CN114099692B - 一种抗菌肽-细胞膜复合物、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗菌肽‑细胞膜复合物,是在体外将抗菌肽嵌入循环细胞的细胞膜或细胞膜衍生物中形成的。所述抗菌肽包括:SR肽、VK肽、GI肽、RW肽、GK肽或FF肽。所述循环细胞的细胞膜为哺乳细胞的两性磷脂膜。所述抗菌肽‑细胞膜复合物的制备方法包括将抗菌肽溶液与细胞或细胞膜衍生物混合,孵育;孵育结束后除去未结合的游离抗菌肽即得到抗菌肽‑细胞膜复合物。抗菌肽‑细胞膜复合物作为药物或药物载体的应用,解决了抗菌肽在体内对病原菌的靶向性问题,从而改善抑菌疗效,实现病原菌亲和力响应性的精准靶向递送。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,具体涉及一种抗菌肽-细胞膜复合物、制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽(AMPs)是一种抑菌型多肽,目前研究范围已达3000余种,其可以在病原菌的细胞膜上形成跨膜的离子通道而破坏膜的完整性,造成细胞内容物泄漏,从而杀死细胞。因此具有快速、广谱的抗菌活性,且不易产生耐药性,是生物非特异性免疫防御系统的重要组成部分,也是抗生素应用的重要补充。
大多数抗菌肽属于阳离子多肽,具有膜选择性,可与细胞膜阴离子磷脂特异性结合。而哺乳动物膜外侧磷脂主要由磷脂酰胆碱及鞘磷脂等两性磷脂组成,病原菌的膜外侧广泛分布了大量阴离子磷脂(如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇等),这种膜组成的差异性促进了阳离子型抗菌肽体外对病原菌的特异性识别,并降低了其对哺乳动物细胞的作用,这也是抗菌肽在体外具有较好安全性的原因之一。如tritrrpticin、indolicidin及其三种衍生物抗菌肽,通过等温滴定量热法(ITC)测定,它们在阴离子型天然微生物膜上的结合常数比两性离子型POPC膜(模拟哺乳动物细胞膜)的结合常数平均高出2-3个数量级。
但近年来仅有数十个抗菌肽被FDA批准应用于临床或进行临床试验(例如,达托霉素、万古霉素等),且主要应用范围局限于皮肤局部给药。其主要的原因之一是体内存在复杂的生理环境,阳离子抗菌肽可能在进入血液循环的初期与阴离子蛋白(如白蛋白)或阴离子多糖(如糖胺聚糖)等结合。同时其末端的疏水端也可能导致抗菌肽非特异性嵌入体内正常细胞的细胞膜,无法实现后续对体内病原菌选择性靶向识别,抗菌疗效不明显,极大地限制了抗菌肽的临床应用。
因此,解决抗菌肽在体内对病原菌的靶向性问题是提高其体内抑菌疗效的关键。同时开发抗菌肽作为靶向分子的潜力有助于新型病原菌靶向递药系统的构建,这也是实现抗菌肽临床转化应用的关键。
目前尚未有此类研究成功的报道。
发明内容
有鉴于此,为了克服现有技术的不足,本发明提供一种抗菌肽-细胞膜复合物,以改善抗菌肽体内的靶向性。
本发明提供的抗菌肽-细胞膜复合物,是在体外将抗菌肽嵌入循环细胞的细胞膜或细胞膜衍生物中从而形成的复合物。
所述抗菌肽包括:SRVEKIVSQRLF (SR肽)、AAVEKIVSAALA (SR突变肽)、VKRWKKWRWKWKKWV-NH2 (VK肽)、GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 (GI肽)、RWRFKWWKK(RW肽)、GKIIKLKASLKLL-CONH2 (GK肽)或FFGTLFKLGSKLIPGVMKLFSKKKER (FF肽),或其各自的衍生物。
所述循环细胞的细胞膜或细胞膜衍生物为哺乳细胞的两性磷脂膜或其衍生物。
所述细胞膜包括:(1)活细胞、(2)鬼影细胞ghost cell或(3)细胞膜碎片cellmembrane fragment。
所述活细胞包括非吞噬性细胞或吞噬性细胞。
所述非吞噬性细胞包括红细胞或血小板。
所述吞噬性细胞包括中性粒细胞等。
所述鬼影细胞在被用于构建抗菌肽-细胞膜复合物的同时,其内部还可包载药物,这通常应用于一些协同递药系统的构建。
所述细胞膜碎片分为囊泡、膜融合制剂以及细胞膜包裹制剂三种形式。
所述抗菌肽修饰于PLGA纳米粒(poly(lactic -co-glycolic acid))或脂质体上。
所述抗菌肽-细胞膜复合物的制备方法,包括步骤:
(1)称取抗菌肽适量,溶解于PBS或其他等渗溶液中;
(2)将上述抗菌肽溶液与细胞或细胞膜衍生物按照一定比例混合,在一定条件下孵育一定时间;
(3)孵育结束后除去未结合的游离抗菌肽,即得到抗菌肽-细胞膜复合物,保存于4℃,即可。
所述步骤(2)和(3)为:将抗菌肽与细胞悬液混合,300 rpm室温搅拌1 h;取出混合溶液,1000 rpm离心10 min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的抗菌肽,即得抗菌肽嵌入细胞膜的抗菌肽-细胞膜复合物。
本发明还提供所述抗菌肽-细胞膜复合物作为药物或药物载体的应用。
