TWI617317B - 抗微生物胜肽用於治療胃潰瘍的用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、 片段或變體用於治療胃潰瘍、預防或治療幽門螺旋桿菌(特別是多重抗藥性幽門螺旋桿菌)感染的新用途，其中該抗微生物胜肽係選自由石斑魚抗菌胜肽-1(Epi-1)、吳郭魚抗菌胜肽(TPs)、及上述之組合所組成之群組。

Description

抗微生物胜肽用於治療胃潰瘍的用途

本發明係關於一種治療胃潰瘍的新方法或組合物。

幽門螺旋桿菌（H. pylori ）的發現和幽門螺旋桿菌在胃潰瘍的作用引發胃腸病學研究的革命（Megraudet al. , Helicobacter pylori resistance to antibiotics in Europe and its relationship to antibiotic consumption. Gut. 2013;62:34-42; Arias & Murray, Antibiotic-resistant bugs in the 21st century--a clinical super-challenge. The New England journal of medicine. 2009;360:439-43）。幽門螺旋桿菌是人體中最普遍存在的細菌病原體之一，而且已移生於全球人口中多達一半人口的胃中。這種病原體可能會導致各種胃與十二指腸的疾病，包括胃炎、消化性潰瘍、MALT淋巴瘤、及胃癌（Fock et al., Helicobacter pylori research: historical insights and future directions. Nature reviews Gastroenterology & hepatology. 2013;10:495-500）。然而，各種開發針對幽門螺旋桿菌的預防性疫苗的嘗試都失敗了。在診斷出感染的情況下，會使用傳統的抗生素療法治療幽門螺旋桿菌。然而，這些治療的成功率會被急劇增加的幽門螺旋桿菌抗微生物抗藥性菌株降低（Rimbara E, Fischbach LA, Graham DY. Optimal therapy for Helicobacter pylori infections. Nature reviews Gastroenterology & hepatology. 2011;8:79-88;. Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet. 1984;1:1311-5）。許多傳統的抗生素對於根除幽門螺旋桿菌是無效的。1990年代初看到三重療法開始治療這種感染。然而，最近出現的、對抗臨床最重要的抗生素，甲硝唑（metronidazole）和克拉黴素（clarithromycin）的抗藥性已對三重療法的功效產生重大不利的影響；此外，抗藥性菌株的出現率提高會限制這些抗生素在未來療法的使用，因為抗藥性無法藉由增加治療的劑量或持續時間來克服（Fischbach L, Evans EL. Meta-analysis: the effect of antibiotic resistance status on the efficacy of triple and quadruple first-line therapies for Helicobacter pylori. Alimentary pharmacology & therapeutics. 2007;26:343-57; Megraud F. H pylori antibiotic resistance: prevalence, importance, and advances in testing. Gut. 2004;53:1374-84）。

仍然需要開發用於治療胃潰瘍或幽門螺旋桿菌感染的新藥物或替代藥物療法。

意外地發現到兩種抗微生物胜肽，石斑魚抗菌胜肽-1 （Epinecidin-1, Epi-1）和吳郭魚抗菌胜肽（tilapia piscidins, TPs）（特別是吳郭魚抗菌蛋白4（TP4））可有效對抗不同的幽門螺旋桿菌菌株，包括多重抗藥性幽門螺旋桿菌。

因此，在一方面，本發明提供一種治療胃潰瘍的方法，包含施予有需要的個體治療有效量的抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體。

在另一方面，本發明提供一種預防或治療幽門螺旋桿菌感染的方法，包含施予有需要的個體治療有效量的抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體。

在又一方面，本發明提供一種預防或治療多重抗藥性幽門螺旋桿菌感染的方法，包含施予有需要的個體治療有效量的抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體。

根據本發明，該抗微生物胜肽係選自由石斑魚抗菌胜肽-1（Epi-1）、吳郭魚抗菌胜肽（TPs）、及上述之組合所組成之群組。具體言之，吳郭魚抗菌胜肽（TP）為吳郭魚抗菌胜肽4（TP4）。

在再一方面，本發明提供一種用於預防或治療幽門螺旋桿菌感染的組合物或醫藥組合物，包含治療有效量的抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體，其中該抗微生物胜肽係選自由石斑魚抗菌胜肽-1（Epi-1）、吳郭魚抗菌胜肽（TPs）、及上述之組合所組成之群組。

在另外又一方面，本發明提供一種用於預防或治療多重抗藥性幽門螺旋桿菌感染的組合物或醫藥組合物，包含治療有效量的抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體，其中該抗微生物胜肽係選自由石斑魚抗菌胜肽-1（Epi-1）、吳郭魚抗菌胜肽（TPs）、及上述之組合所組成之群組。

在又另一方面，本發明提供一種抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體用於製造治療胃潰瘍藥物之用途。

在另外一個進一步方面，本發明提供一種抗微生物肽、該抗微生物肽之功能性衍生物、片段或變體用於製造用於預防或治療幽門螺旋桿菌感染的藥物之用途。

在又另外一個進一步方面，本發明提供一種抗微生物肽、該抗微生物肽之功能性衍生物、片段或變體用於製造用於預防或治療多重抗藥性幽門螺旋桿菌感染的藥物之用途。

在本發明的一個具體實施例中，該抗微生物肽係選自由石斑魚抗菌胜肽-1（Epi-1）、吳郭魚抗菌胜肽（TPs）、及上述之組合所組成之群組。

在本發明的一個具體實例中，吳郭魚抗菌胜肽（TP）為吳郭魚抗菌胜肽4（TP4）。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語皆具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識之人士一般理解的相同的含義。

除非內文以其他方式清楚指明，否則本文中使用的單數形「一」及「該」包括複數的指示對象。因此，舉例來說，提及「一樣品」包括複數個這樣的樣品及所屬技術領域中具有通常知識者習知的該樣品之均等物。

本文中使用的「胃潰瘍（gastric ulcer）」乙詞是指一種消化性潰瘍疾病（PUD），也被稱為十二指腸潰瘍、消化性潰瘍、胃潰瘍（stomach ulcer）。胃潰瘍是胃或十二指腸（小腸的第一部分）黏膜的潰瘍，並伴隨最常見的症狀-燒灼胃痛。在大多數情況下，胃潰瘍是由幽門螺旋桿菌（H. pylori ）感染所引起的。

本文中使用的「其功能性衍生物、片段或變體」乙詞是指保持相同或相似活性、並且表現出相同或相似性質的肽之衍生物、片段或變體。

本文中使用的「治療有效量」乙詞是指與未接收該量的相應個體相比導致疾病、失調、或副作用之治療或痊癒效果、或疾病或失調之進展速度減緩的藥物或藥劑量。該詞還包括在其範圍內可有效增強正常生理功能的量。

本文中使用的「醫藥上可接受的載體」乙詞是指在與製劑的其他成分相容、而且對被施予醫藥組合物的個體無害的層面上醫藥上可接受的載體、稀釋劑、或賦形劑。可以在本發明中使用技術領域中普遍知道或使用的任何載體、稀釋劑或賦形劑，取決於對醫藥製劑的要求。

抗微生物胜肽（ AMPs ）

陽離子基因編碼的宿主防禦胜肽（HDP）是自然界最多樣化且類型豐富的抗生素。大多數的高等生物體利用這些胜肽作為自身的先天免疫系統的一部分。HDP被稱為抗微生物胜肽（AMP）的子類可發揮直接的抗微生物活性。抗微生物胜肽（AMPs）是廣泛的無脊椎動物、植物、及動物的宿主防禦系統的一部分（Lee et al., A helix-PXXP-helix peptide with antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice. Biomaterials. 2014;35:1025-1039; Wimley & Hristova, Antimicrobial peptides: successes, challenges and unanswered questions. The Journal of membrane biology. 2011;239:27-34）。抗微生物肽通常對範圍廣泛的細菌、病毒、真菌及原生動物表現出有效的抗微生物活性。抗微生物肽的主要特徵在於他們是短的、雙性的、及陽離子型的，抗微生物肽擁有快速的滅殺能力，而且他們以細胞的膜和內部成分為目標（Brogden, Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria, Nature reviews Microbiology. 2005;3:238-250; Yount &Yeaman, Immunocontinuum: perspectives in antimicrobial peptide mechanisms of action and resistance. Protein and peptide letters. 2005;12:49-67; Yeaman & Yount, Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacological reviews. 2003;55:27-55; Hancock & Scott, The role of antimicrobial peptides in animal defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2000;97:8856-8861）。

石斑魚抗菌胜肽 -1 （ Epi-1 ）

本發明人分離出編碼來自石斑魚（點帶石斑魚，Epinephelus coioides ）之cDNA和基因體DNA庫的AMP石斑魚抗菌胜肽-1（epinecidin-1, Epi-1）的基因。在結構上，Epi-1類似於比目魚抗菌胜肽（pleurocidin），一種冬季比目魚（美洲鰈，Pleuronectes americanus ）的蛋白質（Pan et al., Gene expression and localization of the epinecidin-1 antimicrobial peptide in the grouper (Epinephelus coioides), and its role in protecting fish against pathogenic infection. DNA and cell biology. 2007;26:403-413.16; Lin et al., Epinecidin-1, an antimicrobial peptide from fish (Epinephelus coioides) which has an antitumor effect like lytic peptides in human fibrosarcoma cells. Peptides. 2009;30:283-290）。隨後有報導Epi-1藉由誘導細菌細胞膜直接溶解、並通過宿主的免疫調節導致細菌清除來作用（Lee et al., The antimicrobial peptide, epinecidin-1, mediates secretion of cytokines in the immune response to bacterial infection in mice. Peptides. 2012;36:100-108; Huang et al., Use of the antimicrobial peptide Epinecidin-1 to protect against MRSA infection in mice with skin injuries. Biomaterials. 2013;34:10319-10327; Pan et al., Insights into the antibacterial and immunomodulatory functions of the antimicrobial peptide, epinecidin-1, against Vibrio vulnificus infection in zebrafish. Fish & shellfish immunology. 2011;31:1019-1025）。Epi-1還顯示出對抗革蘭氏陽性細菌菌株的抗菌活性、以及​抗真菌和抗病毒活性（Pan et al., In vitro activities of three synthetic peptides derived from epinecidin-1 and an anti-lipopolysaccharide factor against Propionibacterium acnes, Candida albicans, and Trichomonas vaginalis. Peptides. 2009;30:1058-1068; Wang et al., Inactivation of nervous necrosis virus infecting grouper (Epinephelus coioides) by epinecidin-1 and hepcidin 1-5 antimicrobial peptides, and downregulation of Mx2 and Mx3 gene expressions. Fish & shellfish immunology. 2010;28:113-120; Pan et al., Evaluation of the epinecidin-1 peptide as an active ingredient in cleaning solutions against pathogens. Peptides. 2010;31:1449-1458）。

