CN117085001B - 一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法及应用 - Google Patents
一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法及应用 Download PDFInfo
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- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
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Abstract
本发明公开了一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法及应用，涉及高分子药物制剂领域。本发明公开的纳米载药颗粒是以三苯基膦‑聚赖氨酸（TPP‑PLL）和cRGDfk‑聚谷氨酸（RGD‑PGA）为载体材料，包载了线粒体凋亡诱导剂ABT‑737和免疫佐剂雷西莫特（R848）制得。本发明公开的纳米载药颗粒可以实现对线粒体凋亡诱导剂和免疫佐剂的双重装载以实现对肿瘤的双重杀伤，构建的核壳结构纳米粒可以程序性释放药物；经试验表明，所述RRTA NPs能有效提高抗癌效果，极具市场应用与推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及高分子药物制剂领域，更具体的说是涉及一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法及应用。
背景技术
线粒体对细胞起着至关重要甚至致命的作用，这些作用也与疾病的病理生理情况有关。包括产生ATP、控制活性氧水平、缓冲胞浆钙水平、调节细胞凋亡等多种重要功能。且研究发现癌细胞具有更低的膜超极化电位，使线粒体成为一个理想的靶点。不同于干扰DNA合成和有丝分裂来发挥作用以导致快速生长和分裂的癌细胞死亡，如果控制着线粒体功能诱导其启动细胞凋亡，也是一种杀伤癌细胞的方式。ABT-737就是一种线粒体凋亡诱导剂。
单一的化疗或免疫治疗都具有治疗效果不足的缺陷，因此将二者联用是突破这种缺陷的有效举措。免疫治疗能逆转肿瘤细胞的化疗耐药性，从而提高了肿瘤细胞的化疗敏感性，从而能降低化疗药物的给药剂量，降低毒性。而化疗可以促进免疫细胞在肿瘤内的渗透，创造对免疫治疗更敏感的环境。R848是一类低分子量咪唑喹啉胺类化合物，它能增强了树突状细胞的成熟，增加免疫细胞因子的产生。
无论免疫治疗还是化疗，都面临着递送和靶向的问题，这是限制两种治疗效果的共同因素。而使用纳米药物递送系统将药物靶向于特定的部位是一个解决这些问题的选择。纳米药物递送系统的设计源于工程、化学和医学领域。纳米粒子的介观尺寸范围在5到200纳米之间，这使得它们可以在分子水平上与生物系统进行独特的相互作用。纳米递送系统具有延长药物的作用时间、靶向输药至特定器官、减轻或消除毒副作用、提高药物的稳定性、改善药物溶解度等优点。
要实现ABT-737靶向递送至癌细胞线粒体，R848靶向递送到肿瘤部位免疫细胞，需要借助核壳结构纳米递送系统。核壳结构纳米递送系统具有一种外壳加核心内层的典型的设计特征，通常，治疗分子可以在分层的核壳结构中被固定和分割，并可以被输送到靶向部位，核和壳可以执行独立的功能。本研究中先通过制备出内核纳米粒，后续在将内核和免疫佐剂再披覆上外壳材料。
核壳结构纳米递送系统需要借用相反电荷之间的静电相互作用构建。内核载体材料为TPP-PLL，带有正电荷，且三苯基膦是一种离域亲脂阳离子，能选择性地积累在癌细胞线粒体中，以赋予纳米粒靶向肿瘤细胞线粒体的能力；而外壳材料为RGD-PGA，带有负电荷，带有的靶头cRGDfk肽是一个五元环肽，由精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、D型苯丙氨酸、赖氨酸组成，并且首尾酰胺键成环，它能与αvβ3整合素受体强烈和特异地结合。整合素是在细胞间和细胞-基质相互作用中起重要作用的蛋白质，在许多肿瘤上高表达，因此赋予了纳米颗粒靶向肿瘤部位的能力。
