CN106039284A - 抗微生物胜肽用于治疗胃溃疡的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗微生物胜肽用于治疗胃溃疡的用途。具体关于一种抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体用于治疗胃溃疡、预防或治疗幽门螺旋杆菌(特别是多重抗药性幽门螺旋杆菌)感染的新用途，其中该抗微生物胜肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽‑1(Epi‑1)、吴郭鱼抗菌胜肽(TPs)、及上述之组合所组成之群组。

Description

抗微生物胜肽用于治疗胃溃疡的用途

相关申请

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年4月14日提交的U.S.临时专利申请No.62/147,308的优先权，通过引用将其内容全部并入本文。

技术领域

本申请关于一种治疗胃溃疡的新方法或组合物。

背景技术

幽门螺旋杆菌(H.pylori)的发现和幽门螺旋杆菌在胃溃疡的作用引发胃肠病学研究的革命(Megraud et al.,Helicobacter pylori resistance to antibiotics inEurope and its relationship to antibiotic consumption.Gut.2013；62:34-42；Arias&Murray,Antibiotic-resistant bugs in the 21st century--a clinical super-challenge.The New England journal of medicine.2009；360:439-43)。幽门螺旋杆菌是人体中最普遍存在的细菌病原体之一，而且已移生于全球人口中多达一半人口的胃中。这种病原体可能会导致各种胃与十二指肠的疾病，包括胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤、及胃癌(Fock et al.,Helicobacter pylori research:historical insights and futuredirections.Nature reviews Gastroenterology&hepatology.2013；10:495-500)。然而，各种开发针对幽门螺旋杆菌的预防性疫苗的尝试都失败了。在诊断出感染的情况下，会使用传统的抗生素疗法治疗幽门螺旋杆菌。然而，这些治疗的成功率会被急剧增加的幽门螺旋杆菌抗微生物抗药性菌株降低(Rimbara E,Fischbach LA,Graham DY.Optimal therapyfor Helicobacter pylori infections.Nature reviews Gastroenterology&hepatology.2011；8:79-88；.Marshall BJ,Warren JR.Unidentified curved bacilli inthe stomach of patients with gastritis and peptic ulceration.Lancet.1984；1:1311-5)。许多传统的抗生素对于根除幽门螺旋杆菌是无效的。1990年代初看到三重疗法开始治疗这种感染。然而，最近出现的、对抗临床最重要的抗生素，甲硝唑(metronidazole)和克拉霉素(clarithromycin)的抗药性已对三重疗法的功效产生重大不利的影响；此外，抗药性菌株的出现率提高会限制这些抗生素在未来疗法的使用，因为抗药性无法藉由增加治疗的剂量或持续时间来克服(Fischbach L,Evans EL.Meta-analysis:the effect ofantibiotic resistance status on the efficacy of triple and quadruple first-line therapies for Helicobacter pylori.Alimentary pharmacology&therapeutics.2007；26:343-57；Megraud F.H pylori antibiotic resistance:prevalence,importance,and advances in testing.Gut.2004；53:1374-84)。

仍然需要开发用于治疗胃溃疡或幽门螺旋杆菌感染的新药物或替代药物疗法。

发明内容

意外地发现到两种抗微生物胜肽，石斑鱼抗菌胜肽-1(Epinecidin-1,Epi-1)和吴郭鱼抗菌胜肽(tilapia piscidins,TPs)(特别是吴郭鱼抗菌蛋白4(TP4))可有效对抗不同的幽门螺旋杆菌菌株，包括多重抗药性幽门螺旋杆菌。

因此，在一方面，本发明提供一种治疗胃溃疡的方法，包含施予有需要的个体治疗有效量的抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体。

在另一方面，本发明提供一种预防或治疗幽门螺旋杆菌感染的方法，包含施予有需要的个体治疗有效量的抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体。

在又一方面，本发明提供一种预防或治疗多重抗药性幽门螺旋杆菌感染的方法，包含施予有需要的个体治疗有效量的抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体。

根据本发明，该抗微生物胜肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽-1(Epi-1)、吴郭鱼抗菌胜肽(TPs)、及上述之组合所组成之群组。具体言之，吴郭鱼抗菌胜肽(TP)为吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)。

在再一方面，本发明提供一种用于预防或治疗幽门螺旋杆菌感染的组合物或医药组合物，包含治疗有效量的抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体，其中该抗微生物胜肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽-1(Epi-1)、吴郭鱼抗菌胜肽(TPs)、及上述之组合所组成之群组。

在另外又一方面，本发明提供一种用于预防或治疗多重抗药性幽门螺旋杆菌感染的组合物或医药组合物，包含治疗有效量的抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体，其中该抗微生物胜肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽-1(Epi-1)、吴郭鱼抗菌胜肽(TPs)、及上述之组合所组成之群组。

在又另一方面，本发明提供一种抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体用于制造治疗胃溃疡药物之用途。

在另外一个进一步方面，本发明提供一种抗微生物肽、该抗微生物肽之功能性衍生物、片段或变体用于制造用于预防或治疗幽门螺旋杆菌感染的药物之用途。

在又另外一个进一步方面，本发明提供一种抗微生物肽、该抗微生物肽之功能性衍生物、片段或变体用于制造用于预防或治疗多重抗药性幽门螺旋杆菌感染的药物之用途。

在本发明的一个具体实施例中，该抗微生物肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽-1(Epi-1)、吴郭鱼抗菌胜肽(TPs)、及上述之组合所组成之群组。

在本发明的一个具体实例中，吴郭鱼抗菌胜肽(TP)为吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)。

一个或更多的本发明实施方式的细节在如下描述中所示。根据如下若干实施方式的详细描述以及所附的权利要求，本发明的其它特征或优势将变得明显。

附图说明

当结合附图一起阅读时，将更好地理解前面的概述、以及以下本发明的实施方式。为了说明本发明的目的，在图式中有图示出目前较佳的具体实施例。然而，应当理解的是，本发明并不限于此具体实施例。

在附图中：

图1(a)图示Epi-1(1/2、1、及2倍MIC)对抗幽门螺旋杆菌(ATCC 43504)的杀菌曲线；其中对照肽和细胞单独被用来作为对照组；并在接触后1、3、6、12、及24小时收集样品及测定菌落数量。每个值都表示平均值±SEM。图1(b)图示浊度下降试验在Epi-1和抗生素对抗抗药性幽门螺旋杆菌之协同作用上的结果，抗生素包括阿莫西林(AMOX)、甲硝唑(METZ)、及克拉霉素(CLRN)；其中所示的数据是两个独立实验的平均值±SEM。

图2包括图2(a)和图2(b)，图2(a)图示Epi-1对幽门螺旋杆菌细胞膜之渗透性的剂量相依性影响，基于一种荧光探针1-N-苯萘胺(NPN)的摄取来检视该渗透性；其中使约5×10⁶幽门螺旋杆菌(Hp)细胞接触指定浓度的Epi-1和阿莫西林(AMOX)持续6小时。使用细胞单独或与NPN一起作为对照组；而且将发射的NPN荧光强度记录为膜渗透的关联值。图2(b)图示Epi-1对幽门螺旋杆菌(在血琼脂(BA)上生长：白条；在液体培养物(Liq)中生长：阴影条；在Epi-1存在下生长：+Epi-1)之ζ电位的影响；其中图标的数据是两个独立实验的平均值±SEM。

图3图示幽门螺旋杆菌接触Epi-1之后的形态变化之穿透式电子显微照片，其中在戊二醛固定之后使用穿透式电子显微镜检视细胞。在图3中，影像(A)图标未治疗的幽门螺旋杆菌组；影像(B)图标使用阿莫西林治疗的细胞，其中发现增加的细胞死亡和减少的球菌形细胞；影像(C)图标Epi-1接触造成完全膜溶解、从而导致细胞内容物泄漏和随后的细胞死亡的组；影像(D)图标显示膜上泡(大箭头)的高倍率影像，表示马鞍形张开的细胞膜弯曲产生；以及影像(E)图标Epi-1藉由细胞膜起泡、细胞膜溶解、及溶解后外膜松弛所引起的幽门螺旋杆菌扭曲，从而诱生过大的周质空间及随后此区中的渗透压不平衡；其中电子显微照片的放大倍率：(A)-(C)x2,550，(D)x15,000，(E)x7,000。比例尺＝0.2μm。

图4提供用于检验Epi-1在幽门螺旋杆菌感染的小鼠模型中的功效之方案；其中在第1天和第3天口服施予接种物(1×10⁹cfu/动物)；在第9天确认细菌移生。从第9天开始，每天给予受感染的小鼠服用250μg的Epi-1或10倍MIC的抗生素四重疗法(PPI(质子泵抑制剂)、阿莫西林、克拉霉素、及甲硝唑)两周；在第23天牺牲动物，并记录总活菌数量。

