CN113521006B - 蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体、靶向肽修饰仿生脂质体及其制备方法和治疗疟疾的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体、靶向肽修饰仿生脂质体及其制备方法和治疗疟疾的应用；本发明的蒿甲醚脂质体制备方法包括将蒿甲醚载入脂质体内，能够提高蒿甲醚的水溶性，提高其抗疟疾效果；本发明的红细胞膜包脂质体的制备方法包括将红细胞膜包裹于蒿甲醚脂质体表面，通过红细胞膜表面的肝素样受体俘获血液游离的裂殖子，阻止裂殖子反复感染正常红细胞，预防疟疾周期性发作；本发明的靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法包括在红细胞膜包脂质体(仿生脂质体)表面修饰PS靶向肽，靶向递送蒿甲醚至感染红细胞，提高抗疟疾效果。

Description

蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体、靶向肽修饰仿生脂质体及其制备方法和治疗疟疾的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体、靶向肽修饰仿生脂质体及其制备方法和治疗疟疾的应用。
背景技术
疟疾(malaria)是经按蚊叮咬传播的急性传染性疾病，是联合国重点防控的三大传染病之一。青蒿素类药物是一线抗疟药物，其抗疟机制主要是影响疟原虫表膜与线粒体的功能，阻断疟原虫营养的供应。蒿甲醚作为青蒿素的主要衍生物之一，其化学性质相对稳定，抗疟效果优于青蒿素，是一种诺华制药抗疟药物-Coartem的主要成分。
然而，蒿甲醚存在生物利用度低，溶解性差，半衰期短等问题，极大限制了其临床应用。而且，传统蒿甲醚制剂缺乏靶向性，因此使用剂量相对较高，患者面临心脏毒性、胚胎毒性及神经毒性等风险提高，新型纳米靶向抗疟制剂的研发显得尤为关键。
发明内容
本发明的目的在于提供蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体、靶向肽修饰仿生脂质体及其制备方法和治疗疟疾的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种蒿甲醚脂质体的制备方法，包括：
将蒿甲醚、蛋黄卵磷脂和胆固醇溶解于乙醇和二氯甲烷的混合溶液中，制成脂质溶液；
将脂质溶液加入PBS缓冲溶液中，搅拌，超声处理，并将有机溶剂蒸发，制得脂质体；
将脂质体依次用200nm、100nm的聚碳酸酯膜来回挤压。
在可选的实施方式中，将脂质溶液按照0.20-0.25mL/min的速率滴加入40-50℃的1×PBS的缓冲溶液中，与此同时，通过磁力搅拌器以700-800r/min的转速搅拌，以200w、超声处理5s，间歇停止5s的条件超声处理8-12min，旋转蒸发有机溶剂，制得脂质体。
第二方面，本发明提供一种蒿甲醚脂质体，其是由前述实施方式的蒿甲醚脂质体的制备方法制备的。
第三方面，本发明提供一种红细胞膜包脂质体的制备方法，包括：
将红细胞膜加入前述实施方式的蒿甲醚脂质体的溶液中，冰水浴超声处理，将悬液用挤出方式依次挤出通过400nm、200nm的聚碳酸酯膜。
在可选的实施方式中，红细胞膜的制备方法包括：在红细胞溶液内加入含0.25mmol/L EDTA的低渗溶液，剧烈涡旋后，添加PBS溶液至等渗，再次涡旋混匀；离心去上清液以浓缩；再添加纯水，重悬，离心去上清液，洗涤红细胞膜至白色。
第四方面，本发明提供一种红细胞膜包脂质体，其是由前述实施方式的红细胞膜包脂质体的制备方法制备的。
第五方面，本发明提供一种靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法，包括：
向前述实施方式的红细胞膜包脂质体的溶液中加入DSPE-PEG2000-PTP，冰水浴超声处理，通过挤出方式依次挤出通过400nm、200nm聚碳酸酯膜。
在可选的实施方式中，DSPE-PEG2000-PTP的制备方法包括：固相合成多肽，并在N段加入半胱氨酸末端，再与DSPE-PEG2000-Mal进行偶联。
第六方面，本发明提供一种靶向肽修饰仿生脂质体，其是由前述实施方式的靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法制备的。
第七方面，本发明提供如前述实施方式的蒿甲醚脂质体、或前述实施方式的红细胞膜包脂质体、或前述实施方式的靶向肽修饰仿生脂质体在治疗疟疾的应用。
本发明的有益效果包括：
本发明实施例的蒿甲醚脂质体的制备方法是将蒿甲醚载入脂质体，提高蒿甲醚的水溶性，增强其抗疟疾效果。
本发明实施例的蒿甲醚脂质体由上述制备方法制得，通过将蒿甲醚载入脂质体，提高水溶性，增强抗疟疾效果。
本发明实施例的红细胞膜包脂质体的制备方法将红细胞膜包裹于蒿甲醚脂质体表面，通过红细胞膜表面的肝素(heparan sulfate,HS)俘获血液游离的裂殖子，阻止裂殖子的再次感染正常红细胞，能够阻断疟疾周期性发作，进而提高抗疟疾的效果；而且，红细胞膜包裹的蒿甲醚脂质体通过将蒿甲醚载入脂质体，提高水溶性，进一步提高抗疟疾效果。
本发明实施例的红细胞膜包脂质体由上述的红细胞膜包脂质体的制备方法制得，能够有效地提高抗疟疾效果。
本发明实施例的靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法在红细胞膜包脂质体(仿生脂质体)表面修饰PS靶向肽，以便于与感染红细胞表面的PS作用，靶向递送蒿甲醚至感染红细胞，提高抗疟疾效果；利用红细胞膜表面的肝素俘获裂殖子阻断其反复感染正常红细胞，通过载入脂质体的蒿甲醚的水溶性得到改善，以有效地提高抗疟疾效果。
本发明实施例的蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体或靶向肽修饰仿生脂质体用于治疗疟疾具有良好的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1的脂质体稳定性试验结果，其中，(A)7天粒径稳定性实验；(B)10％血清粒径稳定性和(C)浊度变化；
图2为本发明实施例1的脂质体靶向性试验结果，其中，(A)鼠疟模型裂殖子对不同红细胞膜含量的脂质体的摄取及(B)MFI的统计分析；(C)鼠疟模型裂殖子对Lip-NR、 EM-NR和PEM-NR的摄取及(D)MFI的统计分析；(E)鼠疟模型裂殖子与PEM-NR的荧光共聚焦图；
图3为本发明中HO/TO双染，流式细胞法对疟疾模型鼠的红细胞生长周期分析结果；
图4为本发明中不同感染率的鼠疟模型红细胞中正常红细胞(A)、环状体(B)、滋养体(C)和裂殖体(D)对脂质体(Lip-NR、EM-NR、P1-EM-NR、P2-EM-NR、P3-EM-NR) 的摄取；(E)滋养体和裂殖体与P1-EM-NR脂质体的激光共聚焦图片；
图5为本发明中实施例1的脂质体抗疟药性考察结果，其中，(A)用药后疟疾模型鼠的生存曲线，(B)为用药后疟疾模型鼠的体重曲线，(C)为用药后感染红细胞的ROS 水平，(D)为用药后感染红细胞的线粒体活性；
图6为本发明中各组动物脏器系数；
图7为本发明中各组动物脏器的HE染色图片；
图8为本发明中各组动物的肺部(A)Tunel染色的荧光图片和(B)Tunel阳性细胞统计分析；
