CN115125211A - 免疫治疗疗效评价用结肠癌腹膜转移小鼠模型 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适用于生物免疫治疗疗效评价的动物模型。所述模型的构建方法包括如下步骤，将小鼠结肠癌细胞株及稳定表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞株细胞培养均在培养基中进行细胞的培养，且所述培养基中含10%胎牛血清、1%青霉素‑链霉素；收集小鼠结肠癌细胞株或稳定表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞株细胞并调节至细胞悬液，腹腔注射入构建小鼠腹膜转移模型。本模型存活时间短，易观察，可客观反应免疫治疗的疗效，因此作为评价指标更具有代表性，有望成为免疫治疗评价的金标准。本发明的模型用于评价免疫治疗的有效性。
Description
本发明涉及一免疫治疗疗效评价用小鼠模型及其制备方法。
背景技术
PD-1单抗是当前最受关注的肿瘤免疫治疗药物，仅国内自主研发的相关产品就有4款获批上市。然而，单纯使用PD-1抑制剂临床疗效和长期缓解率都较低，为了突破瓶颈进一步提高疗效，多种有关免疫治疗的研究在火热开展。但免疫治疗的疗效评价是亟待解决的课题。
与传统的放化疗不同，免疫治疗存在着特殊的应答方式，如延迟应答、假性进展、分离式应答反应等，目前常用的实体瘤的疗效评价 (Response Evaluation Criteria inSolid Tumors ，RECIST) 标准，不足以全面准确评价 PD-1 抑制剂的疗效，这给临床实践带来了极大的挑战（1）。如能及时准确进行疗效评价，可避免对非典型反应的误判，进而做出更为准确的治疗决策。因此，探索免疫治疗的疗效评价的动物模型构建具有重要的临床价值。
对于恶性肿瘤患者，生存时间是评价治疗疗效最可靠的指标。目前，临床前免疫治疗疗效评价最常用的动物模型为小鼠皮下移植瘤模型，但其生存期观察困难；另一可观察指标皮下肿瘤体积容易受假性进展的干扰而会降低评价的精确性。因此，一种容易观察生存期的动物模型的构建具有重要的意义。
根据美国癌症学会数据统计报告，2020年全球新诊断癌症1930万例，死亡病例990万例，其中结直肠癌患者占发病的第三位，死亡率的第二位（2），在结肠癌的死亡原因中，最常见的就是远处转移（3）。其中，腹膜转移是结直肠癌第二最常见的转移部位（4），且一旦发生腹膜转移，则病情进展迅速，治疗难度大，据报道（5），结肠癌发生腹膜转移后，中位总生存期为13-22个月，急需新的治疗手段来突破这一临床难题。
由此可见，结肠癌是全球常见恶性肿瘤之一，其腹膜转移发生率高，发生腹膜转移后生存期短，生存期短正方便观察、有利于治疗效果的体现。为了更好的评价免疫治疗疗效，以小鼠结肠癌腹膜转移模型为研究对象，具有重要的临床价值。
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发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种免疫治疗疗效评价用结肠癌腹膜转移小鼠模型及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
结肠癌腹膜转移小鼠模型的构建方法，包括如下步骤，
S1、将小鼠结肠癌细胞株及稳定表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞株细胞培养均在培养基中进行细胞的培养，且所述培养基中含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-链霉素双抗；
S2、收集小鼠结肠癌细胞株或稳定表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞株细胞并调节至细胞悬液，腹腔注射入构建小鼠腹膜转移模型。
优选地，所述培养基为RPMI-1640。
优选地，所述S2中细胞悬液至5×105/ml，腹腔注射入200ul构建腹膜转移模型。
优选地，以上任意一种所述的结肠癌腹膜转移小鼠模型的构建方法构建的小鼠模型。
优选地，以上所述的结肠癌腹膜转移小鼠模型的构建方法构建的小鼠模型在用于评价免疫治疗法治疗肠癌腹膜转移有效性上的应用。
本发明的有益效果体现在：本发明的模型用于评价免疫治疗法治疗肠癌腹膜转移有效性，为临床试验的开展提供充分的实验基础，且可建立准确的实验数据。
附图说明
图1：小鼠腹部膨隆明显的照片显示示意图。
图2：小鼠腹腔内多发癌结节的照片显示示意图。
图3：小鼠腹腔内癌结节HE染色示意图。