吳郭魚抗菌胜肽 （Tilapia Piscidins）

抗菌胜肽（Piscidins）AMPs是由多達21~44個、具有雙性螺旋結構的殘基組成（Maisetta et al., In Vitro Bactericidal Activity of Human β-Defensin 3 against Multidrug-Resistant Nosocomial Strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2006;50:806-809; Winkler et al., Unexpected Challenges in Treating 432 Multidrug-resistant Gram-negative Rods: Resistance to Ceftazidime-Avibactam in Archived Isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2014）。從尼羅河吳郭魚（尼羅口孵非鯽，Oreochromis niloticus ）分離出五種名為吳郭魚抗菌胜肽1〜5（TP1〜5）的不同抗菌胜肽，並由發明人決定這五種抗菌胜肽的編碼序列。TP1、TP2、TP3、TP4及TP5的完整抗菌胜肽編碼序列分別由207、234、231、270及195個鹼基組成，每個鹼基載有68、77、76、89、及64個胺基酸的轉譯區。測定五種抗菌胜肽TP1、TP2、TP3、TP4及TP5的抗微生物和抗真菌活性顯示，這些胜肽是具有廣譜活性的有效和有前景的抗微生物劑。（Peng et al., Five Different Piscidins from Nile Tilapia, Oreochromis niloticus: Analysis of Their Expressions and Biological Functions. PLoS ONE 2012; 7(11): e50263）。合成的抗菌胜肽2據報告在體外對白色念珠菌、粃糠狀鱗斑黴、及白吉利絲孢酵母菌具有殺真菌活性（Khara et al., Anti-mycobacterial activities of synthetic cationic alpha435 helical peptides and their synergism with rifampicin. Biomaterials 2014; 35:2032-8）。

依據本發明發現，Epi-1可有效對抗不同的幽門螺旋桿菌菌株；此外，抗菌活性經由馬鞍形張開的細胞膜彎曲產生而通過膜滲透出現。體內功效的研究顯示，在感染期間通過抑制Treg細胞和其他細胞激素來消除幽門螺旋桿菌移生的明顯性提高了。因此，使用Epi-1作為消滅多重抗藥性幽門螺旋桿菌的單治療劑是有效的。

本發明還發現，吳郭魚抗菌胜肽在體外對幽門螺旋桿菌表現出抗菌活性。具體來說，被證明的是TP4具有最有效的活性，並且對菌株譜是有活性的，同時在低pH值下非常穩定。還被證實的是，TP4具有多種作用模式，包括直接破壞膜和免疫調節宿主的免疫系統。得出的結論是（i）TP4經由膜微胞化破壞膜來施展其對抗幽門螺旋桿菌的抗微生物作用；（ii）臨床分離物對TP4的易損性與預先存在的對抗生素的抗藥性並無關聯；（iii）TP4與傳統抗生素具協同作用；（iv）TP4藉由選擇性調節對抗胃組織持續移生的宿主適應性免疫反應來清除幽門螺旋桿菌感染；總而言之，TP4也可作為對抗多重抗藥性幽門螺旋桿菌的治療劑。

因此，本發明提供一種治療胃潰瘍的方法，包含施予有需要的個體治療有效量的抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體。

另一方面，本發明提供一種預防或治療幽門螺旋桿菌（具體而言是多重抗藥性幽門螺旋桿菌）感染的方法，包含施予有需要的個體治療有效量的抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體。

在本發明中，該抗微生物胜肽係選自由石斑魚抗菌胜肽-1（Epi-1）、吳郭魚抗菌胜肽（TPs）、及上述之組合所組成之群組。在一個具體的實例中，吳郭魚抗菌胜肽（TP）為吳郭魚抗菌胜肽4（TP4）。

在又一方面，本發明提供一種用於預防或治療幽門螺旋桿菌（具體而言是多重抗藥性幽門螺旋桿菌）感染的組合物或醫藥組合物，包含治療有效量的抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體，其中該抗微生物胜肽係選自由Epi-1、TPs、及上述之組合所組成之群組。

另一方面，本發明提供一種抗微生物胜肽、該抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或變體用於製造用於治療胃潰瘍、或預防或治療幽門螺旋桿菌（具體而言是多重抗藥性幽門螺旋桿菌）感染的藥物之用途。

在本發明中，該組合物或醫藥組合物可以使用任何標準技術或所屬技術領域中具有通常知識者習知的常用方法配製。

對於治療的用途，治療有效量的肽、或該肽之功能性變體可被配製成用於施予的醫藥組合物。因此，本發明進一步提供一種包含治療有效量的胜肽或該胜肽之功能性衍生物、片段或變體、連同一種或更多種醫藥上可接受載體的醫藥組合物。

依據本發明，該醫藥組合物可適用於藉由任何適當的途徑施予，該途徑包括但不限於局部的、直腸的、經鼻的、陰道的、口服的或腸胃外的途徑。在本發明的一個具體實例中，該醫藥組合物被配製用於腫瘤內施予。這樣的製劑可以藉由配藥學技術領域中習知的任意方法製備。本發明的一個實例是處於注射劑形式的醫藥組合物。

現在將參照以下實施例更特定地描述本發明，提供該等實施例是為了示範而不是限制的目的。

實施例

實施例 1 Epi-1 的研究

1.1 材料與方法

1.1.1 細菌菌株、生長條件、及抗微生物肽的合成

從美國菌種保存中心（ATCC 43504、700392、及51653）取得幽門螺旋桿菌菌株，而MDR臨床分離物是由吳彰哲博士（國立台灣海洋大學食品科學系）提供。菌株在菌落外觀、革蘭氏染色、及快速脲酶測試中呈陽性反應的基礎上進行鑑定。幽門螺旋桿菌菌株在有補給10 %羊血（紐約Invitrogen）的腦心臟輸注液（BHI）瓊脂（密西根州底特律Difco實驗室）上恢復並培養。將多孔盤在微好氣性氛圍（日本三菱Anaeropack-Anaero）中在37 ℃下培養24小時。TH2-3（QSHLSLCRWCCNCCR-SNKGC，序列編號：1）、TP3（FIHHIIGG-LFSVGKHIHSLIHGH，序列編號：2）、Epi-1（GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLV，序列編號：3）、GE-33（GFFALIPKIISSPL-FKTLLSAVGSALSSSGGQE，序列編號：4）、及Chrysophsin（FFGWLIKGAIH-AGKAIHGLIHRRRH，序列編號：5）是（i）藉由固相肽合成法合成，（ii）藉由反相高效液相層析純化到＞ 95 %的等級，以及（iii）由GL生物化學（中國上海）凍乾。凍乾合成的肽在PBS中重組，以在每次實驗之前產生工作原料。

1.1.2 體外幽門螺旋桿菌生長抑制試驗

藉由檢驗MIC來評估抗菌活性；使用在滅菌96-孔盤中最終體積200 μl的微稀釋試樣測定如下。製備0.1 OD的細菌接種物並在BHI培養液中稀釋1000倍，並將180 μl的等分試樣加到各孔中。在實驗之前製備抗微生物肽（Epi-1、TH2-3、SALF、GE-33、或Chrysophsin-1）的工作標準液（0.9- 50 μg/mL）；將20 μL的AMP溶液加到各孔中。使用PBS作為對照組。將多孔盤在微好氣性氛圍中在37 ℃下培養整夜。藉由光密度量測在600 nm測定在標準條件下的生長。將MIC視為導致24小時的培育之後光密度沒有增加的最低肽濃度。

1.1.3 時間 - 滅殺動力學

將整夜的細菌培養物稀釋到0.1 OD，並在微需氧條件下、在37 ℃無振盪下、在Epi-1（0.5、1、或2倍MIC）存在或不存在下培育培養接種物長達24小時。在接觸後1、3、6、12、及24小時吸出等分試樣，並測定活菌（CFU）的數目。

1.1.4 Epi-1 和抗生素的劑量依賴性功效

使用濁度下降試驗比較Epi-1與AMX、MTZ及CLR對抗幽門螺旋桿菌的抗菌活性。簡言之，使幽門螺旋桿菌（0.5 OD）接觸各種濃度（0.19-25 μg）的Epi-1或抗生素（0.02-2 μg）。將治療組在37 ℃的微需氧條件下培養整夜，然後記錄光密度（OD 600）並繪圖。

1.1.5 使用 1-N- 苯萘胺（ NPN ） - 攝取試驗檢驗幽門螺旋桿菌細胞膜的完整性

簡言之，在37 ℃的微需氧條件下使用不同濃度的Epi-1培養幽門螺旋桿菌培養接種物（0.5 OD）6小時。然後將培養物製粒，並將22 μg/ml的NPN試劑加到顆粒中直到最終體積為250 μl。最後，記錄螢光。螢光增加被視為與幽門螺旋桿菌細胞膜電位和滲透相關。所有試驗都在室溫下進行。

1.1.6 ζ 電位量測

在血瓊脂或培養液中培養幽門螺旋桿菌到3×10⁷ cfu/mL，以獲得足夠高的計數率。在37 ℃、Epi-1存在或不存在下進行量測，並測定15個量測（每個運作120次）的平均。在動態與靜態光散射儀（Zetasizer Nano ZS，英國馬爾文馬爾文儀器（Malvern Instruments））中使用具有金電極的可丟棄ζ電池藉由相分析光散射（PALS）獲得ζ電位值。

1.1.7 穿透電子顯微術研究

使用穿透電子顯微術來檢驗Epi-1誘導的幽門螺旋桿菌形態變化。如前所述固定和處理樣品。所有的樣品都使用在80 kV的加速電壓下操作的FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN穿透式電子顯微鏡（俄勒岡州希爾斯伯勒FEI公司）檢驗。使用電荷耦合元件照相機以不同放大倍率記錄影像。

