CN110152026B - 一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂及其制备方法。本发明将吐温20、卵磷脂、全氟己烷采用纳乳法制备混悬液，将O‑羧甲基壳聚糖经高速机械搅拌分散于上述混悬液中，经低速离心和过滤后，得到粒径较小且均匀的可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂。本发明制备的可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂，是以O‑羧甲基壳聚糖为壳膜，全氟己烷液体包裹在壳膜内部，粒径为150～200nm，能穿过血管内皮进入肿瘤微环境，对于肿瘤的治疗具有靶向性和高效性，并且该超声造影剂在血液环境中不易与血清中蛋白类物质发生蛋白凝集，具备良好的血液相容性和稳定性，还具有良好的载药(阿霉素)能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂及其制备方法，属于超声分子影像学技术领域。
背景技术
基于纳米颗粒的药物递送系统能够克服肿瘤化疗的全身毒性、获得性药物抵抗、严重的药物副作用等缺点，已经成为目前肿瘤化疗的可替代方案。近年来，很多研究成功合成了多功能的纳米级药物递送系统，这些纳米颗粒(如脂质体、聚合物胶束、纳米乳液、纳泡及纳滴等)具有靶向、显像与治疗等多种功能。其中，壳聚糖(chitosan，CS)因其安全无毒性、良好的生物相容性及生物可降解性等优势，成为理想的纳米颗粒外壳材料。壳聚糖本身不溶于水，且表面带正电荷。众多研究表明，带正电荷的纳米颗粒尽管有利于肿瘤细胞膜(带负电荷)的摄取，但因其能与血液中的成分发生非特异性的聚合反应，在血液中的循环时间较短，从而在肿瘤微环境中达不到有效的药物浓度。O-羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl chitosan,O-CS)是一种壳聚糖的水溶性衍生物，并且改变了壳聚糖表面带正电荷的性质。值得注意的是，O-羧甲基壳聚糖具有pH依赖的表面电荷可转换特性，其在中性的环境中带负电荷，而在弱酸性的条件下表面电荷转换为正电荷。考虑到血液循环和肿瘤微环境的pH差异，很多基于pH依赖的壳聚糖衍生物的纳米药物递送系统被研究和应用，但是在超声造影剂领域尚未见到有相关研究。实际上，多功能超声造影剂有其独特的优势，不仅可作为一种药物递送系统靶向定位输送药物，而且在超声(ultrasound，US)辐照下能够实现可视化及增强治疗。中国专利文献(CN106139174A)公开了一种基于壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法，该发明是通过酰化反应对羟甲基壳聚糖进行改性，合成了具有两亲性的正己酰羟甲基壳聚糖，在此基础上加入液态氟碳，采用超声乳化方法制得由液态氟碳内核和壳聚糖衍生物外壳构成的纳米级超声造影剂，但是该发明以全氟戊烷(沸点29℃)为内核、正己酰羟甲基壳聚糖为外壳制备的纳米级超声造影剂靶向性较差，且物理稳定性和血液循环稳定性也较差，而且没有对载药特性及联合超声的治疗效果作进一步研究及评价。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂及其制备方法，以O-羧甲基壳聚糖为壳膜材料、液态氟碳(全氟己烷)为内核液体制备纳米级超声造影剂，该造影剂显像能力优良，生物安全性高，稳定性好，具有较强的肿瘤细胞结合能力。
本发明还验证了上述纳米级超声造影剂的载药(阿霉素)能力，提供了上述携载阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
术语说明：
O-羧甲基壳聚糖：O-carboxymethyl chitosan(O-CS)，是一种水溶性壳聚糖衍生物，两性聚电解质，羧甲基在壳聚糖的C3-OH上发生取代，取代率为90％。
全氟己烷：perfluorohexane(PFH)，一种液态氟碳，沸点为58-60℃。
阿霉素：Doxorubicin(DOX)，是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
本发明的技术方案如下：
一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂，其特征在于，所述纳米级超声造影剂是以O-羧甲基壳聚糖为壳膜，壳膜内部包裹有液态氟碳，纳米级超声造影剂的粒径为150-200nm。
根据本发明优选的，所述液态氟碳为全氟己烷。
本发明的超声造影剂粒径小于200nm，能很好地穿过血管内皮进入肿瘤微环境，提高靶向性和高效性。