图9为本发明中感染红细胞粘附肺组织的影响结果，其中，(A)为感染红细胞经PBS、 f-ARM、Lip-ARM、EM-ARM和P1EM-ARM孵育后，与肺部组织孵育后的荧光图片，(B)为黏附的感染红细胞数据统计分析；
图10为本发明中实施例1的脂质体的抗裂殖子黏附作用，其中(A)为裂殖子经不同药物孵育后，与红细胞孵育的流式散点图，其中1号：单独裂殖子(无HO，不加药)； 2号：单独裂殖子(含HO，不加药)；3号：正常红细胞(无CFDA-SE)；4号：正常红细胞(含CFDA-SE)；5号：裂殖子加正常红细胞(无HO及CFDA-SE)；6号：裂殖子加正常红细胞(含HO及CFDA-SE，不加药)；7号：裂殖子加正常红细胞(含HO及CFDA-SE，加f-ARM)；8号：裂殖子加正常红细胞(含HO及CFDA-SE，加Lip-ARM)；9号：裂殖子加正常红细胞(含HO及CFDA-SE，加EM-ARM)；10号：裂殖子加正常红细胞(含HO及 CFDA-SE，加P1EM-ARM)。(B)为裂殖子侵袭红细胞的复合体比例统计分析；
图11为本发明实施例1的脂质体安全性考察结果，其中，(A)为MLE-12细胞经脂质体孵育后的荧光显微镜图片，(B)为脂质体的MLE-12细胞的MTT实验，(C)MLE-12 细胞经脂质体孵育后的荧光强度统计分析图，(D)为脂质体的溶血实验。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以将对本发明的蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体、靶向肽修饰仿生脂质体及其制备方法和治疗疟疾的应用作详细描述。
本发明提供一种蒿甲醚脂质体的制备方法，其包括：将蒿甲醚、蛋黄卵磷脂和胆固醇溶解于乙醇和二氯甲烷的混合溶液中，制成脂质溶液；将脂质溶液加入PBS缓冲溶液中，搅拌，超声处理，并将有机溶剂蒸发，制得脂质体；将脂质体依次用200nm、100nm 的聚碳酸酯膜来回挤压。
进一步地，脂质溶液按照0.20-0.25mL/min的速率滴加入40-50℃的1×PBS的缓冲溶液中，与此同时，通过磁力搅拌器以700-800r/min的转速搅拌，以200w、超声处理5s，间歇停止5s的条件超声处理8-12min，旋转蒸发有机溶剂，制得脂质体。
具体地，蒿甲醚脂质体的制备方法包括：称取蒿甲醚(ARM)10mg、蛋黄卵磷脂(Eggyolk phosphatidylcholines，EPC)80mg、胆固醇(Cholesterol，CHO)20mg，共同溶解于3mL无水乙醇与二氯甲烷混合溶液中(无水乙醇和二氯甲烷的体积比未5:1)，支撑脂质溶液；然后用1mL无菌注射器将脂质溶液按照0.23mL/min缓慢滴入45℃的1×PBS(pH＝7.4)中，通过磁力搅拌器以750r/min匀速搅拌直至脂质溶液全部滴定完毕，然后进行超声处理(超声条件包括：200w，超声5s，间歇5s，处理时长10 min)，超声后，通过旋转蒸发的方式将有机溶剂除去，再将脂质体依次用200nm、100 nm的聚碳酸酯膜来回挤压20次(即先用200nm的聚碳酸酯膜挤压20次，再用100nm 的聚碳酸酯膜挤压20次)，得到粒径小于200nm且分散性良好的蒿甲醚脂质体(Lip- ARM)。
本发明的蒿甲醚脂质体的制备方法将蒿甲醚载入脂质体，能够提高蒿甲醚的水溶性，有利于提高其抗疟疾效果。
本发明还提供一种红细胞膜包脂质体的制备方法，其包括：将红细胞膜加入蒿甲醚脂质体的容易中，冰水浴超声处理，将悬液用挤出方式依次挤出通过400nm、200nm的聚碳酸酯膜。
具体地，红细胞膜包脂质体的制备方法包括：将低渗提取到的红细胞膜加入蒿甲醚脂质体溶液中，冰水浴超声10min后，将悬液用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得红细胞膜包脂质体(EM- ARM)。
进一步地，红细胞膜的制备方法包括：在红细胞溶液内加入EDTA溶液，涡旋后，添加PBS溶液至等渗，再次涡旋混匀；离心去上清液以浓缩；再添加纯水，重悬，离心去上清液，并洗涤。
具体地，红细胞膜的制备方法包括：在EP管加入0.25mL 6％压积的小鼠红细胞溶液，在管内加入含0.25mmol/L的EDTA低渗溶液0.95mL，强烈涡旋后，在管内补加 50μL 20×PBS以补至等渗，再次涡旋混匀。在4℃、12000×g的条件下离心10min，去上清，重复上述离心并去上清步骤5次后，得到浓缩的红细胞膜。加入1mL纯水，重悬红细胞膜，将其离心，去上清，重复洗涤3次，即可制得红细胞膜。
需要说明的是，在制备红细胞膜的过程中，如果EP管底部有明显红色杂质(不易吹散的粘稠物)，可以将膜吸取后更换EP管，重复洗涤至膜为白色或几乎为白色。
由于红细胞膜表面的肝素(heparan sulfate,HS)类分子是裂殖子侵入红细胞的重要受体，因此剥取红细胞膜包裹脂质体制备成仿生脂质体伪装成红细胞，可利用仿生脂质体表面HS类分子俘获血液中游离的裂殖子，阻止裂殖子的再次感染正常红细胞，故本发明的红细胞膜包脂质体利用红细胞膜表面肝素俘获裂殖子阻断其反复感染正常红细胞，进而提高抗疟疾的效率。
本发明还提供一种靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法，其包括：向红细胞膜包脂质体的溶液添加DSPE-PEG2000-PTP，冰水浴超声处理，通过挤出方式依次挤出通过400nm、200nm聚碳酸酯膜。
具体地，靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法包括：向红细胞膜包脂质体的溶液加入 DSPE-PEG2000-PTP，冰水浴超声处理10min，利用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(靶向肽修饰仿生脂质体，PEM-ARM)。
DSPE-PEG2000-PTP的制备方法包括：固相合成多肽，并在N段加入半胱氨酸末端，再与DSPE-PEG2000-Mal进行偶联。
具体地，DSPE-PEG2000-PTP的制备方法包括：筛选出PS靶向肽(PS Targetingpeptide， PTP)序列LIPPKF(P1)、PGDLSR(P2)和SVSVGMKPSPRP(P3)等，固相合成以上多肽，并在N段插入半胱氨酸末端。利用马来酰亚胺与巯基的特应性反应，称取5mg DSPE-PEG2000-Mal，将其溶于900μL四氢呋喃后，加入茄形瓶中，转速250r/min匀速混匀。为确保DSPE-PEG2000-Mal充分反应，称取DSPE-PEG2000-Mal 2倍重量的多肽，将其溶于 100μL含0.1％EDTA的PBS(pH＝8.0)中；取100μL移液枪将上述多肽混合溶液缓慢滴加到含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中。为了使反应更好的进行，向添加了多肽的含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中加入三乙胺作催化剂，三乙胺与多肽的比例为3:1、m/m，并在室温下用锡箔纸包裹避光反应24h。之后通过旋转蒸发除去四氢呋喃，在加入1mL dd H2O重悬水化，取分子量未2000Da透析袋，透析24h以除去游离的小分子，形成最终产物DSPE-PEG2000-PTP。
磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)位于细胞膜脂质双分子层内侧，当受到损伤刺激时，会使PS外翻暴露。在红细胞内期，疟原虫造成感染红细胞的损伤，在滋养体和裂殖体阶段中，感染红细胞膜上大量的PS外翻，因此可利用外翻的PS作为潜在的递送靶点区分正常红细胞与感染细胞；本发明的靶向肽修饰仿生脂质体通过修饰磷脂丝胺酸靶向肽，特异性递送蒿甲醚至受损的感染红细胞，从而提高蒿甲醚的抗疟疾作用。
本发明提供的方法制备的蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体以及靶向肽修饰仿生脂质体均能够在治疗疟疾中应用。
以下结合实施例对本发明的蒿甲醚脂质体、红细胞膜包脂质体、靶向肽修饰仿生脂质体及其制备方法和治疗疟疾的应用作进一步的详细描述。
实施例1
一、制备红细胞膜
取EP管，加入0.25mL 6％压积的小鼠红细胞溶液，向管内加入含0.25mmol/L 的EDTA低渗溶液0.95mL，强烈涡旋后，补加50μL 20×PBS以补至等渗，再次涡旋混匀。在4℃，12000×g的条件下离心10min，去上清。重复此步骤5次后，使红细胞膜浓缩。加入1mL纯水，重悬红细胞膜，将其离心，去上清，重复洗涤3次，即得红细胞膜。
二、制备蒿甲醚脂质体
称取蒿甲醚10mg、蛋黄卵磷脂80mg、胆固醇20mg，共同溶解在3mL无水乙醇与二氯甲烷混合溶液中(体积比5:1)，制成脂质溶液，然后使用1mL无菌注射器将上述脂质溶液按0.23mL/min缓慢滴入到45℃的1×PBS(pH＝7.4)中，通过磁力搅拌器以750r/min匀速搅拌直至溶液全部滴定完毕，然后进行超声处理(200w，超声5s，间歇5s，10min)，残留的有机溶剂通过旋转蒸发除去，随后将脂质体依次用200、100 nm聚碳酸酯膜来回挤压20次，得到粒径小于200nm且分散性良好的蒿甲醚脂质体。
三、制备红细胞膜包脂质体
将低渗提取到的红细胞膜加入蒿甲醚脂质体溶液中，冰水浴超声10min后，将悬液用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得红细胞膜包脂质体(EM-ARM)。
四、制备靶向肽修饰仿生脂质体
筛选出PS靶向肽(PS Targeting peptide，PTP)序列LIPPKF(P1)、PGDLSR(P2) 和SVSVGMKPSPRP(P3)等，固相合成以上多肽，并在N段插入半胱氨酸末端。利用马来酰亚胺与巯基的特应性反应，称取5mg DSPE-PEG2000-Mal，将其溶于900μL四氢呋喃后，加入茄形瓶中，转速250r/min匀速混匀。为确保DSPE-PEG2000-Mal充分反应，称取DSPE-PEG2000-Mal 2倍重量的多肽，将其溶于100μL含0.1％EDTA的PBS(pH＝8.0) 中；取100μL移液枪将上述多肽混合溶液缓慢滴加到含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中。为了使反应更好的进行，向添加了多肽的含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中加入三乙胺作催化剂，三乙胺与多肽的比例为3:1、m/m，并在室温下用锡箔纸包裹避光反应24h。之后通过旋转蒸发除去四氢呋喃，在加入1mL dd H2O重悬水化，取分子量未2000Da透析袋，透析24h以除去游离的小分子，形成最终产物DSPE-PEG2000-PTP。
五、制备靶向肽修饰仿生脂质体(靶向肽修饰红细胞膜包脂质体)
向红细胞膜包脂质体加入DSPE-PEG2000-PTP，冰水浴超声处理10min，利用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(靶向肽修饰仿生脂质体，PEM-ARM)。
实施例2
取EP管，加入0.25mL 6％压积的小鼠红细胞溶液，向管内加入含0.25mmol/L的EDTA低渗溶液0.95mL，强烈涡旋后，补加50μL 20×PBS以补至等渗，再次涡旋混匀。在4℃，12000×g的条件下离心10min，去上清。重复此步骤5次后，使红细胞膜浓缩。加入1mL纯水，重悬红细胞膜，将其离心，去上清，重复洗涤3次，即得红细胞膜。
二、制备蒿甲醚脂质体
称取蒿甲醚10mg、蛋黄卵磷脂80mg、胆固醇20mg，共同溶解在3mL无水乙醇与二氯甲烷混合溶液中(体积比5:1)，制成脂质溶液，然后使用1mL无菌注射器将上述脂质溶液按0.20mL/min缓慢滴入到40℃的1×PBS(pH＝7.4)中，通过磁力搅拌器以700r/min匀速搅拌直至溶液全部滴定完毕，然后进行超声处理(200w，超声5s，间歇5s，8min)，残留的有机溶剂通过旋转蒸发除去，随后将脂质体依次用200、100 nm聚碳酸酯膜来回挤压20次，得到粒径小于200nm且分散性良好的蒿甲醚脂质体。
三、制备红细胞膜包脂质体
将低渗提取到的红细胞膜加入蒿甲醚脂质体溶液中，冰水浴超声10min后，将悬液用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得红细胞膜包脂质体(EM-ARM)。
四、制备靶向肽修饰仿生脂质体
筛选出PS靶向肽(PS Targeting peptide，PTP)序列LIPPKF(P1)、PGDLSR(P2) 和SVSVGMKPSPRP(P3)等，固相合成以上多肽，并在N段插入半胱氨酸末端。利用马来酰亚胺与巯基的特应性反应，称取5mg DSPE-PEG2000-Mal，将其溶于900μL四氢呋喃后，加入茄形瓶中，转速250r/min匀速混匀。为确保DSPE-PEG2000-Mal充分反应，称取DSPE-PEG2000-Mal 2倍重量的多肽，将其溶于100μL含0.1％EDTA的PBS(pH＝8.0) 中；取100μL移液枪将上述多肽混合溶液缓慢滴加到含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中。为了使反应更好的进行，向添加了多肽的含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中加入三乙胺作催化剂，三乙胺与多肽的比例为3:1、m/m，并在室温下用锡箔纸包裹避光反应24h。之后通过旋转蒸发除去四氢呋喃，在加入1mL dd H2O重悬水化，取分子量未2000Da透析袋，透析24h以除去游离的小分子，形成最终产物DSPE-PEG2000-PTP。
五、制备靶向肽修饰仿生脂质体(靶向肽修饰红细胞膜包脂质体)
向红细胞膜包脂质体加入DSPE-PEG2000-PTP，冰水浴超声处理10min，利用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(靶向肽修饰仿生脂质体，PEM-ARM)。
实施例3
取EP管，加入0.25mL 6％压积的小鼠红细胞溶液，向管内加入含0.25mmol/L的EDTA低渗溶液0.95mL，强烈涡旋后，补加50μL 20×PBS以补至等渗，再次涡旋混匀。在4℃，12000×g的条件下离心10min，去上清。重复此步骤5次后，使红细胞膜浓缩。加入1mL纯水，重悬红细胞膜，将其离心，去上清，重复洗涤3次，即得红细胞膜。
二、制备蒿甲醚脂质体
称取蒿甲醚10mg、蛋黄卵磷脂80mg、胆固醇20mg，共同溶解在3mL无水乙醇与二氯甲烷混合溶液中(体积比5:1)，制成脂质溶液，然后使用1mL无菌注射器将上述脂质溶液按0.25mL/min缓慢滴入到50℃的1×PBS(pH＝7.4)中，通过磁力搅拌器以 800r/min匀速搅拌直至溶液全部滴定完毕，然后进行超声处理(200w，超声5s，间歇5s，12min)，残留的有机溶剂通过旋转蒸发除去，随后将脂质体依次用200、100 nm聚碳酸酯膜来回挤压20次，得到粒径小于200nm且分散性良好的蒿甲醚脂质体。