1.1.8 在感染幽門螺旋桿菌的小鼠模型中測定 Epi-1 的體內功效

將六週齡的C3H/HeN雄性小鼠用於此研究；小鼠從台灣樂斯科生物科技股份有限公司取得，並安置在台灣基隆國立台灣海洋大學的動物設施實驗室。隨意提供動物食物和水。所有參照號碼96025的動物方案都得到國立台灣海洋大學科學學院的實驗動物照護及使用委員會（IACUC）批准。將六週齡的成年小鼠隨機分成三組，每組6隻小鼠。從血瓊脂穫得整夜的幽門螺旋桿菌培養物。小鼠經由灌胃挑戰幽門螺旋桿菌（~1x10⁹ 個細胞）；小鼠在24小時的時間間隔之後接收第二劑相同數量的細胞。在第9天移生之後起，使用Epi-1（250 μg/動物）/PPI-三重療法抗生素（質子泵抑製劑、阿莫西林、克拉黴素、及甲硝唑）的10倍MIC治療動物14天；對照組接收等體積的PBS。治療之後將小鼠安樂死，並取出胃和脾的組織；藉由流式細胞量測術處理脾臟用於T細胞子群體分析。將得到的胃切成兩半，一半用於組織學，另一半用於細菌計數和其他分析。將懸浮液連續稀釋並塗佈在雙份的幽門螺旋桿菌選擇性EYE瓊脂盤上，然後培育24小時。計數總菌落形成單元（CFU）並表示為CFU/g胃。

1.1.9 胃組織切片的組織學分析

將胃組織切片固定在緩衝石蠟中並包埋在石蠟中。用蘇木紫和曙紅將約5 μm的切片染色以分析組織發炎。對於針對幽門螺旋桿菌的免疫螢光染色則使用二甲苯和乙醇將組織載玻片脫蠟，然後在水中再水合。藉由在壓力鍋中在酸鹼值為6.0的10 mM檸檬酸鈉緩衝液中培育切片10分鐘來進行抗原修復。在PBS中洗滌之後，先用兔多株幽門螺旋桿菌抗體（1：200） （台灣GeneTex）、然後用FITC標記的山羊抗兔次級抗體（1：500）培育組織切片。然後使用DAPI將標記的切片計數染色。在光學顯微鏡下以不同的放大倍率觀察切片。如前所述評估組織。對於吉姆薩染色，將載玻片染色2-5分鐘並用PBS洗滌以去除過量的染色劑。將載玻片固定，然後在光學顯微鏡下觀察。如前所述評估組織。

1.1.10 藉由流式細胞量測儀分析脾臟 T 細胞子群體

從安樂死的小鼠取得小鼠脾臟並放在RPMI介質中。在室溫下將脾臟切碎，並通過100 μ大小的篩網，之後以1500 rpm離心5分鐘。將所得顆粒再懸浮於3 ml的RBC溶菌緩衝液中，並在室溫（RT）下培育5分鐘且定期放液；使用RPMI介質稀釋緩衝液來停止反應。將混合物離心，並使用1-2 % FBS將顆粒再懸浮於1 ml RPMI介質中。將所得的單細胞懸浮液等分至流式細胞量測管（100 μl/管）中。將1微升標記螢光的單克隆抗體（CD4、Th17、Treg細胞）加到每個管中，並用PBS讓體積達到500 μl。將管用箔覆蓋，並在室溫下在黑暗中培育1小時。最後，使用BD FACSCanto流式細胞量測儀分析樣品，並記錄每個細胞子群的百分比。

1.1.11 基因表現分析

使用高純度RNA組織套組依據製造商（美國羅氏）的建議從小鼠的胃組織分離出總RNA。對於細胞激素mRNA的定量，使用高容量cDNA庫套組（Invitrogen）將5 μg的總RNA轉化成cDNA。使用用於A CFX Connect™即時PCR檢測系統（Bio-Rad）的TaqMan基因表現試驗藉由Q-PCR量測介白素IL-6、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、及Foxp3 mRNA的水平。將轉錄水平標準化為內源性對照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的mRNA，並使用比較CT法（Bio-Rad）表示為與來自對照小鼠的樣品相比之倍數變化。

1.1.12 毒性評估

口服毒性：

藉由單次口服施予125 mg/kg體重的Epi-1在小鼠體內評估急性口服毒性，每組6隻動物 [37，38]。觀察動物約48小時。記錄死亡率、發病率及臨床症狀。

亞急性口服毒性：

以超過14天的試驗期評估亞急性口服毒性，其中給予小鼠600 μg/小鼠/天。在研究期間，每天觀察動物的臨床症狀和死亡。在測試期結束後，讓動物恢復，並觀察其他臨床異常的發展持續14天。

皮膚毒性：

通過每天施予Epi-1劑量（2.5 mg/動物）持續7天在Balb/c小鼠體內評估皮膚毒性。持續觀察動物至少48小時。記錄皮膚異常。

兔眼刺激測試：

本研究採用健康青壯年的紐西蘭白化病白兔品種。每隻動物的一個眼睛作為負對照，而另一個眼睛用Epi-1（1 mg/kg）治療7天；正對照兔用0.1 % SDS治療。在第1、3、5、及7天檢查眼睛，然後使其恢復直到第14天；此時，記錄臨床觀察分數，並指定在每個檢查過程中觀察到的視覺反應等級。

1.2 結果

1.2.1 Epinecidin-1 對抗幽門螺旋桿菌的抗菌效果

初步篩選五種不同的陽離子肽對抗幽門螺旋桿菌菌株G27的活性。表1列出這些肽的名稱和序列。表 1. 對抗抗生素敏感和抗藥性的臨床分離幽門螺旋桿菌菌株的不同抗微生物肽序列之抗微生物活性。

初步篩選濃度範圍從0.4至100 μg的每種肽。檢查的5種肽其中的一種Epi-1對敏感和多重抗藥性的幽門螺旋桿菌菌株（ATCC 43504、51653、700392、及抗生素抗藥性臨床分離物CI-HC-028）表現出強烈的生長抑制及/或殺菌效果。由於胃內容物的清除相對快速、從而最終縮短幽門螺旋桿菌接觸口服攝取的抗微生物劑的時間，故在考慮幽門螺旋桿菌感染的可能療法時，抗微生物劑施展抗菌活性的速率是特別重要的。圖1（a）顯示Epi-1對抗幽門螺旋桿菌的劑量和時間相依效力；2X和1X MIC的Epi-1分別在1和12小時的接觸後減少了90 %的幽門螺旋桿菌。在0.5X MIC，菌數一開始有減少，但在6小時的接觸後呈指數增加。這些數據表明，Epi-1對抗幽門螺旋桿菌的抗生素敏感和抗藥性菌株的殺菌效果是劑量和時間相依的，且最小殺菌濃度（MBC）為12.5-25 μg。

1.2.2 濁度下降試驗： Epi-1 和抗生素對抗抗藥性臨床分離物之活性比較

任何新的藥物都應表現出比目前治療中使用的抗生素更強的或至少同等的效力。我們研究Epi-1與用於幽門螺旋桿菌療法的抗生素阿莫西林（AMOX）、梅斯（甲硝唑）、及CLRN（克拉黴素）組合的劑量相依抗菌活性（圖1（b））。Epi-1與AMOX、METZ及CLRN表現出協同作用，明顯降低了MIC。Epi-1單獨或與抗生素組合都優於單獨的抗生素。

1.2.3 Epi-1 誘導幽門螺旋桿菌細胞膜的通透性

由於致病細菌體內抗藥性機制的發展，抗生素只在高濃度時抑制細胞壁合成。抗微生物肽通過眾多機制作用，但主要是藉由破壞目標細菌的細胞膜。藉由量測NPN螢光的攝取來檢查細胞膜的破壞。幽門螺旋桿菌接觸低於MIC濃度的Epi-1持續2小時導致螢光快速增加；阿莫西林導致較少的劑量相依性增加（圖2（A））。螢光強度在較高濃度的Epi-1飽和，且與Epi-1的劑量相依動力學相關聯。整體來說，這些數據證明Epi-1使細胞膜破裂。

1.2.4 幽門螺旋桿菌上的 ζ 電位量測結果

為了確認Epi-1可以與幽門螺旋桿菌細胞膜相互作用、結合、及破壞幽門螺旋桿菌細胞膜，量測ζ電位來檢查表面電荷。如圖2（B）所示，在血瓊脂上或在培養液中培養的幽門螺旋桿菌呈現帶有負電荷（分別為−33.87 ± 0.75 mV和-27.5 ± 0.75 mV）。藉由添加Epi-1到任一個培養物中，ζ電位變成較少負的（分別為+3.52和-14.03 ± 0.75 mV）。這些數據暗指的是，Epi-1可以與幽門螺旋桿菌的負表面相互作用，從而引起劇烈的細胞膜滲透；此外，這些數據與NPN攝取的研究結果是一致的。整體來說，結果顯示Epi-1與幽門螺旋桿菌表面的電位有密切關係，此舉可能會導致細胞膜破裂串聯。

1.2.5 穿透式電子顯微術顯示 Epi-1 誘導馬鞍形張開的細胞膜彎曲產生

未治療的細胞表現出正常的形態（圖3A），並具有鮮明的、完整的內外細胞膜、及薄而均勻的週質空間。阿莫西林治療的幽門螺旋桿菌細胞表現出低比例的球菌形態（圖3B）；這些擴大的細胞具有原生質細胞膜與外細胞膜明確分離的特徵。此外，一些細胞表現出細胞質內容物完全喪失；這些溶解的細胞具有與前面針對幽門螺旋桿菌鬼影細胞所描述的類似的細胞膜。與對照細胞相比，接觸Epi-1的幽門螺旋桿菌樣品（圖3C）顯示明顯改變的形態表型。Epi-1治療的細胞中大多數的細胞顯現為鬼影細胞。Epi-1治療在幽門螺旋桿菌細胞膜中選擇性引發馬鞍形張開的細胞膜彎曲（非零曲率）；這種曲率的引發對於幾個過程是必要的條件，包括孔形成、起泡、出芽及囊狀化（vesicularization）（圖3D-圖3E），上述過程涉及破壞細胞膜的穩定。圖3D顯示細胞膜接觸Epi-1後的囊狀出芽和發泡。過度的出芽和發泡導致細胞膜溶解和細胞組分通過引導孔（圖3E的箭頭）釋放。細胞溶解和外細胞膜鬆弛在顯微照片中是明顯的。