本发明的超声造影剂选用的核材料全氟己烷，表现出与现有技术全氟戊烷截然不同的特点，发明人发现全氟己烷被包裹在壳膜内部在应用时物理稳定性高，而且在超声辐照条件下能够发生液气相变，由液体变成气体，增强显像能力，生物安全性高；另一方面，发明人意外发现选用具有pH依赖的表面电荷可转换性的O-羧甲基壳聚糖作为壳材料制备的可转换表面电荷的纳米级超声造影剂，在中性环境中呈现负电荷，在弱酸环境下表面电荷转换为正电荷，具有较高的血液相容性及较好的肿瘤细胞结合能力且载药性好。
上述一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法，步骤如下：
(1)将液态氟碳、吐温20、卵磷脂分散于去离子水中，纳乳法制得混悬液；
(2)高速机械搅拌下向步骤(1)制得的混悬液中逐滴加入O-羧甲基壳聚糖溶液，得悬乳液；
(3)将步骤(2)制得的悬乳液室温静置5-10min，低速离心，取上层液体，过滤得可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述液态氟碳为全氟己烷。全氟己烷的沸点为58-60℃，在血液循环过程中可以保持稳定的物理状态，在超声辐照作用下能够发生液气相变，由液体变成气体，进而完成显像，并且在相变过程中释放出的能量对肿瘤细胞有一定的治疗作用。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述液态氟碳在混悬液中的体积百分比为5-10％，所述吐温20在混悬液中的体积百分比为0.1-0.4％，所述卵磷脂在混悬液中的质量体积百分比为0-0.15％，单位为g/mL；进一步优选的，所述液态氟碳在混悬液中的体积百分比为5％，所述吐温20在混悬液中的体积百分比为0.2％，所述卵磷脂在混悬液中的质量体积百分比为0.15％，单位为g/mL。本发明中，液态氟碳、吐温20、卵磷脂的加量比例过大或者过小，制备的超声造影剂的粒径均大于200nm，且粒径分散比较大(分散指数大于0.3)，而在优选比例下，制备的纳米级超声造影剂的粒径均匀，分散指数小于0.3。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述纳乳法为13000-20000rpm高速均质1-2min；进一步优选的，所述纳乳法为19000rpm高速均质1min。高速均质使得液态氟碳更好地分散于去离子水中。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述O-羧甲基壳聚糖在悬乳液中的质量体积分数为0.1-0.2％，单位为g/mL；进一步优选的，所述O-羧甲基壳聚糖在悬乳液中的质量体积分数为0.15％，单位为g/mL；其中，O-羧甲基壳聚糖的重均分子量为100-300KD。在优选的O-羧甲基壳聚糖浓度条件下制备的纳米级超声造影剂的粒径均匀一致。
根据本发明优选的，步骤(2)所述高速机械搅拌为12000-14000rpm机械搅拌1-3min；进一步优选的，所述高速机械搅拌为14000rpm机械搅拌2min。O-羧甲基壳聚糖在高速机械搅拌的条件下与混悬液中的液态氟碳充分接触，形成以O-羧甲基壳聚糖为壳、液态氟碳为核的造影剂。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述低速离心为300-1000rpm离心3min；进一步优选的，所述低速离心为500rpm离心3min。经低速离心后粒径较大的造影剂沉降至下层溶液，粒径较小的造影剂保留在上层液体中。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述过滤采用0.45μm过滤器过滤。0.45μm过滤器可过滤掉粒径大于等于450nm的造影剂及遇水溶胀的游离O-羧甲基壳聚糖。
一种可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂，其特征在于，所述纳米级超声造影剂以O-羧甲基壳聚糖为壳膜，壳膜内部包裹有液态氟碳和阿霉素，粒径为170-200nm，O-羧甲基壳聚糖与阿霉素的质量比为3:(0.9-4)。
上述一种可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法，步骤如下：
1)将液态氟碳、吐温20、卵磷脂、阿霉素分散于去离子水中，纳乳法制得混悬液；
2)按照上述一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法中的步骤(2)-(3)，制备得到可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂。
