JPS63501569A - アルファトコフェロ−ルをベ−スとした小胞体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アルファ　トコフェロールをベースとした小゛ｉ属 この出願は、１９８５年１０月１５日に出願した同時係属特許出願番号筒７８６ ，７４０号の一部継続出願である。

ｉ豆度！免 本発明は、二重層（ｂｉｌａｙｅｒｓ）を形成することのできるアルファートコ フェロール（ビタミンＥ）の有機酸誘導体の塩から構成されている小胞体内に化 合物を取り込む方法及び組成物に関するものである。有機酸の塩のような親水性 部分が結合されているアルファートコフェロールは、マルチラメラＣｍｕｌｔｉ ｌａｍｅｌｌａｒ）小胞体（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）又は小さなユニラメラ（ｕｎｉ ’ｌａｍｅｌｌａｒ）小胞体の懸濁液を調製するのに用いられることができる。

これらの小胞体は、有機溶剤を使用し、あるいは使用せずに作ることができ、水 溶性化合物、部分的水溶性化合物及び水不溶性化合物を取り込み。

あるいはそれらと会合することができる。便宜上１本発明の小胞体を単に″アル ファートコフェロール小胞体”と呼ぶが、小胞体を作るに際しては、アルファー トコフェロールの有機酸の塩が常に用いられていることを理解しなければならな い。

ここに述べられているアルファートコフェロール小胞体は、生体内に投与するこ とのできる生物学的に活性な化合物又は医薬化合物を取り込むか、又はそれらの 化合物と会合するのに、特に有用である。一方、本発明の小胞体は、試験管内で 用いてもよい。

例えば、ここに述べられているアルファートコフェロールのコハク酸ヘミエステ ルは、２価カチオン依存定量法において、試験管内で用いてもよい。

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、リポソームである。リポソームは 、被包された水相を含む完全閉鎖二重層膜（二分子膜ｂｉｌａｙｅｒ　ｍｅｍｂ ｒａｎｅｓ）である。リポソームは、任意の種類のマルチラメラ小胞体（水層に よってそ九ぞれ分離された二重層膜で特徴づけられる玉ねぎ状構造）であっても 、またユニラメラ小胞体（単一の二重層膜な有する）であってもよい。

リポソーム製造の２つのパラメーターは、小胞体の大きさと脂質濃度の関数であ る＝　（１）一定量の脂質によって封入された容量として定義される捕捉容量は 、全脂質のモル当りの取り込まれたリットル単位として表わされる（　１　ｍｏ ｌ−’）　、取り込み容量は、ラメラの数及びリポソームの半径に依存し、更に は小胞体の脂質組成物及び媒質のイオン性組成物によって影響を受ける。（２） 被包効率は、二重層膜によって分離された初期の水相の割合として定義される。

〔ディーマー及びアスター（Ｄｅａｍｅｒ　ａｎｄ　Ｕｓｔｅｒ）　。

１９８３、リポソームの製造二方法及び機構、リポソームについて、エム　オス トロ（Ｍ、　０ｓｔｒｏ）　ｍ集、マーセル　デツカ−、インコーホレイテッド （Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、）　、ニューヨーク、ｐｐ、　２７ 〜５１〕 最初のリポソーム製造法〔パンガム等（Ｂａｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、）ジャー ナルオンモレキュラーバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　１３　： ２２ｇ　（１９６５）　）では、有機溶剤中にリン脂質を懸濁させ、次いでその 溶剤を蒸発乾固して１反応容器上にワックス状のリン脂質を析出させた０次いで 、適当量の水相を加え、混合物を“″膨潤″させ、マルチラメラ小胞体（以下Ｍ ＬＶと云う）から成る生成リポソームを機械的手段により分散させた。生成二重 層膜の構造は、脂質の疎水性（非極性）゛′尾″が二重層膜の中心に向って配向 し、親水性（極性）“頭″が水相に向って配向するようになっている。

この技術は、パパハジョボウロス及びミラー（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ）　（バイオヒミカ　ウントバイオフィジカオンアクタ（ Ｂｉｏｅｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）　１３５　：　６２４　（ １９６７）　）が述べている音波処理された小さいユニラメラ小胞体（以下ＳＵ Ｖと云う）の開発の基礎となった。

被包効率を高めようとして、リポソーム前駆物質又はミセル、即ち、極性頭部基 が水相の方向へ向くように配向された脂質分子の−Ｎ（−分子ｉ　ｍｏｎｏｌａ ｙａｒ）によって包まれた水相を含む小胞体を形成することがまず行なわれた。

リポソーム前駆物質は、被包しようとする水溶液を、極性脂質の有機溶剤溶液に 添加し、音波処理することによって形成される。次いで、このリポソーム前駆物 質を、過剰の脂質の存在下で第二の水相中に乳化させ、蒸発させる。生成したリ ポソームは、脂質二重層膜によって被包された水相から成り、水相中に分散して いる（１９８０年９月２３日にエムシュナイダー（Ｍ、　５ｃ）１ｎｅｉｄｅｒ ）に発行された米国特許第４，２２４゜１７９号参照〕。

被包効率も最大にしようとする他の試みとして、パパハジョポウロス（Ｐａｐａ ｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）　（１９８０年１１月２５日発行された米国特許第４ ，２３５，８７１号）は、逆相蒸発小胞体（以下ＲＥＶと云う）としても知られ ているオリゴラメラ脂質小胞体を作る“逆相蒸発法′″について述べている。こ の方法によれば、被包しようとする水性物質を有機溶剤中の極性脂質混合物に添 加する０次いで、均一な油中水型エマルジョンを作り、ゲルが形成されるまで有 機溶剤を蒸発する。その後、ゲル状混合物を水性媒質中に分散させて、ゲルを懸 濁液にする。生成したＲＥＶは、はとんどがユニラメラ小胞体（大きいユニラメ ラ小胞体、ＬＵＶ）から成り、更に、大きい内部水性空間を有するほんのわずが な同心二重層膜であることを特徴とする若干のオリゴラメラ小胞体から成ってい る。

また、リポソームは、次の形で製造することができる。　（ａ）レンダ等（Ｌｅ ｎｋ　ｅｔ、　ａｌ、）　、米国特許第４，５２２，８０３号に記載された方法 による安定なマルチラメラ小胞体胞体（ＳＰＬＶ）、（ｂ）フオンテイン等（Ｆ ｏｕｎｔａｉｎ　ｅｔ、　ａｌ、）　、米国特許第４，５８８，５７８号の方法 による単−相（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ）小胞体（ＭＰＶ）及び（ｃ）バリー等（ Ｂａ１ｌｙ　ｅｔ、　ａｌ、）　、　１９８５年１１月２１日出願の米国特許出 願番号第８００，５４５号の方法による凍結−解凍マルチラメラ小胞体（ＦＡＴ ＭＬＶ）。このパラグラフで引用した出願及び特許の関連部分は、ここにも引用 されている。

リポソームは、脱水及び再水和が可能である。ジャノフ等（Ｊａｎｏｆｆ　ｅｔ 、　ａｌ、）、″脱水リポソーム”　、　１９８６年２月２７日公表のＰＣＴ出 願番号第８６０１１０３号参照。その関連部分は、ここにも引用されている。

薬物供給システムにリポソームを使用することの可能性に関しては、多くの記載 が行われている。例えば、　１９７６年１１月２３日にユニー　エル　ラーマン 及びエリザベス　エイ　サーニー（Ｙｕｃｂ−Ｅｒｈ　Ｒａｈｍａｎ　ａｎｄ　 Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ　Ａ、　Ｃｅｒｎｙ）に発行された米国特許第３゜９９３． ７５４号及び１９７９年３月２０日にバリー　ディ　シアーズ（ＢａｒｒｙＤ、 ５ｅａｒｓ）に発行された米国特許第４，１４５，４１０号の記載参照。リポソ ーム薬物供給システムにおいては、リポソーム形成中に薬剤が取り込まれ、次い で治療しようとする患者に投与される。薬剤は、水又は非極性溶剤に可溶であっ てもよい、このような記載の代表的なものとして、　１９８０年１１月２５日に パパハジャポウロス及びツカ（Ｐａｐａｈａｄｊａｐｏｕｌｓ　ａｎｄ　５ｚａ ｋａ）に発行された米国特許第４，２３５．８７１号及び１９８０年９月２３日 にエム　シュナイダー（Ｍ、　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ）に発行された米国特許第４ ，２２４，１７９号がある。生体内で使用するリポソームを作る場合には、（１ ）リポソーム形成中に有機溶剤を使用する必要性をなくすこと及び（２）−回の 投与量当り。

より大きい容量及びより高い濃度の取り込まれた物質を給供することができるよ うに、被包効率及び捕捉容量を最高にすることが有利であろう。

発明の要約 本発明は、二重層膜がアルファートコフェロールの有機酸誘導体の塩を含んでい る小胞体に種々の物質を取り込み、投与する方法及びその組成物を含むものであ る１本発明の小胞体は、取り込まれた化合物を生体内に投与するのに特に有用で あり、その場合には、小胞体を作るのに、Ｄ−アルファートコフェロールの有機 酸誘導体の生体適合性塩を使用すべきである。事実、生体内投与に関しては、ア ルファートコフェロールの有機酸誘導体のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ タン塩（トリス−塩）が、小胞体二重層膜成分として特に有用である。このよう な誘導体は、コハク酸のエステル又はヘミエステルでもよく、小胞体は、ホルモ ン、抗真菌剤、抗緑内障剤（これらに限定されるものではない）のような生物活 性剤を取り込んでいてもよい、小胞体は、これらに限定されるものではないが、 局所的、非経口的、経口的及び経膣的を含む種々の経路で投与される。