因此，提供一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明采用高分子制剂手段，以相反电荷的两种载体构建成化疗及免疫治疗协同的双重靶向核壳结构肿瘤治疗纳米颗粒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法，利用具有相反电荷的两种聚合物载体制备成能同时装载线粒体药物和免疫佐剂的核壳结构纳米载药颗粒；
具体包括如下步骤：
(1)将ABT-737（线粒体凋亡诱导剂）溶于DMSO（二甲基亚砜）中形成有机相I，将TPP-PLL（三苯基膦-聚赖氨酸）溶于去离子水中形成水相I；
(2)将有机相I在超声条件下滴注到水相I中；
(3)采用透析法去除DMSO，形成内核纳米粒TA NPs（TPP-PLL/ABT NPs ）；
(4)将R848（免疫佐剂雷西莫特）和RGD-PGA（cRGDfk-聚谷氨酸）溶于DMSO和水的混合溶剂中形成有机相II；
(5)将TA NPs作为水相II，在超声条件下将有机相II滴注到水相II中；
(6)采用离心法去除DMSO，加入去离子水超声下将沉淀混悬，形成化疗及免疫治疗协同的双重靶向核壳结构肿瘤治疗纳米粒RRTA NPs（RGD-PGA/R848/TPP-PLL/ABT NPs）。
进一步的，所述步骤(1)中，ABT-737与TPP-PLL的添加质量比为1-10：1-10；所述ABT-737在DMSO中的浓度为0.5~5 mg/mL，所述TPP-PLL在去离子水中的浓度为0.4~4 mg/mL；
所述步骤（4）中R848与RGD-PGA的添加质量比为1-10：1-10；DMSO和水的体积比为1:1以形成DMSO和水的混合溶剂，R848在DMSO和水的混合溶剂中浓度为0.5~5 mg/mL；
步骤（1）所述ABT-737和步骤（4）所述R848的质量比为1-5:1-5。
进一步的，所述步骤(2)，步骤(5)，步骤(6)中，超声温度为15~35℃，超声功率为150~200W，超声时间为5~10min。
进一步的，所述步骤(2)与步骤(5)中，滴注速度为1-3滴/s。
进一步的，所述步骤(3)中的透析时间为4~6h，透析速度为2L/h。
进一步的，所述步骤(6)中的离心转速为5000~8000rpm，离心时间为5~10min。
一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒，所述免疫治疗协同的双重靶向核壳结构纳米载药颗粒是以TPP-PLL和RGD-PGA为载体包载线粒体凋亡诱导剂ABT-737和免疫佐剂R848制得；其中所述TPP-PLL是ε-聚赖氨酸接枝三苯基膦制备而成，RGD-PGA是由γ-聚谷氨酸接枝cRGDfk制备而成。
一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒在药物制剂中的应用。
进一步的，还包括化疗及免疫治疗协同的双重靶向核壳结构纳米粒在抗癌中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明公开的纳米载药颗粒不仅能实现化疗药物和免疫佐剂的双重靶向递送和程序性释放，还能通过协同治疗增强了对肿瘤的治疗效果，极具市场应用与推广前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1制得RRTA NPs的平均粒径分布图；
图2为对比例2物理混合法制得RRTA NPs透射电镜照片；
图3为实施例1逐层包裹法制得RRTA NPs透射电镜照片；
图4为实施例2药载比1 : 10时制得RRTA NPs透射电镜照片；
图5为各实验组的体外抗4T1肿瘤效果；
图6为各实验组4T1肿瘤体积变化；
图7为根据给药结束后肿瘤体积计算得到的各组抑瘤率；
图8为小鼠体重随时间变化曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验原料与器具来源：