根据本发明优选的，步骤1)所述液态氟碳为全氟己烷；所述纳乳法为13000-20000rpm高速均质1-2min，进一步优选的，所述纳乳法为19000rpm高速均质1min。
根据本发明优选的，步骤1)中所述液态氟碳在混悬液中的体积百分比为5-10％，所述吐温20在混悬液中的体积百分比为0.1-0.4％，所述卵磷脂在混悬液中的质量体积百分比为0-0.15％，单位为g/mL；进一步优选的，所述液态氟碳在混悬液中的体积百分比为5％，所述吐温20在混悬液中的体积百分比为0.2％，所述卵磷脂在混悬液中的质量体积百分比为0.15％，单位为g/mL。本发明中，液态氟碳、吐温20、卵磷脂的加量比例过大或者过小，制备的超声造影剂的粒径均大于200nm，且粒径分散比较大(分散指数大于0.3)，而在优选比例下，制备的纳米级超声造影剂的粒径均匀，分散指数小于0.3。
根据本发明优选的，步骤1)中所述阿霉素在混悬液中的浓度为0.5-2.0mg/mL，进一步优选的，所述阿霉素在混悬液中的浓度为1.5mg/mL。
上述可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的技术特点：
将吐温20(表面活性剂)、卵磷脂(助表面活性剂)、液态氟碳(全氟己烷)采用纳乳法制备混悬液，将O-羧甲基壳聚糖经高速机械搅拌分散于上述混悬液中，得到以O-羧甲基壳聚糖为外壳、以液态氟碳或/和阿霉素为内核的悬乳液，经静置后，粒径较大的超声造影剂分布在下层液体，粒径相对较小的纳米级超声造影剂分布在上层液体，取上层液体低速离心和过滤后，得到粒径较小且均匀的纳米级超声造影剂。
有益效果
1、本发明制备的可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂，是以O-羧甲基壳聚糖为壳膜，全氟己烷液体包裹在壳膜内部，粒径为150～200nm，平均粒径为183nm(分散指数PDI小于0.3)，在纳米级范围，且小于200nm，能穿过血管内皮进入肿瘤微环境，对于肿瘤的治疗具有靶向性和高效性。
2、本发明采用O-羧甲基壳聚糖为壳材料，O-羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，改变了壳聚糖表面带正电荷的性质，具有pH依赖的表面电荷可转换性，本发明制备的可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂，在中性环境中呈现负电荷，在弱酸环境下表面电荷转换为正电荷，具有较高的肿瘤细胞结合能力。
3、本发明以全氟己烷为核材料，全氟己烷的沸点为58-60℃，制备的可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂在血液循环中具有良好的物理稳定性，并且该超声造影剂在血液环境中不易与血清中蛋白类物质发生蛋白凝集，具备良好的血液相容性和稳定性。
4、本发明的核材料全氟己烷在超声作用下能够发生液气相变，由液体变成气体，增强显像，因此本发明制备的可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂，具有优良的增强显像能力，生物安全性高，且在相变过程中释放出的能量对肿瘤细胞有一定的治疗作用。
5、本发明制备的可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂具有良好的载药(阿霉素)能力。
6、本发明制备的可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂在超声辐照刺激下，能够大大促进其内包裹的阿霉素的药物释放。
7、本发明制备的可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂联合超声辐照能显著降低肿瘤细胞的生存率。
附图说明
图1是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的电镜图，其中，A图为扫描电镜图，B图为透射电镜图；
图2是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的纳米粒径分布图，其中，左侧纵坐标是粒径强度百分比，右侧纵坐标是指粒径累积强度百分比，横坐标是指粒径；
图3是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的纳米表面电荷图，其中，纵坐标是指强度，上方横坐标是指频率，下方横坐标是指zeta电位；
图4是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)与壳聚糖纳米级超声造影剂(CS NDs)随pH变化的表面电荷变化折线图；