アルファートコフェロール小胞体を製造する方法は、水性区分を取り込む完全閉 鎖二重層膜を形成するのに十分な量の閉鎖二重層膜を形成するアルファートコフ ェロールの有機酸誘導体の塩を、緩衝水溶液に添加することを含む、混合物を振 とうすることによって、小胞体の懸濁液を作る。緩衝水溶液も、溶液中の塩の対 イオンを含んでいる場合は、小胞体の形成が促進される。更に、アルファートコ フェロールの有機酸誘導体の解離塩が、中性ｐＨにおいて負に荷電している場合 は、緩衝水溶液は実質的に二価のカチオンを含むべきでない、同様に、アルファ ートコフェロールの有機酸誘導体の解離塩が、中性ｐＨにおいて正に荷電してい る場合は、緩衝水溶液は実質的に多価のアニオンを含むべきでない。

懸濁エネルギーの適用、即ち音波処理によって、マルチラメラ小胞体がユニラメ ラ小胞体に変る。

水溶性化合物１部分的水溶性化合物及び水不溶性化合物を本発明のアルファート コフェロール小胞体に取り込むためには、多数のアプローチが可能である。アル ファートコフェロールニ重層膜内に分配する化合物（例えば、水不溶性化合物） 又は水溶性化合物を、小胞体の形成前に水相へ添加し、形成中に小胞体内へ取り 込むようにしてもよい、一方、水不溶性又は脂質可溶性の化合物を、小胞体形成 後に小胞体の懸濁液へ添加してもよく、この場合は、化合物がアルファートコフ ェロールニ重層膜内に分配する。

他の例では、水不溶性化合物とアルファートコフェロールの有機酸誘導体の塩と を、両者が可溶性する（共に可溶化する）ように有機溶剤へ添加することもでき る１次いで、有機溶剤を蒸発させて、水不溶性化合物とアルファートコフェロー ル誘導体とが均一に分布しているフィルムを残す、このフィルムに、撹拌しなが ら緩衝水溶液を加えると、水不溶性化合物を取り込んだアルファートコフェロー ル小胞体が形成される１次いで、このような小胞体を音波処理して、ユニラメラ 小胞体を形成することができる。

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、水不溶性生物活性剤又は水にほん のわずかに溶解する生物活性剤を取り込むのに使用すると、特に有利である。こ れによって、薬剤のような水不溶性生物活性剤の生体内投与が可能となる。更に 、投与量：容積比が変更され得るので、水不溶性化合物がより高濃度で生体内に 投与される０本発明のアルファートコフェロール小胞体は、水溶性生物活性剤を 取り込むのに使用する場合も、同様な利点を示す。

アルファートコフェロール小胞体は、有機酸の誘導形成エステル又はヘミエステ ルでもよく、更に、これらの有機酸誘導体は、ピロカルピンとの塩のような生物 活性剤の塩であってもよい０本発明の小胞体は、試験管内での診断試験に用いら れることもできる。

本発明は、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の塩、特に生物活性剤を有 するものを含む組成物を包含している。塩は。

イオン化しうる生物活性剤から誘導することができる。ピロカルピンアルファー トコフェロール小胞体の場合は、アルファートコフェロールの有機酸誘導体のピ ロカルピン塩が用いられ、１：１のモル比で用いられるのが好ましい。

また１本発明は、ステロールの有機酸誘導体の塩とアルファートコフェロールの 有機酸誘導体の塩とを含む組成物をも包含する。

組成物は、更に生物活性剤を含むことができる。ステロール若しくはアルファー トコフェロールのいずれかの有機酸誘導体の塩又はその両者は、イオン化しうる 生物活性剤を含むことができる。

このような生物活性剤としては、これらに限定されるものではないが、免疫抑制 剤サイクロスポリンＡ　（Ｃｙｅｌｏｓｐｏｒｉｎ　Ａ　）のようなポリペプチ ドがある。これらの組成物は、リポソーム小胞体を形成するのに用いることがで きる。

本発明は、次の点で多くの利点をもたらす。

アルファートコフェロール小胞体が。

（１）容易にかつ速く形成される。

（２）リン脂質Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓに比較して、高被包効率を有している。

（３）それらの製造に際し、有機溶剤の使用を必要としない（本発明のアルファ ートコフェロール小胞体は、有機溶剤を用いて製造することができるが）。

（４）高捕捉容量を有している。

（５）生体内に投与されたとき、解放され、代謝する生物活性剤又は薬剤を取り 込むことができる。生体内での取り込まれた剤の帰すうは、投与方式に依存する 。

更に１本発明のアルファートコフェロール小胞体は、アルファートコフェロール 小胞体に取り込ませることによって、取り込もうとする物質をまず可溶化し１次 いで、取り込ま九た物質を含むアルファートコフェロール小胞体自身を通常のリ ポソーム内に取り込ませるという２段階法で用いることができる。

図案の簡単な説明 次の図を参照することによって、本発明を更に容易に理解することができよう。

第１図及び第２図は、アルファートコフェロールのコハク酸ヘミエステルトリス 塩、コレステロールのコハク酸ヘミエステルトリス塩及び会合サイクロスポリン を含む複合小胞体の形成に及ぼす成分濃度の影響をグラフで示したものであり、 それぞれ７０℃の場合と６０℃の場合とである。

第３図は、アルファートコフェロールのコハク酸ヘミエステルトリス塩、コレス テロールのコハク酸ヘミエステルトリス塩及び会合ミコナゾールを含む複合小胞 体の形成に及ぼす成分濃度の影響をグラフで示したものである。

第４図は、下垂体を切除したラットの成長に及ぼす遊離及び小胞体に取り込まれ た牛の成長ホルモンの影響を、時間の関数で示される重量変化として成長を測定 して、グラフに示したものである。

日の　細な量Ｈ アルファートコフェロール小胞体は、水溶性、部分水溶性又は水不溶性化合物を 小胞体内に取り込むのに用いることができ、その二重層膜は、閉鎖二重層膜を形 成することのできるアルファートコフェロールの有機酸誘導体の塩を含んでいる 。従って１本発明のアルファートコフェロール小胞体を製造して、（１）水性区 分内に水溶性化合物を取り込むか、（２）小胞体二重層膜内に分配する水不溶性 化合物を取り込むか、又は（３）水溶性化合物と水不溶性化合物の両者を一つの 小胞体製剤内に取り込むことができる。

本発明の実施においては、リポソームと同様な水溶液中で完全閉鎖二重層膜を形 成することのできるアルファートコフェロールの有機酸誘導体の任意の塩を用い ることができる。アルファートコフェロールの有機酸誘導体の特定の塩の適合性 は、水溶性化合物を外界と接触しないように隔離できるかどうかにかかっている 。

小胞体の水性区分内への取り込みが行われたことを明確に決定するために、リポ ソームについて次の基準が確立されており、それは類推適用されてもよい、〔セ ッサ及びワイズマン（Ｓｅｓｓａａｎｄ　Ｖｅｉｓｓｍａｎｎ）　、バイオロジ カルケミストリー（Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、）罎、５　：　３２９５　（１９ ７０）参照〕。

（ａ）ゲル濾過によって、隔離された化合物を含まないはっきりとした分離が行 われていなければならない、（ｂ）最外部の小胞体二重層膜と取り込まれた化合 物との間に、疎水性又は電荷−電荷相互作用があってはならない、何故ならば、 このために、分子ふるい操作によって小胞体から遊離化合物を分離することが失 敗する結果となり、それによって、見掛は隔離効率が人為的に高くなるからであ る。この可能性を排除するためには、前に形成された小胞体の懸濁液に添加され る水溶性化合物が、小胞体と共に溶出しないことを示さなければならない、（Ｃ ）界面活性剤又は他の膜摂動剤を用いることによるゲル濾過された小胞体の崩壊 によって、隔離された分子のゲル濾過パターンが、小胞体ピークと一致する位置 から遊離分子と共に溶出する位置ヘシフトしなければならない。

アルファートコフェロールを誘導体化するのに用いることのできる有機酸には、 カルボン酸、ジカルボン酸、ポリカルボン酸、ヒドロキシ酸、アミノ酸及びポリ アミノ酸があるが、これらに限定されるものではない、このような誘導体は、エ ステルであっても、またヘミエステルであってもよい、塩は、有機酸の水溶性を 増大させるので、アルファートコフェロールを誘導体化するのに。