细胞膜主要是由磷脂构成的富有弹性的半透性膜,不同细胞的磷脂组成也不尽相同,特别是哺乳动物细胞的膜外侧主要由两性磷脂组成。本发明基于抗菌肽与两性磷脂的较低亲和力作用,采用细胞膜预先中和抗菌肽,使得其在体内循环时避免识别非靶位点造成脱靶现象。常用的哺乳细胞主要是一些循环细胞,其具有一些先天优势,如长循环特性,易获取,具有良好的生物相容性,可穿透诸多生理屏障等。本发明构建的抗菌肽-细胞膜复合物中,细胞膜的存在形式主要有以下三种,但不局限于这三种:
(1)活细胞。活细胞最大程度地保留了原本的生物学特性,主要包括每种细胞的独特结构、机械性能和表面配体。这些特性决定了构建的复合体系的体内循环情况以及跨生理屏障的能力。这类细胞主要包括一些非吞噬性的细胞,例如红细胞和血小板等;
(2)鬼影细胞(ghost cell)。是指隐约可见轮廓的死亡细胞,如细胞坏死后的酶分解过程继续发展,则可导致细胞核溶解消失,残留细胞的轮廓或痕迹称为鬼影细胞。或者细胞经过物理化学作用后细胞内容物排出,残余的细胞膜轮廓也可称为ghost cell。鬼影细胞在被用于构建抗菌肽-细胞膜复合物的同时,其内部还可包载药物,这通常应用于一些协同递药系统的构建。
(3)细胞膜碎片(cell membrane fragment)。细胞膜碎片主要分为囊泡、膜融合制剂以及细胞膜包裹制剂三种形式。细胞膜囊泡和膜融合制剂通常可以继承源细胞的天然属性,并且易于被功能化修饰。细胞膜包裹制剂通常也依赖于细胞膜的功能蛋白或一些信号通路,从而改善被包裹制剂的一些生物学特性。
因此,在构建抗菌肽-细胞膜复合物时可以根据递药系统设计需要对上述细胞膜以及其它细胞膜形式进行选择优化,这极大地丰富了该复合物的构建类型。
本发明的有益效果在于:
1.改善抗菌肽在体内的抑菌疗效:为了解决抗菌肽在体内对病原菌的靶向性问题,从而改善抑菌疗效,本发明在体外将抗菌肽嵌入一些主要的循环细胞的细胞膜或细胞膜衍生物中,避免阳离子抗菌肽在进入血液循环的初期与阴离子蛋白或阴离子多糖等结合,以及其末端的疏水端非特异性插入体内非靶位点。另外,构建的抗菌肽-细胞膜复合物对靶点的识别也依赖于抗菌肽在所嵌入的细胞膜和靶点膜成分之间的亲和力差异大小。当抗菌肽在不同磷脂之间亲和力较低时,复合物并不能在体内外实现病原菌靶向递送;当亲和力差异性足够高时,复合物能够有效地解决抗菌肽体内靶向性差的问题。这种复合物能使得抗菌肽在体内避免脱靶而发挥高效的抑菌疗效。
2.实现病原菌亲和力响应性的精准靶向递送:在体内循环过程中嵌入细胞膜的抗菌肽只能被具有更高亲和力的阴性磷脂竞争性结合,而不与相似或低亲和力的非靶位点作用,从而实现病原菌亲和力响应性的精准靶向递送。
3.将抗菌肽作为纳米制剂的靶向分子:基于抗菌肽-细胞膜复合物的构建思路,将抗菌肽作为纳米制剂的靶向分子,可以有效地将纳米制剂锚定于细胞膜或者细胞膜衍生物,解决抗菌肽作为靶向分子体内靶向性差的问题,实现体内外制剂对目标病原菌的靶向递送。
4.开辟新的研究前景:基于抗菌肽的膜选择性,通过策略改进改善其在体内的病原菌靶向性,具有极大的研究价值。
附图说明
图1为实施例1中SR肽与磷脂酰丝氨酸(PS)及磷脂酰胆碱(PC)SPR拟合结果;
图1A. SR肽与DOPS亲和力SPR拟合结果;
图1B. SR肽与DOPC亲和力SPR拟合结果。
图2为实施例3中血小板膜囊泡(PMV)粒径分布图,以及白念珠菌对MSR-PMV及SR-PMV的摄取结果;
图2-1. 血小板膜囊泡(PMV)粒径分布图;
图2-2. 白念珠菌对MSR-PMV及SR-PMV的摄取结果。
图3为实施例4中SR-PMV与肺感染模型中白念珠菌共定位情况,标尺=50 μm。
图4为实施例5中RW肽及RW-RBC在白念珠菌感染小鼠肺、肝、脾组织中的分布;
图4A. RW肽及RW-RBC在白念珠菌感染小鼠肺组织中的荧光强度;
图4B. RW肽及RW-RBC在白念珠菌感染小鼠肝组织中的荧光强度;
图4C. RW肽及RW-RBC在白念珠菌感染小鼠脾组织中的荧光强度。
图5为实施例6中GK肽及GK-RBC在金葡菌感染小鼠肺、肝、脾组织中的分布;
图5A. GK肽及GK-RBC在金葡菌感染小鼠肺组织中的荧光强度;
图5B. GK肽及GK-RBC在金葡菌感染小鼠肝组织中的荧光强度;
图5C. GK肽及GK-RBC在金葡菌感染小鼠脾组织中的荧光强度。
图6为实施例7中VK肽及VK-RBC体外对白念珠菌的药物浓度-抑菌能力曲线。
图7为实施例8中GI肽及GI-NE体外对白念珠菌的药物浓度-抑菌能力曲线。
图8为实施例9中巨噬细胞膜囊泡粒径图,以及FF肽及FF-RAWm治疗白念珠菌肺感染小鼠后生存率曲线;
图8-1. 巨噬细胞膜囊泡粒径分布图;
图8-2. FF肽及FF-RAWm治疗白念珠菌肺感染小鼠后生存率曲线。
图9为实施例10中SR肽修饰的脂质体结合于红细胞表面的扫描电镜图。
图10为实施例11中FF肽修饰的PLGA纳米粒结合于红细胞表面的扫描电镜图。
图11为实施例12中隐球菌对NPs及VK-NPs的流式摄取结果。
