CN115006367A - 一种载抗生素细菌外膜囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种载抗生素细菌外膜囊泡及其制备方法和应用。具体为提取细菌外膜囊泡包载抗生素美罗培南用于治疗临床常见耐药菌，如：耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌的制剂及其制备方法和应用。本发明构建的纳米载体可以提高抗菌药物美罗培南的作用效果，有效抑制临床常见的耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌生长，达到抗耐药菌目的；且具有良好的安全性，为抗耐药细菌的研究提供了新的策略。

Description

一种载抗生素细菌外膜囊泡及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体为提取细菌外膜囊泡包载抗生素美罗培南用于治疗临床常见耐药菌，如：耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌的制剂及其制备方法和应用。

背景技术

过去十年，全球范围耐碳青霉烯类菌株临床分离率、感染率、耐药性均呈现上升趋势，在世界范围内流行。耐碳青霉烯类菌株的出现，使临床预防和控制难度增大，重度感染患者的病死率显著上升，成为患者院内死亡的重要危险因素。目前临床治疗手段局限，且单药治疗效果不佳，多为抗菌药物联合治疗，但联合用药会进一步导致细菌多药耐药，给临床抗感染治疗带来极大的困难和挑战。新药的研究开发周期长、成本高，新型抗菌药物的研发往往滞后于细菌耐药性的发展，无法对抗全球性日益上升的高水平耐药。日益突出的多重耐药菌问题给世界公共卫生和临床抗感染治疗带来了巨大的困难和挑战。

近年来，利用新型纳米载体递送药物，提高药物对细菌的渗透和在感染部位积累，作为一种新的治疗方法具有巨大潜力。细菌外膜囊泡(Outer Membrane Vesicles,OMVs)是一种新型纳米递送载体，由革兰氏阴性菌释放的具有脂质双分子层的球形纳米囊泡，粒径为20-250nm，主要由脂质、蛋白质、多种病原体相关分子模式(Pathogen-associatedMolecular Patterns,PAMPs)组成，PAMPs 包括脂多糖、肽聚糖、甘露糖、DNA、RNA等。OMVs来源于亲本细菌，细菌通过分泌OMVs向宿主细胞递送活性物质调节细胞功能，是细菌与宿主细胞间的一种交流方式。利用这一特点，本发明以低毒性的大肠埃希菌DH5α来源的 OMVs为载体，负载常用抗菌药物美罗培南(MEM)，构建了一种新型纳米药物递送系统MEM-OMVs，以提高MEM的传递效率和对耐药细菌的敏感性，从而有效杀灭耐药菌。目前，还未见细菌外膜囊泡为药物载体用于拮抗临床常见耐药菌研究报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种载抗生素细菌外膜囊泡，是将细菌外膜囊泡载有美罗培南构成。

进一步地，所述的细菌外膜囊泡由大肠埃希菌DH5α分泌。

本发明提取纯化大肠埃希菌DH5α分泌的细菌外膜囊泡，通过差速超高速离心方法提取细菌培养液中的细菌外膜囊泡并通过可视化纳米粒径分析仪、动态光散射测定其粒径和电位，通过透射电镜观察外观形态、凝胶电泳分析其蛋白组成。

结果表明提取纯化的OMVs平均粒径为74nm，多分散性系数PDI为0.185，电位为-30.32±1.36mV，粒子浓度为4.76×10⁸个/mL，在透射电镜下观察具有球形囊泡结构，可见明显的脂质双分子层。总蛋白在35kDa、38kDa等处有明显的条带分布。

本发明的目的之二是提供上述包载美罗培南的细菌外膜囊泡的制备方法：取一定数量的细菌外膜囊泡粒子，加入美罗培南，将两者混匀，孵育一定时间；即得到载药细菌外膜囊泡。

进一步地，孵育在37℃进行；时间至少1h。

进一步地，孵育后的溶液采用超滤管离心洗涤去除游离药物。

结果表明在美罗培南一定浓度范围内，随着投药量的增加，载药量也会不断提高，每10¹²个OMVs粒子与0.01-0.10mmol美罗培南孵育，最优选的美罗培南投药量为0.1mmol。当10¹²个OMVs粒子与0.1mmol的美罗培南孵育后，载药量可达2524.02±4.29μg。

