JPH06510024A - 医薬調合品及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 医薬調合品及び方法 本発明は生化学及び医学の分野に関し、そして特に、新規なリポソーム調合品及 び方法に関する。更に特に、本発明は免疫抑制剤シクロスポリンを含有するリポ ソーム調合品及びその製法に関する。本発明はまた減少した毒性を有するリポソ ームシクロスポリン調合品に関する。

シクロスポリンは新規な殺菌剤を確認する試みで研究者により１９７０年に発見 された。シクロスポリン（またシクロスポリンＡとして知られる）、有能な免疫 抑制剤は２系統の不完全菌類、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｐｏｎ　ＬｕｃｉｄｕｍＢ ｏｏｔｈ及びＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ　ｉｎｆｌａｔｕｍ　Ｇａｍ５から単 離された。

シクロスポリン類は本質的に類似の化学的及び物理的特性を有する疎水性、中性 の環状ペプチドである。シクロスポリンは代表的な例であり、かつ１２０１の全 分子量を有する７アミノ酸からなる。シクロスポリンはメタノール、クロロホル ム及びエーテルに可溶性でありそして本質的に水に不溶性である。これは専売ヒ マシ油及びアルコールに溶解された静脈調製品又はＬａｂｒｏｐｈｉｌ及びオリ ーブ油に溶解された経口調製品の何れかとして治療用に供される。

ツクロスボリンは主として同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｐｈｔ）患者を治療する ために使用されそして自己免疫病に対する実験に使用されている。この薬品は１ ９７８年の出現以来移植患者の生存率を大いに高めた。

シクロスポリンは非常にを用な免疫抑制剤であるが、これはまた二つとも移植受 容を確実にするために必要である長期間と高い投与量の両方で使用される時に極 めて毒性である。シクロスポリン治療に関連して最も厳しい副作用は薬品誘起腎 毒性である。血管間質毒性はシクロスポリン腎毒性の最も普通の形でありかつ単 −又は組合わせて生ずる三つの異なる形態的障害として表われる。

ツクロスボリン腎毒性に関連したこれらの形態的変化のすへてかシクロスポリン 毒性に特有ではないとしても、これが他のものと組合わされて観察されかつまた 対応する高いレベルの血清シクロスポリンがある場合には、その障害は多分はシ クロスポリン毒性の結果である。ある人は全血て２００〜５００ｎｇ／ｍｌ及び 血清で２０〜６０ｎｇ／ｍｌのトラフレヘルを示す治療投与量（５から１Ｏｎ＋ ｇ／　ｋｇ　／日）でこれらの悪い作用のあるものを示す。腎毒性はクレアチニ ンレベルで増加に続いて血清学的にモニタされる。クレアチニンレベルでのこの 増加は多分動脈収縮と閉塞の直接結果てあり、これは低い腎系濾過率、従って血 清クレアチニンの増加を生ずるであろう。

シクロスポリン治療に関連して別の悪い副作用がある。

これは移植の型式に応して異なる頻度て生ずる。これは心臓血管高血圧及び痙彎 、皮膚粗毛症、歯肉増生、下痢、嘔気、嘔吐、肝臓毒性、白血球減少症及びリン パ腫を含む造血の変性、呼吸困難及び副鼻腔炎の徴候を含む。

ツクロスボリンの静脈内移動に関連した別の副作用は静脈キャリアビヒクル、Ｃ ｒｅｍｏｐｈｏｒ−Ｅ　Ｌ　（Ｃｒ　ｅ　Ｌ　）によるものである。ＣｒｅＬは 親油性薬品を溶解するために使用される最良のイオン界面活性剤の一つであるポ リオキシエチル化ヒマシ油である。Ｃｒ　ｅＬ投与に関連した悪い作用の最も普 通のものは過敏症であり、これはヒスタミンの急速な放出から生じそして増大す る高血圧を引き起こす。これはまたシクロスポリン治療に関した腎毒性の一部か 腎管内にＣｒｅＬ沈着と結晶形成により高められると思オつれる。他の研究によ ればまた（：ｒｅＬで処理した動物では腎血流とクレアチニン浄化の両方で減少 か示された。リコン酸、ＣｒｅＬの一成分は血管収縮を引起こすことか示され、 これはまた高血圧及び減少した糸球体血流に結び付く。

投与の目的のためにリポソームの中に薬品を配合すること、従って毒性ヒマノ油 ビヒクルを排除することによりツクロスボリンの毒性を１）［除する試みがなさ れている。

リポソームは水と混合した時に閉した流体充填球体を形成する、一部には、リン 脂質から作られる顕微鏡的輸送ヘノクルである。リン脂質分子は極性であり、親 水性イオン化可能頭部と長い脂肪酸鎖からなる疎水性尾部を有する。従って、十 分なリン脂質分子が水と共に存在する時に、尾部は水を排除するように任意に結 合し、一方親水性ホスフニー１−頭部は水と相互作用する。この結果が２層膜て あり、そこでは脂肪酸尾部が新たに形成された膜内部て収束しそして極性頭部が 水性媒体の方へ反対方向に指向する。膜の一表面で極性頭部がリポソームの水性 内部の方へ指向する。反対表面では、極性頭部が周囲の水性媒体と相互作用する 。リポソームが形成するにつれて、水溶性分子か水性内部の中に配合されそして 親油性分子が脂質２重層の中に配合される傾向を示す。リポソームは多くの脂質 ２重層を分離する液体を有する、タマネギのような複ラメラ−又は全体に液体の 中心を取囲む単一２重層を有する単ラメラ−の何れかである。

使用できかつ種々の型式のリポソームを生ずる多くの型式のリポソーム製造技術 がある。用途、エントラップするつもりの化学品、及び２層膜を形成するために 使用される脂質の種類に応じてそれを選択できる。

最適のリポソーム調製品を製造する際に考慮しなければならないパラメータは他 の調節されたリリース機構のものと類似している。これは下記の通りである：（ １）化学品エントラップメントの高い百分率：（２）増大した化学的安定性、（ ３）低い化学毒性：（４）製造の迅速な方法、そして（５）再現し得る寸法分布 。

リポソームに化学品をカプセル化するため記載された第一の方法は複うメラーヘ シクル（ＭＬＶｓ）の製造を含んだ。このＭＬＶ法は適当な溶媒に脂質成分を溶 解すること、乾燥した脂質フィルムを形成するように溶媒の蒸発そして水性媒体 で脂質の水和を含む。形成される複ラメラーベシクルは一般に三つ以上の同心２ 重層を有する構造体である。溶媒層に薬品の共溶解により親油性薬品をＭＬＶｓ の中に配合し、一方親水性薬品は水和緩衝剤で２重層の間にエントラップされる 。水和の時間の長さを増加すること及び再懸濁脂質フィルムの緩徐を振とうによ り、脂質のモル当り高い比率の水性相が得られ、従って親水性薬品カプセル化を 高めることかてきる。水性緩衝剤の増大したエントラップメントはまた荷電した 脂質を使用することによって得られる。

リポソームはまた２μｍまでの直径を有し、しかし一般には１μｍ以下である単 ラメラーベシクル（ＵＶ　ｓ　）として形成できる。

単ラメラーリポソームを生ずるために使用される幾つかの技術かある。逆相蒸発 法を使用することによって大きな単ラメラーベシクルを形成できる。これは圧力 下リン脂質、緩衝剤及び過剰の存機溶媒の超音波処理乳濁液の有機層を除去する ことによって行なわれる。この技術は特に親水性分子、例えば、フェリチン、２ ５Ｓ　ＲＮＡ又は５Ｖ−４０ＤＮＡを含有する大容量の水性相をカプセル化する ために有用である。ＬＵＶ水性層の最大カプセル化（６５％）は水性緩衝剤のイ オン強度が低い場合（０，０１Ｍ　ＮａＣ１）に得られる：イオン強度が０．５ Ｍ　ＮａＣ１に増大するにつれてカプセル化は２０％に減少する。ＬＵＶｓの寸 法は脂質とコレステロール含量で変わる。ｌ：１モル比のコレステロールとリン 脂質から形成されたベシクルはエントラップされた容積に基づいて、０．４７μ ｍの平均直径及び０．１７〜０．８μｍの寸法範囲を有するベシクルの不均一な 寸法分布を形成する。コレステロールを欠く類似のリン脂質混合物から調製した ベシクルは０．１８μｍの平均寸法及び０．１〜０．２６μｍの寸法範囲を存す る。

溶媒注入蒸発法は技術の変化に応じて、大きい又は小さいＵＶｓの両方を生ずる ことができる。大きいＵＶｓを形成するために、リン脂質をジエチルエーテルに 溶解しそしてエントラップされ又は注入されるべき物質を含有する５５〜６５° Ｃに保った緩衝剤の中に注入する。この混合物を３０°Ｃて真空下に保つ。溶媒 を蒸発した時には、ベシクルが形成される。これらのベシクルの直径の範囲は０ ．２５〜Ｉμｍである。この工程は大きな分子のエントラップメントに十分に適 している。

種々の技術を使用して小さい単ラメラーベシクルをまた形成できる。エタノール にリン脂質を溶解することそして緩衝剤にこれを注入することによって、脂質は 単ラメラーベシクルに任意に再編成される。これは超音波処理により製造された ものに類似の内部容積（０，２〜０．５Ｌ１モル／脂質）を有するＵＶｓを生ず る簡単な方法を供する。ＭＬＶｓの超音波処理又は押出しくフィルターを通して ）はＯ１２μｍまでの直径を有するＵＶｓの分散を生じ、これは透明な又は半透 明な懸濁液として生ずる。

小さなＵＶｓを生ずる別の普通の方法は洗浄剤除去技術である。リン脂質をイオ ン性又は非イオン性洗浄剤、例えば、コラート（ｃｈｏｌａｔｅｓ）、トリトン Ｘ又はｎ−アルキルグルコシドの何れかに溶解する。次に薬品を溶解された脂質 −洗浄剤ミセルと混合する。次に幾つかの技術：透析、ゲル濾過、アフィニティ ークロマトグラフ、遠心分離、限外濾過の一つにより洗浄剤を除去する。この方 法で製造されたＵＶｓの寸法分布及びエントラップメント効率は使用した技術の 詳細に応じて異なる。またタンパク質をエントラップする時には、一度洗浄剤が 除去されると、タンパク質がその天然の生活性コンホメーションに復元する不確 かさがある。

