CN110638790A - 红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统及其制备方法和用途 - Google Patents

红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统及其制备方法和用途，所述系统内含有红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米粒，所述纳米粒包括红细胞膜、海藻酸钠以及三氧化二砷，所述海藻酸钠与三氧化二砷形成复合体，所述复合体包载于红细胞膜内。本发明采用水溶性材料海藻酸钠包载ATO，制得的RSANs粒径分布均匀，与游离药物相比具有显著的体外缓释作用。对治疗急性早幼粒细胞性白血病和抗肿瘤具有积极的意义。

Description

红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统及其制备 方法和用途
技术领域
本发明涉及一种药物制剂，特别是涉及一种红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统及其制备方法和用途。
背景技术
三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)是中药砒霜的主要有效成分，20世纪70年代，我国学者首次将其应用于急性早幼粒细胞性白血病(APL)取得了显著疗效。后经大量临床研究，2000年ATO被FDA批准成为治疗APL的一线用药。在APL的治疗中，ATO可以抑制细胞凋亡、诱导细胞分化并发挥抗肿瘤作用。目前注射用ATO已应用于临床，用于急性早幼粒细胞性白血病及原发性肝癌晚期的治疗。然而ATO在血液中易被快速清除，在临床治疗中需每天给药，同时网状内皮系统的摄取导致只有极少量的药物能到达肿瘤部位，由于ATO毒性强烈，增大其给药剂量，又会使系统性毒性增加，引起肝肾功能、心脏及外周神经性损伤。针对以上问题，也有ATO的现代剂型研究，如Sheldon L A(L.A.Sheldon,Cell cycle,2058-2072,16,2017)使用ATO磁性纳米粒子热敏磁性脂质体(MZFs)通过E2F1-视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)来探索无机砷抑制细胞周期进程并将其应用于癌症治疗，Xuecheng Xiao(X.Xiao,Y.Liu,M.Guo,W.Fei,H.Zheng,R.Zhang,Y.Zhang,Y.Wei,G.Zheng and F.Li,Journal ofbiomaterials applications,23-35,31,2016)等人使用聚丙烯酸包封负载ATO的介孔二氧化硅纳米粒子来改善砷的药代动力学特征；近年来以海藻酸钠纳米粒作为药物载体也逐渐引起关注，Shardool Jain(Shardool Jain and Mansoor Amiji,Biomacromolecules,1074-1085,13,2012)等人通过Tuftsin修饰的海藻酸钠纳米粒包载DNA靶向巨噬细胞，证明其可以有效递送质粒DNA并实现体外持续的基因表达。
现代研究表明，载ATO纳米粒在一定程度上能降低药物的瞬时血浆浓度从而降低其毒性，实现了药物在体内的缓释，但同时也存在着制备过程复杂、缓释时间不足、载体材料生物相容性不足等问题；而海藻酸钠则多用于包载药物单体或高分子化合物，在包载纳米颗粒的应用上鲜有报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统及其制备方法和用途，用于解决现有技术中ATO纳米粒制备过程复杂、缓释时间不足、载体材料生物相容性不足的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本申请将生物相容性良好的红细胞膜(RBCM)和海藻酸钠(SA)相结合，制得具有缓释作用的载药纳米粒RSANs，并对纳米粒粒径、PDI、包封率、载药量和形态进行表征。同时，体外释放实验、体外细胞摄取实验结果表明该载药系统可实现缓释长循环及保效减毒的目的。进一步，通过体内外安全性实验验证，将游离三氧化二砷制备成为RSANs后，在一定浓度下无静脉注射毒性。