1.2.6 Epi-1 在小鼠模型中對抗幽門螺旋桿菌感染的體內功效

基於我們強有力的體外數據，我們接下來尋求評估Epi-1在感染模型中對抗幽門螺旋桿菌的體內治療功效（圖4顯示的方案）。我們在第1天使C3H/HeN小鼠感染幽門螺旋桿菌接種物（1X 10⁹ CFU），並在第3天以相同劑量再次刺激小鼠。在感染8天後證實移生。從第9天開始，每天給予小鼠Epi-1劑量（250 μg）或PPI-三重療法（10xMIC）持續兩個星期。然後犧牲小鼠，並收集器官。製備胃溶解物用於各種生化和組織病理學試驗。感染對照組和抗生素組在快速脲酶試驗中測試幽門螺旋桿菌為陽性的（圖5A）。藉由比較未治療組和三重療法組之間小鼠胃組織中的幽門螺旋桿菌數量來評估治療功效（圖5B）。研究期之後，觀察到未治療組有5x10⁶ CFU幽門螺旋桿菌/胃組織，而在PPI-三重療法組中這減少了2個數量級（4x 10⁴ CFU/g）。Epi-1治療導致100%清除（幽門螺旋桿菌無法通過脲酶試驗、PCR、西方墨點法、或選擇性瓊脂電鍍檢測到），表示Epi-1是對抗幽門螺旋桿菌感染的有效單治療劑。

1.2.7 胃組織中幽門螺旋桿菌感染的免疫螢光檢測

隨後使用免疫螢光染色來檢測胃組織切片中的幽門螺旋桿菌。如圖6所示，感染幽門螺旋桿菌的未治療小鼠呈現綠色螢光，表示細菌在胃的表面黏膜並朝向黏膜肌層。幽門螺旋桿菌也存在於腺狀管腔中，並深深滲透到胃腺體中。PPI-三重療法（抗生素）的螢光減少，但未能消除胃組織的細菌（與幽門螺旋桿菌數量一致。相反地，在來自Epi-1治療組的切片中未觀察到螢光，表示組織層次的幽門螺旋桿菌被大量清除。

1.2.8 用於胃炎評估的組織學檢驗

用蘇木紫-曙紅和吉姆沙染色劑將胃組織切片染色用於組織學檢驗（圖7（a）和圖7（b））。未治療小鼠的胃切片有明顯發炎；另外，潰爛底和黏膜肌層被免疫細胞嚴重浸潤（圖8（a））。這些發炎細胞往小凹、主要的、及壁細胞區浸潤，而對表面上皮造成表面損傷（圖7（b））。這種結果是移生過程中由幽門螺旋桿菌介導宿主免疫系統的調節所造成的。PPI-三重療法並不影響發炎，而Epi-1的治療則明顯減少在潰爛底和黏膜肌層的發炎和免疫細胞浸潤。這些數據暗示，單治療劑量的Epi-1通過明顯清除幽門螺旋桿菌來恢復胃組織的形態。

1.2.9 Epi-1 對幽門螺旋桿菌在脾細胞誘導的 CD4+Foxp3 、 Th17 T 細胞亞群優勢的影響

最近的研究已經指出，幽門螺旋桿菌感染誘導對抗輔助T細胞免疫力的強調節性T細胞（Treg）極化，以增強幽門螺旋桿菌的持久移生；初始增加的Th17細胞引起發炎以有助於移生（圖8（a）），但保持低的Th17/Treg比來對抗宿主的免疫反應。Epi-1治療明顯減少幽門螺旋桿菌偏移的Treg亞群，並適度減少Th17數量；另外，Epi-1恢復Th17/Treg的平衡（圖8（a））。這表示，在第一時間，Epi-1抑制幽門螺旋桿菌介導的宿主免疫反應調節，這可能導致所觀察到的幽門螺旋桿菌移生減少。這些數據與圖5B所示對胃組織細菌負荷的作用相關聯。

1.2.10 Epi-1 對幽門螺旋桿菌在胃組織誘導的細胞激素 mRNA 表現的影響

為了進一步評估幽門螺旋桿菌引起的胃組織免疫反應，我們進行了即時PCR來量測Epi-1治療對編碼細胞激素的基因之mRNA表現水平與感染小鼠體內的T細胞標記物的影響（圖8（b））。我們報告某些細胞激素（腫瘤壞死因子-α、IL-6、IL-10、及IL-17）和T細胞標記物FOXP3在幽門螺旋桿菌感染的過程中明顯上調。IL-10和IL-17在持久的幽門螺旋桿菌移生和胃發炎中扮演主要的角色。Epi-1明顯抑制IL-10的表現，IL-10在Treg細胞的發展中扮演關鍵的角色；此外，Epi-1恢復Th17/Treg的平衡。

1.2.11 臨床前毒性評估

據報告，Epi-1的急性和亞急性口服施予（分別以125mg/kg和600 μg/小鼠的劑量）沒有在小鼠中引起任何臨床異常、發病或死亡。檢驗全血的生化：沒有觀察到麩胺酸草乙酸轉胺酶（GOT）、麩胺酸丙酮酸轉胺酶（GPT）、血脲氮（BUN）、肌酸酐（CRE）、總膽紅素（TBIL）、或尿酸（UA）的水平有明顯的變化。身體發育也正常。

與SDS（正對照組）相比，皮膚毒性試驗（施加2.5 mg Epi-1/2 cm² 皮膚表面）沒有在施加區域引起任何刺激、病變、或臨床症狀。在試驗期間頭髮和身體生長均正常，粗略屍檢沒有在重要器官或在施加區域顯現任何可檢測的異常（圖10（a））。

接著，使用兔子進行眼刺激試驗。眼睛接受1 mg/眼/日的Epi-1持續7天，並使之復原7天。在第2天和第3天，徐徐滴入Epi-1的眼睛呈現流淚的跡象，但後來眼睛變成正常，而且在測試期間與SDS治療的眼（陽性刺激物）相比時並沒有顯現任何明顯的眼部症狀（表2）。屍檢沒有發現任何異常。整體來說，我們的結論是，當通過口服、皮膚或眼的途徑施予時Epi-1沒有引起任何不良的毒性（圖10（b））。表 2 Epi-1 的眼刺激試驗結果

得出的結論是，當在小鼠和兔子身上通過試驗途徑施予時Epi-1不會造成不良的影響。先前發現Epi-1在皮膚損傷期間參與傷口癒合；而且在小鼠的全身毒性研究中沒有觀察到不良的影響。因此，Epi-1適用於全身、口服、或局部施用。

實施例 2 TP4 的研究

2.1 材料與方法

2.1.1 幽門螺旋桿菌菌株及其他材料

使用幽門螺旋桿菌菌株美式細胞培養物（ATCC）43504、51653及700392、以及由吳明賢博士（台灣國立台灣大學醫院內科部胃腸肝膽科）提供的臨床分離物CI-HC-028來測定TP4的抗微生物功效。使用Anaeropack-Anaero包（日本三菱）在微需氧氛圍下生長幽門螺旋桿菌。抗生素；阿莫西林、克拉黴素及甲硝唑（密蘇里州聖路易斯Sigma化學公司）。所有動物方案編號96025都得到台灣基隆國立台灣海洋大學科學學院的實驗動物照護及使用委員會（IACUC）批准。

2.1.2 抗微生物胜肽 TP4 的合成

由GL生化（中國上海）使用Fmoc化學的固相程序合成具有FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR胺基酸序列的尼羅河吳郭魚抗菌蛋白4（TP4）。將粗肽萃取、凍乾、並藉由反相高效液相層析術（HPLC）純化。純化肽的分子量和純度分別藉由質譜儀和HPLC驗證。在每個實驗之前在PBS中新鮮重組純度＞ 95 %的合成肽用於工作原料。

2.1.3 體外抗幽門螺旋桿菌評估

將進行指數生長的幽門螺旋桿菌細胞懸浮在無菌磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中，並使用BHI培養液調整到0.05 OD；將接種物分配到微量滴定盤上。使用PBS製備不同濃度（0.04至50 μg mL^-1 ）的肽TP4。使用抗生素抗藥性臨床分離物CI-HC-028和三個參考菌株進行敏感性試驗。將MIC定義為沒有可見生長的最低藥物濃度。為了品質控制和比較分析，還檢驗了全部四個幽門螺旋桿菌菌株對抗生素阿莫西林、克拉黴素、及甲硝唑的敏感性。

2.1.4 TP4 的劑量和時間相依性影響

製備濃度對應於1/4、1/2、1、2、及4倍MIC的TP4肽溶液（100 μl）並加入等體積含約107 CFU mL^-1 幽門螺旋桿菌量的溶液到微量滴定盤上。在37 ℃下培育滴定盤，並在1、3、6、12、及24小時收集樣品，而且使用適當稀釋劑將樣品塗到血瓊脂盤上；計數細菌數量並表示為平均對數(CFU mL^-1 ）與標準差。

2.1.5 TP4 對幽門螺旋桿菌表面電荷的影響

在室溫下使用裝有633 nm氦氖雷射的Zetasizer Nano ZS（英國伍斯特郡馬爾文儀器）進行ζ電位研究。製備在MIC的TP4。將體積100 μl的每種肽原料稀釋液添加到900 μl（0.5 OD）在液體培養物/血瓊脂培養物中的幽門螺旋桿菌。正對照組包含過濾的緩衝液，而不是肽。將細菌懸浮液分配到具有金電極的可丟棄ζ電池中，並使其在25 ℃下平衡15分鐘。計算每個樣品的ζ電位。使用獨立生長的培養物進行完整的實驗，每種肽進行兩次。