图5是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂在表面电荷转换过程中的粒径变化折线图；
图6是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂随时间变化的粒径变化折线图；
图7是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)与壳聚糖纳米级超声造影剂(CS NDs)在含有10％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)中的粒径变化折线图；
图8是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂在8％兔红细胞悬液中的溶血分数柱状图，其中NS为生理盐水阴性对照组；
图9是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)与壳聚糖纳米级超声造影剂(CS NDs)对牛白蛋白的凝集柱状图；
图10是不同质量浓度的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂对细胞存活率的影响；
图11是纳米级超声造影剂与前列腺癌细胞PC-3细胞的结合能力的荧光检测图，其中，A为壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的荧光结果，B为壳聚糖纳米级超声造影剂的荧光结果；
图12是纳米级超声造影剂与前列腺癌细胞PC-3细胞结合的流式细胞检测结果图；图中，纵坐标为细胞数量，横坐标为荧光信号强度，1为阴性对照，2为O-CS NDs pH7.4下与PC-3细胞的结合，3为CS NDs pH6.3下与PC-3细胞的结合，4为CS NDs pH7.4下与PC-3细胞的结合，5为O-CS NDs pH6.3下与PC-3细胞的结合；
图13是自制体外超声增强显像装置图，其中，1：支架，2：纳米级超声造影剂，3：滴管，4：烧杯，5：9MHz超声探头；
图14是壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的显像图像，其中，PBS为阴性对照；
图15是包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的荧光显微镜图；
图16是包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的粒径分布图；其中，左侧纵坐标是粒径强度百分比，右侧纵坐标是指粒径累积强度百分比，横坐标是指粒径；
图17是包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的包封率及载药率折线图，其中，A为包封率折线图，B为载药率折线图；
图18是包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的累计药物释放率曲线图，其中A为37℃下的累计药物释放率曲线图，B为加或不加超声辐照条件下的累计药物释放率曲线图；
图19是不同阿霉素剂量下PC-3细胞的生存率曲线；图中，纵坐标为细胞存活率，横坐标为阿霉素剂量；
图20是包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂结合超声辐照下PC-3细胞存活率柱状图；图中，纵坐标为细胞存活率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
O-羧甲基壳聚糖购自Santa Cruz，产品编号CAS 83512-85-0，重均分子量为100-300KD；壳聚糖购自索莱宝，产品编号CAS 9012-76-4/C8320，重均分子量为100-300KD；吐温20购自索莱宝，产品编号CAS 9005-64-5/T8220；卵磷脂购自索莱宝，产品编号CAS 8002-43-5/L8050。
兔红细胞购自索莱宝公司，前列腺癌细胞PC-3Sigma公司有售。
本实施例涉及药品及试剂如无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例1：可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备
一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法，步骤如下：
(1)将150μL全氟己烷液体、6μL吐温20、0.004g卵磷脂分散于2.7mL去离子水中，19000rpm高速均质1min制得混悬液；
(2)在14000rpm高速机械搅拌2min的条件下，向步骤(1)制得的混悬液中逐滴加入0.02g/mL的O-羧甲基壳聚糖溶液0.225mL，得悬乳液；