任意の有機酸を用いることができる。しかし、有機酸部分それ自体が水溶性であ れば、有利であろう、このような水溶性有機酸部分には、酢酸、プロピオン酸、 酪酸、吉草酸等のような水溶性脂肪族カルボン酸（注意：炭素数４個以下の酸は 、水と混和できる；炭素数５個の遊離酸は、一部可溶であり、それより長い鎖の 遊離酸は、実質的に不溶性である）；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピ ン酸、ピメリン酸、マレイン酸等のような水溶性脂肪族ジカルボン酸（注意：鎖 長が短かいほど、水に溶は易くなることが認められる。水への溶解度の境界線は 、ＣＧ−Ｃ，にある）；ヘミメリト酸、トリメシン酸、スクシンイミド等のよう な水溶性芳香族ジカルボン酸：ボリカルボン酸；グリコール酸、乳酸、マンデル 酸、グリセリン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等のような水溶性ヒドロキシ酸 （カルボニル基のアルファー炭素に付加した枝分れ鎖を有するアルファーヒドロ キシ酸は、加水分解を受けにくいため１本発明の実施においては有利である）並 びに任意のアミノ酸及びポリアミノ酸があるが、これらに限定されるものではな い。

誘導体化されたアルファートコフェロールの塩は、アルファートコフェロールの 有機酸誘導体と塩の対イオン（例えば塩の遊離塩基）の両者を適当な揮発性溶剤 に溶解し、蒸発又は同じような手法で溶剤を除去して、アルファートコフェロー ルの有機酸誘導体の塩から成る残留物を残すことによって作ることができる。用 いることのできる対イオンには、対応する塩を形成するトリス。

２−アミノ−２−メチル−１−３−プロパンジオール、２−アミノエタノール、 ビス−トリスプロパン、トリエタノールアミン等があるが、これらに限定される ものではない、事実、ミコナゾール遊離塩基等のようなイオン化しうる生物活性 剤の遊離塩基を、対イオンとして用いることができる。

一般に、生物活性剤の遊離塩基とアルファートコフェロールのジカルボン酸誘導 体とのモル比は、対応する生物活性剤塩を作るのに、１：１が用いられる０岡山 発物質を溶解する有機溶剤には、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジメ チルスルホミドのようなものがある。出発物質は、好ましくは約２０〜５０℃、 更に好ましくは約２０〜３０℃で溶剤に添加される０反応に続いて、減圧下での 溶剤除去、蒸発、結晶化又は技術上既知の他の方法によって。

生成生物活性剤塩を単離することができる。好ましいジカルボン酸誘導体は、コ ハク酸の誘導体である。好ましいアルファートコフェロールは、旦−フルファー トコフェロールである。

生物活性剤遊離塩基がピロカルピンであり、ジカルボン酸がコハク酸である場合 は、ピロカルピン：Ｄ−アルファートコフェロールのモル比は１：０．５から１ ：１の範囲で用いることができる。

出発物質の最も好ましい等モル量を、クロロホルムや塩化メチレンのような極性 有機溶剤中に溶解する。塩化メチレンについては、好ましくは約３０〜６０℃、 より好ましくは約４０〜６０℃、最も好ましくは５５℃で出発物質を添加し、加 熱還流する０反応完了後、溶剤を減圧下に除去して、アルファートコフェロール コハク酸ヘミエステルのピロカルピン塩から成る生成物を得た。

ミコナゾール、チルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾー ル、ビフォナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イ ソコナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、ナイスクチン、ナフチ ファイン、アンホテリシンＢ、ジノコナゾール及びシクロピロックスオラミンの ような抗真菌剤、特にミコナゾール又はチルコナゾールが、イオン化しうる生物 活性剤として用いられる。

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、誘導体化されたアルファートコフ ェロールが小胞体（即ち、取り込まれた水性区分を含む完全閉鎖二重層膜）を形 成するのに十分な量で存在するように、アルファートコフェロールの有機酸誘導 体の塩を水性相に添加することによって製造してもよい。次いで、小胞体５通常 はマルチラメラの乳状懸濁液が形成されるまで、生成物を振とうする。好ましい 実施態様においては、／ＪＸ胞体形体形成進するために、水相は溶液中に塩を含 有すべきである。更に、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の解離塩が、 中性ｐＨにおいて負に荷電している場合は、緩衝水溶液は実質的に多価のカチオ ンを含むべきでない。同様に、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の解離 塩が、中性ｐＨにおいて正に荷電している場合は、緩衝水溶液は実質的に多価の アニオンを含むべきでない。

本発明の小胞体は、マルチラメラ小胞体として用いてもよく。

また濾過や音波処理のような技術上知られている多くの技法を用いて、大きさを 小さくしてもよい、また、ホープ等（Ｈｏｐｅ　ｅｔ。

ａｌ、）　、　Ｂ　Ｂ　Ａ　８１２巻、　１．９８５．　ｐｐ、　５５−６５及 び１９８５年ｌＯ月１６日出願の、標題が１′ユニラメラ小胞体を製造する押出 方法″である、カリス等（Ｃｕｌｌｉｓ　ｅｔ、　ａｌ、）の同時係属米国特許 出願番号第７８８゜０１７号に記載されているように、ＶＥＴ法（小胞体押出技 法）を用いて、小胞体の大きさを小さくしてもよい。小胞体の大きさを合せる他 の技法に、小胞体をポンプによってフィルターユニットから連続的に押し出すＣ ８Ｒ法（連続サイズ低減）がある。

マルチラメラ小胞体形成について報告されている方法〔例えばプロッカーホッフ 及びラムサミイ（Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ　ａｎｄ　Ｒａｍｓａｍｍｙ　）、パ イオヒミカ　ウントバイオフイジカオンアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ＋Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ａｃｔａ、）　６９１　：　２２７　（１９８２）のリン脂資小胞体又は コレステロールのリポソーム〕とは完全に異なり１本発明のアルファートコフェ ロールマルチラメラ小胞体の形成方法は、有機溶剤を使用する必要がない、更に 、プロッカーホッフ及びラムサミイの方法とは異なり、マルチラメラ小胞体を形 成するのに音波処理は必要でない、しかしながら、本発明のアルファートコフェ ロールマルチラメラ小胞体の乳状懸濁液に音波処理を施すこと、又はフレンチプ レス（ニス　エル　エムーアミンコ（ＳＬＭ　−Ａｍ１ｎｃｏ）社、イリノイ州 、アーバナ（Ｌｌｒｂａｎａ）　）の使用に引続いて音波処理を施すことが、マ ルチラメラアルファートコフェロール小胞体の乳状懸濁液をユニラメラ小胞体の 透明な懸濁液に変えるために行われてもよい、音波処理を行わずにフレンチプレ スを使用すると、ユニラメラ小胞体になることが多い。

前に説明したように、アルファートコフェロールの任意の有機酸誘導体のトリス −塩は、本発明の実施において有利に用いられよう１例えば、アルファートコフ ェロールコハク酸ヘミエステルやコハク酸ヘミエステルの混合物のようなアルフ ァートコフェロールジカルボン酸ヘミエステルのトリス−塩は、生体内に投与す るためのアルファートコフェロール小胞体の小胞体二重層膜を形成するのに特に 有用である。例えば、アルファートコフェロールのコハク酸ヘミエステルを用い る場合、約５〜７００マイクロモルのトリス−塩を、トリス−ＨＣＱ（トリス（ ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩）を含む約５．０ｍ　Ｑの緩衝水溶液に 添加して、小胞体を形成することができる。この場合、緩衝水溶液は実質的に２ 価のカチオンを含むべきでない。

本発明によれば、水溶性化合物、水不溶性化合物又はわずかに可溶性の化合物を 、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の塩で構成されているリポソームに 、多くの方法で取り込み又は会合させることができる。

（１）水不溶性化合物を、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の適当な塩 を用いて上述のように作ったアルファートコフェロール小胞体（マルチラメラ又 はユニラメラのいずれか）の懸濁液に添加することができる。この化合物は、ア ルファートコフェロール二重層膜内に分配するために、小胞体内に取り込まれる 。

この実施態様は、次のようにして便利に実施される。水不溶性化合物を適当な有 機溶剤に溶解し、次いでその溶剤を蒸発させて、化合物のフィルム又は残留物を 残す、あらかじめ形成したアルファートコフェロール小胞体の水分散液を残留物 に加えると、残留物は小胞体の二重層膜に取り込まれるであろう。好ましい実施 態様においては、ユニラメラ小胞体が用いられるべきである。代りにマルチラメ ラ小胞体が用いられると、水不溶性化合物は、小胞体の最外部二分膜だけに取り 込まれて、最内部二重層膜は変らないままで残り、誘導体化されたアルファート コフェロールを無駄に使うことになるかもしれない。

（２）水不溶性化合物及びアルファートコフェロールの有機酸誘導体の塩を、有 機溶剤に共に可溶化させ１次いでその溶剤を蒸発させて、均一に分布した水不溶 性化合物とアルファートコフェロールとを含むフィルムを残すことができる。振 とうしなから水相をフィルムに加えると、取り込まれた化合物を含有するアルフ ァートコフェロール小胞体の懸濁液が形成される。前に述べたように、マルチラ メラ小胞体をユニラメラ小胞体に変えることができる。

（３）水溶性化合物又は不水溶性化合物を、小胞体の製造に用いられろ水相に添 加することによって、この化合物をアルファートコフェロール小胞体に取り込む ことができる。即ち、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の塩を添加する 前又はそれと同時に、化合物を水相に添加することができる。この場合、水不溶 性化合物は、それが小胞体形成中に二重層膜内に分配する際に。

取り込まれるようになり、一方、水溶性化合物は、小胞体の水性区分に取り込ま れるようになる。いずれの場合も、前に述べたように、マルチラメラ小胞体をユ ニラメラ小胞体に変えることができる。