本发明的目的之三是提供载抗生素细菌外膜囊泡在制备拮抗耐药细菌耐药性制剂中的应用。

所述的耐药菌包括：耐碳青霉烯类细菌。

进一步地，耐碳青霉烯类细菌包括：鲍曼不动杆菌和/或铜绿假单胞菌。

本发明验证了包载美罗培南细菌外膜囊泡对耐药细菌的药效考察：实验选择两种临床最常见的耐药细菌：耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌。

选择一定浓度范围的载药细菌外膜囊泡和游离药物溶液。在96孔板中各加入生长状态良好的相应菌液100μL，分别加入不同浓度的细菌外膜囊泡OMVs、游离美罗培南溶液或载药细菌外膜囊泡溶液100μL，混合均匀后置于37℃生化培养箱中培养，在固定时间点0h、2h、3.5h、6h、8h、10h、13h、24 h用酶标仪检测细菌培养液的OD600值，记录细菌24h动态生长曲线，正常细菌培养基作为对照。

实验结果证明，在耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌中，在选择的给药浓度(128μg·mL^-1、64μg·mL^-1、32μg·mL^-1、16μg·mL^-1、 8μg·mL^-1)下，随着美罗培南的浓度增加，细菌生长曲线越平缓，细菌生长越缓慢。在指定给药剂量下(32μg·mL^-1)对于CRAB、CRPA，游离美罗培南组、 OMVs组及对照组在4～24h内细菌快速生长，生长曲线呈现显著上升趋势；而MEM-OMVs组4～24h内生长曲线斜率明显小于MEM组、OMVs组及对照组，细菌生长缓慢。结果证明相比游离药物，经细菌外膜囊泡包载后可以显著增加其抑菌效果，改善其临床应用。

本发明还考察了细菌外膜囊泡载美罗培南后的抑菌机制。将药物溶液与菌液混合均匀后，置于37℃生化培养箱中培养24h，弃去浮游菌，结晶紫染色，计算生物膜比例。结果表明在给定剂量下(128μg·mL^-1、64μg·mL^-1、32 μg·mL^-1、16μg·mL^-1、8μg·mL^-1)对于CRAB，当MEM-OMVs浓度大于 16μg·mL^-1生物膜总量为40％以下；对于CRPA而言，当MEM-OMVs浓度大于16μg·mL^-1生物膜总量为15％以下。同时可以发现，当药物浓度高于16 μg·mL^-1时，MEM-OMVs相比游离MEM可以更明显地抑制细菌生物膜形成，从而有效抑菌。

本发明还考察了OMVs的生物分布以及安全性，表明OMVs进入小鼠体内后主要分布在肝脏、脾脏和肺部中，具有较好的安全性。

本发明有益效果：

本发明构建的载抗生素细菌外膜囊泡可以提高抗菌药物美罗培南的作用效果，有效抑制临床常见的耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌生长，达到抗耐药菌目的。

本发明成功构建的包载美罗培南的细菌外膜囊泡，可增加美罗培南进入耐药菌浓度，显著抑制细菌生物膜形成，达到抗耐药菌目的，且具有良好的安全性，为抗耐药细菌的研究提供了新的策略。

附图说明

图1：大肠埃希菌DH5α菌落形态；

图2：提取OMVs的方法示意图；

图3：OMVs的粒径分布；

图4：OMVs的电位分布；

图5：OMVs的外观形态；

图6：OMVs的蛋白分布；

图7：高效液相色谱分析MEM色谱图；

图8：不同孵育比例MEM对载药量的影响；

图9：各给药组中CRAB的动态生长曲线；

图10：各给药组中CRPA的动态生长曲线；

图11：不同浓度MEM-OMVs下CRAB生长曲线影响；

图12：不同浓度MEM-OMVs对CRPA生长曲线影响；

图13：MEM-OMVs与MEM对CRAB生物膜抑制作用的对比，(n＝3)^*P< 0.05，^**P<0.01；

图14：MEM-OMVs与MEM对CRPA生物膜抑制作用的对比，(n＝3)^*P< 0.05，^**P<0.01；

图15：DIR染色OMVs在小鼠中的体内分布；

图16：DiR染色OMVs在组织器官中的分布；

图17：各组小鼠体重变化情况；

图18：各组小鼠肝肾功能指标检测结果；

图19：各组小鼠血清中细胞因子检测结果；

图20：各组小鼠主要器官的HE染色结果。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例中使用的试剂和仪器如下：