图12为实施例13中小动物组织离体成像结果。
具体实施方式
1. 实验细胞株
白念珠菌菌株ATCC90028、新型隐球菌菌株H99、金黄色葡萄球菌均来自于ATCC;
小鼠类巨噬细胞系细胞 RAW264.7 购自中科院上海细胞库;
红细胞,中性粒细胞及血小板按下述实验步骤提取获得:
(1)红细胞提取步骤
通过心脏穿刺收集来自6-8周龄雌性健康 Balb/c 小鼠的全血并储存在肝素化的管中以防止凝血。将全血以1000 g离心10分钟去除血浆和血小板层分离红细胞(RBC),采用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬RBC,以1000 g离心10分钟洗涤3次。弃去上清,用PBS重悬收集分离的RBC,制成RBC悬液。用细胞计数器对进行计数,并储存于4℃下,24 h内用于实验。
(2)中性粒细胞提取步骤
通过心脏穿刺收集来自6-8周龄雌性健康 Balb/c 小鼠的全血并储存在肝素化的管中以防止凝血。将全血和葡聚糖T-500分离液按5:1比例混合,4℃静置40 min。吸取上清液,铺在淋巴细胞分离液上(该分离液预先装在离心管内),保持两相界面清晰,1000 rpm离心15 min。取出离心管,管内液体分为三层,上层是淡黄色的血清,中部的白色雾状区带为单核细胞和淋巴细胞,下层沉降到管底的是中性粒细胞和残存的少量血红细胞。弃去上清液及中部雾状区带。向离心管中加入2 mL PBS,用吸管轻轻将细胞吹起,2000 rpm离心3min,弃去上清液。在离心管中加2 mL无菌水,轻轻振荡20 s,血红细胞由于内外溶液不等渗而胀破。然后,立即加入的1.8 %氯化钠溶液2 mL,振荡混匀,恢复等渗。2000 rpm离心3min,弃去上清液,再用PBS清洗两次,即为分离好的中性粒细胞。加入PBS重悬细胞,制成中性粒细胞悬液。用细胞计数器对细胞进行计数,并储存于4℃下,24 h内用于实验。
(3)血小板提取步骤
通过心脏穿刺收集来自6-8周龄雌性健康 Balb/c 小鼠的全血并储存在肝素化的管中以防止凝血。将全血以100 g离心20分钟分离去除红细胞和白细胞,收集富含血小板的血浆,再次以100 g离心20分钟分离去除残余的红细胞。将收集到的上层清液与含有EDTA和前列腺素E1的PBS混合以防止血小板聚集。将混合液以800 g离心20分钟,弃去上清,用含有EDTA和蛋白酶抑制剂的PBS重悬沉淀,即可。
2.实验动物
Balb/c小鼠,雌性,6-8周龄,体重 18-22 g,由重庆市中药研究院实验动物研究所提供。动物饲养于SPF级动物房,实验前24 h动物禁食不禁水。实验研究严格按照中国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》进行。
3.实验材料
4.实验仪器
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。下述实施例中,对于操作温度和压力,如未作特别说明,一般是指室温和常压。其中,室温是指10-30℃;常压是指一个标准大气压。
实施例1SR肽与磷脂酰丝氨酸(PS)及磷脂酰胆碱(PC)互作考察
精密称定DOPS 0.1mg及DOPC 0.9mg,分别溶于甲醇和氯仿 (1:1, v/v) 的混合溶剂中并将两组分混匀。将混合溶液转移至圆底烧瓶中,于37℃条件下采用旋转蒸发仪除去有机试剂,在圆底烧瓶中获得脂质膜。以PBS作为水化介质于37℃条件下水化使得脂质膜充分溶解分散,超声处理,利用挤出器(孔径 = 100 nm)反复挤推脂质体以制备具有均一粒径的脂质体。连接并调试好SPR仪器,将所制备的脂质体固定于L1芯片后,分别注入不同浓度的SR多肽溶液,拟合计算所得的数据,以评价多肽与PS之间的相互作用大小。
对于SR肽与PC互作考察,除原料由DOPC 1mg组成外,其余步骤均与上述步骤相同,以评价多肽与PC之间的相互作用大小。图1A. SR肽与DOPS亲和力SPR拟合结果;图1B. SR肽与DOPC亲和力SPR拟合结果。
由图1A&B可知,SR肽与DOPS(KD=5.51×10-7M)亲和力显著高于DOPC(KD=7.04×10-6 M),两者之间相差约12.78倍。
实施例2SR突变肽与磷脂酰丝氨酸(PS)及磷脂酰胆碱(PC)互作考察
精密称定DOPS 0.1mg及DOPC 0.9mg,分别溶于甲醇和氯仿 (1:1, v/v) 的混合溶剂中并将两组分混匀。将混合溶液转移至圆底烧瓶中,于37℃条件下采用旋转蒸发仪除去有机试剂,在圆底烧瓶中获得脂质膜。以PBS作为水化介质于37℃条件下水化使得脂质膜充分溶解分散,超声处理,利用挤出器(孔径 = 100 nm)反复挤推脂质体以制备具有均一粒径的脂质体。连接并调试好SPR仪器,将所制备的脂质体固定于L1芯片后,分别注入不同浓度的SR突变肽(mutated SR)溶液,拟合计算所得的数据,以评价mutated SR肽与PS之间的相互作用大小。
对于mutated SR肽与PC互作考察,除原料由DOPC 1mg组成外,其余步骤均与上述步骤相同,以评价mutated SR肽与PC之间的相互作用大小。