（４）生物活性剤がイオン化可能であれば、アルファートコフェロールの有機酸 誘導体の塩を作るための対イオンとして、生物活性剤の遊離塩基を用いることが できる。生成組成物は、溶解度又は安定性を高めることができる。更に、アルフ ァートコフェロールの有機酸誘導体の生物活性剤塩を用いて、前述の任意の方法 により、アルファートコフェロール小胞体を製造してもよい０例えば、ミコナゾ ール、チルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾール、ビフ ォナゾール、クロトリマゾール。

ケトコナゾール、ブタコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、フェン チコナゾール、ナイスタチン、ナフチファイン。

アンホテリシンＢ、ジノコナゾール及びシクロピロックスオラミンのような抗真 菌剤の遊離塩基を、本発明の一実施態様において塩誘導体を作るのに用いること ができる。また、ピロカルピンの遊離塩も１本発明の一実施態様において塩誘導 体を作るのに用いることができる。アルファートコフェロールコハク酸ヘミエス テルのピロカルピン塩誘導体を用いるリポソームは、３０〜４０℃の温度で、乾 燥したアルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのピロカルピン塩に水溶 液を加え、懸濁液を撹拌することによって作られることができる。使用できる水 溶液の例には、米国薬局方、注射用蒸留水があり、次のもののいずれか単独又は 組合せたものである。０．０１％（ｖ／ｖ）塩化ペンジルコニウム、０．０２５ 〜０．１％（ｖ／ｖ）ソルビン酸ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢酸）、 １．４％（ｖ／Ｖ）ポリビニルアルコール及び０．０５〜０．５０％（誓／ν） ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ここに名前を挙げた他のイオン化しうる 生物活性剤を使用してもよい。

本発明の組成物は、アルファートコフェロールの有機酸の塩に加えて、小胞体の 二重層膜内又はその間に取り込まれた生物活性剤を含有しいてもよく、あるいは 生物活性剤が二重層膜と会合していてもよい、このような会合によって、生物活 性剤が小胞体の外部に位置する結果とする。

本発明の組成物は、緑内障のような眼病の治療における目への投与に用いること ができる。このような用途では、点眼瓶又はアプリケーターのような技術上知ら れている目への供給システムによって、組成物を投与することができる。組成物 は、更に、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシルプロピルメチルセ ルロース又はポリビニルアルコールのような凝性粘液剤（ＩＩＩｕｃｏＩｌｌｉ ＩＩＩｅｔｉｃｓ）、上記パーセントの、ソルビン酸ＥＤＴＡ又は塩化ペンジル コニウムのような防腐剤、通常量の希釈剤及び／又は担体物質を含有することが できる。

緑内障のような眼病の治療において人に投与する際には、結局は、処方箋を書く 医師が所定の患者に適当な投与量を決定し、それは患者の症状の性質及び重さと 共に１個人の年令、体重、応答に応じて変るものと予期することができる。代表 的には、組成物の目への投薬量は、薬として受け入れられる適当な希釈剤又は担 体にて、平均成人患者に１日１〜２回投与される４％ピロカルピン溶液で、２５ 〜５０ｕ　Ｑの範囲内にあるであろう。しかし、これらの数字は、単に説明上の ものであり、場合によっては、この限界外の投薬量を用いる必要があるがもしれ ない。

上記４方法のいずれかを用いて、水溶性化合物及び水不溶性化合物の間者を一つ のアルファートコフェロール小胞体生成物に取り込むことができる。

本発明のアルファートコフェロール小胞体を用いて水不溶性化合物を取り込むた めの上記方法によれば、一旦、水不溶性化合物が二重層膜に分配すれば、小胞体 がそのままである必要はない。

事実、一旦、化合物が二重層膜に分配すれば、／１１胞体が乱されたりあるいは 破壊されたりして、取り込まれた水性化合物を漏出又は放出することになる。こ れらの″漏出性ＩＩ　、Ｊ、形体は、取り込まれた水不溶性化合物を供給するの に用いることができるが、水溶性物質を被包あるいは供給するのに用いるべきで はない。

本発明の一実施態様によれば、アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステル のトリス塩を用いて、次のようなリポソームを製造すルコトが７−キル、　０． ＯＩＭ（７）　ト’Ｊ　Ｘ−ＨＣＱ　、　０．１４Ｍ（７）Ｎ　ａＣｐを含む緩 衝水溶液１ｍ（１当りに、アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのト リス塩を約１〜４００ｍｇ添加する。混合物を振とうして、アルファートコフェ ロールコハク酸ヘミエステルの乳状懸濁液を形成する。小胞体を遠心分離によっ てペレットにし、緩衝水溶液をくりかえし洗浄してもよい。アルファートコフェ ロールコハク酸ヘミエステルマルチラメラ小胞体（ＡＨ５−Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓ　） を音波処理して、アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルの小さなユニ ラメラ小胞体（Ａ　ＨＳ　−Ｓ　Ｕ　Ｖ　ｓ　）を形成することもできる。小胞 体は、２価のカチオンが存在すると不安定である。即ち、２価のカチオンにさら すと、取り込まれた水性区分及び水溶性化合物が放出される。従って、小胞体の 製造中又は貯蔵中に用いる水性媒質は、実質的に２価のカチオンを含むべきでは ない。

本発明の方法によって取り込まれた化合物は、種々の方法で用いることができる ０例えば、化合物が生物活性剤である場合は、アルファートコフェロール小胞体 に取り込まれた化合物を生体内に投与することができる。これは、通常、水溶液 に不溶性であるか又はわずかに可溶性である生物活性剤の生体内供給を促進する 。

アルファートコフェロールの有機酸誘導体の塩から構成されている小胞体に取り 込むことによって、より高い投与量：容積比でのこのような不溶性化合物の投与 を容易にすることができる。事実、生体内へ供給するために、一つ又はそれ以上 の生物活性剤を取り込むのに小胞体が用いられるので、本発明のアルファートコ フェロール小胞体が、特に有利に用いられる。更に、本発明の小胞体は、有機溶 剤を使用せずに製造することができるので、生体内で用いられる場合１通常の脂 質小胞体又はリポソームよりも優った利点を呈する。

生物活性剤である化合物を、本発明のアルファートコフェロール小胞体内に取り 込むことができる。このような化合物には、ゲンタマイシンのような抗菌性化合 物、リファンパシンのような抗ウィルス性化合物、アンホテリシンＢのような抗 真菌性化合物、アンチモン誘導体のような駆虫性化合物、アドリアマイシンのよ うな殺腫瘍性化合物、抗代謝物質、ペプチド、アルブミンのようなたんばく質、 ジフテリア毒素のような毒素、カタラーゼのような酵素、サイクロスポリンＡの ようなポリペプチド、エストロゲンのようなホルモン、ホルモン拮抗物質、アセ チルコリンのような神経伝達拮抗物質、ヒアルロン酸のような糖たんばく質、ア ルファーリボたんばく質のようなリボたんばく質、ＩｇＧのような免疫グロブリ ン、インターフェロン又はインターロイキンのような免疫調節剤、アルセナゾ■ のような染料、”Ｃのような放射性標識、　”　Ｔ　ｅのような放射線不透過性 化合物、カルボキシフルオレセインのような蛍光化合物、エストロゲン受容体た んばく質のような受容体結合分子、インドメタシンのような抗炎症性化合物、ピ ロカルビンのような抗緑内障剤、散瞳性化合物、リドカインのような局所麻酔剤 、コディンのような麻酔剤、アルファートコフェロールのようなビタミン、チミ ンのような核酸、ＲＮＡポリマーのようなポリヌクレオチド、ジアゼパムのよう な精神活性剤又は抗不安剤、単糖類、二糖類又は多糖類等があるが、これらに限 定されるものではない。取り込むことのできる多くの特定化合物のうちのいくつ かを挙げると、ピロカルピン；人の成長ホルモン、牛の成長ホルモン及び豚の成 長ホルモンのようなポリペプチド成長ホルモン；インドメタシン；ジアゼパム； アルファートコフェロールそれ自体及びチロシンがある。抗真菌性化合物には、 ミコナゾール、チルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾー ル、ビフォナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イ トラコナゾール、オキシコナゾール。

フェンチコナゾール、ナイスタチン、ナフチファイン、アンホテリシンＢ、ジノ コナゾール及びシクロピロックスオラミンがあり、ミコナゾール又はチルコナゾ ールが好ましい、２つ又はそれ以上の化合物を同時に取り込むことは、それらの 化合物が補足的又は相乗的効果を奏する場合には、特に望ましいかもしれない、 リポソームに入れて投与される薬剤の量は、一般に遊離薬剤の場合と同じであろ うが、投与回数は少なくなるかもしれない。

アルファートコフェロール小胞体に取り込まれるかあるいはそれと会合している 薬剤は、非経口接種又注射（例えば静脈注射、腹膜注射、筋肉注射、皮下注射、 耳内注射、乳房内注射等）１局所的適用（例えば目、皮膚のような部分の上に、 耳内に、又は傷及び火傷のような患部の上に）及び上皮又は粘膜皮膚層からの吸 収（例えば鼻１口、膣、直腸、胃腸の粘膜等）を含む適当な経路により、生体内 に投与されることができるが、これらに限定されるものではない。