试剂：ABT-737（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C11358823）；R848（上海源叶生物科技有限公司，批号：R04S10G96793）；PGA（天津希恩思生化科技有限公司，批号：P0144038GLL1）；PLL（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：A2002048）；TPP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：G07M10L87472）；cRGDfk（西安瑞禧科技有限公司，批号：RA0221835）；DMSO（北京化工厂）；甲醇（美国Fisher公司）。
仪器：KQ3200DB型数控超声仪（昆山市超声仪公司）；Master-D实验室超纯水仪（上海和泰仪器有限公司）；S- 4800型扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）；Infinite M1000多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；AL204分析天平（梅特勒–托利多仪器上海有限公司）；Zetasizer Nano ZS型粒度仪（美国Malvern Instruments公司）；TG16MW台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；MCA-15AC细胞培养箱（日本SANYO公司）；UltiMate3000高效液相色谱仪（美国戴安仪器公司）。
动物及细胞培养：4T1鼠乳腺癌细胞株购自国家实验细胞资源共享平台，RPMI1640培养基、牛血清、青链霉素由美国Gibco公司提供；96 孔无菌培养板由美国 Corning公司提供。SPF级雌性Bal b/c鼠（20 ± 2 g, 6 - 8 周龄）由北京维通利华动物技术有限公司提供。
实施例1：RRTA NPs的制备
采用超声滴注法制备RRTA NPs，具体包括如下步骤：
内核纳米粒TA NPs的制备：
(1)将10mgABT-737溶于1mLDMSO中形成有机相I，将20mgTPP-PLL溶于5mL去离子水中形成水相I；
(2)将有机相I在超声条件（温度15~35℃，功率150~200W，时间5~10min）下滴注到水相I中，滴注速度为1-3滴/s；
(3)采用透析法去除DMSO（普通型透析袋（3500），去离子水透析6h，透析速度2L/h），形成内核纳米粒TA NPs（TPP-PLL/ABT NPs ）；
完整核壳结构RRTA NPs的制备（逐层包裹法）：
(4)将10mgR848和20mgRGD-PGA溶于1mLDMSO和水的混合溶剂（体积比1:1）中形成有机相II；
(5)将5mLTA NPs作为水相II，在超声条件（温度15~35℃，功率150~200W，时间5~10min）下将有机相II滴注到水相II中，滴注速度为1-3滴/s；
(6)8000rpm离心去除上清（DMSO），加入去离子水超声条件（温度15~35℃，功率150~200W，时间5~10min）下将沉淀混悬，形成化疗及免疫治疗协同的双重靶向核壳结构肿瘤治疗纳米粒RRTA NPs（产物1）。
产物1的粒径为257.7 nm（见图1），多分散指数(PDI)为0.142，电位为-29.2 mV。
对比例1
将DMSO替换为甲醇，制备方法同实施例1步骤（1）-（3）；结果表明甲醇对ABT-737溶解度不够，仅有1.4 mg/mL，无法形成内核纳米粒TA NPs。
实施例1中DMSO对ABT-737溶解度为50 mg/mL，故选择DMSO作为有机相溶剂。
对比例2
步骤（1）-（3）同实施例1；
完整核壳结构RRTA NPs的制备（物理混合法）：
(4)将10mgR848溶于0.5mLDMSO形成有机相II，将20mgRGD-PGA溶于0.5mL水中形成水相II，在超声条件下有机相II滴注到水相中II，制备RGD-PGA/R848 NPs（RR NPs）；
(5)将5mLTA NPs作为水相III，在超声条件（温度15~35℃，功率150~200W，时间5~10min）下，按体积比1:1，将RR NPs滴注到水相III中，滴注速度为1-3滴/s；