图4：小鼠腹部照射范围，框选区域表示照射野，（从左至右依次为10%腹部照射组，20%腹部照射组，50%腹部照射组，100%腹部照射组）。
图5：小鼠生存期示意图。
图6：治疗期间各组小鼠体重变化示意图。
图7：治疗期间各组小鼠腹围变化示意图。
图8： PRaG早治疗组小鼠生存期。
图9：早期各治疗组小鼠活体成像图片：小鼠腹腔注射CT26.WT/LUC细胞，从治疗当天开始，每隔四天进行活体成像，共6次。
图10：早治疗组小鼠活体成像荧光值分析示意图。
图11：PRaG晚治疗组小鼠生存期
图12：晚治疗组治疗期间活体成像：小鼠腹腔注射CT26.WT/LUC细胞，从治疗当天开始，每隔四天进行活体成像，共5次。
图13：晚治疗组小鼠活体成像荧光值分析示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种结肠癌腹膜转移小鼠模型的构建方法及其应用。以下以具体实施例进行说明。
采用动物为，SPF级Balb/c小鼠，雄性，6-8周龄，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。
涉及的肿瘤细胞株，小鼠结肠癌细胞株CT26.WT购于武汉普诺赛生命科技有限公司，稳定表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞株CT26.WT/LUC购于上海富衡生物科技有限公司。
主要仪器为：X射线机（RAD SOURCE RS 2000），荧光剂化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司，ChemiScope 6200 Touch）。
主要药物及试剂：重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）由厦门特宝生物工程股份有限公司提供；PD-1抑制剂由信达生物科技有限公司提供；培养基RPMI-1640购自Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；戊巴比妥购自Biohonren公司，荧光素钾盐购自Promega公司。
具体实施步骤如下：
1.细胞培养：CT26.WT及CT26.WT/LUC细胞培养均在RPMI-1640中，含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-链霉素双抗。
腹膜转移模型构建：收集CT26.WT或CT26.WT/LUC细胞并调节至细胞悬液至5×105/ml，腹腔注射入200ul构建腹膜转移模型。
本模型在免疫治疗评价中的应用
3.1小鼠分组及给药
实验分为对照组（CON），rmGM-CSF联合PD-1抑制剂组（PG），局部照射组（Ra），局部照射联合rmGM-CSF联合PD-1单抗组(PRaG)，照射时除需要照射的区域，其余部位予以铅板遮挡；rmGM-CSF予以100ng/只/次腹腔注射，共6或8次；PD-1抑制剂予以0.5mg/kg/次腹腔注射，共3或4次。
小动物活体成像
使用0.1%的戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠（7ul/g），待小鼠麻醉倒下后，腹腔注射200ul荧光素钾盐溶液（15mg/ml），10分钟后进行成像，曝光1分钟获取荧光图像。
统计分析
本实施例中所有给出的数据是至少三个独立实验的平均，结果表示为平均值±均数的标准误差。处理组和对照组之间的比较采用SPSS软件进行log-rank检验，独立样本t检验，P值<0.05被认为是有统计学意义的。
结论：
1.成功构建小鼠结肠癌腹膜转移模型
小鼠腹腔注射1*105的CT26.WT后，第10天左右小鼠腹围开始逐渐增大，存活时间约20天，小鼠自然死亡后打开腹腔，可见散在多发癌结节，随机取出其中一个癌结节进行HE染色，如图1-图3所示，可见细胞聚集成片，核质比例明显失调，细胞核体积显著增大，染色质明显增多增粗，呈蓝紫色。这一结果提示结肠癌腹膜转移模型构建成功。
小鼠结肠癌腹膜模型成功用于评价免疫治疗疗效
虽然肿瘤治疗已进入免疫治疗时代，但单纯使用PD-1抑制剂的有效率还是比较低，因此其发展进入了瓶颈期。而PD-1联合其他方式的抗肿瘤治疗可能是其发展的突破口。近期本课题组自主设计了晚期肿瘤治疗的临床新方案，该技术被命名为“布拉格治疗”(PD-1 inhibitor, Radiotherapy and GM-CSF, PRaG)。此方法通过放射治疗增敏PD-1抑制剂的疗效，拓宽了PD-1免疫治疗的抗癌谱，其实质是通过局部放射治疗杀伤患者体内的肿瘤细胞，释放肿瘤新抗原，进而形成“瘤苗效应”，后辅以GM-CSF激发抗原提呈，启动放射远隔效应，在此基础给予PD-1抑制剂，从而增强CD8+T细胞的肿瘤杀伤能力，最终介导高效而广谱的抗肿瘤效应。布拉格治疗的实质是免疫治疗，因此我们以我们的方案为例，使用本发明中的模型进行疗效评价。