これらの使用の別の例においては、アルファートコフェロール小胞体に取り込ま れた化合物を、脂質小胞体又はリポソーム、ゲル、オイル、エマルジョン等を含 む広い範囲の物質に取り入れることができるが、これらに限定されるものではな い。例えば、任意のタイプのリポソーム生成物（例えばリン脂質５ＰＬＶｓ、Ｍ ＰＶｓ、ＦＡＴＭＬＶｓ、ＭＬＶｓ、５ＵＶｓ、ＬＵＶｓ、ＲＥＶｓ及びその他 ）における成分として、取り込まれた化合物を含む懸濁液を水相に添加してもよ い、これによって、水不溶性化合物がリン脂質リポソームに取り込まれる。

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、１９８５年９月１０日出願で、そ の関連部分がここにも引用されており、標題が“′ステロイダルリボソームであ る同時係属米国特許出願番号節７７３，４２９号に記載されている如き、コレス テロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩小胞体のようなステロールの有機酸誘 導体の塩の小胞体と共に、有利に使用することができる。このようなステロイド のリポソームは、二重層膜小胞体を形成し、多分ユニラメラ又はマルチラメラで あり、生物活性剤である化合物を取り込むことができる。

一般に、有機酸の結合によって改質されうるステロールであれば１本発明の実施 に用いることができる。例えば、そのようなステロールには、コレステロール、 ビタミンＤ、フイトスアロール（シトステロール、カンペステロール、スチグマ ステロール等を含むが、これらに限定されるものではない）、ステロイドホルモ ン等があるが、これらに限定されるものではない。

ステロールを誘導体化するのに用いることのできる有機酸としては、前述のよう なアルファートコフェロールを誘導体化するのに用いる有機酸が挙げられる。

有機酸は、通常の方法を用い、エステル又はエーテル結合を介して、ステロール のヒドロキシル基に結合されることができる（例えば、米国特許第３，８５９， ０４７号、米国特許第４，０４０，７８４号、米国特許第４，０４２，３３０号 、米国特許第４，１８３，８４７号及び米国特許第４゜１８９．４００号参照） 、誘導体化されたステロールの塩は、ステロールの有機酸誘導体と塩の対イオン （例えば塩の遊離塩基）の両者を適当な揮発性溶剤に溶解し、蒸発又は同じよう な手法で溶剤を除去して、ステロールの有機酸誘導体の塩から成る残留物を残す ことによって作ることができる。用いることのできる対イオンには、対応する塩 を形成するトリス、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２− アミノエタノール、ビス−トリスプロパン、トリエタノールアミン等があるが、 これらに限定されるものではない、事実、ミコナゾール遊離塩基等のようなイオ ン化しうる生物活性剤の遊離塩基を、対イオンとして用いることができる。この ように、生物活性剤を、対イオンとして用いることができる。

本発明の小胞体において、ステロールの有機酸誘導体をアルファートコフエロー ルと共に用いる場合は、アルファートコフェロールに対するステロールの比は、 Ｑ　：　１００〜１００：０モル％で用いられる。

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、種々の物質を可溶化するために、 従来のリポソームと共に用いることもできる。

物質を、まずアルファートコフェロール小胞体内に取り入れ、かくして取り込ま れたものを、リポソーム内に取り入れることができる。一方、可溶化しようとす る物質が、２種類の小胞体を作るのに必要とするすべての物質と共に、始めに存 在していてもよい。

生成物の特殊な性質による他の用途については、出業者が想像できるであろう０ 例えば、本発明のアルファートコフェロールコハク酸ヘミエステル小胞体は、２ 価のカチオンに対する感度が高いので、生体内での比色診断法に使用するために 、２価のカチオンに鋭敏な指示染料を取り込んで作られることができる。

次の実施例は、説明のために示すもので１発明の範囲を限定するために示すもの ではない。

失−凰一虹−１ アルファートコフェロールコハク酸 ヘミエステルのトリス塩の製造 アルファートコフェロール水素コハク酸エステル〔シグマ　ケミカル　カンパニ ー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、ミズリー州、セントルイス〕 ５グラムとジエチルエーテル１００ｍ　Ｑに溶解した０次いで、約５ｍｌの水に 溶かしたトリス塩基〔フッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）社、ニューシャーシー州、フ ェアローン）　（１，１４ｇ）を０．５＋ａＲずつ撹拌又は振とうしながらエー テル溶液に加えた。その溶液を回転蒸発乾固し、次いで、更に高真空下で乾ｌし て、ゴム状の黄色失−嵐−孤一主 アルファートコフェロールコハク酸 ヘミエステルのトリス塩の　′ 熱水３ｍｎ中のトリス〔ヒドロキシメチルコアミノメタン２．２８ｇを、５００ ＩＱＱの丸底フラスコ中にて塩化メチレンＬｏｏｍ　ＱにＤ−アルファートコフ ェロール酸性コハク酸エステル１０ｇを２５℃で溶かした溶液に、かきまぜなが ら添加した。反応混合物は、恒温槽で５５℃に１５分間維持しながら、ロータリ エバポレータで回転させた。

溶剤を減圧下で除去し、生成物質を２４時間凍結させた。この物質を取り出し、 乳鉢と乳棒ですり砕き、過剰溶剤を２４時間真空下で除去した。生成題詞化合物 （４，８ｇ）を、密閉ガラスびん中に保存し、遮光した。

若しくは、この物質を４８時間凍結させた。

別の製造法においては、溶剤を凍結乾燥により除去した。

去−」Ｌ−似−」− アルファートコフェロール小胞体への アルセナゾｍ　（Ａｒｓｅｎａｚｏ　ｍ　の取り′み上述のようにして調製した アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩１００ミリグラムを 、０．ＯＩＭ　ｌ−リスーＨＣ党。

０．１４ＭＮ　ａ　ＣＱ及び４　、５＋ｏＭアルセナゾｍ　（Ａｒｓｅｎａｚｏ 　ｍ　）をすべてｐＨ７，３で含有する溶液１ｍＱに加え、３ｍｍのガラスピー ズの存在下で懸濁液を旋回混合した。生成したアルファートコフェロールコハク 酸ヘミエステルのトリス塩小胞体を、１０．００（ｌｘｇで１５分間遠心分離す ることによって、ペレット化し、その後、ペレットを洗浄し、０．０１Ｍトリス −ＨＣＤ及びＯ，］、４ＭＮ　ａ　ＣＱを含むＰＨ７，３の溶液１０１ＩＩＱ中 で３回再遠心分離した。生成ペレットは、アルセナゾ■の取り込みにより赤色を 呈した。取り込み度は、３０％と測定ブｙ！ブノ」し二伊刈紐並剋ヨ□□□−へ 匪隆生アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩５０■、コレ ステロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩５０■及び５−β−プレグナン−３ −オール−２０−オン〔カビビトラム（にａｂｉＶｉｔｒｕｍ）社、スエーデン 、ストックホルム）　２０■を過剰量のメタノールに加え、丸底フラスコ中で真 空下に乾燥した１次いで、１４０＋ｓＭ　Ｎ−ａ　ＣＱを含むｐＨ１，４の１１ ０１１Ｉトリス−ＨＣＱ緩衝液ｌ。

Ｏｍ＆ｌ中に、ガラスピーズの存在下で５強固なゲルが形成されるまで振とうし ながら、生成フィルムを再懸濁させた。ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）　Ｅ−モ デュール（４０ＫＨ２）　５ガロン水浴音波発生器で。

広範な音波処理を行うことによって、ゲルの粘度を低下させ、直径が０．２〜０ ．４ミクロンの小胞体を生成した。

コレステロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩を次のようにして調製した。オ ハイオ州、クリーブランドのＩＣＮ社製のコレステロール水素コハク酸エステル （５０，３ｇ、　０．１１モル）を１．５Ｑのジエチルエーテルに溶解した。ニ ューシャーシー州、フェアローンのフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）社製のトリス 塩（１２，１ｇ、　０．１（−ル）を３０ｍＱの水に溶解した６次いで、トリス 溶液をコレステロール溶液に加え、生成溶液を回転蒸発させて、乳状湿潤残留物 とした。乳状残留物を１２時間凍結乾燥し、その後、約５リツトル容量の沸とう 酢酸エチルから、コレステロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩生成物を３回 再結晶化させた。

沸とう酢酸エチル溶液を熱いうちに濾過し、室温にまで冷却した。ゲル状コレス テロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩が生じ、１００ｍＡの焼結がガラス漏 斗でそれを濾過し、酢酸エチルを除去した。溶剤の最初の除去は、圧搾によった 。別の製造法においては、最初の溶剤除去を機械的圧縮によって行った。更に。

０．１ｍ＋ｎＨｇの真空下で１２時間溶剤除去を行った。その時、銀貨の大きさ の２３ｇの円板の形をした固くてもろい白色物質が認められた。

白色円板を乳鉢と乳棒で粉末にして、その物質を５０”Ｃに加熱し、０．１ｎ＋ ｍ）Ｉｇの真空にすることによって、酢酸エチルの最後の痕跡を除去シタ、生成 粉末５５１１ｇを、　０．１４ＭＮ　ａ　ＣＱを含むｐ　Ｈ７，４（７）０．０ １Ｎトリス−ＨＣＱ緩衝液１．ＯｍＱ中に懸濁させた。乳状の懸濁液が生じ、そ れを水浴音波発生器で音波処理して、透明なコレステロールコハク酸ヘミエステ ルのトリス塩小胞体溶液を作った。