2.1.6 TP4 誘導的幽門螺旋桿菌形態變化之穿透式電子顯微術（ TEM ）分析

使用穿透式電子顯微術（TEM）來研究TP4對幽門螺旋桿菌的作用機制、整體細胞形態、TP4移位進入幽門螺旋桿菌、及TP4與內部標靶的相互作用。從BHI血瓊脂盤收集幽門螺旋桿菌整夜培養物，並使用TP4、阿莫西林、及/或PBS（僅PBS：負對照組）培育0.1 OD的接種物。在培養6小時時，收集幽門螺旋桿菌細胞並在PBS中藉由離心和再懸浮連續洗滌兩次。然後使用前述方法並修改一些來固定並處理細胞用於進行TEM。簡言之，將細胞在分級系列的乙醇中脫水，隨後在65 ℃下樹脂聚合3天。使用電磁超薄切片機來從聚合塊切出厚度70至80 nm的薄切片，然後將薄切片裝載在400目的銅網上。之後使用2 %乙酸氧鈾將切片染色15分鐘，然後檸檬酸鉛5分鐘，再固定以使用在80 keV下操作的FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN穿透式電子顯微鏡（俄勒岡州希爾斯伯勒FEI公司）觀察。以低功率倍率（X1100）觀察細胞的形態，並以高功率倍率（X2、500/5,000/7,000、或X15,000）觀察細胞壁超微結構。使用相同的設定仔細檢查每個網格。使用4MP SPOT Insight電荷耦合元件（CCD）照相機記錄影像。

2.1.7 TP4 在小鼠模型中對抗幽門螺旋桿菌感染的單一治療功效

從樂斯科台灣生物科技股份有限公司取得雄性C3H/HeN小鼠，並將小鼠安置在動物設施實驗室。依據農委會（台灣COA）的指導方針，將小鼠保持在無病原體的無菌隔離區中。所有參照號碼96025的動物方案都得到台灣基隆國立台灣海洋大學科學學院的實驗動物照護及使用委員會（IACUC）批准。對於幽門螺旋桿菌的感染模型，將六週齡的雄性小鼠隨機分成三組，每組6隻小鼠。為了建立初步的幽門螺旋桿菌感染，在兩天（時間間隔24小時）使用~1x109 CFU的幽門螺旋桿菌灌胃刺激小鼠。移生之後（第9天起），每天使用單一治療劑量的TP4（8 mg/kg）治療小鼠持續14天；對照組接收等體積的PBS。治療兩週後在第22天犧牲小鼠，並處理胃組織用於脲酶活性、幽門螺旋桿菌定量、西方墨點法、組織病理學分析、T細胞亞群定量、及即時PCR。

2.1.8 幽門螺旋桿菌移生的評估

製備獲得的胃溶解產物且連續稀釋，並將100 μl等分試樣重複塗佈到EYE選擇性瓊脂盤上兩次。在37 ℃下將盤在微需氧條件下培養24-72小時。記錄粉紅色的菌落（幽門螺旋桿菌）和總活菌數。

2.1.9 幽門螺旋桿菌致病因子基因的表現

使用組織和細胞基因體DNA純化套組（台灣GeneMark；DP021-50）從胃組織溶解產物（25 μl）中分離出基因體DNA（gDNA）。使用NanoDrop N1000分光光度計測定DNA的濃度和品質。使用基因特異性引子（ Ure B F: 5'-GGC ACC ACT CCT TCT GCA AT-3' (序列編號：10）； R: 5'-CAG CTG TTT GCC AAG TTC TGG-3' (序列編號：11）； Cag A F: 5'-GAT GTG AAA TCC CCG GGC TC-3'(序列編號：12）； R: 5'-ACT GCG ATC CGG ACT ACG AT-3'(序列編號：13）；，內部對照16s rRNA F: 5'-ACG CGT CGA CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3'(序列編號：14）； R: 5'-AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC-3'(序列編號：15））進行聚合酶鏈反應（PCR）及100 ng的gDNA作為模板。在2 %瓊脂糖凝膠上藉由電泳來分離所得的PCR產物並用溴化乙錠染色。

2.1.10 西方墨點法

使用脲酶B蛋白作為標記以確認幽門螺旋桿菌存在於胃組織中。將所有的溶解產物蛋白（25 μg）裝載到SDS凝膠上並藉由電泳分離。然後將蛋白帶轉移到PVDF膜上。印漬之後，使用溶於TBS且帶有0.01 % Tween 20的3 % BSA將膜封閉，並使用脲酶B特異性抗體檢測蛋白質。使用化學發光檢測器（UVP BioSpectrum）測定蛋白帶的相對強度。

2.1.11 組織病理學檢查

將胃組織切片固定在緩衝石蠟中並包埋在石蠟中。用蘇木紫和曙紅將約5 μm的切片染色以分析組織發炎。對於針對幽門螺旋桿菌的染色則使用二甲苯和乙醇將組織載玻片脫蠟，然後於水中再水合。在PBS中洗滌之後，使用改質的吉姆薩染色來培育組織切片2-5分鐘，然後用PBS洗滌。將載玻片固定，然後在光學顯微鏡下以不同放大倍率觀察切片。如前所述評估組織。

2.1.12 流式細胞量測術

進行流式細胞量測術來量化小鼠的脾臟T細胞亞群。簡言之，在安樂死的小鼠上進行脾切除術，並將脾臟轉移到RPMI介質中。在室溫下將脾臟切碎，並通過100 μ大小的篩孔，而且將單細胞懸浮液以1500 rpm製粒5分鐘。將所得的細胞顆粒再懸浮於3 ml的RBC溶解緩衝液中，並在室溫（RT）下培育5分鐘且緩和放液，以有助於溶解和細胞解體。使用RPMI介質稀釋緩衝液來停止溶解反應。將混合物再次離心，並將顆粒懸浮在RPMI介質中。將所得的單細胞懸浮液等分至流式細胞量測管（100 μl/管）。將1微升螢光染料標記的單株抗體（T細胞亞群；CD4、Th17、Treg）加到各管中，並用PBS將體積補足到500 μl。將管用箔覆蓋，並在室溫下在黑暗中培育1小時。然後使用BD FACS Canto-A流式細胞量測儀分析樣品，並記錄T細胞亞群的百分比。

2.1.13 胃細胞激素和 T 細胞標記基因的表現

使用高純度RNA組織套組依據製造商（美國羅氏）的建議製備來自C3H/HeN小鼠的胃的全體RNA。對於細胞激素mRNA的定量，使用高容量cDNA庫套組（Invitrogen）將5 μg的全體RNA轉化成cDNA。使用用於A CFX Connect™即時PCR檢測系統（Bio-Rad）的TaqMan基因表現試驗藉由Q-PCR量測介白素IL-1β、IL-6、IL-18、IL-10、IL-23、IL-17、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、TGF-β、及Foxp3 mRNA的水平。將轉錄水平標準化為內源性對照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的mRNA之轉錄水平，並使用比較CT法（Bio-Rad）表示為與來自對照小鼠的樣品相比之倍數變化。

2.1.14 TP4 的 毒性研究

口服毒性：

藉由單次口服施予TP4（125 mg/kg）在C3H/HeN小鼠體內評估急性毒性，每組6隻動物。劑量施予之後持續觀察動物最少48小時，並記錄死亡率和臨床症狀。亞急性毒性：施予動物TP4（600 μg的劑量/天）14天。在劑量施予期間，每天觀察動物有無任何毒性的症狀持續28天的測試期。記錄和評估發病率、死亡率、及其他臨床症狀。

皮膚毒性：

施加TP4（125 mg/kg）到小鼠的皮膚（局部）上。施予後，持續觀察動物至少48小時並注意臨床症狀。

紐西蘭白兔的眼刺激測試：

使用TP4、PBS（載體對照組）、或0.1 % SDS（正對照組）治療健康的青壯年兔眼。每天施予重複的劑量1 mg/kg持續7天。在治療期間，在第1、3、5、及7天檢查眼睛，並讓眼睛恢復直到第14天。在測試期間記錄臨床症狀，並對檢查過程中的視覺反應指定等級。

2.1.15 統計分析

進行統計分析，並使用SPSS 17.0， Graphpad 5.2軟體產生圖表。將結果表示為平均值±s.e.m.（平均值的標準差）。使用學生t測試(Student’s t-test)、ANOVA進行統計分析。在p ＜ 0.05時p的值是有意義的。

2.2 結果

2.2.1 吳郭魚抗菌胜肽 1 〜 5 對抗幽門螺旋桿菌的 MIC 和 MBC 之測定

證明的是，吳郭魚抗菌胜肽可有效對抗革蘭氏陰性和革蘭氏陽性的病原體。這裡，我們研究了五種吳郭魚抗菌胜肽對抗各種幽門螺旋桿菌菌株（包括抗生素抗藥性菌株）的最小抑菌濃度（MICs）。將MIC值呈現於表3。TP2例外，其他四種胜肽（TP1、TP3、TP4、及TP5）抑制幽門螺旋桿菌的生長。效力最強的胜肽是TP4，所以TP4被選擇用於深入特徵化。表3的數據指出的是，幽門螺旋桿菌的四種菌株全都對TP4敏感（MIC- 1.5-3 μg mL^-1 ），不管菌株是否對抗生素敏感或有抗藥性。重要的是，TP4的效果是劑量和時間相依的，表示TP4與固定數量的細菌標靶有相互作用。表 3 吳郭魚抗菌胜肽 1 〜 5 對抗實驗室和抗藥性 552 臨床分離物幽門螺旋桿菌菌株的抗微生物活性

2.2.2 劑量和時間滅殺曲線

抗微生物活動的速率是重要的，因為它決定了所需的濃度是否在惡劣的胃環境中保持足夠的時間。因此，我們分析了對抗幽門螺旋桿菌的劑量相依性影響，並發現在MIC和2xMIC分別為99 %和99.99 %。另外，我們評估對抗幽門螺旋桿菌菌株的時間滅菌試驗。如圖11（A）所示，在使用1xMIC的TP4治療之後沒有菌落恢復；建立99 %滅殺率所需的時間為約3小時。以2或4xMIC培育提高了滅殺率。一起來看，這些數據表示，TP4以劑量和時間相依的方式對幽門螺旋桿菌作用。抗微生物胜肽的快速滅殺動力學經由細胞膜溶解/孔形成而發生。

2.2.3 TP4 抗微生物活性與抗生素的抗藥性無關

比較TP4和傳統抗生素對抗抗藥性臨床分離物CI-HC-028的殺菌活性。幽門螺旋桿菌的某些抗藥性菌株先前被報告為對甲硝唑和克拉黴素有抗藥性。這裡，我們檢視圖11（B）圖示的、基於時間的CI-HC-028敏感性曲線；在約6小時之前，TP4治療已減少了＞ 3對數等級（99 %）的幽門螺旋桿菌，同時，抗生素中，只有阿莫西林在24小時內表現出90 %的滅殺。甲硝唑使細胞數量一開始減少，但逐漸失去活性；克拉黴素持續減少cfu，但減少90 %所花的時間＞ 24小時。因此，多重抗藥性（MDR）表型與對TP4的易損性之間沒有相關。因此，TP4對抗MDR幽門螺旋桿菌比抗生素更有效。

