CN111000802B - 一种抗菌肽脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗菌肽脂质体制剂及其制备方法，所述抗菌肽脂质体制剂由两亲性的脂肽和胆固醇、磷脂制备而成，其中，所述脂肽的脂肪链为C14‑18，亲水部分为由4‑6个氨基酸组成的短肽。所述制备方法为醇注入法。本发明通过构建并筛选出合适的抗菌脂肽，将该抗菌脂肽装载在合适的脂质体磷脂双分子层膜表面，这种方式可以将抗菌肽容易引起溶血的疏水部位屏蔽起来，只暴露带正电荷的亲水部位，提高脂质体表面电荷密度，增强所述制剂识别细菌的能力，同时降低药物的毒副作用。另外，当脂质体通过膜融合发挥药效的时候，可以将抗菌肽高效传递到其作用部位(细菌细胞膜)，从而提高了抗菌肽的治疗效果。

Description

一种抗菌肽脂质体制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地是涉及一种抗菌肽脂质体制剂及其制备方法。

背景技术

抗菌肽由于其广谱的抗菌活性和抗多重耐药菌的能力，被认为是最有望替代传统抗生素的新型药物之一。抗菌肽，也称为宿主防御肽，是抵抗侵袭性感染的先天免疫防御系统的重要组成部分。抗菌脂肽(Lipopeptide)是其中代表性的一类，具有两亲性结构，其亲水嵌段由带正电的短肽构成，而疏水嵌段由脂肪酸构成。

抗菌脂肽通过静电作用，与细菌细胞膜表面的负电荷结合，然后将疏水的脂肪链插入细菌细胞质膜中促进穿膜，进而通过独特的破膜机制，达到杀菌效果。两亲性结构是抗菌脂肽的主要特点。虽然抗菌脂肽具有抗菌活性好，杀菌效率高，不容易产生耐药等特点，然而由于很多抗菌脂肽的选择性不够好，在体内发挥杀菌作用的同时，也容易结合正常的哺乳动物细胞产生毒副作用（如溶血等），因此此类药物被真正应用到临床治疗的少之又少。另外，作为多肽类药物，其在体内容易被酶所降解，稳定性较差，半衰期短，这些问题也成为了限制其应用的重要原因。

在现有的抗菌肽递药系统中，脂质体是一种较为理想的载体，除了具备较好的生物相容性外，脂质体还能通过膜融合的方式实现药物的高效递送。根据药物的性质，疏水性药物一般被载在双分子层膜中，而亲水性药物常被装载在脂质体的内水相中。常见的抗菌肽载药脂质体主要采用后面的方式将极性较高的两亲性抗菌肽包裹于脂质体的内水相。这种载药方式虽然有利于提高抗菌肽抵抗体内酶降解的能力，改善药物的体内分布，提高药物体内半衰期，然而由于多肽的活性位点（亲水区域）被屏蔽，这种载药方式不利于抗菌肽与细菌的静电结合。

因此，设法把两亲性抗菌肽装载在脂质体膜上，将抗菌脂肽的疏水链段嵌入脂质体的疏水层，同时把脂肽的活性位点（亲水区域）暴露于脂质体表面，这种载药方式不但有利于屏蔽抗菌脂肽容易结合哺乳动物细胞进而诱发溶血的疏水区域，还有利于将抗菌肽特异性结合细菌的活性位点富集于脂质体表面，进而促进脂质体与细菌的结合。另外，利用脂质体独特的膜融合递药方式，抗菌脂肽递送到膜上的递药效率很高。

市面上很少见到把抗菌肽装载于脂质体膜上的报导，其原因主要有两个方面。第一，由于常见的抗菌肽水溶性较好，极性大，亲水与疏水区域的界限不明显，这些抗菌肽在脂质体的双层膜上相容性较差；第二，传统抗菌肽脂质体的制备工艺忽视了对其载药方式的工艺探索与优化。因此，设计适合装载到脂质体膜上的抗菌脂肽，同时对其制备工艺进行严格筛选进而促进药物在脂质体膜上的富集，才是制备出新一代低毒高效抗菌脂质体的合理策略。

