64g, 8.59 mmol) 및 DMAP(0.21 g, 1.72 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 N2 하에서 45분 동안 0℃에서 교반한 다음, 실내온도까지 데웠다. 반응의 완료를 HPLC에 의해 확인할 때, 반응 혼합물을 1% NaHCO3(2 x 100 ml), H2O(100 mL) 및 0.1 N HCl(2 x 100 mL)로 세척하였다. 유기상을 무수 MgSO4로 건조한 후 여과하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 상기 결과물인 고체를 88%의 수율로 4.2 g의 산물을 획득하기 위해 밤새 40℃ 이하 진공 하에서 건조하였다. 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3) δ: 170.3, 166.8, 157.1, 155.2, 151.4, 151.2, 149.7, 147.0, 146.6, 145.3, 145.1, 138.9, 136.6, 133.5, 131.7, 130.5, 130.3, 130.2, 127.3, 127.0, 125.3, 125.1, 121.2, 119.8, 114.1, 96.1, 84.3, 76.7, 67.0, 56.7, 53.5, 53.4, 49.3, 31.6, 31.0, 29.7, 27.7, 23.1, 15.4, 13.9, 7.4; ESI-MS, 846.24 [M + H]+.
실시예 14. Boc -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(20)- Met - NH 2 · HCl (화합물 16):
무수 CH2Cl2(200 mL) 내 Boc-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(20)-Met-Bsmoc(화합물 15, 4.1 g, 4.85 mmol) 및 4-피페리디노피페리딘(1.06 g, 6.31 mmol)의 용액을 5시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물을 0.1 N HCl(2 x 40 ml)로 세척한 다음, 무수 MgSO4 상에서 유기층을 건조하였다. 상기 용액을 여과한 후, HPLC에 의해 결정되는 약 97%의 순도로 2.8 g의 산물을 획득하기 위해, 용매를 진공 증류에 의해 제거하였다. 상기 산물을 에테르(3 x 20 ml)에 의한 분쇄, 그 다음 에틸 아세트산(4 x 20 ml)에 의한 분쇄로 추가로 정제하여 수율 97%로 1.54 g을 획득하였다. 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3) δ: 167.2, 166.5, 156.9, 151.12, 150.9, 149.8, 146.3, 145.9, 145.8, 144.9, 131.3, 127.2, 127.0, 125.1, 119.6, 113.8, 96.7, 84.3, 78.2, 67.0, 60.4, 52.2, 49.4, 31.4, 29.6, 29.1, 27.7, 23.2, 15.1, 13.9, 7.7.
실시예 15. 40k 4 arm - PEG - Met -(20)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(10)- Boc (화합물 17):
실온에서, 무수 CH2Cl2(80 mL) 용액에 Boc-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(20)-Met(화합물 16, 1.48 g, 2.25 mmol) 및 4arm-PEG-COOH(화합물 3, 9.0 g, 0.9 mmol)를 첨가하였다. 상기 용액을 0℃로 냉각한 다음, EDC(0.26 g, 1.35 mmol) 및 DMAP(0.27 g, 2.25 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 N2 하에서 1시간 동안 0℃로 교반한 다음, 이를 밤새 실온에서 방치하였다. 상기 반응 혼합물을 30 ml의 0.1 N HCl/1M NaCl 수용성 용액으로 추출된 70 ml의 CH2Cl2로 희석하였다. 유기층을 MgSO4로 건조한 후, 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 잔유물을 40 mL의 CH2Cl2에 용해시켰고, 조생성물을 에테르(300 mL)로 침전시켰다. 여과에 의한 결과물인 고체 습윤물을 65℃에서 270 mL의 DMF/IPA에 용해시켰다. 용액을 2 내지 3시간 동안 실온으로 식힌 다음, 산물을 침전시켰다. 그런 다음, 고체를 여과한 후, 에테르(2 X 400 mL)로 세척하였다. DMF/IPA에서 상기 결정화 과정을 반복하였다. 7.0 g의 산물을 획득하기 위해, 웨트 케이크를 밤새 40℃ 이하 진공 하에서 건조하였다. 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3) δ: 169.8, 169.6, 166.5, 156.9, 151.2, 151.1, 149.9, 147.0, 146.6, 145.0, 131.7, 127,1, 126.8, 124.9, 119.7, 113.8, 95.5, 84.1, 70.1, 69.9, 66.9, 50.7, 49.2, 31.5, 31.2, 29.6, 27.6, 23.1, 15.3, 13.9, 7.5.
실시예 16. 40k 4 arm - PEG - Met -(20)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )(화합물 18):
실온에서, 무수 CH2Cl2(100 mL) 내 30% TFA의 용액에 디메틸 황화물(dimethyl sulfide)(2.5 mL) 및 4arm-PEG-Met-(20)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(10)-Boc(화합물 17, 6.0 g)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 3시간 동안 또는 HPLC에 의해 개시 물질이 소실될 때까지 교반하였다. 용매를 35℃로 진공 하에서 가능한 많이 제거하였다. 잔유물을 50 mL의 CH2Cl2에 용해시켰고, 조생성물을 에테르(350 mL)로 침전시킨 후 여과하였다. 고체 습윤물을 65℃에서 DMF/IPA(60/300 mL)의 혼합물에서 용해시켰다. 상기 용액을 2 내지 3시간 동안 실온으로 식힌 후, 산물을 침전시켰다. 그런 다음, 고체를 여과한 후, 에테르(2 x 200 mL)로 세척하였다. 5.1 g의 산물을 획득하기 위해, 웨트 케이크를 밤새 40℃ 이하 진공 하에서 건조하였다. 13C NMR(75.4 MHz, CDCl3) δ:169.7, 166.6, 157.0, 156.3, 148.4, 147.3, 145.0, 144.4, 142.9, 131.5, 128.3, 126.4, 122.5, 118.7, 105.2, 94.7, 78.1, 67.0, 50.7, 49.2, 31.6, 31.3, 29.7, 23.0, 15.3, 13.5, 7.5; PEG에 대한 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 비율: 2.1%(wt).
