JPH02504027A - プロスタグランジン‐脂質製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロスタグランジン−８製 関　した米　出　　料 この出願は１９８７年５月２２日に出願された共係属特許出願第０５３，３Ｑ、 ’）号の一部継続出願である。

見見例里見 本発明は、アラキドン酸代謝物−結合リボンーム製剤およびその製造方法に関す る。このアラキドン酸代謝物としてはその構造類似体１合成ｉ＊ｒ凹害剤および アラキドン酸それ自体が挙げられる。アラキドン酸代謝物の一つの種類として、 プロスタグランジン類として知られている生物活性剤のグループがある。この発 明はプロスタグランジンＥ、を用いたプロスタグランジン−結合リポソームを特 に開示している。この「プロスタグランジン」という語は天然に存在するプロス タグランジンに構造的に関連した合成化合物をも包含している。

プロスタグランジンは本質的に全ての人間の組織および体液中に見出される物質 であり、事実止金ての生物学的機能を包含する広範囲の効果を奏している。これ らの物質は２０個の炭素原子の必須脂肪謙（アラキドン酸、最も登高な前耗体） から得られ、このものは以下に示される２０−炭素プロスタグランジンサグクラ スＥ、（ｒＰＧＥ、Ｊ　）のような構造を生物学的に合成されるので他のプロス タグランジンのサブクラス類は文字によって指定され、またそのシクロペンタン 環における置換によって区別される。

このようなサグクラス類としてはプロスタグランジンＥおよびＦａシリーズがあ り、これらはＥの誘導体であるサグクラスＡ、ＢおよびＣと共に、最も集中的に 研究されてきたものである。プロスタグランジンＡからＦまではｒ第一のプロス タグランジン類」と考えられており、プロスタグランジンＧ２およびＨ，（環状 エンドパーオキシド類）およびスロンボキサンＡ２およびＢ２の構造はより最近 になって解読された［Ｇｏｏｄｍａｎら編、ザファーマコロジカルベーンスオブ セラボイティクス（Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏ ｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、　Ｍａｅｍｉｌｌｉａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ　Ｃｏ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ＰＰ　６６８−６７６：１．本発明に用いることのできる他の生物活性剤として はブロスタサイタリン類およびロイコトリエン類がある。

プロスタグランジン類は、血管拡張作用、末梢血管循環改善および抗脂肪分解作 用のような種々の生理作用を有する。このプロスタグランジン類は種々の状態で 治療的に指示され、その状態としては動物における動脈管（ｄｕｃｔｕｓ　ａｒ ｔｉｏｓｕｓ）、　’ＪＢ産と同様、出産予定日における陣痛を誘導する子宮収 縮の刺激、気管支喘息の処置、および胃潰瘍の抑圧等があるが、これらに限定さ れるものではない、これらはまた動脈硬化の予防に用いられる。

リポソームは取り込まれた水性容量を有する完全に閉鎖された二分子膜層である 。リポソームはユニラメラ小胞体（ｕｎｉｌａｉｅｌｌａｒｖｅｓｉｅｌｅｓ） 　（単−膜二分子層を有す）もしくはマルチラメラ小胞体（多数の膜二分子層に よって特徴づけられる玉葱様構造をもち、各層は水性層によって次の層と分けら れている）であることもできる、この二分子層は疎水性“尾部”領域と親水性“ 頭部”領域を有する２つの脂質モルイフ−（一分子層）から成っている。膜二分 子層の構造は、単分子膜の疎水性（無極性）の脂質モルイヤの”尾部″が二分子 層の中心に向かっており、一方親水性（極性）の”頭部”が水性層に向かうとい ったものとなってぃ机 パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）等の、初期のリポソーム製造〔ジャーナルオブモレ キュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍ。１．Ｂユ。１．）、１２，２３８−２５２，１ ９６５〕は有機溶媒中にリン脂質を懸濁させ２次いでこの溶媒を蒸発乾燥させ、 反応容器上にリン脂質の膜を残留させるものである。

続いて適当量の水性相を添加し、この混合物を”膨潤（ｓｗｅｌｌ）″させ、そ して得られたマルチラメラ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）小胞体（ＭＬνＳ） からなるリポソームを機械的手段で分散させる。この技術が。

パパハジョボウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｉｏｐｏｕｌｏｓ）らによって記載され た〔バイオヒミカエトバイオフィジカ　ラント　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）１３５，６２４−６３８．１９６８）音波処理さ れた小さなユニラメラおよび大きなユニラメラ小胞体の開発のための基礎を提供 している。

ユニラメラ小胞体はＣｕ１ｌｉｓ等、ＰＣＴ公開番号８６１０　Ｏ２３８，１９ ８６年１月１６日１名称“ユニラメラ小胞体製造のための押し出し手法″に記載 されている方法によって押出機を用いて製造することができ、これはここで引用 している。この手法によって作られた小胞体は、ＬＵＶＥＴＳと呼ばれ、加圧下 で膜フィルターを通して押し出される。小胞体は、２００ｎｍのフィルターを通 す押し出し技術によって作られてもよい、このような小胞体は、　Ｖ　Ｅ　Ｔｚ ｏｅ　Ｓとして知られている。

リポソームを製造するための他の技術としてはパパジョボウロス（米国特許第４ ，２３５，８７１号、１９８０年１１月２５日発行）の［逆相蒸発（ＲＥＶ）Ｊ 法がある。この方法はオリゴラメラ脂質小胞体を製造し、ここでは取り込まれる べき水性物質が有機溶媒中の脂質に添加され、油中水型エマルジョンを形成する 。

この有機溶媒が除去されてゲルを形成する。このゲルは水性媒体中に分散され、 それをＭ濁液に変える。また別の方法としては洗浄剤−透析法〔ニック（Ｅｎｏ ｅｈ）ら、　１９７９．プロシージングスオブザナショナルアカデミーオブサイ エンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、）、７６：１４５）である、 この方法では、脂質をデオキシコレートのような洗浄剤と水中で混合し、音波処 理を行い、ゲルろ過によってこの洗浄剤を除去する。更に別の技術としては、小 さなユニラメラ小胞体を製造するためのバツリイ（Ｂａｔｚｒｉ）　　ら（１９ ７３，パイオヒミカバイオフィジカ　ラント　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂ４ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）、２９８：１０１５）のエタノール注入法であり 、ここでは脂質のエタノール溶液が目的とする水性相に注入され、直径が約３０ ｎｍから２ｕｍのリポソームを形成するものである。残っているエタノールは続 いて回転蒸発により除去することができる。

本発明において使用することのできる他の種類のリポソーム類に、実質的に均一 なラメラ溶質分布を有することを特徴とするものがある。この種のリポソーム類 は、　Ｌｅｎｋ等米国特許第４，５２２．８０３で定義されているように、安定 複ラメラ小胞体（ＳＰＬＶ）、ハウンライン（Ｆｏｕｎｔａｉｎ）等、米国特許 第４．５８８゜５７８号に記載されているような単相性／Ｊ％胞体及びこの方法 はＢａ１１ｙらのＰＣＴ公開Ｎｏ、８７１０００４３．１９８７年１月１５日、 発明の名称は“改善された取り込み効果を有するマルチラメラ　リポソーム類” に記載されているが、該小胞体は少なくとも１回の凍結融解をサイクルにさらさ れた。凍精解凍した多重ラメラ小胞体（ＦＡ丁ＭＬＶ）と呼ばれている。これら の文献の関連ある部分は参考のためにここに引用されている。

リポソーム−薬搬送（ｄｅｌ　１ｖｅｒｙ　）系において、薬のような生物活性 剤をリポソーム中に取り込むか或いは会合させ１次いで治療すべき患者に投与す る。例えば、ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）等、米国特許第３，９９３，７５４号； 　５ｅａｒｓ、米国特許第４，１４５，４１０号；パパジョボウロス等、米国特 許第４，２３５，８７１号；シュネイダー（Ｓｅｈｎｅｉｄｅｒ）　。

米国特許第４，１１４，１７９号；レンダ（Ｌｅｎｋ）等、米国特許第４，５２ ２，８０３号；及びファウンティン（Ｆｏｕｎｔａｉｎ）等、米国特許第４，５ ８８，５７８号参照。

薬を投与するためのリポソーム類の使用は、薬の取り込みおよび治療の間の薬放 出の両者に関して問題を生ぜしめた。取り込みに関しては、患者に与えられる脂 質の負荷を最小限にするよう取り込み効率を増加させることがこれまでずっと必 要とされてきた。