现有的抗菌肽载药脂质体通常采用薄膜分散法或醇注入法制备，但制备出来的脂质体主要是把抗菌肽装载于脂质体的内水相，其载药方式与本项目的设计不同。虽然也有把抗菌肽装载于脂质体膜上的报导，但是该工作是将抗菌肽接上胆固醇后再和大豆卵磷脂混合制备而成，其抗菌药物和脂质体的成分与本项目的设计不同。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗菌肽脂质体制剂，提高对于细菌的选择性，增强抗菌效果，同时降低毒副作用。

实现上述目的的技术方案如下。

一种抗菌肽脂质体制剂，其由两亲性的脂肽和胆固醇、磷脂制备而成，所述脂肽由亲水部分的短肽和疏水部分的脂肪链构成，其中，所述脂肽的脂肪链为C14-C18脂肪链，亲水部分为由4-6个氨基酸组成的短肽。

本发明的另一个目的是提供上述抗菌肽脂质体制剂的制备方法，该制备方法得到的脂质体粒径较小、均一。

实现上述目的的制备方法如下。

上述抗菌肽脂质体制剂的制备方法，包括以下步骤：

称取所述胆固醇、磷脂和抗菌肽，溶解于无水乙醇中得到油相，超纯水作为水相；

随后，在水浴、搅拌的条件下，缓慢逐滴把油相滴入到水相中，并继续加热搅拌；

除去游离抗菌肽，即得。

本发明通过设计并筛选出最佳抗菌脂肽，通过醇注入法直接将其装载在脂质体的磷脂双分子层膜上，制备得到的抗菌脂肽脂质体表面电荷密度高，选择性好。

在其中一个实施例中，脂肪链为C16。

在其中一个实施例中，所述短肽为带正电荷的短肽，更进一步优选为赖氨酸和/或精氨酸。更进一步地，所述氨基酸序列为：KKKK，RRRR，KRKR，或KRKRKR。

在其中一个实施例中，脂肽与胆固醇加磷脂用量的总和比为：25-35：65-75，总和100；进一步优选为28-32：68-72，总和为100，更优选为30:70。

在其中一个实施例中，胆固醇在胆固醇和磷脂的总量中占比为25-35%；进一步优选为28-32%，更优选为30%。

在其中一个实施例中，所述磷脂为卵磷脂，更进一步优选为氢化卵磷脂。

在其中一个实施例中，所述制备方法为醇注入法。

在其中一个实施例中，在37±1℃水浴、1000±10 rpm的转速搅拌，缓慢逐滴把油相滴入到水相中，并继续加热搅拌30±1 min。

在本发明中，我们构建并筛选出合适的抗菌脂肽，通过将该抗菌肽装载在合适的脂质体磷脂双分子层膜表面，这种方式可以将抗菌脂肽容易引起溶血的疏水部位屏蔽起来，只暴露带正电荷的亲水部位，提高脂质体的表面电荷密度，增强所述制剂识别细菌的能力，同时降低药物的毒副作用。另外，当脂质体通过膜融合发挥药效的时候，可以将抗菌脂肽高效传递到其作用部位，即细菌细胞质膜上面，从而提高了抗菌脂肽的治疗效果。

附图说明

图1、 PBS、空白脂质体、C16-RRRR及LipC16-RRRR分别与细菌培育后的SEM图像。

图2、 PBS、C16-RRRR及LipC16-RRRR与细菌培育、染色后激光共聚焦成像图。

图3、 C16-RRRR及LipC16-RRRR对293T、L02和HaCaT细胞株的细胞毒性测定。

图4、 尾静脉注射PBS，C16-RRRR，LipC16-RRRR和蜂毒肽后小鼠各主要器官的组织H＆E染色切片图。

图5、PBS、C16-RRRR，LipC16-RRRR、蜂毒肽和强力霉素体内药效实验结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

我们通过分析脂质体与抗菌肽的结构，发现将抗菌脂肽载在脂质体膜上的优势更大：1、抗菌脂肽亲水活性位点暴露在脂质体表面，有利于提高脂质体识别细菌的能力；2、抗菌脂肽疏水部分嵌入脂质体膜上，有利于降低抗菌脂肽的溶血副作用；3、脂质体的膜融合递药方式有利于脂质体膜上的抗菌脂肽较好地递药到细菌膜上。