실시예 17. Boc -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(20)- Sar - Boc (화합물 19):
Boc-Sar-OH(432 mg, 2.287 mmol)를 75 mL의 DCM 내 Boc-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)(화합물 10, 750 mg, 1.52 mmol)의 용액에 첨가한 후, 0 ℃로 냉각하였다. DMAP(432 mg, 2.287 mmol) 및 EDC(837 mg, 0.686 mmol)를 1.5시간 동안 0℃ 내지 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5% NaHCO3(75 mL x 2)로, 물(75 ml x 2)로, 그리고 최종적으로 0.1 N HCl(75 mL x 1)로 세척하였다. 메틸렌 클로라이드 층(methylene chloride layer)을 MgSO4 상에서 건조하였고, 용매를 진공 하에서 증발시킨 후 건조하였다. 수율 = 0.900 mg(89%). 상기 구조는 NMR에 의해 확인하였다.
실시예 18. 7-에틸-10-히드록시 캄포테신 -(20)- Sar · TFA (화합물 20):
Boc-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(20)-Sar-Boc(화합물 19, 900 mg, 1.357 mmol)를 4 mL TFA 및 16 mL DCM의 용액에 첨가한 후, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 30℃에서 톨루엔으로 증발시켰다. 잔유물을 10 mL CHCl3에서 용해시킨 후, 에틸 에테르로 침전시켰다. 상기 산물을 여과한 후 건조하였다. 수율 = 700 mg(1.055 mmol, 78%). 13C NMR(67.8 MHz, CDCl3) δ: 168.26, 167.07, 158.84, 158.71, 148.82, 147.94, 147.22, 146.34, 144.04, 131.18, 130.08, 128.97, 124.46, 119.78, 106.02, 97.23, 79.84, 79.34, 66.87, 50.84, 49.86, 31.81, 23.94, 15.47, 13.84, 8.08.
실시예 19. TBDMS -(10)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(20)- Sar · HCl (화합물 21):
무수 DMF(30 mL) 내 7-에틸-10-히드록시캄포테신-(20)-Sar·TFA(화합물 20, 2.17 g, 3.75 mmol, 1 eq.)의 용액을 200 mL의 무수 DCM으로 희석하였다. Et3N(2.4 mL, 17.40 mmol, 4.5 eq.)를 TBDMSCl(2.04 g, 13.53 mmol, 3.5 eq.) 다음으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 HPLC가 개시 물질의 소실을 보여줄 때까지(약 1시간) 교반하였다. 유기층을 0.5% NaHCO3로 두 번, 물로 한번, 및 식염수를 포함하는 포화된 0.1 N HCl 용액으로 두 번 세척한 다음, MgSO4 상에서 건조하였다. 진공 하에서 용매를 여과 및 증발시킨 후, 결과물인 오일을 DCM에 용해시켰다. 에테르의 첨가가 미세(fine) 또는 중간(medium) 흡인 여과기(buchner funnel)(2.00 g, 87% 수율)를 이용하여 여과된 고체를 제공하였다. 상기 고체의 HPLC는 96% 순도를 보여주었다. 1H NMR 및 13C NMR로 구조를 확인하였다. 1H NMR(300 MHz, CD3OD): δ 0.23(6H, s), 0.96(9H, s), 0.98(3 H, t, J = 7.3 Hz), 1.30(3 H, t, J = 7.6 Hz), 2.13-2.18(2H, m), 2.67(3H, s), 3.11(2 H, q, J = 7.6 Hz), 4.10(1H, d, J = 17.6 Hz), 4.22(1H, d, J = 17.6 Hz), 5.23(2 H, s), 5.40(1 H, d, J = 16.7 Hz), 5.55(1H, d, J = 16.7 Hz), 7.32(1H, s), 7.38-7.43(2H, m), 8.00(1H, d, J = 9.1 Hz). 13C NMR(75.4 MHz, CD3OD): δ-4.14, 8.01, 14.10, 19.30, 23.98, 26.16, 31.78, 33.52, 49.46, 50.95, 67.66, 79.80, 97.41, 111.96, 119.99, 127.75, 129.28, 129.67, 131.57, 145.24, 146.86, 147.16, 148.02, 150.34, 156.69, 158.72, 167.02, 168.27.
실시예 20. 40K 4 arm - PEG - Sar -(20)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )-(10)- TBDMS (화합물 22):
150 mL의 무수 DCM 내 40K 4arm-PEG-COOH(화합물 3, 10 g, 0.25 mmol, 1 eq.)의 용액에 20 mL의 무수 DMF 내 TBDMS-(10)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-Sar·HCl(화합물 21, 1.53 g, 2.5 mmol, 2.5 eq.)의 용액을 첨가한 다음, 상기 혼합물을 0℃로 냉각하였다. 상기 용액에 EDC(767 mg, 4 mmol, 4 eq.) 및 DMAP(367 mg, 3 mmol, 3 eq.)를 첨가한 다음, 상기 반응 혼합물을 천천히 실온으로 데운 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시킨 후, 잔유물을 최소 양의 DCM에 용해시켰다. 에테르의 첨가 후, 고체를 형성하였고, 진공 하에서 여과하였다. 상기 잔유물을 30 mL의 무수 CH3CN에 용해시킨 후, 600 mL IPA의 첨가에 의해 침전시켰다. 산물(9.5 g)를 획득하기 위해, 상기 고체를 여과한 후, IPA 및 에테르로 세척하였다. 상기 구조를 NMR로 확인하였다.
실시예 21. 40K 4 arm - PEG - Sar -(20)-(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 )(화합물 23):
방법 A. 40K 4arm-PEG-Sar-(20)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(10) TBDMS(화합물 22)를 H2O(200 mL) 내 TFA의 50% 혼합물에 용해시켰다. 상기 반응 혼합물을 10시간 동안 실온에서 교반한 다음, 100 mL의 H2O로 희석한 후, DCM(2 x 300 mL)으로 추출하였다. 화합된 유기상을 H2O(2 x 100 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조하고, 여과한 후, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔유물을 열기 장치(열기총; heat gun)으로 서서히 가열된 100 mL의 무수 DMF에 용해시킨 후, 400 mL DMF의 느린 첨가에 의해 침전시켰다. 상기 고체를 여과한 후, IPA 내 20% DMF, 및 에테르로 세척하였다. 상기 고체를 DCM에 용해시킨 후, 에테르(6.8 g)로 침전시켰다. 상기 구조를 NMR로 확인하였다.
