CN108201515A

CN108201515A - 一类生物活性肽在护肤和皮肤美白中的应用

Info

Publication number: CN108201515A
Application number: CN201611181278.9A
Authority: CN
Inventors: 万芪; 陈娟; 庄杨; 张娅; 廖华宝; 万沙
Original assignee: Wuhan Hongyue Medical Science Inc
Current assignee: Wuhan Hongyue Medical Science Inc
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: CN108201515B

Abstract

本发明提供一类具有抑制黑色素合成活性的生物活性肽在皮肤美白中的应用，该类生物活性肽的氨基酸序列如式I，X1 ‑(Gly‑L‑Cys)n‑X2‑ X3（I），式中，X1是无或L‑Phe，X2是无或Gly，X3是无或L‑Phe，X1和X3不能同时为无，n≤8。属于生物医药、化妆品技术领域。该类肽可穿过皮肤表皮进入真皮层，穿过细胞膜，进入细胞，在细胞内水解酶的作用下水解生成相应的甘氨酸和半胱氨酸，从而发挥抑制酪氨酸酶活性的作用，抑制黑色素的合成，能够有效美白，以及制备用于预防和治疗黑色素过多导致的人体色素沉着性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症药物的各种制剂。

Description

一类生物活性肽在护肤和皮肤美白中的应用

技术领域

本发明属于生物医药、化妆品技术领域，涉及一类生物活性肽在护肤和皮肤美白中的应用。

背景技术

爱美之心，人皆有之。对于女性来说，美白是一个永恒的话题，具有美白功效的化妆品一直备受东方女性青睐。近年来，市场上为了迎合女性对美白的需求，出现了遮瑕膏、粉底、定妆粉等一系列粉饰美白的化妆品，有即时美白的效果，但对于肤质根本的改善是没有作用的。其实，只有把内在肤质调理好，根治影响美白的罪魁祸首——黑色素，肌肤才能展现真正的亮白光彩。

黑色素其实是一种氨基酸衍生物，在每个人的体内都有。黑色素在表皮基底部的黑色素细胞中形成，然后转移至基底细胞中，随着表皮细胞的移行被带到表皮全层，形成色斑和肤色不均等皮肤问题。

黑色素形成的生物学过程非常复杂，其中酪氨酸酶是黑色素形成过程中主要的限速酶，酪氨酸酶活性程度对色素的沉积起主要作用，阻断黑色素的合成和转移是评价美白化妆品功效的主要途径。

甘氨酸，是化学结构最简单的氨基酸，是蛋白质重要的组成成分，能调控哺乳动物的生理功能。研究表明，甘氨酸通过下调酪氨酸酶的表达，抑制黑色素细胞合成黑色素。

L-半胱氨酸是一种含有巯基的天然氨基酸，近年来，L-Cys作为抗氧化剂，广泛用于果蔬保鲜领域。研究表明，L-半胱氨酸的巯基对抑制酪氨酸酶活性起重要作用，因此，L-半胱氨酸及其衍生物也可作为美白化妆品的添加剂，减少黑色素合成。

尽管甘氨酸和半胱氨酸都能明显减少黑色素合成，起美白护肤作用，但是甘氨酸和半胱氨酸难以透过细胞膜，不能从皮肤表皮进入真皮，限制了它们在护肤品领域的应用。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一类具有抑制黑色素合成活性的生物活性肽在护肤和皮肤美白中的应用，该类生物活性肽的氨基酸序列如式I，

X1-(Gly-L-Cys)n-X2-X3(I)，式中，

X1是无或L-Phe

X2是无或Gly

X3是无或L-Phe

X1和X3不能同时为无，n≤8

蛋白水解酶切割后产生游离Gly和Cys作为药物或药理活性基团，Phe作为穿透细胞膜的载体。

优选地，所述生物活性肽选自下组任意一种：a、NH₂-Gly-Cys-Phe-COOH；b、NH₂-(Gly-Cys)₄-Phe-COOH；c、NH₂-(Gly-Cys)₈-Phe-COOH、d、NH₂-Gly-Cys-Gly-Phe-COOH；e、NH₂-Phe-Gly-Cys-COOH；f、NH₂-Phe-Gly-Cys-Gly-COOH；g、NH₂-Phe-Gly-Cys-Phe-COOH；h、NH₂-Phe-(Gly-Cys)₄-Phe-COOH；i、NH₂-Phe-(Gly-Cys)₇-Phe-COOH；j、NH₂-Phe-Gly-Cys-Gly-Phe-COOH。