これに加えて、高取り込み効率とは、はんのわずかな量の薬だけしかこの取り込 み工程の間に失われないことを意味しており、これは高価な薬を扱うときに重要 な利点である。薬放出に関しては、多くの薬がカプセルに包まれた後リポソーム から急速に放出されてしまうことが見出された。このような急速な放出はリポソ ームカプセル包囲の有利な効果を消滅させるものである。したがって。

リポソームからの薬の放出の割合を減少させる方法を見出すために、当業者によ り努力が続けられている。

カプセル包囲および放出に関するこれらの問題に加えて、薬含有リポソームを臨 床医に提供するための商業上許容し得る方法を見出すという最大の問題がある。

リポソームの製造および「必要とさ九る」基本上にリポソームを装薬することは 実験の状態では許容し得る手法であるが、それは一般的には＠床の状態では不満 足なものである。したがって、カプセルに包まれた薬を含有するものも含有しな いものも含めてリポソームを輸送し、貯蔵し、実質的な損害なしに通常の商業的 な流通手段と通して移動させる手段を見つけるための重大な必要性が継続的にあ るのである。

ｌ匪ム１１ 本発明は、プロスタグランジンをリポソーム中に区画分割（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｉｎｇ）およびそれに続く取り込みの両者およびリポソーム−取り込みプロスタ グランジン製剤の安定性を非常に改善させるカプセルに包む方法を開示している 。より特定すれば、このリポソームはまず比較的塩基性のｐＨの水溶液中で製造 され、このｐＨは後から比較的酸性のＰＨに調整される。リポソームの外部溶液 を急性化するとき、プロスタグランジンはリポソームと結合する。このような結 合物は区画分割によりリポソーム膜中に及び膜を通じて入っていくのである。こ の方法では驚くべきことに、プロスタグランジンのリポソーム中への５０〜１０ ０％の取り込みという結果となる。この取り込みを獲得するために用いられるこ の緩衝系はしたがって区画分割−強化緩衝剤と呼ばれる。

得られたリポソームは均一なサイズの分布となるまでサイズの減少が行われる。

ｐＨの調整に続き、ｖｆられた溶液は脱水されるか凍結粉砕され、使用まで貯烹 され、使用時には水溶液を用いて再水和することができる。このような方法はそ の乾燥工程（脱水もしくは凍結乾燥）の前に乾燥保護剤（ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ 　）の添加を必要とし、乾燥工程は再水和後のリポソーム粒子のサイズを維持す るものである。このような乾燥保護剤がないと、水性懸濁液中にあるときのリポ ソームの完全な状態（ユｎｔｅｇｒユｔｙ）を維持する力が除去される。このよ うな保護剤としてはシュークロース、デキストロース、マルトース、マンノース 、ガラクトース、ラフィノース、トレハロースもしくはラクトースのようなサツ カロイドを挙げることができる。マンニトールはどのようなサツカロイドとも一 緒に用いることができる。アルブミン、デキストランもしくはポリ（ビニルアル コール）のような他の物質もまた用いることができる。

高価でない脂質が本発明で用いることができ、広範囲の脂質組成に対し約５０％ およびそれ以上（好ましくは８０−１００％）の取り込み効率が容易に得られる のである。このｐＨ−Ｎ動取り込み方法のもう一つの独特の利点は、薬がリポソ ームから数比される割合を減少させることで、その結果、消極的に取り込まれた （ｐＨ勾配なし）プロスタグランジンを有するリポソームと比べて安定性が増大 する。取り込まれた生物活性剤の数比の減少された割合は、この製剤中で用いら れている水溶液のＰＨの相違（区画分割強化緩衝系）によって測定される。すな わち、この区画分割強化緩衝剤もしくは緩衝系がリポソームにおけるプロスタグ ランジンの維持を助けるのである。

すなわち１本発明は好ましくはプロスタグランジンであるアラキドン蛮代謝物、 脂質、乾燥保護剤および区画分割−強化緩衝剤もしくは緩衝系を含有するリポソ ーム組成物を開示している。このプロスタグランジンとしてはプロスタグランジ ンＥ、が好ましい、このリポソームは濃度勾配等のような、それは好ましくはｐ Ｈ勾配であるが、膜間化学電位をもつことができる。この区画分割−強化緩衝系 は２つの溶液を含有し、１つは乾燥保護剤溶液でその好ましいものはサツカロイ ト溶液であり、２つ目は好ましくはクエン散溶液である。このサツカロイド溶液 としてはデキストロース、シュークロース、もしくはマルトースが好ましいが、 これらのうちいずれもマンニトールと一緒に用いることができる。

使用し得る他の保護剤としてはデキストラン、ポリ（ビニルアルコール）もしく はアルブミンが挙げられる。保護剤溶液のＰＨは比較的塩基性であることが好ま しく、約ｐＨ３から約ｐ　Ｈ１，１であり、最も好ましいのはｐＨ７である。乾 燥保護剤溶液、好ましくはサツカロイト溶液であるが、約５重量％から約２０重 量％存在し、最も好ましいのは約１０ないし約１２％である。リポソーム溶液は 例えば押出もしくは乳濁化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ　）手段によってサ イズｋｍ少させることができる。得られた溶液は脱水もしくは凍結乾燥手段によ って乾燥させることができる。クエン３溶液は約２．５ないし約４．５のｐＨで あるのが好ましく、ｐ）（３，０であれば最も好ましい。

脂質はリン脂質を含有するのが好ましく、より好ましいのはホスファチジルコリ ンであり、最も好ましいのは卵ホスファチジルコリンである。リポソームは直径 １００ないし５００ｎｍであるのが好ましく、最も好ましいのが約２００ｎｍで ある。リポソーム中へのプロスタグランジンの取り込みは約５０ないし約１００ ％であり、特に約６０ないし１００％である。このリポソーム組成物は患者に静 脈注射をすることができる。このリポソーム性プロスタグランジンの薬剤組成物 は、薬剤用担体もしくは希釈剤と混合することによって製造することができる。

本発明の組成物におけるプロスタグランジンに対する脂質の重量割合は約１５０ ：１から約１０００：１であり、より好ましくは約３００：１から８００：１、 最も好ましいのは約６００　：　１である０本発明のリポソーム性プロスタグラ ンジン組成物はまた凍結乾燥することもできる。

本発明のリポソームは該プロスタグランジンと該脂質を膜透過（ｔｒａｎｓＩＩ ｌｅｍｂｒａｎｅ）　ｐ　）（勾配手段によって結合させて！Ｉ！１８１２する ことができる。この勾配はまず塩基性水性媒体中でリポソームを形成し、この水 性懸濁液にプロスタグランジンを添加、次いでリポソームの外部（水性）媒体を 酸性化することによって得ることができる。この塩基性外部媒体はサツカロイド 溶液であることができ、上記急性化はクエンｒａ溶液のような酸性溶液を使用す ることによって達成することができる。

本発明のリポソームは直線経路もしくは曲りくねった経路をもつフィルターを通 じてそれらを押比すことによって、もしくは均質化によって均一なサイズ分布に までサイズを減少させることができる。このサイズ−減少工程はプロスタグラン ジン添加、乾燥工程および膜透過ｐＨ勾配の形成に先立って行われるのが好まし く）。

また別法として、本発明のリポソームは消極的装薬技術を用いることにより製造 することができ、このときには脂質は、プロスタグランジンをも含有する乾燥保 護剤の水性溶液を混合される。

この脂質は乾燥した脂質膜の形態のものでよい、消極的に装薬されたリポソーム はまた凍結乾燥することができる。

２１し列色舅μｍ斃コ一 本発明のリポソームはリポソームと結合したアラキドン酸代謝物、特にプロスタ グランジンを提供する。該結合としてはリポソーム中へのプロスタグランジンの 取り込み、およびリポソームの外部もしくは内部膜表μｓとプロスタグランジン との電位的結合を上で述べたように１本発明のリポソームはリポソームを製造す るための公知の方法のいずれによっても製造することができるが。

Ｂａｌ］ｙらのイオン化し得る抗腫瘍剤、ＰＣＴ畠Ｕ４１１ｉ６１０１１０２号 、１９８６年２月２７日に記載された方法で参考のためにここにも引用されてい るものにしたがって生物活性性が装薬されているものが好ましい、この技術はリ ポソームにイオン化し得る生物活性剤を装薬させるものであり、その場合に膜透 過濃度勾配がリポソームの膜を横切って生じ、その薬はこの勾配手段によってリ ポソーム中に装薬される。この膜透過濃度（イオン）勾配はリポソーム膜を横切 って工ないしはそれ以上の荷電種（例えばＮａ　”　ｇＣＱ−、に＋、Ｌｉ◆、 Ｈ＋）のための濃度勾配を創ることによってつくられるものである。これらのイ オン勾配はｐＨ（Ｈ＋）勾配であるのが好ましい。これらのＰＨ＠Ｑはそのリポ ソーム膜を横切ってイオン化し得る生物活性剤（プロスタグランジンのような薬 ）の取り込みを推進することができる。

