CN111039821B - 一种磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氯硝柳胺纳晶的技术领域，具体涉及一种磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶的制备方法及应用。所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶采用反溶剂沉淀法结合高压均质技术，以泊洛沙姆188和磷酸盐为稳定剂，具体步骤如下：将适量氯硝柳胺溶于乙醇和丙酮的混合溶剂，将适量泊洛沙姆188和磷酸盐溶于水；在搅拌下将有机相加到水相中，旋蒸除去有机溶剂；高压均质数次，即得到氯硝柳胺纳晶。所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶粒径为167 nm，氯硝柳胺以最稳定的HB晶型存在，且磷酸盐可以增加氯硝柳胺纳晶的电位值，使得氯硝柳胺纳晶稳定六个月以上，成功解决了氯硝柳胺纳晶体系稳定性差的问题。此外，磷酸盐可以促进氯硝柳胺纳晶的释放，增强体内外抗肿瘤疗效。

Description

一种磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及氯硝柳胺纳晶的技术领域，具体涉及一种磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶的制备方法及应用。
背景技术
研究表明，大约40％候选化合物是难溶性药物，它们水溶性差，生物利用低，大大限制了其临床应用。研究者采取许多方法来解决这一难题，比如环糊精包合技术，共溶剂技术，固体分散技术，脂质体、胶束、纳米粒等纳米制剂技术，从而改善药物的水溶性。但是这些方法都存在许多问题，比如过量有机溶剂和辅料产生的毒性，制剂载药量低、重现性差、不适宜工业化生产。
纳晶是一种纳米混悬剂，它是由表面活性剂或者聚合物作为稳定剂形成的粒径在1-1000nm的晶体系统，具有提高难溶性药物生物利用度、载药量高、毒副作用低、给药途径多样等优势。它的制备方法可以分为“自上而下”的介质研磨法和高压均质法、“自下而上”的反溶剂沉淀法。目前应用最广且适用于工业化生产的是高压均质法，它不仅克服介质研磨法中可能引入的研磨介质静注带来的不良后果，而且弥补了反溶剂沉淀法制备得到的纳米制剂因粒子大小差异而聚集的缺陷。实验室研究主要采用反溶剂和高压均质结合的方式，这种方式可以使制备得到的纳晶粒径小且均一。
氯硝柳胺(NLM)，化学名为N-(2’-氯-4’-硝基苯)-5-氯水杨酰胺，它具有药效高和毒性低的特点，是目前FDA唯一推荐使用的杀灭钉螺和蠕虫的药物。近年来，在抗肿瘤药物的研发过程中，通过大量的药物筛选实验发现氯硝柳胺还具有潜在的抗肿瘤作用，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、喉癌等。相对于新研究合成的抗肿瘤药物，氯硝柳胺具有药物细胞毒性强、对人体毒副作用小的优势，但是氯硝柳胺因其水溶性差限制其临床应用。为了解决水溶性这一难题，研究者考虑将氯硝柳胺制备成各种制剂，比如采用高压均质法以吐温80为稳定剂将氯硝柳胺制备成纳晶，载药量满足动物给药的要求，但是由于吐温80存在溶血的风险，故不适用于静脉注射给药。此外，研究者采用反溶剂法制备的氯硝柳胺乙醇胺盐纳米剂存在的主要问题是磁力搅拌分散得到的粒子由于粒径不均一导致的聚集，制剂的稳定性和重现性特别差，无法满足给药需求。值得注意的是，氯硝柳胺是一种弱酸，酚羟基极易被氧化，并且它具有假多晶型的特性，其无水晶型在水溶液中会转变成亚稳的一水合氯硝柳胺HA和最稳定的一水合晶型HB，制剂中氯硝柳胺的晶型对体系稳定性的影响极大。研究者将氯硝柳胺制备成纳米粒，胶束等纳米制剂也无法解决载药量低和制剂溶液稳定性差的问题，这可能和氯硝柳胺未形成最稳定的晶型有关。
此外，根据DLVO理论，纳米粒子的稳定性也取决于双层反离子所产生的范德华力和静电斥力之间的平衡，当静电斥力主导范德华力时，体系保持稳定的分散状态。Zeta电位是衡量纳米粒子之间静电斥力的重要参数，电位值越高，体系越稳定。研究者采取一些方式增强纳米粒子的Zeta电位，增强粒子间的静电斥力，从而增强体系的稳定性。比如，在体系中加入三价铁离子增强体系的稳定性，但是考虑到制备成功的氯硝柳胺纳晶会进一步包载于凝胶中进行瘤内给药的相关研究，三价铁离子会对胶凝温度产生影响，故排除这个方法。也有研究者在纳米粒体系中加入羧酸盐，羧酸可以很容易地与体系中的某些基团进行配体交换，改善粒子的表面性质。但我们前期处方筛选试验结果表明羧酸盐无法稳定氯硝柳胺纳晶，这可能和氯硝柳胺本身的化学性质有关。有少量的文献指出磷酸盐缓冲液可以通过提高电位来增加纳米粒的稳定性，并且磷酸盐的pH和浓度会对体系的稳定性产生影响，而迄今未见磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶的文献报道。