本发明涉及式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物，通过不加或加入化妆品、护肤品辅料在护肤和皮肤美白中的应用。

本发明涉及式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物作为化妆品或护肤品添加剂的用途。

本发明涉及式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物，通过不加或加入药物制剂辅料在制备用于预防和治疗黑色素过多导致的人体色素沉着性疾病药物中的应用。

本发明涉及式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物，通过不加或加入药物制剂辅料在制备用于预防和治疗黑色素瘤的药物中的应用。

本发明涉及式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物，通过不加或加入药物制剂辅料在制备用于预防和治疗其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中的应用。

本发明的原理在于：式I的生物活性肽中存在两个蛋白水解酶切割位点，一个是Gly与Cys连接,另一个是肽两端Phe与任意氨基酸连接，Phe作为穿透细胞膜的载体，可携带多肽分子穿过皮肤表皮，进入真皮层，生物活性肽可以穿过细胞膜，进入细胞，在细胞内水解酶的作用下水解生成相应的甘氨酸和半胱氨酸，抑制黑色素的合成，从根本上达到美白效果。

为了更好地理解本发明的实质，本发明的一个实施例证实式I所示的生物活性肽可透过表皮进入真皮层。

一个非常适合的应用实例是式I所示的生物活性肽对于UVB引起的人真皮成纤维细胞氧化损伤，具有保护作用。

本发明的实施例还证实式I所示的生物活性肽抑制小鼠B16黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性。

本发明的有益之处在于：

(1)本发明对式I所示的生物活性肽发掘了新的美容和医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

(2)本发明的式I所示的生物活性肽是由天然的氨基酸组成，进入人体后不存在排斥反应，因此副作用小，预示着很好的美容及药用前景。

(3)本发明发现了式I所示的生物活性肽具有抑制酪氨酸酶活性的作用，抑制黑色素的合成，从根本上达到美白效果。

(4)本发明式I所示的生物活性肽在细胞模型上能明显抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素合成，因此对由黑色素引起的晒斑、黄褐斑、妊娠斑等皮肤问题具有一定的效果。

附图说明

图1为本专利生物活性肽的HPLC图谱以及质谱图，这些多肽均由本实验室自主合成。

图2为生物活性肽透过大鼠表皮进入真皮层的示意图。

图3为生物活性肽对正常人真皮成纤维细胞活性无影响的示意图。

图4为生物活性肽对UVB辐射人真皮成纤维细胞活性的影响示意图。

图5为生物活性肽对小鼠B16黑色素瘤细胞生长无影响的示意图。

图6为生物活性肽影响小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的示意图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】本专利以甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽(GCF)为例说明固相合成肽的制备过程如下：

一、复合物I Fmoc-L-Phe-树脂的合成：

本专利三肽用固相合成的方法，称取取代度为0.4mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)10.7g，将树脂放入多肽反应管中，加入二氯甲烷(DCM)160.5ml,震荡30分钟；通过沙芯抽滤掉DCM溶剂，加入12mmol的Fmoc-L-Phe-OH氨基酸，再加入40mmol的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分钟后抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分钟后抽掉哌啶溶液，从管中取反应后的树脂十几粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化钾溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应，说明Fmoc-L-Phe-OH与树脂联接成功，形成复合物I Fmoc-L-Phe-树脂。

二、复合物II Fmoc-Cys(Trt)-L-Phe-树脂的合成：

多肽反应管分别用160.5ml DMF洗两次，160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两次；后在Fmoc-L-Phe-树脂复合物上联接第二个氨基酸，在反应管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-Cys(Trt)-OH和12mmol苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，后立即加入N-甲基吗啉(NMM)40mmol,反应30min，反应管分别用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两次。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分钟后抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分钟后抽掉哌啶溶液，从管中取反应后的树脂十几粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化钾溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应，说明Fmoc-Cys(Trt)-OH与Fmoc-L-Phe-树脂联接成功，形成新的复合物II Fmoc-Cys(Trt)-L-Phe-树脂。