图5(A)提供用于在胃组织溶解物中鉴定幽门螺旋杆菌的快速脲酶试验之结果；左边自顶部图示未治疗的组；Epi-1治疗的细胞的组；三重疗法治疗的细胞的组；其中粉红色的菌落表示对幽门螺旋杆菌感染为阳性；而右边图示培养的选择介质盘。图5(B)提供在未治疗的、感染幽门螺旋杆菌的小鼠、使用Epi-1治疗的感染小鼠、或使用三重疗法治疗的感染小鼠(每组n＝6)的胃中细菌负载量的量化；其中条表示平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.001，**P<0.0001。

图6图示未治疗/使用PPI三重疗法抗生素或Epi-1治疗的、感染幽门螺旋杆菌的小鼠的胃组织切片之免疫荧光。绿色荧光表示存在幽门螺旋杆菌(放大倍率200X)。

图7图示未治疗/使用PPI三重疗法抗生素或Epi-1治疗的、感染幽门螺旋杆菌的小鼠的组织学染色分析。图7(a)图示用于在感染期间和治疗之后进行胃炎给分的HE染色，而图7(b)图示用于免疫细胞浸润的吉姆萨染色(比例尺：50μm)。

图8(a)图示Epi-1对幽门螺旋杆菌诱导的宿主免疫反应(指定的蛋白质)的影响；其中脾脏T子群体是使用对抗发炎和抗发炎T细胞的荧光抗体进行定量。Epi-1的治疗平衡了由幽门螺旋杆菌感染引起的发炎和抗发炎反应之间的脾脏T细胞子群反应。图8(b)图示Epi-1对于在感染幽门螺旋杆菌的小鼠体内调节发炎和抗发炎反应的指定基因之表达的影响；其中胃组织的mRNA是从未治疗和治疗过的小鼠分离，而且mRNA的表达是藉由实时PCR量测。数值是平均值±SEM。

图9提供所提出的Epi-1对抗幽门螺旋杆菌的作用机制，包括1)吸引Epi-1到细胞膜上，2)插入/并入细胞膜脂质小叶中而在脂质分子间产生非零曲率张力，3)马鞍形张开的弯曲导致细胞膜囊状出芽/起泡，以及4)由于大量非零弯曲张力造成的细胞膜破坏导致不稳定的膜完整性，细胞内容物释放导致幽门螺旋杆菌死亡。

图10图示Epi-1的毒性评估结果，包括a)皮肤毒性：施加Epi-1(每天2.5mg/动物持续7天；每组n＝12)到Balb/c小鼠的指定区域(虚线椭圆形)；以及b)眼睛刺激试验：使兔眼每天接触Epi-1(1mg/兔)持续7天。使用SDS作为正对照组来评估异常分数；使用PBS作为负对照组(n＝2)。

图11图示TP4对敏感和抗药性幽门螺旋杆菌菌株的影响。图11(A)图示剂量和时间相依的灭杀动力学，其中培育约2×10⁵个细胞1小时，然后使用指定浓度(1/4、1/2、1、2、及4倍MIC)的TP4培育，并使用对照肽和单独幽门螺旋杆菌作为对照组；其中监测培养物24小时，并在第1、3、6、12、及24小时取出等份试样，以测定存活的CFU。图11(B)图示培育幽门螺旋杆菌细胞1小时、然后用MIC的TP4、AMOX、METZ、及CLRN培育的结果；其中监测培养物24小时，并在第1、3、6、12、及24小时取出等份试样，以测定存活的CFU。图11(C)图示TP4对体外和体内传代诱导的幽门螺旋杆菌抗药性的影响。图11(D)图示TP4与AMOX、METZ、及CLRN组合的协同效应。MICs：标准MIC值；MICp：传代诱导的MIC(所有的数据表示都是平均值±SEM)。

图12图示TP4经由微胞化和细胞成分泄漏而对幽门螺旋杆菌细胞膜作用的机制。图12(A)图示TP4以剂量相依的方式迅速渗透幽门螺旋杆菌外膜；藉由摄入1-N-苯萘胺荧光强度来检视膜破裂的关联。使用单独幽门螺旋杆菌、或与NPN/对照肽一起作为对照组。图12(B)图示存在/不存在TP4之下幽门螺旋杆菌的ζ电位(斜纹条：幽门螺旋杆菌在血琼脂盘上生长；白条：液体培养物；所示的数据是平均值±SEM)。图12(C)图标的电子显微照片显示TP4经由微胞化使幽门螺旋杆菌的膜破裂；其中(a)栏图示在PBS中的幽门螺旋杆菌细胞；正常螺旋和逗号状的形态；(b)栏图示1x MIC阿莫西林；几个鬼影细胞/死细胞和诱导的球菌形幽门螺旋杆菌；(c)栏：由于膜溶解而含大量「鬼影/死」细胞的接触TP4细胞外观；上图在低(1,100X)放大倍率或下图在高放大倍率(5,500X)。图12(D)图示TP4诱导的幽门螺旋杆菌细胞膜微胞化：(a)7,000×放大倍率的影像显示幽门螺旋杆菌膜破裂的特征；(b和c)在15,000×放大倍率显示短圆箭头：微胞形成位点，箭头的头：微胞化开始的裂口区，短箭头：缺少膜的区块，以及长箭头：在细胞内的电子致密聚集物，可能是核酸(比例尺：图12D(a)200nm；(b、c)100nm)。

图13图示TP4对幽门螺旋杆菌感染小鼠模型的效用。图13(A)图示实验计划，其中在第1天和第3天使小鼠口服感染约1×10⁹CFU的幽门螺旋杆菌。在第9天，将小鼠安乐死，并确认感染率；将动物分成三组：(i)单独幽门螺旋杆菌感染；(ii)感染并使用TP4治疗来治疗；以及(iii)感染并使用三重疗法抗生素治疗。给予各组口胃剂量的(ii)TP4(200μg/动物)和(iii)10X MIC的PPI三重疗法复合物持续两个星期；之后，将小鼠安乐死，并取得胃、脾及血液用于各种细胞和生化分析。图13(B)图标用于在胃组织溶解物中鉴定幽门螺旋杆菌的快速脲酶试验的结果，包括未治疗的组(顶图)、TP4治疗的组(中图)、及PPI三重疗法治疗的组(底图)；其中粉红色的斑点表示幽门螺旋杆菌感染：右边：培养的选择介质盘。图13(C)图示感染幽门螺旋杆菌、使用TP4或三重疗法治疗的胃中的细菌负载数(n＝6)。图13(D)图示TP4对幽门螺旋杆菌致病因子的影响，其中(a)检视IV型分泌的CagA和脲酶B之基因和蛋白表现；未治疗的(左栏)、或TP4治疗的(中间栏)或PPI三重疗法(右栏)；(b)胃组织溶解物中的脲酶蛋白之西方墨点法分析(条纹表示中间值。**p<0.05，***p<0.001(n＝6))。

图14图示用于检测小鼠体内的幽门螺旋杆菌和发炎的病理组织学评估：(a)幽门螺旋杆菌特异性染色用于检测胃切片的幽门螺旋杆菌(红色箭头指示幽门螺旋杆菌)；(b)藉由HE染色以低放大倍率(200X)检查小鼠在感染和治疗过程中的形态；(c)高放大倍率(400X)：在黏膜肌层的免疫细胞浸润(黑色箭头)(比例尺200μm)。

图15图示TP4对感染幽门螺旋杆菌的小鼠的免疫调节作用，包括图15(A)图示脾T子群体分离自未治疗和治疗过的小鼠，并使用对抗前发炎性、发炎性及抗发炎性T细胞的荧光抗体定量；以及图15(B)图示藉由实时PCR对胃组织进行的基因表现分析(数据表示平均值±SEM)。

图16图示所提出的、TP4对抗幽门螺旋杆菌的作用机制，包括1)膜微胞化，2)移位和DNA解体，3)细胞的重要呼吸离子泄漏引起渗透压失衡、及随后的细胞死亡。

图17图示TP4在新西兰兔和C3H/HeN小鼠体内的毒性安全评估。图17(A)提供眼睛刺激的结果，包括对照组、及使用50mg/kg TP4或SDS治疗7天的兔子的眼睛外观；其中每天观察动物，而且在对照组或TP4治疗的兔子身上没有检测到眼睛病变；正对照组SDS造成严重的流泪、眼睑肿胀，而且在结膜血管升高(箭头)。在图17(A)中，下图图标荧光染色影像。图17(B)图示皮肤毒性，包括使用TP4治疗的小鼠在接触48小时之后的皮肤外观；其中在去除残余物之后，在使用125mg/kg TP4或20％SDS治疗的小鼠身上没有观察到明显的病变；将TP4接触延长7天，而且每天观察动物直到第14天；在研究结束时没有在TP4治疗的小鼠身上观察到菌块或病变(每组n＝12)。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语皆具有与本发明所属技术领域中具有通常知识之人士一般理解的相同的含义。

除非内文以其他方式清楚指明，否则本文中使用的单数形「一」及「该」包括复数的指示对象。因此，举例来说，提及「一样品」包括复数个这样的样品及所属技术领域中具有通常知识者习知的该样品之均等物。