本发明采用反溶剂法结合高压均质技术，以适量泊洛沙姆188(F68)，适宜pH和浓度的磷酸盐为稳定剂，制备得到粒径均一、稳定性强、载药量高的氯硝柳胺纳晶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于静脉注射的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶的制备方法及应用。
一种磷酸盐稳定的氯硝柳胺纳晶，其特征在于所述的纳晶的稳定剂包括泊洛沙姆188和磷酸盐。
所述的氯硝柳胺的浓度为1-3mg/ml，泊洛沙姆188的浓度为0.5-2mg/ml。
所述的磷酸盐的浓度为0.02-0.1M，磷酸盐的pH为6-6.8。
纳晶的粒径范围为150-250nm。
所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶在制备抗肿瘤药物的应用。
所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶的制备方法，其特征在于按步骤如下：
A将氯硝柳胺溶于乙醇和丙酮的混合溶剂作为有机相；
B将泊洛沙姆188和磷酸盐溶于水作为水相；
C在磁力搅拌下将有机相逐滴加入水相中；
D旋蒸除去有机溶剂；
E高压均质数次即可得到纳晶。
进一步来说所述的的纳晶的制备方法，其特征在于步骤A-C中所述的搅拌速率为300-1000rpm，步骤D中所述的旋蒸温度为35-42℃；步骤A中所述的乙醇和丙酮的混合溶剂比为2:1-1:2；步骤E中所述的高压均质压力为800-1200bar，均质次数为10-40次。
进一步来说：
本发明采用的稳定剂是泊洛沙姆188，它是聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物,水溶性好，是一种良好的表面活性剂和稳定剂，更重要的是，它是适用于静脉注射的辅料，化学性质比较稳定。
本发明采用的磷酸盐的组成是磷酸二氢钾和十二水合磷酸氢二钠，磷酸盐的浓度包括0.02 -0.1M，磷酸盐的pH包括6-6.8。
本发明所述的制备方法，其特征在于：将处方量氯硝柳胺溶于乙醇和丙酮的混合溶剂，将处方量泊洛沙姆188和磷酸盐溶于水；在搅拌下将有机相加到水相中，旋蒸除去有机溶剂；高压均质数次，即得到氯硝柳胺纳晶。
本发明所述的制备方法，其特征在于乙醇和丙酮的混合溶剂比为2:1-1:2；所述的氯硝柳胺的浓度为1-3mg/ml；所述的泊洛沙姆188的浓度为0.5-2mg/ml；所述的有机相加入水相的搅拌速度为800-1000rpm；所述的旋蒸温度为37-42℃；所述的高压均质压力为800-1200bar，均质次数为10-40次。
有益效果
1、稳定性是纳米制剂最重要的考察因素之一，普遍存在长期放置后出现沉淀或粒径变大的问题，导致纳米制剂难以进入临床应用。
本发明制备的关键点在于所述的氯硝柳胺和泊洛沙姆188的质量比为3:1-1:2，稳定剂过高过低都会导致制备的纳晶粒径大，呈浑浊状态，稳定效果差；磷酸盐的浓度和pH对氯硝柳胺纳晶的Zeta电位影响大，浓度过高使体系中离子浓度过高，不利于体系的稳定；浓度过低不足以使纳晶稳定。pH过高过低都会影响药物的稳定，pH为6-6.8时，纳晶的稳定效果最好。
所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶制备方法简便，适用于工业化生产；所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶中的氯硝柳胺以最稳定的HB晶型存在，且磷酸盐增加纳晶体系的Zeta电位值，进一步增强体系的稳定性；所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶血清稀释稳定性强，适宜静脉注射；所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶在六个月的低温放置中保持药物浓度基本不变，避免了药物降解和药物析出，成功解决了氯硝柳胺纳晶体系在低温放置条件下稳定性差的问题，具备商业化价值。更重要的是，磷酸盐可以促进氯硝柳胺纳晶的释放，增强体内外抗肿瘤疗效，为临床试验提供数据参考。
附图说明
图1是实施例15氯硝柳胺纳晶透射电镜图；
图2是实施例15氯硝柳胺纳晶粒径分布图；
图3是实施例21氯硝柳胺纳晶DSC分析图；
图4是实施例22氯硝柳胺纳晶稀释稳定性曲线图；
图5是实施例23氯硝柳胺纳晶释放曲线；
图6是实施例24氯硝柳胺纳晶低温放置中药物浓度随时间变化曲线；
图7是实施例25氯硝柳胺纳晶对MDA-MB-231细胞抑制作用曲线；
图8是实施例26氯硝柳胺纳晶对MDA-MB-231细胞的摄取柱状图；
图9是实施例27氯硝柳胺纳晶的药效实验中瘤体积随时间变化曲线；
图10是实施例27氯硝柳胺纳晶的药效实验中鼠体重随时间变化曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本发明并不限于下列实施例包含的内容。
实施例1