방법 B. 40K 4arm-PEG-Sar-(20)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)-(10)-TBDMS(1 g)를 10 mL의 1N HCl 용액에 용해시켰다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안(HPLC로 확인된) 교반한 다음, DCM(2 x 40 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과한 후, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 결과물인 밝은 황색(bright yellow) 잔류물을 10 mL의 DMF(열기총으로 서서히 가열된)에 용해시킨 다음, 40 mL의 IPA를 첨가하였다. 상기 결과물인 고체를 여과한 후, 진공 오븐에서 40℃로 밤새 건조하였다. 상기 구조를 NMR로 확인하였다.
생물학적 데이타
실시예 22. 독성 데이타( TOXICITY DATA )
4-분지형 PEG를 접합하는 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 최대 내성 용량(maximum tolerated dose; MTD)을 누두 마우스를 이용하여 연구하였다. 마우스를 사망 및 병의 징후에 대해 14일 동안 모니터하였고, 체중 감량이 처리 전 체중의 >20%일 때 희생시켰다.
표 1은 1회 및 수 회 투약량 투여 모두에 대해서 각 화합물의 최대 내성 용량을 보여준다. 수 회 투약량 투여를 위한 각 투약량을 10일 동안 격일로 마우스에 제공하였고, 상기 마우스를 또 다른 4일 동안 관찰하였으므로, 총 14일 걸렸다.
누드 마우스에서 MTD 데이타
화합물 투여 수준(mg/kg) 생존 수/총 수 설명
화합물 91회 투약량 25 5/5
30 5/5
35 4/5 마우스는 체중 감소율이 >20%일 때 안락사시켰다.
화합물 9수 회 투약량* 10 5/5
15 3/5 마우스는 체중 감소율이 >20%일 때 안락사시켰다.
20 0/5 마우스는 체중 감소율이 >20%일 때 안락사시켰다.
4arm-PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)(화합물 9)에 대한 MTD는 1회 투약량으로 제공되었을 때 30 mg/kg이고, 수 회 투약량(q2d x 5)으로 제공되었을 때 10 mg/kg인 것을 발견하였다.
실시예 23. 생체 내( In Vitro ) 데이타
표 2에서, 세포독성(IC50에 대한 결과인 각 화합물의 uM)은 각 화합물의 생체 내 항종양 효능의 징후를 제공한다. 본 연구는 4개의 분지형 페그화(PEGylated) 7-에틸-10-히드록시캄포테신 접합체의 페그화의 효과를 결정하는데 이용되었다. PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신), 7-에틸-10-히드록시캄포테신, 및 CPT-11의 생체 내 세포독성은 MTS 분석을 이용하여 결정하였다. 세포를 37℃에서 72시간 동안 약물로 배양하였다. 배양한 다음, MTS 염료(dye)를 첨가한 후, 염색된 산물(formazan)의 형성을 490 nm에서 측정하였다.
4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 및 CPT-11의 IC50 값은 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)가 CPT-11 보다 모든 테스트된 종양 세포에서 더 높은 생체 내 억제를 가진다는 것을 나타낸다. 게다가, 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)가 기존의 7-에틸-10-히드록시캄포테신 보다 HT29 종양 세포를 제외한 테스트된 종양 세포들의 유의성 있게 높은 생체 내 억제를 가진다.
PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체가 Camptosar® 보다 약 10 내지 600배 더 효능이 있었다. PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체가 COLO 205, HT-29 및 OVCAR-3 세포주에서 페가모테칸(Pegamotecan)(캄포테신의 페그화된 전구약물) 보다 8 내지 16 배 더 민감하였다.
IC 50 ( uM ) 데이타
암 유형 세포주 7-에틸-10-히드록시캄포테신 화합물 9 CPT-11
대장암 Colo 205 0.2 ± 0.2 1.0 ± 0.6 11 ± 1.4
HT29 0.1 ± 0.04 0.5 ± 0.3 27 ± 8.6
폐암 A549 1.0 ± 0.1 2.7 ± 0.4 67 ± 17
췌장암 PANC-1 0.56 ± 0.38 0.67 ± 0.14 34 ± 16
MIA PaCa-2 0.18 0.09 67 ± 46
ASPC-1 0.64 ± 0.13 1.6 ± 1.1 33 ± 1.0
BxPC-3 0.54 ± 0.58 0.24 ± 0.04 44 ± 44
난소암 OVCAR-3 0.1 ± 0.02 0.3 ± 0.2 20 ± 7.1
OV90 0.1 ± 0.02 0.6 ± 0.7 18 ± 4.8
OVCAR-8 0.03 ± 0.01 0.5 ± 0.1 9.0 ± 1.3
A2780 0.02 ± 0.01 0.2 ± 0.2 8.0 ± 3.5
SK-0V-3 0.2 ± 0.1 0.9 ± 0.01 52 ± 8.5
4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)(화합물 9)의 IC50는 -에틸-10-히드록시캄포테신 당량(equivalent)의 관점에서 나타내었다. 값은 평균±SD(n=3)를 나타내고; SD가 없는 것으로 나타낸 값은 두 번 반복의 평균이다.
표 3에서 요약된 바와 같이, 다양한 아미노산을 포함하는 PEG-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체가 암 세포주의 패널(panel)에 대한 생체 내 세포독성 효능이 있다. 모든 PEG-7-에틸-10-히드록시캄포테신 접합체가 소분자 전구약물 CPT-11 및 페가모테칸(Pegamotecan)의 활성을 초과하는 생체 내 항-종양 활성 효능을 보여주었다.