三、复合物III Fmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-树脂的合成：

多肽反应管分别用160.5ml DMF洗两次，160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两次；后在Fmoc-Cys(Trt)-L-Phe-树脂上联接第三个氨基酸，在反应管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-Gly-OH和12mmolHBTU，后立即加入N-甲基吗啉(NMM)40mmol,反应30min，反应管分别用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两次。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分钟后抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分钟后抽掉哌啶溶液，从管中取反应后的树脂十几粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化钾溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应，说明Fmoc-Gly-OH与复合物II联接成功，形成新的复合物III Fmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-树脂。

四、得到粗品肽：

多肽反应管分别用160.5ml DMF洗两次，160.5ml甲醇洗两次，160.5ml DMF再洗两次,抽干10min,配制切割液107ml,配方分别是TFA(三氟乙酸)94.5％；水2.5％；EDT(1,2-乙二硫醇)2.5％；TIS(三异丙基硅烷)1％,将树脂装入烧瓶或者离心管中，倒入切割液，恒温震荡2h,将切割液用氮气尽量吹干，乙醚层析，再用乙醚洗6次，然后常温挥干，得到1g粗品肽Gly-Cys-Phe。

五、纯化粗品肽Gly-Cys-Phe

仪器：LC3000型高效液相色谱仪

柱子：Gemini-NX C18 10um 120A 4.6*250mm

流动相A:0.1％TFA in 100％Acetonitrile

流动相B:0.1％TFA in 100％Water

根据上述纯化条件，将粗品肽(1g),进入到HPLC内(每次进样100mg),进行分离纯化，收集主峰馏分，放冻干机上冻干(48h),最后得到98％以上的纯品500mg。

图1A为甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸(简称GCF)三肽的HPLC图谱以及质谱图,HPLC图中可见该三肽纯度为98.2％；质谱图结果可见，[M+H]⁺326.05,因此该物质分子量为325.05，与甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽理论分子量相符。

采用同样的固相合成的方法，本实验室合成了本专利实施例中其它小肽，由于合成量较多，主要展示下面几类小肽的HPLC图谱以及质谱图。

图1B为甘氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸(简称GCGCF) 五肽的HPLC图谱以及质谱图，HPLC图中可见该五肽纯度为98.68％；质谱图结果可见，[M+H]⁺486.2，因此该物质分子量为485.2，与甘氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸五肽理论分子量相符。

图1C为L-苯丙氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸(简称FGCF)四肽的HPLC图谱以及质谱图，HPLC图中可见该四肽纯度为97.51％；质谱图结果可见，[M+H]⁺473，因此该物质分子量为472，与L-苯丙氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸四肽理论分子量相符。

【实施例2】该生物活性肽可透过表皮进入真皮层

一、主要实验试剂和仪器

FITC,武汉明皓生物科技股份有限公司；FITC-GCF和FITC-FGCGF,武汉明皓生物科技股份有限公司；OCT胶，北京中杉金桥生物技术有限公司；病理组织切片机，德国Leitz,1512型；荧光显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司。

二、实验动物

动物SPF级SD雄性大鼠，体重240-260g。湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号为NO.42000600017494，生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。

三、实验原理

FITC(异硫氰酸荧光素):为黄色或橙黄色结晶粉末，分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长为520～530nm,呈现明亮的黄绿色荧光，是目前应用最广泛的荧光素。

FITC-GCF:就是GCF进行荧光标记，FITC与GCF三肽结合，结合后不影响GCF三肽的结构和功能，通过在荧光显微镜下观察，具有强烈的黄绿色荧光，可用于GCF的定位或定量的检测。

FITC-FGCGF:也是FGCGF进行荧光标记，用于FGCGF的定位或定量检测。

皮肤屏障作用：主要指皮肤角化细胞能抵御外界刺激、微生物病原及过敏原的侵入，皮肤屏障作为机体与外界环境相互作用的第一天然要素，发挥重要的调节作用。同时，这一屏障也阻止了皮肤对有效成分的吸收，限制了这些物质在护肤领域的应用。