将180mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 溶于60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再40℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar 均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为165.2±3.6nm，PDI为0.289±0.002，Zeta电位为-8.64 ±1.2，HPLC实测药物浓度为2.520±0.01mg/ml，4℃放置1天有药物析出。
实施例2
将180mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.01M pH＝4磷酸盐溶于60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
实施例3
将180mg氯硝柳胺溶于15ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.01M pH＝5磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
实施例4
将120mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.02M pH＝6磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；400bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为235.8±1.8nm，PDI为0.286±0.015,Zeta电位为-9.28±1.1，HPLC实测药物浓度为1.549±0.85mg/ml，4℃放置3天析出。
实施例5
将180mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.02M pH＝6.5磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；600bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为196.4±2.4nm，PDI为0.248±0.019，Zeta电位为-9.89±0.8，HPLC实测药物浓度为1.876±0.09mg/ml，4℃放置14天析出。
实施例6
将240mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.02M pH＝7磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为194.5±5.8nm，PDI为0.259±0.075，Zeta电位为-9.33±0.3，HPLC实测药物浓度为2.112±0.08mg/ml，4℃放置7天析出。
实施例7
将240mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.03M pH＝7磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为206.7±2.7nm，PDI为0.339±0.006，Zeta电位为-9.52±1.1，HPLC实测药物浓度为2.005±0.01mg/ml，4℃放置7天析出。
实施例8
将300mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.04M pH＝7.4磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
实施例9
将240mg氯硝柳胺溶于8ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188和0.04M pH＝7.4磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为215.9±2.3nm，PDI为 0.188±0.019，Zeta电位为-9.21±0.4，HPLC实测药物浓度为1.936±0.09mg/ml，4℃放置14 天析出。
实施例10
将180mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.04M pH＝7.4磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为128.7±2.5nm，PDI为0.216±0.013，Zeta电位为-9.65±1.6，HPLC实测药物浓度为1.846±0.06mg/ml，4℃放置14 天析出。
实施例11
将180mg氯硝柳胺溶于8ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188和0.05M pH＝8磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1200bar均质20次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
实施例12