本発明によれば、最初の水性媒体（相対的に急性もしくは塩基性）をカプセルに 包んでリポソームが調整される。ＰＧＥ、の場合には、第一の水性媒体が相対的 に塩基性（第２の水性媒体に関連して）であるカプセル包囲形式の場合に高い取 り込みの結果となることを見出した。

濃度勾配を形成するために、第一の外部媒体が調整（外部ｐＨの調整により）さ れるか、第二の外部媒体が添加される（例えば最初の外部媒体に関して相対的に 塩基性もしくは急性のいずれかであることができる）、ＰＧＥ、取り込みの場合 には、第一の外部媒体に対して散性である第二の外部媒体の添加が好ましい、篤 −のもしくは第二の外部媒体のいずれかがイオン化し得るプロスタグランジンの ようなイオン化し得る生物活性剤？含有するならば、この膜透過ｐＨ（Ｈ＋）勾 ！２（外部によって内部が塩基性である）が装薬をリポソーム中に、遊離の小胞 体−結合生物活性剤比が〔Ｈ＋〕内〔Ｈ◆〕外比を反映するように区画分割させ る。イオン勾配は、この装薬が完了した後もリポソーム内に残る。

この膜透過ｐＨ勾配装薬法は、適当な水性媒体中に溶解したときイオン化し得る 状態で存在できるいずれのプロスタグランジンについても本質的に使用すること ができる。プロスタグランジン類の場合、イオン化し得る基としては脂肪酸類（ 上記Ｉを参照）上のカルボキシル基であることができる。プロスタグランジンは 、リポソーム膜中に区画分割するので相対的に親油性であることが好ましい。こ の方法によりリポソーム中に装薬でき、そのため本発明で用いることのできるプ ロスタグランジンの例としては、ＰＧＥ、、ＰＧＥ２．ＰＧＧ、およびＰＧＦ等 が挙げられる。

単一のプロスタグランジンをリポソーム中に装薬させることに加えて、このｐＨ 勾配装薬法は、多数のプロスタグランジン類を同時もしくは逐次のいずれかで装 薬するために用いることができる。

一般に、本発明の背景の所で述べたようにリポソーム形成法のいずれかの方法も 本発明の実施に用いることができるが、ユニラメラ小胞体を形成する方法が好ま し、＜、大ユニラメラ小胞体のものが最も好ましい、これらのユニラメラ小胞体 形成する２つの方法が好ましい：第一の技術は生物活性剤（薬、特にプロスタグ ランジン）と脂質のエタノール溶液との結合であり、これはＢａ１ｌｙら（前出 ）に記載されている様に、生物活性剤を装薬するために膜透過濃度勾配を使用し てバラツリ（Ｂａｔｚｒｉ　）らの技術〔１９７３、バイオヒミカ　エト　バイ オフィジカ　ラント　アクタ（Ｂｉ。

ｃｈｆ、ｅｔ　Ｂａ１ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）、２９８：１０１５）と同様の方 法である。この技術においては脂質とプロスタグランジンを総水性容量の５％を エタノール水溶液のような水混合性有機溶媒中に共溶解させ、続いてこれらを第 一の水性溶液にゆっくりと添加する。この第一の水性溶液は、好ましくは乾燥保 護剤、もしくは緩衝剤２例えばクエン数基もしくはリン酢塩のような水性溶液で あることができる。

このような緩衝溶液は更に乾燥保護剤を含有することができる。

この乾燥保護剤はシュークロース、マルトース、ラクトースもしくはデキストロ ースのようなサツカライド、或いはシュークロース、マルトース、ラクトースも しくはデキストロースのいずれかとマンニトールとの組合せのようなサツカロイ ドの組合せを包含することができる。マルトースを使用するのが好ましい、他の サツカロイドとしては例えばマンノース、ガラクトース、ラフィノースもしくは トレハロースを挙げることができる。他のものとしては、デキストラン、アルブ ニンおよびポリビニルアルコールのような他の保護剤をも用いることができる。

この第一の水性溶液のｐＨは相対的に塩基性であり（第二の水性溶液に比して、 以下参照）５例えば約３．ｏから約１１．○であり、最も好ましくは約７．０で ある。言葉を換えて言えば、第二の水性溶液に比して、第一のものはより塩基性 である。この緩衝剤はまた相対的に酸性（第二の水性溶液に比して）であること もできる。

得られた単−相リポソーム溶液は１例えばフィルターを通した押出しによって均 質な集団となるまでサイズが減少され、このフィルターは好ましくは０．２ミク ロンの孔サイズで、直・線経路もしくは曲りくねった経路のいずれかである。こ のような集団はクリス（Ｃｕ１ｌｉｓ　）ら、ＰＣＴ公開第８６１０　Ｏ２３８ 号、１９８９年１月１６日の押出法により形成され、その内の関連ある部分は参 考のため、ここに引用される。加圧下リポソームをフィルターを通過させるこの ような押出法により、サイズに関して均質な集団のリポソームの形成が行われる 。この押出はフィルターを１回もしくは数回通過することによって行うことがで きる。フィルターとしては例えば直線経路膜フイルタ−〔例えばヌクレオボーア （λｕｃ１．ｅｏｐｏｒａ　）ポリカーボネートフィルター〕もしくは曲りくわ った経路のフィルター〔例えば０．２ｕｍサイズのヌクレオボーアメンブランフ ィルタ−（混合セルロースエステル）〕である。

リポソームがフィルターを１回以上通過するとき、必要とされる通過回数は目的 のリポソームサイズ、すなわち好ましくは約０゜２０ｕｍを得るのに必要な回数 ということで決定される。

本発明で用いられるフィルターのサイズは最終的なリポソーム生成物の目的とす るサイズによって選択される１本発明では例えば、約０．２０ｕｏの平均直径を 有するリポソームが好ましい。

本発明のリポソームは直径が約５００ｎｍより小であることが好ましく、直径１ １００ｎから３０Ｏｎ＋ｏが好ましい０本発明では約２００ｎｍのものが最も好 ましい、というのはこのサイズのリポソームは肺の毛細床を通過し、そこを通っ て他の器官および組織へと通っていくことができることが知られているからであ る。したがって約０．２０ｕｍの孔サイズを有するフィルターがこの押出し工程 における使用に選ばれる。

上で定義したような均質なサイズ分布までリポソームをサイズ減少させる他の方 法は超音波照射、プレンチプレス技術、液体力学剪断１例えばコロイドミルもし くはガラリン（Ｇａｕｌｉｎ　）ホモジナイザーを用いた均質法、もしくは他の サイズ減少化技術である。例えばガラリン均質化法が使われるとき、サイズを調 整されるリポソーム類は貯槽から例えばホモジナイザーへ２Ｑ／分の流速で、す なわち１リツトルのバッチに対してリポソームは４分間の間約１４，０ＯＯｐｓ ｉで再Ｗ環されるように、継続的に循環される。熱交換器がこのバッチ温度を約 ３０℃より下に維持するために使用することができる。

得られたサイズ減少化リポソームはサイズに関して均質である。

例えばこのリポソームは約２０ないし約５００ｎｍの範囲、平均２００ｎ−のガ ウス分布を有している。

得られたサイズの減少された生成物は追加の水性溶液で希釈し。

乾燥、使用まで貯蔵することができる。またこのＰＨは膜透過ｐＨ勾配を介して 薬を装薬するために変化させることができる。しかしながらこの大きさを決める 工程は最終的なｐＨＴＡ整の前に行われなければならない。

本発明のリポソームを形成するための第二のそしてより好ましい方法は、バラツ リら（前出）のエタノール注入法を用いるもので、まず脂質と防腐剤１例えばブ チル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）とを全水性容量の５％のエタノール中で混 合し１次いでこの混合物を最初の水性媒体にゆっくりと添加する。この第一の水 性媒体はこれまで述べてきたいずれのものでもよいが、例えばマルトースのよう なサツカライド溶液が好ましい、この第一の水溶液のｐＨは第二の水性溶液に比 べて塩基性であり、ｐＨ３，０から約１１．０が好ましく、最も好ましいのは約 ｐＨ７，０である。

この方法でサツカライド溶液を取り込むリポソームを形成する。

得られたリポソーム溶液は上述のいずれの方法によっても均質な集団にまでサイ ズの減少を行うことができるが、記載したようにガラリンの均質化方法によるの が好ましい、約２０〜５００ｎｍのリポソーム、好ましくは直径約３００ｎｍか ら約５００ｎｍＯもの、好ましくは平均サイズ２００ｎｍのリポソームが形成さ れる。