本文中使用的「胃溃疡(gastric ulcer)」乙词是指一种消化性溃疡疾病(PUD)，也被称为十二指肠溃疡、消化性溃疡、胃溃疡(stomach ulcer)。胃溃疡是胃或十二指肠(小肠的第一部分)黏膜的溃疡，并伴随最常见的症状-烧灼胃痛。在大多数情况下，胃溃疡是由幽门螺旋杆菌(H.pylori)感染所引起的。

本文中使用的「其功能性衍生物、片段或变体」乙词是指保持相同或相似活性、并且表现出相同或相似性质的肽之衍生物、片段或变体。

本文中使用的「治疗有效量」乙词是指与未接收该量的相应个体相比导致疾病、失调、或副作用之治疗或痊愈效果、或疾病或失调之进展速度减缓的药物或药剂量。该词还包括在其范围内可有效增强正常生理功能的量。

本文中使用的「医药上可接受的载体」乙词是指在与制剂的其他成分兼容、而且对被施予医药组合物的个体无害的层面上医药上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂。可以在本发明中使用技术领域中普遍知道或使用的任何载体、稀释剂或赋形剂，取决于对医药制剂的要求。

抗微生物胜肽(AMPs)

阳离子基因编码的宿主防御胜肽(HDP)是自然界最多样化且类型丰富的抗生素。大多数的高等生物体利用这些胜肽作为自身的先天免疫系统的一部分。HDP被称为抗微生物胜肽(AMP)的子类可发挥直接的抗微生物活性。抗微生物胜肽(AMPs)是广泛的无脊椎动物、植物、及动物的宿主防御系统的一部分(Lee et al.,A helix-PXXP-helix peptidewith antibacterial activity without cytotoxicity against MDRPA-infectedmice.Biomaterials.2014；35:1025-1039；Wimley&Hristova,Antimicrobial peptides:successes,challenges and unanswered questions.The Journal of membranebiology.2011；239:27-34)。抗微生物肽通常对范围广泛的细菌、病毒、真菌及原生动物表现出有效的抗微生物活性。抗微生物肽的主要特征在于他们是短的、双性的、及阳离子型的，抗微生物肽拥有快速的灭杀能力，而且他们以细胞的膜和内部成分为目标(Brogden,Antimicrobial peptides:pore formers or metabolic inhibitors in bacteria,Nature reviews Microbiology.2005；3:238-250；Yount&Yeaman,Immunocontinuum:perspectives in antimicrobial peptide mechanisms of action andresistance.Protein and peptide letters.2005；12:49-67；Yeaman&Yount,Mechanismsof antimicrobial peptide action and resistance.Pharmacological reviews.2003；55:27-55；Hancock&Scott,The role of antimicrobial peptides in animaldefenses.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America.2000；97:8856-8861)。

石斑鱼抗菌胜肽-1(Epi-1)

本发明人分离出编码来自石斑鱼(点带石斑鱼，Epinephelus coioides)之cDNA和基因体DNA库的AMP石斑鱼抗菌胜肽-1(epinecidin-1,Epi-1)的基因。在结构上，Epi-1类似于比目鱼抗菌胜肽(pleurocidin)，一种冬季比目鱼(美洲鲽，Pleuronectes americanus)的蛋白质(Pan et al.,Gene expression and localization of the epinecidin-1antimicrobial peptide in the grouper(Epinephelus coioides),and its role inprotecting fish against pathogenic infection.DNA and cell biology.2007；26:403-413.16；Lin et al.,Epinecidin-1,an antimicrobial peptide from fish(Epinephelus coioides)which has an antitumor effect like lytic peptides inhuman fibrosarcoma cells.Peptides.2009；30:283-290)。随后有报导Epi-1藉由诱导细菌细胞膜直接溶解、并通过宿主的免疫调节导致细菌清除来作用(Lee et al.,Theantimicrobial peptide,epinecidin-1,mediates secretion of cytokines in theimmune response to bacterial infection in mice.Peptides.2012；36:100-108；Huanget al.,Use of the antimicrobial peptide Epinecidin-1to protect against MRSAinfection in mice with skin injuries.Biomaterials.2013；34:10319-10327；Pan etal.,Insights into the antibacterial and immunomodulatory functions of theantimicrobial peptide,epinecidin-1,against Vibrio vulnificus infection inzebrafish.Fish&shellfish immunology.2011；31:1019-1025)。Epi-1还显示出对抗革兰氏阳性细菌菌株的抗菌活性、以及抗真菌和抗病毒活性(Pan et al.,In vitroactivities of three synthetic peptides derived from epinecidin-1and an anti-lipopolysaccharide factor against Propionibacterium acnes,Candida albicans,and Trichomonas vaginalis.Peptides.2009；30:1058-1068；Wang et al.,Inactivationof nervous necrosis virus infecting grouper(Epinephelus coioides)byepinecidin-1and hepcidin 1-5antimicrobial peptides,and downregulation ofMx2and Mx3gene expressions.Fish&shellfish immunology.2010；28:113-120；Pan etal.,Evaluation of the epinecidin-1peptide as an active ingredient in cleaningsolutions against pathogens.Peptides.2010；31:1449-1458)。

吴郭鱼抗菌胜肽(Tilapia Piscidins)

抗菌胜肽(Piscidins)AMPs是由多达21～44个、具有双性螺旋结构的残基组成(Maisetta et al.,In Vitro Bactericidal Activity of Humanβ-Defensin 3againstMultidrug-Resistant Nosocomial Strains.Antimicrobial Agents andChemotherapy2006；50:806-809；Winkler et al.,Unexpected Challenges in Treating432Multidrug-resistant Gram-negative Rods:Resistance to Ceftazidime-Avibactamin Archived Isolates of Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother2014)。从尼罗河吴郭鱼(尼罗口孵非鲫，Oreochromis niloticus)分离出五种名为吴郭鱼抗菌胜肽1～5(TP1～5)的不同抗菌胜肽，并由发明人决定这五种抗菌胜肽的编码序列。TP1、TP2、TP3、TP4及TP5的完整抗菌胜肽编码序列分别由207、234、231、270及195个碱基组成，每个碱基载有68、77、76、89、及64个胺基酸的转译区。测定五种抗菌胜肽TP1、TP2、TP3、TP4及TP5的抗微生物和抗真菌活性显示，这些胜肽是具有广谱活性的有效和有前景的抗微生物剂。(Peng et al.,Five Different Piscidins from Nile Tilapia,Oreochromisniloticus:Analysis of Their Expressions and Biological Functions.PLoS ONE2012；7(11):e50263)。合成的抗菌胜肽2据报告在体外对白色念珠菌、粃糠状鳞斑霉、及白吉利丝孢酵母菌具有杀真菌活性(Khara et al.,Anti-mycobacterial activities ofsynthetic cationic alpha435helical peptides and their synergism withrifampicin.Biomaterials 2014；35:2032-8)。

依据本发明发现，Epi-1可有效对抗不同的幽门螺旋杆菌菌株；此外，抗菌活性经由马鞍形张开的细胞膜弯曲产生而通过膜渗透出现。体内功效的研究显示，在感染期间通过抑制Treg细胞和其他细胞激素来消除幽门螺旋杆菌移生的明显性提高了。因此，使用Epi-1作为消灭多重抗药性幽门螺旋杆菌的单治疗剂是有效的。

本发明还发现，吴郭鱼抗菌胜肽在体外对幽门螺旋杆菌表现出抗菌活性。具体来说，被证明的是TP4具有最有效的活性，并且对菌株谱是有活性的，同时在低pH值下非常稳定。还被证实的是，TP4具有多种作用模式，包括直接破坏膜和免疫调节宿主的免疫系统。得出的结论是(i)TP4经由膜微胞化破坏膜来施展其对抗幽门螺旋杆菌的抗微生物作用；(ii)临床分离物对TP4的易损性与预先存在的对抗生素的抗药性并无关联；(iii)TP4与传统抗生素具协同作用；(iv)TP4藉由选择性调节对抗胃组织持续移生的宿主适应性免疫反应来清除幽门螺旋杆菌感染；总而言之，TP4也可作为对抗多重抗药性幽门螺旋杆菌的治疗剂。

因此，本发明提供一种治疗胃溃疡的方法，包含施予有需要的个体治疗有效量的抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体。

另一方面，本发明提供一种预防或治疗幽门螺旋杆菌(具体而言是多重抗药性幽门螺旋杆菌)感染的方法，包含施予有需要的个体治疗有效量的抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体。

在本发明中，该抗微生物胜肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽-1(Epi-1)、吴郭鱼抗菌胜肽(TPs)、及上述之组合所组成之群组。在一个具体的实例中，吴郭鱼抗菌胜肽(TP)为吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)。

在又一方面，本发明提供一种用于预防或治疗幽门螺旋杆菌(具体而言是多重抗药性幽门螺旋杆菌)感染的组合物或医药组合物，包含治疗有效量的抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体，其中该抗微生物胜肽系选自由Epi-1、TPs、及上述之组合所组成之群组。

另一方面，本发明提供一种抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体用于制造用于治疗胃溃疡、或预防或治疗幽门螺旋杆菌(具体而言是多重抗药性幽门螺旋杆菌)感染的药物之用途。