然而，进一步发现要将抗菌脂肽载在脂质体表面，对抗菌脂肽的结构有一定的要求：1.要有两亲性，其亲水与疏水区域的界限要明显；2.亲水部分不能比重太大，否则水溶性和极性太好，多肽在疏水层的相容性差；3.疏水部分不能太长，否则脂肽在脂质体双层膜的相容性太好，不利于其亲水活性位点自发暴露在脂质体表面。更进一步研究发现，抗菌脂肽带电基团4个左右为最佳，氨基酸种类最好是赖氨酸或者精氨酸，疏水部分为棕榈酸。因此，要制备抗菌活性高且副作用低的抗菌脂质体，需要对抗菌脂肽结构进行设计与筛选。

当抗菌脂肽的头部含4或6个氨基酸的时候，该抗菌脂肽的cLog P值越接近0，因此我们选择4或6个氨基酸组成抗菌脂肽的亲水头部。所合成的四条抗菌脂肽的cLog P分别为C16-KRKRKR(-1.391)，C16-KRKR（1.0932），C16-RRRR（-1.689），C16-KKKK（3.8312），均比较接近0。

本发明为了制备得到合适的抗菌脂肽脂质体制剂，选择了醇注入法制备， 并优化了各原料的最佳比例，其中脂肽与胆固醇加磷脂用量的总和比为：25-35：65-75，总和100；进一步优选为28-32：68-72，总和为100，更优选为30:70；而且，胆固醇的用量在制剂中也比较重要，当其在胆固醇和磷脂的用量中占比为15-45%，优选为25-35%，进一步优选为28-32%，更优选为30%时，制剂具有比较小的粒径，比较高的电位，有利于抗菌脂肽载在脂质体层膜上，同时包封率和载药量也都较高。

实施例1

通过前期大量的实验，最后设计了四种脂肽，分别为C16-KKKK、C16-RRRR、C16-KRKR、 C16-KRKRKR。采用醇注入法制备载抗菌脂肽的脂质体，包括以下步骤：

精确称取一定量胆固醇（16.8 mg）、氢化卵磷脂（39.2mg）和24 mg抗菌脂肽（共80mg）超声溶解于1 mL无水乙醇中得到油相，量取6 mL超纯水作为水相；

随后，在37℃水浴的条件下一边以1000 rpm的转速搅拌，一边缓慢逐滴把油相滴入到水相中，并继续加热搅拌30 min。

将载药脂质体通过透析除去游离抗菌肽。

通过以上制备方法得到lipC16-KKKK、lipC16-RRRR、lipC16-KRKR、lipC16-KRKRKR。

实施例2 脂质体制备方法比较

1.分别使用薄膜水化法、逆向蒸发法和醇注入法（按照实施例1所述方法）制备抗菌脂肽（lipC16-RRRR）脂质体，采用激光粒度分析仪（DLS）测量脂质体粒径及电位。并将制得的脂质体分别对具有代表性的革兰氏阴性菌（P. aeruginosa，铜绿假单胞菌）和革兰氏阳性菌(MRSA，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)进行最小抑菌浓度的测定。

薄膜水化法：用500μL甲醇和氯仿的混合溶剂（1:1）溶解磷脂、胆固醇和抗菌脂肽（C16-RRRR），然后用氮气将溶剂缓慢吹干，使磷脂、胆固醇和抗菌脂肽形成薄膜。加入2mL超纯水对薄膜进行水化，然后涡旋1min，超声3min得到脂质体。

逆向蒸发法：磷脂和胆固醇溶在4mL氯仿中作为油相，抗菌脂肽（C16-RRRR）溶在1mL超纯水中作为水相，在65°C，1000rpm的搅拌下将水相滴入油相中，搅拌10min后减压除去部分溶剂，加入2mL PBS，超声3min得到脂质体。