(3)将步骤(2)制得的悬乳液室温静置5-10min，500rpm离心3min，取上层液体，经0.45μm过滤器过滤，即得可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂。
取上述制备的纳米级超声造影剂，通过扫描电镜和透射电镜观察超声造影剂的表观形貌，结果如图1A和图1B所示，电镜照片中可见超声造影剂均呈球形，粒径均一，分散均匀无聚集，壳核结构。
取上述制备的纳米级超声造影剂，使用纳米激光粒度及Zeta电位分析仪检测超声造影剂的粒径和表面电位，如图2和图3所示，超声造影剂的粒径为150-200nm，平均粒径为183nm，分散指数小于0.3；超声造影剂的表面电位为-9.14mV。
实施例2：壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的表面电荷转换性分析
将实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)与壳聚糖纳米级超声造影剂(CS NDs)分别分散于pH为7.4和6.3的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，pH7.4模拟的是正常血液环境，pH6.3模拟的是肿瘤微环境，共孵育不同时间(0、0.5、1、3h)后，使用纳米激光粒度及Zeta电位分析仪检测其粒径和表面电荷。结果如图4所示，O-CS NDs在pH由7.4变为6.3时，表面电荷由负电荷转换为正电荷，而CS NDs在pH变化时，表面电荷仍为正电荷，没有出现明显变化。而且O-CS NDs在表面电荷转换过程中，没有出现粒径的明显变化，如图5所示。说明了O-CS NDs具有pH依赖的表面电荷的可转换性，且pH的变化不会对O-CS NDs的形态结构产生影响。
其中，壳聚糖纳米级超声造影剂的制备方法参照实施例1壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法，不同之处在于：步骤(2)中逐滴加入的为0.02mg/mL壳聚糖溶液0.225mL。
实施例3：壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的体外稳定性分析
将实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)于4℃存放，一定时间(0.5、1、3、5、24、48h)后，使用纳米激光粒度仪检测超声造影剂的粒径变化。如图6所示，4℃存放48h内超声造影剂的粒径比较稳定，没有发生明显变化。
将实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)与实施例2制备的壳聚糖纳米级超声造影剂(CS NDs)于含10％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)孵育一定时间(0、1、2、4、24h)后，使用纳米激光粒度仪检测超声造影剂的粒径变化。如图7所示，O-CS NDs在24h内仍保持稳定的粒径，未出现聚集，而CS NDs仅在0.5h后就出现了明显的聚集现象，粒径出现明显的增大。
将不同浓度(0.5和0.8mg/mL)的实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)加入到8％的兔红细胞悬液中，37℃下共孵育2h后，2000rpm离心5min，取上清液使用多功能分光光度计(414nm)测量吸光度，使用溶血剂氯化铵为阳性对照，生理盐水为阴性对照。各组实验兔红细胞的溶血分数如图8所示，所有浓度的超声造影剂未发生明显的溶血现象，溶血分数都在1％以下。
将实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)与实施例2制备的壳聚糖纳米级超声造影剂(CS NDs)与含1mg/mL牛白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)分别于pH为7.4和6.3的环境下混合，37℃低速震荡一定时间(0.5、1、1.5和2h)后，13000rpm离心10min后，取上清液使用多功能分光光度计(280nm)检测吸光度，计算不同超声造影剂的牛白蛋白吸附量，结果如图9所示，所有组中，O-CS NDs在pH7.4时，牛白蛋白的吸附量最小，蛋白凝集最小，说明了O-CS NDs在血液环境中不容易发生蛋白凝集，在血液环境中的稳定性良好，同时说明了O-CS NDs的随pH变化的表面电荷可逆转性。