다양한 PEG -(7-에틸-10-히드록시 캄포테신 ) 접합체의 IC 50 ( uM ) 데이타
화합물 대장암 난소암 폐암
Colo 205 HT29 OVCAR-3 A549
화합물 12(Ala) 0.03 0.16 0.14 4.4
화합물 23(Sar) 0.04 0.27 0.17 11
화합물 18(Met) 0.03 0.14 0.13 1.6
7-에틸-10-히드록시 캄포테신 0.08 0.08 ND ND
CPT-11 20 56 41 13
실시예 24. 생체 내 데이타 -유방암 이종이식( Xenograft ) 마우스에서 1회 투약량 효능
누드 마우스에서 성장한 피하의 인간 유선종양(human mammary carcinoma; MX-1)에 대한 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체(화합물 9)의 효능은 다음과 같이 결정하였다. 적어도 1 주일의 순화(acclimation) 후, 누드 마우스의 왼쪽 옆구리 부위(auxiliary flank region)에 한 피하 부위로, 공여(donor) 마우스 유래 작은 종양 단편을 이식함으로써 종양을 확립시켰다. 상기 종양 이식 부위는 매주 두 번 관찰하였고, 1번은 명확하게 측정하였다. 각 마우스의 종양 크기(tumor volume)는 캘리퍼스(calipers)로 2차원으로 측정하고, 공식: 종양 크기 = (길이 x 폭2)을 이용하여 계산됨으로써 결정되었다. 종양이 대략 100 mm3의 평균 크기에 도달했을 때, 상기 마우스를 비처리된 대조군, 본 발명의 실시예 7과 같이 제조된 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 처리군, 본 발명의 참고문헌으로 통합되는 Conover 등(Anti - Cancer Drug Design, 1999, 14:499-506)에 기재된 바와 같이 제조된 PEG-Ala-CPT 처리군, 및 CPT-11 처리군으로 구성된 실험군으로 분류하였다. 약물을 마우스의 20 mg/kg 체중에 대한 1회 투약량으로 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 투여하였다. 접합체의 투약량은 7-에틸-10-히드록시캄포테신에 대한 당량의 양을 의미한다. 마우스 체중 및 종양 크기는 연구의 개시 및 1회 투약량 투여 후 31일째에 측정하였다.
표 4는 마우스의 20 mg/kg 체중에 대한 1회 투약량을 정맥 주사한 후 31일째에 MX-1 유방암 세포로 이종이식된 마우스에서 관찰된 종양 감소량(shrinkage)을 나타낸다. 종양의 전체적인 성장은 평균 종양 크기(mean tumor volume; TV)로 계산되었다. 또한, 대조군에 대한 처리군의 퍼센트가 계산되었다. 종양 퇴화(regression)의 비율은 각 화합물의 생체 내 활성을 나타낸다. 4개의 분지형 PEG-GLY-7-에틸-10-히드록시캄포테신 접합체는 마우스의 100% 생존과 100% 치료로 유의성 있는 항종양 활성을 나타냈다. CPT-11 및 식염수를 처리한 대조군 모두는 0% 생존으로 보호하지 못한 것으로 나타냈다. 모든 데이타는 표 4에 요약되어 있다.
MX -1 유방암 이종이식 마우스 모델에서 1회 투약량 효능 비교
화합물 평균TV±SD(㎣) 중앙값TV(㎣) F/I(%) Chg inTV±SD(%) TGI(%) 퇴화(%) 치료(%) 생존(%) T/C(%)
대조군 1136 ± 686 785 1259 1399 ± 658 0 0 0 0 ---
화합물 9 7 ±9 3 7 -94 ± 10 99 100 100 100 0.3
PEG-Ala-CPT 43 ±41 40 42 -40 ± 93 96 50 33 100 5
CPT-11 845 ±50 845 843 1424 ± 432 26 0 0 0 108
그 결과는 유방암의 치료에 있어서, 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)이 PEG-Ala-CPT 또는 CPT-11 중 어느 하나 보다 더 유의성 있게 효과적인 것을 보여준다.
유방 MX-1 종양 모델에 있어서, 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)로의 처리는 거의 100% 종양 성장 억제 및 모든 동물의 완벽한 치료를 야기하였다. 동등한 투약량 수준에서, CPT-11로의 처리는 26 % 종양 성장 억제를 야기하였다.
실시예 25. 생체 내 데이타 -유방암 이종이식 마우스에서 다중 투약량 효능
누드 마우스에서 성장한 인간 유선종양(MX-1)에 대한 4개의 분지형 PEG-아미노산(유도체)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체 유형의 효능을 측정하였다. 상기 마우스를, 본 발명에 기재된 바와 같이 제조된 4arm-PEG-Ala-(7-에틸-10-히드록시캄포테신), 4arm-PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신), 4arm-PEG-Met-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 및 4arm-PEG-Sar-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)을 각각 받은 군, 및 CPT-11 또는 식염수 대조군으로 할당하였다. 상기 마우스에 연속되는 6일 동안 5 mg/kg/day를 투약하였다(2일 마다 [qx2d] x 6). 마우스 체중 및 종양 크기를 첫 번째 투약량 투여 및 그 다음 투여 후 31일째 되는 날까지 모니터하였다.
표 5는 6일 동안 5 mg/kg/day(qx2d x 6)로 정맥 주사한 후, 31일째에 MX-1 유방암 세포로 이종이식된 마우스에서 관찰된 종양 감소량을 나타낸다. 모든 4개의 분지형 PEG-아미노산(유도체)-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체는 마우스의 100% 생존과 100% 퇴화로 유의성 있는 항-종양 활성을 나타냈다. CPT-11 및 식염수를 처리한 대조군 모두는 0% 생존으로 보호하지 못한 것으로 나타냈다. 모든 데이타는 표 5에 요약되어 있다.
MX -1 유방암 이종이식 마우스 모델에서 다중 투약량 효능 비교
화합물 평균TV±SD(㎣) 중앙값TV(㎣) F/I(%) Chg inTV±SD(%) TGI(%) 퇴화(%) 치료(%) 생존(%) T/C(%)
Control 1136±686 785 1259 1399±658 0 0 0 0 ---
화합물12(Ala) 10±11 9.6 10 -91±11 99 100 67 100 1.2
화합물9(Gly) 12±18 6.6 14 -91±10 99 100 100 100 0.8
화합물18(Met) 8±9 5.6 7.8 -94±7 99 100 100 100 0.7
화합물23(Sar) 12±10 14.6 13 -87±12 99 100 100 100 1.9
CPT-11 632±698 340 594 423±243 44 0 0 0 43
상기 데이타는 유방암에 있어서, 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 4개의 분지형 PEG-아미노산 유도체가 CPT-11 보다 더 유의성 있게 효과적이라는 것을 보여준다.