本发明提供一种红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统，所述系统内含有红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米粒，所述纳米粒包括红细胞膜、海藻酸钠以及三氧化二砷，所述海藻酸钠与三氧化二砷形成纳米复合物，所述纳米复合物包载于红细胞膜内。
优选地，所述纳米粒的粒径为160-200nm，PDI小于等于0.3。
本发明的另一方面提供了上述载药系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠溶液、表面活性剂与ATO纳米颗粒混合，搅拌，获得海藻酸钠包载的纳米复合物；
(2)向海藻酸钠包载的纳米复合物中加入红细胞囊泡，利用挤出仪挤出，即可。
进一步地，所述步骤(1)中ATO纳米颗粒的制备方法为：将ATO溶液加入氯化钙溶液中并持续搅拌。更进一步地，所述ATO与氯化钙的质量比为4～100:5～120。例如所述ATO浓度可以为0.4％～1.0％,0.4％～0.8％，0.8％～1.0％。体积范围0.1mL～1.0mL；氯化钙浓度可以为0.1％～0.4％，0.1％～0.2％，0.2％～0.3％，体积范围0.5mL～3.0mL。
进一步地，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂。例如泊洛沙姆188，吐温80。更进一步地，所述海藻酸钠与表面活性剂的质量比为：3～10:1～5，表面活性剂的pH范围为4～11；4～7；7～11。例如若所述海藻酸钠溶液体积为10mL则浓度可为0.03％～0.1％，0.03％～0.05％，0.05％～0.08％，0.08％～0.1％；同时表面活性剂浓度为1％则体积范围为0.1mL～0.5mL。
例如可以使用氯化钙浓度为0.2％，体积为3mL；ATO浓度为0.8％，体积为1mL；泊洛沙姆188浓度为10％，体积为0.1mL；海藻酸钠浓度为0.03％，体积为10mL，pH为5。
更进一步地，当1mL红细胞膜对应1mL全血时，所述红细胞囊泡与海藻酸钠包载的纳米颗粒体积比为1:5～12，也可以是1:5～8，1:8～10，1:10～12。
进一步地，所述步骤(1)中的搅拌采用磁力搅拌，转速500-700rpm，时间为0.25h～1h。
进一步地，所述红细胞囊泡的制备方法为：利用超声或者挤出仪处理红细胞膜。更进一步地，所述挤出条件为将红细胞膜依次通过800nm、400nm及200nm的聚碳酸酯膜，每个粒径下来回挤出10-30次。
更进一步地，所述红细胞膜的制备方法为：取血，离心去除血浆和白细胞，破壁，离心、清洗。更具体可以是：大鼠腹主动脉取血，低温低速离心去除血浆和白细胞，低渗EDTA溶液破壁多次，离心、清洗后即得所述红细胞膜。
本发明的另一方面提供了上述红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统在制备治疗肿瘤药物中的用途。所述药物可以是静脉注射用制剂。
更进一步地，所述肿瘤是指急性早幼粒细胞性白血病。
如上所述，本发明的红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统，具有以下有益效果：
1)本发明采用水溶性材料海藻酸钠包载ATO，制得的RSANs分布均匀，平均粒径160-200nm，PDI稳定在0.3以下，与游离药物相比具有显著的体外缓释作用。
2)本发明的递药系统没有溶血作用，可用于静脉注射，连续给药体内后无明显的系统毒性。
3)本发明的递药系统在抗APL和肝肿瘤方面与游离药物相比可保效减毒。
附图说明
图1为SANs和RSANs的粒径(A)、PDI(B)及Zeta电位(C)实验图；
图2为RSANs在15天内的粒径(A)及PDI(B)变化实验图；
图3为SANs(A)和RSANs(B)在透射电镜下的形态图；
图4为ATO、SANs和RSANs体外释放曲线；
图5为RSANs孵育3h(A)和24h(B)后的体外溶血实验结果图；。