(6)8000rpm离心去除上清（DMSO），加入去离子水超声条件（温度15~35℃，功率150~200W，时间5~10min）下将沉淀混悬。
实施例2：不同比例RRTA NPs的制备
采用超声滴注法制备RRTA NPs，药载比为1 : 10，其余条件同实施例1；
药载比为1 : 10时，仍可制成肿瘤治疗纳米粒。首先进行内核纳米粒TA NPs制备，将2mgABT-737溶于1mLDMSO中形成有机相I，将20mgTPP-PLL溶于5mL去离子水中形成水相I，将有机相I在超声条件下滴注到水相I中，透析除去DMSO（普通型透析袋（3500），去离子水透析6h）），形成内核纳米粒TPP-PLL/ABT NPs（TA NPs）；
然后进行完整核壳结构RRTA NPs制备，将2mgR848和20mgRGD-PGA溶于1mLDMSO和水的混合溶剂中形成有机相II，将5mLTA NPs作为水相II，在超声条件下将有机相II滴注到水相II中，在8000rpm离心去除上清以去除DMSO，超声下加去离子水将沉淀混悬（产物2）。
产物2的粒径为207.7 nm，PDI为0.331，电位为19.2 mV。
为了进一步验证本发明的优异效果，还进行了如下实验。
实验1：RRTA NPs的形貌观察
将对比例2制备的最终产物，实施例1和实施2制备的RRTA NPs(1mg/mL)分别滴到300目的测量铜网上，室温下晾干10 min，用滤纸沿边缘吸去多余水分，滴入5 μL的2 %（w/v）磷钨酸染液复染10 min，自然晾干，用JEM-1400透射电镜下进行观察和拍照，对比例2物理混合法制备的最终产物如图2所示，实施例1逐层包裹法制备的最终产物如图3所示，实施例2药载比1 : 10制备的最终产物如图4所示。
结果表明实施例1和2都形成了完整的核壳结构。
实验2：RRTA NPs载药量考察
将实施例1制备的RRTA NPs冻干后精密称重后，分别加入1 mL色谱甲醇，涡旋 15min使被负载的药物充分溶解后，13000 r/min条件下高速离心30 min，取上清液加入色谱甲醇稀释20倍后上样检测模型药物质量，按下列公式计算：
载药量(DLC％)＝负载药物总质量/纳米粒总质量×100％；
结果为DLCABT％＝6.25%，DLCR848%＝9.6%。
实验3：RRTA NPs放置稳定性考察
将实施例1制备的RRTA NPs(1 mg/mL)于室温条件下密封放置，分别在预先设置的时间点点0、2、4、6、8、10、12和14d取取样，室温条件下马尔文Nano-ZS粒度仪测定其粒径，平行测量3次，粒径变化结果见下表1所示。
表1 放置稳定性结果
由上述表1数据可知，RRTA NPs稳定性较好，放置14天后粒径、PDI有所增大，但在一定范围内波动。
实验4：体外抗肿瘤试验
给药分组：ABT组，R848组，PLL/ABT NPs（PA NPs）组，TPP-PLL/ABT NPs（TA NPs）组，RGD-PGA/R848 NPs（RR NPs）组，PGA/R848/ TPP-PLL/ABT NPs（PRTA NPs）组，RGD-PGA/R848/TPP-PLL/ABT（RRTA NPs）组，制备方法参考实施例1。
通过 MTT 实验来评价 ABT 和 R848 以及免疫协同纳米粒对鼠源乳腺癌 4T1细胞的体外抗肿瘤效果。4T1细胞株使用 RPMI 1640完全培养基（包含10 %的胎牛血清和1000U/mL的青链霉素），在37 ℃下，含5 %的CO2的培养箱中进行培养，每24h换液一次，待细胞生长到对数生长期后，以8000个/孔的细胞浓度接种于96孔板，继续在培养箱中培养24 h后，将其取出，吸去 96 孔板中的完全培养基。先设定对照组，每孔滴加150 µL用 RPMI 1640不完全培养基（其中只含1000 U/mL的青链霉素）；设定5个纳米粒组，每个浓度设 6 孔，每孔滴加 150µL 用RPMI 1640不完全培养基稀释的不同浓度（0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5,5, 10, 100, 500 µg/mL）；设定游离ABT-737，R848组，ABT-737，R848用 DMSO 溶解后分散于 RPMI 1640不完全培养基（DMSO < 0.1 %）中，继续使用RPMI 1640不完全培养基稀释成的不同浓度（0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 5, 10, 100 µg/mL）的游离ABT-737，R848，每个浓度设六孔。