실시예 26. 소( small ) 및 대( large ) 유방암 이종이식 마우스에서 생체 내 효능
4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 항종양 효능을 소(약 100 mm3) 또는 대(약 450 mm3) 인간 유선 MX-1 종양이 확립된 누드 마우스에서 평가하였다. 항종양 치료적 활성을 1회 투약량 또는 다중 투약량 처방 계획의 마우스에서 결정하였다. 소 유방암으로 이종이식된 마우스에 있어서, 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 1회 처리(20mg/kg)는 100% TGI를 야기하였다. 또한, 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 다중 투약량으로의 처리(20mg/kg q2d × 5)는 100% TGI를 야기하였다. CPT-11의 1회 투약량(20mg/kg) 투여는 종양 성장을 억제하지 않았으며, CPT-11의 다중 투약량(20mg/kg q2d × 5)은 31일째 44% TGI의 결과를 야기하였다.
대 유방암으로 이종이식된 마우스에 있어서, 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 1회 MTD(30 mg/kg)로의 처리는 96% TGI를 야기하였다. 6마리의 마우스 중 4마리가 54일째 치료되었다. CPT-11의 1회 MTD(80mg/kg)로의 처리는 13일째 70% TGI를 야기하였다. 모든 동물을 과다한 종양 적하(tumor burden) 때문에 20일째쯤 희생시켰다. 또한, 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 다중 투약량 MTD(10 mg/kg q2d × 5)로의 처리는 96% TGI를 야기하였고, 6마리 마우스 중 5마리가 54일째 치료되었다. CPT-11의 다중 투약량 MTD(40mg/kg q2d × 5)로의 처리는 13일째 ~95% TGI를 야기하였다. 그러나, 종양은 ~5주 후에 6마리 마우스 중 4마리에서 재생하였다. 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)(10 mg/kg q2dx5)과 동등한 투약량 수준으로 제공된 CPT-11는 처리가 중단될때 까지 효과적인 TGI를 기졌다. 상기 결과는 도 6A 및 도 6C에서 설명한다. 항종양 효과는 일반적인 독성 효과에 기여하지 않았고, MTD로 제공되는 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-하이드록시캄포테신) 또는 CPT-11 중 어느 하나로의 처리 이후, 도 6B 및 도 6D에서 보는 바와 같이 처리기간 동안 동물의 체중이 유의성 있게 감소하지 않았다.
1회 투약량 또는 다중 투약량으로 주사한 MX-1 유방암 모델에 있어서, 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)는 소(약 100 mm3) 및 대(약 450 mm3) 확립된 모든 종양에서 효과적으로 종양 성장을 억제하였다. 약 75 mm3 내지 약 450 mm3의 크기인 종양이 MX-1 유방암 이종이식된 마우스에서 성공적으로 치료되었다.
실시예 27. 생체 내 데이타 -대장암 이종이식 마우스에서 1회 투약량 효능
본 발명의 실시예에 있어서, 종양 감소율을 HT-29 대장암 세포로 이종이식된 마우스에 30 mg/kg의 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 또는 CPT-11의 단일 투약량 정맥 주사 후, 4, 8, 11, 15, 18, 및 22일에 관찰하였다. 또한, CPT 11을 80 mg/kg 투약하였다. 상기 결과는 도 7에서 설명한다. 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체는 유의성 있는 항-종양 활성을 나타내었다. 식염수 대조군의 경우, 0% 생존으로 보호를 하지 않았음을 나타내었다. 상기 결과는, 대장암 치료에 있어서 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)이 CPT-11 보다 유의성 있게 효과적임을 나타낸다.
실시예 28. 생체 내 데이타 -대장암 이종이식 마우스에서 다중 투약량 효능
본 발명의 실시예에 있어서, 종양 감소율을 HT-29 대장암 세포로 이종이식된 마우스에 5일 동안 10 mg/kg/dose로 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 또는 CPT-11의 단일 투약량 정맥 주사 후, 4, 8, 11, 15, 18, 및 22일에 관찰하였다. 또한, CPT-11을 5일 동안 40 mg/kg/dose로 투약하였다. 상기 결과는 도 8에서 설명한다. 다중 투약량 투여의 경우, 유사한 결과가 획득되었다. 게다가, 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 다중 투약량 투여가 CPT-11에 비해 유의성 있는 치료적 효능을 나타내었다. 상기 결과는 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 다중 투약량 투여가 CPT-11에 비해 유의성 있게 더 효과적이라는 것을 나타낸다. MX-1 종양이 이종이식된 마우스에서 관찰된 바와 같이, 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 또는 CPT-11로의 처리가 상기 처리 동안 마우스의 체중을 유의성 있게 감소시키지 않았다.
실시예 29. 생체 내 데이타 -췌장암 이종이식 마우스에서 1회 투약량 효능
본 발명의 실시예에 있어서, 종양 감소율을 MiaPaCa-2 췌장암 세포로 이종이식된 마우스에 30 mg/kg의 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 또는 CPT-11의 단일 투약량 정맥 주사 후, 4, 8, 11, 15, 18, 및 22일에 관찰하였다. 또한, CPT 11을 80 mg/kg 투약하였다. 상기 결과는 도 9에서 설명한다. 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체는 유의성 있는 항-종양 활성을 나타내었다. 식염수 대조군 및 CPT-11의 경우, 보호를 하지 않았음을 나타내었다. 상기 결과는, 췌장암 치료에 있어서 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)이 CPT-11 보다 유의성 있게 효과적임을 나타낸다. 1회 투약량의 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)로의 치료는 71% TGI를 야기한 반면에, 1회 투약량 주사의 CPT-11 치료는 0% TGI를 야기하였다.
실시예 30. 생체 내 데이타 -췌장암 이종이식 마우스에서 다중 투약량 효능
종양 감소율을 MiaPaCa-2 췌장암 세포로 이종이식된 마우스에 5일 동안 10 mg/kg/dose로 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 또는 CPT-11의 단일 투약량 정맥 주사 후, 4, 8, 11, 15, 18, 및 22일에 관찰하였다. 또한, CPT-11을 5일 동안 40 mg/kg/dose로 투약하였다. 상기 결과는 도 10에서 설명한다. 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 다중 투약량 투여가 CPT-11에 비해 유의성 있는 치료적 효능을 나타내었다. 상기 결과는 췌장암 치료에 있어서, 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 다중 투약량 투여가 CPT-11에 비해 유의성 있게 더 효과적이라는 것을 나타낸다. 다중 투약량의 4개의 분지형 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)로의 치료는 95% TGI를 야기한 반면에, 1회 투약량 주사의 CPT-11 치료는 34% TGI를 야기하였다.