大肠杆菌DH5α购于韦晖生物，LB肉汤培养基购于杭州微生物，BCA蛋白试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购于博士德生物，考马斯亮蓝购于索莱宝生物，甲醇、冰醋酸、磷钨酸购于国药集团，美罗培南(MEM)购于源叶生物，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CRPA)来自于湘雅二医院检验科。

生物安全柜购自热力(Heal Force)，生化培养箱购自上海跃进，低温超速离心机购自贝克曼，纳米粒径跟踪分析仪NS300、动态光散射粒度仪购自马尔文，酶标仪购自赛默飞生物，高效液相色谱仪H20-AT购自岛津。

具体步骤如下：

实施例1

本实施例用于大肠杆菌DH5α培养。

LB肉汤培养基用于提供细菌生长所需的营养和环境。称取25g LB肉汤粉末溶于1000mL纯化水中，加热溶解后，121℃高压灭菌15min，封口后常温干燥处保存备用。

将-80℃冻存的大肠埃希菌DH5α甘油菌取出，用接种环蘸取少量菌液，哥伦比亚血琼脂培养基上分区划线，倒置(培养基底部向上于)37℃生化培养箱中培养24h，得到单克隆菌落。用接种环挑取1-3个单克隆菌落接种到20mL 已高压蒸汽灭菌的LB肉汤培养基中，37℃生化培养箱中摇床培养12h，用LB 肉汤培养基以1：100稀释，转移到灭菌锥形瓶中，37℃生化培养箱继续培养。

从图1中的单克隆菌落可知，细菌生长状态良好，繁殖迅速，琼脂表面光滑，边缘整齐可用于后续培养。

实施例2：本实施例用于大肠埃希菌DH5α来源的OMVs提取。

用酶标仪检测细菌培养液的OD600值，直到OD600为1，即可用来提取 OMVs。收集OD600值为1的培养菌液4L，分装至50mL高速圆底离心管中，4℃，10,000g离心10min，除去绝大部分细菌以及细胞碎片。将上清液通过 0.22μm滤膜过滤，除去残留的细菌。再将收集到的滤液通过100kDa滤膜超滤浓缩，除去大部分非OMVs蛋白质组分。最后将浓缩后的超滤液4℃，200,000g 超速离心4h，弃去上清，加入PBS将OMVs重悬，置于-80℃冰箱中冻存备用，提取方法如图2所示。

取新鲜的OMVs进行表征，采用NTA示踪技术测定提取的大肠埃希菌DH5 α来源OMVs的纳米粒径和粒子数。将待测样品用PBS稀释一定倍数后，吸取 1mL用注射器打入纳米颗粒跟踪分析仪，仪器自动采集液体中纳米粒子的布朗运动轨迹，计算出纳米粒子的粒径大小和数量。

采用DLS激光粒度仪测定OMVs电位，将待测样品用纯水稀释一定倍数后，吸取1mL置于Zeta电位样品池中，将Zeta电位样品池按要求放置于粒径仪，仪器运用电泳光散射测量纳米粒子在分散体系中的电泳迁移率和Zeta电位。

采用透射电镜观察OMVs的形态学。将提取的OMVs用PBS稀释一定倍数后，取10μL样品悬液于带膜铜网上，37℃静置1～5min，干燥后将磷钨酸染色液滴加在制好样品的铜网上染色1～2min，用纯水洗去多余的磷钨酸，静置干燥。在TEM下观察OMVs形态及结构。

由图3-5结果可知OMVs的平均粒径为74nm，粒子浓度为4.76×10⁸个/mL， Zeta电位为-30.32±1.36mV，外观形态呈球形囊泡结构，并且可以看出明显的脂质双分子层结构，证明本发明成功提取纯化了大肠埃希菌来源的OMVs。