薄膜水化法和逆向蒸发法所用的磷脂、胆固醇和抗菌肽的质量与醇注入法一致。

测定结果如下表。

当药物浓度一致的时候，脂质体粒径越小则表示该溶液中脂质体数量越多，有更多的脂质体可以用于结合细菌，所以选择粒径小且均一的脂质体更好。

综合考虑各种制备方法所得的脂质体的粒径、电位和杀菌能力，醇注入法所得的脂质体粒径最小且最均一，且杀菌能力更强，可见本发明所设计的醇注入法进行抗菌脂肽脂质体制剂的制备是最合适的。

2. 采用激光粒度分析仪（DLS）测量脂质体粒径及电位。取100μL脂质体用超纯水稀释至1 mL，混合均匀后测定脂质体的粒径和电位。测定温度为25℃，测量前平衡1 min，每次测量3个重复。

载药量与包封率：将含不同胆固醇量的脂质体通过透析除去游离药物，并在250μL脂质体中加入250μL乙醇，进行破乳，使脂质体释放药物后进行HPLC分析，测定抗菌肽的浓度。按照下列公式计算包封率和载药量

包封率（%）=包载入脂质体的药量/投药量×100%

载药量（%）=包载入脂质体的药量/脂质体总质量×100%。

按照实施例1 所述的通过醇注入法制备的C16-RRRR抗菌脂肽脂质体，除了胆固醇在脂质体用量（胆固醇和氢化卵磷脂）中的比例不同，其他相同。

综合考虑所制得的脂质体的粒径、电位、包封率和载药量，当胆固醇比例为30%的时候具有比较小的粒径，比较高的电位、包封率和载药量。

3.抗菌脂质体的筛选

在本实验中通过设计了一系列抗菌脂肽，将其载在脂质体表面得到了一系列脂质体抗菌载体。分别测定它们的粒径与zeta电位，得到相应的数据（如表 1）。

表1：一系列脂质体制剂的大小，zeta电位和PDI

从上表中可以得出，C16-RRRR的脂质体以粒径最小且表面zeta电位最高（粒径为157.77±3.27，表面zeta电位为53.37±1.63），为最佳脂质体抗菌载体。

实施例3

1.MIC测定：

选择六种常见的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，将单个菌种加入10 mL MHB培养基中，放入摇床内孵育6-8小时。待细菌进入对数生长状态后，将其稀释到2×10⁵ CFU/mL，制成细菌悬液。在96孔板中每孔加入50μL PBS（第一个孔不加）；取2 mg抗菌脂肽或者抗菌脂肽脂质体制剂，溶入1 mL超纯水中。取200 µL上述制备的溶液，加入800 µL超纯水，制成400μg/mL溶液，取100μL加至96孔板的第一个孔中，吹打均匀后吸走50μL加入下一个孔中，依此类推，最后一个孔吸走50μL，配制得到0.2到400μg/mL的系列药物溶液。

将稀释得到的细菌悬液以每孔50μL加入到上述含50 μL药物溶液的孔中。在37°C培养箱内孵育18-20小时后，用酶标仪在600nm波长下测试吸光度。记录吸光度低于0.1的药物最低浓度即为可以抑制细菌生长的最低浓度。整个实验过程重复三次。

溶血反应测定：

采集新西兰兔血液于EDTA-K2抗凝管中，3500 rpm条件下离心10 min，弃上清，收集底部红细胞。用PBS缓冲液冲洗红细胞3次，每次都于3500 rpm条件下离心10 min，最后加入PBS缓冲液重悬，配成5% v/v浓度红细胞悬液。

取抗菌脂肽加入PBS缓冲液溶解，配成母液。在96孔板第一孔中加入100 μL抗菌脂肽溶液或者抗菌脂肽脂质体制剂，其他孔中用50μL PBS缓冲液逐步倍比稀释，得到8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.3和15.6 μg/mL浓度的抗菌脂肽溶液或者抗菌脂肽脂质体制剂溶液。取50 μL上述备好的红细胞悬液加入上述抗菌脂肽或者抗菌脂肽脂质体系列稀释液，使他们的浓度分别为4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6和7.8μg/mL。把混合好的样品置于37℃培养箱内恒温孵育1 h。以相同体积的PBS缓冲液作为0%溶血阴性对照，2% Triton X-100作为100%溶血的阳性对照各设三个复孔。