リポソームの治療用途は遊離の形では通常には毒性である薬品の輸送を含む。こ のリポソーム形で毒性薬品は感受性の組織から離れて向いそして選択された区域 をターゲットとする。リポソームはまた長期間にわたって薬品を徐々に放出する ように治療上使用して投与の頻度を減することができる。更に、リポソームは静 脈輸送のため疎水性薬品の水性分散を形成する方法を供することができる。

リポソームか選択されたホスト組織に対してかつ感受性の組織から離れてカプセ ル化薬品をターゲットとするために使用される時には、幾つかの技術を使用でき る。

これらの工程はリポソームの寸法、その正味の表面電荷並びに投与の経路を操作 することを含む。更に特定の操作は身体内の特別な位置に受容体又は抗体を有す るリポソームをラベルすることを含む。

リポソ−ム形輸送の経路はまた身体中の分布に影響できる。リポソームの受動輸 送は投与の種々の経路の使用、例えば、静脈、皮下及び局所を含む。各経路はリ ポソームの局所化に差を生ずる。選択されたターゲット区域にリポソームを活性 に向けるために使用した二つの普通の方法はリポソームの表面に抗体又は特定の 受容体リガンドの何れかを結合することにある。抗体は対応する抗原に高い特異 性ををすることで知られそしてリポソームの表面に結合でき、従ってリポソーム カプセル化薬品のターゲット特異性を増大できることが示されている。

多くの薬品の化学組成により静脈投与が阻止されるので、リポソームは静脈輸送 に薬品を適合させるのに非常に有用である。シクロスポリンを含めて多くの疎水 性薬品は水をペースとした媒体に容易に溶解できずかつ生体内で毒性反応を起こ すことが示されるアルコール又は界面活性剤に溶解されねばならないのでこの範 ちゅうに入る。コレスロールと共に又はなしで、主として脂質からなるリポソー ムは非毒性である。更に、リポソームは両親和性分子から作られるので、これは その内部空間に親水性薬品そして脂質２重層に疎水性分子をエントラップできる 。

安定なリポソームキャリアに十分なシクロスポリンを、エントラップするために 主として当業者の無能力で行なわねはならない種々の理由て、治療上有効なシク ロスポリン挿入リポソーム製品は市販されていない。か（して高い比率の活性剤 を内部に配合することができかつ商業的用途に対して十分に安定である調合品を 含存するリポソームシクロスポリンを開発する特別な必要性があった。

本発明はこのような製品を供する。

発明の要約 生理学的に相和性の緩衝剤、好ましくは７．０から９．５、好ましくは７．５か ら９．１のｐＨを存する水溶液を用いて、負に荷電したリン脂質及びシクロスポ リンを含む固体脂質相を水和することによって安定な免疫抑制調合品を調製する 。この固体脂質相は有機溶媒にリン脂質とシクロスポリンを溶解することにより 形成できる。中性のリン脂質、例えは、ホスファチジルコリン、好ましくは１６ から１８の炭素脂肪酸直鎖から原則的に構成される脂質部分を有するものかまた この固体脂質相に含まれる。負に荷電されたリン脂質は好ましくはホスファチジ ルグリセロール、好ましくは１４から１８炭素脂肪酸直鎖から原則的に構成され る脂質部分を有するもの又はホスファチノック酸、例えば、ジステアロイルホス ファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、シミリ ストイルホスファチジルグリセロール、又はシミリストイルホスファチシック酸 である。

更に特に、凍結乾燥かない時てさえ、安定であるリポソ−ムシクロスポリン治療 用調合品を下記の工程からなる方法により調製する・ （ａ）（ｉ）ホスファチジルコリン、（ｉｉ）ホスファチジルグリセロール、ホ スファチシック酸及びこれらの混合物からなる群から選択された化合物及び（ｉ ｉｉ）シクロスポリンを有機溶媒に溶解して（１）対（１１）対（ｉｉｉ）のモ ル比が約７：７：０．０５から約７：３：２の範囲に及ぶ溶液を形成し、 （ｂ）このように形成された有機溶液を乾燥して固体脂、例えば、フィルム又は 粉末を形成し、 （Ｃ）約７．５から約９．５のｐｌを有する水溶液でこの固体脂を水和して安定 なリポソームシクロスポリン治療用調合品を形成する。

別の面では、本発明は約７．５から約９．１の範囲に及ぶｐＨを有する水溶液に 懸濁された、負に荷電した脂質及びシクロスポリン類、好ましくはシクロスポリ ンを含む治療用脂質組成物である。

本発明の好適な具体例でイよ、リポソームは０．２μｍ以下の直径を有する単ラ メラーベシクルである。更に、コレステロールが好ましくはホスファチジルコリ ンの５０モル％までの量でリポソームの中にまた配合できリポソーム膜に安定性 を加える。

本発明は新規な方法及び貯蔵で安定であり、治療上を効な量の活性成分を含存す るシクロスポリン挿入リポソーム調合品を供し、そして減少した毒性を有するリ ポソームシクロスポリン調合品を供する。本発明の方法はすボッ−ムシクロスボ リンの製造のため商業上実施できる方法を供する。

図面の簡単な説明 第１図はリポソーム調合品を測定するために使用した試験の結果を示すグラフで ある。

第２図はリポソーム調合品の種々の成分の濃度を測定するため使用した試験の結 果を示すグラフである。

第３図はリポソーム調合品中でＤＭＰＧのモル比を測定するために使用した試験 の結果を示すグラフである。

発明の詳細な説明 ここで使用される用語のリポソームは米国特許第４，７５３．７８８号及び第４ ．９３５．１７１号に記載されるような単ラメラーベシクル又は複ラメラーベシ クルを示し、その内容をここで参照として挿入する。ここで使用される用語のカ プセル化はリポソーム膜の中にシクロスポリンの配合を示す。

本発明の方法はリポソームが形成される溶液の調製で開始される。要約すると、 一定量のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及びシクロスポリ ンをイ「磯溶媒、好ましくはクロロホルムに溶解して溶液を形成する。この溶液 を例えば、回転蒸発器、噴霧乾燥器又は他の装置て蒸発させてフィルム又は粉末 のような固体脂質相を形成する。次にこのフィルムを約７．０から約９゜５の範 囲に及ぶｐＨを有する水溶液て水和してリポソーム分散を形成する。

好ましくは米国特許第４．９３５．１７１号に記載されるような薄膜蒸発装置を 使用して分散のかきまぜにより複うメラーリボ゛ノームを形成する。例えば、超 音波処理又はＧａｕｌｊｎホモジナイザー又はＦｒｅｎｃｈブレスのような均質 化装置の使用により脂質固体相の水性分散へせん断力の適用により単ラメラーベ シクルを形成する。エーテル注入、凍結及び融解、脂質から洗浄剤溶液を透析、 又はリポソームを調製するために使用される他の公知の方法を使用してせん断力 をまた適用できる。せん断力の継続を含めて種々の公知の技術を使用してリポソ ームの寸法を調節できる。好ましくは米国特許第４，７５３，７８８号に記載さ れる改修したＧａｕｌｉｎホモジナイザー装置を用いて、７０００から１３．０ ００ｐｓｉの圧力と脂質の大体のアグリゲー）・遷移温度の温度て２００ナノメ ートル以下の直径を有する単ラメラーベシクルを形成する。複ラメラ−又は単ラ メラーベシクルを形成するために脂質のかきまぜ又はせん断の方法は当業者に公 知でありかつそれ自体本発明の一部ではない。

ジステアロイルホスファチジルコリンは卵ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）は本 発明に使用のため好適なホスファチジルコリンである。好適なホスファチジルコ リンは大豆又は他の植物原料から得られるもの又は一部又は全体に合成であるも の、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンを含む。これらのすべては市 販されている。

本発明で使用に好適なホスファチジルグリセロールはジステアロイルホスファチ ジルグリセロール（ＤＳＰＧ）及びシミリストイルホスファチジルグリセロール （ＤＭＰＧ）である。使用に適している他のホスファチジルグリセロールはジラ ウリルホスファチジルグリセロール（Ｄ　Ｌ　Ｐ　Ｇ）を含む。これらのすへて は市販されている。

このホスファチジルグリセロールに代り、又はこれに加えて、シミリストイルホ スファチノック酸、ジステアロイルホスファチシック酸、及びジパルミトイルホ スファチシック酸を使用できる。この成分を約７：７：０．０５から約７：３２ 、最も好ましくは７：５：２の範囲に及ぶホスファチジルコリン対ホスファチジ ルグリセロール又はホスファチシック酸対シクロスポリンのモル比で溶液に好ま しくは配合する。７：５：Ｉから７：３：ｌのような他のモル比も実質上等価の 結果て使用できる。

好適な有機溶媒はクロロホルムであるが、エーテル、メタノール、エタノール及 び他のアルコールのような池の溶媒又は溶媒の組合わせも使用できる。

水和の目的のために好適な水溶液は緩衝溶液、例えば、７．８のｐＨを有するリ ン酸塩緩衝液（０，１４５Ｍ　ＮａＣ１，０、００３Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４，０， ００３５Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４）　（Ｐ　ＢＳ）である。

前記の方法に従って製造された調合品は高い百分率の・　シクロスポリン、６０ ％又はそれ以上をエントラップし、そして貯蔵で安定性であり、これはこの調合 品の治療用途を商業上実行可能にする。この調合品をまた凍結乾燥し、貯蔵しそ して効能を失うことなく再水和できる。遊離のシクロスポリンに対する投与量管 理法は医学実務者に周知であるので、哺乳類そして特に人間で免疫応答の抑制に 有効である本発明のシクロスポリン挿入リポソーム調合品の量は当業者には明ら かである。

前記の方式でシクロスポリンのカプセル化は存在する治療用調合品の毒性を減少 しかつその治療の効果を高める。

本発明は下記の例に関してより十分に理解されよう。

これは本発明の例示であることを意図し、これを限定するつもりはない。例１か ら例６は本発明のリポソームシクロスポリンの形成、及び化学的かつ生物学的試 験を詳回転蒸発技術を使用してツクロスボリンを含有する一連のリポソーム調合 品を調製し、そこでは脂質とシクロスポリンを有機溶媒（クロロホルム）に溶解 し、このように形成した溶液を回転蒸発器で乾燥した。次にこの乾燥したフィル ムを６．５から９．１のｐＨに緩衝された水溶液て水和して複ラメラーベシクル を形成した。７：５：２モル比でシクロスポリン粉末（Ｍ、Ｗ、＝１２０１）、 シミリスｊ・イルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ。