实施例3

本实施例用于说明本发明中OMVs的蛋白表征。

通过BCA定量OMVS蛋白，取OMVs与蛋白上样缓冲液以4：1的体积比混匀，100℃加热变性3min，-20℃保存备用。制胶：根据SDS-PAGE试剂盒说明书配制10％的分离胶和浓缩胶。上样：将样品于4℃解冻，涡旋混匀。将20 μL样品与2μL Marker分别上样到泳道。凝胶电泳：80V，30min后，120V， 60min。染色：电泳结束后，剥下分离胶，加入考马斯亮蓝染色液，摇床震荡染色60min。脱色：倒去染色液，用纯水漂洗几遍染色的分离胶，加入脱色液(V 甲醇：V水：V冰醋酸＝9:9:2)，摇床震荡脱色，直至蛋白条带清晰。

经SDS-PAGE凝胶电泳后，考马斯亮蓝染色显示样品蛋白分布如图6所示。 OMVs在35kDa-38kDa处有明显条带分布，大肠埃希菌在35kDa处是OmpA， 38kDa处是OmpF与OmpC，说明提取的OMVs存在细菌外膜蛋白，验证了 OMVs来源于细菌外膜起泡具有细菌外膜囊泡的明显条带。

实施例4：制备载美罗培南细菌外膜囊泡MEM-OMVs

通过高效液相色谱法定量美罗培南的浓度，测定色谱条件为：色谱柱： AgilentTC-C18(2)柱，250×4.6mm,5μm；流动相：0.3％三乙胺溶液(pH6.0±0.1) —乙腈(90：10，v/v)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：220nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

制备MEM-OMVS：取10¹²个OMVs粒子，加入1mLPBS，0.22μm滤膜过滤后，加入MEM，涡旋混匀，37℃孵育2h。孵育后的溶液用100kDa的超滤管，4000g，离心3min，PBS充分润洗三次，除去MEM-OMVs中的游离MEM，超滤液即为MEM-OMVs溶液。

由图7可知，色谱图基线平稳无干扰，专属性良好，保留时间为7.620min。满足MEM含量测定要求。对于载药量测定，10¹²个OMVs粒子与不同摩尔质量的MEM在PBS体系中孵育，获得MEM-OMVs溶液，精密吸取100μL MEM-OMVs溶液，加入900μL甲醇，3000rpm离心15min，破坏OMVs的蛋白，使游离药物析出。吸取上清液通过上述高效液相色谱法测定MEM浓度，计算得到的载药量如图8所示。随着MEM用量的增加，载药量也在不断提高。当 10¹²个OMVs粒子与0.1mmol MEM孵育后，载药量可达2524.02±4.29μg。证明本发明提取的OMVs可以很好地包载MEM，成功构建了包载美罗培南的细菌外膜囊泡。

实施例5：MEM-OMVs抗耐药细菌药效考察。

将MEM与MEM-OMVs(药物浓度均以MEM-OMVs中的MEM计算)用 LB肉汤培养基分别进行等比稀释，得到质量浓度依次为128μg·mL-1、64μg·mL^-1、 32μg·mL^-1、16μg·mL^-1、8μg·mL^-1的药物溶液，现配现用。

CRAB、CRPA于血琼脂平板培养基过夜培养后，分别用接种环挑取形态相似CRKP、CRAB、CRPA单克隆菌落2～4个，接种于20mL的LB肉汤培养基中，37℃生化培养箱中摇床培养12h，用生理盐水将菌悬液浓度调为0.5麦氏浊度，约含1～2×10⁸CFU·mL^-1。在96孔板中各加入菌液100μL后，继续加入不同浓度的MEM和MEM-OMVs溶液各100μL，药物溶液与菌液混合均匀后，放置于37℃生化培养箱中培养，在固定时间点0h、2h、3.5h、6h、8h、10h、13h、 24h用酶标仪检测细菌培养液的OD600值，记录细菌24h动态生长曲线。

采用24h细菌动态生长曲线法，在不同时间段内观察MEM与MEM-OMVs 对CRAB、CRPA的生长影响，如图9和图10所示。在给定剂量下(32μg·mL^-1)，对于CRAB或CRPA的MEM组、OMVs组及对照组在4～24h内，细菌快速生长，生长曲线呈现快速上升趋势，表明其对细菌的生长没有明显影响。而通过 OMVs包载以后，MEM-OMVs组可以明显增加MEM对细菌的生长抑制作用，有效拮抗细菌对MEM的耐药性。