四、实验方法

本实验用脱毛的SD大鼠作为实验对象，动物随机分为三组，分别是FITC组、FITC-GCF组和FITC-FGCGF组，每组三只。将动物置于特制的大鼠固定器中，暴露其背部皮肤，背部涂FITC、FITC-GCF和FITC-FGCGF(100μM，每只1ml)。1h后处死动物，取皮肤组织用4％多聚甲醛固定后，冰冻切片，切片厚度为12μm，在荧光显微镜下观察生物活性肽是否能透过大鼠表皮进入真皮层。

五、实验结果

结果可见图2，FITC处理的大鼠发现FITC只定位在大鼠表皮，未进入真皮层，并且在表皮的荧光信号强；FITC-GCF处理大鼠背部皮肤1.0h后，发现荧光信号不仅定位在表皮，真皮层也有荧光标记的细胞，说明该生物活性肽可穿过皮肤表皮进入真皮层；FITC-FGCG F处理的大鼠发现荧光信号也进入真皮层，并且荧光信号特别强，说明该生物活性肽也可穿过皮肤表皮进入真皮层。通过比较单纯FITC与FITC标记的本发明肽穿透皮肤的能力，发现单纯FITC是不能透过皮肤表皮的，而本发明肽可携带FITC穿过皮肤表皮，进入真皮。

【实施例3】生物活性肽对UVB辐射人真皮成纤维细胞具有保护作用

本实施例用人真皮成纤维细胞作为实验对象，正常人真皮成纤维细胞用1mM的各多肽处理后，用MTT法去评价细胞活力，观察各多肽对于真皮成纤维细胞是否有毒性；另一部分细胞在UVB(辐射强度为1.176×10^-4J/cm²)氧化损伤情况下，用200μM的各多肽处理成纤维细胞，用MTT法去评价细胞的活力，从而判断各多肽对人真皮成纤维细胞的氧化损伤是否发挥保护作用。本实施例所用多肽如下：

一、实验主要试剂及仪器

实验中各多肽均由本实验室自主合成；人真皮成纤维细胞，由武汉大学保藏中心提供；DMEM,由Hyclone公司提供；小牛血清，Hyclone公司提供；青霉素钠,80万单位/支，由华北制药股份有限公司提供；硫酸链霉素，100万单位/支，由山东鲁抗医药股份有限公司提供；MTT,由sigma公司提供；胰蛋白酶，由Gibco公司提供；培养箱，来自于SANYO公司，培养条件是37℃,5％CO₂；酶标仪,美国Bio-Tek公司；其余部分试剂全为国药集团化学试剂有限公司提供的分析纯试剂。

二、主要溶液的配置

1、D-Hanks液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH₂PO₄ 0.06g，Na₂HPO₄ 0.06g，加双蒸水溶解，用NaHCO₃调PH至7.2，定容到1000ml。

2、DMEM培养基：配成含10％小牛血清，100μg/ml青霉素钠，100μg/ml硫酸链霉素水溶液，PH 7.2-7.4，过滤除菌，-20℃保存备用。

3、胰蛋白酶:用D-Hanks液配成0.125％的溶液，过滤除菌，-20℃保存备用。

4、MTT:用D-Hanks液配成5mg/ml的溶液，PH 7.2-7.4，过滤除菌，4℃避光保存，二周内有效。

三、实验原理

MTT的原理：是一种检测细胞活性的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原形成不溶于水的蓝紫色结晶甲臜，然后甲臜在细胞中沉积，形成MTT结晶甲臜的量与活细胞的数量成正相关关系。加入DMSO后可溶解结晶甲臜，然后在570nm波长处测吸光值，此值可反映所测活细胞数或细胞活力。

四、实验方法

购买的人真皮成纤维细胞接种于含DMEM培养基的培养瓶中，静置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待成纤维细胞生长融合约80％时，用0.125％胰蛋白酶消化，按1：3或1：4进行传代培养。取生长状态良好的细胞，胰蛋白酶消化后，200g离心5min,重悬细胞于DMED培养基中，接种于96孔培养板，调节细胞浓度为2×10⁴/孔，每孔终体积为100μl,培养24h使细胞融合约80-90％。

细胞随机分为对照组和处理组，每组设4个复孔，各孔细胞经D-Hanks液洗后，加入含1mM各多肽的DMEM培养液，继续培养24h后，弃上清，每孔加入新的DMEM培养液，再加入MTT溶液20μl，继续培养4h后终止培养，弃去上清液，每孔加入DMSO 100μl，震荡5min，以充分溶解formazan，酶标仪上490nm波长处检测各孔的吸光度(A₄₉₀)值，DMEM调零。