실시예 31. 시험관 내( In Vitro ) 물질대사
PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체의 생체 내 물질대사를 랫트 간세포(rat hepatocyte)에서 관찰하였다. PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)를 pH 7.5 및 37℃에서 2시간 동안 랫트 간세포와 함께 배양하였다. 도 11에서 보는 바와 같이, 7-에틸-10-히드록시캄포테신 및 7-에틸-10-히드록시캄포테신-글로쿠로니드(Glucuronide)(7-에틸-10-히드록시캄포테신-G)는 확인된 주요 대사물질이었고, 알려진 생체 내 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 대사 경로와 일치하였다.
실시예 32. PEG 접합체의 특성
표 6은 수용성 식염수 용액에서 4개의 다른 PEG-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체들의 용해도를 나타낸다. 모든 4개의 PEG-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체들은 4 mg/mL 당량의 7-에틸-10-히드록시캄포테신까지의 높은 용해도를 나타내었다. 인간 혈장에 있어서, 7-에틸-10-히드록시캄포테신은 22 내지 52분의 배가시간(doubling time)으로 PEG 접합체로부터 끊임없이 분비되었고, 상기 분비는 다음의 실시예 33에 기재된 바와 같이 pH 및 농도 의존적으로 일어났다.
PEG -7-에틸-10-히드록시 캄포테신 접합체의 특성
화합물 식염수에서 용해도(mg/mL)a 인간 혈장에서 t 1/2(min) b 혈장에서 더블링 타임(min) c
인간 마우스 랫트
화합물 9(Gly) 180 12.3 31.4 49.5 570
화합물 12(Ala) 121 12.5 51.9 45.8 753
화합물 23(Sar) ND 19.0 28.8 43.4 481
화합물 18(Met) 142 26.8 22.2 41.9 1920
a: 7-에틸-10-히드록시캄포테신은 식염수에서 용해성이 없다.
b: PEG 접합체 반감기(half life).
c: 접합체 유래 7-에틸-10-히드록시캄포테신 형성 비율.
PEG-7-에틸-10-히드록시캄포테신 접합체는 실온에서 24시간 동안 식염수 및 다른 수용성 배지에서 높은 안정성을 보인다.
실시예 33. 안정성에 대한 농도 및 pH 의 효과
이전 실험을 근거로, 20-OH 위치의 아실화(acylation)는 활성의 닫힌 형태(active closed form)에서 락톤 링(lactone ring)을 보호한다. 랫트 및 인간 혈정에서 수용성 안정성 및 가수분해 특성을 UV 기반 HPLC법(UV based HPLC method)을 이용하여 모니터하였다. 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체를 실온에서 5분 동안 각 시료와 함께 배양하였다.
완충용액에서 PEG-7-에틸-10-히드록시캄포테신 접합체의 안정성은 pH에 의존적이었다. 도 12는 다양한 시료에서 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 안정성을 나타낸다. 도 13은 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)로부터 분비되는 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 비율이 증가된 pH와 함께 증가되는 것을 나타낸다.
실시예 34. 약물동력학( Pharmacokinetics )
종양이 없는 Balb/C 마우스에 1회 주사의 20 mg/kg 4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체를 주입하였다. 다양한 시점에서, 마우스를 희생시켰고, 혈장을 HPLC에 의해 기존의 접합체 및 분비된 7-에틸-10-히드록시캄포테신에 관해 분석하였다. 약물동력학적 분석은 비구분적 분석(non-compartmental analysis)(WinNonlin)을 이용하여 수행하였다. 상세한 것은 표 7에서 설명한다.
약물 동력학적 데이타
매개변수 화합물 9 화합물 9로부터 분리된 7-에틸-10-히드록시캄포테신
AUC(h*㎍/mL) 124,000 98.3
Terminal t1 /2(Hr) 19.3 14.2
Cmax(㎍/mL) 20,500 13.2
CL(mL/hr/kg) 5.3 202
Vss(mL/kg) 131 3094
도 14에서 보는 바와 같이, 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 페그화(pegylation)는 장시간 순환 반감기(long circulation half life) 및 기존 약물인 7-에틸-10-히드록시캄포테신에 대한 높은 노출이 가능하게 한다.
4armPEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신) 접합체의 장간순환(enterohepatic circulation)을 관찰하였다. 마우스에서 PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 약물동력학적 프로파일은 초기 2시간 동안 이상성 급성 플라즈마 분배상(biphasic showing rapid plasma distribution phase)이었고, 뒤이어 18 내지 22시간 정도의 접합체에 대한 소실 반감기(terminal elimination half-life), 및 동시에 18 내지 26시간 정도의 7-에틸-10-히드록시캄포테신에 대한 소실 반감기가 따랐다.
추가적으로, 4arm PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)의 약물 동력학적 프로파일은 랫트에서 조사하였다. 랫트에 있어서, 3, 10 및 30 mg/kg(7-에틸-10-히드록시캄포테신 당량)의 투약량 수준을 이용하였다. 랫트에서 약물 동력학적 프로파일은 마우스의 프로파일과 일치하였다.