三、制备红细胞膜包脂质体
将低渗提取到的红细胞膜加入蒿甲醚脂质体溶液中，冰水浴超声10min后，将悬液用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得红细胞膜包脂质体(EM-ARM)。
四、制备靶向肽修饰仿生脂质体
筛选出PS靶向肽(PS Targeting peptide，PTP)序列LIPPKF(P1)、PGDLSR(P2) 和SVSVGMKPSPRP(P3)等，固相合成以上多肽，并在N段插入半胱氨酸末端。利用马来酰亚胺与巯基的特应性反应，称取5mg DSPE-PEG2000-Mal，将其溶于900μL四氢呋喃后，加入茄形瓶中，转速250r/min匀速混匀。为确保DSPE-PEG2000-Mal充分反应，称取DSPE- PEG2000-Mal 2倍重量的多肽，将其溶于100μL含0.1％EDTA的PBS(pH＝8.0)中；取100 μL移液枪将上述多肽混合溶液缓慢滴加到含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中。为了使反应更好的进行，向添加了多肽的含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中加入三乙胺作催化剂，三乙胺与多肽的比例为3:1、m/m，并在室温下用锡箔纸包裹避光反应24 h。之后通过旋转蒸发除去四氢呋喃，在加入1mL dd H2O重悬水化，取分子量未2000Da 透析袋，透析24h以除去游离的小分子，形成最终产物DSPE-PEG2000-PTP。
五、制备靶向肽修饰仿生脂质体(靶向肽修饰红细胞膜包脂质体)
向红细胞膜包脂质体加入DSPE-PEG2000-PTP，冰水浴超声处理10min，利用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(靶向肽修饰仿生脂质体，PEM-ARM)。
将实施例1制备的蒿甲醚脂质体(Lip-ARM)、红细胞膜包脂质体(EM-ARM)和靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(PEM-ARM)放于4℃的冰箱保存备用，通过Zetasizer 3000 激光粒度分析仪，测定脂质体的粒径、多分散系数以及Zeta膜电位，结果如表1所示，以上脂质体PDI均小于0.3，提示脂质体大小分布比较均一。本实验所制备的Lip-ARM 为负电，EM-ARM和PEM-ARM所带的负电荷更多，这是因为红细胞膜上含有唾液酸，在正常情况下，唾液酸含量越多，负电荷也就越多。多肽是由2种以上氨基酸分子脱水缩合而成的聚合物，根据氨基酸分子中所含氨基(-NH2)和羧基(-COOH)的数目，可以将其分为中性、酸性(带负电荷)和碱性氨基酸(带正电荷)三类，因此多肽的带电属性是由其组成的氨基酸决定的。在3条PTP中，P1、P2、P3的等电点(pl)分别为8.22(碱性)、5.83(酸性)和9.51(碱性)，分别将其修饰于EM-ARM表面后，与EM-ARM相比， P1EM-ARM和P3EM-ARM所带负电荷减少，而P2EM-ARM所带负电荷增加。
表1脂质体的粒径、PDI和电位
Figure BDA0003162568140000071
对实施例1制备的脂质体(蒿甲醚脂质体(Lip-ARM)、红细胞膜包脂质体(EM-ARM)和靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(PEM-ARM))进行稳定性考察。
体外稳定性：将脂质体(Lip-ARM、EM-ARM、P1EM-ARM、P2EM-ARM、P3EM-ARM)置于 4℃中进行孵育，并于预设时间点(0、1、2、3、4、5、6和7d)对粒径进行测定，以第0d的粒径作为空白对照，观察粒径变化，结果如图1中的A所示，7天内各脂质体组(Lip-ARM、EM-ARM、P1EM-ARM、P2EM-ARM和P3EM-ARM)的相对粒径变化幅度不大，差异不明显，表明脂质体在7天内未出现严重的聚集现象，在体外能够保持相对稳定性，便于储存以进行后续相关实验。
血清稳定性：将脂质体(Lip-ARM、EM-ARM、P1EM-ARM、P2EM-ARM、P3EM-ARM)加入胎牛血清，并使血清含量为10％，在预设时间点(0、1、2、4、8和12h)测定各组脂质体粒径和浊度(OD 600)，以第0h的粒径或者浊度为空白对照，观察粒径或者浊度的变化。如图1中的B-C所示，脂质体组在10％的胎牛血清中，其粒径大小与浊度均无显著性改变，证明脂质体能够在血清中稳定存在，有利于脂质体在体内的递送。
对实施例1制备的脂质体(蒿甲醚脂质体(Lip-ARM)、红细胞膜包脂质体(EM-ARM)和靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(PEM-ARM))进行靶向性考察。
使用尼罗红(Nile red，NR)标记脂质体，方法与实施例1类似，稍作修改，即将10mg蒿甲醚(Artemether，ARM)改为0.25mg尼罗红(Nile red，NR)，其他步骤不变，使用荧光酶标仪测定尼罗红含量，所得脂质体为Lip-NR、EM-NR、P1EM-NR、P2EM-NR 和P3EM-NR。
鼠疟模型构建：
实验动物及虫株：传代鼠为4-5周龄雌性ICR小鼠；模型鼠为6周龄雌性C57BL/6 小鼠；虫株为伯氏疟原虫ANKA株(Plasmodium berghei ANKA，p.b.ANKA)。
虫株的复苏与传代：
复苏：在液氮中冻存管保存的p.b.ANKA需要复苏后才可用于小鼠接种，复苏时应迅速从液氮罐取出虫株，于40℃恒温水浴锅中复苏1min，肉眼见血液可流动时，用 1mL注射器抽取，直接腹腔注射到ICR小鼠体内。一般接种3只小鼠，同步观察感染率情况，见腹腔无漏出液即可进行染色标记。
传代：第一代接种的ICR鼠，感染率一般较低，正常饲养一段时间，当感染率达到7-10％(涂片镜检)时，用0.5mm×100mm点样毛细管进行眼眶静脉丛采血，采血后按全血：3.8％柠檬酸钠抗凝剂(9:1，v/v)进行抗凝，当全血量低于0.9mL时，直接使用0.1mL抗凝剂。根据ICR小鼠数量计算采血量，200μL/只腹腔注射进行传代，传代3-5次后，接种制备鼠疟模型。
模型构建：造模所使用的ICR小鼠感染率控制在7-10％之间，使用一次性微血管点样管尾尖虹吸采血20μL，用0.9％生理盐水稀释100倍后，通过血涂片，吉姆萨染色检测感染率。
本实验接种剂量为106个iRBC/只，根据C57BL/6小鼠的总数，计算所需的液体总量、ICR小鼠血量及生理盐水的量，接种过程中，稀释后的血液保持冰上操作，注射前摇匀，按200μL/只腹腔接种C57BL/6小鼠，接种后，通过血涂片，吉姆萨染色检测模型鼠感染率。
体外靶向性及处方筛选：