在本发明中，该组合物或医药组合物可以使用任何标准技术或所属技术领域中具有通常知识者习知的常用方法配制。

对于治疗的用途，治疗有效量的肽、或该肽之功能性变体可被配制成用于施予的医药组合物。因此，本发明进一步提供一种包含治疗有效量的胜肽或该胜肽之功能性衍生物、片段或变体、连同一种或更多种医药上可接受载体的医药组合物。

依据本发明，该医药组合物可适用于藉由任何适当的途径施予，该途径包括但不限于局部的、直肠的、经鼻的、阴道的、口服的或肠胃外的途径。在本发明的一个具体实例中，该医药组合物被配制用于肿瘤内施予。这样的制剂可以藉由配药学技术领域中习知的任意方法制备。本发明的一个实例是处于注射剂形式的医药组合物。

现在将参照以下实施例更特定地描述本发明，提供该等实施例是为了示范而不是限制的目的。

实施例

实施例1Epi-1的研究

1.1材料与方法

1.1.1细菌菌株、生长条件、及抗微生物肽的合成

从美国菌种保存中心(ATCC 43504、700392、及51653)取得幽门螺旋杆菌菌株，而MDR临床分离物是由吴彰哲博士(国立台湾海洋大学食品科学系)提供。菌株在菌落外观、革兰氏染色、及快速脲酶测试中呈阳性反应的基础上进行鉴定。幽门螺旋杆菌菌株在有补给10％羊血(纽约Invitrogen)的脑心脏输注液(BHI)琼脂(密执安州底特律Difco实验室)上恢复并培养。将多孔盘在微好气性氛围(日本三菱Anaeropack-Anaero)中在37℃下培养24小时。TH2-3(QSHLSLCRWCCNCCR-SNKGC，序列编号：1)、TP3(FIHHIIGG-LFSVGKHIHSLIHGH，序列编号：2)、Epi-1(GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLV，序列编号：3)、GE-33(GFFALIPKIISSPL-FKTLLSAVGSALSSSGGQE，序列编号：4)、及Chrysophsin(FFGWLIKGAIH-AGKAIHGLI HRRRH，序列编号：5)是(i)藉由固相肽合成法合成，(ii)藉由反相高效液相层析纯化到>95％的等级，以及(iii)由GL生物化学(中国上海)冻干。冻干合成的肽在PBS中重组，以在每次实验之前产生工作原料。

1.1.2体外幽门螺旋杆菌生长抑制试验

藉由检验MIC来评估抗菌活性；使用在灭菌96-孔盘中最终体积200μL的微稀释试样测定如下。制备0.1OD的细菌接种物并在BHI培养液中稀释1000倍，并将180μL的等分试样加到各孔中。在实验之前制备抗微生物肽(Epi-1、TH2-3、SALF、GE-33、或Chrysophsin-1)的工作标准液(0.9-50μg/mL)；将20μL的AMP溶液加到各孔中。使用PBS作为对照组。将多孔盘在微好气性氛围中在37℃下培养整夜。藉由光密度量测在600nm测定在标准条件下的生长。将MIC视为导致24小时的培育之后光密度没有增加的最低肽浓度。

1.1.3时间-灭杀动力学

将整夜的细菌培养物稀释到0.1OD，并在微需氧条件下、在37℃无振荡下、在Epi-1(0.5、1、或2倍MIC)存在或不存在下培育培养接种物长达24小时。在接触后1、3、6、12、及24小时吸出等分试样，并测定活菌(CFU)的数目。

1.1.4Epi-1和抗生素的剂量依赖性功效

使用浊度下降试验比较Epi-1与AMX、MTZ及CLR对抗幽门螺旋杆菌的抗菌活性。简言之，使幽门螺旋杆菌(0.5OD)接触各种浓度(0.19-25μg)的Epi-1或抗生素(0.02-2μg)。将治疗组在37℃的微需氧条件下培养整夜，然后记录光密度(OD 600)并绘图。

1.1.5使用1-N-苯萘胺(NPN)-摄取试验检验幽门螺旋杆菌细胞膜的完整性

简言之，在37℃的微需氧条件下使用不同浓度的Epi-1培养幽门螺旋杆菌培养接种物(0.5OD)6小时。然后将培养物制粒，并将22μg/mL的NPN试剂加到颗粒中直到最终体积为250μL。最后，记录荧光。荧光增加被视为与幽门螺旋杆菌细胞膜电位和渗透相关。所有试验都在室温下进行。

1.1.6ζ电位量测

在血琼脂或培养液中培养幽门螺旋杆菌到3×10⁷cfu/mL，以获得足够高的计数率。在37℃、Epi-1存在或不存在下进行量测，并测定15个量测(每个运作120次)的平均。在动态与静态光散射仪(Zetasizer Nano ZS，英国马尔文马尔文仪器(MalvernInstruments))中使用具有金电极的可丢弃ζ电池藉由相分析光散射(PALS)获得ζ电位值。

1.1.7穿透电子显微术研究

使用穿透电子显微术来检验Epi-1诱导的幽门螺旋杆菌形态变化。如前所述固定和处理样品。所有的样品都使用在80kV的加速电压下操作的FEI Tecnai G2F20S-TWIN穿透式电子显微镜(俄勒冈州希尔斯伯勒FEI公司)检验。使用电荷耦合组件照相机以不同放大倍率记录影像。

1.1.8在感染幽门螺旋杆菌的小鼠模型中测定Epi-1的体内功效

将六周龄的C3H/HeN雄性小鼠用于此研究；小鼠从台湾乐斯科生物科技股份有限公司取得，并安置在台湾基隆国立台湾海洋大学的动物设施实验室。随意提供动物食物和水。所有参照号码96025的动物方案都得到国立台湾海洋大学科学学院的实验动物照护及使用委员会(IACUC)批准。将六周龄的成年小鼠随机分成三组，每组6只小鼠。从血琼脂获得整夜的幽门螺旋杆菌培养物。小鼠经由灌胃挑战幽门螺旋杆菌(～1x10⁹个细胞)；小鼠在24小时的时间间隔之后接收第二剂相同数量的细胞。在第9天移生之后起，使用Epi-1(250μg/动物)/PPI-三重疗法抗生素(质子泵抑制剂、阿莫西林、克拉霉素、及甲硝唑)的10倍MIC治疗动物14天；对照组接收等体积的PBS。治疗之后将小鼠安乐死，并取出胃和脾的组织；藉由流式细胞量测术处理脾脏用于T细胞子群体分析。将得到的胃切成两半，一半用于组织学，另一半用于细菌计数和其他分析。将悬浮液连续稀释并涂布在双份的幽门螺旋杆菌选择性EYE琼脂盘上，然后培育24小时。计数总菌落形成单元(CFU)并表示为CFU/g胃。

1.1.9胃组织切片的组织学分析

将胃组织切片固定在缓冲石蜡中并包埋在石蜡中。用苏木紫和曙红将约5μm的切片染色以分析组织发炎。对于针对幽门螺旋杆菌的免疫荧光染色则使用二甲苯和乙醇将组织载玻片脱蜡，然后在水中再水合。藉由在高压锅中在酸碱值为6.0的10mM柠檬酸钠缓冲液中培育切片10分钟来进行抗原修复。在PBS中洗涤之后，先用兔多株幽门螺旋杆菌抗体(1：200)(台湾GeneTex)、然后用FITC标记的山羊抗兔次级抗体(1：500)培育组织切片。然后使用DAPI将标记的切片计数染色。在光学显微镜下以不同的放大倍率观察切片。如前所述评估组织。对于吉姆萨染色，将载玻片染色2-5分钟并用PBS洗涤以去除过量的染色剂。将载玻片固定，然后在光学显微镜下观察。如前所述评估组织。

1.1.10藉由流式细胞量测仪分析脾脏T细胞子群体

从安乐死的小鼠取得小鼠脾脏并放在RPMI介质中。在室温下将脾脏切碎，并通过100μ大小的筛网，之后以1500rpm离心5分钟。将所得颗粒再悬浮于3mL的RBC溶菌缓冲液中，并在室温(RT)下培育5分钟且定期放液；使用RPMI介质稀释缓冲液来停止反应。将混合物离心，并使用1-2％FBS将颗粒再悬浮于1mL RPMI介质中。将所得的单细胞悬浮液等分至流式细胞量测管(100μL/管)中。将1微升标记荧光的单克隆抗体(CD4、Th17、Treg细胞)加到每个管中，并用PBS让体积达到500μL。将管用箔覆盖，并在室温下在黑暗中培育1小时。最后，使用BD FACSCanto流式细胞量测仪分析样品，并记录每个细胞子群的百分比。

1.1.11基因表现分析

使用高纯度RNA组织套组依据制造商(美国罗氏)的建议从小鼠的胃组织分离出总RNA。对于细胞激素mRNA的定量，使用高容量cDNA库套组(Invitrogen)将5μg的总RNA转化成cDNA。使用用于A CFX Connect^TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)的TaqMan基因表现试验藉由Q-PCR量测介白素IL-6、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、及Foxp3mRNA的水平。将转录水平标准化为内源性对照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA，并使用比较CT法(Bio-Rad)表示为与来自对照小鼠的样品相比之倍数变化。