2.2.4 抗藥性的發展

抗藥性發展的主要驅動力是不恰當的抗生素使用及與治療方案的順從性差。這裡，我們建立了用於模擬抗藥性出現的情況的模型：在體外使細菌接觸次抑制劑量的抗生素（AMOX、CLRN、METZ）或胜肽TP4。如圖11（C）所示，抗藥性指數（抗藥性指數：MICp/MICs）；阿莫西林在傳代6代後略微增加，並且此後保持不變。克拉黴素和甲硝唑的抗藥性指數（MIC）從傳代3代逐漸增加到最後的傳代。然而，在我們的實驗過程中TP4的抗藥性指數沒有發生變化。這些結果暗示，細菌可能不容易對TP4胜肽發展出抗藥性。

2.2.5 TP4 與抗生素對抗藥性幽門螺旋桿菌展現協同作用

組合療法往往會增強抗生素的療效並減少抗藥性出現的頻率。為了確定TP4用於組合療法的適宜性，我們研究了此AMP是否與不同類的抗生素表現出協同活性。評估體外劑量OD降低動力學，以確定TP4與AMOX、CLRN、或METZ組合之活性，傳統上AMOX、CLRN、或METZ被用作抵抗幽門螺旋桿菌的第一線防禦。據報告，TP4具有顯著的協同作用、將AMOX的MIC降低四分之一、並將METZ和CLRN的MIC降低二分之一倍（圖11（D））。

2.2.6 經由膜微胞化的 TP4 體外抗微生物機制： NPN 螢光、表面電荷及穿透電子顯微術研究

陽離子AMP已顯示可針對並破壞細菌細胞膜及/或以可中斷生物分子合成的方式與內部標靶相互作用。因此，我們檢驗TP4是否誘導幽門螺旋桿菌細胞膜的滲透和破壞。我們使用1-N-苯萘胺（NPN）攝取試驗評估膜的完整性。一般來說，NPN被完整的細菌細胞膜忽略。然而，當膜集合體被破壞時，NPN可容易穿過屏障進入外膜的疏水性內部，導致螢光迅速增加。因此，我們在TP4治療之後檢視NPN螢光強度（圖12（A））。TP4以次MIC值增加螢光；因此，此AMP可以次MIC劑量有效地滲透細胞膜。然而，AMOX僅在高劑量下顯示螢光強度略微增加。為了確認TP4滲透細胞膜，我們通過ζ電位研究來分析細菌培養物的表面電荷（ζ電位/mV）（圖12（B））。幽門螺旋桿菌血瓊脂和培養液接種物分別顯示-33.83和-27.47 mV的ζ電位。添加MIC的TP4到兩種接種物分別將ζ電位大大提高到+13.03和-6.18 mV。這些數據強有力地表示，TP4與幽門螺旋桿菌表面膜相互作用，並從而將膜溶解。

2.2.7 TP4 對幽門螺旋桿菌細胞膜形態的影響

接下來，使用TEM檢視與TP4接觸2小時之後獲得的細胞之超微結構。對照組幽門螺旋桿菌細胞的低和高放大倍率影像分別顯示長且規則的螺旋結構、和具有完整細胞膜的圓球菌細胞（圖12（C）（a））。接觸AMOX後（圖12（C）（b）），幽門螺旋桿菌顯現為具有鬆弛外膜的「鬼影」細胞。另一方面，TP4導致細菌細胞膜實質破壞（圖12（C）（c））；高倍率影像顯示，這是由於微胞化（圖12D）。此外，觀察到電子緻密結構。TP4在這個早期時間點的作用與觀察到的NPN膜滲透時間（圖12（A））和滅殺動力學試驗數據（圖11（A））一致。

2.2.8 抗微生物肽 TP4 對幽門螺旋桿菌感染的功效

令人驚訝的是，在更高的放大倍率下（X7000-15000）觀察到廣泛的幽門螺旋桿菌細胞膜擾動（圖12（D）（a-c）），與突出微胞的外觀、膜脫落一致（圖12（D）（a））。此外，觀察到缺少膜的區塊（圖12（D）（b））和表示微胞化的裂口、以及細菌-TP4微胞分離（圖12（D）（c））。微胞形成時證明外膜破壞，這接著導致洩漏和膜去極化；如所預期的，形態與ζ電位相關（圖12（A）和圖12（B））。總之，這是第一次根據這些數據顯示TP4藉由誘導細胞膜的微胞化而導致幽門螺旋桿菌的細胞死亡。圖16給予提出的作用機制。

2.2.9 TP4 在小鼠感染模型中對抗幽門螺旋桿菌的體內功效

上述體外數據表示，TP4具有強的、對抗幽門螺旋桿菌的活性。因此，我們繼續評估TP4對抗幽門螺旋桿菌的體內治療功效和免疫調節特性。圖13（A）顯示建立體內感染的實驗計劃，在感染後1週，將小鼠分成3組（n = 6），並用PBS、TP4、或PPI三重療法治療。治療後，進行脲酶測試並確認幽門螺旋桿菌存在於未​​治療的小鼠或使用三重療法治療的小鼠的胃組織中，但不在使用TP4治療的小鼠的胃組織中（圖13（B））。此外，在未治療組的小鼠胃中檢測到平均7×10⁵ CFU/g的幽門螺旋桿菌；這在使用PPI三重療法治療的小鼠身上大幅降到5×10⁴ CFU/g（p= 0.0187）。在使用TP4治療的小鼠的胃組織中未檢測到細菌（雖然幾種方法都無法在這一組檢測到細菌，但為了進行統計比較將細菌存在的可能性設為＜ 10 CFU）（圖13（C）。與PPI三重療法組相比，TP4導致細菌負載量明顯減少（p= 0.00152）。我們的結論是，TP4治療從感染小鼠的胃中大量清除了幽門螺旋桿菌負載量。

2.2.10 TP4 對幽門螺旋桿菌致病因子之基因和蛋白表現的影響

幽門螺旋桿菌菌株之間有從致病因子存在或不存在所產生的不同致病度的證據。使用PCR來放大幽門螺旋桿菌的某些推定致病標記（cagA基因和ureB基因）作為檢測幽門螺旋桿菌在胃中移生的敏感237手段（圖13（D）（a））。發現在第22天犧牲的感染小鼠對於ureB和cagA都是陽性的，從而確認分子水平的移生。使用抗生素複合物治療未能根除幽門螺旋桿菌，但降低了帶強度（儘管這種降低並不明顯，與圖13（C）相關）。然而，TP4治療組測試對於ureB和cagA基因都是陰性的。據建議，用於ureB和cagA的PCR可適用於在治療後作為診斷工具，治療後在胃黏膜的細菌量通常是少量的，而且可能無法藉由培養或其它診斷方法檢測到。我們繼續檢查幽門螺旋桿菌致病因子脲酶B的胃溶解物，脲酶B對於在胃的酸性環境中移生是重要的。在未治療組中檢測到高強度的脲酶B蛋白，而三重療法降低了蛋白表現，而且TP4治療徹底破壞了可檢測蛋白（圖13（D）（b））。這些數據與膜和表面電荷破壞的結果（圖12（A）和圖12（B））一起意味著，幽門螺旋桿菌致病因子Cag A和脲酶是通過分泌外膜囊泡被釋放，外膜囊泡是從細菌細胞膜產生的，並具有與母膜相同的成分和表面電荷。因此，TP4也清除細胞外的細菌及其致病因子。

2.2.11 組織學檢查及特殊染色分析

使用改質的吉姆沙將胃組織切片染色用於檢測胃黏膜的幽門螺旋桿菌移生（圖14（a））。未治療和三重療法治療的小鼠在胃的表面表現出大量的幽門螺旋桿菌負載量；使用TP4治療明顯清除胃組織的幽門螺旋桿菌負載量。因此，TP4治療明顯減少了胃細菌負載量。然後我們繼續使用HE染色切片來進行發炎的組織學檢查（圖14（b）和圖14（c））。在感染小鼠身上觀察到嚴重的發炎；此外，潰爛底和黏膜肌層被嚴重浸潤。由於前發炎性和發炎性細胞激素的誘導，往主要壁細胞區浸潤的發炎細胞對表面上皮造成表面損傷。三重療法並不能減少發炎。然而，使用TP4治療明顯減少幽門螺旋桿菌引起的發炎，並大量減少免疫細胞，從而恢復胃組織的形態。

2.2.12 TP4 在感染幽門螺旋桿菌的小鼠體內對脾 CD4+Foxp3-Treg 、 Th17 子集動力學的宿主免疫調節作用機制

先前報告的是，幽門螺旋桿菌感染誘導調節性T細胞（Treg），從而導致幽門螺旋桿菌的持久性。Foxp3 + Treg和T輔助17（Th17）細胞已涉及對幽門螺旋桿菌的宿主免疫，具體而言是在胃的黏膜表面。幽門螺旋桿菌的持久性可以取決於Th17/Treg的平衡，如幽門螺旋桿菌相互作用的抗原呈遞細胞介導的。幽門螺旋桿菌藉由調節宿主的免疫反應來避開免疫清除，以保持低的Th17/Treg。在本研究中，我們使用流式細胞量測術來證明TP4導致Treg細胞的強烈抑制並適度影響Th17細胞，從而明顯增加脾T細胞子群中的Th17/Treg比（圖15A）。藉由抑制Treg細胞，TP4治療動態地清除幽門螺旋桿菌移生；此外，適度減少的Th17細胞也將導致胃的發炎減少。

2.2.13 胃細胞激素和 T 細胞標記的表現

為了在我們的小鼠模型中分析幽門螺旋桿菌感染的免疫反應，我們進行了胃組織mRNA即時RT-PCR來分析細胞激素和285 T細胞標記的表現水平（圖15B）。我們報告的是，某些細胞激素（腫瘤壞死因子α、IL-6、IL18、IL-10、IL-17、IL-23、及TGF-β）和T細胞標記FOXp3在幽門螺旋桿菌感染期間極度上調。在這些細胞激素中，IL-10、IL-18、及IL-17在頑強的幽門螺旋桿菌移生和胃發炎中扮演主要的角色。另一方面，TP4治療導致這些基因全部下調，IL-23和TGF-β例外。體內降低的IL-10導致Treg細胞明顯減少，並恢復宿主的Th17/Treg平衡。另外，適度減少的IL-17促進發炎的胃組織形態復原（相關證據：圖14）。