载体组则是将TPP-PLL，RGD-PGA用RPMI 1640不完全培养基溶解并稀释到不同浓度（0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 5, 10, 100µg/mL），每个浓度设六孔。继续在培养箱中培育 48h后，向每孔内滴加 20µL 的含有MTT的PBS溶液（5mg/mL）。接着在培养箱内培育 4h 后，吸去孔内的上清液，每孔加入150µL的DMSO溶剂，震荡溶解后，570nm 波长下，利用酶标仪测定各实验组的吸光度（A）值，利用下列公式计算细胞的抑制率：细胞抑制率（%）=（1-药物组OD均值/空白组OD均值）× 100 %。以药物的浓度为横坐标，对细胞的抑制率为纵坐标绘制剂量-效应曲线，通过 GraphPad Prism软件计算细胞抑制率，其中抑制效率达到 50 %的药物浓度，为半数抑制浓度（50% concentration of inhibition，IC50）。
通过MTT法检测了免疫协同纳米粒的体外抗肿瘤药效（见图5），两种载体对4T1细胞无显著影响，两种载体安全。R848作为免疫佐剂，在实验中的给药浓度下，对癌细胞无明显杀伤，同时RR NPs也同样对4T1无明显杀伤；而ABT-737作为一种凋亡诱导剂，原药的IC50值就达到了0.72 μg/mL，制备成纳米粒后毒性增强，不带线粒体靶向配体的PA NPs相较于原药毒性提升了3.8倍，内核纳米粒TA NPs比原药毒性提升了8倍。后将内核与免疫佐剂包裹在PGA和RGD-PGA中，制成的PRTA NPs和RRTA NPs的IC50值分别为0.10 μg/mL和0.04 μg/mL；PRTA NPs外壳不带靶向配体，与TA NPs的毒性相似，而增加靶向配体的RRTA NPs的抗肿瘤效果得到了进一步提升，较于原药提升了18倍，较于TA NPs提升了2.2倍。
实验5：体内抗肿瘤试验
给药分组：5%葡萄糖溶液组（阴性），MTX 注射液组（阳性），载体（TPP-PLL，RGD-PGA）组，PLL/ABT NPs（PA NPs）组，TPP-PLL/ABT NPs（TA NPs）组，RGD-PGA/R848 NPs（RRNPs）组，RGD-PGA/ TPP-PLL/ABT（RTA NPs）组，PGA/R848/ TPP-PLL/ABT NPs（PRTA NPs）组，RGD-PGA/R848 NPs + TPP-PLL/ABT NPs（RR+TA NPs）组，RGD-PGA/R848/TPP-PLL/ABT（RRTANPs）组，制备方法参考实施例1。
体内抗肿瘤药效通过Bal b/c荷瘤小鼠进行考察。在雌性Bal b/c鼠右前肢下侧接种适量的4T1乳腺癌细胞（1.0 × 107 /mL, 0.2 mL/只），当肿瘤体积长到 150 mm3时，挑选肿瘤体积比较接近的荷瘤鼠100只，随机分成10组（每组 10只）。
每隔一天尾静脉给药一次，分别为5%葡萄糖溶液组（阴性对照组，0.2 mL/只）、MTX注射液组（阳性药组，3 mg/kg）、载体组（RGD-PGA、TPP-PLL：根据载药量由给药剂量计算得来）、PA NPs组（ABT：5 mg/kg）、TA NPs组（ABT：5 mg/kg）、RR NPs组（R848：4 mg/kg）、RTANPs组（ABT：5 mg/kg）、PRTA NPs组（ABT：5 mg/kg，R848：4 mg/kg）、RR+TA NPs组（ABT：5 mg/kg，R848：4 mg/kg）、RRTA NPs组（ABT：5 mg/kg，R848：4 mg/kg）。自首次给药后，每隔一天用游标卡尺测量记录小鼠的瘤体积长宽并称量体重，根据公式：瘤体积 = (长×宽2) / 2 计算瘤体积。连续给药14天后，每天记录小鼠生存情况及瘤体积情况，瘤体积超过2000 mm3视作小鼠死亡，并根据各组瘤体积情况计算体积抑瘤率并绘制生长曲线。