图6为NB4细胞摄取SANs和RSANs的共聚焦显微镜图；
图7为Raw 264.7细胞(A)、NB4细胞(B)及7721细胞(C)摄取SANs和RSANs的流式细胞图；
图8为通过293细胞验证空白载体SNs和RSNs(A)及SANs和RSANs(B)的体外毒性实验结果图；
图9为ATO、SANs和RSANs对7721细胞(A)及NB4细胞(B)的抑制作用结果图；
图10为连续给药ATO、SANs和RSANs入体内后的小鼠体重变化(A)、白细胞数量(B)、谷丙转氨酶ALT(C)、谷草转氨酶AST(D)等安全性评价结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
在下文中缩写及其含义：
RBCM：红细胞膜
SA：海藻酸钠
SANs：海藻酸钠载药纳米粒
RSANs：红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米系统
实施例1.SANs的制备
①3mL 0.2％的氯化钙与1mL 0.8％的ATO混匀后搅拌0.5h形成纳米颗粒；加入10mL 0.03％的海藻酸钠溶液与0.1mL10％的F188，调pH为5，持续搅拌0.5h得到海藻酸钠载药纳米粒；
②0.5mL 0.2％的氯化钙与1mL 0.6％的ATO混匀后搅拌1h形成纳米颗粒；加入10mL 0.03％的海藻酸钠溶液与0.5mL 10％的F188，调pH为11，持续搅拌0.5h得到海藻酸钠载药纳米粒；
③3mL 0.2％的氯化钙与0.1mL 0.4％的ATO混匀后搅拌0.5h形成纳米颗粒；加入10mL 0.03％的海藻酸钠溶液与0.1mL 10％的F188，调pH为7，持续搅拌0.5h得到海藻酸钠载药纳米粒；
④3mL 0.2％的氯化钙与0.1mL 1.0％的ATO混匀后搅拌0.5h形成纳米颗粒；加入10mL 0.03％的海藻酸钠溶液与0.1mL 10％的F188，调pH为7，持续搅拌0.5h得到海藻酸钠载药纳米粒。
实施例2.红细胞膜的制备
取健康大鼠，称体重，按照100g/0.7mL腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，将血液分装至含有50μL肝素钠的EP管中，每管0.5mL，离心(20000rpm，5min，4℃)去掉上清和白细胞层，加入PBS溶液混匀，重复清洗三次。加入0.9mL EDTA溶液(0.2mM)混匀，使红细胞在低渗介质中裂解，释放血红蛋白，然后再加入0.1mL 10倍浓度PBS混匀，离心(13200r/min，10min，4℃)清洗，去掉上清液，保留底部红细胞膜，重复此过程三遍以上，直至上清液无色。去上清后用EDTA溶液定容至0.5mL，-80℃保存。
实施例3.RVs的制备
取按照实施例2制备好的红细胞膜，在37℃水浴中解冻后于功率250W、频率40KHz下超声2min，然后再用薄膜挤出仪将超声得到的囊泡依次通过800、400及200nm的聚碳酸酯膜进行挤出，每个粒径下反复挤出至少10次，得到RVs。
实施例4.RSANs的制备
取按照实施例3制备好的RVs溶液与实施例1制备好的4种SANs纳米溶液适量，按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:5、1:8、1:10、1:12进行混合，然后用薄膜挤出仪通过400nm、200nm的聚碳酸酯膜进行挤出，反复挤出至少15次，得到RSANs。按照上述方法平行制备SANs和RSANs样品各三组。制备好的样品供下述实施例使用。
用马尔文激光粒度仪测定其粒径、PDI及Zeta电位。结果显示，各个样品中SANs平均粒径为200～420nm，PDI为0.25～0.50；而当RVs溶液与1-①SANs溶液的体积比为1:5、1:10、1:12时，RSANs平均粒径为150～250nm，PDI为0.263～0.447。由图1可以看出，按照实施例1-①制备好的SANs平均粒径为147.9nm，当体积比为1:8时RSANs平均粒径为163.2nm，粒径相差约16nm，与两侧红细胞膜的厚度相符，证明了红细胞膜的包封；SANs和RSANs的PDI平均值分别为0.24和0.27，均小于0.3，说明纳米粒大小均一，为最佳实例。