裂殖子靶向性：洗涤后的感染红细胞采用低渗法进行破膜处理，先在管底加入2mL去离子水，充分涡旋震荡后，在离心力800×g，离心10min，将含有感染红细胞膜成分的红色上清溶液去除掉，留下沉淀，再次加入1mL去离子水混悬沉淀，并转移至1.5 mL离心管内，涡旋混匀，继续在离心力800×g，离心5min，去上清，重复洗涤2次，直到上清澄清透明为止，管底黄褐色沉淀即为裂殖子，为保持裂殖子活性，用1mL含 0.1％葡萄糖的1×PBS溶液重悬裂殖子。分装含10％胎牛血清及0.1％葡萄糖的1640培养基中，混合均匀后，每管分装500μL，随后向各管中加入Lip-NR、EM-NR(0.3、0.6、 0.9mg/mL不同浓度)、P1EM-NR等药物，使得各管内NR总荧光强度相同。同时，预设空白对照组，里面加入50μL 1×PBS溶液。各组脂质体孵育溶液混匀后，每管加入150μ L重悬的裂殖子溶液，混合均匀后置于恒温水浴锅中，在37℃下孵育75min。孵育结束后，用含0.1％葡萄糖的1×PBS溶液重复洗涤裂殖子3次，以除去游离的HO、TO及脂质体。使用流式细胞仪定量分析裂殖子对各组脂质体的摄取情况，统计分析尼罗红荧光强度差异，对各组药物对裂殖子靶向能力进行评价。结果如图2中的A-B所示，裂殖子对0.6mg/mL膜蛋白浓度的EM-NR摄取的中位荧光强度(Median FluorescenceIntensity,MFI)略高于0.3mg/mL和0.9mg/mL膜蛋白浓度的EM-NR，但无显著性差异，说明正常红细胞膜对裂殖子吸附是有饱和性的，并不是越高越好。当膜蛋白浓度过高时，通过挤出仪的压力明显增大，增加实验难度，耗费时间，因此0.6mg/mL膜蛋白浓度用于制备EM-NR。通过不同脂质体的比较，结果图2中的B-C所示，与其他组相比，含有红细胞膜包裹的脂质体组(EM-NR、P1EM-NR)与其他无膜组(PBS和Lip-NR)相比，其荧光强度更强，差异明显，具有统计学意义，提示脂质体中的正常红细胞膜能够与裂殖子结合，捕获裂殖子，从而提高脂质体对血液中游离裂殖子的靶向性。提取裂殖子，使用HO标记，脂质体使用NR标记，按上述操作孵育后，激光共聚焦显微镜获取图片。如图2中的E所示，蓝色荧光标记的裂殖子与红色荧光标记的P1EM-NR能够较好地重合，提示P1EM-NR能够捕获裂殖子，对游离的裂殖子具有很好的靶向性。
感染红细胞靶向性：
(1)首先，配制流式所需要的2种荧光素母液及与细胞孵育相关溶液：A.Hoechst33342(HO)储存液(4mmol/L)：取2.25mg HO粉末，溶于1mL 1×PBS中，每管100 μL进行分装，-20℃保存备用，使用时用培养基稀释1000倍即可。B.Thiazole Orange (TO)储存液(1mg/mL)：取1mg TO粉末，溶于1mL细胞级无水DMSO中，每管100 μL进行分装，-20℃保存备用，使用时用培养基稀释10000倍即可。C.含10％胎牛血清的1640培养基：细胞超净工作台下，取1瓶500mL RMPI-1640培养基，加入50mL 胎牛血清(FBS)及5mL青霉素-链霉素-两性霉素B(三抗)溶液，充分混合均匀后，在瓶身标明添加的成分，配制时间，4℃保存备用，取用时用50mL离心管分装即可。
(2)在C57BL/6小鼠接种后第5天，先进行涂片检查感染是否为5％左右，确认后用毛细点样管进行眼眶静脉丛采血，提前在肝素化EP管中加入1×PBS以防凝血，采血 1-2滴即可，采血后将小鼠放回笼内继续饲养，待其感染率增至10％及10-20％时，重复此次操作。
(3)采集到的血液先用1×PBS溶液，在700×g离心洗涤3次，后3200×g离心再洗涤3次，直至上清澄澈透明为止，随后用200μL 1×PBS溶液重悬细胞，通过此差速离心法，可以去除血液中白细胞和血小板等含有细胞核的细胞，以达到富集红细胞的目的。
(4)将HO及TO储存液分别按1:1000及1:10000加入到步骤1所配制的含10％胎牛血清的1640培养基中，混合均匀后，500μL每管进行分装，随后向各管中加入 Lip-NR、EM-NR、P1EM-NR、P2EM-NR和P3EM-NR等药物，使得各管内NR总荧光强度相同。同时，预设空白对照组，里面加入50μL 1×PBS溶液。
(5)各组脂质体孵育溶液混匀后，每管加入10μL重悬的红细胞溶液，吹打均匀，置于恒温水浴锅，在37℃下孵育75min。
(6)孵育结束后，用1×PBS溶液洗涤细胞3次，以除去游离的HO及TO。
(7)通过流式细胞仪对各组红细胞进行定量分析，考察不同PS靶向肽修饰在不同感染率(5％、10％和10-20％)情况下被细胞的摄取情况，统计分析各组之间的摄取差异，筛选出最优处方，并确定最佳动物模型给药时间以便后续实验。结果如图3所示，首先通过G1去除细胞团，然后通过Hoechst 33342/Thiazole Orange(HO/TO)双染法，对细胞内DNA/RNA进行标记，根据细胞内DNA/RNA的含量进行分析，可将细胞进行分类处理。如图3所示，G2(HO-/TO-)为正常红细胞，G3(HO+/TO-)为环状体，G4(HO+/TO+) 为滋养体和裂殖体，对G4的Hoechst 33342标记的DNA荧光强度进行分析，得G5(1N- 3N)为滋养体，G6(≥4N)为裂殖体。实验结果表明，该流式分析与吉姆萨涂片镜检结果所得的感染率一致，可用于后续实验。在该实验中，感染红细胞主要以环状体为主，以此为基础对血液红细胞进行分类，检测其尼罗红的荧光强度，分析脂质体的靶向性效果。如图4中的A-D所示，在5％、10％和10-20％的三个感染率中，5％的感染率的感染红细胞对于脂质体的摄取效果较好，其中P1多肽在5％感染率时可以促进环状体、滋养体和裂殖体对脂质体的摄取，P1多肽在疟疾感染早期具有较好的靶向性，可用于后续实验中。各组脂质体的在各类细胞中的内化作用依次为正常红细胞<环状体<裂殖体<滋养体，青蒿素类药物对于滋养体的作用强于裂殖体，该给药系统能显著提高药物在滋养体的分布，提示该脂质体可进一步增强青蒿素类药物的抗疟作用，并减少其对于正常红细胞的毒性。
提取疟原虫感染红细胞，将1μL HO储存液以1:1000比例加入到1mL含10％胎牛血清的1640培养基中，混合均匀后向管中加入100μL P1EM-NR与20μL提纯的感染红细胞，再次吹打均匀，在37℃下孵育75min后，用1×PBS溶液重复洗涤感染红细胞 3次，以除去游离的HO及未摄取的P1EM-NR，然后用300μL提前配制好的AnnexinⅤ- Cy5 Reagent溶液重悬沉淀，混合均匀后4℃下孵育30min。接着，提前预热甘油明胶封片剂，滴加10μL至粘附载玻片上，而后滴加30μL重悬的红细胞溶液，与明胶混合后用盖玻片沿载玻片边缘进行封片，过程中应避免气泡的产生，在共聚焦显微镜下观察荧光的共定位情况。结果如图4中的E所示，与正常红细胞相比，滋养体(<4N)和裂殖体(≥4N)有明显的细胞核，并存有大量的PS外翻，且PS能够与P1EM-NR脂质体共定位，提示P1多肽能够与外翻的PS结合，P1EM-NR具有PS靶向性。P1EM-NR能够进入感染红细胞内，并且与胞内的疟原虫细胞核共定位，提示P1EM-NR不仅能够通过PS结合靶向到感染红细胞，还能够进入胞内靶向疟原虫。
对实施例1制备的脂质体(蒿甲醚脂质体(Lip-ARM)、红细胞膜包脂质体(EM-ARM)和靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(PEM-ARM))进行抗疟药效及安全性考察。