1.1.12毒性评估

口服毒性：

藉由单次口服施予125mg/kg体重的Epi-1在小鼠体内评估急性口服毒性，每组6只动物。观察动物约48小时。记录死亡率、发病率及临床症状。

亚急性口服毒性：

以超过14天的试验期评估亚急性口服毒性，其中给予小鼠600μg/小鼠/天。在研究期间，每天观察动物的临床症状和死亡。在测试期结束后，让动物恢复，并观察其他临床异常的发展持续14天。

皮肤毒性：

通过每天施予Epi-1剂量(2.5mg/动物)持续7天在Balb/c小鼠体内评估皮肤毒性。持续观察动物至少48小时。记录皮肤异常。

兔眼刺激测试：

本研究采用健康青壮年的新西兰白化病白兔品种。每只动物的一个眼睛作为负对照，而另一个眼睛用Epi-1(1mg/kg)治疗7天；正对照兔用0.1％SDS治疗。在第1、3、5、及7天检查眼睛，然后使其恢复直到第14天；此时，记录临床观察分数，并指定在每个检查过程中观察到的视觉反应等级。

1.2结果

1.2.1Epinecidin-1对抗幽门螺旋杆菌的抗菌效果

初步筛选五种不同的阳离子肽对抗幽门螺旋杆菌菌株G27的活性。表1列出这些肽的名称和序列。

表1.对抗抗生素敏感和抗药性的临床分离幽门螺旋杆菌菌株的不同抗微生物肽序列之抗微生物活性。

初步筛选浓度范围从0.4至100μg的每种肽。检查的5种肽其中的一种Epi-1对敏感和多重抗药性的幽门螺旋杆菌菌株(ATCC 43504、51653、700392、及抗生素抗药性临床分离物CI-HC-028)表现出强烈的生长抑制及/或杀菌效果。由于胃内容物的清除相对快速、从而最终缩短幽门螺旋杆菌接触口服摄取的抗微生物剂的时间，故在考虑幽门螺旋杆菌感染的可能疗法时，抗微生物剂施展抗菌活性的速率是特别重要的。图1(a)显示Epi-1对抗幽门螺旋杆菌的剂量和时间相依效力；2X和1X MIC的Epi-1分别在1和12小时的接触后减少了90％的幽门螺旋杆菌。在0.5X MIC，菌数一开始有减少，但在6小时的接触后呈指数增加。这些数据表明，Epi-1对抗幽门螺旋杆菌的抗生素敏感和抗药性菌株的杀菌效果是剂量和时间相依的，且最小杀菌浓度(MBC)为12.5-25μg。

1.2.2浊度下降试验：Epi-1和抗生素对抗抗药性临床分离物之活性比较

任何新的药物都应表现出比目前治疗中使用的抗生素更强的或至少同等的效力。我们研究Epi-1与用于幽门螺旋杆菌疗法的抗生素阿莫西林(AMOX)、梅斯(甲硝唑)、及CLRN(克拉霉素)组合的剂量相依抗菌活性(图1(b))。Epi-1与AMOX、METZ及CLRN表现出协同作用，明显降低了MIC。Epi-1单独或与抗生素组合都优于单独的抗生素。

1.2.3Epi-1诱导幽门螺旋杆菌细胞膜的通透性

由于致病细菌体内抗药性机制的发展，抗生素只在高浓度时抑制细胞壁合成。抗微生物肽通过众多机制作用，但主要是藉由破坏目标细菌的细胞膜。藉由量测NPN荧光的摄取来检查细胞膜的破坏。幽门螺旋杆菌接触低于MIC浓度的Epi-1持续2小时导致荧光快速增加；阿莫西林导致较少的剂量相依性增加(图2(A))。荧光强度在较高浓度的Epi-1饱和，且与Epi-1的剂量相依动力学相关联。整体来说，这些数据证明Epi-1使细胞膜破裂。

1.2.4幽门螺旋杆菌上的ζ电位量测结果

为了确认Epi-1可以与幽门螺旋杆菌细胞膜相互作用、结合、及破坏幽门螺旋杆菌细胞膜，量测ζ电位来检查表面电荷。如图2(B)所示，在血琼脂上或在培养液中培养的幽门螺旋杆菌呈现带有负电荷(分别为-33.87±0.75mV和-27.5±0.75mV)。藉由添加Epi-1到任一个培养物中，ζ电位变成较少负的(分别为+3.52和-14.03±0.75mV)。这些数据暗指的是，Epi-1可以与幽门螺旋杆菌的负表面相互作用，从而引起剧烈的细胞膜渗透；此外，这些数据与NPN摄取的研究结果是一致的。整体来说，结果显示Epi-1与幽门螺旋杆菌表面的电位有密切关系，此举可能会导致细胞膜破裂串联。

1.2.5穿透式电子显微术显示Epi-1诱导马鞍形张开的细胞膜弯曲产生

未治疗的细胞表现出正常的形态(图3A)，并具有鲜明的、完整的内外细胞膜、及薄而均匀的周质空间。阿莫西林治疗的幽门螺旋杆菌细胞表现出低比例的球菌形态(图3B)；这些扩大的细胞具有原生质细胞膜与外细胞膜明确分离的特征。此外，一些细胞表现出细胞质内容物完全丧失；这些溶解的细胞具有与前面针对幽门螺旋杆菌鬼影细胞所描述的类似的细胞膜。与对照细胞相比，接触Epi-1的幽门螺旋杆菌样品(图3C)显示明显改变的形态表型。Epi-1治疗的细胞中大多数的细胞显现为鬼影细胞。Epi-1治疗在幽门螺旋杆菌细胞膜中选择性引发马鞍形张开的细胞膜弯曲(非零曲率)；这种曲率的引发对于几个过程是必要的条件，包括孔形成、起泡、出芽及囊状化(vesicularization)(图3D-图3E)，上述过程涉及破坏细胞膜的稳定。图3D显示细胞膜接触Epi-1后的囊状出芽和发泡。过度的出芽和发泡导致细胞膜溶解和细胞组分通过引导孔(图3E的箭头)释放。细胞溶解和外细胞膜松弛在显微照片中是明显的。

1.2.6Epi-1在小鼠模型中对抗幽门螺旋杆菌感染的体内功效

基于我们强有力的体外数据，我们接下来寻求评估Epi-1在感染模型中对抗幽门螺旋杆菌的体内治疗功效(图4显示的方案)。我们在第1天使C3H/HeN小鼠感染幽门螺旋杆菌接种物(1X 10⁹CFU)，并在第3天以相同剂量再次刺激小鼠。在感染8天后证实移生。从第9天开始，每天给予小鼠Epi-1剂量(250μg)或PPI-三重疗法(10xMIC)持续两个星期。然后牺牲小鼠，并收集器官。制备胃溶解物用于各种生化和组织病理学试验。感染对照组和抗生素组在快速脲酶试验中测试幽门螺旋杆菌为阳性的(图5A)。藉由比较未治疗组和三重疗法组之间小鼠胃组织中的幽门螺旋杆菌数量来评估治疗功效(图5B)。研究期之后，观察到未治疗组有5x10⁶CFU幽门螺旋杆菌/胃组织，而在PPI-三重疗法组中这减少了2个数量级(4x10⁴CFU/g)。Epi-1治疗导致100％清除(幽门螺旋杆菌无法通过脲酶试验、PCR、西方墨点法、或选择性琼脂电镀检测到)，表示Epi-1是对抗幽门螺旋杆菌感染的有效单治疗剂。

1.2.7胃组织中幽门螺旋杆菌感染的免疫荧光检测

随后使用免疫荧光染色来检测胃组织切片中的幽门螺旋杆菌。如图6所示，感染幽门螺旋杆菌的未治疗小鼠呈现绿色荧光，表示细菌在胃的表面黏膜并朝向黏膜肌层。幽门螺旋杆菌也存在于腺状管腔中，并深深渗透到胃腺体中。PPI-三重疗法(抗生素)的荧光减少，但未能消除胃组织的细菌(与幽门螺旋杆菌数量一致。相反地，在来自Epi-1治疗组的切片中未观察到荧光，表示组织层次的幽门螺旋杆菌被大量清除。

1.2.8用于胃炎评估的组织学检验

用苏木紫-曙红和吉姆沙染色剂将胃组织切片染色用于组织学检验(图7(a)和图7(b))。未治疗小鼠的胃切片有明显发炎；另外，溃烂底和黏膜肌层被免疫细胞严重浸润(图8(a))。这些发炎细胞往小凹、主要的、及壁细胞区浸润，而对表面上皮造成表面损伤(图7(b))。这种结果是移生过程中由幽门螺旋杆菌介导宿主免疫系统的调节所造成的。PPI-三重疗法并不影响发炎，而Epi-1的治疗则明显减少在溃烂底和黏膜肌层的发炎和免疫细胞浸润。这些数据暗示，单治疗剂量的Epi-1通过明显清除幽门螺旋杆菌来恢复胃组织的形态。