Ｍ、Ｗ、＝６８４）及び卵ホスファチジルコリン（Ｍ。

Ｗ、＝７８６）からシクロスポリン複ラメラーベシクル（シクロスポリン−ＭＬ Ｖｓ）を調製した。シクロスポリン、ＤＭＰＧ及び卵ＰＣの原料溶液をクロロホ ルムで調製した。１００ｍ１丸底フラスコ中にシクロスポリン原料溶液１．２０ ｍ１、卵ＰＣ原料溶液２．７５　ｍｌ及びＤＭＰＧ原料溶液１．．７０ｍ１を組 合わせることによってシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓを調製した。次に９５ｒ ｐｍでセットした３６°Ｃの水浴温度を有する回転蒸発器にこの丸底フラスコを 置くことにより有機溶媒クロロホルムを蒸発させた。

５２℃に加熱したｐＨ７，８の滅菌０．０１Ｍ　ＰＢＣ３，０ｍｌを薬品−脂質 フィルムを含有する丸底フラスコに加え、５２°Ｃにセラ！−１，た、加熱した 振りまぜ機に入れそして２０分間１２０　ｒｐｍで回転させた時にシクロスポリ ン−ＭＬＶｓか形成された。次に小さな滅菌磁気かきまぜ捧を丸底フラスコに加 えてホットプレートかきませ機上で約５〜１０分間低い熱（６０°Ｃ）でこれを 激しく（高いセツティング）かきませることによってフィルムを除去することを 助けた。このシクロスポリン−ＭＬＶｓを滅菌試験管に移した。ｐＨ７，８の滅 菌ＰＢＳを別に２．０　ｍｌ丸底フラスコに加えて残りのＭＬＶｓのフラスコを 洗った。

プールしたＭ　Ｌ　Ｖ　ｓを２０分間２９８７ｘｇで遠心分離し、上澄みを除去 しそしてＭＬＶペレットを滅菌ＰＢＳ、ｐＨ７，８，５，０ｍｌに懸濁させた。

ＭＬＶｓを２０分間２９８７ｘｇて遠心分離した。上澄みの除去後に、最終ＭＬ Ｖペレットを滅菌Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐＨ７，８，５，０ｍｌで再懸濁させた。

シクロスポリンの欠除以外、シクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓに対して記載した ものと同じ工程を使用してシクロスポリン−ＭＬＶｓと同時に空の−ＭＬＶｓ　 （Ｅ−ＭＬＶＳ）を調製した。この工程では下記の成分でリポソームを形成した 。

＃ｌ　ＤＭＰＧ　シクロスポリン　１０：１モル比＃２　卵ＰＣ：ンクロスボリ ン　１０．１モル比＃３　卵ＰＣニジクロスポリン　５０：１モル比リポソーム 試料の各々をメタノールで１＝３０に希釈しそして分光測光分析を使用し、４４ ，９００の吸光率を使用して２１４ｎｍて光学濃度（０，Ｄ、）を得ることによ ってシクロスポリンの濃度を測定した。

この結果を第１図に示し、ここではＩＯ：１モル比でＤＭＰＧ　シクロスポリン を含むリポソーム調合品がシクロスポリン０．５７ｍｇ／ｍｌをカプセル化し、 卵ＰＣで調合されたものより著しく高いことが判る。

例　２ 別のシリーズの複ラメラーベシクル試料、即ち、リポソームを例１に記載した方 法に従って調製した。これらの試料は下記の通りであった： ＃ｌ　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ　ニジクロスボリン　７：５・１モル比 ＃２　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ　ニジクロスボリン　３：３１モル比 ＃３　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ・シクロスポリン　５，３１モル比 このＭＬＶ試料をメタノールで１：３０に希釈し、そして分光測光分析を使用し 、４４．９００の吸光率を使用して２１４ｎｍて０．Ｄ、を得ることによってシ クロスポリンの濃度を測定した。

分光測光分析の結果を第２図に示し、ここでは７：５１比て卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ 　ニジクロスボリンを含むＭＬＶｓが０．６３ｍｇ／ｍｌシクロスポリンをカプ セル化し、他のモル比で同一の組成のものより著しくより高いことＤＭＰＧの濃 度を変えて、例１に記載した方法に従って別のシリーズの複ラメラーベシクルを 調製した。試料は下記の通りであった。

＃１　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ　ニジクロスボリン　７５：１モル比 ＃２　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ　ニジクロスボリン　７：７：１モル比 ＃２　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ・シクロスポリン　７３１モル比 ＃４　卵ＰＣ：ＤＭＰＧ・ツクロスボリン　７：ｌ：１モル比 この試料をメタノールで１３０に希釈し、前記の例におけるようにシクロスポリ ンの濃度を測定した。分光測光の結果を第３図に示し、そこては７：５：１の卵 ＰＣ：　ＤＭＰＧ　ニジクロスボリンモル比を有するＭ　Ｌ　Ｖ　ｓがより低い 又はより高い量てＤＭＰＧを含有するＭＬＶＳより著しく多量のシクロスポリン （０，９９ｍｇ／ｍｌ）をカプセル化することが判る。

例　４ 例１に記載した方法に従って別のシリーズのＭ　Ｌ　Ｖ　ｓを調製した。このシ リーズではシクロスポリンの量を下記の通り変えた： ＃ｌ　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ　ニジクロスボリン　７．５：１モル比 ＃２　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ　シクロスポリン　７：５：２モル比 ＃３　卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ　ニジクロスボリン　７．５二０．５モル比 前記の試料をメタノールでｌ：３０に希釈し、そして分光測光分析を使用し、４ ４．９００の吸光率を使用して２１４ｎｍてＯ，Ｄ、を得ることによってシクロ スポリンの濃度を測定した。

この分析結果を第１表に示す。判るように、カプセル化されたシクロスポリンの 量はすべての三つのモルレベルで本質上同一であった。

第１表 シクロスポリンの種々のモル比でカプセル化脂質　：　０．Ｄ、　全ノクロ　回 収された　カプセル化薬品比　＠２１４ｎｍｌ＃リン　ツクロスボリン　百分率 ７：５：０．５　０．３６　０．６ｍｇ　０．２６ｍｇ　４３　％７：５：ｌ　 Ｏ，７８１，２ｍｇ　０．５７ｍｇ　４７　％７：５：２　１．３８　２．４ｍ ｇ　１．０］ｍｇ　４２　０１例１に記載した方法に従って別のシリーズのリポ ソームを調製した。このシリーズでは、すべてのリポソーム（こ７：５二２　１ ｆｌＰｃ：ＤＭＰＧニジクロスボリンボリン比を使用した。しかしながら、水和 緩衝剤ｐＨを６．５から９．１の数値の間で変えた。

次にこの試料をメタノールで１３０に希釈しそして４４．９００の吸光率を使用 して２１４１ｍで分光測光分析により再びシクロスポリンの濃度を測定した。

結果を第２表に示し、ここでは％薬品回収に関して最良の緩衝剤ｐＨか７．８で あるが、満足すべき結果が７．２から９．１の範囲のｐＨ値で得られることが判 る。

第２表 カプセル化効率に関してｐＨの影響 ｐＨ６，５７，２７，５７，８８，２９，１％ツクロスボリン カプセル化　２８．７　６６．０　７１．７　８８．０　７７．０　−７２．３ （最初の薬品の回収） ％標準偏差　５．５　３．０　２．９　６．０　３．０　２．０前記の例に記載 した結果から、７：５・０．０５から７：５：２モル比て卵ＰＣ：　ＤＭＰＣニ ジクロスボリンを含むリポソーム調合品が従来の調合品より形成の工程の間シク ロスポリンをカプセル化することでずっと更に作動であることが明らかである。

最適の結果に対して、水和か約７．０から約９．５、好ましくは７．８のｐＨを 有する媒体中で行なわれることが必須である。

本発明の調合品の安定性を下記の例により示す。

例　６ シクロスポリン−ＭＬＶｓを新たに調製し又は凍結乾燥に続いて再水和した時に シクロスポリンＭＬＶ結合に関して種々の時間に対して（２時間、２４時間、４ ８時間）異なる温度（４°Ｃ１２５°Ｃ及び３７°Ｃ）の効果を示すためにこの 実験を使用した。前記の回転蒸発の技術を使用して７：５：２　卵ＰＣ：　ＤＭ ＰＧ　ニジクロスボリンのモル比てシクロスポリン挿入Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓを調製し た。

水和緩衝剤はＰ　Ｂ　Ｓ、　ｐＨ７，８てあった。水和に続いて、Ｍ　Ｌ　Ｖ　 ｓを５ｎ＋１シリンジ中で０５０−８０セフアデツクスカラム」二に層化しそし て１０分間２５０　Ｏｒｐｍで遠心分離した。これはツクロスボリン挿入ＭＬＶ ｓから未カプセル化シクロスポリンを分離するために行なった。

遠心分離に続いて、シクロスポリン−ＭＬＶペレットをＰＢＳ、ｐＨ７，８に再 懸濁させそして約９ｍｌの全容量を生ずるようにプールした。このプールした試 料を紫外線吸収分光測光によりツクロスボリン濃度に対して調へた。

全試料容量を各４．５　ｍｌの２部分に分割した。一部分を更に三つのアリコー トに細分割した（アリコート当り１．５ｍ１）。他の部分を少なくとも２時間− ７０°Ｃに凍結し、次に凍結乾燥した。

新しいシクロスポリン−ＭＬＶｓを含有する未凍結アリコート（各１．５　ｍｌ ）を４°Ｃ１２５℃（室温）又は３７°Ｃの何れかでインキュベートし、そして 試料（０，５ｍｌ）を２時間、２４時間及び４８時間で各温度条件から取出した 。取出して各試料を５ｍｌシリンジでセファデックスＧ５０−８０カラムを通し て遠心分離し、シクロスポリン−ＭＬＶベレットを再懸濁しモしてシクロスポリ ン濃度に対して分析した。

凍結乾燥したシクロスポリン−ＭＬＶｓを十分な滅菌脱イオン水て再水和して調 製品を元の容量に戻した。この再水和した物質をシクロスポリン濃度に対して分 析しそして次に三つの１．５　ｍｌアリコートに分割し、これを４°Ｃ１２５° Ｃ（室温）又は３７°Ｃで貯蔵した。試料（０，５ｍ１）を２時間、２４時間及 び４８時間の後に各貯蔵状態から取出し、５ｍｌシリンジ中のセファデックスＧ ５０−８０カラムを通して遠心分離しそして各シクロスポリンーＭＬＶペレット を再懸濁させかつシクロスポリン濃度に対して分析した。結果を第３表及び第４ 表に要約する。