造模5天后，将感染疟疾的C57BL/6小鼠随机分成5组，分别为PBS组(模型组)、游离蒿甲醚注射制剂组(f-ARM)、Lip-ARM组、EM-ARM组和P1EM-ARM组，每组10只，给予相应药物，给药量为50μg/只，尾静脉注射给药，隔天给药。同时，另设10只正常 C57BL/6小鼠为空白对照组，所有动物规范化饮食饮水，每隔1天定时称量小鼠体重，疟疾模型小鼠眼眶采血，离心分离红细胞，通过流式细胞仪测定不同时间的感染红细胞的比例，记录动物的存活情况。实验终点，采血进行血常规分析，并将动物进行安乐死，剖取心、肝、脾、肺、肾和脑等脏器，称重，并于4％多聚甲醇固定，HE染色并进行病理分析，其中肺部进行Tunnel染色。
生存曲线：利用感染疟疾模型C57BL/6小鼠评价脂质体体内抗疟疗效，实验结果如图5中的A所示。在PBS组中，第9天即出现小鼠死亡，第24天小鼠全部临床死亡，症状表现为极低体温、毛发疏松无光泽及身体发颤等，体重下降明显，超过30％-50％，中位生存期为21天。f-ARM组在第12天开始出现死亡，共死亡2只；而Lip-ARM、EM- ARM和P1EM-ARM组在15天才出现死亡，与PBS组相比，所有给药组中位生存时间均延长，差异显著，明显延长了小鼠的生存时间。各给药组之间中位生存时间无明显差异，与f-ARM组相比，Lip-ARM、EM-ARM和P1EM-ARM组初始死亡时间延后。上述结果表明，蒿甲醚抗疟效果显著，能够显著延长生存时间；与传统注射制剂相比，脂质体装载蒿甲醚能够更好地将药物递送至靶点，延缓动物的初始死亡时间。
体重曲线：称量小鼠初始体重(Initiate weight)，并从小鼠造模第5天起，每隔1天定时称量小鼠体重，绘制体重曲线图，分析各组用药后体重变化规律，如图5中的B所示，正常小鼠在规范化饮食饮水条件下，体重逐渐增加，未出现任何症状；感染疟疾小鼠(PBS组)体重呈下降趋势，越往后体重下降幅度越大，此时可观察到小鼠毛发稀疏、体温偏低、食欲下降、身体发颤等表现,其他给药组治疗后，小鼠体重下降也略有下降，但趋势不是太明显，与药物抗疟作用有关。
感染红细胞内ROX活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测：将CellROXTMDeep Red Reagent溶于DMSO溶液，储存液浓度为2.5mmol/L，每管50μL，-20℃冰箱避光保存，使用时使其终浓度为5μmol/L。以前述方法，在尾静脉给药7次后各组随机挑选3只小鼠进行眼眶静脉采血，富集红细胞，清除上清部分，将各组待测红细胞加入含血清1640培养基(含HO及TO)，孵育45min后离心去上清，去除培养基里面的血清后，加入含CellROXTM DeepRed Reagent终浓度为5μM的无血清培养基(含HO 和TO)，继续孵育30min，染色结束后重复洗涤离心3次收集细胞，加300μL 1× PBS溶液混悬后过流式细胞仪检测，分析各给药组感染红细胞内ROS含量。结果如图5 中的C所示，所有给药组都能探测到深红色荧光形成，并且含细胞膜脂质体给药组(EM- ARM和P1EM-ARM)感染红细胞内MFI显著高于PBS组和f-ARM组(P<0.05)，而脂质体中又以P1EM-ARM组MFI最高，但无明显差异(P>0.05)。以上数据说明，f-ARM在刺激感染红细胞，诱导氧化应激能力上略逊于脂质体递药系统，通过脂质体靶向递送ARM，不仅可以有效激发机体自身应激能力，而且通过ARM产自由基作用抑制感染红细胞内疟原虫，破坏其功能，进而达到抗疟效果。
感染红细胞内线粒体活性测定：50nmol/L工作液为检测falciparum感染红细胞线粒体活性的适宜浓度。根据前述方法，在尾静脉给药7次后各组随机挑选3只小鼠进行眼眶静脉采血以富集红细胞，清除上清部分，将各组待测红细胞加入150nmol/L工作液中，37℃避光孵育30min，染色结束后离心收集细胞，加300μL 1×PBS溶液混悬后过流式细胞仪检测，分析各给药组感染红细胞内线粒体活性。实验结果如图5中的 D所示，所有给药组都能探测到深红色荧光形成，并且脂质体给药组(Lip-ARM、EM-ARM 和P1EM-ARM)感染红细胞内MFI显著低于PBS组和f-ARM组(P<0.05)，而脂质体中以 P1EM-ARM组最低，但无明显差异(P>0.05)。以上数据提示，f-ARM虽能延长动物生存期，但是在破坏线粒体功能活性上有所欠缺，而在给予脂质体递药系统后，则可以有效抑制感染红细胞内线粒体活性，攻击线粒体，破坏其功能，进而达到抗疟目的。
脏器系数：结果如图6所示，小鼠在心、肝、脾、肺、肾及脑等均具有统计学差异，但以肝、肺及脾3个脏器为主。在感染疟原虫后，小鼠出现急性的肝脾肿大，但是如果及时清除感染，短期内肝脾肿大是可以通过相似的动力学恢复的，但如果感染持续存在，或者两次感染间隔时间过短时，则可转为慢性肝脾肿大，这一过程则不可逆；从图6可见，与正常脾脏相比，其他各组均有不同成程度的脾肿大(P<0.01)，脾肿大的各组之间无差异性(P>0.05)；与正常肝脏相比，通过EM-ARM和P1EM-ARM给药后，肝脏虽发生肿大，但是与PBS组有极显著性差异(P<0.01)，提示短期内如果能够有效清除疟原虫，肿大的肝脏可以通过动力学恢复，虽然理论上脾肿大恢复所具备的动力学与肝脏相似，但是时间上可能需要更久。
由于感染红细胞对肺组织的粘附，导致一系列出血及血栓形成等病理改变，引发肺实变及肺不张等，肺为空腔脏器，为气体交换场所，肺实变导致肺泡塌陷，交换氧气功能受损，在外观形态上则表现为肺脏体重增加，再加上色素(如血黄素、疟色素等) 沉淀。与PBS组相比，通过EM-ARM给药后，肺脏器系数有显著性差别(P<0.01)，说明通过生物膜载送药物后，能在一定程度上减轻肺部炎症。
PBS组脑脏体比高于其他各组，提示模型小鼠发生脑型疟的可能性，与PBS组相比，正常组和P1EM-ARM组脑脏体比更小，有显著性差异(P<0.01)，说明通过PS靶向肽修饰后，可以预防小鼠脑型疟疾的发生，有效规避死亡的风险。
PBS组心脏及肾脏脏体比增加的原因，可能是血流动力学的改变(如血栓形成及出血等)，增加了心脏负荷，同时一些溶血性蛋白沉积于肾脏所致。通过P1EM-ARM给药后，心脏及肾脏在脏体比上均小于PBS组(P<0.05)，说明靶向给药后在一定程度上抑制了体内疟原虫的侵染，对改善血流动力学可能存在帮助。
血常规分析：实验终点，眼眶采血进行血常规分析，结果如表2所示，感染疟原虫后，无论是模型组(PBS)还是给药组，均有不同程度贫血，与正常组(Control)在血红蛋白(HGB)及红细胞压积(HCT)比较上，除EM-ARM及P1EM-ARM外，均有显著性差异(P<0.05)，说明给予EM-ARM及P1EM-ARM后，一定程度上改善了小鼠的贫血状态，提示脂质体在给予正常红细胞膜包裹及PS靶向肽修饰后，能够更加有效的对抗疟原虫侵袭，从而减缓贫血进程。另外，与正常组血小板(PLT)数目比较，各组血小板数目明显减少，有显著性差异(P<0.05)，造成该结果的原因是疟疾小鼠循环系统中存在游离裂殖子，其表面表达的疟原虫粘附分子(PfEMP1)与血小板大量结合。
表2实验终点动物的血常规比较(M(P25,P75))
Figure BDA0003162568140000121
其中，各组PBS组与Control组比较△P<0.05，△△P<0.01；f-ARM组与Control组比较▽P<0.05，▽▽P<0.01；Lip-ARM组与Control组比较□P<0.05，□□P<0.01；EM-ARM组与 Control组比较*P<0.05，**P<0.01；P1EM-ARM组与Control组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01； PBS组与P1EM-ARM组比较▼P<0.05，▼▼P<0.01。