1.2.9Epi-1对幽门螺旋杆菌在脾细胞诱导的CD4+Foxp3、Th17T细胞亚群优势的影响

最近的研究已经指出，幽门螺旋杆菌感染诱导对抗辅助T细胞免疫力的强调节性T细胞(Treg)极化，以增强幽门螺旋杆菌的持久移生；初始增加的Th17细胞引起发炎以有助于移生(图8(a))，但保持低的Th17/Treg比来对抗宿主的免疫反应。Epi-1治疗明显减少幽门螺旋杆菌偏移的Treg亚群，并适度减少Th17数量；另外，Epi-1恢复Th17/Treg的平衡(图8(a))。这表示，在第一时间，Epi-1抑制幽门螺旋杆菌介导的宿主免疫反应调节，这可能导致所观察到的幽门螺旋杆菌移生减少。这些数据与图5B所示对胃组织细菌负荷的作用相关联。

1.2.10Epi-1对幽门螺旋杆菌在胃组织诱导的细胞激素mRNA表现的影响

为了进一步评估幽门螺旋杆菌引起的胃组织免疫反应，我们进行了实时PCR来量测Epi-1治疗对编码细胞激素的基因之mRNA表现水平与感染小鼠体内的T细胞标记物的影响(图8(b))。我们报告某些细胞激素(肿瘤坏死因子-α、IL-6、IL-10、及IL-17)和T细胞标记物FOXP3在幽门螺旋杆菌感染的过程中明显上调。IL-10和IL-17在持久的幽门螺旋杆菌移生和胃发炎中扮演主要的角色。Epi-1明显抑制IL-10的表现，IL-10在Treg细胞的发展中扮演关键的角色；此外，Epi-1恢复Th17/Treg的平衡。

1.2.11临床前毒性评估

据报告，Epi-1的急性和亚急性口服施予(分别以125mg/kg和600μg/小鼠的剂量)没有在小鼠中引起任何临床异常、发病或死亡。检验全血的生化：没有观察到麸胺酸草乙酸转胺酶(GOT)、麸胺酸丙酮酸转胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、总胆红素(TBIL)、或尿酸(UA)的水平有明显的变化。身体发育也正常。

与SDS(正对照组)相比，皮肤毒性试验(施加2.5mg Epi-1/2cm²皮肤表面)没有在施加区域引起任何刺激、病变、或临床症状。在试验期间头发和身体生长均正常，粗略尸检没有在重要器官或在施加区域显现任何可检测的异常(图10(a))。

接着，使用兔子进行眼刺激试验。眼睛接受1mg/眼/日的Epi-1持续7天，并使之复原7天。在第2天和第3天，徐徐滴入Epi-1的眼睛呈现流泪的迹象，但后来眼睛变成正常，而且在测试期间与SDS治疗的眼(阳性刺激物)相比时并没有显现任何明显的眼部症状(表2)。尸检没有发现任何异常。整体来说，我们的结论是，当通过口服、皮肤或眼的途径施予时Epi-1没有引起任何不良的毒性(图10(b))。

表2Epi-1的眼刺激試驗結果

得出的结论是，当在小鼠和兔子身上通过试验途径施予时Epi-1不会造成不良的影响。先前发现Epi-1在皮肤损伤期间参与伤口愈合；而且在小鼠的全身毒性研究中没有观察到不良的影响。因此，Epi-1适用于全身、口服、或局部施用。

实施例2TP4的研究

2.1材料与方法

2.1.1幽门螺旋杆菌菌株及其他材料

使用幽门螺旋杆菌菌株美式细胞培养物(ATCC)43504、51653及700392、以及由吴明贤博士(台湾国立台湾大学医院内科部胃肠肝胆科)提供的临床分离物CI-HC-028来测定TP4的抗微生物功效。使用Anaeropack-Anaero包(日本三菱)在微需氧氛围下生长幽门螺旋杆菌。抗生素；阿莫西林、克拉霉素及甲硝唑(密苏里州圣路易斯Sigma化学公司)。所有动物方案编号96025都得到台湾基隆国立台湾海洋大学科学学院的实验动物照护及使用委员会(IACUC)批准。

2.1.2抗微生物胜肽TP4的合成

由GL生化(中国上海)使用Fmoc化学的固相程序合成具有胺基酸序列FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR(序列编号：6)的尼罗河吴郭鱼抗菌蛋白4(TP4)。将粗肽萃取、冻干、并藉由反相高效液相层析术(HPLC)纯化。纯化肽的分子量和纯度分别藉由质谱仪和HPLC验证。在每个实验之前在PBS中新鲜重组纯度>95％的合成肽用于工作原料。

2.1.3体外抗幽门螺旋杆菌评估

将进行指数生长的幽门螺旋杆菌细胞悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并使用BHI培养液调整到0.05OD；将接种物分配到微量滴定盘上。使用PBS制备不同浓度(0.04至50μg mL^-1)的肽TP4。使用抗生素抗药性临床分离物CI-HC-028和三个参考菌株进行敏感性试验。将MIC定义为没有可见生长的最低药物浓度。为了质量控制和比较分析，还检验了全部四个幽门螺旋杆菌菌株对抗生素阿莫西林、克拉霉素、及甲硝唑的敏感性。

2.1.4TP4的剂量和时间相依性影响

制备浓度对应于1/4、1/2、1、2、及4倍MIC的TP4肽溶液(100μL)并加入等体积含约10⁷CFU mL^-1幽门螺旋杆菌量的溶液到微量滴定盘上。在37℃下培育滴定盘，并在1、3、6、12、及24小时收集样品，而且使用适当稀释剂将样品涂到血琼脂盘上；计数细菌数量并表示为平均对数(CFU mL^-1)与标准偏差。

2.1.5TP4对幽门螺旋杆菌表面电荷的影响

在室温下使用装有633nm氦氖雷射的Zetasizer Nano ZS(英国伍斯特郡马尔文仪器)进行ζ电位研究。制备在MIC的TP4。将体积100μL的每种肽原料稀释液添加到900μL(0.5OD)在液体培养物/血琼脂培养物中的幽门螺旋杆菌。正对照组包含过滤的缓冲液，而不是肽。将细菌悬浮液分配到具有金电极的可丢弃ζ电池中，并使其在25℃下平衡15分钟。计算每个样品的ζ电位。使用独立生长的培养物进行完整的实验，每种肽进行两次。

2.1.6TP4诱导的幽门螺旋杆菌形态变化之穿透式电子显微术(TEM)分析

使用穿透式电子显微术(TEM)来研究TP4对幽门螺旋杆菌的作用机制、整体细胞形态、TP4移位进入幽门螺旋杆菌、及TP4与内部标靶的相互作用。从BHI血琼脂盘收集幽门螺旋杆菌整夜培养物，并使用TP4、阿莫西林、及/或PBS(仅PBS：负对照组)培育0.1OD的接种物。在培养6小时时，收集幽门螺旋杆菌细胞并在PBS中藉由离心和再悬浮连续洗涤两次。然后使用前述方法并修改一些来固定并处理细胞用于进行TEM。简言之，将细胞在分级系列的乙醇中脱水，随后在65℃下树脂聚合3天。使用电磁超薄切片机来从聚合块切出厚度70至80nm的薄切片，然后将薄切片装载在400目的铜网上。之后使用2％乙酸氧铀将切片染色15分钟，然后柠檬酸铅5分钟，再固定以使用在80keV下操作的FEI Tecnai G2F20S-TWIN穿透式电子显微镜(俄勒冈州希尔斯伯勒FEI公司)观察。以低功率倍率(X1100)观察细胞的形态，并以高功率倍率(X2、500/5,000/7,000、或X15,000)观察细胞壁超威结构。使用相同的设定仔细检查每个网格。使用4MP SPOT Insight电荷耦合组件(CCD)照相机记录影像。

2.1.7TP4在小鼠模型中对抗幽门螺旋杆菌感染的单一治疗功效

从乐斯科台湾生物科技股份有限公司取得雄性C3H/HeN小鼠，并将小鼠安置在动物设施实验室。依据农委会(台湾COA)的指导方针，将小鼠保持在无病原体的无菌隔离区中。所有参照号码96025的动物方案都得到台湾基隆国立台湾海洋大学科学学院的实验动物照护及使用委员会(IACUC)批准。对于幽门螺旋杆菌的感染模型，将六周龄的雄性小鼠随机分成三组，每组6只小鼠。为了建立初步的幽门螺旋杆菌感染，在两天(时间间隔24小时)使用～1x10⁹CFU的幽门螺旋杆菌灌胃刺激小鼠。移生之后(第9天起)，每天使用单一治疗剂量的TP4(8mg/kg)治疗小鼠持续14天；对照组接收等体积的PBS。治疗两周后在第22天牺牲小鼠，并处理胃组织用于脲酶活性、幽门螺旋杆菌定量、西方墨点法、组织病理学分析、T细胞亚群定量、及实时PCR。

2.1.8幽门螺旋杆菌移生的评估

制备获得的胃溶解产物且连续稀释，并将100μL等分试样重复涂布到EYE选择性琼脂盘上两次。在37℃下将盘在微需氧条件下培养24-72小时。记录粉红色的菌落(幽门螺旋杆菌)和总活菌数。