另一部分细胞随机分为13组：对照组(不经UVB辐射，无多肽)、UVB模型组(UVB辐射，无多肽)、UVB+GCF组(UVB辐射，200μM GCF)、UVB+Ac-GCF组(UVB辐射，200μM Ac-GCF)、UVB+(GC)₄F组(UVB辐射，200μM(GC)₄F)、UVB+(GC)₈F组(UVB辐射，200μM(GC)₈F)、UVB+GCGF组(UVB辐射，200μM GCGF)、UVB+FGC组(UVB辐射，200μM FGC)、UVB+FGCG组(UVB辐射，200μMFGCG)、UVB+FGCF组(UVB辐射，200μM FGCF)、UVB+F(GC)₄F组(UVB辐射，200μM F(GC)₄F)、UVB+F(GC)₇F组(UVB辐射，200μM F(GC)₇F)、UVB+FGCGF组(UVB辐射，200μM FGCGF)。每组设4个复孔，同时设4个空白对照孔，作为调零孔。4支平行UVB的灯管为UVB光源，UVR辐照计测定UVB辐照强度为1.176×10^-4J/cm²，辐照2h。多肽预处理30min，辐照2h后，弃上清，各孔细胞经D-Hanks液洗后，加入DMEM培养液，每孔加入MTT溶液20μl，继续培养4h后终止培养，弃去上清液，每孔加入DMSO 100μl，震荡5min，以充分溶解formazan，酶标仪上490nm波长处检测各孔的吸光度(A₄₉₀)值，DMEM调零。细胞存活(％)＝(A_实验组-A_背景)/(A_对照组-A_背景)×100％。

五、实验结果

MTT法测定各组A₄₉₀值如图3和4所示。图3中，与对照组相比，1mM各生物活性肽处理组细胞活性无影响，说明本专利生物活性肽对于正常的人真皮成纤维细胞无毒性；图4中，与对照组相比，UVB辐射可显著降低细胞的活性，有显著差异(P<0.05)，表明造模成功。Ac-GCF是稳定形式的GCF，不能水解生成相应的甘氨酸和半胱氨酸，用GCF和Ac-GCF处理细胞发现GCF活性肽能显著升高UVB氧化损伤的细胞活性，对人真皮成纤维细胞有保护作用，而Ac-GCF无作用，说明本发明生物活性肽需水解生成相应的功能基团才能发挥保护作用。其余活性肽各组的吸光值均升高，其中(GC)₄F、GCGF、FGC、FGCG、FGCF、F(GC)₄F和FGCGF组与UVB模型组比有显著差异(P<0.01)。

【实施例4】GCF生物活性肽对小鼠B16黑色素瘤细胞的生长无影响

一、实验仪器及试剂

小鼠B16黑色素瘤细胞，由武汉大学保藏中心提供；RPMI1640培养基，由Gibco公司提供；MTT,由sigma公司提供；DMSO由Amresco公司提供。

二、实验方法

购买的小鼠B16黑色素瘤细胞接种于RPMI1640培养基(含10％小牛血清，100μg/ml青霉素钠，100μg/ml硫酸链霉素)中，静置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞生长融合约80％时，用0.125％胰蛋白酶消化，按1：3或1：4进行传代培养。取生长状态良好的细胞，胰蛋白酶消化后，200×g离心5min,重悬细胞于RPMI1640培养基中，接种于96孔培养板，调节细胞浓度为2×10⁴/孔，每孔终体积为100μl,待细胞完全贴壁后，弃去培养液，加入100μl含GCF(0.01-10mM)的培养液，继续培养72h后弃培养液，各孔细胞经D-Hanks液洗后，加入80μl培养液，每孔再加入MTT溶液20μl，继续培养4h后终止培养，弃去上清液，每孔加入DMSO 100μl，震荡5min，以充分溶解formazan，酶标仪上490nm波长处检测各孔的吸光度(A₄₉₀)值。每一浓度设4个复孔，取平均值。每一次实验均取同一传代细胞。细胞增殖率＝(A_实验组-A_背景)/(A_对照组-A_背景)×100％。三、实验结果