表1 SR突变肽与PS/PC亲和力SPR拟合结果
由表1可知,利用丙氨酸替代SR肽序列中的部分氨基酸位点之后,SR突变肽与DOPS的拟合KD值显著上升,亲和力下降;而与DOPC的拟合KD值变化不大,并且SR突变肽与DOPS和DOPC的KD值差异不大,两者之间相差3.19倍。表明利用丙氨酸代替SR肽序列中的部分氨基酸后会导致SR突变肽在DOPS与DOPC之间的亲和力差异降低。
实施例3SR突变肽及SR肽-血小板膜囊泡复合物对白念珠菌靶向性考察
采用反复冻融法制备血小板膜囊泡。将收集的血小板放置于−80 °C冷冻,室温解冻30 min。再悬浮于PBS中,经3次冻融循环和离心后,超声处理,利用挤出器进行反复挤出,分别过400 nm,200 nm,100 nm滤膜,形成均匀的血小板膜囊泡(PMV)。用动态光散射法(DLS)测量PMV的粒径大小及分布。将FITC标记的SR肽及SR突变肽与PMV悬液混合,300 rpm室温搅拌1 h。取出混合溶液,1000 rpm离心10 min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的游离多肽,即得多肽嵌入血小板膜囊泡的SR突变肽-PMV复合物(MSR-PMV)及SR肽-PMV复合物(SR-PMV)。
采用YPD液体培养基将处于对数生长期的白念珠菌稀释,并以 1×106 细胞/孔的密度接种于 24 孔板中,分为两组,每组三个复孔。分别向每组中加入等量荧光强度的MSR-PMV及SR-PMV,于30℃培养箱中避光孵育2 h后,弃去YPD培养基,PBS小心清洗三次后用PBS重悬沉淀,采用流式细胞仪检测荧光强度用于定量分析白念珠菌对MSR-PMV及SR-PMV的摄取情况。图2-1. 血小板膜囊泡(PMV)粒径分布图;图2-2. 白念珠菌对MSR-PMV及SR-PMV的摄取结果。
由图2-1可知,血小板膜囊泡的粒径为103.13 ± 3.78 nm,PDI值为0.052±0.031,表明所制备的囊泡粒径分布均一。
由图2-2流式定量结果可知,白念珠菌对SR-PMV摄取显著高于MSR-PMV,且存在显著性差异(P<0.001)。在本实施例中,SR突变肽及SR肽在磷脂PS与PC之间的亲和力差异分别为3.19倍和12.78倍。结果表明,所构建的抗菌肽-细胞膜复合物对靶点的有效识别依赖于抗菌肽在所采用的细胞膜与靶点膜成分之间的亲和力差异大小。当这种亲和力差异较小时,抗菌肽作为靶向分子的靶向效应极大受限;当这种亲和力差异足够大时(例如12.78倍),所构建的抗菌肽-细胞膜复合物中抗菌肽能够有效识别靶点。
实施例4SR突变肽及SR肽-血小板膜囊泡复合物对白念珠菌体内靶向性考察
白念珠菌肺感染小鼠模型构建。取白念珠菌单菌落于YPD液体培养基中,30℃过夜培养,使其处于对数生长期。将对数生长期的白念珠菌菌液于2000 rpm离心5 min,收集白念珠菌沉淀,无菌PBS清洗3次后重悬稀释至白念珠菌浓度为2×108 CFU。取健康balb/c雌性小鼠,麻醉后利用门牙悬挂于固定好的水平尼龙线上,使其保持垂直体位,气管伸直,吸取50 μL重悬后的菌液,从一侧鼻道逐滴滴入小鼠鼻腔。感染24 h后可用于实验。
采用反复冻融法制备血小板膜囊泡。将收集的小鼠血小板放置于−80 °C冷冻,室温解冻30 min。再悬浮于PBS中,经3次冻融循环和离心后,超声处理,利用挤出器进行反复挤出,分别过400 nm,200 nm,100 nm滤膜,形成均匀的血小板膜囊泡(PMV)。用动态光散射法(DLS)测量PMV的粒径大小及分布。将FITC标记的SR肽及SR突变肽与PMV悬液混合,300rpm室温搅拌1 h。取出混合溶液,1000 rpm离心10 min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的游离多肽,即得多肽嵌入血小板膜囊泡的SR突变肽-PMV复合物(MSR-PMV)及SR肽-PMV复合物(SR-PMV)。
取白念珠菌肺感染小鼠9只,随机分为三组,分别通过尾静脉注射等量荧光强度的SR肽,MSR-PMV及SR-PMV。给药2h后处死小鼠,取出肺组织,用预冷的PBS清洗肺组织后用滤纸吸干,重复三次。用OCT包埋肺组织后进行冰冻切片,4%多聚甲醛固定液室温固定所得切片1h,固定完成后用PBS浸洗三次,用滤纸吸干多余水,采用高内涵细胞分析系统进行荧光拍摄,观察游离的SR肽,MSR-PMV及SR-PMV在肺组织中荧光分布情况。图3. SR-PMV与肺感染模型中白念珠菌共定位情况,标尺=50 μm。
由图3可知,SR-PMV在白念珠菌感染的肺部荧光强度明显高于另外两组,且与白念珠菌具有较好的共定位。结合实施例2,表明SR-PMV在体内同样能够很好地实现对白念珠菌的主动靶向。而所构建的MSR-PMV则荧光分布较少且共定位水平显著降低,表明抗菌肽-细胞膜复合物对靶点的识别依赖于抗菌肽在所嵌入的细胞膜和靶点膜成分之间的亲和力差异大小,与实施例2体外实验结果相符。而游离的SR肽同样具有很低荧光强度,这可能是SR肽在进入血液循环后吸附了大量的阴离子蛋白或多糖,使得对靶点识别受阻。也可能在进入体内初期非选择性的作用到了非靶位点,无法实现后续的靶点识别。因此,本实施例体现了抗菌肽-细胞膜复合物在体内改善抗菌肽靶向性的优势,但这也需要基于抗菌肽在不同膜成分之间具有足够的亲和力差异。