新しいシクロスポリン−ＭＬＶｓ 貯蔵　時間　濃　度　最初の薬品 温度　（ｍｇ／ｍｌ）　１１１度の％ ４°Ｃ２ｈ　Ｏ，５５８０％ ４°Ｃ２４ｈ　Ｏ，５６８１χ ４°Ｃ４８ｈ　Ｏ，５６８１％ ２５℃　ＯＯ，６９ ２５°Ｃ２ｈ　Ｏ，４５６５］； ２５°Ｃ２４ｈ　Ｏ，４８７０％ ２５°Ｃ４８ｈ　Ｏ，４８７０％ ３７°Ｃ００，６９ ３７℃　２ｈ　Ｏ，４５６５％ ３７°Ｃ２４ｈ　０．４８　７０％ ３７℃　４８ｈ　Ｏ，２３３３％ 第４表 凍結乾燥しかっ再水和したシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ貯蔵　時間　濃　度 　最初の薬品 温度　（ｍｇ／ｍｌ）　濃度の％ ４℃　２ｈ　Ｏ，５０８５％ ４℃　２４ｈ　Ｏ，４９８３％ ４℃　４８ｈ　Ｏ，４３７３％ ２５°Ｃ００，５９ ２５°Ｃ２ｈ　Ｏ，４４７５％ ２５℃　２４ｈ　Ｏ，４５７６％ ２５℃　４８ｈ　Ｏ，４４７５％ ３７°ＣＯＯ，５９ ３７°Ｃ２ｈ　Ｏ，４３７３％ ３７℃　２４ｈ　０．４０　６８％ ３７℃　４８ｈ　０．２６　４４％ このデータは新たに調製した及び凍結乾燥し、再水和したシクロスポリン−ＭＬ Ｖｓの両方に対して類似の結果を示し、凍結乾燥しそして再水和の工程がＭＬＶ ｓとシクロスポリンの結合を著しく変えないことを示す。両型式の調製品は試験 しだすへての温度で２時間のインキュヘーション後若干の薬品損失を示した。し かしなから、調製品を２時間４°Ｃて貯蔵した時に、ＭＬＶｓとシクロスポリン の結合（１５〜２０％の薬品損失）は２５°Ｃ又は３７°Ｃの何れかで（２５〜 ３５％の薬品損失）より良好であった。

安定でありかつ最適の薬品カプセル化を示すシクロスポリン−ＭＬＶ調合品を調 製することで、種々の脂質、そのモル比が水和緩衝剤のｐＨを含めて幾つか要因 を調へた。シクロスポリンは疎水性分子でありかつリポソーム内の水性空間より むしろ脂質膜に配合されるので、ベシクル当りの脂質容量を最大にするために最 初の実験に複ラメラーベシクルを選択した。

シクロスポリンと−っの脂質を使用して、最初の研究を行なった。ＤＭＰＧ　ニ ックロスボリンＭ　Ｌ　Ｖ　ｓは卵ＰＣニジクロスボリンＭＬＶｓより著しく高 いカプセル化を示した。これはその遷移温度、大体２３°Ｃ（室温）でＤ　Ｍ　 Ｐ　Ｇの可撓性によるものであり、これはリポソーム２重層の中にシクロスポリ ンのような大きな分子を適合させることかできる。非水素化卵ＰＣを使用したが 、その理由は合成脂質と異なって卵ＰＣは各々異なる鎖長を存する一つ以上の脂 質を含むからであり、これはまたリポソーム２重層内に大きなシクロスポリン分 子を適合させることをまた助ける。

脂質、卵ＰＣ及びＤＭＰＧの種々の組合わせを使用してリポソームヘシクロスポ リン配合を最適にしかつＭＬＶｓからのその漏出を最小にする時に、卵ＰＣ：　 ＤＭＰＧニジクロスポリンの７：５：Ｉのモル比が最高量の薬品カプセル化を示 した。これは適正な比率で両脂質の性質か増大したカプセル化効率に寄与するこ とを示唆する。

リポソーム膜中て負に荷電したＤＭＰＧとシクロスポリンの結合を更に調へるた めに、研究者はシクロスポリンリポソーム結合に関して水和緩衝剤ｐｌを変える 効果を試験した。最大のカプセル化は０．１５Ｍ　ＰＢＳ、　ｐＨ７゜８で観察 され、この数値の上下にｐＨを修正するとカプセル化効率は更に変わる。６．５ から９．５の間のｐｌを有する水和緩衝剤を使用すると、２５からたかだか８８ ％の範囲に及ぶ薬品回収を生ずる。

脂質対薬品比を減少するようにリポソーム調合品のシクロスポリンの増加量を使 用して最終の調合品研究を行なった。これらの研究はシクロスポリンのモル比で ２倍増加（７：５：２モル比、卵ＰＣ：　ＤＭＰＧ　ニジクロスボリン）はリポ ソームに回収された最初の薬品の百分率で変わらなかった。これはより少ない脂 質で多くのシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓか作られ、一定量のカプセル化薬品 を生ずるために必要なコストと時間を減少するので重要である。

本発明のシクロスポリンリポソーム調合品の治療上の効率を測定するために試験 を行なった。

材料と方法を下記の欄に記載しそして試験を例７〜１２に詳述する。

マウスの処理のための薬品調合品の調製９５％エタノール０．１ｍｌと共にＣｒ ｅｍｏｐｈｏｒ−ｅＬ　１．　Ｏｍｌ中にシクロスポリン粉末１２ｍｇを溶解し そして次に５０°Ｃに加熱することによって遊離のシクロスポリン（シクロスポ リン−ＣｒｅＬ）を調製した。シクロスポリンが溶解した後に、５５°Ｃに加熱 した滅菌０．１５Ｍ　ＰＢＳ。

ｐＨ７，８，１，９ｍｌを溶液に加え、４ｍｇ／ｍｌのシフ０スポリン濃度を生 じた。使用したＰＢＳは下記の組成を有した・０．００２８Ｍリン酸モノナトリ ウム、０．００７２Ｍリン酸ジナトリウム及びＯ，１４５Ｍ塩化ナトリウム。更 にこの溶液をＰＢＳて希釈して２．０ｍｇ／ｍｌの最終シクロスポリン濃度を生 した。２．０ｍｇ／ｍｌシクロスポリン溶液１、０　ｍｌに滅菌０．１５Ｍ　Ｐ ＢＳ、ＰＨ７，８，９，０ｍｌを加えて０．２ｍｇ／ｍｌのシクロスポリン濃度 を生ずる。マウスに必要とされる投与量は異なるので次に三つの異なる濃度のシ クロスポリン溶液を調製し、そしてすへての処理に対して注入物質の容量を類似 に保つことが必要であった（０．１から０．２　ｍｌ）。

例１の第２パラグラフに麦載したようにシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ及びＥ ＭＬＶｓを調製した。薬品をメタノールとテ１へラヒドロフラン（ＴＨＦ）　、 ｖ／ｖ、１　：Ｉに溶解した時にＢｅｅｒｓ　−Ｌａｍｂｅｒｔ式と２３８ｒ＋ ｍでシクロスポリンに対する吸光率を使用することによって例７〜１２てシクロ スポリン−ＭＬＶ懸濁液中でシクロスポリンの濃度を測定した。無水メタノール １．４　ｍｌを含む試験管にシクロスポリン−ＭＬＶ試料０．１ｍｌを加えるこ とによってシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓからシクロスボリンを抽出した。こ の試験管に約１０秒開局を起こし、Ｔ　ＨＦ　１．５　ｍｌを加えそして溶液に 再び渦を生じさせた。Ｅ−ＭＬＶ試料を同様に処理した。この抽出工程はシクロ スポリン−ＭＬＶ試料の１＝３０希釈を生じそして２３８ｎｍで分光測光で分析 し、Ｅ−ＭＬＶ試料の１：３０希釈と対照した。シクロスポリン濃度を測定した 後に、シクロスポリンの１から２ｍｌアリコートをＲｅｖｃｏフリーザーで一７ ０°Ｃに徐々に凍結した。試料が完全に凍結した時に、これを凍結乾燥しかつ一 ２０°Ｃて貯蔵した。使用前に、これを滅菌蒸留水に再懸濁させ、１０分間３７ °Ｃに加熱し、そしてシクロスポリン濃度に対して再分析した。

必要に応して、この試料を滅菌Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐＨ７，８で希釈して注入のため 適当な濃度を得た。

シクロスポリン処理のための動物モデルこの実験で使用したマウスはＣ５７ＢＬ ／６Ｊ、雌マウス、８から１６週令であった。治療管理に応じて、異なる時に、 種々の投与量のシクロスポリン−ＭＬＶｓ及びシクロスポリン−ＣｒｅＬでマウ スに静脈内に接種した。犠牲の口に、心臓穿孔又は眼窩後放血により血液を無菌 的に取出した。血清を回収しそして後の血球凝集分析と血液尿素窒素（ＢＵＮ） 測定のため一２０°Ｃに貯蔵した。若干の腎臓を取出し、０．１５Ｍ　ＰＢＳで 希釈した、１０９６ホルマリン溶液、ｐＨ７，３で固定しそして切片にするまて ４°Ｃて貯蔵した。牌臓も無菌的に取出しそして滅菌組織モホソナイサーで均質 化した。各処理群からの牌臓ホモシエ不−１・をプールし、ＲＰＭＩ　１６４０ て６．　Ｏｍｌに希釈しそして１５ｍ１滅菌円錐遠心分離管中のＮｅｕｔｒｏｐ ｈｉｌ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　４．　Ｏｍｌ上に層化した。この 材料を１８〜２０°Ｃて３０分間２２５　Ｘｇで遠心分離した。分離したリンパ 球帯域をＮ１Ｍグラディエンドから取出しそしてＲＰＭＩ　６．Ｏｍｌて希釈し た。この帯域中の細胞を９分間１２５Ｘｇて遠心分離し、上澄みを廃棄し、ペレ ットをＲＰＭＩ　６．Ｏｍｌに再懸濁させ、再び９分間１２５　Ｘｇで遠心分離 した。上澄みを再び廃棄しそして最終ペレットをＲＰＭＩ　１．Ｏｍｌに再懸濁 させた。

ヘマトサイトメーター計数室を用いて０．１％Ｔｒｙｐａｎブルーて染色した細 胞を数えることによってこの最終ペレットの細胞濃度と生存率を測定した。この 濃度を完全なＲＰＭＩ（１０％新生子牛血清、２％ペニシリン−ストレプトマイ シン及びグルタミンを有するＲＰＭＴ）で５×１０６細胞／ロ１１に調節した。