实施例5.RSANs的稳定性考察
按照实施例4的方法制备的样品①按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:8制备三个批次的RSANs，将样品于常温下放置，连续15天测量样品粒径、多分散系数，考察其稳定性。
由图2结果可见，RSANs在15天内粒径稳定在200nm以下，PDI保持在0.3以下，样品粒径在第10天后有轻微增大的趋势，但基本稳定，实验中未观察到纳米乳液出现沉淀或团聚等现象，说明RSANs在15天内性状和分布能基本保持稳定。
将实施例4制备的其他RSANs采用同样的方法考察其稳定性，当体积比为1:5及1:10时获得类似的实验结果，而当体积比为1:12时四天内能保持基本稳定。
实施例6.纳米粒的形态观察
将普通碳支持网有膜面向上放于铺有滤纸的培养皿中，取10μL前述实施例中制备的纳米粒溶液滴于碳支持网上，风干后滴10μL超纯水清洗，再次风干后滴10μL磷钨酸钠溶液染色5min，用滤纸从边缘吸去多余染液，红外烘烤灯下烘烤30min，置于透射电镜下观察。
由图3电镜图可知，制得的SANs具有规整的球形结构，表面光滑；RSANs可见清晰的壳-核双层结构，表示红细胞膜成功包封。两者粒径均约在50-100nm之间。
实施例7.包封率和载药量的测定
取实施例4制备好RSANs，，加入已处理好的透析袋(MW 3500)中，将两端夹紧，置于50mL的透析外液(pH＝7.4,1×PBS)中，37℃、磁力搅拌下透析3h后取透析液经0.22μm微孔滤膜过滤后使用电感耦合等离子体法(ICP)测量透析液中砷浓度。通过以下公式计算包封率和载药量：包封率＝(投入砷量-透析液中砷量)/投入砷量x 100％；载药量＝(投入砷量-透析液中砷量)/(投入砷量-透析液中砷量+SA质量)。
其中ICP的测定条件为：
高频发生器频率：27.12MHz；RF功率：1150W；冷却气流量：1.0L/min；辅助气流量：0.5L/min；载气流量：0.5L/min；垂直观测高度：15.0mm；冲洗泵速：50rmp/min；分析泵速：50rmp/min；泵稳定时间：5s；冲洗时间30s；积分时间：短波15s；长波5s。标准溶液为美国SPEX多元素混标液(1000μg/mL)。
通过ICP检测，纳米粒包封率为4.82％～14.31％、载药量为1.01％～4.98％，其中采用实施例1中的样品①，当ATO浓度为0.8％时该纳米粒包封率和载药量分别为14.31％.和4.98％，但当ATO浓度由0.8％增加到1.0％时，载药量变化不大而包封率减小。因此可以确定ATO浓度为0.8％时为最佳实例。
实施例8.纳米粒的体外释放实验
分别取2mL ATO溶液、SANs溶液和RSANs(按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:5、1:8、1:10、1:12进行混合)溶液于透析袋中(MW 3500)，扎线封口后置于50mL 1×PBS中，于37℃、磁力搅拌下恒温震荡进行体外释放，分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72、84h取出1mL释放液并补加1mL新鲜释放外液，于24h时以50mL新鲜1×PBS替换全部释放液。
由图4(样品①)结果可知，4h内三组药物均快速释放，其中游离ATO在2h内释放98.61％并在4h内完全释放；在84h时间内，SANs和RSANs均显示出了缓释作用，且RSANs的缓释效果明显优于SANs。在0-4h内，SANs和RSANs的突释现象来源于未包裹进纳米粒的游离药物，包括一些存在于SANs与红细胞膜之间或附着在纳米粒表面的药物。累计释放时间为12h时，SANs的药物累计释放量为91％，36h内完全释放；而RSANs的释放进一步减缓，在12h内累计释放量为67％，直至84h累积释放率达到95％。总体分析，RSANs在各个时间点的ATO累计释放量与SANs显著减少，证明RBCM在SANs周围形成物理屏障进一步加强了缓释效果。