实施例5RW肽及RW肽-红细胞复合物在白念珠菌肺感染小鼠模型中组织分布考察
白念珠菌肺感染小鼠模型构建。取白念珠菌单菌落于YPD液体培养基中,30℃过夜培养,使其处于对数生长期。将对数生长期的白念珠菌菌液于2000 rpm离心5 min,收集白念珠菌沉淀,无菌PBS清洗3次后重悬稀释至白念珠菌浓度为2×108 CFU。取健康balb/c雌性小鼠,麻醉后利用门牙悬挂于固定好的水平尼龙线上,使其保持垂直体位,气管伸直,吸取50 μL重悬后的菌液,从一侧鼻道逐滴滴入小鼠鼻腔。感染24 h后可用于实验。
将Cy5.5标记的RW肽与红细胞细胞悬液混合,300 rpm室温搅拌1 h。取出混合溶液,1000 rpm离心10 min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的游离RW肽,即得RW肽嵌入红细胞膜的RW肽-红细胞复合物(RW-RBC)。
取白念珠菌鼻滴感染24 h的balb/c雌性小鼠18只,随机分为两组,每组9只。按照RW肽10 mg/Kg给药剂量分别通过尾静脉给与游离的RW肽以及RW-RBC。各组小鼠分别于1,2,4 h麻醉处死(每组在每个时间点取3只小鼠),解剖收集肺、肝、脾组织,生理盐水洗净后,滤纸吸干水分并称重。将各脏器置于EP管中,按组织重量(g)与生理盐水体积(mL)1:3 的比例添加生理盐水进行组织匀浆。取匀浆液100 μL于EP管中,加入900 μL甲醇,涡旋2分钟,超声处理10分钟,10000 rpm 离心10分钟,取上清液再离心,取上清采用酶标仪测定Cy5.5荧光强度。图4A. RW肽及RW-RBC在白念珠菌感染小鼠肺组织中的荧光强度;
图4B. RW肽及RW-RBC在白念珠菌感染小鼠肝组织中的荧光强度;图4C. RW肽及RW-RBC在白念珠菌感染小鼠脾组织中的荧光强度。
由图4A可知,相较于RW-RBC组,在各个时间点游离的RW肽在肺部分布较少,这可能是在进入血液循环初期,RW肽表面吸附了大量阴离子蛋白以及多糖等,这使得RW肽很难识别白念珠菌而造成脱靶现象。同时,RW肽在进入血液循环后也更易被网状内皮系统清除,最终导致了肺组织分布较少。而对于RW-RBC,因RW肽嵌入红细胞膜中,这使得其避免了阴离子蛋白以及多糖等吸附,同时RBC作为机体自身的循环细胞,使得嵌入RBC细胞膜的RW肽不易被网状内皮系统识别而实现逃逸。在肺组织分布着大量的白念珠菌,基于RW肽的膜选择性,在这种亲和力的作用下,使得RW-RBC能够识别白念珠菌,最终实现肺组织聚集。因此,本发明所构建的抗菌肽-细胞膜复合物能够显著改善抗菌肽在体内对白念珠菌的靶向性。从图4B, C中可知,RW-RBC在肝和脾中分布较游离的RW肽明显降低,主要可能归因于网状内皮系统对RW肽及RW-RBC的识别清除差异性。
实施例6GK肽及GK肽-红细胞复合物在金葡菌球菌肺感染小鼠模型中组织分布考察
金葡萄球菌肺感染小鼠模型构建。取金葡菌单菌落于LB液体培养基中,37℃过夜培养,使其处于对数生长期。将对数生长期的金葡菌菌液于2000 rpm离心5 min,收集沉淀,无菌PBS清洗3次后重悬稀释至金葡菌浓度为2×108 CFU。取健康balb/c雌性小鼠,麻醉后利用门牙悬挂于固定好的水平尼龙线上,使其保持垂直体位,气管伸直,吸取50 μL重悬后的菌液,从一侧鼻道逐滴滴入小鼠鼻腔。感染24 h后可用于实验。
将Cy5.5标记的GK肽与红细胞悬液混合,300 rpm室温搅拌1 h。取出混合溶液,1000 rpm离心10 min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的游离GK肽,即得GK肽嵌入红细胞膜的GK肽-红细胞复合物(GK-RBC)。
取金葡菌鼻滴感染24 h的balb/c雌性小鼠18只,随机分为两组,每组9只。按照GK肽10 mg/Kg给药剂量分别通过尾静脉给与游离的GK肽以及GK-RBC。各组小鼠分别于1,2,4,8 h麻醉处死(每组在每个时间点取3只小鼠),解剖收集肺、肝、脾组织,生理盐水洗净后,滤纸吸干水分并称重。将各脏器置于EP管中,按组织重量(g)与生理盐水体积(mL)1:3 的比例添加生理盐水进行组织匀浆。取匀浆液100 μL于EP管中,加入900 μL甲醇,涡旋2分钟,超声处理10分钟,10000 rpm 离心10分钟,取上清液再离心,取上清采用酶标仪测定Cy5.5荧光强度。图5A. GK肽及GK-RBC在金葡菌感染小鼠肺组织中的荧光强度;
图5B. GK肽及GK-RBC在金葡菌感染小鼠肝组织中的荧光强度;图5C. GK肽及GK-RBC在金葡菌感染小鼠脾组织中的荧光强度。