次に修正したＪｅｒｎｅプラーク分析およびＴ−リンパ球胚子発生分析のために この細胞懸濁液を使用した。

Ｋｅｎｎｅｄｙ分析　修正したＪｅｒｎｅプラーク分析モルモットの補体をマグ ネシウム塩水で希釈することによってこの補体の１５希釈を調製した：マグネシ ウム塩水て１：１０に５ＸｌＯ＠細胞懸濁液を希釈することによって５ＸＩＯ’ 　リンパ球懸濁液を作製した。補体ｌ　５希釈１．０　ｍｌと２９６ｓＲＢＣ１ ，Ｏｍｌを混合することによって補体の１１０希釈を含有する１％羊赤血球細胞 （ｓＲＢＣ）懸濁液を調製した。

９６ウ工ル平底組織培養皿てＫｅｎｎｅｄｙ分析（Ｋｅｎｎｅｄｙ１９７１）を 設定しそして一定の処理群からの各リンノく球試料を３重に試験した。各ウェル に完全なＲＰＭＩ組織培地中でリンパ球懸濁液０．１ｍｌ　（５ｘ　ｌ　Ｏ’細 胞／ｍｉ）、１：１０補体を有する１％５ＲＢｃ０．０５ｍ１及び完全なＲ，Ｐ ＭＩ　Ｏ，１ｍｌを加えた。対照ウェルのあるものはリンパ球懸濁液０．１ｍｌ 、コンブリメントなして１％５ＲＢｃ０．０５ｍ１及び完全なＲＰＭＩ　Ｏ，１ ｍｌを含有した。一つのウェルて１％５ＲＢｃ０．０５ｍ１と完全なＲＰＭｌ　 Ｏ，２ｍｌを混合することそして別のウェルでＲＰＭｌ　０．２ｍｌど１：１０ 補体を有する１％５ＲＢｃ０．０５ｍ１を混合することによって二つの別の対照 ウェルを調製した。培養皿を次に湿性環境（湿ったペーノく一タオルで裏打ちし たトレー）に入れそして１．２５時間４°Ｃてインキュへ一トシた。次にこの培 養皿を２０分間室温に置きそして３７°Ｃ１５９６ＣＯ２／　９５％空気インキ ュベーターで１．５時間培養した。最後のインキュベーションに続いて、４００ 倍のインバーテツド顕微鏡で各ウェル中のプラークを数えることによりプラーク 形成を査定しそして各試料に対して三つのウェルてプラークの数を平均した。

結果をプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）／１０’細胞として報告する。

Ｔ−リンパ球ＰＨＡ刺激及び走化性分析Ｔ−ＩＪンバ球の胚発生を９６ウエル、 丸底組織培養皿て行なった。各ウェルに各処理群から調製した、５ＸＩ０６細胞 ／ｍｌリンパ球懸濁液（Ｋｅｎｎｅｄｙ分析のために単離した）　０．１　ｍｌ を加えた。各処理群からの細胞懸濁液試料を２重に行なった。試験ウェルの各々 に、ＲＰＭＩ１６４０で希釈したフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）の９００　 ｕｇ　／ｍｌｍｌ溶液０．１及ｌ完全なＲＰＭＩ　１６４０．０．０５　ｍｌを 加えた。対照ウェルはリンパ球懸液０゜１ｍｌと完全なＲＰＭＩ　Ｏ，１５ｍ１ を含んだ。次に組織培養皿を５％ＣＯ２／９５％空気、３７°Ｃインキュベータ ーで６０時間培養した。３７°Ｃ培養時間の後に、各ウェルからの材料をマイク ロフユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管の中にピペットで入れそして１０分間８３ ２０　Ｘｇで遠心分離した。この遠心分離から各上澄みを別のマイクロフユージ 管の中にピペットで入れそしてこれを走化性分析で使用するまで一２０°Ｃに凍 結して保った。

顕微鏡スライドを２時間Ｉ：１比の３ＭＨＣｌと９５％エタノールで酸洗浄し、 脱イオン水で水洗しそして５分間０．５％ゼラチンに浸漬して負の電荷を減した 。このスライドを最後に蒸留水で洗浄しそして風乾にまかせた。

蒸留水５０ｍ１にアガロース１．Ｏｇ及びゼラチン０．２５　ｇを溶解すること によってスライドのだめのアガロースを調製した。この調製品をオー１〜クレー プに入れ、４７℃に冷却し、加温したＲＰＭＩ　１６４０．５０ｍ１と混合しそ してこの溶液約３ｍｌを各ガラススライド上にピペットで入れた。アガロースが 固化した後に、各スライドのアガロースで３ウエルの列を作った。

マクロファージはこの勾配の混合リンパ球帯域で局所化するのてＮ１Ｍ分離技術 を使用し非薬品処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの牌臓ホモジネートからマクロファ ージを分離した。次にリンパ球／単球懸濁液を完全なＲＰＭｌ　１６４０て３Ｘ １０７細胞／ｍｌに調節した。次に各スライド上のアガロース中の三つのウェル に下記の通り充填した：中心ウェルに３Ｘ１０７細胞／ｍ１１５μ！、外側のウ ェルにＲＰＭＩ　１５μ！そして他の外側のウェルに胞発生上澄み試料１５μ１ ０このスライドを滅菌湿性化室（湿った滅菌フィルターで裏打ちした滅菌ペトリ 皿）に入れそして１８時間５％ＣＯ２／９５％空気、３７°Ｃインキュベーター で培養した。インキュベーション後、３０分間無水アルコールに、次に３０分間 ３７％ホルムアルデヒド、ｐＨ７，３に浸漬することによってこのスライドを固 定し１次にアガロースをスライドから注意深く除去した。このスライドをＷｒｉ ｇｈｔ　５ｔａｉｎで染色しそしてマイクロプロジェクタ−でこれらを調べそし てウェルの縁から細胞移動を測定することによりマクロファージ移動を評価した 。

５ＲＢＣ刺激マウスから血清の血球凝集分析各マウスから得た血清試料を使用し て０．１５Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７，３で２倍続きの希釈（１：１から１　：１０２ ４）を調製した。９６ウエル、丸底組織培養皿てこの分析を行なった。各試験ウ ェルに０．５％５ＲＢｃ０．０５ｍ１（ＩＸＩＯ＠細胞／ｍ１）及び血清試料０ ．０５ｍ１を入れ：対照ウェルは０．５％５ＲＢｃ０．０５ｍ１及びＯ，１５Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７，３，０，０５ｍｌを含有した。このプレートを振とう機に置き そして１０分間＋　００　ｒｐｍで回転し、続いて室温で１時間培養した。４０ ０倍のインバーテツド顕微鏡てウェルを調へることによって各試料に対する血球 凝集価を測定した。

ＬＰＳ刺激マウスから血清の血球凝集分析リポ多糖類（ＬＰＳ）と結合した５Ｒ ＢＣ懸濁液をＡｎｄｅｒｓｓｏロ　（１９７１）に記載されるように調製した。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉからのＬＰＳを１．０　ｍｇ ／ｍｌの濃度で滅菌０．１５Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７，３、に溶解した。次にこのＬ 　Ｐ　Ｓ　（３，０ｍｌ、）を２時間ガラスネジキャップ管で沸騰させた。加熱 後、このＬＰＳを水浴で３７℃に冷却し、パックした５ＲＢｃ１．０ｍｌをＬＰ Ｓに加え、続いて４５分間３７℃で別にインキュベーションを行なった。

次に５ＲＢＣ−ＬＰＳ混合物を０．１５Ｍ　ＰＢＳＳｐＨ７゜３、で３回洗浄し そして１ｘ１０７細胞／ｍｌに希釈した。

０．１５Ｍ　ＰＢＳ、ＰＩ（７，３、で１：１からｌ：２０４８まて各試料の２ 倍希釈を行なうことによりこの分析のための血清試料を調製した。前記のように 分析を行なったが、但し５ＲＢＣ−ＬＰＳ懸濁液を０．５％５ＲＢＣの代わりに 用いた。

シクロスポリン処理に続いてマウス腎臓の組織学４°Ｃて少なくとも緩衝された ホルマリン中でセツティング後に、腎臓を下記の通り更に固定した＝７０％エタ ノールに２時間、８０％エタノールに１．５時間：９０％エタノールに１．５時 間、１００％エタノールで各々１．５時間の３インキュヘーション；脱水剤で各 々１．５時間の２インキユヘーシヨンそしてパラフィンで各々１．５時間の３イ ンキュベーション。腎臓をパラフィンに埋め込みそして６μｍの切片を得た。こ の切片を下記の通り染色した：各回２．５分間脱水剤中で２浸漬、各回２分間１ ．００％エタノールに２回、２分間９５％エタノール、２分間７０％エタノール 、水洗、２．５分間へマドキシリンに酸−アルコールで洗浄、アンモニウム水に １０回浸漬、水洗、１．５分間エオシン染色、９５％エタノールに１０回浸漬、 １００％エタノールに２回そして脱水剤で２回。

１００倍及び４００倍で切片をＩｆｆ微鏡で調へることによって腎毒性に対して 腎切片を評価した。

シクロスポリンの生体外抗菌効果 ３種のコウジカヒ属、Ａ、ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、　Ａ、ｆｌａｖｕｓ及びＡ。

ｎｉｇｅｒ及び酵母ｃｒｙｐｔｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓをこの研究の この部分て使用した。これらの培養菌はＣａ１ｉｆｏｒｎｉａ　５ｔａｔｅＰｏ ｌｙｔｅｃｎｉｃυｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｐｏｍｏｎａ、微生物学培養菌コレ クションからのものでありそして各々実験室系統＃３８５、＃３５９、＃３６０ 及び＃６０８と名付けられた。

これらの有機体を成長させるための培地は５ａｂｏｕｒａｕｄ（ＳＡＢ）デキス トロース肉汁及びＳＡＢデキストロース寒天（１，５％）であった。これらの研 究で使用した４種の菌をＳＡＢ寒天スラント上に保った。胞子を試験に回収する 前にコウジカピ培養菌を６日間にわたって各４８時間毎に移した。滅菌０．８５ ％塩水１．５ｍｌでスラントを洗浄することによって胞子を回収した。ヘマトサ イトメーター計数室を使用して胞子を数えそして胞子の数を０．８５％塩水でｌ Ｘｌ０”胞子／ｍｌに調節した。回収前に６日間にわたって各４８時間毎にＣ， ｎｅｏｆｏｒｍａｎｃｅ酵母細胞をまた移した：しかしながら、ＳＡＢ肉汁を使 用してこの細胞を回収した。ヘマサイトメーター計数室を使用して酵母細胞をま た数え、そして細胞の数をＳＡＢ肉汁中でｌＸｌ０’細胞／ｍｌに調節した。