将180mg氯硝柳胺溶于8ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188和0.1M pH＝8磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1200bar均质20次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
实施例13
将240mg氯硝柳胺溶于8ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188和0.1M pH＝8磷酸盐溶于60ml水；在800rpm搅拌下将有机相加到水相中，再37℃旋蒸除去有机溶剂；1200bar均质20次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
实施例14
将180mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.02M pH＝6.8磷酸盐溶60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再40℃旋蒸除去有机溶剂1000bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为152.4±4.8nm，PDI为0.287±0.032，Zeta电位为-14.2±1.3，HPLC实测药物浓度为2.689±0.03mg/ml，4℃放置180天稳定，无药物析出。
实施例15
将180mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.05M pH＝6.8磷酸盐溶于60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再40℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为167.3±2.8nm，PDI为0.283±0.018，Zeta电位为-20.5±0.9，HPLC实测药物浓度为2.741±0.08mg/ml，4℃放置180天稳定，无药物析出。
实施例16
将180mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.1M pH＝6.8磷酸盐溶于60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再40℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为168.4±3.2nm，PDI为0.279±0.008，Zeta电位为-17.9±1.7，HPLC实测药物浓度为2.712±0.01mg/ml，4℃放置180天稳定，无药物析出。
实施例17
将240mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.02M pH＝6.8磷酸盐溶于60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再40℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质20次，即得到氯硝柳胺纳晶粒径为180.1±2.3nm，PDI为0.213±0.004，Zeta电位为-10.1±2.1，HPLC实测药物浓度为3.011±0.01mg/ml，4℃放置7天有药物析出。
实施例18
将300mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.05M pH＝6.8磷酸盐溶于60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再40℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质30次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
实施例19
将300mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.1M pH＝6.8磷酸盐溶于60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再40℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质30次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
实施例20
将300mg氯硝柳胺溶于10ml乙醇和丙酮的混合溶剂(1:1,v/v)，将60mg泊洛沙姆188 和0.15M pH＝6.8磷酸盐溶于60ml水；在1000rpm搅拌下将有机相加到水相中，再40℃旋蒸除去有机溶剂；1000bar均质30次，得到的氯硝柳胺纳晶浑浊，有颗粒沉淀，未测粒径。
表1实施例1-20中氯硝柳胺纳晶的粒径、Zeta电位、稳定性及药物浓度结果汇总(X±SD,N＝3)
Figure BDA0002321528600000071