培养结束后，取出96孔板，在3500 rpm下离心10 min。取30 μL上清加入含100 μLPBS缓冲液的另一块96孔板中混匀，用酶标仪在540 nm处测吸光度值。

溶血率（%）=(A_sample - A_PBS) / (A_Triton - A_PBS) × 100%

A_sample：表示药物与红细胞混合物的吸光度

A_Triton：表示阳性对照的吸光度

A_PBS：表示阴性对照的吸光度

最小抑制浓度(MIC)是在共同孵育18-20小时后完全抑制微生物生长的最低浓度，HC₂₅是导致25%溶血率的抗菌肽或制剂浓度。选择性指数（SI）通过HC₂₅的值除以MIC_MRSA的值计算得出，代表该制剂对于MRSA的选择性。当SI越大，表示制剂杀菌作用更好且在更高的浓度才会引起溶血（即副作用低），安全性更好。

从表格1可以看出四条抗菌脂肽都显示了较好的广谱抗菌活性。制成制剂后，抗菌脂肽的活性基本提高或者保持不变，特别是C16-RRRR的制剂相比于原药来说效果提高较为明显。另外，所有制剂的选择性（SI）都有所提高，最高提高了约17倍（ lipC16-KRKR）。C16-RRRR的制剂对所测试的六种菌都表现出较好的抗菌活性。

实施例4

将MRSA（耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌）以及P. aeruginosa（铜绿假单胞菌）单个菌种加入8 mL MHB培养基中，放入培养箱内孵育7 h。各取100 μL菌液继续加入90 mL MHB培养基中进行扩大培养。12 h后，将菌液在3000 rpm下离心15 min，弃上清，用PBS洗2次后加入适宜PBS重悬。取PBS、空白脂质体、以及稀释于PBS中浓度为8×MIC的抗菌脂肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）各800 μL，加入800 μL上述菌液，在200 rpm，37℃下孵育4h。将孵育好的样品于8000 rpm下离心5 min，用PBS洗2次后弃上清。加入1 mL 2.5%戊二醛溶液，吹打均匀后在4℃，200rpm下孵育30 min后于4℃固定过夜。弃掉戊二醛溶液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次。用1%的锇酸溶液固定样品1-2 h，用梯度浓度（包括30%，50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用100%的乙醇处理2次，每次20 min。用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30 min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1 h或放置过夜。临界点干燥。镀膜，在扫描电镜下观察。

抗菌脂肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）对于细菌膜结构的破坏显示在图1中。未经药物处理的细菌表面完整光滑，MRSA呈圆球状，P. aeruginosa呈杆状。空白载体也未造成细菌形态的改变，参见图1中（B）和（F）。

抗菌脂肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）主要富集在细菌表面，造成明显的细胞膜或细胞壁的形貌变化。参见图1中（C）（D）（H）（G）可见，细菌发生皱缩且内容物渗出。对比于原药，制剂组使得细菌形貌变化的更为明显。

实施例5

为了进一步评估抗菌脂肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）的抗菌活性，我们用SYTO 9 和PI染料将其双重染色后进行激光共聚焦成像.将MRSA以及P. aeruginosa培养到对数生长期，用MHB稀释菌液至2×10⁶ CFU/mL，取800 μL菌液与8×MIC浓度的抗菌脂肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）在37 ℃共同孵育2 h。在8000 rpm下离心5 min，弃上清，用PBS洗两次。将收集到的细菌重悬在800 μL PBS中，加入50 μL 100 μM的SYTO9染液和50 μL 600 μM的PI染液，使总体积为1 mL。将染液与菌液吹打均匀，避光孵育15 min。用PBS洗去多余染液后重悬于100 μL PBS中，取10 μL滴于载玻片上，晾干后观察。

SYTO9可以穿透活细胞并将其染成绿色，而PI可以使受损膜的细菌染成红色。未经处理的MRSA和P. aeruginosa为绿色，分别呈球状和棒状。将两种菌分别与抗菌酯肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）孵育后，细菌被不同程度地杀死。LipC16-RRRR可以杀死几乎所有的MRSA和P. aeruginosa，而C16-RRRR只能杀死其中的一部分。 该结果与抗菌活性和SEM成像的结果一致。请参见图2。