シクロスポリン−ＣｒｅＬ及びシクロスポリンＭＬＶＳの抗菌活性を測定するた めに、ＳＡＢプレートに下記の通り薬品処理胞子（又は酵母細胞）を接種した； １×】０コ胞子／ｍｌ懸濁液０．１５ｍ１を適当な濃度のシクロスポリン−ＭＬ Ｖｓ又はシクロスポリンーＣｒｅＬ　（１μｇ、５μｇ、１０μｇ又は２００μ ｇ）と試験管中で混合しそして各管で０．５　ｍｌの最終容量を得るように、異 なる薬品濃度を含む各管に十分なＳＡＢ肉汁を加え：次にすべての管を旋回させ そして別のＳＡＢプレート上に注入し二滅菌わん曲ガラス棒て均一に展開し；３ ７°Ｃて３６時間のインキュベーション後に、コロニーヲ数工そしてその直径を 測定した。

Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ内のシクロスポリンのカプセル化がその抗菌生体外活性を変える かどうかを測定するために酵母Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎ ｓ及びカビ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ　１ｕｓｆｌａｖｕｓ、　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ及 びｎｉｇｅｒ上のシクロスポリン−ＭＬＶｓ及びシクロスポリン−ＣｒｅＬの生 体外抗菌活性を比較する研究を行なった。カプセル化（シクロスポリン−ＭＬＶ ）及び未カプセル化（シクロスポリン−ＣｒｅＬ）の両方は３６時間のインキュ ベーション後に生体外てＣ，ｎｅｏｆｏｒｍａｎｃｅコロニーの数を阻害した。

シクロスポリン１μｇの濃度が酵母を５０％だけ阻害しそしてシクロスポリン− ＣｒｅＬＩμｇは対照の未処理試料と比較して６５％たけ数を減した。シクロス ポリン−ＭＬＶ又はシクロスポリン−ＣｒｅＬｉ１度を増加すると（５μｇ、１ ０ｇｇ及び２００μｇ）、対照の未処理試料に対する１０６のコロニー数と比較 して、ツクロスボリン−ＭＬＶｓに対して３８、ＩＯ及び２そしてシクロスポリ ン−ＣｒｅＬに対して３．３及び０のコロニー数で更に減少があった。シクロス ポリンはまたＣ、　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｃｅのコロニー寸法に影響した。ｌμｇ はとの低い濃度てさえ酵母をシクロスポリン−ＣｒｅＬに露出すると、対照の未 処理試料に比較して８７％の寸法の減少かあった。シクロスポリン−Ｃｒ　ｅＬ ５μｇ又は１０ｇｇを使用した時に酵母コロニー寸法の類似程度の阻害が見られ た：酵母に薬品２００μｇで攻撃した時には検出可能な酵母は見られなかった。

対照的に、種々の量のシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓの存在で酵母コロニー寸 法の阻害は投与量応答を示した：　ｌ１１ｇ、５μｇ、１０μｇ及び２０Ｌ４／ 、ｇでコロニー寸法は対照と比較して各々３３％、６７％、８０％及び９３９も てあった。

何れの形ても、ツクロスボリンはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ、の数を減し なかったか、しかしながら、Ａ、ｆｌａｖｕｓ、Ａ、　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ及び Ａ、ｎｉｇｅｒのコロニー寸法を阻害する。

シクロスポリン−ＭＬＶｓは対照の未処理培養に比較して５０％、７８９６．９ ２％及び９６％たけｌμｇ、５μｇ、ＩＯμｇ及び２００μｇの濃度てＡ、ｆｌ ａｖｕｓのコロニー寸法を減じた。しかしながら、シクロスポリン−ＣｒｅＬは 対照と比較して、１μｇ％に対して６０％、５μｇに対して８５％、１０ｇｇに 対して９６％そして２００μｇに対して９８％だけコロニー寸法を減するので、 シクロスポリン−ＭＬＶｓよりＡ、ｆｌａｖｕｓのより著しい阻害を示した。

シクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓはＩｎ２の濃度てＡ、　ｆｕｍｉｇａｔｕｓの コロニー寸法を阻害しなかったが１０ｇｇ及び２００μｇではこの薬品は対照と 比較して各々４０９６及び９６％たけ菌を阻害した。対照的に、シクロスポリン −ＣｒｅＬは５μｇてＡ、　ｆｕｍｉｇａｔｕｓのコロニー寸法を阻害し、並ひ にＩＯμｇ及び２００μｇのより高い投与量では、未処理対照と比較して、各々 ３０％、８０％及び９６％の減少であった。

Ａ、ｎｉｇｅｒのコロニー寸法はシクロスポリン−ＭＬＶｓ及びツクロスボリン −Ｃｒ　ｅＬの両方により減少した。

シクロスポリン−ＮＩＬＶｓは１μｇ、５μｇ、ｔｏμｇ及び２００μｇの濃度 で各々、対照と比較して、３７９４．７５％、７５９６及び９７．５９６たけコ ロニー寸法を減した。

シクロスポリン−ＣｒｅＬは未処理対照と比較して各々１μｇ、５μｇ及び１０ ｇｇか８７，５％、８７．５％及び９２、５９６たけコロニー寸法を減したので より大きな阻害を示した。２００μｇでは、菌成長の阻害は薬品の両型式に対し て匹敵し得るものであった。

これらのデータはＭＬＶｓの中にシクロスポリンのカプセル化は１０ｇｇ又はそ れ以下の用量で投与された時には特定の菌に対して遊離の薬品の生体外抗菌効力 を減することを示す。より高い薬品レベル（即ち、薬品の何れかの形の２００μ ｇ）は匹敵し得る生体外抗菌活性を７クロスポリンーＮ・（ＬＶｓ及びシクロス ポリン−ＣｒｅＬか生体内で匹敵し得る免疫抑制活性を有するかどうかを調−＼ るために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ７ウスを５ＲＢＣのＴ−依存抗原Ｐｉ撃に関連して 薬品の何れかの形で処理した。この抗原に対するこれらのマウスのＢ細胞活性を Ｊｅｒｎｅプ→−り分析及び血清血球凝集抗体力価によりモニターした。実験の 第一セントでは、種々の投与量レベルの薬品でマウスを５回処理した。Ｊｅｒｎ ｅプラーク分析の結果は５ＲＢＣで攻撃したかツクロスボリンで処理しないマウ スは５６０／Ｉ　Ｏ＠細胞のプラーク形成ユニット価（ＰＦＵ）を存することを 示した。しかしながら、５ＲＢＣを与えたマウスをＥｍｐｔｙ−して処理した時 には、未処理、抗原攻撃マウスに比較してＰＦＵて１．４倍の増加かあった。５ ．１５又は２５　ｍｇ／　ｋＨのシクロスポリン−ＣｒｅＬの５投与量で処理し たマウスは５ＲＢＣ攻撃、未処理対照と比較して各々２５％、５７％及び８４％ のプラークでの減少を示した。！、５．１５又は２５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリ ン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓで処理したマウスは５ＲＢＣ攻撃、未処理対照のものの各々 ４５％、５４％、６８９６及び８９％たけプラークで減少を示した。５　ｍｇ／ 　ｋｇの５投与量（総計＝マウス当り０．５５　ｍｇ）のシクロスポリン−Ｍ　 Ｌ　Ｖ　ｓて処理したマウスのプラークレベルは１５　ｍｇ／　ｋｇの５投与量 （総計＝マウス当り１．６５　ｍｇ）のシクロスポリン−Ｃｒｅして処理したマ ウスのそれと匹敵し得る。

前記の実験からのマウス血清を血球凝集力価に対して分析した。非抗原攻撃、未 処理マウスは０の血球凝集力価を有した。ただ５ＲＢＣ，５ＲＢＣとＣｒｅＬ又 は５ＲＢＣと空の−Ｌを与えられたマウスはＩ：８５３の力価を存した。５ＲＢ Ｃと５又は２５　ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン−ＣｒｅＬの何れかを与えられた マウスはたた５ＲＢＣを与えられたマウスに比較して、各々、８０％及び９９、 ５９６の抗体力価における減少を示した。１．５、Ｊ５、又は２５　ｍｇ／　ｋ ｇンシクスポリリンＭＬＶｓて処理されたマウスは５ＲＢＣのみ与えられたマウ スに比較して抗体力価において、各々、９７．５％、９９．５９６．９９．５％ 及び９９．８％減少を示した。かくして、シクロスポリン−ＭＬＶｓて処理され たマウスはシクロスポリン−ＣｒｅＬの匹敵する投与量を与えられたマウスに比 較してより低い抗体力価を有した。この結果はまたＣｒ　ｅＬ処理又は空の−Ｌ 処理の何れもか５ＲＢＣに対するこれらのマウスの抗体応答を変えないことを示 した。

シクロスポリン−ＣｒｅＬ又はシクロスポリン−ＭＬＶｓの何れかの５投与量で 処理したマウスからのＴ細胞をその分離に続いてＰＨＡて刺激した。リンホカイ ン、ケモタキンンを生ずる能力を走化性分析により測定してケモタキシン係数と して表わした。非ツクロスボリン処理マウスは１．４３のケモタキシン係数を有 した。５．１５、又は２５　ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン−Ｃｒｅして処理した マウスは未処理対照マウスに比較してケモタキシン係数て３９石、３７９６、及 び５０％の減少で示されるように減少したケモタキノン産生を示した。５．１５ 又は２５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンーＭＬＶｓで処理したマウスは未処理マウス に比較して各々３６９６．４１１％及び３８．５％たけ減少しだケモタキノン係 数を有した。従って単に５ｍｇ／ｋｇツクロスポリンーＭ　Ｌ　Ｖ　ｓを与えら れたマウスが１５　ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン−Ｃｒｅして処理されたマウス のものと匹敵するケモタキシン産生の抑制を示した。

次のセットの実験では、より低い全投与量のシクロスポリン−ＣｒｅＬ及びシク ロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓの免疫抑制効果を調へた。これらの生体内実験では 、ツクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ又はツクロスポリン−ＣｒｅＬの何れかの３ 投与量でマウスを処理した。Ｊｅｒｎｅプラーク分析の結果はシクロスポリンを 投与しない５ＲＢＣ攻撃マウスは６８０ＰＦＵ／Ｉ　Ｏ’細胞のプラークレベル を存することを示した。５ＲＢＣとＣｒｅＬを投与したマウスは高い数値のプラ ーク（７００）をまた示したが、３投与量の５ｍｇ／ｋｇ（総計＝マウス当り０ ．３３　ｍｇ）又は１５ｍｇ／ｋｇ（総計＝マウス当り０．９９　ｍｇ）のシク ロスポリン−Ｃｒｅして処理した５ＲＢＣ攻撃マウスは非シクロスポリン処理マ ウスと比較して各々５０％（３４０）及び６８（％）２２０だけ減少したプラー クレベルを有した。