组织病理分析：经H&E染色对主要脏器进行病理学观察，结果如图7所示，可以看出，当感染疟原虫后，未经过药物治疗组(PBS组)的肝脏、肺脏及脾脏受影响较大。在肝、脾及肺脏均可见到大量的疟色素沉着(图中黑色箭头所示)，脾脏生发中心(Germinalcenter)破坏严重，脾索走形紊乱，单核巨噬细胞反应性增生；肝细胞空泡样变性，某些视野下可见肉芽肿，肝板结构不规则，肝窦有闭锁倾向，肝细胞胞浆内糖原量较少(动物处死前一天未做禁食处理)，说明动物在疟原虫感染后，严重影响进食，出现厌食现象；在肺脏可见肺泡上皮细胞损伤(见空泡)，肺泡塌陷导致肺部实变严重，管腔内可见嗜酸性粒细胞浸润(提示寄生虫感染)；经过f-ARM、Lip-ARM、EM-ARM及P1EM- ARM连续静脉注射给药后，沉积于肺、肝及脾脏的疟色素依次减少。在P1EM-ARM组，还可以见到稍完整的生发中心结构，脾索走行规则；肝脏空泡样变性减少，肝索走形规则，肝窦结构大小正常范围，肝细胞胞浆内见大量空隙，说明肝糖原含量丰富，表明动物状态良好，能够正常饮食，未发生厌食行为；肺泡上皮细胞损伤减少，肺泡大部分保留了原有结构，气管及支气管正常管腔形态，肺实变面积明显缩小。由此可知，经过药物尤其是红细胞膜及多肽修饰化后脂质体治疗后，不仅未对正常组织器官产生明显毒副作用，反而在很大程度上能够起到保护正常组织器官免受疟原虫感染造成的损伤的效果。
各组在心脏方面表现出来的差异不大，可见正常心肌细胞核，心肌纤维结构完整，走形正常。各组在肾脏上可见结构正常的肾小球、近端肾小管、远端肾小管及集合管等结构，在PBS组中，偶见疟色素沉着及肾小管周围蛋白，但不多，提示疟原虫感染后出现肾炎情况；可见肾小球毛细血管充血现象(正常的肾小球毛细血管横断面仅有一个红细胞，但疟原虫感染后可见多个红细胞堆积)，药物尾静脉注射后，此种现象未得到明显改善，说明药物对于肾脏靶向性及药效均不显著，但对其无明显毒副效果。各组在脑中均可见白质、灰质、海马区、小脑、齿状核等正常结构，细胞排列致密，神经元与神经胶质细胞相伴而行，小脑梨状神经元丰富。但PBS组在脑中偶见少量疟色素沉着，同时见锥体细胞损伤，旁边少量炎性细胞浸润，说明部分模型组小鼠出现脑疟现象，治疗组未见明显疟色素沉着，神经元及胶质细胞基本情况正常范围。综上所述，相比于PBS组，药物通过尾静脉注射后，在H&E染色处理下，不仅未改变重要脏器(心、肾、脑等)组织病理学形态特征，而且还通过受体-配体相互作用以减轻感染红细胞对正常组织的粘附损伤，减少疟色素的沉着，在很大程度上起着保护机体重要脏器(肺、肝及脾等)免受疟原虫感染所造成的损伤的作用。
肺组织Tunel分析：Tunel染色可以分析组织切片的凋亡情况，如图8所示，与模型组相比，各给药组尾静脉注射后肺上皮细胞凋亡明显减少(p<0.05)，说明不管是常规制剂给药还是脂质体运载药物，均能减少肺上皮细胞凋亡；各给药组之间比较，发现EM-ARM和P1EM-ARM组tunel+细胞数目明显少于f-ARM和Lip-ARM组(p<0.01)，有统计学差异，说明在利用细胞膜和PS靶向肽修饰常规ARM脂质体后，能够更加有效阻止感染红细胞对微血管上皮细胞的粘附损伤，减轻肺上皮细胞凋亡，保护肺组织。
实施例1制备的脂质体(蒿甲醚脂质体(Lip-ARM)、红细胞膜包脂质体(EM-ARM) 和靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(PEM-ARM))对感染红细胞粘附肺组织的影响。
将正常C57BL/6小鼠麻醉后，置于托盘上用手术剪打开胸腔，暴露心脏位置后，剪开右心耳，左心室进针，固定针头位置，注入50mL 1×PBS溶液，进行心脏灌流以冲洗掉脏器内的血液。将小鼠双肺剖出，蔗糖脱水后切取适度大小的组织，并用OCT包埋剂进行包埋，在冷冻切片机下进行切割，组织厚度为6μm/片，装入组织切片盒内，- 20℃保存备用。使用Percoll分离液分离出感染红细胞后，将SYBR Green I核酸染料按1:1000加入到含10％胎牛血清的1640培养基内，混合后将培养基均分为5份，将提前备好并通过液相测得浓度的(f-ARM、Lip-ARM、EM-ARM、P1EM-ARM)加入到培养基内，各组药物ARM含量保持一致；另1份不加药，作为模型对照组。随后将感染红细胞加入其中，置于恒温水浴锅中，在37℃下孵育30min。同时，将肺组织冰冻切片从冰箱取出，在1×PBS溶液中浸泡3次，每次5min，将包埋剂彻底清洗干净后，用免疫组化笔将肺组织圈好，平放于免疫组化保湿盒凹槽内，加入含HO(1:1000加入)的10％胎牛血清的1640培养基，置于恒温水浴锅中在37℃下孵育30min。孵育结束后，将肺组织切片在1×PBS溶液清洗3次，每次5min；感染红细胞用1×PBS溶液在3200×g下离心3次，每次5min，分别进行以除去多余荧光染料。重悬感染红细胞后，将混悬液滴加到正常肺组织切片上，在保湿盒中共同孵育1h后，倾去多余液体，用1×PBS溶液清洗3次，每次5min，然后加入组织自发荧光淬灭剂，继续孵育1h，结束后用1× PBS溶液清洗3次，每次5min，用甘油明胶封片剂将肺组织固定封存，于荧光显微镜下观察，并存档计数各组用药后感染红细胞粘附肺组织的情况，统计分析差异，对比研究脂质体对感染红细胞粘附肺组织的影响。结果如图9所示，与PBS组相比，用药后各组绿色荧光点个数均减少，顺序依次为P1EM-ARM<EM-ARM<Lip-ARM<f-ARM，证明抗疟药物的使用是可以减少感染红细胞对肺组织上皮细胞粘附的，其中，又以P1EM-ARM抑制粘附效果为最佳(P<0.05)，提示PS靶向肽修饰化脂质体可以靶向感染红细胞，阻断其与正常肺组织CD36的相互作用而发挥抑制粘附损伤的效果。
实施例1制备的脂质体(蒿甲醚脂质体(Lip-ARM)、红细胞膜包脂质体(EM-ARM) 和靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(PEM-ARM))对裂殖子粘附正常红细胞的影响。
取1只感染疟疾模型C57BL/6小鼠，按照动物伦理要求行眼眶静脉丛采血法收集小鼠全血，Percoll分离液分离出感染红细胞后，再通过低渗法以富集裂殖子(富集裂殖子的方法和脂质体的靶向性考察时的裂殖子富集方式相同)；同时，取1只正常C57BL/6 小鼠，行眼眶静脉丛采血法，采血1滴即可，取血后按梯度离心法，先700×g，离心3 次，每次5min；后3200×g，离心3次，每次5min，以除去血液中白细胞、血小板等成分。CFDA-SE按1:1000加入到含0.1％葡萄糖的PBS(即HBSS)中，混合均匀后重悬 3/4正常红细胞沉淀，置于恒温水浴锅中，在37℃下孵育30min，留取1/4正常红细胞，相同环境下，用不含CFDA-SE荧光HBSS重悬并在37℃下孵育30min。同时，将提取到的裂殖子中的3/4加入到含有HO(1:1000加入)的10％胎牛血清的1640培养基中，混合均匀后分为6小份，并各自加入f-ARM、Lip-ARM、EM-ARM、P1EM-ARM等药物50 μg在37℃下孵育30min，另外2份不加药，作为含荧光的模型对照组；剩下的1/4 裂殖子用不含HO的1640培养基在37℃下孵育30min。孵育结束时，将裂殖子与正常红细胞分别用1×PBS溶液在3200×g下离心洗涤3次，每次5min，以除去游离的荧光染料，最后正常红细胞与裂殖子用HBSS重悬，并按照下面组合方式，在37℃条件下进行混合孵育，孵育时间为30min。混合孵育结束后，直接上流式细胞仪进行荧光检测，以对比分析各脂质体对裂殖子粘附正常红细胞的影响。结果如图10所示，与PBS、f- ARM和Lip-ARM组相比，EM-ARM及P1EM-ARM组在降低Q2区(裂殖子侵袭红细胞的复合体)占比上有显著性差异(P<0.01)，说明含红细胞膜脂质体(EM-ARM及P1EM-ARM)可以俘获裂殖子，阻止其对正常红细胞的结合从而抑制粘附入侵。