实施例6 细胞毒性

以293T、L02和HaCaT细胞株为模型细胞，采用MTT法测定抗菌酯肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）的细胞毒性。收集对数生长期的细胞，以5×10⁴个每孔种入96孔板内，在37 °C，5% CO₂恒温培养箱内培养。待细胞贴壁生长24h后，将抗菌酯肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）溶液逐倍稀释成200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，0 ug/mL，同时以等体积PBS为阴性对照孔，每孔加入100 μL上述药物后，继续在37 °C，5% CO₂恒温培养箱内培养18 h。在每孔中加入10μL MTT溶液，放入培养箱培继续培养4h。培养结束后，吸走含MTT的培养基，每孔加入100 μL DMSO溶液，放入摇床振摇10 min后，用酶标仪在570 nm处测定吸收值（OD值），按照下式计算细胞存活率。

细胞存活率（%）=（药物处理孔的OD值-无细胞对照孔的OD值)/(无处理细胞孔的OD值-无细胞对照孔的OD值）× 100%

如图3，抗菌酯肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）治疗组的细胞存活率在一定范围内呈现浓度依赖性，在3.125 至 100 μg/mL浓度范围内，细胞存活率基本保持在50%以上。在每个浓度下，C16-RRRR对三种细胞的细胞毒性都比LipC16-RRRR大，尤其是当浓度高于100μg/ mL时。在低浓度下，游离的C16-RRRR对LipC16-RRRR的293T和L02表现出相似的细胞毒性。 但是，当游离C16-RRRR的浓度达到200μg/ mL时，细胞存活率下降至10％以下，甚至更低。相反，本发明所述抗菌脂肽脂质体制剂（LipC16-RRRR）在相同浓度下显示出较低的毒性。

实施例7 体内毒性实验

抗菌酯肽（C16-RRRR）及其制剂（LipC16-RRRR）全身毒性考察

取20只18-20 g雄性ICR小鼠，随机分成4组：1）健康组；2）蜂毒肽组；3）C16-RRRR（6mg/mL）；4）LipC16-RRRR（6mg/mL）。分别尾静脉注射100 μL PBS、蜂毒肽溶液、C16-RRRR和LipC16-RRRR。七天后对小鼠实行安乐死，取心、肝、脾、肺、肾用10%多聚甲醛溶液固定后制备石蜡切片，并进行HE染色，评价各组对小鼠内脏的损害情况。

PBS，C16-RRRR，LipC16-RRRR和蜂毒肽处理的小鼠的内脏组织切片如图（4）所示。具体来说，各处理组的药物对小鼠心脏，脾脏，肺和肾脏等脏器的损害较小。但作为阳性对照，用蜂毒肽（阿拉丁，Aladdin）治疗的组的肝脏切片表现出明显的器质性变性。C16-RRRR治疗组的组织中可观察到相对轻微的肝损害，而在LipC16-RRRR治疗组的组织切片未观察到损害现象。结果表明，当把C16-RRRR装载到脂质体中制备成制剂时，全身毒性可以得到改善。

实施例8 体内药效实验

MRSA菌株培养

将单个菌种加入10 mL MHB培养基中，放入摇床内孵育8-10 h。5000 rpm下离心10min，弃上清液，用PBS洗4次后用10 mL PBS重悬。用PBS稀释成1×10⁸ CFU/mL菌液备用。

MRSA感染模型的建立及治疗

取36只18-20 g雄性ICR小鼠，随机分成5组：1）PBS组；2）C16-RRRR组（5mg/mL）；3）LipC16-RRRR（5mg/mL）；4）Melittin（蜂毒肽，5mg/mL）；5）Doxycycline(强力霉素，5mg/mL）。用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，除去背部毛发，皮下注射100 μL上述菌液，标记注射部位。30 min后，待皮肤吸收菌液后在标记部位分别注射100 μL PBS、5mg/mLC16-RRRR、5mg/mLLipC16-RRRR、5mg/mL Melittin和5mg/mL Doxycycline。皮肤吸收菌液后会形成脓肿，于24h和48 h观察皮肤脓肿消退情况，并于48 h对小鼠实行安乐死。取炎症部位皮肤放入均将管内，加入1 mL PBS进行组织匀浆。取10 μL匀浆液加入PBS中倍比稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6系列稀释液。取10 μL系列稀释液点于琼脂板，培养过夜后进行活菌计数。