５ＲＢＣと３投与量の５　ｍｇ／　ｋｇ　（総計＝マウス当り０．３３　ｍｇ） 又はＩ　５　ｍｇ／　ｋｇ　（総計＝マウス当り０．９９ｍｇ）のシクロスポリ ン−ＭＬＶｓて処理したマウスはシクロスポリン−Ｃｒ　ｅＬの匹敵する投与量 で処理したマウスよりその５ＲＢＣ応答において更に免疫抑制された（各々、７ ０％（２００）及び７９％（１４０）の減少）。

前記の実験からマウス血清を血球凝集抗体力価について分析すると、Ｊｅｒｎｅ プラーク分析で見られたものと類似の結果か第５表に見られるように得られた。

第５表 薬品（第９０に回収された血清）　力　価Ｇｌ・対照（ｓＲＢＣのみ）　Ｉ：８ ５３Ｇ２　：　５．Ｏｍｇ／ｋｇ　ツクロスボリン−ＣｒｅＬ　ｌ二３４１Ｇ　 ３　：　１５．０　ｍｇ／ｋｇ　シクロスポリン−ＣｒｅＬ　１：Ｉ２８Ｇ４　 ：　５．Ｏｍｇ／ｋｇ　ツクロスポリン−ＭＬＶｓ　１　：１２８Ｇ　５　：　 １５．Ｏｍｇ／ｋｇ　シクロスポリン−ＭＬＶｓ　ｌ：　４３例９て報告した実 験ては、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（こ第１日と第４　ＩＥに１０％５ＲＢＣＩＰ ｏ、２ｍｌを接種した。このマウスにツクロスボリンーＣｒｅＬ又はシクロスポ リン−！’ｖｌ　Ｌ　Ｖ　ｓの３静脈投与量（第０日、第４日そして第８日）で 処理した。対照マウスＧ１に５ＲＢＣのみを接種した。す−＼てのマウスを第９ 日に犠牲にしモして５マウス／群からプールされた血清で血球凝集分析を行なっ た。結果は５マウス／群の３回繰返してありそして平均力価として報告する。

５ＲＢＣのみ投与されたマウスはｌ　８５３０力価をイｆし、これに対して５Ｒ ＢＣと５又はＩ　５　ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン−Ｃｒ　ｅＬの何れかで処理 したマウスは非シクロスポリン処理マウスに比較して各々力価で２．５倍又は６ バ倍減少を示し；５ＲＢＣと５又は１５　ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン−Ｎｉ　 Ｌ　Ｖ　ｓの何れかで処理したマウスは各々６゜７倍及び１９．８倍減少を示し た。５ＲＢＣの匹敵する免疫抑制は５　ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン−ＭＬＶｓ 及び１５ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン−ＣｒｅＬを投与されたマウスで見られた 。

シクロスポリンで３回処理されたマウスからのＴｍ胞をＰＨＡて刺激しかつケモ タキシン産生に対して試験した時に、ケモタクチック係数が第６表に示されるよ うにＴ細胞活性を測定するように計算できる。

第６表 ＰＨＡ−刺激Ｔ細胞のケモタキシン産生第８日；血清回収第９日）　実験１　実 験２Ｇｌ　：Ｃｏｎｔｒｏｌ（ンクａスホリンな　し）　１．７６　１．６０Ｇ ２：ＣｒｅＬ　Ｏ，１５ｍ１　ｏｆ　２５％希釈　１．７８　１．５０Ｇ３：　 ５．０　ｍｇ／ｋｇ　ツク０スホリンーＣｒｅＬ　１．５０　１．１９Ｇ４：１ ５．０　ｍｇ／ｋｇ　ツクロスポリン−ＣＪｅＬ　１．１７　１．αΩＧ５：　 ５．０　ｍｇ／ｋｇ　シクロスホリ７−ＭＬＶＳ　１．０７　１．００Ｇ６：１ ５．Ｏｍｇ／ｋｇ　ツクロスポリ７−ＭＬＶＳ　Ｏ，８９０，７８例９て報告し た実験では、３投与量（第０日、第４日及び第８日）のシクロスポリン−Ｃｒｅ Ｌ又はシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓの何れかてＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを処 理した。対照マウスＧｌは処理を受けずそしてＧ２をＣｒｅして処理した。第９ 日にマウスを犠牲にしそしてＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　Ｍｅ ｄｉａ　（Ｎ　Ｉ　Ｍ）を使用して混合リンパ球帯域としてＴ細胞を分離しそし て５マウス／群からプールした。結果は５マウス／群の４回繰返しからのものて あり、そして平均ケモタクチック係数として作力する。

実験ｌては、非シクロスポリン処理マウスは１．７６の係数を示し、これに対し て５又は１５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンーＣｒｅＬの何れかで処理したマウスは 未処理マウスに比較して、各々、ケモタクチック係数で１５％及び３３％減少を 示した。５又は１５　ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓで処理した マウスの係数は未処理マウスより各々３９％及び４９％低かった。この実験の繰 返しは５及び１５　Ｂ／　ｋｇツクロスポリン−ＣｒｅＬに対して各々２６％及 び３７％のケモタクチック係数の減少、そして５及び１５　ｍｇ／　ｋｇンシク スボボリンＭＬＶｓに対して各各３７％及び５１９６の減少を示した。両方の実 験で、１５　ｍｇ／　ｋｇ　：／クロスポリンーＣｒｅＬ及び５　ｍｇ／　ｋｇ シクロスポリン−Ｌｉ　Ｌ　Ｖ　ｓの免疫抑制活性は匹敵し得るものであった。

ＣｒｅＬのみはＰ　ＨＡ−刺激Ｔ細胞活性て著しい減少を示さなかった。

例　１０ ツクロスボリンーＭＬＶｓ及びシクロスポリン−ＣｒｅＬか５ＲＢＣ攻撃に対し て一次及び二次応答に関して匹敵する免疫抑制Ｂ細胞活性を有するかとうかを調 べるために、一つ又は二つの抗原攻撃の何れかに続いてＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス を薬品の何れかの形で３回処理した。

Ｊｅｒｎｅプラーク分析及び血球凝集分析を使用してＢ細胞応答を測定した。応 答で産生した抗体の性質について更に情報を得るために、各試料で直接及び間接 の両方のＪｅｒｎｅプラーク分析を行なってＩｇＭ及びＩｇＧ力価を各々得た。

５ＲＢＣに対する一次応答についてシクロスポリン効果を調へるため設計された 実験では、マウスに第０日に５ＲＢＣを接種しそして、第０日、第４日及び第７ 日にシクロスポリンで処理した。この実験で５ＲＢＣ攻撃対照マウスからのＪｅ ｒｎｅプラーク分析は直接分析（１ｇＭ応答）から５６０ＰＦＵ／１０’細胞そ して間接分析（組合わせたＩｇＭ及びＩｇＧ応答）から１０４０　ＰＦＵを示し た。５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンーＣｒｅして処理したマウスは対照マウスと比 較して直接及び間接の両方の分析で僅かに増加した数のプラークを示した。

しかしながら、５　ｍｇ／　ｋｇツクロスボリン−ＭＬＶｓで処理したマウスは 対照マウスと比較した時に、直接分析においてプラーク数で３．５倍減少を示し た。このデータはシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓが低い投与量でシクロスポリ ン−ＣｒｅＬより一次応答でのＩｇＭ産土に対して更に前記のマウスから血球凝 集力価を調へた時に、そのデータはある面でプラーク分析に類似していた。５ｍ ｇ／ｋｇのツクロスボリンーＣｒ　ｅＬ又はシクロスポリン−ＭＬＶｓで処理し たマウスは５ＲＢＣ攻撃対照マウスに比較して、各々、力価で１．７倍及び５倍 減少を示した。

５ＲＢＣ攻撃及びシクロスポリン処理マウスの二次応答を調へた時には、マウス に第０日及び第４日に５ＲＢＣ１そして第４日、第６目及び第８日にツクロスポ リン（５ｍｇ／　ｋｇ　）を投与した。シクロスポリン−ＣｒｅＬの１ｇＭ応答 は対照マウスに類似していたが、間接分析のプラーク数で変化を示さず、これら のマウスで５ＲＢＣに対するＴｇＧＣ？答の抑制を示唆する。しかしながら、ツ クロスボリンーＭＬＶて処理したマウスは対照マウスに比較して５ＲＢＣに対し てＴｇＭ及びＩｇＧの両方で減少を示した。このデータはまた等価の投与量のシ クロスポリン−ＣｒｅＬに比較してシクロスポリン−ＭＬＶのより大きな免疫抑 制活性を示す。

例　１１ マウスＢ細胞及びＴ細胞応答に関してシクロスポリン−ＮＩＬＶｓ叉はツクロス ボリンーＣｒｅしてマウスの予防処理の効果を調へるために、マウスを一投与量 のシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ又はツクロスボリン−ＣｒｅＬの何れかで予 防的に処理し、一方対照マウスは５ＲＢＣ攻撃の前に薬品処理を受けなかった。

Ｊｅｒｎｅプラーク分析から５ＲＢＣ攻撃対照マウスが５６０ＰＦＵ／１０＠細 胞のプ→−クレヘルを示し、抗原攻撃の１日又は２日前の何れかに１５ｍｇ／ｋ ｇシクロスポリンーＣｒｅして処理したマウスは対照マウスのそれと類似である が、より低い（各々４２０及び５２０）プラークレベルを示すことか判る。他方 、５ＲＢＣ攻撃の１日又は２日前の何れかに１５　ｍｇ／　ｋｇシクロスポリン −ＭＬＶｓで処理したマウスは対照に比較して分析でより低い数のプラーク、各 々５４％（３００）及び５０％（２８０）を有した。１日又は２日前に１５　ｍ ｇ／　ｋｇシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓで処理したマウスは等価投与量のシ クロスポリン−ＣｒｅＬを投与されたマウスに比較してプラークで各々２８．６ ％及び４６％減少を示した。３投与量の５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンーＭＬＶｓ 　（第０日、第４ｓ及び第８日に）で治療的に処理したマウスは対照に比較して プラークの数で３倍減少（１８０）で最良のプラーク減少を示した。