実施例５ サイクロスポリンＡ　（Ｃｙｃｌｏｓ　ｏｒｉｎ　Ａの可溶化サイクロスポリン Ａ〔サンドズ、インコーホレイテッド（Ｓａｎｄｏｚ、　Ｉｎｃ、）　、ニュー シャーシー州、イーストハノーバー〕。

コレステロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩及びアルファートコフェロール コハク酸ヘミエステルのトリス塩を、第１表に示した相対割合でメタノールに溶 解した。

最終水性ｉ濁液の容量を０．２５ｍ　Ｈにするのに十分な量の溶液の一部分を、 １３Ｘ１００ｍ＋ｏの試験管中で、試験管を７０”Ｃの水浴中の５００ｍＱ丸底 フラスコに入れ、回転蒸発で溶剤を除去することにょって乾燥して、薄いフィル ムにした。

このようにして得たフィルムに、０．１４ＭＮ　ａ　ＣΩを含むｐ　Ｈ７，３の ０．０１Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液０．２５ｒｎΩを加え、ガラスピーズの存在下 で懸濁液を旋回混合させながら、フィルムを再水和させた。

第１表に挙げた種々の条件下で、顕微鏡観察によりサイクロスポリンＡ結晶の有 無を調べ、その結果を第１図に示した。第１図に示すように、コレステロールコ ハク酸ヘミエステルのトリス塩及び／又はアルファートコフェロールコハク酸ヘ ミエステルのトリス塩の濃度が低すぎる場合は、サイクロスポリンＡの結晶が観 察された。

６０℃の水浴を使用して実験を繰り返した。その結果を第２図に示す。

失−万一何一且 ミコナゾールの可溶化 ミコナゾール遊離塩基（ＭＣＺ）、コレステロールコハク酸ヘミエステルのトリ ス塩（ＣＨ３）及びＤ−アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリ ス塩（ＴＨ３）の貯蔵溶液を、無水エタノールの５０ｍＱ溶液として調製した。

貯蔵溶液の適量を、５０ｍＱの丸底フラスコにピペットで入れた。

各フラスコには、第２表に示した相対割合で、合計０．１ｍｍｏＱの物質が含ま れていた。

６０℃での回転蒸発により、溶剤を除去した。次いで、０．０１Ｍトリス−ＨＣ Ｑを含むｐＨ７，４の０．１５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ　１．０ｍ　Ｑに、物質を再懸 濁させた。　生成物について、２週間以上にわたり、ミコナゾール結晶の形跡を 顕微鏡で、また相分離の形跡を肉眼で調べた。

結晶も相分離も観察されなければ、生成物は満足なものであると判定された（第 ３図参照）。

失−嵐一匠−Ｉ 垂　を　７、したラットへの ホルモンの持続　給 本発明の可溶化性及び徐放出特性を実証するために、中成長ホルモン（ＢＧＭ） が会合した２つのタイプの小胞体を調製した。

一つのタイプの小胞体は、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ又はレシチン）及び ＢＧＭと会合したアルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩を 含んでいた。もう一方の小胞体は、同じ成分に加えて、卵ホスファチジルエタノ ールアミン（ＥＰＥ）を含んでいた。

ＲＰＣが存在しない小胞体は、次のようにして調製した。溶剤相は、３７℃での 回転蒸発により、ＥＰＣ［シグマ　ケミカル　カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、ミズリー州、セントルイス〕４００■を含むクロロホ ルム溶液から溶剤を除去して調製した１次いで残留物をジエチルエーテル５ｍＱ に溶解した。アルファートコフェロール小胞体と会合したＢＧＨを含む水相は、 ０．１４ＭＮ　ａＣＱを含むｐＨ７，４の０．０１Ｍ　）−リス−ＨＣＱ１ｍＱ にアルファートコフェロールのコハク酸ヘミエステル２５ｍｇを加えることによ って調製した。不透明な懸濁液が生じ、それを、　５００ｎｍにおいて０．３と ０．６との間の光学濃度が得られるまで、上述のように音波処理して、透明にし た。０．３の示度が好ましい、粉末ＢＧＨ（イーライリリイ　（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ ｌｙ）社、インディアナ州、インディアナポリス〕２８ＩＩＩｇを、粉末を分散 させるために短時間の音波処理を行って旋回させることにより、０．３ｍＱの小 胞体生成物に添加した。乳状懸濁液が生じ、それは粉末そのままの形跡を示さな がった。この水相懸濁液を溶剤相に滴下した。その場合、かき乱されなければ。

液滴は沈み、不透明な底層を作るであろう。

しかしながら、溶剤相への水相の添加に関し、容器上にチッ素気流を流しながら エーテル相中の水滴を音波処理することによって、安定なマルチラメラ／ＩＳ形 体［５ＰＬＶ、レンダ等（Ｌｅｎｋ　ｅｔａｌ、）、米国特許第４．５２２．８ ０３号〕の形成が促進された。溶剤を蒸発させ、ペーストを残し、最終濃度の１ ０鱈ＣａＣＱ□を含む上記トリス−ＨＣＱ緩衝液１０ｍ　Ｑ中でそれを再水和さ せた。カルシウムは、アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス 塩によって与えられた電荷を中和し、遠心分離におけるリポソームの強固なペレ ット化を促進した。ゆっくり旋回混合することによって、再水和が促進された。

生成５ＰＬＶｓを、１０，０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離してペレット化し 、４バツチからのベレットをプールして、トリス−Ｈ（１１／カルシウム緩衝液 で更に２回洗浄した。上澄み液をデカントして粘性ペレットを残し、その約０． ５ｍ　Ｑ部を以下の研究に使用した。

ＥＰＥを更に含有する小胞体は、Ｅ　Ｐ　Ｃ１，５４ｇを含むクロロホルム溶液 とＥＰＥ　（アバンティ　ポーラ−リピッズ、インコーポレイテッド（Ａｖａｎ ｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ、）　、アラバマ州、バーミンガム） 　５２．８Ｂを含むクロロホルム溶液とを丸底フラスコ中で混合し、３７℃での 回転蒸発によってクロロホルムを除去して調製した。生成乾燥脂質フィルムを２ ０ｍＱのジエチルエーテルに溶解し、アルファートコフェロールコハク酸ヘミエ ステルのトリス塩小胞体と会合したＢＧＭを含む水相を添加した。

水相は、０．１４ＭＮ　ａ　ＣＱを含むｐＨ１，４の０．ＯＩＭ　）−リスーＨ ＣＱ緩衝液の２５Ｂ／ｍＱアルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルトリ ス塩液１．２ｍ　Ｑに、　１１２ｍｇのＢＧＭを可溶化することによって調製し た。アルファートコフェロール懸濁液を、前もって４０．０００ボンド／平方イ ンチの圧力でフレンチ圧力セルプレス〔ニス　エム　エル　インストルメンツ、 インコーホレイテッド（ＳＬＭ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、）　、イリ ノイ州、アーパナ〕に通し、５５０ｎｍにおける光学濃度を０．３−０．６にし た。

上述のように、チッ素下で音波処理しながら、エーテル相に水相を加えることに よって、粘性の５ＰＬＶペーストが作られ、０、ＯＩＭ　トリス、０．１４ＭＮ 　ａ　ＣＱ及び１０ｍＭＣａ　ＣＱ部を含むｐＨ７，４の緩衝液２０ｍＱでそれ を再水和させた。再水和は、ガラスピーズの存在下で旋回混合しながら行われた 。生成リポソームを合計２０ｍＱの上記緩衝液で３回洗浄し、ＪＡ−１４日−タ を用いたバックマン（Ｂａｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１遠心分離機で、　１０．ＯＯ Ｏｒｐｍにて４５分間遠心分離した。生成した粘性ペレットの約０．５ｍ　Ｑ部 を以下の研究に使用した。

小胞体の徐放性を、マサチューセッツ州、ウィルミングトンのチャールズ　リバ ー　ブリーディング　ラボラトリイズ　インコーホレイテッド（Ｃｈａｒｌｅｓ 　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）から の生後２５日の雌の下垂体切除ラットで調べた。到着時に動物の体重を測り、２ 日間５％グルコースの規定食を取らせ、その後。

任意に水とラット用食事に切り替えた。動物の体重を、生後３２日と３９日に測 り、この期間中に１０ｇ以上増えたものは、下垂体切除が不完全なものとして除 外した０次いで、８匹の動物のグループに、遊離ＢＧＭ又は小胞体調製物のうち の一つに取り込まれたＢＧＭを、筋肉注射（１，Ｍ、）又は皮下注射（Ｓ、Ｃ， ）ｔ、た。

遊ＭＢＧＨを与える動物には、毎日Ｓ、Ｃ，を行った。一方、小胞体会合ＢＧＨ を与える動物には、第４図に示したルートで、ＥＰＣ／ＥＰＥ製剤に関しては約 ９．８ｍｇの会合ホルモン（小胞体製造中に７０％会合と推定）を、又５．６ｍ ｇ　（Ｅ　Ｐ　Ｃ製剤に関しては会合４０％と推定される）を、最初の日に一回 だけ注射した。比較動物には、処理を施さなかった。データは、各グループの８ 匹の動物についての平均体重変化値を示す。