2.1.9幽门螺旋杆菌致病因子基因的表现

使用组织和细胞基因体DNA纯化套组(台湾GeneMark；DP021-50)从胃组织溶解产物(25μL)中分离出基因体DNA(gDNA)。使用NanoDrop N1000分光亮度计测定DNA的浓度和品质。使用基因特异性引子(UreB F:5'-GGC ACC ACT CCT TCT GCAAT-3'(序列编号：10)；R:5'-CAG CTG TTT GCC AAG TTC TGG-3'(序列编号：11)；CagA F:5'-GAT GTG AAA TCC CCGGGC TC-3'(序列编号：12)；,R:5'-ACT GCG ATC CGG ACT ACG AT-3'(序列编号：13)；，内部对照16s rRNA F:5'-ACG CGT CGA CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3'(序列编号：14)；R:5'-AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC-3'(序列编号：15))进行聚合酶链反应(PCR)及100ng的gDNA作为模板。在2％琼脂糖凝胶上藉由电泳来分离所得的PCR产物并用溴化乙锭染色。

2.1.10西方墨点法

使用脲酶B蛋白作为标记以确认幽门螺旋杆菌存在于胃组织中。将所有的溶解产物蛋白(25μg)装载到SDS凝胶上并藉由电泳分离。然后将蛋白带转移到PVDF膜上。印渍之后，使用溶于TBS且带有0.01％Tween 20的3％BSA将膜封闭，并使用脲酶B特异性抗体检测蛋白质。使用化学发光检测器(UVP BioSpectrum)测定蛋白带的相对强度。

2.1.11组织病理学检查

将胃组织切片固定在缓冲石蜡中并包埋在石蜡中。用苏木紫和曙红将约5μm的切片染色以分析组织发炎。对于针对幽门螺旋杆菌的染色则使用二甲苯和乙醇将组织载玻片脱蜡，然后于水中再水合。在PBS中洗涤之后，使用改质的吉姆萨染色来培育组织切片2-5分钟，然后用PBS洗涤。将载玻片固定，然后在光学显微镜下以不同放大倍率观察切片。如前所述评估组织。

2.1.12流式细胞量测术

进行流式细胞量测术来量化小鼠的脾脏T细胞亚群。简言之，在安乐死的小鼠上进行脾切除术，并将脾脏转移到RPMI介质中。在室温下将脾脏切碎，并通过100μ大小的筛孔，而且将单细胞悬浮液以1500rpm制粒5分钟。将所得的细胞颗粒再悬浮于3mL的RBC溶解缓冲液中，并在室温(RT)下培育5分钟且缓和放液，以有助于溶解和细胞解体。使用RPMI介质稀释缓冲液来停止溶解反应。将混合物再次离心，并将颗粒悬浮在RPMI介质中。将所得的单细胞悬浮液等分至流式细胞量测管(100μL/管)。将1微升荧光染料标记的单株抗体(T细胞亚群；CD4、Th17、Treg)加到各管中，并用PBS将体积补足到500μL。将管用箔覆盖，并在室温下在黑暗中培育1小时。然后使用BD FACS Canto-A流式细胞量测仪分析样品，并记录T细胞亚群的百分比。

2.1.13胃细胞激素和T细胞标记基因的表现

使用高纯度RNA组织套组依据制造商(美国罗氏)的建议制备来自C3H/HeN小鼠的胃的全体RNA。对于细胞激素mRNA的定量，使用高容量cDNA库套组(Invitrogen)将5μg的全体RNA转化成cDNA。使用用于ACFX Connect^TM实时PCR检测系统(Bio-Rad)的TaqMan基因表现试验藉由Q-PCR量测介白素IL-1β、IL-6、IL-18、IL-10、IL-23、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TGF-β、及Foxp3mRNA的水平。将转录水平标准化为内源性对照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA之转录水平，并使用比较CT法(Bio-Rad)表示为与来自对照小鼠的样品相比之倍数变化。

2.1.14TP4的毒性研究

口服毒性：

藉由单次口服施予TP4(125mg/kg)在C3H/HeN小鼠体内评估急性毒性，每组6只动物。剂量施予之后持续观察动物最少48小时，并记录死亡率和临床症状。亚急性毒性：施予动物TP4(600μg的剂量/天)14天。在剂量施予期间，每天观察动物有无任何毒性的症状持续28天的测试期。记录和评估发病率、死亡率、及其他临床症状。

皮肤毒性：

施加TP4(125mg/kg)到小鼠的皮肤(局部)上。施予后，持续观察动物至少48小时并注意临床症状。

新西兰白兔的眼刺激测试：

使用TP4、PBS(载体对照组)、或0.1％SDS(正对照组)治疗健康的青壮年兔眼。每天施予重复的剂量1mg/kg持续7天。在治疗期间，在第1、3、5、及7天检查眼睛，并让眼睛恢复直到第14天。在测试期间记录临床症状，并对检查过程中的视觉反应指定等级。

2.1.15统计分析

进行统计分析，并使用SPSS 17.0，Graphpad 5.2软件产生图表。将结果表示为平均值±s.e.m.(平均值的标准偏差)。使用学生t测试(Student’s t-test)、ANOVA进行统计分析。在p<0.05时p的值是有意义的。

2.2结果

2.2.1吴郭鱼抗菌胜肽1～5对抗幽门螺旋杆菌的MIC和MBC之测定

证明的是，吴郭鱼抗菌胜肽可有效对抗革兰氏阴性和革兰氏阳性的病原体。这里，我们研究了五种吴郭鱼抗菌胜肽对抗各种幽门螺旋杆菌菌株(包括抗生素抗药性菌株)的最小抑菌浓度(MICs)。将MIC值呈现于表3。TP2例外，其他四种胜肽(TP1、TP3、TP4、及TP5)抑制幽门螺旋杆菌的生长。效力最强的胜肽是TP4，所以TP4被选择用于深入特征化。表3的数据指出的是，幽门螺旋杆菌的四种菌株全都对TP4敏感(MIC-1.5-3μg mL^-1)，不管菌株是否对抗生素敏感或有抗药性。重要的是，TP4的效果是剂量和时间相依的，表示TP4与固定数量的细菌标靶有相互作用。

表3吴郭鱼抗菌胜肽1～5对抗实验室和抗药性552临床分离物幽门螺旋杆菌菌株的抗微生物活性

2.2.2剂量和时间灭杀曲线

抗微生物活动的速率是重要的，因为它决定了所需的浓度是否在恶劣的胃环境中保持足够的时间。因此，我们分析了对抗幽门螺旋杆菌的剂量相依性影响，并发现在MIC和2xMIC分别为99％和99.99％。另外，我们评估对抗幽门螺旋杆菌菌株的时间灭菌试验。如图11(A)所示，在使用1xMIC的TP4治疗之后没有菌落恢复；建立99％灭杀率所需的时间为约3小时。以2或4xMIC培育提高了灭杀率。一起来看，这些数据表示，TP4以剂量和时间相依的方式对幽门螺旋杆菌作用。抗微生物胜肽的快速灭杀动力学经由细胞膜溶解/孔形成而发生。

2.2.3TP4抗微生物活性与抗生素的抗药性无关

比较TP4和传统抗生素对抗抗药性临床分离物CI-HC-028的杀菌活性。幽门螺旋杆菌的某些抗药性菌株先前被报告为对甲硝唑和克拉霉素有抗药性。这里，我们检视图11(B)图示的、基于时间的CI-HC-028敏感性曲线；在约6小时之前，TP4治疗已减少了>3对数等级(99％)的幽门螺旋杆菌，同时，抗生素中，只有阿莫西林在24小时内表现出90％的灭杀。甲硝唑使细胞数量一开始减少，但逐渐失去活性；克拉霉素持续减少cfu，但减少90％所花的时间>24小时。因此，多重抗药性(MDR)表型与对TP4的易损性之间没有相关。因此，TP4对抗MDR幽门螺旋杆菌比抗生素更有效。

2.2.4抗药性的发展

抗药性发展的主要驱动力是不恰当的抗生素使用及与治疗方案的顺从性差。这里，我们建立了用于模拟抗药性出现的情况的模型：在体外使细菌接触次抑制剂量的抗生素(AMOX、CLRN、METZ)或胜肽TP4。如图11(C)所示，抗药性指数(抗药性指数：MICp/MICs)；阿莫西林在传代6代后略微增加，并且此后保持不变。克拉霉素和甲硝唑的抗药性指数(MIC)从传代3代逐渐增加到最后的传代。然而，在我们的实验过程中TP4的抗药性指数没有发生变化。这些结果暗示，细菌可能不容易对TP4胜肽发展出抗药性。

2.2.5TP4与抗生素对抗药性幽门螺旋杆菌展现协同作用

组合疗法往往会增强抗生素的疗效并减少抗药性出现的频率。为了确定TP4用于组合疗法的适宜性，我们研究了此AMP是否与不同类的抗生素表现出协同活性。评估体外剂量OD降低动力学，以确定TP4与AMOX、CLRN、或METZ组合之活性，传统上AMOX、CLRN、或METZ被用作抵抗幽门螺旋杆菌的第一线防御。据报告，TP4具有显著的协同作用、将AMOX的MIC降低四分之一、并将METZ和CLRN的MIC降低二分之一倍(图11(D))。