其他样品采用前述方法，当RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:10时获得类似的实验结果。当RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:5时RSANs在48h内累计释放98％，体积比为1:12时虽0～4h内突释现象略有缓解，但4～12h释放较快。。
实施例9.体外溶血与凝聚试验
取SD大鼠全血，加入生理盐水，混合后离心(2000rpm 4min)除去上层液体，重复3次直至上清液呈无色澄清。收集红细胞，加入生理盐水，制成2％(v/v)的红细胞混悬液。取6支试管，按表所示配比量，分别加入红细胞混悬液、RSANs、生理盐水和超纯水。分别以生理盐水和超纯水作为阴性对照和阳性对照。摇匀后置于37℃恒温箱中孵育，分别于3h和24h时观察溶血情况并取上清测量溶血率，进一步在倒置显微镜下观察红细胞聚集情况。
表1体外溶血试验分组
Figure BDA0002256340770000071
Figure BDA0002256340770000081
由图5(样品①按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:8制备)可看出，孵育3h及24h后给药组(1-4)上清液均无色澄明，溶液中无棕红色絮状沉淀，且测量溶血率均低于0.01％，与阴性对照组(阴)无明显差异，进一步在倒置相差显微镜下观察，无红细胞聚集现象。溶血实验结果表明，当ATO最终浓度低于0.0375mg/mL时，RSANs不会引起红细胞的溶血和凝集，对红细胞的毒性可以忽略不计，可用于静脉注射。
其他样品采用前述方法进行实验，获得类似的实验结果。
实施例10.激光共聚焦观察NB4细胞对纳米粒的摄取
1.APL细胞NB4培养：NB4细胞使用RPMI 1640完全培养基，于37℃，5％CO2条件下培养。
2.Dil标记的RVs制备：取2mg/mL的Dil储备液100μL，加入900μLPBS配制成浓度为0.2mg/mL的工作液，备用；另取制备好的RVs溶液0.5mL，加入0.5mL Dil工作液，室温条件下避光孵育离心(4000rpm，30min，4℃)8min，最后得到的沉淀用0.5mL 1×PBS溶解备用。
3.5(6)-氨基荧光素标记的SANs制备：取10ml 0.03％的SA溶液加入400μL的5(6)-氨基荧光素(2mg/ml)，搅拌过夜。按照实施例1的制备方法，得到5(6)-氨基荧光素标记的载药纳米粒。
4.荧光标记的RSANs的制备：取制备好的荧光标记的RVs溶液和SANs溶液，按照实施例4的制备方法，得到荧光标记的RSANs。
5.细胞给药：取灭菌12孔细胞培养板，准备2个孔，向孔中接种1mL细胞密度约为2*105个/mL的细胞液，以去血清培养液于CO2培养箱中培养2h。离心弃旧细胞培养液，以PBS清洗细胞两遍后，两孔各加入含有荧光标记SANs和RSANs(高分子材料浓度均为0.2mg/mL)的去血清培养液1mL，培养箱中孵育1h后取出，后续实验过程均应注意避光操作：
(1)离心弃培养基，PBS清洗3次；
(2)加入4％多聚甲醛500μL，室温下固定细胞15min；
(3)离心弃溶液，PBS清洗3次；
(4)向每个孔中加入500μL Hoechst 33342，染核15min；
(5)离心弃溶液，PBS清洗3次；
(6)离心弃PBS，加入抗荧光淬灭液与细胞混匀后，滴加与多聚赖氨酸涂布的载玻片上，盖片，10min后用无色指甲油封片；
(7)激光共聚焦扫描显微镜下观察，采用405nm的激发光激发Hoechst 33342，549nm的激发光激发Dil，493nm的激发光激发5(6)-氨基荧光素。
如图6(样品①按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:8制备)所示，蓝色荧光代表被染色的细胞核，红色荧光代表被染色的RVs，绿色荧光代表被染色的SANs。在给药1h后，可以观察到红色和绿色荧光均出现在细胞核周围，且两者位置重合，说明SANs和RSANs在体外均能够被NB4细胞摄取且在此过程中RSANs能够保持其壳-核结构的完整性。