Figure BDA0002321528600000081
“--”表示未加磷酸盐，未调节pH；“---”表示未制备形成氯硝柳胺纳晶，未进行粒径、电位、稳定性及浓度测定。
表1的结果显示，按照实施例14、15、16所述的制备方法得到的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶粒径小、4℃放置稳定性最强、药物浓度最高，且电位的绝对值比不加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶高两倍以上，故后续实验的磷酸盐稳定纳晶样品的制备方法参照实施例14、15、16。而按照实施例1中的制备方法，不加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶虽然药物浓度和粒径符合要求，但是电位绝对值低，粒子之间的静电斥力小，体系的稳定性差，放置1天就有明显药物析出，说明磷酸盐可以增强氯硝柳胺纳晶体系在低温条件下的稳定性。
实施例21：氯硝柳胺纳晶DSC分析
参照实施例15制备得到的氯硝柳胺纳晶，12000rpm离心30min得到纳晶沉淀，60℃烘干，称取适量的样品进行DSC分析，升温速率10℃/min，升温范围40～300℃，测定载气为氮气。
图3的结果显示，磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶的DSC曲线中219℃的峰表示氯硝柳胺的熔融峰，152℃的峰表示氯硝柳胺HB晶型失水峰，说明氯硝柳胺在纳晶中以最稳定的HB晶型存在。
实施例22：氯硝柳胺纳晶稀释稳定性实验
参照实施例1、14、15、16中的方法制备得到的不加磷酸盐和加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶，分别用DMEM完全培养基(含10％血清)稀释10、20、50、100倍，测量粒径变化，考察其稀释稳定性。
图4的结果显示，实施例14、15、16中加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶稀释100倍后粒径基本没有变化，说明其血清稀释稳定性强，满足静脉注射的要求；实施例1中不加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶稀释100倍粒径从165.2nm增加至220.9nm，粒径略微增加，说明磷酸盐可以增强氯硝柳胺纳晶稀释稳定性，降低在静脉给药过程中因粒子聚集堵塞血管的风险。
实施例23：氯硝柳胺纳晶释放实验
分别精密吸取1ml实施例1、14、15、16中的制备方法制备得到的氯硝柳胺纳晶于透析袋(MWCO＝3500),放置在40ml具塞锥形瓶中,以40ml含有0.5％十二烷基硫酸钠(SDS) 的PBS为释放介质,100r·min-1摇床37℃恒温释放。分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h、 36h、48h取1ml释放外液,过0.45μm滤膜后直接进样(如果浓度过大再稀释)HPLC测量释放介质中的药物含量,计算累积释放率。每次取样后立即补充等温、新鲜的释放介质1ml, 每24h完全更换释放外液。释放介质满足漏槽条件,每组平行实验3份，绘制累积释放率- 时间曲线。
图5的结果显示，实施例14、15、16中加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶的累积释放率明显高于实施例1中不加氯硝柳胺纳晶，48h累积释放率高达95％以上，说明磷酸盐可以促进氯硝柳胺纳晶的释放。
实施例24：磷酸盐对氯硝柳胺纳晶低温放置稳定性影响实验
按照实施例1、14、15、16中的制备方法制备得到的氯硝柳胺纳晶分别置于4℃放置，分别于第0、7、14、30、60、90、120、180天HPLC测定纳晶中药物浓度，每组平行实验3 份，绘制药物浓度-时间曲线。
图6的结果显示，实施例1中不加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶在六个月放置过程中，氯硝柳胺浓度从2.520±0.01mg/ml下降至0.511±0.09mg/ml，说明没有磷酸盐的存在，纳晶体系极不稳定，随着储存时间延长，药物析出，体系中药物浓度下降。实施例14、15、16中加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶的药物浓度在六个月储存中基本维持在2.5mg/ml以上，说明磷酸盐可以增强氯硝柳胺纳晶的低温放置稳定性。
实施例25：MDA-MB-231细胞毒性试验