得られたサイズの減少されたリポソーム生成物は０．２ｕｍのミリパック（Ｍｉ ｌｌｉｐａｋ　）フィルター（ミリポア社、ベットフォード、マサチニーセッツ ）を通して無菌的にろ過することができる。

得られたサイズの減少されまたろ過されたリポソームは続いて、エタノールに溶 解された生物活性剤と混合される０例えばエタノール中に溶解されたプロスタグ ランジンはリポソーム撹拌溶液に加えられる。このプロスタグランジン−リポソ ーム生成物は続いて０．２ｕ＋ａのフィルターを通して無菌的にろ過することが できる。

この生成物はまた追加の水溶液で希釈、およびまたは乾燥（脱水）。

使用まで貯蔵することができる。好ましい実施態様では、この大きさが減少され た生成物はガラスびんにつめられ、凍結乾燥し。

使用するまで貯蔵する。

使用直前にこの凍結乾燥生成物は第一の水性媒体に対し相対的に酸性もしくは塩 基性のｐＨを有する水性溶液で再構成化される。

この第二の水性媒体は相対的に酸性であるのが好ましい、この水性媒体の添加に よりＰＨＨ２Ｏ形成される。

使用されるリポソーム形成法にかかわらず、膜透過ＰＨ勾配を形成するために、 第一の外部媒体に対し相対的に酸性のＰＨを有する第二のｐＨ（第二の外部媒体 ）の水性溶液を含有する外部媒体をリポソーム溶液に添加される。この第二の水 性溶液のＰＨは一般的に約２．５から約４．５．好ましくは約３．０から３．５ 、最も好ましくは約ｐＨ３，０である１例えばこの第二の水性溶液の添加により 第一の外部婢体をｔＡＷすると、そのリポソーム溶液のＰＨは約３．５から４． ５．最も好ましくは約ｐＨ３，０である。また選択的に、第一の水性溶液が相対 的に散性であるなら、第二の水性溶液は相対的に塩基性であろう。

外部媒体のｐＨをこのように調整すると、リポソーム膜の中および通して生物活 性剤（プロスタグランジン）を区画分割させ、効率的にプロスタグランジンをリ ポソーム中に装薬することになる６本発明の区画分割強化緩衝剤と上述のｐＨ勾 配とを使用すると、プロスタグランジンの取り込み率は約５０ないし１００％、 より特定すればＧｏないし１００％、そして最も好ましくは８０ないし１００％ である。

いずれの理論にも拘束されるものではないが、製剤中の乾燥保護剤の役割は乾燥 工程の間、および再水和後のリポソームのサイズおよび保全を保持することであ る。リポソーム製剤から乾燥保護剤が除外されると、再水和リポソームは低い取 り込み効率（約３０％およびそれより低いもの）を有し、凍結乾燥に続くリポソ ームサイズは保持されない。

脱水もしくは凍結乾燥手段はｐＨ勾配の確立の前もしくは確立後に行うことがで きる。ＰＨＨ２Ｏ確立の前に行われるのが好ましく、最も好ましいのは第一の水 性媒体が相対的に塩基性で、第二の媒体が相対的に酸性のものである。この場合 、乾燥されたリポソーム−プロスタグランジン製剤の再水和は第二の（相対的に 酸性の）溶液を用いて行われ、それによって濃度勾配が確立され。

プロスタグランジンを効率的にリポソーム中に装薬する。この諺性化が脱水もし くは凍結乾燥に先だって行われれば、第二の溶液は乾燥保護剤、およびＢＨＴの ような防腐剤、および／またはエチレンジアミン四酢象（ＥＤＴＡ）を含有する こともできる。この第二の水性（酸性化）溶液のＰＨ約１．５から約３．５で好 ましくは約３．０である。しかしながら、この酸性化が脱水もしくは凍結乾燥に 続いて行われるのであれば、再水和はｐＨ約２．５から約４．５．好ましくは約 ３．０の水性溶液を用い、乾燥保護剤は存在させずに行われる。この後者の方法 、即ち乾燥工程後に溶液を酸性化するのが好ましい。

両リポソーム形成法において、得られたプロスタグランジン−結合リポソームは 公知のいずれの方法によっても脱水もしくは凍結乾燥することができる。この乾 燥工程はリポソーム懸濁液への乾燥保護剤の添加を必要とする。この乾燥保護剤 はリポソーム中への脂質の再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｎｔ）を妨げ、こ の乾燥手段および再水和の間、サイズとその中身を保持するものである。このよ うな乾燥保護剤の適当な特質はそれらが強い水素結合受容体であり、リポソーム 二分子層成分の分子間空間を保護する立体化学的性質を有することである。乾燥 保護剤の一部たるサツカロイド糖はリポソーム製剤に含まれたとき、再水和後の リポソーム粒子サイズを維持するのに特に有用であることが見出されている。こ のサツカロイドの特定のグループとしては例えばデキストロース。

シュークロースおよびマルトースがあり、これらは水性相の５ないし２０重量％ 、好ましくは１ｏ重量％で使用することができる。

使用することのできる他のサツカロイドとしてはマンノース、ガラクトース、ラ フィノース、トレハロース、ラクトースもしくはトリオース糖がある。マンニト ールはいずれのサツカロイドとも一緒に用いることができるが、単独で用いたと きは、マンニトールはリポソームのサイズを維持することには成功しないという ことが驚くべきことに見出された。マンニトールはサツカロイトと共に約０−２ ％の濃度で、好ましくは１％の濃度で用いることができる。用いられるサツカロ イドの総濃度は約５％から約２０％。

好ましくは１０％から１２％、最も好ましくは約１０％である。

製剤中におけるＢＨＴもしくはＥＤＴＡのような追加する防腐剤は１例えばエタ ノール１μΩにつき０．０２ｍｇＢＨＴ、また１０％デキストロース中の０．０ １％ＥＤＴＡといったものも含まれる。尿素、アルブミン、デキストランもしく はポリ（ビニルアルコール）のような他の物質もまた月いることができる。

脱水もしくは凍結された生成物の再水和に当たっては、、（ｐＨ勾配が凍結乾燥 に先立って確立されていたならば）蒸留水のような水性溶液を添加することがで きる。リポソームがその元来の外部水性溶液中で凍結乾燥された場合、以下に記 載されるように（それが相対的に酸性もしくは塩基性であるもの）、再水和はｐ Ｈ勾配を確立する第二の水性溶液を用いて行われる。好ましい方法においては、 ｐＨ勾配は相対的に酸性水性溶液を製剤に添加することにより、好ましくは例え ばクエン酸溶液を添加するが、それによって確立される。全ての場合、再構成は 約２０ないし３０℃、好ましくは２５℃で行うことができ、この溶液は必要に応 じて希釈され投与される。

本発明においては、ここで用いられる脂質という語は水性媒体との混合によって 脂質化合物の疎水性部分が二分子層の方を向き。

親水性部分が水性相の方向を向く形の二分子層となるいずれの好適な物質も意味 する。脂質としては、トリグリセライドのようなよび両親媒性脂質が挙げられる １本発明のリポソーム製剤において好ましく用いられる脂質としては、ホスファ チジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチ ジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール＜ｐａ）、ホスファチジンａ 　（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）。

スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）等のようなリン脂質が、単独もしくは組合せて用 いられる。このリン脂質は合成のものでもよいし、卵もしくは大豆のような天然 物出来のものでもよい、好ましい実施態様としてはリン脂質卵ホスファチジルコ リン（ＥＰＣ）が用いられる。リポソームはまたコレスタノール、コレスタノー ルもしくはコレスタンのような他のステロイド成分、およびＥＰＣとコレステロ ールの組合せをも包含することができる。リポソームはまた糖脂質を含有するこ とができる。

ｐＨ勾配を介してリポソームに装薬を行い第一の外部媒体が塩基性であるような 場合、好適な水性媒体としてはｐＨ３，０から約１１．０、好ましくは約ｐＨ７ ，０に調整された例えばクエン酸、コハク諧もしくはマレイン酸緩衝剤のような ものが挙げられるが、これに限定されることはない、使用される第一の緩衝剤が 塩基性である他の場合にはリン酸塩緩衝液もしくは０．９％水性塩化ナトリウム のような緩衝剤がＰＨ７−９で使用することができる。さもなければ、炭酸ナト リウムもしくは重炭酸塩緩衝剤に使用することができる。他の緩衝塩がこの混合 物に約ＰＨ８，０で含むことができる。このような緩衝塩としては、リン酸緩衝 生理食塩水ｒＰＢＳ」、）−リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩化水 素（「トリスＪ）緩衝液、もしくはＮ−２−ヒドロキシエチル　ピペラジン−Ｎ ’２−エタンスルホン酸Ｃｒ’ＨＥｐＥＳＪ）あるいはグリシンが挙げられる。