实施例4：可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂生物的安全性评价
以1×104个/孔将前列腺癌细胞PC-3细胞接种于96孔板中，加入Roswell parkmemorial institute(RPMI)-1640培养基，37℃、5％CO2孵育培养24h后，加入含有实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)的新鲜培养基，培养基中超声造影剂的浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL，分别孵育24h和48h后，将培养基换成含有10μL CCK-8的新鲜培养基，继续孵育1～4h，用多功能分光光度计在450nm波长处检测吸光度并计算细胞存活率。结果如图10所示，当超声造影剂浓度为0.4mg/mL时，细胞活性开始受到明显抑制，而在常用超声造影剂浓度(＜0.4mg/mL)时均未出现明显的细胞毒性(细胞存活率＞98％)，说明实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的生物安全性高。
实施例5：可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂与肿瘤细胞的结合能力评价
前列腺癌细胞PC-3细胞以1×106个/孔接种于6孔板，待细胞生长至50％～70％密度时，加入Dil标记的实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS NDs)(pH为7.4和6.3)，共孵育培养30min后，用PBS缓冲液洗去未结合的造影剂，并采用DAPI染料进行PC-3细胞染色。分别用荧光显微镜及流式细胞仪分析超声造影剂的结合能力。同时，以Dil标记的实施例2制备的壳聚糖纳米级超声造影剂(CS NDs)(pH为7.4和6.3)作为对照。
荧光显微镜及流式细胞仪结果显示：与CS NDs(pH为7.4和6.3)和O-CS NDs(pH为7.4)相比，O-CS NDs(pH为6.3)与PC-3细胞结合能力更强(图11和图12，细胞结合率85.5％)。说明纳米级超声造影剂O-CS NDs在pH为6.3的环境下更能有效结合PC-3细胞，即O-CS NDs具有较高的肿瘤细胞结合能力。
实施例6：可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的体外超声显影能力评价
采用图13所示的装置检测超声造影剂的体外超声显影能力。将实施例1制备的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂2置于滴管3中，滴管3固定于支架1上，同时将滴管3置于37℃的水中，37℃的水盛装于烧杯4中，超声探头5进行超声检测，采用GE logiq E9超声诊断仪的造影模式，频率9.0MHz，机械指数(MI)0.5，二维与超声造影模式同步观察，调节参数设置，用超声诊断仪内部工作站存储图像资料，以PBS缓冲液为对照组。超声显影结果如图14所示，纳米级超声造影剂组出现增强显像，而对照PBS缓冲液组未出现增强显像。
实验例7：可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的载药能力评价
一种可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂(O-CS-DOXNDs)的制备方法，步骤如下：
1)将150μL全氟己烷液体、6μL吐温20、0.004g卵磷脂、阿霉素分散于2.7ml去离子水中，19000rpm高速均质1min制得混悬液；共制备四组混悬液，阿霉素在混悬液中的浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL；
2)在14000rpm高速机械搅拌2min的条件下，向步骤1)制得的混悬液中逐滴加入0.02g/mL O-羧甲基壳聚糖溶液0.225mL，得悬乳液；
3)将步骤2)制得的悬乳液室温静置5-10min，500rpm离心3min，取上层液体，经0.45μm过滤器过滤，即得可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂。
取上述制备的纳米级超声造影剂，稀释后滴加到载玻片上，通过荧光显微镜观察造影剂的表观形貌，结果如图15所示，1000×光学显微镜下可见造影剂均呈球形，粒径均一，分散均匀无聚集，图中的荧光光点表示包裹阿霉素的纳米级超声造影剂。
取上述制备的纳米级超声造影剂，使用纳米激光粒度仪检测超声造影剂的粒径，结果如图16所示，造影剂的粒径为170-200nm，平均粒径为175nm。