其他样品采用前述方法测试，当体积比为1:10时获得类似的实验结果。当体积比为1:5时由于RVs量不足细胞内部分区域可见单独的绿色荧光，当体积比为1:12时由于RVs过量细胞内外部分区域均出现红色荧光而未见绿色荧光。但各比例下SANs和RSANs均能被细胞摄取并保持结构完整。
实施例11.流式细胞仪观察Raw 264.7、NB4细胞及7721细胞对纳米粒的摄取
流式细胞仪定量检测细胞对纳米粒的摄取时，对于荧光标记的SANs溶液的制备同实施例10，而RSANs的制备则使用不含荧光标记的RVs溶液和荧光标记的SANs溶液制得。然后取灭菌12孔细胞培养板，准备9个孔，分成SANs组、RSANs组和空白组，每组设3个复孔。向孔中接种1mL细胞密度约为2*105个/mL的细胞液，于CO2培养箱中培养24h。吸弃旧细胞培养液，以PBS清洗细胞两遍后，实验组加入含有荧光标记SANs和RSANs(高分子材料浓度均为0.2mg/mL)的去血清培养液1mL，空白组加入等量去血清培养液，培养箱中孵育1h后取出。移除培养基，PBS清洗3次(每次3min)，胰酶消化细胞后离心，移除上清液，PBS清洗3次，最后重悬于500μL PBS中，用流式细胞仪FITC通道检测细胞摄取情况。
由图7(样品①按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:8)知，NB4细胞摄取SANs和RSANs后，平均荧光强度分别为813和941；7721细胞摄取SANs和RSANs后，平均荧光强度分别为5111和5211；Raw 264.7细胞摄取SANs和RSANs后，平均荧光强度分别为4158.5和2045，对RSANs的摄取显著低于SANs(P＜0.01)。这说明了红细胞膜在纳米粒表面的包覆不影响病理细胞的摄取同时可以降低巨噬细胞的摄取，原因与红细胞膜表面上存在的一些识别自身物质的蛋白如CD47、CD59等有关，它们通过结合巨噬细胞表面的信号调节蛋白从而“躲避”巨噬细胞的吞噬。
其他样品采用前述方法实验，当体积比为1:10与1:12时获得类似的实验结果。而体积比为1:5时由于RVs量不足，Raw 264.7对RSANs组的吞噬略有增加，与其他样品组相比荧光强度稍有增加。
实施例12.体外细胞毒性实验
采用CCK-8法考察纳米粒的细胞毒性。取灭菌96孔细胞培养板，分成给药组、对照组和空白组，每组设置3个复孔。给药组和对照组各孔中接种100μL细胞密度约为5×104个/mL的293细胞液，空白组加入等体积完全培养基，于CO2培养箱中培养24h。吸弃旧培养液，不同浓度的给药组分别给予含药完全培养液100μL，对照组给予等量完全培养液，孵育24h。吸弃各孔中溶液，PBS清洗两遍，再加入100μLCCK8工作液，孵育2h后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度值，计算细胞存活率。其中不载药的SA纳米粒(SNs)和红细胞膜包裹的不载药SA纳米粒(RSNs)SA浓度分别为8、12、20、30、40、50、60μg/mL，ATO、SANs和RSANs组ATO浓度分别为1,2,4,6,8,10,12,20μg/mL。
Figure BDA0002256340770000101
图8显示为样品①(按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:8制备)的实验结果，如图8A所示，在SA浓度为8-60μg/mL的范围内，SNs组和RSNs组各组细胞存活率均高于95％，显示载体材料SA及RBCM对293细胞没有明显毒性，安全性良好。通过图8B可知，游离的ATO对细胞具有较强杀伤力，其毒性明显强于各纳米粒组，而RSANs组均能够显著减少药物对正常细胞的毒副作用。
其他样品采用前述方法实验，获得类似的实验结果。
实施例12.体外有效性实验
取灭菌96孔细胞培养板，分成给药组、对照组和空白组，每组设置3个复孔。给药组和对照组各孔中接种100μL细胞密度约为5×104个/mL的7721或NB4细胞液，空白组加入等体积完全培养基，于CO2培养箱中培养24h。将制备好的游离ATO、SANs和RSANs溶液用DMEM完全培养基稀释得ATO浓度分别2μg/mL的各给药组。取出在96孔板中培养了24h的细胞，吸弃培养基，每种细胞分别给予以上药液，孵育24h，加入CCK8工作液，孵育2h，测定吸光度，计算存活率，考察各制剂组对肿瘤细胞的抑制作用。