最も好ましいものとしては、第一の水性溶液が乾燥保護剤の溶液゛二部ちサツカ ロイド溶液で５例えば約５ないし２０％のマルトース（好ましくは約１ｏ％マル トース）、ｐＨは約７．０のものである。この溶液はＥＤＴＡもしくは同じよう な防腐剤（ＢＨＴ）を薬剤生成物に対し許容し得るいずれの濃度においても含有 することもできる（好ましくは約０．０１％のＥＤＴＡ）。

ｐＨ勾配を確立するために、第二の外部媒体が添加され（脱水工程の後が好まし い）、即ち第一の媒体が好ましくは酸性のＰＨに調整される。第一の外部媒体に 取って替わることのできるこのような第二の外部媒体としては例えばＰＨ約２． ５から４．５゜最も好ましくは約ＰＨ３，０のクエン酸、乳酸もしくはリン酸の ような緩衝液を含有することができる１例えば０．ＩＮの水性塩酸で適当なｐＨ （上記のような）に調整された生理食塩水（０゜９％）もまた使用することがで きる。最も好ましいのは、外部媒体のｐＨがおよそ等量のクエンａ溶液（ｐＨ約 ２．５ないし約４゜５、好ましくは３．０）をリポソーム溶液に添加することに よって調整することができる。どちらの場合も外部リポソーム溶液の最終ＰＨは 約２．５から約４．５であり、好ましくは３．０−３゜５、最も好ましくは３． ０である。このクエン諺溶液はまた５ないし２ｏ重量％の乾燥保護剤（サツカロ イド、好ましくはマルトースを好ましくは１０重量％）を含有することができ、 そしてＢＨＴおよび／またはＥＤＴＡのような防腐剤を薬剤生成物が許容し得る 濃度で含有することもできる（好ましくは最終溶液１＋ｎｆｌにつき０．０１％ ＥＤＴＡおよび０．０２ｍｇＢＨＴ）。

相対的に酸性の第一の外部媒体の場合、約ｐＨ５ないし約６のクエン象ホスフェ ート緩衝液、あるいはＨＣＱで約３．０のＰＨにｒＡａされた０、９％水性塩化 ナトリウムまたは他の上述の鼠性溶液のいずれも用いることができる。この場合 、濃度勾配を確立するために使用される相対的に塩基性の媒体は約ｐＨ８，○の ホスフェート緩衝液、水蓬化ナトリウムで約ｐＨ７−１０に調整された塩化ナト リウム水溶液（０，９％）、炭酸ナトリウム、重炭酸塩緩衝剤または上述の塩基 性溶液のいずれかである。

最も好ましくは、初期の塩基性媒体、好ましくは約ｐＨ７から約８まで、最も好 ましくは約ＰＨ７，０の塩基性サツカライド溶液を有するリポソームがつくられ る。濃度勾配が第二の（相対的に酸性の）緩衝液、好ましくはｐＨ約２．５ない し４．５の０゜０１Ｍクエン徴の添加により確立され、このものは第一の（相対 的に塩基性の）外部媒体に添加されたとき最終ｐＨが約３．０となる。このよう な相対的に塩基性／相対的に散性溶液の対（緩衝液の対）がプロスタグランジン のリポソーム中への区画分割を強化するのである。この濃度勾配は脱水もしくは 凍結乾燥工程の前もしくは後のいずれかで確立できるが、しかし、上述のように 、この脱水もしくは凍結乾燥工程は製剤の酸性化の前に行われるのが好ましい。

本発明において、リポソームはまた消極的技術によって（ｐＨ勾配なし）装薬さ れることができ、この場合水性溶液は蒸留水のような水性溶液、水性緩衝液、も しくは乾燥保護剤、例えばデキストロースもしくはマルトール溶液のようなサツ カライド溶液を含有することができる。これらの方法はマルチラメラ小胞体（Ｍ ＬＶ）、安定プリルラメラ小胞体（ＳＰＬＶ）、押出し手段により形成された大 ユニラメラ小胞体（ＬｖＶＥＴ法）とし・て知られているリポソームを形成する 方法、または他の公知のリポソーム形成法を包含することができる。５ＰＬＶｓ を形成する方法はレンダ（Ｌｅｎｋ　）ら、米国特許第４，５２２，８０３号、 １９８５年６月１１日発行に開示されており、そしてＬｖＶＥＴ法はクリス（Ｃ ｕ１ｌｉｓ　）ら、ＰＣＴ公開第８６１０　Ｏ２３号、１９８６年１月１６日に 記載されており、そして各々の関連した部分は参考のためにここに引用されてい る。この場合、リポソームは濃度勾配の利益なしに形成されている１本発明のリ ポソームを形成するためのこの別途の技術において、乾燥保護剤およびプロスタ グランジンを含有する水溶液を、これまで述べられてきた本発明で用いられる好 適な脂質のいずれかを含有する乾燥フィルムに添加することができる。この脂質 膜は管、注射器もしくはフラスコのような容器面を覆うことができる。得られる リポソーム溶液は前述のように脱水もしくは凍結乾燥することができる。

本発明で用いられる脂質対プロスタグランジンの重量比は約１０００　：　１の ように高いものであることができる。好ましくは。

それらは１０００：１から約１５０：１．更に好ましくは約９００＝１から２０ ０：１．最も好ましいのは約６００：１の範囲である。脂質対薬の重量比が約１ ５０：１およびそれ以上のものは６０％以上のＰＧＥ、の取り込みをもたらし、 ８０−１００％の取り込みをもたらすことができる。

本発明のリポソーム類の脱水および凍結乾燥はリポソーム類を脱水または凍結乾 燥するための技術分野における既知の方法で行うことができる。脱水に対しては 、例えばリポソーム類をジャノフ等：　１９８６年２月２７日ＰＣＴ出願Ｎｏ、 ８６１０１１０３に従って乾燥することができ、そして、それはここに参考に引 用されている。

本発明のリポソーム類は好ましくは凍結乾燥の停止器の取付けられた血清ガラス びん中にその水性−懸濁液リポソーム類の一定量をピペットで取り、その凍結乾 燥器に入れて凍結乾燥される。

このガラスびんをついで約１分間から約２４時間、０℃から５０℃、好ましくは 、約１０℃で好ましくは約１時間保持する。この槽温度を１分間当たり約２０” Ｃから０．００５℃、好ましくは１分間当たり約１℃の割合で、約−１２℃から 約−８０℃、好ましくは約−４０”Ｃまで減少させる。このガラスびんをこの温 度に約０．１時間から約１２０時間、好ましくは３時間保持した。約０゜２時間 から約２７時間、好ましくは０．６時間、約０．ＯｍｒｒＩＨｇから約１００− 　Ｏｍ　ｒｎ　Ｈｇ　＋好ましくは０．００５ｍｍＨＨの真空が適用される。こ の槽温度をついで１時間当たり約２０℃から約０．００５℃、好ましくは１時間 当たり約１０℃の割合で約−４０℃から０℃、好ましくは約−２５℃まで上昇さ せる。

このガラスびんを上記の温度（好ましくは約−２５℃）に約０゜１から約１２０ 時間、好ましくは約１２時間保持し、その後、この槽温度を１時間当たり約２０ ℃から約０．００５℃、好ましくは１時間当たり約１０”Ｃの割合で約−２０℃ から０℃、好ましくは約−１０℃まで上昇させ、そして約０．１から約１２０時 間。

好ましくは８時間保持する。この槽温度をついで１時間当たり約２０℃から約０ ．００５℃、好ましくは１時間当たり約１０℃の割合で約２℃から約４０℃、好 ましくは約１０”Ｃまで上昇させ。

そして約０．１から約１２０時間、好ましくは８時間保持した。

ついでこの槽温度を約２０”Ｃから約８０℃、好ましくは約４０℃に上昇させ、 約０．１から約１２０時間好ましくは約１６時間保持した。最後にこの槽温度を 、１時間当たり２０℃から約０．００５℃、好ましくは１時間当たり約ｘｏ”ｃ ：の割合で約５℃から約３０℃に減少させ、そしてこの温度を停止するまで保持 した。このガラスびんをついで窒素を充満させ、そして栓をした。

凍結乾燥技術の脱水に関係なく、この操作は約２％より少なく、好ましくは約１ ％より少なくなるまで試料の水性含量を減少させる。この現在の方法を用いて、 このリポソーム性プロスタグランジンの製剤は０〜２％水性含有量、そして好ま しくは０〜１％水性（水）含有量の点まで凍結乾燥される。