实施例1制备的脂质体(蒿甲醚脂质体(Lip-ARM)、红细胞膜包脂质体(EM-ARM) 和靶向肽修饰红细胞膜包脂质体(PEM-ARM))的安全性考察。
MLE-12细胞对脂质体的摄取：本实验以小鼠肺上皮细胞MLE-12细胞为模型细胞，研究细胞对脂质体的摄取作用，取对数生长期的MLE-12细胞，经消化后种于6孔板中，在37℃、5％CO2环境下培养12h。给于细胞相同荧光量的脂质体，孵育45min后，各孔内再加入0.5μL的HO33342储存液(5mg/mL，1×PBS溶液配制)，继续孵育30 min。待孵育结束时，用1×PBS溶液润洗MLE-12细胞3次，除去多余脂质体后，于荧光显微镜进行观察，获取图片。按上述实验步骤进行细胞对脂质体的摄取，除去未摄取脂质体后，收集细胞流式细胞仪进行定量分析。MLE-12细胞对不同脂质体的摄取情况如图9中的A和C所示，在相同条件下，细胞对不同组药物的摄取量大小顺序依次为：f- NR>Lip-NR>P1EM-NR>EM-NR≈PBS。与f-NR组相比较，细胞对EM-NR摄取很少，具有统计学差异(P<0.05)。以上结果提示：P1EM-NR和EM-NR，其被红细胞膜包裹，可一定程度地减少药物在正常肺组织细胞中的非特异性吸收，从而减轻药物对正常肺上皮细胞的损伤，安全性更高。
脂质体的MLE-12细胞毒性实验：本实验研究脂质体对肺上皮细胞的毒性，取对数生长期的MLE-12细胞，种于96板种，1万/孔，置于培养箱中继续培养12h。待细胞贴壁生长且状态良好时，按梯度浓度稀释法给予细胞一系列不同浓度的药物，其浓度(μ g/mL)分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625及0，然后继续孵育48h。加入MTT4h后，吸弃培养基，加入100μL的DMSO振荡溶解沉淀，酶标仪测定490nm处OD值，计算各组细胞活力，如图9中的B所示，蒿甲醚在抑制MLE-12细胞增殖能力上略显不足，对该细胞毒性较弱，生物安全性良好，其抑制作用虽然呈剂量依赖性，但是变化幅度不太大。以上结果提示蒿甲醚在常规剂量体内给药时，对正常肺组织上皮细胞产生的毒性很小，不良反应少，用药安全并可以选择性地杀伤体内感染红细胞疟原虫。
脂质体的溶血性实验：本节实验以水作为阳性对照组，PBS为阴性对照组，在相同作用环境下将f-ARM、Lip-ARM、EM-ARM和P1EM-ARM与正常红细胞悬液进行孵育，并且在不同时间点(0、0.5、1、2、3、4和5h)于545nm处测量吸光值，结果如图9中的 D所示，水为低渗溶液，当与红细胞混合孵育后，能够裂解红细胞，释放血红蛋白，所以OD值高，而且溶血程度与时间呈现出类指数增长模型趋势。反观药物组(f-ARM、Lip- ARM、EM-ARM和P1EM-ARM)的溶血情况，与PBS组相比较，无明显差异，其OD值与阴性组相近，且其溶血百分比均在5％以下，提示所制备的仿生脂质体不具有溶血性，生物安全性良好，可用于体内注射给药。
综上所述，本发明的蒿甲醚脂质体的制备方法制备的蒿甲醚通过将蒿甲醚载入脂质体，提高水溶性，有利于提高抗疟疾效果。本发明的红细胞膜包脂质体的制备方法将红细胞膜包裹于蒿甲醚脂质体表面，通过红细胞膜表面的肝素(heparan sulfate,HS) 俘获血液游离的裂殖子，阻止裂殖子的再次感染正常红细胞，能够阻断疟疾周期性发作，进而提高抗疟疾的效果。本发明的靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法在红细胞膜包脂质体(仿生脂质体)表面修饰PS靶向肽，以便于与感染红细胞表面的PS作用，靶向递送蒿甲醚至感染红细胞，提高抗疟疾效果。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种红细胞膜包脂质体的制备方法，其特征在于，包括：
制备红细胞膜：取EP管，加入0.25mL 6％压积的小鼠红细胞溶液，向管内加入含0.25mmol/L的EDTA低渗溶液0.95mL，强烈涡旋后，补加50μL 20×PBS以补至等渗，再次涡旋混匀；在4℃，12000×g的条件下离心10min，去上清；重复此步骤5次后，使红细胞膜浓缩；加入1mL纯水，重悬红细胞膜，将其离心，去上清，重复洗涤3次，即得红细胞膜；
制备蒿甲醚脂质体：称取蒿甲醚10mg、蛋黄卵磷脂80mg、胆固醇20mg，共同溶解在3mL体积比为的5:1的无水乙醇与二氯甲烷混合溶液中，制成脂质溶液，然后使用1mL无菌注射器将脂质溶液按0.23mL/min缓慢滴入到45℃的1×PBS中，1×PBS 的pH＝7.4，通过磁力搅拌器以750r/min匀速搅拌直至溶液全部滴定完毕，然后进行超声处理，超声条件为200w，超声5s、间歇5s，共10min，残留的有机溶剂通过旋转蒸发除去，随后将脂质体依次用200、100nm聚碳酸酯膜来回挤压20次，得到粒径小于200nm且分散性良好的蒿甲醚脂质体；
制备红细胞膜包脂质体：将低渗提取到的红细胞膜加入蒿甲醚脂质体溶液中，冰水浴超声10min后，将悬液用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得。
2.一种红细胞膜包脂质体，其特征在于，其是由权利要求1所述的红细胞膜包脂质体的制备方法制备的。
3.一种靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法，其特征在于，包括：
筛选出磷脂酰丝氨酸靶向肽序列LIPPKF、PGDLSR或SVSVGMKPSPRP，固相合成多肽，并在N段插入半胱氨酸末端；利用马来酰亚胺与巯基的特应性反应，称取5mg DSPE-PEG2000-Mal，将其溶于900μL四氢呋喃后，加入茄形瓶中，转速250r/min匀速混匀；为确保DSPE-PEG2000-Mal充分反应，称取DSPE-PEG2000-Mal 2倍重量的多肽，将其溶于100μL含0.1％EDTA、pH＝8.0的PBS中；取100μL移液枪将多肽混合溶液缓慢滴加到含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中；向添加了多肽的含有DSPE-PEG-Mal的四氢呋喃溶液中加入三乙胺作催化剂，三乙胺与多肽的比例为3:1、m/m，并在室温下用锡箔纸包裹避光反应24h；之后通过旋转蒸发除去四氢呋喃，再加入1mL dd H2O重悬水化，取分子量为2000Da透析袋，透析24h以除去游离的小分子，形成最终产物DSPE-PEG2000-PTP；
向权利要求2所述的红细胞膜包脂质体加入DSPE-PEG2000-PTP，冰水浴超声处理10min，利用纳米挤出仪通过400nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，再通过200nm聚碳酸酯膜连续挤出3次，即可制得。
4.一种靶向肽修饰仿生脂质体，其特征在于，其是由权利要求3所述的靶向肽修饰仿生脂质体的制备方法制备的。
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