第４図に示す略号は次の通りである。（１）ＥＰＣ：　ＥＰＣ／−ＴＨ８−ＢＧ ＨＳ、Ｃ，は、卵ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルエタノールアミン及 びアルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩を含む小胞体と会 合した牛成長ホルモンが、皮下に投与されたことを意味する。（２）ＥＰＣ／− ＴＨ８−ＢＧＨＳ、Ｃ，は、卵ホスファチジルコリン及びアルファートコフェロ ールコハク酸ヘミエステルのトリス塩を含む小胞体（卵ホスファチジルエタノー ルアミンは存在しない）と会合した牛成長ホルモンが、皮下に投与されたことを 意味する。（３）ＥＰＣ／−ＴＨ８−ＢＧＩ−（１，Ｍ、は、筋肉内に投与する ことを除けば、（２）と同じである。

第４図に示すように、未処理比較動物は、実験過程で目立った体重増加を示さな かった。遊離ＢＧＭによって、著しい成長が生じたが、遊離ＢＧＨの投与は、毎 日行われた１種々の会合ＢＧＭ−小胞体調製物によって生ずる成長促進は、幾分 低いが、これらの生成物をたった１回注射するだけであるという事実を考えると 。

顕著なものであった。ＥＰＣ：　ＥＰＥ／ＴＨ８小胞体と会合したＢＧ）（を皮 下に投与した場合に、最良の結果が認められた。

去−」糺−夕（−望 第３表に示す種々の量のＤ−アルファートコフェロールコハク醋ヘミエステルの トリス塩（″トリス塩″）粉末を、５マイクロ’Ｊ　７　ト）Ｌ／（Ｑ”Ｃｒ　 ヲ添加した０、０１Ｍ　ト’）　ス１０．１４ＭＮ　ａ　ＣＱ緩衝液（ｐ　Ｈ７ ，４）　５．０ｍｇ量ずつに、丸底フラスコ中で加えた。ｗＸ濁液を２分間かき まぜて、トリス塩を溶解し、２時間静置して、ＭＬＶｓを形成した。一方、トー マスサイエンティフィック　スペクトレイパー（Ｔｈｏｍａｓ　５ｃｉｅｎｔｊ ｆｊｃ　５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ）　１２．ＯＯＯＭＷＣ０１／４′透析チユーブ をフインチの長さに切り、蒸留水を２回とりかえながら１時間煮沸した。バッグ を一端でしばり、各Ｍ　Ｌ　Ｖ生成物から１．０ｍ　Ｑをバッグ内にピペットで 入れた。バッグを上端でプラスチックファスナーにより閉じ、ティーエムエーナ リティック（Ｔ　Ｍ　Ａ　ｎａｌｙｔｉｃ）モデル１１９１ガンマカウンターで 、１分間放射能を計測した０次いで、１００ｍｇのトリス／　Ｎ　ｚ　ＣＱ　緩 衝液中で、撹拌しながら、各バッグを透析した。６時間後、透析物を新しい緩衝 液と交換した。透析は、２０時間継続した。次いで、バッグの放射能を計測し、 取り込まれた５″Ｃｒのパーセントを次のようにして計算した。

捕捉された容量（溶質）値は、次のようにして計算した。トリス塩のサンプル量 当り３回の試験から得られた計測数を平均し、計算された取り込みパーセント（ 上記）と既知のマイクロリットルで表わされるサンプル容量（５，Ｏｍ　Ｑ　＝ ５０００　Ｑ　）とがら、脂質のマイクロモル当りの１／＋ｏｏｆｌ　”Ｃｒを 次のようにして計算した。

番′み％　全マイクロリットル”量 トリス塩のマイクロモル 結果を第３表に示す。

一大一五−五一旦 ピロカルピンーアルファートコフ 二ロールコハク酸ヘミエステル ピロカルピン塩基５ｇを、秤量した５００ｍｆｌの栓付き丸底フラスコに入れ、 全質量をグラム数で記録した。Ｄ−アルファートコフェロール酸性コハク酸エス テル（１２，７５ｇ、ピロカルピン：Ｄ−アルファートコフェロールの１：１の モル比に相当）フラスコに加え、内容物を再度秤量した。メチレンクロライド（ ５０ｍＱ）を加え、フラスコをかきまぜ、固体を溶解させ、フラスコを再度秤量 した。フラスコに、５５℃の水浴中のロータリエバポレータに載せ、３０分間回 転させた（真空は適用せず）。３０分後、フラスコと内容物を再度秤量し、次い で、５５℃にて真空で回転蒸発させた。

その後、２回の連続した秤量が０．１ｇ以内になるまで、フラスコの重量を３０ 分毎に記録した１次いで、生成物を室温（２５℃）に冷却し、栓をして、４℃で 貯蔵した。

失−五一員一烈 ビロカルピンーアルファートコフ 二ロールコハク酸ヘミエステル ５．０リツトルの栓付丸底フラスコ、ピロカルピン塩基３０ｇ、Ｄ−アルファー トコフェロールコハク酸エステル（ピロカルピン：Ｄ−アルファートコフェロー ルの１：１のモル比に相当）、及びメチレンクロライド３００ｍＡを使用して、 実施例９の材料、方法で実施した。

上記実施例９の生成物を含む５００ｍＧの丸底フラスコをロータリエバポレータ に載せ、水浴温度を５５℃にセットした。塩を３０分間暖めた後、水浴温度を３ ５℃に低下させた。０．１％（ｗ／ν）ソルビン酸と０．１％（ｖ／ν）ＥＤＴ Ａナトリウムニ水和物の水溶液（９２ｍＡ）を加え、懸濁液を旋回混合した。水 相を加えて、最終容量を１２５ｍ　ｍに調節した。生成リポソームを、Ｃ５Ｒ（ 連続サイズ低減）、即ち大きい容量のリポソームを連続処理して、均一な平均直 径を有するサイズの小さいリポソー・ムを作る方法及び装置で処理した。

サイズ低減装置は、（、）高圧ビス１〜ンボンプ、（ｂ）所定の細孔サイズを有 するイン−ライン　フィルターエレメント、（ｃ）供給ストック（リポソーム懸 濁液）を入れる貯槽及び（ｄ）処理した供給ストックを集める貯槽がら構成され ている。このシステムは、再循環のために供給容器へ原料を逆流させるが、ある いは処理収集容器へ流すかを方向づけるバルブユニットを含んでもよい１．これ らに限定されるものではないが、ポンプヘッドそれ自身のピストン作用によるポ ンプヘッドへのくみ上げ、及び／又は外部装置による供給ストックの外部ボンピ ングを含む任意の通常手段で、供給ストックをポンプへ供給することができる。

ポンプヘッドによって、供給ストックをフィルターユニットに循環させるエネル ギーが与えられる。

上記実施例においては、公称細孔サイズが５００ｎｍのステンレススケールフィ ルターに、リポソームを１０回通した。

上記方法は、第４表による水相組成物を用いて行われた。

・災−凰一災−■ ピロカルビンアルファートコフェロ ールコハク酸ヘミエステル）ＪＳ胞形体支圧ス夾定腹互 実施例１１の生成物を、凍結破面電子顕微鏡検査によって調べた。

その結果、サイズ範囲が約３０〜２２５ｎｍで主にユニラメラのリポソーム集団 が認められる。実施例１１のようにして作った小胞体については、準弾性光散乱 を用いても測定した。

叉一度一災一眼 ビロカルビンーアルファートコフ 二ロールコハク酸ヘミエステル 細孔サイズが４０Ｏｒ＋ｗ＋の２枚のヌクレオボア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）フ ィルターを通してサイズを小さくするＶ　Ｅ　Ｔ４００法（小胞体押出技法）を 使用して、実施例１１の材料、方法で実施した。Ｖ　Ｅ　Ｔ４００法は、１９８ ５年１０月１６日出願の、標題が″ユニラメラ小胞体を製造する押出方法”であ る、カリス等（Ｃｕｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ。）の同時係属米国特許出願番号第７ ８８，０１７号に記載されており、その関連部分は、ここにも引用されている。

水相として、０．１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡと共に、０．１％（ｖ／ｖ）ソルビン 酸を用いて、上記方法を実施した。

大−五一性一旦 ２１ソ乙隨公」≦（入テＪ４１釦 バッチリポソームの　゛ 実施例１１の材料及び方法で実施し、大きさをそろえたバッチを全容量が７５０ ｍＱとなるように合せた。次いで、実施例１１と同様にしてリポソームを処理し た。

また、第６表による水相組成物を使用して、上記方法を実施した。

ヌー」１−麿１　１５ 上記実施例１０の生成物を含む５Ｑの丸底フラスコをロータリエバポレータに載 せ、水浴温度を５５℃にセットした。塩を３０分間暖めた後、水浴温度を３５℃ に低下させた。０．０１％（ｖ／ｖ）ソルビン酸０．０１％（ｖ／ｖ）ＥＤＴＡ −ナトリウム二水和物の水溶液（５５０ｍＱ）を加え、懸濁液を撹拌翼を用いて １〜１．５時間混合した。水相を加えて、最終容量を７５０ｍｆｌに調節した８ 生成リポソームをＣ３Ｒ（連続サイズ低減）で処理した。即ち、公称細孔サイズ が５００ｎ＋ｉであるステンレススチールフィルターに、リポソームを１゜回通 した。