この凍結乾燥されたプロスタグランジン−リポソームの製剤は６℃または２５℃ で貯蔵されるとき、少なくとも１年間安定であることができる。安定性の研究は 実施例４の方法により行われ、そしてその製剤の高圧液体クロマトグラフ（ＨＰ ＬＣ）分析を用いる。１年間６℃で貯蔵後、ＰＧＥ、の分解生成物は存在しなか った・ この凍結乾燥されたリポソーム類が用いられるとき、再水和は水性溶液、例えば 蒸留水、注射のための水（ＷＦＩ）、または上記したような緩衝剤または適当な ｐＨの水性溶液をこのリポソーム類に加え、そしてそれを再水和するまで静置す ることにより達成される。このリポソームをゆっくりと混合しながら、その水溶 液中に再懸濁することができる。この再水和化は約２５℃で行われる。もしもそ のプロスタグランジンが脱水前にそのリポソーム類中にまぜ合わされ、そして更 に組成の変化を望まないならば。

その水和されたリポソーム類は薬を取り込んだリポソームを投与するための既知 の方法により治療に直接用いることができる。

このリポソーム類の製造中に、有機溶媒がその脂質を懸濁するために用いること ができる。適当な有機溶媒は脂質を溶解する種々の極性および誘電性を有するも のであり、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチ レンフロライドおよびヘキサン：エタノール（９５：５）のような溶媒混合物を 包含するが、それに限定されるものではない、ヘキサン：エタノール（９５：５ ）はその脂質を最初に懸濁するのに好ましく用いられ、そしてエタノールは脂質 とプロスタグランジンの共−混合を行うのに好ましく用いられる。ＷＩ媒はそれ らの生的適合性、低毒性および可溶化力を基にして選択される。

本発明の方法により得られたリポソーム類は、その生活性の形態での薬の持続し た搬送を必要とする伝染病或いは状態の治療において、人間を含む哺乳動物に用 いることができる。そのような状態とは、プロスタグランジンで処置できるもの のような病気の状態を含むが、これに限定されるものではない。

その製剤の投与形態が、その化合物が搬送される組織中の部位及び細胞を決定す ることができる１本発明のリポソーム類は単独で投与することができるが、一般 的には投与の意図されたルート及び標準の裏薬学的ブラクティスに関して選択さ れた製薬上の担体と混合して投与される。この製剤は非経口的に１例えば動脈内 または静脈内注射することができる。又この製剤は口、皮下又は筋肉内ルートを 経由して投与することができる。非経口的投与のために、その他の溶質例えば、 その溶液を等張性とするための十分な塩またはグルコースを含有する滅菌された 水性溶液の形態で用いることができる。例えば本発明のプロスタグランジンＥ１ すポソーム類は１分間当たり、１ｋｇ体重当たり５．０ｎｇの服用量で、２時間 にわたり、１日１又は２回に非経口的に与えることができる。この製剤の特別の 性質による他の方性は当該技術の当業者により予見することができる。

投薬の経口的態様のために、この発明のプロスタグランジン−リポソーム組成物 は錠剤、カプセル、ローゼンゲ（ユ。ｓｅｎｇｅｓ　）、粉末、シロップ、エリ キシル、水性溶液及び懸濁液及びそれと同等のもの形態で用いることができる０ 錠剤の場合において、用いることのできる担体はラクトース、クエン准ナトリウ ム及び燐象塩を包含する。でん粉のような種々の崩壊剤、ステアリン准マグネシ ウムのような潤滑剤が通常錠剤中に用いられる。カプセルの形態での投薬のため に、有用な希釈剤はラクトース及び高分子量のポリエチレングリコールである。

水性懸濁液が経口使用のために要求されるとき、成る種のせ剤及び／又は風味剤 が添加され得る。

プロスタグランジン療法に反応する病気の状態の治療処置における人間への投薬 のために、前述の医師は究拐的には与えられた患者に応じて適当な服用量を決定 するであろう、そしてこれは患者の病気の性質及び重さはもちろん、個々の人の 年齢１体重及び応答により変化することが期待され得る。リポソーム形態での薬 の服用量は一般に、その遊離の薬に対して用いられるものであろう、成る場合に は、しかしながら、これらの限定外の服用量を投与することが必要であり得る。

次の実施例は説明のためにのみ記載されるものであり、この発明の範囲を限定す るものではない。

ｚ３１１辷 ヘキサン：エタノール（９５：５）中の卵ホスファチジルコリン（２００＋ｎｇ ）１３７℃で水浴中で減圧下回転蒸発し、フラスコの側部上に薄膜を形成した。

この膜を２００．ＯｕΩのエタノール中に再ｆｆ１ｆｆｉし、それに１．０■の ＰＧＥ、及び２．０■のＢＨＴを加えた。このエタノール溶液をユ、Ｏｍρ容量 のツベルクリンａＪＭ器中に引き入れ、ｐＨ７，０（７）ＥＤＴＡ　　０．０１ ％（Ｗ／Ｖ）水溶液を含む４．０ｍＱの１０％（Ｗ／Ｖ）デキストロース水溶液 中にかきまぜながら約２滴／秒で２１０径針を通して注入した。エタノール／脂 質混合物の添加により、この溶液は濁って来た。この溶液を０．２ｕｍのポリカ ーボネート（直線通路型）フィルターを通して５回押出し１次いで第２番目の同 一の０．２ｕｍのフィルターを通して第２回目の５回の押出しを行った。得られ たリポソーム類の粒子サイズは準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）にコンブパーティクル サイザー社）を用いて０．２４ｕｍ±２２％であると測定された。この！Ｉ！濁 液をついで１ｏ％デキストロース、０．０１％ＥＤＴＡ、ＰＨ７，Ｑ％を用いて １００ｍＱまで希釈し、そして１．０ｍＨの一定量をガラスびん中にピペットで 入れ、そして実施例９の操作により凍結乾燥した。この生成物を０．ＯＩＭクエ ンｍｏ、１ｍΩで再水和し、水醋化ナトリウム（Ｎ　ａ　ＯＨ）でｐ）（３，０ に調節した。得られた懸濁液のＰＨは約３．０であった。リポソーム中のＰＧＥ 、の取り込みは、実施例８の技術によりＨＰＬＣにより測定された。

！ｕｕＬ８一 実施例１の操作及び物質を用いたが、粒子サイズの測定後、この懸濁液を１０％ デキストロース及び０．０１％ＥＤＴＡ＋　ＰＨ２，３を含有する０、０１％ク エン散４．○ｍΩで２回希釈した。

これを更にｐＨ４，５の０．０１％ＥＤＴＡを含有すＳＸＯ％デキストロースに より１００ｍ１に希釈した。この懸濁液のＩ＆１ｋｐＨは約３．５であった。こ のＷＰＦＡ液の一定量（１，○＋ｎｆｌ）をガラスびん（ν１ａｌ）中にピペッ トで入れ、そして実施例９の操作により凍結乾燥した。この生成物を蒸留水１． ０ｍΩで再水和し、最終ＰＨを約３．４にした。取り込みは実施例８の技術によ り測定された。

失亙板１ １０％デキストロース、０．０１％ＥＤＴＡ及び１％マンニトール（全１１％糖 類）の４．０ｍΩを含有する撹拌水溶液を用いて、実施例１の操作及び物質を行 った。取り込みは実施例８の技術に従って江定された。ＱＥＬＳはこのリポソー ム粒子のサイズが約０．２４７ｕｍ±１０％であると決定した。

叉り匹土 ｐ）（７，４の撹拌水溶液を用いて、実施例１の操作及び物質を行った。取り込 みは実施例８の技術に従って測定された。ＱＥＬＳはこのリポソーム粒子のサイ ズが直径０．２８８ｕｍ±４４％であると決定した。

１１仁旦 Ｐ、Ｈ７，４の撹拌水溶液、及び２％マンニトール、１０％デキストロース、及 び０．０１％ＥＤＴＡを用いて、実施例２の操作を行った。取り込みは実施例８ の技術に従って測定された。ＱＥＬＳにより測定されたこのリポソームの粒子サ イズは０．２８８ｕｍ±４４％であった。

去」Ｅ母Ｊ− １０％デキストロース、０．０１％ＥＤＴＡ、及び２％マンニトール（全１２％ 糖類）の４．　Ｏｒｒ＋ｆｌを含有する撹拌水溶液を用いて、実施例１の操作及 び物質登行った。

叉庭籠Ｉ ヘキサン：エタノール（９５：５）中の卵ホスファチジルコリン（１００■）を 減圧下回転蒸発し、フラスコの側部上に薄膜を形成した。その膜を渦巻き状混合 により０．３Ｍクエン酸溶液（ｐＨ３，０）の１．Ｏｍｆｌ中に再憩濁し、そし て室温で１時間放置した。このリポソーム溶液の最終ｐＨは３゜５であった。こ の懸濁液を０．２ｕｍの直線通路のポリカーボネート　フィルターを通して５回 押出し、そして得られたＷ８濁液のｐＨをＮａＯＨを用いて６．９に調節した。