取对数生长期的人源乳腺癌细胞系MDA-MB-231，以每孔5×103个的密度将细胞接种于 96孔板中，用无菌PBS填充边缘孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，使细胞充分贴壁生长。随后吸弃旧培养基，用PBS洗涤3次，用不同浓度氯硝柳胺原料药(0.00125、0.0125、0.125、1.25、12.5μM)，实施例1纳晶样品(0.00125、0.0125、0.125、1.25、12.5μM)，实施例14纳晶样品(0.00125、0.0125、0.125、1.25、12.5μM)，实施例15纳晶样品(0.00125、 0.0125、0.125、1.25、12.5μM)，实施例16纳晶样品(0.00125、0.0125、0.125、1.25、12.5μM) 分别处理，每组设置6个复孔，同时设置调零孔和阴性对照孔。给药后孵育24h，除去旧培养基，每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液。孵育4h后，吸弃旧培养基，每孔加入150μl DMSO， 37℃摇床震摇至结晶完全溶解。用酶标仪于490nm处测定各孔的吸光度值(OD)，按照下列公式计算细胞的存活率：细胞存活率(％)＝(OD实验组-OD调零组)/(OD对照组-OD调零组)×100％
图7的结果显示，氯硝柳胺纳晶对MDA-MB-231细胞的抑制作用强于氯硝柳胺原料药，其中加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶(实施例14、15、16)对细胞的抑制作用强于不加磷酸盐的实施例1，说明磷酸盐可以增强氯硝柳胺纳晶对细胞的抑制作用。
实施例26：MDA-MB-231细胞定量摄取实验
取MDA-MB-231细胞以5×104的密度接种到6孔板中，并在37℃下孵育24小时。之后将旧培养基除去并用PBS洗涤3次，之后细胞用以下几组孵育4h：(1)氯硝柳胺原料药(12.5μM)，(2)实施例1纳晶样品(12.5μM)，(3)实施例14纳晶样品(12.5μM)，(4)实施例15纳晶样品(12.5μM)，(5)实施例16纳晶样品(12.5μM)。4h后，将细胞用PBS洗涤3次以除去游离药物，加入500μl去离子水，-20℃和室温反复冻融裂解细胞，通过HPLC分析确定细胞内药物含量，BCA测定试剂盒测定细胞内蛋白质含量。
图8的结果显示，MDA-MB-231细胞对加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶(实施例14、15、16)的摄取显著强于不加磷酸盐的实施例1纳晶样品和氯硝柳胺原料药组，说明磷酸盐可以增强 MDA-MB-231细胞对氯硝柳胺纳晶的摄取。
实施例27：MDA-MB-231荷瘤鼠肿瘤模型的建立及药效学实验
将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞用0.25％的胰蛋白酶消化，PBS洗涤后离心。用生理盐水稀释至细胞数量为2×106/ml,于裸鼠右腋下皮下注射100μl，用游标卡尺监测肿瘤的体积直至荷瘤鼠的肿瘤体积达到100mm3后，将荷瘤鼠随机分成以下的实验组：(1)生理盐水组，(2)氯硝柳胺原料药(iv,10mg/kg)，(3)实施例1纳晶样品(iv,10mg/kg)，(4)实施例14纳晶样品(iv,10mg/kg)，(5)实施例15纳晶样品(iv,10mg/kg)，(6)实施例16纳晶样品(iv,10mg/kg)。每个实验组5只荷瘤鼠，尾静脉注射200μl上述制剂，隔天给药并记录荷瘤鼠肿瘤的体积及体重，15天后处死鼠并取出肿瘤。肿瘤体积按如下公式计算：肿瘤体积＝ 0.5×长×宽2
图9的结果显示，氯硝柳胺纳晶组(实施例1、14、15、16纳晶样品)的荷瘤鼠的肿瘤体积显著小于氯硝柳胺原料药组，表明纳晶的抗肿瘤疗效优于原料药；其中，加磷酸盐的氯硝柳胺纳晶组(实施例14、15、16纳晶样品)的荷瘤鼠体积显著低于不加磷酸盐的实施例1纳晶样品组，说明磷酸盐可以增强氯硝柳胺纳晶的抗肿瘤疗效。
图10的结果显示，各组的荷瘤鼠的体重在15天的治疗中均呈现上升趋势，说明各给药组的生物安全性高，毒副作用低。

Claims (4)

1.一种磷酸盐稳定的氯硝柳胺纳晶，其特征在于：所述的纳晶的稳定剂包括泊洛沙姆188和磷酸盐；所述的氯硝柳胺的浓度为1-3 mg/ml，泊洛沙姆188的浓度为0.5-2 mg/ml；
所述的氯硝柳胺纳晶按如下步骤制备获得：
A 将氯硝柳胺溶于乙醇和丙酮的混合溶剂作为有机相；
B 将泊洛沙姆188和磷酸盐溶于水作为水相；
C 在磁力搅拌下将有机相逐滴加入水相中；
D 旋蒸除去有机溶剂；
E 高压均质数次即可得到纳晶；
所述的磷酸盐的浓度为0.02-0.1 M，磷酸盐的pH为6-6.8。
2.根据权利要求1所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶，其特征在于：纳晶的粒径范围为150-250 nm。
3.根据权利要求1所述的磷酸盐稳定的氯硝柳胺纳晶，其特征在于：步骤A-C中所述的搅拌速率为300-1000 rpm，步骤D中所述的旋蒸温度为35-42℃；步骤A中所述的乙醇和丙酮的混合溶剂比为2:1-1:2；步骤E中所述的高压均质压力为800-1200 bar，均质次数为10-40次。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的磷酸盐稳定氯硝柳胺纳晶在制备抗肿瘤药物的应用。
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