在阿霉素的4个初始浓度下，即0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL，超声造影剂的包封率及载药率如图17所示，超声造影剂的药物包封率均在75％以上，药物携载率均在20％以上，其中，阿霉素的初始浓度为1.5mg/mL时，制备的超声造影剂的药物包封率与载药率最为理想。
实验例8：可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的药物(阿霉素)释放能力评价
可转换表面电荷的O-CS-DOX NDs在未超声辐照条件下的药物释放实验，应用透析法，步骤如下：
1)将实施例7的制备的O-CS-DOX NDs置于透析膜(截留分子量为12000g/mol)，透析膜浸入装有20mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中；
2)将步骤1)制得的透析装置垂直置于恒温震荡培养箱内，37℃下100rpm震荡，在指定时间(0,0.5,1,2,4,8,12,24,36,48,72,120h)取出0.5mL释放介质进行阿霉素浓度的测定，并补充0.5mL的37℃PBS缓冲液，以保证释放介质的总体积保持不变；
3)将步骤2)取得的释放介质用多功能分光光度计在480nm波长处检测吸光度，计算释放介质中的阿霉素浓度，累积药物释放率用以下公式计算：
其中，R：累计药物释放率；Ve：PBS的置换体积；V0：释放介质总体积；Ci：第i次置换取样时释放介质的阿霉素浓度；mdrug：纳米粒子所载药物总质量；n：置换PBS的次数。
可转换表面电荷的O-CS-DOX NDs在超声辐照条件下的药物释放实验，应用透析法，步骤如下：
(1)将实施例7的制备的O-CS-DOX NDs置于透析膜(截留分子量为12000g/mol)，透析膜浸入装有20mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中；
(2)将步骤(1)制得的透析装置垂直置于恒温震荡培养箱内，37℃下100rpm震荡，施加超声辐照(WED-300超声治疗仪，1w/cm2)，辐照时间为0,0.5,1,2,4,8,10min)，未施加超声辐照为对照组，分别于指定时间取出0.5mL释放介质进行阿霉素浓度的测定，并补充0.5mL的37℃PBS缓冲液，以保证释放介质的总体积保持不变；
(3)将步骤(2)取得的释放介质用多功能分光光度计在480nm波长处检测吸光度，计算释放介质中的阿霉素浓度，累积药物释放率用以下公式计算：
其中，R：累计药物释放率；Ve：PBS的置换体积；V0：释放介质总体积；Ci：第i次置换取样时释放介质的阿霉素浓度；mdrug：纳米粒子所载药物总质量；n：置换PBS的次数。
O-CS-DOX NDs在未超声辐照条件下的累积释放药物率结果如图18A所示，37℃条件下，药物释放比较缓慢，120h内的药物累积释放率仅为20.4％，显示阿霉素被紧密包裹在纳米级超声造影剂内，释放缓慢。
O-CS-DOX NDs在超声辐照条件下的累积释放药物率结果如图18B所示，37℃条件下，在超声辐照刺激下，纳米级超声造影剂的阿霉素释放量大大增加，10min内药物累积释放率达到73.6％，而无超声辐照组，10min内纳米级超声造影剂的药物累积释放率仅为0.59％。结果表明，超声辐照能够大大促进O-CS-DOX NDs的药物释放。
实施例9：包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米超声造影剂联合超声辐照对PC-3细胞的杀伤作用
取实施例7制备的O-CS-DOX NDs，使用CCK-8试剂测定其联合超声辐照对PC-3细胞的杀伤作用，预测O-CS-DOX NDs在肿瘤治疗方面的应用价值。具体操作为：
首先通过剂量-PC-3细胞活性曲线确立阿霉素的半数致死剂量(IC50)，然后再进行细胞杀伤检测，PC-3细胞以1×106个/孔接种于6孔板，待细胞生长至50％～70％密度时，分别给予11组不同处理，11个不同的处理组如下：
PBS组：阴性对照组，加入PBS缓冲液；
DOX组：加入阿霉素，未进行超声辐照；
DOX+US1组：加入阿霉素后进行超声辐照，超声辐照强度为0.5w/cm2，时间为30s；
DOX+US2组：加入阿霉素后进行超声辐照，超声辐照强度为0.5w/cm2，时间为60s；
DOX+US3组：加入阿霉素后进行超声辐照，超声辐照强度为1w/cm2，时间为30s；
DOX+US4组：加入阿霉素后进行超声辐照，超声辐照强度为1w/cm2，时间为60s；
ND-DOX组：加入O-CS-DOX NDs，未进行超声辐照；
ND-DOX+US1组：加入O-CS-DOX NDs后进行超声辐照，超声辐照强度为0.5w/cm2，时间为30s；