结果表明，各组瘤体积变化趋势不同，阴性组和载体组两组平均瘤体积明显增大，载体材料对肿瘤生长无影响；阳性药组具有中等抑瘤效果，剩下几组具有很强的抑瘤效果，而RRTA NPs能使肿瘤减小甚至消失（见图6）。在给药结束后，根据瘤体积得来的体积抑瘤率（见图7），MTX组、PA NPs组、TA NPs组、RR NPs组、RTA NPs组、PRTA NPs组、TA+RR NPs组、RRTA NPs组的平均抑瘤率分别为52.7%、58.8%、73.5%、75.6%、76.6%、77.3%、79.0%、96.9%。
同时记录给药过程中各组小鼠平均体重的变化，可以看出所有的纳米粒都具有安全性，在给药过程中未发现体重显著降低的情况，显示出纳米粒具有很强的安全性（见图8）。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，利用具有相反电荷的两种聚合物载体制备成能同时装载线粒体药物和免疫佐剂的核壳结构纳米载药颗粒；
具体包括如下步骤：
(1)将线粒体凋亡诱导剂ABT-737溶于DMSO中形成有机相I，将三苯基膦-聚赖氨酸溶于去离子水中形成水相I；所述线粒体凋亡诱导剂ABT-737与三苯基膦-聚赖氨酸的添加质量比为1-10：1-10；所述线粒体凋亡诱导剂ABT-737在DMSO中的浓度为0.5~5 mg/mL，所述三苯基膦-聚赖氨酸在去离子水中的浓度为0.4~4 mg/mL；所述三苯基膦-聚赖氨酸是ε-聚赖氨酸接枝三苯基膦制备而成；
(2)将有机相I在超声条件下滴注到水相I中；
(3)采用透析法去除DMSO，形成内核纳米粒TA NPs；
(4)将免疫佐剂雷西莫特R848和cRGDfk-聚谷氨酸溶于DMSO和水的混合溶剂中形成有机相II；所述免疫佐剂雷西莫特R848与cRGDfk-聚谷氨酸的添加质量比为1-10 : 1-10；DMSO和水的体积比为1:1以形成DMSO和水的混合溶剂，免疫佐剂雷西莫特R848在DMSO和水的混合溶剂中浓度为0.5~5 mg/mL；所述cRGDfk-聚谷氨酸是由γ-聚谷氨酸接枝cRGDfk制备而成；
(5)将TA NPs作为水相II，在超声条件下将有机相II滴注到水相II中；
(6)采用离心法去除DMSO，加入去离子水超声下将沉淀混悬，形成化疗及免疫治疗协同的双重靶向核壳结构肿瘤治疗纳米粒RRTA NPs；
步骤（1）所述线粒体凋亡诱导剂ABT-737和步骤（4）所述免疫佐剂雷西莫特R848的质量比为1-5:1-5。
2.根据权利要求1所述的一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)，步骤(5)，步骤(6)中，超声温度为15~35℃，超声功率为150~200W，超声时间为5~10min。
3.根据权利要求1所述的一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)与步骤(5)中，滴注速度为1-3滴/s。
4.根据权利要求1所述的一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的透析时间为4~6h，透析速度为2L/h。
5.根据权利要求1所述的一种双重靶向核壳结构纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中的离心转速为5000~8000rpm，离心时间为5~10min。
6.一种如权利要求1～5任一所述方法制备的核壳结构纳米载药颗粒，其特征在于，所述核壳结构纳米载药颗粒是以三苯基膦-聚赖氨酸和cRGDfk-聚谷氨酸为载体包载线粒体凋亡诱导剂ABT-737和免疫佐剂雷西莫特R848制得；其中所述三苯基膦-聚赖氨酸是ε-聚赖氨酸接枝三苯基膦制备而成，所述cRGDfk-聚谷氨酸是由γ-聚谷氨酸接枝cRGDfk制备而成。
7.一种如权利要求1～5任一所述方法制备的核壳结构纳米颗粒或如权利要求6所述核壳结构纳米载药颗粒在制备抗乳腺癌药物中的应用。
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