如图9(样品①按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:8制备)所示，ATO在低浓度下即显示出较强的细胞杀伤作用，各组NB4细胞和7721细胞在给药60h内几乎全部被抑制且作用强度依次为RSANs组<SANs组<游离ATO组；但由于培养板为封闭体系且纳米粒具有缓释性，各纳米粒组中药物随着时间推移逐渐释放，最终达到与游离组相同的疗效，也说明各纳米粒中的药物最终可完全释放。根据实验结果可以推测，当药物进入体内后，与游离ATO和SANs相比，RSANs能避免被免疫系统快速清除，并且能保持药物对肿瘤细胞的杀伤作用。
其他样品采用前述方法实验，获得类似的实验结果。
实施例12.体内安全性评价
本实例的目的在于考察连续静脉注射制备的纳米制剂之后，其是否会引起小鼠全身系统及血液毒性。将健康裸鼠分为生理盐水组、ATO组、SANs组和RSANs组，每两天给药一次(给药ATO浓度为20μg/mL、体积为0.2mL)并记录小鼠体重，重复七次，实验期间随时观察小鼠生存状态、饮水进食精神状态等，记录各组小鼠存活率。末次给药两天后，各组小鼠均眼眶取血，血样加入预先混好肝素钠的EP管中，对WBC、ALT、AST等进行分析。
由图10(样品①按照RVs溶液与SANs溶液的体积比为1:8制备)可知，试验期间小鼠平均体重呈增长趋势，SANs组和RSANs组各血液学指标均在正常值范围内，而ATO组白细胞与对照组相比略有降低。推测该浓度下长期给与游离ATO可能造成慢性毒性，与其相比SANs组和RSANs组由于药物的缓释作用降低了瞬时血药浓度，可降低药物毒性，于体内无明显毒性。
其他样品采用前述方法实验，获得类似的实验结果。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统，其特征在于，所述系统内含有红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米粒，所述纳米粒包括红细胞膜、海藻酸钠以及三氧化二砷，所述海藻酸钠与三氧化二砷形成纳米复合物，所述纳米复合物包载于红细胞膜内。
2.如权利要求1所述的红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠溶液、表面活性剂与ATO纳米颗粒混合，搅拌，获得海藻酸钠包载的纳米复合物；
(2)向海藻酸钠包载的纳米复合物中加入红细胞囊泡，利用挤出仪挤出，即可。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中ATO纳米颗粒的制备方法为：将ATO溶液加入氯化钙溶液中并持续搅拌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ATO与氯化钙的质量比为4～100:5～120。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述海藻酸钠与表面活性剂的质量比为：3～10:1～5，表面活性剂的pH范围为4～11。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当1mL红细胞膜对应1mL全血时，所述红细胞囊泡与海藻酸钠包载的纳米复合物体积比为1:5～12。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述红细胞囊泡的制备方法为：利用超声或者挤出仪处理红细胞膜。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述红细胞膜的制备方法为：取血，离心去除血浆和白细胞，破壁，离心、清洗。
10.如权利要求1所述的红细胞膜包封海藻酸钠载三氧化二砷纳米载药系统在制备治疗肿瘤药物中的用途。
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