由图5A可知,相较于GK组,GK-RBC组在各个时间点均在肺组织有较高含量分布,这可能是在进入血液循环初期,GK肽表面吸附了大量阴离子蛋白以及多糖等,这使得GK肽很难识别金葡菌,并且GK肽在体内易被清除。而因GK肽嵌入红细胞膜中,这使得GK-RBC避免了阴离子蛋白以及多糖等吸附,同时RBC作为机体自身的循环细胞,使得GK肽不易被清除。在肺组织分布着大量的高表达阴性磷脂的金葡菌,基于GK肽的膜选择性,使得GK-RBC能够精准靶向金葡菌,最终实现肺组织聚集。因此,本发明所构建的抗菌肽-细胞膜复合物能够显著改善抗菌肽在体内对金葡菌的靶向性。从图5 B, C中可知,GK-RBC在肝和脾中分布较游离的GK肽明显降低,这同样可能归因于网状内皮系统对GK肽及GK-RBC的识别清除差异性。
实施例7VK肽及VK肽-红细胞复合物对白念珠菌的体外抑制作用考察
将VK肽与RBC细胞悬液混合,300 rpm室温搅拌1 h。取出混合溶液,1000 rpm离心10 min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的游离VK肽,即得VK肽嵌入红细胞膜的VK肽-红细胞复合物(VK-RBC)。
采用微板稀释法考察游离的VK肽及VK-RBC对白念珠菌的抑制能力。分别将上述两种药液用YPD培养基稀释到多肽终浓度 64 μg/mL,吸取 100 μL加入96孔板的第一孔,加入100 μL YPD培养基混匀,从中吸取 100 μL 加入后一孔,按照此种两倍稀释法进行稀释,形成多肽浓度为 32,16,8、4,2、1,0.5,0.25,0.125,0.063 μg/mL的药液。每个孔内加入 100μL 白念珠菌菌液(1×106 CFU/mL)。另设阳性和阴性两组对照,其中一组加菌不加药(阳性对照),用于观察白念珠菌在实验培养条件下能否正常生长;另一组加药不加菌,用于观察在实验操作过程是否存在污染。接种好的96孔板置于30℃培养箱培养。48 h后观察并测定每孔在630 nm波长下的OD值,用于计算MIC 值,分析两组药液的抑菌能力。图6. VK肽及VK-RBC体外对白念珠菌的药物浓度-抑菌能力曲线。
由图6可知,VK肽及VK-RBC在体外对白念珠菌的MIC值均约为1 μg/mL,表明将VK肽嵌入RBC细胞膜上不会影响其在体外对白念珠菌的抑制作用。
实施例8GI肽及GI肽-中性粒细胞复合物对白念珠菌的体外抑制作用考察
将GI肽与中性粒细胞悬液(NE)混合,300 rpm室温搅拌1 h。取出混合溶液,1000rpm离心10 min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的游离GI肽,即得GI肽嵌入中性粒细胞膜的GI肽-中性粒细胞复合物(GI-NE)。
采用微板稀释法考察游离的GI肽及GI-NE对白念珠菌的抑制能力。分别将上述两种药液用YPD培养基稀释到多肽终浓度 64 μg/mL,吸取 100 μL加入96孔板的第一孔,加入100 μL YPD培养基混匀,从中吸取 100 μL 加入后一孔,按照此种两倍稀释法进行稀释,形成多肽浓度为 32,16,8、4,2、1,0.5,0.25,0.125,0.063 μg/mL的药液。每个孔内加入 100μL 白念珠菌菌液(1×106 CFU/mL)。另设阳性和阴性两组对照。接种好的96孔板置于30℃培养箱培养。48 h后观察并测定每孔在630 nm波长下的OD值,用于计算MIC 值,分析两组药液的抑菌能力。图7. GI肽及GI-NE体外对白念珠菌的药物浓度-抑菌能力曲线。
由图7可知,GI肽及GI-NE在体外对白念珠菌的MIC值均约为4 μg/mL,表明将GI肽嵌入中性粒细胞不会影响其在体外对白念珠菌的抑制作用。
实施例9FF肽及FF肽-巨噬细胞膜囊泡在白念珠菌肺感染小鼠模型中生存率考察
精密称定Tris-HCl 31.5 mg,KCl 7.45 mg,MgCl2于容量瓶中,溶于PBS 10 mL中,即得溶液A;另按照蛋白酶抑制剂:溶液A(1:100)进行混匀,即得细胞膜裂解液,4℃保存待用。取培养的巨噬细胞,用胰酶消化后离心收集,弃去上清,收集沉淀,再用适量PBS清洗,三次,收集沉淀,即为清洗后的巨噬细胞。向所得的巨噬细胞中加入细胞裂解液3 mL,超声破碎细胞,离心处理,分别收集上清和沉淀,即为上清液A和沉淀A。配置50%的细胞裂解液,对沉淀A进行二次裂解,离心后收集上清,即为上清B。将上清液A和B混匀,高速离心,收集沉淀,即为提取的巨噬细胞膜,4℃保存待用。取制备好的巨噬细胞膜,利用挤出器进行反复挤出,分别过400 nm,200 nm,100 nm滤膜,即得巨噬细胞膜囊泡(RAWm),用动态光散射法(DLS)测量RAWm的粒径大小及分布。
白念珠菌肺感染小鼠模型构建。取白念珠菌单菌落于YPD液体培养基中,30℃过夜培养,使其处于对数生长期。将对数生长期的白念珠菌菌液于2000 rpm离心5 min,收集白念珠菌沉淀,无菌PBS清洗3次后重悬稀释至白念珠菌浓度为2×108 CFU。取健康balb/c雌性小鼠,麻醉后利用门牙悬挂于固定好的水平尼龙线上,使其保持垂直体位,气管伸直,吸取50 μL重悬后的菌液,从一侧鼻道逐滴滴入小鼠鼻腔。感染24 h后可用于实验。