ND-DOX+US2组：加入O-CS-DOX NDs后进行超声辐照，超声辐照强度为0.5w/cm2，时间为60s；
ND-DOX+US3组：加入O-CS-DOX NDs后进行超声辐照，超声辐照强度为1w/cm2，时间为30s；
ND-DOX+US4组：加入O-CS-DOX NDs后进行超声辐照，超声辐照强度为1w/cm2，时间为60s；
上述DOX均按照其对PC-3细胞的半数致死量添加。
处理结束后CCK-8试剂检测各处理组细胞活性。
PC-3细胞活性曲线如图19所示，阿霉素对PC-3细胞的IC50为4.25μg/mL。各组PC-3细胞杀伤效果如下：ND-DOX+US4>DOX+US4>ND-DOX+US3＞ND-DOX+US2＞DOX+US3>DOX+US2>DOX+US1＞DOX＞ND-DOX+US1＞ND-DOX>PBS，如图20所示。结果表明，与DOX组相比，ND-DOX组细胞存活率明显增高(75.0％VS 56.7％)，表明作为药物递送系统，纳米级超声造影剂能避免DOX的系统毒性；另外，在高于US1强度的超声辐照各组中，包裹阿霉素的纳米级超声造影剂的细胞杀伤的效果均显著高于阿霉素组(ND-DOX+US2,35.2％VS.DOX+US2,45.7％；ND-DOX+US3,30％VS.DOX+US3,45.3％；ND-DOX+US4,13.6％VS.DOX+US4,15.2％)，表明一定强度的超声辐照可以增强包裹药物的纳米级超声造影剂在肿瘤细胞靶向治疗中的作用。
Claims (4)
1.一种可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂，其特征在于，所述纳米级超声造影剂是以O-羧甲基壳聚糖为壳膜，壳膜内部包裹有液态氟碳，纳米级超声造影剂的粒径为150-200nm；所述液态氟碳为全氟己烷；
所述可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法如下：
(1)将液态氟碳、吐温20、卵磷脂分散于去离子水中，纳乳法制得混悬液；
所述液态氟碳在混悬液中的体积百分比为5-10％，所述纳乳法为13000-20000rpm高速均质1-2min；
所述吐温20在混悬液中的体积百分比为0.1-0.4％，所述卵磷脂在混悬液中的质量体积百分比为0-0.15％，单位为g/mL；
(2)高速机械搅拌下向步骤(1)制得的混悬液中逐滴加入O-羧甲基壳聚糖溶液，得悬乳液；
所述O-羧甲基壳聚糖在悬乳液中的质量体积分数为0.1-0.2％，单位为g/mL；其中，O-羧甲基壳聚糖的重均分子量为100-300KD；
所述高速机械搅拌为12000-14000rpm机械搅拌1-3min；
(3)将步骤(2)制得的悬乳液室温静置5-10min，低速离心，取上层液体，过滤得可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂；
所述低速离心为300-1000rpm离心3min。
2.如权利要求1所述纳米级超声造影剂，其特征在于，步骤(3)中所述过滤采用0.45μm过滤器过滤。
3.一种可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂，其特征在于，所述纳米级超声造影剂以O-羧甲基壳聚糖为壳膜，壳膜内部包裹有液态氟碳和阿霉素，粒径为170-200nm，O-羧甲基壳聚糖与阿霉素的质量比为3:(0.9-4)；
所述可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法如下：
1)将液态氟碳、吐温20、卵磷脂、阿霉素分散于去离子水中，纳乳法制得混悬液；
所述液态氟碳为全氟己烷，所述液态氟碳在混悬液中的体积百分比为5-10％；所述阿霉素在混悬液中的浓度为0.5-2.0mg/mL；
所述吐温20在混悬液中的体积百分比为0.1-0.4％，所述卵磷脂在混悬液中的质量体积百分比为0-0.15％，单位为g/mL；
所述纳乳法为13000-20000rpm高速均质1-2min；
2)按照权利要求1所述的可转换表面电荷的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂的制备方法中的步骤(2)-(3)，制备得到可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂。
4.权利要求3所述的可转换表面电荷的包裹阿霉素的壳聚糖衍生物纳米级超声造影剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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