确定对构建结肠癌腹膜转移模型进行照射的照射范围
腹部具有肝、肾、肠等重要脏器，照射由于腹腔内小肠的耐受剂量低受到限制，本实施例的照射剂量选择为8Gy×3，为了确认在该照射剂量下的安全性，随机测量了10只6-8周龄的Balb/c小鼠的腹部宽度，约为3cm，以3cm的宽度为100%，1.5cm的宽度为50%，0.6cm的宽度为20%，0.3cm的长度为10%，设置五个组，对照组（CON），10%腹部面积照射组（Ra-10%），20%腹部面积照射组（Ra-20%），50%腹部面积照射组（Ra-50%），100%腹部面积照射组（Ra-100%），监测各组小鼠的生存期及体重以明确不同面积照射的安全性，同时监测小鼠腹围观察腹部局部放疗对腹腔瘤体控制的有效应。
结合图4-图8所示，其中图中的数值表示均数±标准误。*代表P值＜0.05 vs CON，**代表P值＜0.01 vs CON ，***代表P值＜0.001 vs CON。结果显示：Ra-100%组和Ra-50%组，小鼠均在照射后体重显著下降，并在一周内全部死亡，而Ra-20%组和Ra-10%组在20天内均未出现死亡，但Ra-20%组照射后短期内小鼠的体重下降显著，提示20%面积的照射存在肠道损伤，Ra-10%组小鼠体重未见明显的下降，腹围结果提示，Ra-10%以及Ra-20%组腹围在照射后一直低于对照组，其中Ra-20%组最为明显，种瘤开始至第20天，Ra-10%组腹围为对照组的0。94，Ra-20%组为对照组的0.91倍，但无统计学差异。综上，Ra-20%组或许拥有更好的肿瘤控制，但其照射后短期内体重下降明显，提示存在肠道损伤，故后期的试验选择10%的照射面积。
小鼠结肠癌腹膜转移瘤用于PRaG治疗疗效评价
上一过程中确定了腹部局部照射的范围为10%（位于下腹部），本部分实验根据治疗干预的时间分为早期干预组和晚期干预组，生存期结果如图8-图13显示，其中*代表p＜0.05 vs CON；#代表p＜0.05 VS PG：不管是早期干预还是晚期干预，我们从生存期上可以明显区别不同治疗组之间的差异，PRaG方案均可显著延长小鼠的生存期，早治疗组中，CON、PG、Ra、PRaG四组小鼠的中位生存期分别为：26d、28d、33d、52d；晚治疗组中，CON、PG、Ra、PRaG四组中位生存期分别为：24d、26d、25d、29d。另外，治疗期间每组选取3只进行小动物活体成像分析，我们可以观察出：治疗当天，各组小鼠的荧光值无差异，在治疗开始后，可通过荧光值的变化清晰的反应各治疗组小鼠体内肿瘤的生长受到抑制，其中PRaG组的抑制最明显。
本发明模型通过最终获益的生存期作为主要观察指标，短期内的疗效可以通过活体成像监测体内肿瘤生长情况。可以利用多个指标评价治疗疗效。
当然本发明尚有多种具体的实施方式，在此就不一一列举。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
Claims (6)
1.免疫治疗疗效评价用动物模型。
2.如权利要求1所述的免疫治疗疗效评价用动物模型为结肠癌腹膜转移小鼠模型。
3.如权利2所要求的结肠癌腹膜转移小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤，
S1、将小鼠结肠癌细胞株及稳定表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞株细胞培养均在培养基中进行细胞的培养，且所述培养基中含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-链霉素双抗；
S2、收集小鼠结肠癌细胞株或稳定表达荧光素酶的小鼠结肠癌细胞株细胞并调节至细胞悬液，腹腔注射入构建小鼠腹膜转移模型。
4.如权利要求3所述的结肠癌腹膜转移小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述S2中细胞悬液至5×105/ml，腹腔注射入200ul构建腹膜转移模型。
5.如权利要求1-4中任意一种所述的结肠癌腹膜转移小鼠模型的构建方法构建的小鼠模型。
6.如权利要求5所述的结肠癌腹膜转移小鼠模型的构建方法构建的小鼠模型在用于评价免疫治疗有效性上的应用。
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