また、第７表による水相を使用して、上記方法を実施した、Ｘ−凰一気一胆 ビロカルピン１．０ｇ、Ｄ−アルファートコフェロール、１．２８　ｇに相当す るピロカルビン＝Ｄ−アルファートコフェロールのモル比１：０．５を用いて、 実施例１１の方法及び材料を繰返した。実施例１２の方法によりリポソームを形 成した。この場合、添加した水相は、米国薬局方の注射用蒸留水であり、ピロカ ルピンの最終濃度が４％となるようにした。上記リポソーム溶液の粘度に関する 結果を、第８表に挙げる。

０．１％（ｖ／ｖ）ソルビン酸と０．１％（ｖ／ｖ）ＥＤＴＡ−ナトリウム二水 和物の米国薬局方注射用蒸留水を用いて、上記方法を繰り返した。

実施例１７ ピロカルピン１．０＝、０−アルファートコフェロール５．１ｇに相当するピロ カルビン＝Ｄ−アルファートコフェロールのモル比１：２を用いて、実施例１６ の方法及び材料を繰返した。実施例１２の方法によりリポソームを形成した。こ の場合、添加した水相は、米国薬局方注射用蒸留水であり、ピロカルピンの最終 濃度が４％となるようにした６上記リポソーム溶液に関する濃度の結果を第８表 に挙げる。

０．１％（％Ｉ／Ｖ）ソルビン酸と０．１％（ｗ／ｖ）　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ−ナト リウム二水和物の米国薬局方注射用蒸留水水溶液を用いて、上記方法を繰り返し た。

ヌーｍ ピロカルピン１．０ｇ、Ｄ−アルファートコフェロール１０．２ｇに相当するピ ロカルピン：Ｄ−アルファートコフェロールのモル比ｌ：４を用いて、実施例１ ６の方法及び材料で繰返した。実施例１２の方法によりリポソームを形成した。

この場合、添加した水相は、米国薬局方注射用蒸留水であり、ピロカルピンの最 終濃度が４％となるようにした。上記リポソーム溶液に関する濃度の結果を第８ 表に挙げる。

０．１％（ｗ／ｖ）ソルビン酸と０．１％（％ｌ／Ｖ）　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ−ナト リウム二水和物の米国薬局方注射用蒸留水水溶液を用いて、上記方法を繰り返し た。

第２」−二数 サイクロスポリンＡの可溶化 ａＣＨ８は、コレステロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩である。

ｂ　ＴＨ８は、アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩であ る。

Ｃ示した数字は、最終水溶液中のサイクロスポリンＡ＋ＣＨ８＋ＴＨ５のモルの 合計数である。

第一」し−表 調製物（全マイクロモル＝Ｏ，ＸＯ）におけるミコナゾール、コレステロールコ ハク酸ヘミエステル（トリス塩）及びＤ−アルファートコフェロールコハク酸ヘ ミエステル（トリス塩）の割合（モ茅−５−艮 準弾性　散乱法によるピロカルピン−ＴＨ８小胞体の測２混合せず　２０５ ４：１　２０２ １：１１　２０６ １　：　１０　２３３ 邦ど一旦一」＆ 多二」１　水　組　成　％　（Ｗ／ｖ ＢＡＫ　’））Ｌ／ビン酸　＊ＥＤＴＡ　ＰＶＡ　ＨＰＭＣ第一二し一艮 Ｊ！Ｌｊ４．　水　相　組　％　（警／ｖ）ＢＡＫ　Ｖ）Ｌ／ビン酸　１１ＥＤ ＴＡ　ＰＶＡ　ＨＰＭＣｆ■一旦一」改 リポソーム調製物の粘度に及ぼすピロカルピン塩基：Ｄ−アルファートコフェロ ールのモル比　化の影響モル比　結　果 ＷＦＩ　ソルビン酸ＥＤＴＡ １：０．５　粘稠　分散、混濁 ｌ：１　分散、混濁　分散、混濁 １：２　分散不能　分散不能 ｌ：４　分散不能　分散不能 第１図 ・＝結晶存在せず ＋＝結晶が存在 第２図 Ｃ＝コレステロールコハク酸ヘミエステル・＝許容できる 十二許容できない 第３図 ａ＝ミコナゾール ｂ＝コレステロールコハク酸ヘミエステル（ＣＨ８）Ｃ＝アルファートコフェロ ールコハク酸ヘミエステル（ＴＢＳ）・＝許容できる ＋＝許容できない 第４図 下垂体を切除したラットの成長プロフィール日　数 凡　例 シー１　遊歴、ＢＧＭ２５０μｇ／日、毎日投与’ｙｆ−□　ＥＰＣ：ＥＰＥ／ ａ−ＴＢＳ−ＢＧＨ５，Ｃ。

ム・・・・・ムＥＰＣ／ａ−ＴＨ５−ＢＧＨＳ、Ｃ。

０−ＯＥに／ａ−ＴＢＳ−ＢＧ）１１．Ｍ。

０一つ　処理せず 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和６２年６月１５８ １、国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ　８６１０２１０１、発明の名称　アルファト コフェロールをベースとした小胞体 ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国ニュージャーシイ用０８５４０．プリンストン、プリンス トンフオレスタルセンター、ワン　リサーチ　ウェイ（無番地） 名称　ザ　リポソーム　カンパニー、インコーホレイテッド代表者　ブルーム、 　アレン ４、代理人 住所　〒１０５ 東京都港区西新橋二丁目３番２号　ニュー栄和ビル１９８７年３月６日 ６、添付書類の目録 １１７、更に、生物活性剤を含む請求の範囲第１１６項による組成物。

１１８、ステロール又はアルファートコフェロールの塩が、生物活性剤塩である 請求の範囲第１０４項による組成物。

１１９、コレステロールのコハク酸ヘミエステルのトリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン塩、アルファートコフェロールのコハク酸ヘミエステルのトリス（ ヒドロキシメチル）アミノメタン塩及びサイクロスポリンＡ　（ｃｙｃｌｏｓｐ ｏｒｉｎ　Ａ）を含む組成物。

１２０、リポソーム懸濁液をフィルターユニットに通す工程を含む、リポソーム 懸濁液からリポソームを押し出す方法。

１２１、フィルターユニットが、金属で構成されている請求の範囲第１２０項の 方法。

１２２、リポソーム懸濁液をフィルターユニットに通す工程の前に、リポソーム 懸濁液を調製してリポソームにする工程を含む請求の範囲第１２１項の方法。

１２３、フィルターユニットが、約５００ナノメーターの細孔サイズ範囲を有す る請求の範囲第１２２項の方法。

１２４、リポソーム懸濁液を、加圧下にフィルターに通す工程を含む請求の範囲 第１２３項の方法。

１２５、リポソーム懸濁成製フィルターユニットに約１０回再循環させる工程を 含む請求の範囲第１２４項の方法。

１２６、リポソーム懸濁液が、Ｄ−アルファートコフェロール酸性コハク酸エス テルを含む請求の範囲第１２５項の方法。

１２７、フィルターユニットが、約５００ナノメーターの細孔サイズ範囲を有す る請求の範囲第１２０項の方法。

１２８、リポソーム懸濁液をフィルターユニットに通す工程の前に、リポソーム 懸濁液を調製してリポソームにする工程を含む請求の範囲第１２７項の方法。

１２９、（ａ）リポソーム懸濁液の供給ストックを入れるのに適した貯槽−（ｂ ）（ａ）に連通ずるポンプ、（ｃ）（ｂ）に連通ずるフィルターユニットを含む リポソーム押こ出し装置。

１３０、フィルターユニットが、金属で構成されている請求の範囲第１２９項の 装置。

１３１、フィルターユニットが、約５００ナノメーター以下の細孔サイズ範囲を 有する請求の範囲第１３０項の方法６１３２、（ａ　’）リポソーム懸濁液を貯 槽内へ入れること。（ｂ）ポンチ手段によって、該リポソーム懸濁液を貯槽から フィルターユニットへポンプ輸送すること、及び（ｃ）リポソーム懸濁液をフィ ルターユニットに通すことを含むリポソーム押し出し方法。

１３３、リポソーム懸濁液を貯槽内へ入れることが、リポソームの形でリポソー ム懸濁液を貯槽内へ入れることを含む請求の範囲第１３２項の方法。

１３４、リポソーム懸濁液をフィルターユニットに通することが、リポソーム懸 濁液を金属フィルターユニットに通すことを含む請求の範囲第１３２項の方法。

１３５、リポソーム懸濁液を金属フィルターユニットに通すことが、リポソーム 懸濁液を５００ナノメーターよりも小さい細孔サイズ範囲の金属フィルターに通 すことに含む請求の範囲第１３４項の方法。

１３６、金属フィルターユニットが、ステンレス鋼である請求の範囲第１３５項 の方法。

１３７、金属フィルターユニットが、ステンレス鋼である請求の範囲第１３１項 の方法。

国際調査報告 “ｎｍｎａ＋′ｏｎａ′Ａ１１ｌｌｌ（ｌｌｌａｎ　Ｎａｐ、Ｔ、、、８，０２ ．　ｏ。