将FF肽与RAWm悬液混合,300 rpm室温搅拌1 h。取出混合溶液,1000 rpm离心10min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的游离FF肽,即得FF肽嵌入巨噬细胞膜囊泡的FF肽-巨噬细胞膜囊泡复合物(FF-RAWm)。
取白念珠菌鼻滴感染24 h的balb/c雌性小鼠30只,随机分为三组,每组10只。按照FF肽10 mg/Kg给药剂量分别通过尾静脉给与游离的FF肽以及FF-RAWm。另一组通过尾静脉给与PBS,为control组。每天给药一次,连续给药三天,观察小鼠状态并记录生存率。图8-1.巨噬细胞膜囊泡粒径分布图;图8-2. FF肽及FF-RAWm治疗白念珠菌肺感染小鼠后生存率曲线。
由图8-1可知,巨噬细胞膜囊泡的粒径为108.30 ± 2.71 nm,PDI值为0.027±0.012,表明所制备的囊泡粒径分布均一。
由图8-2可知,control组接种白念珠菌后第5天开始出现死亡,并且在12天内全部死亡。FF肽组表现出微弱的疗效,感染小鼠在第8天开始出现死亡,在第19天全部死亡,并不能较明显的延长小鼠生存率。而FF-RAWm组在给药后第11天才开始出现死亡,并且死亡率明显低于另外两组,直至第21天仍保持50%的生存率,明显延长小鼠生存率。这也表明这种将抗菌肽嵌入细胞膜中所构建的抗菌肽-细胞膜复合物可以显著改善抗菌肽体内的病原菌靶向递送能力从而提高抑菌疗效。
实施例10SR肽修饰的脂质体结合于红细胞表面形貌表征
基于-NHS和-NH3基团反应,将SR肽与DSPE-PEG2000-NHS反应合成得到功能化SR肽靶向分子(DSPE-PEG2000-P)。精密称取卵磷脂(EPC) 10 mg,胆固醇2 mg,DSPE-PEG2000-P1mg分别溶于甲醇和氯仿 (1:1, v/v) 的混合溶剂中并将两组分混匀。将混合溶液转移至圆底烧瓶中,于37℃条件下采用旋转蒸发仪除去有机试剂,在圆底烧瓶中获得脂质膜。以PBS作为水化介质于37℃条件下水化使得脂质膜充分溶解分散,超声处理,利用挤出器(孔径 = 100 nm)反复挤推脂质体以制备具有均一粒径的SR肽修饰的脂质体(SR-LIP)。
将SR-LIP和RBCs分别用PBS重悬至适宜浓度,将两者混合并在室温下按300 rpm搅拌孵育1 h。将混合溶液1000 g 离心10分钟,用PBS重悬沉淀,重复三次,以去除未结合的脂质体。收集脂质体-红细胞的结合物,将样品用2.5%戊二醛溶液在4℃条件下固定1 h,再用纯水通过离心洗涤 3 次并重悬至所需浓度,将样品滴在干净的硅片上并干燥,喷金,采用扫描电镜进行形貌观察。
由图9可知,SR肽修饰的脂质体能够锚定于红细胞表面,这不仅依靠静电吸附作用,同时还依靠SR肽与细胞膜两性磷脂相对较弱的亲和力作用,使得SR肽可以内嵌入细胞膜中,这有助于脂质体更加牢固地修饰于细胞表面。
实施例11FF肽修饰的PLGA纳米粒结合于红细胞表面形貌表征
基于-NHS和-NH3基团反应,将FF肽与DSPE-PEG2000-NHS反应合成得到功能化FF肽靶向分子(DSPE-PEG2000-P)。精密称取PLGA 10 mg,DSPE-PEG2000-P 1mg,分别溶解于乙酸乙酯100 µL与氯仿200 µL中。将PLGA与FF肽混匀后作为油相,在连续搅拌下滴加油相到水相(1 mL 1%聚乙烯醇溶液, PVA)中,冰浴超声处理制备得到乳液。收集乳液并在800 rpm的磁力搅拌器12 h以除去有机试剂。通过12000 g离心20分钟,收集纳米粒沉淀用去PBS重悬洗涤,重复3次。然后收集纳米粒沉淀物并用PBS重悬至所需浓度,即得多肽修饰的PLGA纳米粒(P-NPs)。
将FF肽修饰的PLGA纳米粒和RBCs分别用PBS重悬至适宜浓度,将两者混合并在室温下按300 rpm搅拌孵育1 h。将混合溶液1000 g 离心10分钟,用PBS重悬沉淀,重复三次,以去除未结合的纳米粒。收集纳米粒-红细胞的结合物,将样品用2.5%戊二醛溶液在4℃条件下固定1 h,再用纯水通过离心洗涤 3 次并重悬至所需浓度,将样品滴在干净的硅片上并干燥,喷金,采用扫描电镜进行形貌观察。图10 . FF肽修饰的PLGA纳米粒结合于红细胞表面的扫描电镜图
由图10可知,FF肽修饰的PLGA纳米粒能够锚定于红细胞表面,这不仅依靠静电吸附作用,同时还依靠FF肽与细胞膜两性磷脂相对较弱的亲和力作用,使得FF肽可以内嵌入细胞膜中,这有助于纳米粒更加牢固地修饰于细胞表面。
实施例12VK肽修饰的PLGA纳米粒体外对隐球菌的靶向性考察