结果如图5所示，以GCF为效应物，DMSO为背景，研究GCF对小鼠B16黑色素瘤细胞生长速率的影响，发现当GCF浓度为0.1-10mM时，用GCF生物活性肽处理细胞，对细胞生长无影响，表明GCF生物活性肽对小鼠B16黑色素瘤细胞无毒性。

【实施例5】GCF抑制小鼠B16黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性

一、实验药品及试剂

L-多巴(L-DOPA)，由sigma公司提供；TritonX-100，DMSO由Amresco公司提供。

二、主要溶液的配制

1、1％TritonX-100：用D-Hanks稀释TritonX-100至1％的浓度，4℃保存备用。

2、L-DOPA：用D-Hanks溶解多巴，终浓度为1.0mg/ml，4℃保存备用。

三、实验方法

取生长状态良好的小鼠B16黑色素瘤细胞，胰蛋白酶消化后，200×g离心5min,重悬细胞于RPMI1640培养基中，接种于96孔培养板，调节细胞浓度为2×10⁴/孔，每孔终体积为100μl,待细胞完全贴壁后，弃去培养液，加入100μl含GCF(0.001-1000mM)的培养液，继续培养72h后弃培养液，各孔细胞经D-Hanks液洗涤后，每孔加入体积分数为1％TritonX-100的D-Hanks缓冲液90μl培养液，然后加入10μl 1.0mg/ml L-DOPA，超声30sec，随后置于30℃烘箱中30min，在波长为475nm处测吸光值。每一浓度设4个复孔，取平均值。每一次实验均取同一传代细胞。酪氨酸酶活力(％)＝(A_实验组-A_背景)/(A_对照组-A_背景)×100％。

四、实验结果

结果可见图6，以GCF为效应物，研究不同浓度GCF对小鼠B16细胞中酪氨酸酶活力的影响，发现GCF对细胞内酪氨酸酶的活性具有较强的抑制作用，当GCF的浓度为10mM时，GCF对酪氨酸酶的抑制达到饱和，抑制率为70-80％，导致细胞内酪氨酸酶活力下降的GCF浓度IC₅₀为0.06mM。

【实施例6】生物活性肽GCF护肤液制备

1g甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽冻干粉分装到1000个已灭菌的管制冻干瓶中，真空封瓶，储存于-20或-80℃，每瓶含甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽1mg,每瓶肽冻干粉需用15ml护肤水溶解,直接涂抹于需要美白的皮肤处，现配现用，未用完护肤液放入4℃保存，1-2周内用完。

Claims

1.一类具有抑制黑色素合成活性的生物活性肽在皮肤美白中的应用，其特征在于，所述的生物活性肽的氨基酸序列如式I，

X1 -(Gly-L-Cys)n-X2- X3（I），式中，

X1是无或L-Phe

X2是无或Gly

X3是无或L-Phe

X1和X3不能同时为无，n≤8

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的式I选自下组任意一种：

a、NH₂-Gly-Cys-Phe-COOH；b、NH₂-(Gly-Cys)₄-Phe-COOH；c、NH₂-(Gly-Cys)₈-Phe-COOH、d、NH₂-Gly-Cys -Gly-Phe-COOH；e、NH₂-Phe-Gly-Cys-COOH；f、NH₂-Phe-Gly-Cys-Gly-COOH；g、NH₂-Phe-Gly-Cys -Phe-COOH；h、NH₂-Phe -(Gly-Cys)₄-Phe-COOH；i、NH₂-Phe -(Gly-Cys)₇-Phe -COOH；j、NH₂-Phe-Gly-Cys -Gly-Phe-COOH。

3.权利要求1或2式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物，通过不加或加入化妆品、护肤品辅料在皮肤美白中的应用。

4.权利要求1或2式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物作为化妆品或护肤品添加剂的用途。

5.权利要求1或2式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物，通过不加或加入药物制剂辅料在制备用于预防和治疗黑色素过多导致的人体色素沉着性疾病药物中的应用。

6.权利要求1或2式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物，通过不加或加入药物制剂辅料在制备用于预防和治疗黑色素瘤的药物中的应用。

7.权利要求1或2式I所示的生物活性肽中的一种或它们的混合物，通过不加或加入药物制剂辅料在制备用于预防和治疗其他需要抑制酪氨酸酶活性的病症的药物中的应用。