2.2.14 TP4 的體內毒性評估

急性口服毒性：

將相當於10倍體內治療劑量的單劑量給C3H/HeN小鼠（n = 6）口服，並觀察動物發病率或死亡率24小時。小鼠沒有表現出任何異常的臨床症狀，而且在重要器官沒有檢測到異常。

亞急性口服毒性：

用3倍的治療劑量給小鼠口服持續14天。從第1至28天觀察動物有無發病或死亡的任何臨床症狀。TP4沒有在小鼠身上引發臨床併發症，而且在第28天安樂死之後沒有觀察到異常（n = 6）。

兔眼刺激測試：

表4提供使用肽TP4的眼睛刺激實驗之總結。表 4 TP4 的兔眼刺激

在測試期間（第1至7天）與正對照組相比時，沒有觀察到明顯的臨床症狀；在第14天犧牲兔子，沒有在重要器官觀察到異常，也沒有在眼睛觀察到病變或菌塊（圖17A）。

在測試期間（第1至7天）與正對照組相比時，沒有觀察到明顯的臨床症狀；在第14天犧牲兔子，沒有在重要器官觀察到異常，也沒有在眼睛觀察到病變或菌塊（圖17A）。

皮膚毒性：

在使C3H/HeN的皮膚接觸到TP4之後，不管是立即或在14天的觀察期期間都沒有觀察到死亡或有害的影響（圖17B）。此外，直到觀察的最後一天，治療過的動物體重都是正常的。在試驗期期間，TP4治療沒有引發病變或刺激，而且沒有觀察到嚴重的行為變化。還發現頭髮生長是正常的，而且屍檢沒有在器官結構或構造上顯現任何嚴重的異常。

總結來說，證明了TP4對幽門螺旋桿菌菌株（MDR臨床分離物和標準菌株）施加有效的抗微生物活性。還首次經由膜微胞化證明了TP4的作用機制。使用TP4治療的小鼠的幽門螺旋桿菌感染明顯比未治療的和傳統抗生素治療的小鼠減少。重要的是，高劑量的TP4並沒有在小鼠或兔子身上造成任何毒性。此外，TP4藉由改變免疫反應基因的表現來選擇性調節幽門螺旋桿菌引發的免疫反應。總而言之，這些結果支持TP4作為新穎類別的抗幽門螺旋桿菌療法的發展潛力。

提供的描述和申請專利範圍應被理解為具有示範的目的，而不是以任何方式限制本發明的範圍。

無

當結合附圖一起閱讀時，將更好地理解前面的概述、以及以下本發明的實施方式。為了說明本發明的目的，在圖式中有圖示出目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明並不限於此具體實施例。

在圖式中：

圖1（a）圖示Epi-1（1/2、1、及2倍MIC）對抗幽門螺旋桿菌（ATCC 43504）的殺菌曲線；其中對照肽和細胞單獨被用來作為對照組；並在接觸後1、3、6、12、及24小時收集樣品及測定菌落數量。每個值都表示平均值±SEM。圖1（b）圖示濁度下降試驗在Epi-1和抗生素對抗抗藥性幽門螺旋桿菌之協同作用上的結果，抗生素包括阿莫西林（AMOX）、甲硝唑（METZ）、及克拉黴素（CLRN）；其中所示的數據是兩個獨立實驗的平均值±SEM。

圖2包括圖2（a），圖2（a）圖示Epi-1對幽門螺旋桿菌細胞膜之滲透性的劑量相依性影響，基於一種螢光探針1-N-苯萘胺（NPN）的攝取來檢視該滲透性；其中使約5×10⁶ 幽門螺旋桿菌（Hp）細胞接觸指定濃度的Epi-1和阿莫西林（AMOX）持續6小時。使用細胞單獨或與NPN一起作為對照組；而且將發射的NPN螢光強度記錄為膜滲透的關聯值。圖2（b）圖示Epi-1對幽門螺旋桿菌（在血瓊脂（BA）上生長：白條；在液體培養物（Liq）中生長：陰影條；在Epi-1存在下生長：+Epi-1）之ζ電位的影響；其中圖示的數據是兩個獨立實驗的平均值±SEM。

圖3圖示幽門螺旋桿菌接觸Epi-1之後的形態變化之穿透式電子顯微照片，其中在戊二醛固定之後使用穿透式電子顯微鏡檢視細胞。在圖3中，影像（A）圖示未治療的幽門螺旋桿菌組；影像（B）圖示使用阿莫西林治療的細胞，其中發現增加的細胞死亡和減少的球菌形細胞；影像（C）圖示Epi-1接觸造成完全膜溶解、從而導致細胞內容物洩漏和隨後的細胞死亡的組；影像（D）圖示顯示膜上泡（大箭頭）的高倍率影像，表示馬鞍形張開的細胞膜彎曲產生；以及影像（E）圖示Epi-1藉由細胞膜起泡、細胞膜溶解、及溶解後外膜鬆弛所引起的幽門螺旋桿菌扭曲，從而誘生過大的週質空間及隨後此區中的滲透壓不平衡；其中電子顯微照片的放大倍率：(A)-(C) x2,550，(D) x15,000，(E) x7,000。比例尺 = 0.2 μm。

圖4提供用於檢驗Epi-1在幽門螺旋桿菌感染的小鼠模型中的功效之方案；其中在第1天和第3天口服施予接種物（1×10⁹ cfu/動物）；在第9天確認細菌移生。從第9天開始，每天給予受感染的小鼠服用250 μg的Epi-1或10倍MIC的抗生素四重療法（PPI（質子泵抑製劑）、阿莫西林、克拉黴素、及甲硝唑）兩週；在第23天犧牲動物，並記錄總活菌數量。

圖5（A）提供用於在胃組織溶解物中鑑定幽門螺旋桿菌的快速脲酶試驗之結果；左邊自頂部圖示未治療的組；Epi-1治療的細胞的組；三重療法治療的細胞的組；其中粉紅色的菌落表示對幽門螺旋桿菌感染為陽性；而右邊圖示培養的選擇介質盤。圖5（B）提供在未治療的、感染幽門螺旋桿菌的小鼠、使用Epi-1治療的感染小鼠、或使用三重療法治療的感染小鼠（每組n = 6）的胃中細菌負載量的量化；其中條表示平均值±SEM。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.001，**P ＜ 0.0001。

圖6圖示未治療/使用PPI三重療法抗生素或Epi-1治療的、感染幽門螺旋桿菌的小鼠的胃組織切片之免疫螢光。綠色螢光表示存在幽門螺旋桿菌（放大倍率200X）。

圖7圖示未治療/使用PPI三重療法抗生素或Epi-1治療的、感染幽門螺旋桿菌的小鼠的組織學染色分析。圖7（a）圖示用於在感染期間和治療之後進行胃炎給分的HE染色，而圖7（b）圖示用於免疫細胞浸潤的吉姆薩染色（比例尺：50 μm）。

圖8（a）圖示Epi-1對幽門螺旋桿菌誘導的宿主免疫反應（指定的蛋白質）的影響；其中脾臟T子群體是使用對抗發炎和抗發炎T細胞的螢光抗體進行定量。Epi-1的治療平衡了由幽門螺旋桿菌感染引起的發炎和抗發炎反應之間的脾臟T細胞子群反應。圖8（b）圖示Epi-1對於在感染幽門螺旋桿菌的小鼠體內調節發炎和抗發炎反應的指定基因之表達的影響；其中胃組織的mRNA是從未治療和治療過的小鼠分離，而且mRNA的表達是藉由即時PCR量測。數值是平均值±SEM。

圖9提供所提出的Epi-1對抗幽門螺旋桿菌的作用機制，包括1）吸引Epi-1到細胞膜上，2）插入/併入細胞膜脂質小葉中而在脂質分子間產生非零曲率張力，3）馬鞍形張開的彎曲導致細胞膜囊狀出芽/起泡，以及4）由於大量非零彎曲張力造成的細胞膜破壞導致不穩定的膜完整性，細胞內容物釋放導致幽門螺旋桿菌死亡。

圖10圖示EPi-1的毒性評估結果，包括a）皮膚毒性：施加Epi-1（每天2.5 mg/動物持續7天；每組n = 12）到Balb/c小鼠的指定區域（虛線橢圓形）；以及b）眼睛刺激試驗：使兔眼每天接觸Epi-1（1 mg/兔）持續7天。使用SDS作為正對照組來評估異常分數；使用PBS作為負對照組（n = 2）。

圖11圖示TP4對敏感和抗藥性幽門螺旋桿菌菌株的影響。圖11（A）圖示劑量和時間相依的滅殺動力學，其中培育約2×10⁵ 個細胞1小時，然後使用指定濃度（1/4、1/2、1、2、及4倍MIC）的TP4培育，並使用對照肽和單獨幽門螺旋桿菌作為對照組；其中監測培養物24小時，並在第1、3、6、12、及24小時取出等份試樣，以測定存活的CFU。圖11（B）圖示培育幽門螺旋桿菌細胞1小時、然後用MIC的TP4、AMOX、METZ、及CLRN培育的結果；其中監測培養物24小時，並在第1、3、6、12、及24小時取出等份試樣，以測定存活的CFU。圖11（C）圖示TP4對體外和體內傳代誘導的幽門螺旋桿菌抗藥性的影響。圖11（D）圖示TP4與AMOX、METZ、及CLRN組合的協同效應。MICs：標準MIC值；MICp：傳代誘導的MIC（所有的數據表示都是平均值±SEM）。