랫트에 있어서, 4arm PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)는 랫트에서 12 내지 18시간의 소실 반감기를 가지는 순환으로부터 이상성 제거(biphasic clearance)를 보였다. 4armPEG-Gly-7-에틸-10-히드록시캄포테신 접합체로부터 분비된 7-에틸-10-히드록시캄포테신는 21 내지 22시간의 소실 반감기를 나타내었다. 랫트에서 최대 혈장 농도(maximum plasma concentration; Cmax) 및 곡선 아래 면적(area under curve; AUC)은 투약량 의존적 방식으로 증가하였다. 마우스 또는 랫트에서 4armPEG-Gly 접합체로부터 분리된 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 명백한 반감기는 CPT-11로부터 분리된 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 명백한 반감기 보다 유의성 있게 더 길고, 4arm PEG-Gly-(7-에틸-10-히드록시캄포테신)로부터 분리된 7-에틸-10-히드록시캄포테신 노출은 CPT-11로부터 분리된 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 노출보다 유의성 있게 더 높다. 랫트에서 모(parent) 화합물의 소실은 0.35 mL/hr/kg이었다. 랫트에서 모 화합물의 정상상태에서 분배 체적(volume of distribution at steady state; Vss)은 5.49 mL/kg이었다. 랫트에서 분리된 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 소실은 131 mL/hr/kg이었다. 랫트에서 분리된 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 추정된 Vss는 2384 mL/kg이었다. 분비된 7-에틸-10-히드록시캄포테신의 장간순환(Enterohepatic circulation)은 마우스 및 랫트 모두에서 관찰되었다.

Claims (29)

  1. 하기 화학식(1):
    [화학식 1]
    {여기서,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 OH 또는 (L)m-D이다;
    L은 이중기능성 링커(Bifunctional linker)이다;
    D는 캄포테신(camptothecin) 또는 캄포테신 유도체(analog)의 잔기(residue)이다;
    m은 0 또는 양의 정수이다;
    n은 양의 정수이다; 및
    R1, R2, R3 및 R4는 모두 OH가 아니다}의 화합물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 D는 하기 화학식(2):
    [화학식 2]
    {여기서,
    R7은 NO2, NH2, N3, 수소(hydrogen), 할로겐(halogen)(F, Cl, Br, I), COOH, OH, O-C1 -8 알킬, SH, S-C1 -3 알킬, CN, CH2NH2, NH-C1 -3 알킬, CH2-NH-C1 -3 알킬, N(C1 -3 알킬)2, CH2N(C1 -3 알킬), O-, NH- 및 S-CH2CH2N(CH2CH2OH)2,, O-, NH- 및 S-CH2CH2CH2N(CH2CH2OH)2, O-, NH- 및 S-CH2CH2N(CH2CH2CH2OH)2, O-, NH- 및 S-CH2CH2CH2N(CH2CH2CH2OH2)2, O-, NH- 및 S-CH2CH2N(C1 -3 알킬)2, O-, NH- 및 S-CH2CH2CH2N(C1-3 알킬)2, CHO 및 C1 -3 알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다; 및
    R8은 H, C1 -8 알킬 및 CH2NR9R10로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다,
    여기서,
    R9는 수소, C1 -6 알킬, C3 -7 사이클로알킬(cycloalkyl), C3 -7 사이클로알킬-C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐(alkenyl), 히드록시(hydroxy)-C1 -6 알킬, 및 C1 -6 알콕시(alkoxy)-C1 -6 알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다;
    R10은 수소, C1 -6 알킬, C3 -7 사이클로알킬, C3 -7 사이클로알킬-C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 히드록시-C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시-C1 -6 알킬, 및 COR11로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다,
    여기서, R11은 수소, C1 -6 알킬, 퍼할로(perhalo)-C1 -6 알킬, C3 -7 사이클로알킬, C3 -7 사이클로알킬-C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, 히드록시-C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, 및 C1 -6 알콕시-C1-6 알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다; 또는
    R9, R10 및 B 고리의 질소(nitrogen)는 O, S 또는 NR12를 포함하는 포화된 3-7원 헤테로고리환(heterocyclic ring)을 형성한다,
    여기서, R12는 수소, C1 -6 알킬, 퍼할로-C1 -6 알킬, 아릴(aryl), 및 C1 -6 알킬, 할로겐, 니트로(nitro), 아미노(amino), C1 -6 알킬아미노(alkylamino), 퍼할로-C1 -6 알킬, 히드록시-C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, C1 -6 알콕시-C1 -6 알킬 및 COR13로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환되는 아릴로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 여기서 R13은 수소, C1 -6 알킬, 퍼할로-C1 -6 알킬, C1 -6 알콕시, 아릴, 및 C1 -6 알킬, 퍼할로-C1 -6 알킬, 히드록시-C1 -6 알킬, 및 C1 -6 알콕시-C1 -6 알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환되는 아릴로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다;
    R110-R111은 각각 독립적으로 수소, 할로(halo), 아실(acyl), 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 사이클로알킬(cycloalkyl), 하이드록실(hydroxyl), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 아지도(azido), 아미도(amido), 히드라진(hydrazine), 아미노, 치환된 아미노, 히드록시카르보닐(hydroxycarbonyl), 알콕시카르보닐(alkoxycarbonyl), 알킬카르보닐옥시(alkylcarbonyloxy), 알킬카르보닐아미노(alkylcarbonylamino), 카르바모일옥시(carbamoyloxy), 아릴설포닐옥시(arylsulfonyloxy), 알킬설포닐옥시(alkylsulfonyloxy), -C(R117)=N-(O)j-R118, R119C(O)O- 및 R120-O-(CH2)k-로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이다,
    여기서, R117은 H, 알킬, 알케닐, 사이클로알킬 또는 아릴이고, j는 0 또는 1이며, R118은 H, 알킬, 알케닐, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클(heterocycle)이며, R119는 할로겐, 아미노, 치환된 아미노, 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클이며, k는 1-10의 정수이고, R120은 알킬, 페닐(phenyl), 치환된 페닐, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클이다; 또는
    R7와 R110이 함께, 또는 R110와 R111이 함께 치환 또는 비치환된 메틸렌디옥시(methylenedioxy), 에틸렌디옥시(ethylenedioxy) 또는 에틸렌옥시(ethyleneoxy)를 형성한다; 및
    R112은 H 또는 OR'이고, 여기서 R'는 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 할로알킬(haloalkyl) 또는 히드록시알킬(hydroxyalkyl)이다}의 화합물의 잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 캄포테신 유도체의 잔기는