ＰＧＥ、と脂質の結合は実施例８中で用いられているフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ 　）操作により再構成する前及び後で測定された。

夫庭皿旦 実施例１のリポソーム類を１．０ｍＱ水溶液中に懸濁し、１５ｍΩコレックス（ Ｃｏｖｅｘ）管に移した。このリポソームを含有しているガラスびんをヒストバ フラ（’　ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ　）フィコール溶液（シグマケミカル社）５ｍ Ωで２回洗浄し、そしてコレソクス管の内容物と混合した。この管をツルパル（ ５ｏｒｖａｌｌ　）遠心分離器中で１０分間１６　＋　３２０　Ｘ　ｇで遠心分 離した。脂質がフィコールの頂部に定着した。底部の洗浄液０．５−１．○ｍρ 及びこの脂質層以外はすべて螺動ポンプを用いてこの管から除去した。脂質がマ イクロベビット抽出管にくっついて残らないように注意が払われた。テトラヒド ロフラン（ＴＨＦ）（２，５ｍＵ）をこの管中に残っている脂質に加え、そして 完全に混合した。この溶液を箔で包まれた３０ｍＱコレソクス管に移した。この １５ｍｋコレックス管を０．１％燐謙１０．０ｍｆｆ１で洗浄し、この洗浄液を そのリポソーム溶液に加えた。更に０．１％燭謎の７．０ｍｇを付加的にこのリ ポソーム溶液に加えた。このリポソーム溶液を、メタノール５．０ｍｆｆを通過 し１次いで蒸留水１０．０ｍｇを通過させて調製された５ｅｐ−Ｐａｋ　　Ｃ， 、カートリッジを通して通過した。この脂質から分離するＰＧＥ、はこのカート リッジ中に保有される。メタノール（７，０ｍｇ）を５ｅｐ−Ｐａｋを通して通 過し、ＰＧＥ、を溶出し、このＰＧＥ、を小さい丸底フラスコ中に集めた。この 調製物におけるメタノールは３５℃以下の温度で減圧下回転蒸発により除去した ０次いでこのＰＧＥ、を５０ｕｇ／ｍｆ１１度の内部標準ベーター−ナフトール を含有する１、０ｍｇのＨＰＬＣ流動相〔アセトニトリル：　ｐＨ２，０（ｐＨ ２，２，燐酸と共に）４０：６０容量部〕で溶解した。この懸濁液をついで、） （ＰＬＣ中に注入する前に０．４５ｕｍ注射器−先端フイルター〔ミリボーア　 ミレックス（阿１１１ｉｐｏｒｅ　Ｍｉｌｌｓス）ＨＶ、型）を通してろ過した 。

上記操作を上記実施例２−７のリポソーム類に繰り返した。

失庭史主 割れ目を有する頂部、ブチルゴムの栓を有するこはく色の凍結乾燥ガラスびんを 、取り込まれたＰＧＥ、を含有する水性−Ｓ濁すボソーム１．０ｍｆｆで満たし た。これらのガラスびんをホネイウエルＤＣＰ　７７００　ディジタルコントロ ールプログラマ−（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ　ＤＣＰ７７００　Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｃ ｏｎｔｒｏｌ　Ｐｒｏｇｒａｍ＋ｍａｒ）を装備した凍結乾燥機（ＰＶ−２４ス トークス　リオファライザー）中のステンレススチール　トレイ上に置いた。こ のガラスびんを１０℃で１時間保持した９この板温度をついで１分間当り１℃の 速度で一４０℃まで減少させた。−４０℃の温度に到達した後、０．００５ｍｍ Ｈｇ以下の真空に０．６時間適用し、３時間、−４０℃にこのガラスびんを保持 した。その板温度を、ついで０．００５ｍｍ　Ｈｇ以下の真空下で１時間当り１ ０℃の速度で一２５℃まで上昇させた。

このガラスびんを０．００５ｍｍＨｇ以下で１２時間、−２５℃に保持した。こ の板温度を、ついで１時間当り１０”Ｃの速度で一１０℃まで上昇させ、８時間 保持した。ついでこの板温度を１時間当り１０℃の速度で＋１０℃まで上昇させ 、８時間保持した。

ついでこの板温度を４０℃に上昇させ、０．Ｏ０５ｍｍＨｇ以下で１６時間保持 した。最後に、この板温度を１時間当り１０℃の速度でＱ、ｏ○５ｍｍＨｇ以下 で２０℃に減少させ、栓をするまで保持した。このガラスびんを窒素で充満させ 、栓をした。

１１艶よ立 ヘキサン：エタノール（９５：５）中の１０８　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｎ溶液として 、卵ホスファチジルコリン（４１ｍＡ）、（全４，４２８ｍｇＥＰＣ）を５００ ｍｇ容量の丸底フラスコ中に秤量し、そのヘキサン：エタノールを３７℃に設定 された水浴中で回転蒸発により除去した。ＢＨＴ３０ｍｇを含有するエタノール （２，０ｍｇ）をこのフラスコに加え、その乾燥脂質膜を懸濁した。付加的にエ タノール１．０ｍｇを加え、そのＥＰＣを充分に懸濁させた。

１０％マルトース溶液１Ωを調製し、そのＰＨを１．ＯＮＮ水化化ナトリウム７ ．４にＴＡＢした。この溶液を、殺菌した水で予め濡らされたＱ、２２ｕｍミリ パック４０フィルターを通過させて滅菌した。

このＥＰＣ／ＢＨＴ／エタノール溶液を、２０００ｍｇビーカー中の１０％マル トース約８００ｍＱの撹拌溶液中に、約１．０ｍρ／分の速度で２１０径針を取 付けた１、０ｍＡ注射器から滴下して加えた。これをＥＰＣ／ＢＨＴ／エタノー ルの全量、約８゜０＋ｎｆｌに対して繰り返し行った。脂質の全てを加えた後、 この丸底フラスコをマルトース溶液約３．０ｍｇの一定量で２回連続して洗浄し 、そしてこのマルトースのビーカーに加えた。この溶液を付加的に１０％マルト ース溶液を加え１０００ｍｇとした。

夫り五よ上 実施例１０の方法によって形成したリポソーム類をガラリンモデル（Ｇａｕｌｉ ｎ　Ｍｏｄｅｌ　）　３０　ＣＤホモゲナイザーを用いて均質化した。このリポ ソーム類を、ガラリンへの配管、そして３１６Ｌステンレススチール、衛生的外 部、及びガラリンの下流の端に取付けられた管状熱交換器の取付けられた５Ｌ密 閉貯Ｎ器中に置き、３０℃以下の温度にこのリポソーム溶液の温度を保った。

窒素！（２０ｓｐｉ）をガラリン中のリポソームに与えられる圧力のために、そ の５Ｌ貯蔵器に連結した。このリポソーム溶液を１分間当り約１／２ガロンの流 れ速度で、約４分間１４，０００ｐｓｉの圧力でそのガラリンを通して循環した 。均質化を行ったこのリポソームは、ニコプンパーティクルサイザー（Ｎｉｃｏ ｍｐＰａｒｔｉｃｌｅ　５ｉｚｅｒ　）　にコンブインストルーメンツインク、 ゴレタ、カナダ）を用いて準−弾性光散乱により測定したところ、約２０〜５０ ０ｎｍのサイズ分布領域を有し、平均直径約コ５０〜２００ｎｍを有するもので あった。

災り樵上ｌ 実施例１１の操作に従って均質化されたリポソーム類（７００ｍｇ）を０．２ｕ ｍミリバック　フィルターでろ過し、１５００ｍｍビーカー中で撹拌板上で撹拌 した。プロスタグランジンＥ。

のエタノール溶液（１，４ｍ１２エタノール中に３．８５ｍｇ　　ＰＧＥ、）を ５．０ｒｎＱのピペットで滴下して加えた。このＰＧＥ。

の添加後、この懸濁液を０．２ｕｍミリパック　フィルターでろ過してｔｉ菌し 、１．０ｍｆｆの一定量を血清ガラスびん中に充満した。この充満ガラスびんを 実施例９の方法に従って凍結乾燥した。