剩余的组织匀浆液在3000 rpm下离心20 min，取10 μL 稀释到100 μL后用ELISA试剂盒测试IL-6 和TNF-α含量。

在小鼠被感染的48小时后对其背部注射部位进行观察可知（如图5中a），PBS组的小鼠背部可以明显看到红斑，而在C16-RRRR，LipC16-RRRR和强力霉素处理的小鼠中未观察到明显的病变。 经蜂毒肽治疗的小鼠背部也可见轻微的红斑。 在皮下部位，PBS组的小鼠皮肤可明显观察到脓肿。相比之下，用C16-RRRR，LipC16-RRRR和强力霉素治疗的小鼠没有出现任何明显的肿胀现象。菌落计数的结果表明(图5中b），单次注射C16-RRRR和LipC16-RRRR治疗的小鼠皮肤中残留的细菌数量减少了99%以上，且LipC16-RRRR组的治疗效果更好（P<0.05）。

随后，我们通过组织H＆E染色切片对小鼠感染MRSA后不同治疗组的皮肤状态做病理学分析(图5中c）。在PBS治疗组中，急性和慢性炎症浸润细胞渗透到皮质层（主要是中性粒细胞）并伴有局部脓肿。在蜂毒素治疗的小鼠中也可以观察到症状。相反，从C16-RRRR，LipC16-RRRR和强力霉素治疗的小鼠中观察到很少的融合粒细胞。这三组的炎症浸润程度为强力霉素> C16-RRRR> LipC16-RRRR。

白介素（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-a）都在炎症进程中发挥关键作用。 在急性和慢性炎症条件下，TNF-α和IL-6的浓度增加。因此，我们测量IL-6和TNF-α的含量，以研究治疗后小鼠的炎症反应。治疗后所有IL-6含量均下降(参见图5中e），其中以LipC16-RRRR治疗的小鼠表现最低。同样，LipC16-RRRR治疗组的TNF-α含量也为最低（参见图5中d）。

体内实验的所有结果与体外结果一致且相符，表明该实验中本发明所制备得到的抗菌脂肽脂质体制剂在各方面具有优势。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，其由两亲性的脂肽和胆固醇、磷脂制备而成，其中，所述脂肽由亲水部分的短肽和疏水部分的脂肪链构成，所述脂肽的脂肪链为C14-C18脂肪链，亲水部分是由4-6个氨基酸组成的带正电荷短肽，由赖氨酸和/或精氨酸组成；所述制备方法为醇注入法，所述脂肽与胆固醇加磷脂用量的总和比为：25-35：65-75，总和100；所述短肽的氨基酸序列为： RRRR，或KRKR；所述胆固醇在胆固醇和磷脂的总量中占比为25-35%。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，脂肪链为C16。

3.根据权利要求1所述的抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列为RRRR。

4.根据权利要求1所述的抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列为KRKR。

5.根据权利要求1所述的抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，所述脂肽与胆固醇加磷脂用量的总和比为：28-32：68-72，总和100。

6.根据权利要求5所述的抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，所述脂肽与胆固醇加磷脂用量的总和比为30:70。

7.根据权利要求1所述的抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，所述磷脂为卵磷脂。

8.根据权利要求7所述的抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，所述磷脂为氢化卵磷脂。

9.根据权利要求1所述的抗菌肽脂质体制剂，其特征在于，所述胆固醇在胆固醇和磷脂的总量中占比为28-32%。

10.权利要求1所述的抗菌肽脂质体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

称取所述胆固醇、磷脂和抗菌肽，溶解于无水乙醇中得到油相，超纯水作为水相；

随后，在水浴、搅拌的条件下，缓慢逐滴把油相滴入到水相中，并继续加热搅拌；

除去游离抗菌肽，即得。

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