采用24h细菌动态生长曲线法，在不同时间段内观察不同浓度的 MEM-OMVs对CRAB、CRPA的生长影响:

由图11和图12可知，在给定剂量下(128μg·mL^-1、64μg·mL^-1、32μg·mL^-1、 16μg·mL^-1、8μg·mL^-1)，对于CRAB以及CRPA，MEM-OMVs的浓度越高，细菌生长曲线越平缓，细菌生长越缓慢。

实施例6：本实施例用于考察OMVs对细菌耐药机制的影响。

细菌生物膜是细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。细菌生物膜形成是耐碳青霉烯类菌株耐药及引起难治性感染的重要原因，因此本发明考察了 MEM-OMVs抑制耐药细菌生物膜形成的能力。

CRAB、CRPA于血琼脂平板培养基过夜培养后，分别用接种环挑取形态相似CRKP、CRAB、CRPA单克隆菌落2～4个，接种于20mL的LB肉汤培养基中，37℃生化培养箱中摇床培养12h，用生理盐水将菌悬液浓度调为1麦氏浊度。在96孔板中分别加入不同浓度的MEM和MEM-OMVs溶液各195μL，再分别加入5μL菌液，药物溶液与菌液混合均匀后，放置于37℃生化培养箱中培养 24h，弃去浮游菌，用无菌PBS轻柔洗涤2次，再各加入200μL 0.1％结晶紫溶液，室温静置染色15min，弃去结晶紫染色液，用无菌PBS再次轻柔洗涤3次，分别加入200μL无水乙醇，溶解与细菌结合的结晶紫，用酶标仪测定OD560 吸光值。

MEM-OMVs与MEM对CRAB、CRPA生物膜形成的抑制作用如图13和图 14所示，在给定剂量下(128μg·mL^-1、64μg·mL^-1、32μg·mL^-1、16μg·mL^-1、 8μg·mL^-1)，MEM-OMVs组的相对生物膜含量较MEM组更少，表明OMVs包载MEM后可能是通过抑制生物膜形成来促进MEM的抗菌效果。原因可能是 OMVs与细菌生物膜外部融合，在生物膜内部释放MEM，提高了生物膜内部 MEM的浓度，从而抑制生物膜的形成作用较MEM更强。

实施例7：本实施例用于说明OMVs在体内的生物分布。

4～6周大小的雌性BALB/c小鼠在无特定病原体(Specific pathogen Free， SPF)级环境下饲养适应环境，给予小鼠维持饲料，充足饮水，昼夜节律为12h。

用红色荧光染料DiR染色OMVs。OMVs解冻后加入10μg·mL^-1的DiR 染色工作液，孵育30min后超滤除去多余的染料，得到DiR标记的OMVs。

体内生物分布：取小鼠6只，随机分为2组，每组3只。分别为对照组(Free DiR)和实验组(OMVs-DiR)，尾静脉注射，分别给予游离的DiR和DiR染色后的OMVs。第4h、8h、24h后进行活体成像，观察OMVs在不同时间点的体内分布。随后处死小鼠，再取各组织器官(心、肝、脾、肺、肾、肠、脑)进行成像。成像参数如下：激发波长为720nm，发射波长为790nm，曝光时间5min。

安全性考察：取小鼠24只，随机分为3组，每组8只。分别为对照组(PBS)、 OMVs组和MEM-OMVs组。给药方式为尾静脉注射，对照组给予150μL的PBS 溶液，OMVs组给予150μL的OMVs(3×10¹¹粒子溶于PBS)，MEM-OMVs组给予150μL的MEM-OMVs(3×10¹¹粒子溶于PBS，其中MEM给药剂量为65 mg/kg体重)，给药后1天开始收集标本，连续4天。将小鼠眼眶取血，用肝素钠抗凝后3000rpm·min^-1离心15min，吸取上层血浆，-80℃冻存。解剖小鼠后收集心、肝、脾、肺和肾，4％多聚甲醛浸泡，常温保存。