１庭性よ主 実施例１２の凍結乾燥された１本のガラスびんのリポソームを。

１．０ｍｆｆの滅菌クエン１ｌｆｉｔｐＨ３，０を用いて、このガラスびんを手 で振って完全に再懸濁して再構成した。

失り且よ土 実施例１２の凍結乾燥された１本のガラスびんのリポソームを標準流動相ＨＰＬ Ｃ（６０％水、ＰＨ２，２，５０ｕｇ／ｒｎＱの濃度のＢ−ナフトールを含有す る４０％ＨＰＬＣ級アクリロニトリル）１．０ｍｇで再懸濁した。この試料を、 注射器先端フィルターであるミリボアＨＶ４０．４５ｕｍフィルターを通して２ ゜０ｍｇ容量のＨＰＬＣガラスびん中にろ過した。この試料を、２０５ｎｍに設 定されたギルソン（Ｇ１１ｓｏｎ　）　１１６探知器に取付けられた１５ｃｍ逆 相カラム〔レイニン（Ｒａｉｎｉｎ）Ｃ−１８カラム〕の上に１．２ｍｇ１分の 流出速度で２０ｕＱ充填＃（環）上に過負荷される５０ｕΩ装置を用いるレイニ ンＨＰＬＣ上に流した。

このクロマトグラフカラムを１３分間流した。ＰＧＥ、及びＢ−ナフトールに相 当するピークが確認された。

この試料びんのＰＧＥ、濃度を、ピーク域の標準直線回帰分析により計算し、Ｐ ＧＥ、ＨＰＬＣの標準曲線と比較した。試駆される各試料に対して３つのびんに ついて行なわハ、その平均濃度を計算した。

ｘｌ」ＬＬ望 実施例１の方法に従って作られたリポソーム類に対して、ユ週間、２ｉ！！闇、 ３０日、３力月、６力月、９力月及び１年の間隔で実施例１４の方法を繰り返し た。

匡際調査報告

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．アラキドン酸代謝物，脂質，及び乾燥一保護剤を含有するリポソーム組成物 であって、その際、該リポソームが区画分割−強化緩衝剤を含むことを特徴とす るリポソーム組成物。
2. ２．アラキドン酸代謝物がプロスタグランジンである請求の範囲１記載のリポソ ーム組成物。
3. ３．プロスタグランジンがプロスタグランジンＥ１を含有する請求の範囲２記載 のリポソーム組成物。
4. ４．リポソームが膜透過濃度勾配を有するものである請求の範囲１記載のリポソ ーム組成物。
5. ５．膜透過濃度勾配がイオン勾配である請求の範囲４記載のリポソーム組成物。
6. ６．イオン勾配がｐＨ勾配である請求の範囲５記載のリポソーム組成物。
7. ７．区画分割一強化緩衝剤が乾燥一保護剤溶液及びクエン酸溶液を含有する請求 の範囲１記載のリポソーム組成物。
8. ８．乾燥−保護剤溶液が糖類溶液である請求の範囲７記載のリポソーム組成物。
9. ９．糖類溶液のｐＨが約３．０から約１１．０である請求の範囲８記載のリポソ ーム組成物。
10. １０．糖類溶液のｐＨが約７．０である請求の範囲９記載のリポソーム組成物。
11. １１．クエン酸溶液のｐＨが約２．５から約４．５である請求の範囲８記載のリ ポソーム組成物。
12. １２．クエン酸溶液のｐＨが約３．０である請求の範囲８記載のリポソーム組成 物。
13. １３．該溶液の糖類がデキストロース，シュークロース又はマルトースを含有す る請求の範囲８記載の糖類溶液。
14. １４．糖類がマルトースを含有する請求の範囲１３記載の糖類溶液。
15. １５．約５％から約２０％の糖類を含有する請求の範囲８記載の糖類溶液。
16. １６．約１０％から約１２％の糖類を含有する請求の範囲１５記載の糖類溶液。
17. １７．脂質が燐脂質を含有する請求の範囲１記載のリポソーム組成物。
18. １８．燐脂質がホスファチジルコリンを含有する請求の範囲１７記載のリポソー ム組成物。
19. １９．ホスファチジルコリンが卵ホスファチジルコリンを含有する請求の範囲１ ８記載のリポソーム組成物。
20. ２０．リポソーム類が直径が約１０ｎｍから約５００ｎｍである請求の範囲１記 載のリポソーム組成物。
21. ２１．リポソーム類が１５０から２００ｎｍの平均直径を有する請求の範囲２０ 記載のリポソーム組成物。
22. ２２．組成物が凍結乾燥されている請求の範囲２０記載のリポソーム組成物。
23. ２３．リポソーム中へのプロスタグランジンの取り込みが約５０％から１００％ である請求の範囲２記載のリポソーム組成物。
24. ２４．プロスタグランジンＥ２，卵ホスファチジルコリン及び１０％マルトース を含有するリポソーム組成物であって、その際リポソーム類が区画分割一強化緩 衝剤を含有するリポソーム組成物。
25. ２５．患者に該組成物を静脈注射することを含む請求の範囲２４記載のリポソー ム組成物を投与する方法。
26. ２６．請求の範囲２４記載のリポソーム組成物及び製薬学的に許容し得る担体又 は希釈剤を含有する製薬学的組成物。
27. ２７．脂質対プロスタグランジンの重量比が約３００：１から約１０００：１で ある請求の範囲２４記載のリポソーム組成物。
28. ２８．脂質対プロスタグランジンの重量比が約３００：１から約８００：１であ る請求の範囲２７記載のリポソーム組成物。
29. ２９．脂質、プロスタグランジン及び約１０％乾燥保護剤を含有する凍結乾燥さ れたリポソーム性ープロスタグランジン組成物。
30. ３０．凍結乾燥剤が糖類を含有するものである請求の範囲２９記載の凍結乾燥さ れた組成物。
31. ３１．糖類がデキストロース，シュークロース，マルトースを含有するものであ る請求の範囲３０記載の凍結乾燥された組成物。
32. ３２．プロスタグランジンをリポソーム類と膜透過ｐＨ勾配の手段により結合す る工程を含有するリポソーム性ープロスタグランジン組成物の製造方法。
33. ３３．膜透過ｐＨ勾配が以下の工程により得られる請求の範囲３２記載の方法。 （ａ）相対的に塩基性水溶液中でリポソームを形成する工程；（ｂ）上記（ａ） 工程の懸濁液にプロスタグランジンを加える工程、及び （ｃ）リポソーム類の外部媒体を酸化する工程。
34. ３４．（ａ）工程のリポソーム類がサイズー減少されたものである請求の範囲３ ３記載の方法。
35. ３５．リポソーム類がねじれた通路型フィルターを通してろ過することとにより サイズ減少される請求の範囲３４記載の方法。
36. ３６．リポソーム類が真直な通路型膜フィルターを通してろ過することによりサ イズ減少される請求の範囲３４記載の方法。
37. ３７．リポソーム類が均質化によりサイズ減少される請求の範囲３４記載の方法 。
38. ３８．リポソーム類が凍結乾燥されている請求の範囲３３記載の方法。
39. ３９．脂質対プロスタグランジンの重量比が約３００：１から１０００：１であ る請求の範囲３３の方法。
40. ４０．脂質対プロスタグランジンの重量比が約３００：１から８００：１である 請求の範囲３９記載の方法。
41. ４１．プロスタグランジンを含む乾燥保護剤の水溶液を乾燥脂質フィルムと混合 する工程を含有する、脂質、プロスタグランジンＥ２、及び乾燥保護剤を含有す る、リポソーム性ープロスタグランジンの製造方法。
42. ４２．リポソーム類が凍結乾燥されているものである請求の範囲４１記載の方法 。
43. ４３．脂質、プロスタグランジンＥ１、乾燥保護剤及び区画分割−強化緩衝剤を 含有し、以下の工程を含有するリポソームープロスタグランジン組成物の製造方 法：（ａ）脂質のエタノール溶液を乾燥保護剤の相対的に塩基性溶液と混合し、 リポソームを形成する工程；（ｂ）リポソーム類のサイズ減少工程；（ｃ）リポ ソーム類をプロスタグランジンＥ２のエタノール溶液と混合する工程； （ｄ）工程（ｃ）のリポソーム類を凍結乾燥する工程、及び（ｅ）リポソーム類 を相対的に酸性のクエン酸溶液を用いて再構成する工程。
44. ４４．脂質が卵ホスファチジルコリンである請求の範囲４３記載の方法。
45. ４５．乾燥保護剤が糖類である請求の範囲４３記載の方法。
46. ４６．糖類がテキストロース，シュークロース又はマルトースである請求の範囲 ４５記載の方法。
47. ４７．糖類がマルトースである請求の範囲４６記載の方法。
48. ４８．工程（ａ）のリポソーム類が均質化によってサイズ減少される請求の範囲 ４３記載の方法。
49. ４９．請求の範囲４３記載の方法によって形成されたリポソーム類を含有する製 薬学的組成物。