    인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 L은 아미노산 또는 아미노산 유도체이고, 여기서 상기 아미노산 유도체는 2-아미노아디픽산(2-aminoadipic acid), 3-아미노아디픽산(3-aminoadipic acid), 베타-알라닌(beta-alanine), 베타-아미노프로피온산(beta-aminopropionic acid), 2-아미노부티르산(2-aminobutyric acid), 4-아미노부티르산(4-aminobutyric acid), 피페리딘산(piperidinic acid), 6-아미노카프로산(6-aminocaproic acid), 2-아미노헵타논산(2-aminoheptanoic acid), 2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid), 3-아미노이소부티르산(3-aminoisobutyric acid), 2-아미노피멜릭산(2-aminopimelic acid), 2,4-아미노부티르산(2,4-aminobutyric acid), 데스모신(desmosine), 2,2-디아미노피멜릭산(2,2-diaminopimelic acid), 2,3-디아미노프로피온산(2,3-diaminopropionic acid), N-에틸글리신(N-ethylglycine), N-에틸아스파라긴(N-ethylasparagine), 3-히드록시프롤린(3-hydroxyproline), 4-히드록시프롤린(4-hydroxyproline), 이소데스모신(isodesmosine), 알로-이소류신(allo-isoleucine), N-메틸글리신(N-methylglycine), 사르코신(sarcosine), N-메틸-이소류신(N-methyl-isoleucine),6-N-메틸-라이신(6-N-methyl-lysine), N-메틸발린(N-methylvaline), 노르발린(norvaline), 노르류신(norleucine) 및 오르니틴(ornithine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 L은 글라이신(glycine), 알라닌(alanine), 메티오닌(methionine) 또는 사르코신(sarcosine)의 잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 L은 글라이신의 잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 L은 하기의 군:
    -[C(O)]vNR21(CR22R23O)t-,
    -[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24R25)yO-,
    -[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24R25)y-,
    -[C(O)]vNR21(CR22R23)tO-,
    -[C(O)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR25O)yNR26-,
    -[C(O)]vO(CR22R23)tNR26-,
    -[C(O)]vO(CR22R23)tO-,
    -[C(O)]vNR21(CR22R23)tNR26-,
    -[C(O)]vNR21(CR22R23)t(CR24CR25O)y-,
    -[C(O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24CR25)yNR26-,
    ,
    ,
    및
    ,
    {여기서:
    R21-R26은 각각 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐(alkynyl), C3 -19 가지난 알킬(branched alkyl), C3 -8 사이클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬(aralkyl), C1 -6 헤테로알킬(heteroalkyl), 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1 -6 알콕시, 페녹시(phenoxy) 및 C1 -6 헤테로알콕시(heteroalkoxy)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다;
    R27은 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -19 가지난 알킬, C3 -8 사이클로알킬, C1 -6 치환된 알킬, C2 -6 치환된 알케닐, C2 -6 치환된 알키닐, C3 -8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C1 -6 헤테로알킬, 치환된 C1 -6 헤테로알킬, C1-6 알콕시, 페녹시, C1 -6 헤테로알콕시, NO2, 할로알킬(haloalkyl) 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다;
    t 및 y는 각각 약 1 내지 4의 양의 정수이다; 및
    v는 0 또는 1이다}으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 m은 1 내지 10에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 m은 1인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 n은 약 28 내지 341에서 선택되는 어느 하나로서 화합물의 고분자 부분(polymeric portion)의 총 분자량이 약 5,000 내지 60,000 Da 범위 내인 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 n은 약 114 내지 227에서 선택되는 어느 하나로서 화합물의 고분자 부분의 총 분자량이 약 20,000 내지 40,000 Da의 범위 내인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 n은 227로서 화합물의 고분자 부분의 총 분자량이 약 40,000 Da인 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제 1항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4는 각각 (L)m-D인 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제 1항에 있어서, 하기의 군:
    으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 하기 화학식:
    을 포함하는 상기 제 1항의 화합물.
  16. 약학적으로 유효한 양의 제 1항의 화합물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함하는 포유류의 치료 방법.
  17. 제 16항에 있어서, D는 7-에틸-10-히이드록시캄포테신(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin)의 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 약학적으로 유효한 양의 제 1항의 화합물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 암은 고형암(solid tumor), 림프종(lymphoma), 폐암(lung cancer), 소세포성 폐암(small cell lung cancer), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia(ALL)), 유방암(breast cancer), 대장암(colorectal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 교아세포종(glioblastoma), 난소암(ovarian cancer) 및 위암(gastric cancer)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 암은 전이성(metastatic)인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 상기 암은 유방암이고, 상기 제 1항의 화합물은
    인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 화합물은 약 5 내지 20 mg/kg/dose의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19항에 있어서, 상기 암은 대장암이고, 상기 제 1항의 화합물은
    인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 화합물은 약 10 내지 30 mg/kg/dose의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19항에 있어서, 상기 암은 췌장암이고, 상기 제 1항의 화합물은
    인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 화합물은 약 10 내지 30 mg/kg/dose의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 18항에 있어서, 상기 화합물은 약 1 mg/kg/week 내지 100 mg/kg/week의 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 18항에 있어서, 상기 화합물은 약 2 mg/kg/week 내지 60 mg/kg/week의 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. (a) 유용한 20-하이드록실기(20-hydroxyl group)를 포함하는 캄포테신 또는 캄포테신 유도체 1 당량, 및 유용한 카르복실산기(carboxylic acid group)를 포함하는 이중기능성 링커 1 당량 이상을 제공하는 단계;
    (b) 상기 두 반응물이 유효한 조건 하에서 유용한 아민기(amine group)를 포함하는 캄포테신-이중기능성 링커 중간체(intermediate)를 형성하도록 반응시키는 단계; 및
    (c) 상기 결과물인 중간체의 각각의 활성부위 1 당량 이상과 화학식(1):
    [화학식 1]
    의 활성화된 고분자 1 당량을, 하기의 구조:
    {여기서,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 OH 또는 (L)m-D이다;
    L은 이중기능성 링커(Bifunctional linker)이다;
    D는 캄포테신(camptothecin) 또는 캄포테신 유도체(analog)의 잔기(residue)이다;
    m은 0 또는 양의 정수(positive integer)이다;
    n은 양의 정수이다; 및
    R1, R2, R3 및 R4는 모두 OH가 아니다}를 포함하는 다분지형 고분자 전구약물을 형성하기에 유효한 조건 하에서 반응시키는 단계를 포함하는 다분지형 고분자 전구약물(multi-arm polymeric prodrug)을 제조하는 방법.
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