由图15和图16结果可知，OMVs在体内可以循环较长时间，在24h仍有较强的荧光分布，且主要分布在肝脾和肺部中，其中肺部也是常见的感染部位，表明OMVs-MEM具有治疗肺部耐药菌的潜力。

实施例8：本实施例用于说明OMVs和OMVs-MEM的体内安全性。

取小鼠24只，随机分为3组，每组8只。分别为对照组(PBS)、OMVs 组和MEM-OMVs组。给药方式为尾静脉注射，对照组给予150μL的PBS溶液，OMVs组给予150μL的OMVs(3×10¹¹粒子溶于PBS)，MEM-OMVs组给予150 μL的MEM-OMVs(3×10¹¹粒子溶于PBS，载65mg·kg^-1的MEM)，给药后1 天开始收集标本，连续4天。将小鼠眼眶取血，用肝素钠抗凝后3000rpm·min^-1离心15min，吸取上层血浆，-80℃冻存。解剖小鼠后收集心、肝、脾、肺和肾， 4％多聚甲醛浸泡，常温保存。

由图17可知，与对照组PBS相比，给药后，OMVs组和MEM-OMVs组小鼠的体重在第1天有较为严重的下降情况，第2天开始体重逐渐回升，第4 天与对照组体重持平。

各组BALB/c小鼠血浆的肝肾功能指标检测情况如图18所示。与对照组相比，给药后，OMVs组和MEM-OMVs组小鼠ALT和AST出现小幅下降，BUN 和Cr有小幅上升，但均处于正常参考范围内。

各组BALB/c小鼠血浆的TNF-α、IFN-γ及IL-6水平情况如图19所示。与对照组相比，给药后，OMVs组和MEM-OMVs组小鼠TNF-α、IFN-γ及IL-6 水平基本没有变化。

各组BALB/c小鼠组织切片H&E染色结果如图20所示。与对照组相比，给药后，OMVs组和MEM-OMVs组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏从染色结果来看，各组之间没有明显差异。

通过安全性考察，OMVs组和MEM-OMVs组小鼠的体重曲线呈现“勺型”，在给药后第一天有较为显著的降低，随后逐渐上升至与对照组水平一致，说明该给药剂量下的OMVs和MEM-OMVs对小鼠产生了一定的影响，但是随着时间的增加，影响逐渐消失。在肝肾功能方面，OMVs组、MEM-OMVs组的肝肾功能指标ALT、AST、BUN和Cr均在正常参考值范围发生波动，说明该给药剂量下的OMVs和MEM-OMVs对小鼠的肝肾功能没有造成影响。在免疫原性方面，OMVs组和MEM-OMVs组TNF-α、IFN-γ及IL-6水平均与对照组没有明显差别。H&E染色OMVs组、MEM-OMVs组和对照组并无明显差异的实验结果，也证实了该给药剂量下的OMVs和MEM-OMVs对小鼠的心、肝、脾、肺和肾没有造成实质性损伤。综合所有数据来看，OMVs和MEM-OMVs虽然对小鼠的免疫系统造成了一定的影响，但在可以耐受的范围内，因此，该给药剂量下的OMVs和MEM-OMVs具有较高的安全性和良好的生物相容性。

Claims (9)

1.一种载抗生素细菌外膜囊泡，其特征在于，是将细菌外膜囊泡载有美罗培南构成。

2.根据权利要求1所述的载抗生素细菌外膜囊泡，其特征在于，所述的细菌外膜囊泡由大肠埃希菌DH5α分泌。

3.权利要求1或2所述的载抗生素细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，取细菌外膜囊泡，加入美罗培南，将两者混匀、孵育；即得到载抗生素细菌外膜囊泡。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，孵育温度37℃。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，孵育时间至少1h。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，每10¹²个细菌外膜囊泡粒子与0.01-0.1mmol的美罗培南孵育。

7.权利要求1或2所述的载抗生素细菌外膜囊泡在制备拮抗耐药细菌耐药性制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的耐药菌包括：耐碳青霉烯类细菌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，耐碳青霉烯类细菌包括：

鲍曼不动杆菌和/或铜绿假单胞菌。

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