基于-NHS和-NH3基团反应,将VK肽与DSPE-PEG2000-NHS反应合成得到功能化VK肽靶向分子(DSPE-PEG2000-P)。精密称取PLGA 10 mg,DSPE-PEG2000-P 1mg,分别溶解于乙酸乙酯100 µL与氯仿200 µL中。将PLGA与VK肽混匀后作为油相,在连续搅拌下滴加油相到水相(1 mL 1%聚乙烯醇溶液,PVA)中,冰浴超声处理制备得到乳液。收集乳液并在800 rpm的磁力搅拌器12 h以除去有机试剂。通过12000 g离心20分钟,收集纳米粒沉淀用去PBS重悬洗涤,重复3次。然后收纳米粒沉淀物并用PBS重悬至所需浓度,即得VK肽修饰的PLGA纳米粒(VK-NPs)。对于空白纳米粒,在制备时不加DSPE-PEG2000-P,用空白溶剂氯仿200 µL代替即可,其他步骤同上所述进行,即得空白纳米粒(NPs)。
采用YPD液体培养基将处于对数生长期的隐球菌稀释,并以 1×106 细胞/孔的密度接种于 24 孔板中,分为两组,每组三个复孔。分别向每组中加入香豆素6荧光素标记的NPs和VK-NPs,于30℃培养箱中避光孵育2 h后,弃去YPD培养基,PBS小心清洗三次后用PBS重悬沉淀,采用流式细胞仪检测荧光强度用于定量分析。图11. 隐球菌对NPs及P-NPs的摄取结果
由图11流式细胞术结果可知,隐球菌对VK-NPs摄取显著高于NPs,且存在显著性差异(P<0.001),表明VK肽可作为纳米制剂的靶向分子进行修饰,以加强纳米制剂对隐球菌的靶向性。
实施例13抗菌肽-红细胞复合物提高SR肽修饰的PLGA纳米粒体内靶向性
取白念珠菌单菌落于YPD液体培养基中,30℃过夜培养,使其处于对数生长期。将对数生长期的白念珠菌菌液于2000 rpm离心5 min,收集白念珠菌沉淀,无菌PBS清洗3次后重悬稀释至白念珠菌浓度为2×108 CFU。取健康balb/c雌性小鼠,麻醉后利用门牙悬挂于固定好的水平尼龙线上,使其保持垂直体位,气管伸直,吸取50 μL重悬后的菌液,从一侧鼻道逐滴滴入小鼠鼻腔。取白念珠菌鼻滴感染24 h的balb/c雌性小鼠,随机分为三组。每组分别通过尾静脉给与包载DiR荧光素的NPs,SR-NPs及SR-NPs-RBC。在给药后2 h麻醉处死小鼠,取各组织进行离体成像分析。(图12显示:小动物组织离体成像结果)
由图12可知,相比较NPs组,SR-NPs表现出一定的肺靶向,但荧光强度较低,这可能是由于修饰于纳米粒表面的靶向分子SR肽吸附了大量阴离子蛋白或多糖,使得纳米粒识别病原菌受阻。但SR-NPs-RBC组表现出明显的肺部聚集,荧光强度较高,表明将SR-NPs修饰于RBC表面可以解决SR-NPs体内病原菌靶向性差的问题。SR-NPs-RBC在进入血液循环时由于修饰于纳米粒上的SR肽靶向分子是以嵌入在细胞膜中的形式存在,避免了阴离子蛋白及多糖的吸附,对于后续SR-NPs-RBC识别高表达阴离子磷脂的白念珠菌是有利的。因此,本发明所构建的抗菌肽-细胞膜复合物策略同样适应于纳米粒-细胞膜复合物,特别是用于解决抗菌肽作为纳米制剂导向分子体内靶向性差的问题。
Claims (5)
1. 一种抗菌肽-细胞膜复合物,其特征在于,所述抗菌肽-细胞膜复合物是在体外将抗菌肽嵌入循环细胞的细胞膜中从而形成的复合物,所述抗菌肽为:SR肽、VK肽、GI肽、RW肽、GK肽或FF肽,所述循环细胞的细胞膜为哺乳细胞的两性磷脂膜,所述SR肽为:SRVEKIVSQRLF、所述VK肽为:VKRWKKWRWKWKKWV-NH2 、所述GI肽为:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2、所述RW肽为:RWRFKWWKK、所述GK肽为GKIIKLKASLKLL-CONH2、所述FF肽为FFGTLFKLGSKLIPGVMKLFSKKKER;所述细胞膜为:活细胞或细胞膜碎片cell membrane fragment;所述活细胞为非吞噬性细胞或吞噬性细胞,所述非吞噬性细胞为红细胞或血小板,所述吞噬性细胞为中性粒细胞;所述细胞膜碎片为囊泡。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽-细胞膜复合物,其特征在于,所述抗菌肽修饰于PLGA纳米粒或脂质体上。
3.根据权利要求1所述的抗菌肽-细胞膜复合物的制备方法,其特征在于,包括步骤:
(1)称取抗菌肽溶解于PBS或其他等渗溶液中;
(2)将抗菌肽溶液与细胞膜混合,孵育;
(3)孵育结束后除去未结合的游离抗菌肽,即得到抗菌肽-细胞膜复合物,保存于4℃。
4.根据权利要求3所述的抗菌肽-细胞膜复合物的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)和(3)为:将抗菌肽与细胞悬液混合,300 rpm室温搅拌1 h;取出混合溶液,1000 rpm离心10min,用PBS重悬,重复三次,以洗去未结合的抗菌肽,即得抗菌肽嵌入细胞膜的抗菌肽-细胞膜复合物。
5.根据权利要求1所述的抗菌肽-细胞膜复合物在制备药物或药物载体中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
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