圖12圖示TP4經由微胞化和細胞成分洩漏而對幽門螺旋桿菌細胞膜作用的機制。圖12（A）圖示TP4以劑量相依的方式迅速滲透幽門螺旋桿菌外膜；藉由攝入1-N-苯萘胺螢光強度來檢視膜破裂的關聯。使用單獨幽門螺旋桿菌、或與NPN/對照肽一起作為對照組。圖12（B）圖示存在/不存在TP4之下幽門螺旋桿菌的ζ電位（斜紋條：幽門螺旋桿菌在血瓊脂盤上生長；白條：液體培養物；所示的數據是平均值±SEM）。圖12（C）圖示的電子顯微照片顯示TP4經由微胞化使幽門螺旋桿菌的膜破裂；其中（a）欄圖示在PBS中的幽門螺旋桿菌細胞；正常螺旋和逗號狀的形態；（b）欄圖示1 x MIC阿莫西林；幾個鬼影細胞/死細胞和誘導的球菌形幽門螺旋桿菌；（c）欄：由於膜溶解而含大量「鬼影/死」細胞的接觸TP4細胞外觀；上圖在低（1,100X）放大倍率或下圖在高放大倍率（5,500X）。圖12（D）圖示TP4誘導的幽門螺旋桿菌細胞膜微胞化：（a）7,000×放大倍率的影像顯示幽門螺旋桿菌膜破裂的特徵；（b和c）在15,000×放大倍率顯示短圓箭頭：微胞形成位點，箭頭的頭：微胞化開始的裂口區，短箭頭：缺少膜的區塊，以及長箭頭：在細胞內的電子緻密聚集物，可能是核酸（比例尺：圖12D（a）200 nm；（b、c）100 nm）。

圖13圖示TP4對幽門螺旋桿菌感染小鼠模型的效用。圖13（A）圖示實驗計劃，其中在第1天和第3天使小鼠口服感染約1×10⁹ CFU的幽門螺旋桿菌。在第9天，將小鼠安樂死，並確認感染率；將動物分成三組：（i）單獨幽門螺旋桿菌感染；（ii）感染並使用TP4治療來治療；以及（iii）感染並使用三重療法抗生素治療。給予各組口胃劑量的（ii）TP4（200 μg/動物）和（iii）10X MIC的PPI三重療法複合物持續兩個星期；之後，將小鼠安樂死，並取得胃、脾及血液用於各種細胞和生化分析。圖13（B）圖示用於在胃組織溶解物中鑑定幽門螺旋桿菌的快速脲酶試驗的結果，包括未治療的組（頂圖）、TP4治療的組（中圖）、及PPI三重療法治療的組（底圖）；其中粉紅色的斑點表示幽門螺旋桿菌感染：右邊：培養的選擇介質盤。圖13（C）圖示感染幽門螺旋桿菌、使用TP4或三重療法治療的胃中的細菌負載數（n = 6）。圖13（D）圖示TP4對幽門螺旋桿菌致病因子的影響，其中（a）檢視IV型分泌的CagA和脲酶B之基因和蛋白表現；未治療的（左欄）、或TP4治療的（中間欄）或PPI三重療法（右欄）；（b）胃組織溶解物中的脲酶蛋白之西方墨點法分析（條紋表示中間值。**p ＜ 0.05，*** p ＜ 0.001（n=6））。

圖14圖示用於檢測小鼠體內的幽門螺旋桿菌和發炎的病理組織學評估：（a）幽門螺旋桿菌特異性染色用於檢測胃切片的幽門螺旋桿菌（紅色箭頭指示幽門螺旋桿菌）；（b）藉由HE染色以低放大倍率（200X）檢查小鼠在感染和治療過程中的形態；（c）高放大倍率（400X）：在黏膜肌層的免疫細胞浸潤（黑色箭頭）（比例尺200 μm）。

圖15圖示TP4對感染幽門螺旋桿菌的小鼠的免疫調節作用，包括圖15（A）圖示脾T子群體分離自未治療和治療過的小鼠，並使用對抗前發炎性、發炎性及抗發炎性T細胞的螢光抗體定量；以及圖15（B）圖示藉由即時PCR對胃組織進行的基因表現分析（數據表示平均值±SEM）。

圖16圖示所提出的、TP4對抗幽門螺旋桿菌的作用機制，包括1）膜微胞化，2）移位和DNA解體，3）細胞的重要呼吸離子洩漏引起滲透壓失衡、及隨後的細胞死亡。

圖17圖示TP4在紐西蘭兔和C3H/HeN小鼠體內的毒性安全評估。圖17（A）提供眼睛刺激的結果，包括對照組、及使用50 mg/kg TP4或SDS治療7天的兔子的眼睛外觀；其中每天觀察動物，而且在對照組或TP4治療的兔子身上沒有檢測到眼睛病變；正對照組SDS造成嚴重的流淚、眼瞼腫脹，而且在結膜血管升高（箭頭）。在圖17（A）中，下圖圖示螢光染色影像。圖17（B）圖示皮膚毒性，包括使用TP4治療的小鼠在接觸48小時之後的皮膚外觀；其中在去除殘餘物之後，在使用125 mg/kg TP4或20 % SDS治療的小鼠身上沒有觀察到明顯的病變；將TP4接觸延長7天，而且每天觀察動物直到第14天；在研究結束時沒有在TP4治療的小鼠身上觀察到菌塊或病變（每組n = 12）。

無

序列表 ＜110＞ 中央研究院 ＜120＞ 抗微生物勝肽用於治療胃潰瘍的用途 ＜130＞ ACA0099TW ＜140＞ 105111716 ＜141＞ 2016-04-14 ＜150＞ 62/147,308 ＜151＞ 2015-04-14 ＜160＞ 15 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 20 ＜212＞ PRT ＜213＞ 莫三比克口孵非鯽(Oreochromis mossambicus) ＜400＞ 1 Gln Ser His Leu Ser Leu Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys Arg Ser 1 5 10 15 Asn Lys Gly Cys 20 ＜210＞ 2 ＜211＞ 23 ＜212＞ PRT ＜213＞ 吳郭魚（Tilapia Piscidins） ＜400＞ 2 Phe Ile His His Ile Ile Gly Gly Leu Phe Ser Val Gly Lys His Ile 1 5 10 15 His Ser Leu Ile His Gly His 20 ＜210＞ 3 ＜211＞ 21 ＜212＞ PRT ＜213＞ 點帶石斑魚（Epinephelus coioides） ＜400＞ 3 Gly Phe Ile Phe His Ile Ile Lys Gly Leu Phe His Ala Gly Lys Met 1 5 10 15 Ile His Gly Leu Val 20 ＜210＞ 4 ＜211＞ 33 ＜212＞ PRT ＜213＞ 石紋豹鰨（Pardachirus marmoratus） ＜400＞ 4 Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys 1 5 10 15 Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln 20 25 30 Glu ＜210＞ 5 ＜211＞ 25 ＜212＞ PRT ＜213＞ 嘉臘魚（Chrysophrys major） ＜400＞ 5 Phe Phe Gly Trp Leu Ile Lys Gly Ala Ile His Ala Gly Lys Ala Ile 1 5 10 15 His Gly Leu Ile His Arg Arg Arg His 20 25 ＜210＞ 6 ＜211＞ 25 ＜212＞ PRT ＜213＞ 吳郭魚（Tilapia Piscidins） ＜400＞ 6 Phe Ile His His Ile Ile Gly Gly Leu Phe Ser Ala Gly Lys Ala Ile 1 5 10 15 His Arg Leu Ile Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 ＜210＞ 7 ＜211＞ 18 ＜212＞ PRT ＜213＞ 吳郭魚（Tilapia Piscidins） ＜400＞ 7 Phe Asp Trp Asp Ser Val Leu Lys Gly Val Glu Gly Phe Val Arg Gly 1 5 10 15 Tyr Phe ＜210＞ 8 ＜211＞ 22 ＜212＞ PRT ＜213＞ 吳郭魚（Tilapia Piscidins） ＜400＞ 8 Gly Glu Cys Ile Trp Asp Ala Ile Phe His Gly Ala Lys His Phe Leu 1 5 10 15 His Arg Leu Val Asn Pro 20 ＜210＞ 9 ＜211＞ 26 ＜212＞ PRT ＜213＞ 吳郭魚（Tilapia Piscidins） ＜400＞ 9 Gln Leu Gln Gly Lys Gln Val Ser Gly Glu Val Val Gln Lys Val Leu 1 5 10 15 Gln Glu Leu Ile Gln Ser Val Ala Lys Pro 20 25 ＜210＞ 10 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子UreB F ＜400＞ 10 ggcaccactc cttctgcaat 20 ＜210＞ 11 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子UreB R ＜400＞ 11 cagctgtttg ccaagttctg g 21 ＜210＞ 12 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子CagA F ＜400＞ 12 gatgtgaaat ccccgggctc 20 ＜210＞ 13 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子CagA R ＜400＞ 13 actgcgatcc ggactacgat 20 ＜210＞ 14 ＜211＞ 27 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子16s rRNA F ＜400＞ 14 acgcgtcgac agagtttgat cctggct 27 ＜210＞ 15 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子16s rRNA R ＜400＞ 15 aggcccggga acgtattcac 20

Claims (4)

1. 一種抗微生物胜肽用於製造治療胃潰瘍藥物之用途，其中該抗微生物胜肽係選自由具有序列編號：3之胺基酸序列之石斑魚抗菌胜肽-1(Epinecidin-1,Epi-1)、具有序列編號：2之胺基酸序列之吳郭魚抗菌蛋白3(TP3)、具有序列編號：6之胺基酸序列之吳郭魚抗菌蛋白4(TP4)及上述之組合所組成之群組。
2. 一種抗微生物肽用於製造預防或治療幽門螺旋桿菌(H.pylori)感染藥物之用途，其中該抗微生物肽係選自由具有序列編號：3之胺基酸序列之石斑魚抗菌胜肽(Epi-1)、具有序列編號：2之胺基酸序列之吳郭魚抗菌蛋白3(Tp3)、具有序列編號：6之胺基酸序列之吳郭魚抗菌蛋白4(TP4)及上述之組合所組成之群組。
3. 一種抗微生物肽用於製造預防或治療多重抗藥性幽門螺旋桿菌感染藥物之用途，其中該抗微生物肽係選自由具有序列編號：3之胺基酸序列之石斑魚抗菌胜肽(Epi-1)、具有序列編號：2之胺基酸序列之吳郭魚抗菌蛋白3(TP3)、具有序列編號：6之胺基酸序列之吳郭魚抗菌蛋白4(TP4)及上述之組合所組成之群組。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗微生物肽為具有序列編號：6之胺基酸序列之吳郭魚抗菌蛋白4(TP4)。