第７表に見られるように、前記の研究でマウスの血清で行なった血球凝集分析か らまた結果を得た。

抗体力価（ｓＲＢＣ攻撃）−投与量で 薬品処理（第９日に回収した血清）　力　価Ｇ１：対照（ｓＲＢＣのみ）Ｉ　： ｌ３６５Ｇ　２　：　１５．０ｍｇ／ｋｇ　ツクロスホリン−ＣｒｅＬ（１日前 ）　Ｉ：６８２Ｇ　３　：　１５．Ｏｍｇ／ｋｇ　ツクロスホリン−ＣｒｅＬ（ ２日前）　Ｉ：６８２０　４　：　１５．０ｍｇ／ｋｇ　シクロスポリン−ＡＩ ＬＶｓ（１日前）　Ｉ：２５６Ｇ　５　：　１５．Ｏｍｇ／ｋｇ　ツクロスホリ ン−ＭＬＶｓ（２日前）１：２１Ｇ６　：　５．Ｏｍｇ／ｋｇ　シクロスポリン −Ｍ［、Ｖｓ（第０日、第４日、第８日）１：１６ 前記の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに第０日と第４日に１０％５ＲＢ ＣＩＰ　０．２ｍｌを接種した。

またマウスを１５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンーＣｒｅＬ又はシクロスポリン−Ｍ ＬＶｓの一静脈投与量（ｓＲＢＣ攻撃に対して２日前又は１日前の何れかに）で 処理した。

対照マウスＧｌに第０日及び第４日に５ＲＢＣを接種したが、シクロスポリンで 処理せず、そしてＧ６マウスに５ＲＢＣを接種しそして５　ｍｇ／　ｋｇシクロ スポリン−ＭＬＶｓの３投与量（第０日、第４日及び第８日）で治療的に処理し た。すへてのマウスを第９日に犠牲にしそして５マウス／群からプールされた血 清で血球凝集分析を行なった。結果は平均力価として報告される５マウス／群の ３回繰返しである。

５ＲＢＣで攻撃しかつツクロスボリン処理を与えないマウスはＩ　：ｌ３６５の 力価を示した。１日前又は２日前に１５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンーＣｒｅして 処理したマウスは対照に比較して力価で２倍減少を示した。匹敵する投与量のシ クロスポリン−Ｃｒ　ｅＬに比較して２日前に１５ｍｇ／ｋｇツクロスボリンー Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓて処理したマウスの抗体力価で３２倍のより大きい減少があった 。更に、２日前に＋５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンーＭＬＶｓで処理したマウスは ５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンーＭ　Ｌ　Ｖ　ｓの３投与量て治療的に処理したマ ウスのそれと匹敵する抗体力価を有した。このデータはツクロスポリン−Ｃｒ　 ｅＬの匹敵する投与量と異なってシクロスポリン−ＭＬＶｓの単一投与量は予防 的に使用して５ＲＢＣに対して免疫応答に有効に抑制できることを示す。

前記のマウスからのＴ細胞をＰＨＡて処理しそしてケモタキシン産生について調 へた時に、シクロスポリン−ＣｒｅＬ及びツクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ処理 マウスのケモタクチック係数は同一ではなかった。非シクロスポリン処理対照マ ウスは１．４６の平均係数を存しそして１日前又は２日前に１５　ｍｇ／　ｋｇ シクロスポリン−Ｃｒｅして処理したマウスは対照マウスのそれと類似した係数 を有した。しかしながら、１日前又は２日前に１５　ｍｇ／　ｋｇシシクスポリ リンＭＬＶｓで処理したマウスはシクロスポリン−ＣｒｅＬの匹敵する投与量で 処理したマウスより各々低い係数、２３％及び２９％を示した。２日前に１５ｍ ｇ／ｋｇのシクロスポリン−ＭＬＶｓて処理したマウスは５　ｍｇ／　ｋｇシク ロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓの３投与量で治療的に処理したマウスのそれに類似 の免疫抑制を示した。

このデータはＴｍ胞応答及びＢ細胞応答の両方がシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　 ｓでの予防的処理により有効に抑制できるが等価の投与量のシクロスポリン−Ｃ ｒｅしてはできないことを示唆する。

例　■２ この実験では、マウスをリポ多糖類（ＬＰＳ）　、Ｔ−非依存抗原て攻撃しそし てシクロスポリン−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ又はシクロスポリン−Ｃｒｅして処理してこ の抗原に対してマウスＢ細胞応答に両方の試剤の効果を測定した。対照マウスは ＬＰＳのみを受入れた。結果を第８表に示す。

３投与量で処理したマウスの抗体力価（ＬＰＳ攻撃）Ｇ］：　対照（リネソーム ムし）　（シクロスポリンなし）　ＯＧ２：対照（ｓＲＢＣのみ）　１：８５Ｇ 　３　：　ＣｒｅＬ　０．１５ｍ１　ｏｆ　２５％　希釈　１：８５Ｇ５　：　 ５．Ｏｍｇ／ｋＨ：／りＵスポリン−ＣｒｅＬ　１　：８５Ｇ　６　：　１５． Ｏｍｇ／ｋｇ　ツクロスポリン−ＣｒｅＬ　１　：８５Ｇ７　：　５．Ｏｍｇ／ ｋｇ　ツクロスポリン−ＭＬＶｓ　１：１１Ｇ　８　：　１５．Ｏｍｇ／ｋｇ　 ツクロスポリン−ＭＬＶｓ　ｌ　：１３例１２ては、第０日及び第４０にＬＰＳ 、ＴＶｌ、０ｍｇを接種したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＢ細胞応答を調へた。Ｇ ５、Ｇ６、Ｃ７及びＣ８てマウスをまたシクロスポリン−ＣｒｅＬ又はシクロス ポリン−ＭＬＶｓの３静脈投与量（第０日、第４日及び第８日）で処理した。対 照マウスをシクロスポリン又はＬＰＳの何れでも処理しなかった。Ｇ２にＬＰＳ を接種したがシクロスポリンで処理しなかった。Ｇ３をＬＰＳて接種しかつＣｒ 　ｅＬで処理しそして０４をＬＰＳて接種しそして空の一リポソームで処理した 。すへてのマウスを第９日に犠牲にしそして５マウス／群からプールされた血清 で血球凝集分析を行なった。結果は５マウス／群の３回繰返しのものであり、平 均力価として報告する。

ＬＰＳに対する抗体力価についてマウス血清を分析した時に、非シクロスポリン 処理対照マウスはｌ：８５の平均力価を示した。Ｃｒ　ｅＬ又はＥｍｐｔｙ　− Ｌの何れかで処理したマウスはまたＩ：８５の力価を有し、ＬＰＳに対するＢ細 胞応答にこれらの物質の影響がないことを示す。同様に、５又は１５　ｍｇ／　 ｋｇシクロスポリン−Ｃｒｅして処理したマウスはまた対照マウスに比較して抗 体力価で減少がないことを示した。しかしながら、５又は１５　ｍｇ／　ｋｇの シクロスポリン−ＭＬＶｓで処理したマウスは対照マウス及びシクロスポリン− Ｃｒ　ｅＬの匹敵する投与量を投与したマウスの両方と比較して、各々、力価で ７．７倍及び６．５倍減少を示した。このデータはシクロスポリン−ＭＬＶｓが 、等価投与量のシクロスポリン−ＣｒｅＬと異なって、Ｔ非依存抗原に対するＢ 細胞応答を抑制できることを示す。それ故に、この結果はまたシクロスポリン− ＭＬＶｓに対する免疫抑制のターゲットは抗原提示マクロファージであり、これ はＴ非依存及びＴ依存抗原の両方に対するＢ細胞応答に影響できることを示唆す る。

片側検定を行なってシクロスポリン−ＭＬＶｓ対匹敵する投与量のシクロスポリ ン〜ＣｒｅＬの使用の間の差の確率を測定した。三つの免疫の分析の各々を使用 した時に、ツクロスポリン〜Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓは匹敵する投与量のシクロスポリン −Ｃｒ　ｅ　Ｌより有意に更に免疫抑制性であることの９５％確率があることが 判明した。

本明細書は特定の適用に関連して開示しかつ例示したが、含まれる原理は当業者 に明白である多くの他の適用に可能である。それ故に、本発明は添付の請求項の 範囲に示されるようにのみ限定されるへきである。

０、Ｄ。

Ｑ」 ＯＤ。

０Ｄ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ（ｉ）中性のリン脂質、（ｉｉ）ホスファチジルグリセロール及びジミリ ストイルホスファチジック酸から選択された負に荷電されたリン脂質、及び（ｉ ｉｉ）シクロスポリン、を有機溶媒に溶解して溶液を形成すること；ｂ．この溶 液を乾燥して固体相を形成すること；ｃ．水溶液でこの固体相を水和してリボソ ームシクロスポリン治療用調合品を形成すること、を特徴とする、リボソームシ クロスポリン治療用調合品の製法。 ２．（ｉ）中性のリン脂質、（ｉｉ）ホスファチジルグリセロール及びジミリス トイルホスファチジック酸から選択された負に荷電されたリン脂質、及び（ｉｉ ｉ）シクロスポリン、を含むことを特徴とする、水溶液に懸濁されたリボソーム 。 ３．（ｉｉ）がジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホ スファチジルグリセロール、ジラウリルホスファチジルグリセロール及びジミリ ストイルホスファチジック酸からなる群から選択された化合物である、請求項１ 又は２の方法。 ４．（ｉ）が１６又は１８の炭素脂肪酸鎖から構成される脂質部分を有する、請 求項１又は２の方法。 ５．水溶液が５．５から９．５のｐＨを有する緩衝液であることを特徴とする、 請求項１又は２の方法。 ６．リボソームが単ラメラーでありかつ０．２μｍ未満の直径を存する、請求項 １又は２の方法。 ７．（ｉ）が１６又は１８の炭素脂肪酸鎖から構成される脂質部分を有する、請 求項３の方法。 ８．水溶液が７．０から９．５のｐＨを有する緩衝液であることを特徴とする、 請求項３の方法。 ９．水溶液が５．５から９．５のｐＨを有する緩衝液であることを特徴とする、 請求項４の方法。 １２．リボソームが単ラメラーでありかつ０．２μｍ未満の直径を有する、請求 項３の方法。 １３．リボソームが単ラメラーでありかつ０．２μｍ未満の直径を有する、請求 項４の方法。 １４．リボソームが単ラメラーでありかつ０．２μｍ未満の直径を有する、請求 項５の方法。