2.2.6经由膜微胞化的TP4体外抗微生物机制：NPN荧光、表面电荷及穿透电子显微术研究

阳离子AMP已显示可针对并破坏细菌细胞膜及/或以可中断生物分子合成的方式与内部标靶相互作用。因此，我们检验TP4是否诱导幽门螺旋杆菌细胞膜的渗透和破坏。我们使用1-N-苯萘胺(NPN)摄取试验评估膜的完整性。一般来说，NPN被完整的细菌细胞膜忽略。然而，当膜集合体被破坏时，NPN可容易穿过屏障进入外膜的疏水性内部，导致荧光迅速增加。因此，我们在TP4治疗之后检视NPN荧光强度(图12(A))。TP4以次MIC值增加荧光；因此，此AMP可以次MIC剂量有效地渗透细胞膜。然而，AMOX仅在高剂量下显示荧光强度略微增加。为了确认TP4渗透细胞膜，我们通过ζ电位研究来分析细菌培养物的表面电荷(ζ电位/mV)(图12(B))。幽门螺旋杆菌血琼脂和培养液接种物分别显示-33.83和-27.47mV的ζ电位。添加MIC的TP4到两种接种物分别将ζ电位大大提高到+13.03和-6.18mV。这些数据强有力地表示，TP4与幽门螺旋杆菌表面膜相互作用，并从而将膜溶解。

2.2.7TP4对幽门螺旋杆菌细胞膜形态的影响

接下来，使用TEM检视与TP4接触2小时之后获得的细胞之超威结构。对照组幽门螺旋杆菌细胞的低和高放大倍率影像分别显示长且规则的螺旋结构、和具有完整细胞膜的圆球菌细胞(图12(C)(a))。接触AMOX后(图12(C)(b))，幽门螺旋杆菌显现为具有松弛外膜的「鬼影」细胞。另一方面，TP4导致细菌细胞膜实质破坏(图12(C)(c))；高倍率影像显示，这是由于微胞化(图12D)。此外，观察到电子致密结构。TP4在这个早期时间点的作用与观察到的NPN膜渗透时间(图12(A))和灭杀动力学试验数据(图11(A))一致。

2.2.8抗微生物肽TP4对幽门螺旋杆菌感染的功效

令人惊讶的是，在更高的放大倍率下(X7000-15000)观察到广泛的幽门螺旋杆菌细胞膜扰动(图12(D)(a-c))，与突出微胞的外观、膜脱落一致(图12(D)(a))。此外，观察到缺少膜的区块(图12(D)(b))和表示微胞化的裂口、以及细菌-TP4微胞分离(图12(D)(c))。微胞形成时证明外膜破坏，这接着导致泄漏和膜去极化；如所预期的，形态与ζ电位相关(图12(A)和图12(B))。总之，这是第一次根据这些数据显示TP4藉由诱导细胞膜的微胞化而导致幽门螺旋杆菌的细胞死亡。图16给予提出的作用机制。

2.2.9TP4在小鼠感染模型中对抗幽门螺旋杆菌的体内功效

上述体外数据表示，TP4具有强的、对抗幽门螺旋杆菌的活性。因此，我们继续评估TP4对抗幽门螺旋杆菌的体内治疗功效和免疫调节特性。图13(A)显示建立体内感染的实验计划，在感染后1周，将小鼠分成3组(n＝6)，并用PBS、TP4、或PPI三重疗法治疗。治疗后，进行脲酶测试并确认幽门螺旋杆菌存在于未治疗的小鼠或使用三重疗法治疗的小鼠的胃组织中，但不在使用TP4治疗的小鼠的胃组织中(图13(B))。此外，在未治疗组的小鼠胃中检测到平均7×10⁵CFU/g的幽门螺旋杆菌；这在使用PPI三重疗法治疗的小鼠身上大幅降到5×10⁴CFU/g(p＝0.0187)。在使用TP4治疗的小鼠的胃组织中未检测到细菌(虽然几种方法都无法在这一组检测到细菌，但为了进行统计比较将细菌存在的可能性设为<10CFU)(图13(C)。与PPI三重疗法组相比，TP4导致细菌负载量明显减少(p＝0.00152)。我们的结论是，TP4治疗从感染小鼠的胃中大量清除了幽门螺旋杆菌负载量。

2.2.10TP4对幽门螺旋杆菌致病因子之基因和蛋白表现的影响

幽门螺旋杆菌菌株之间有从致病因子存在或不存在所产生的不同致病度的证据。使用PCR来放大幽门螺旋杆菌的某些推定致病标记(cagA基因和ureB基因)作为检测幽门螺旋杆菌在胃中移生的敏感237手段(图13(D)(a))。发现在第22天牺牲的感染小鼠对于ureB和cagA都是阳性的，从而确认分子水平的移生。使用抗生素复合物治疗未能根除幽门螺旋杆菌，但降低了带强度(尽管这种降低并不明显，与图13(C)相关)。然而，TP4治疗组测试对于ureB和cagA基因都是阴性的。据建议，用于ureB和cagA的PCR可适用于在治疗后作为诊断工具，治疗后在胃黏膜的细菌量通常是少量的，而且可能无法藉由培养或其它诊断方法检测到。我们继续检查幽门螺旋杆菌致病因子脲酶B的胃溶解物，脲酶B对于在胃的酸性环境中移生是重要的。在未治疗组中检测到高强度的脲酶B蛋白，而三重疗法降低了蛋白表现，而且TP4治疗彻底破坏了可检测蛋白(图13(D)(b))。这些数据与膜和表面电荷破坏的结果(图12(A)和图12(B))一起意味着，幽门螺旋杆菌致病因子Cag A和脲酶是通过分泌外膜囊泡被释放，外膜囊泡是从细菌细胞膜产生的，并具有与母膜相同的成分和表面电荷。因此，TP4也清除细胞外的细菌及其致病因子。

2.2.11组织学检查及特殊染色分析

使用改质的吉姆沙将胃组织切片染色用于检测胃黏膜的幽门螺旋杆菌移生(图14(a))。未治疗和三重疗法治疗的小鼠在胃的表面表现出大量的幽门螺旋杆菌负载量；使用TP4治疗明显清除胃组织的幽门螺旋杆菌负载量。因此，TP4治疗明显减少了胃细菌负载量。然后我们继续使用HE染色切片来进行发炎的组织学检查(图14(b)和图14(c))。在感染小鼠身上观察到严重的发炎；此外，溃烂底和黏膜肌层被严重浸润。由于前发炎性和发炎性细胞激素的诱导，往主要壁细胞区浸润的发炎细胞对表面上皮造成表面损伤。三重疗法并不能减少发炎。然而，使用TP4治疗明显减少幽门螺旋杆菌引起的发炎，并大量减少免疫细胞，从而恢复胃组织的形态。

2.2.12TP4在感染幽门螺旋杆菌的小鼠体内对脾CD4+Foxp3-Treg、Th17子集动力学的宿主免疫调节作用机制

先前报告的是，幽门螺旋杆菌感染诱导调节性T细胞(Treg)，从而导致幽门螺旋杆菌的持久性。Foxp3+Treg和T辅助17(Th17)细胞已涉及对幽门螺旋杆菌的宿主免疫，具体而言是在胃的黏膜表面。幽门螺旋杆菌的持久性可以取决于Th17/Treg的平衡，如幽门螺旋杆菌相互作用的抗原呈递细胞介导的。幽门螺旋杆菌藉由调节宿主的免疫反应来避开免疫清除，以保持低的Th17/Treg。在本研究中，我们使用流式细胞量测术来证明TP4导致Treg细胞的强烈抑制并适度影响Th17细胞，从而明显增加脾T细胞子群中的Th17/Treg比(图15A)。藉由抑制Treg细胞，TP4治疗动态地清除幽门螺旋杆菌移生；此外，适度减少的Th17细胞也将导致胃的发炎减少。

2.2.13胃细胞激素和T细胞标记的表现

为了在我们的小鼠模型中分析幽门螺旋杆菌感染的免疫反应，我们进行了胃组织mRNA实时RT-PCR来分析细胞激素和285T细胞标记的表现水平(图15B)。我们报告的是，某些细胞激素(肿瘤坏死因子α、IL-6、IL18、IL-10、IL-17、IL-23、及TGF-β)和T细胞标记FOXp3在幽门螺旋杆菌感染期间极度上调。在这些细胞激素中，IL-10、IL-18、及IL-17在顽强的幽门螺旋杆菌移生和胃发炎中扮演主要的角色。另一方面，TP4治疗导致这些基因全部下调，IL-23和TGF-β例外。体内降低的IL-10导致Treg细胞明显减少，并恢复宿主的Th17/Treg平衡。另外，适度减少的IL-17促进发炎的胃组织形态复原(相关证据：图14)。

2.2.14TP4的体内毒性评估

急性口服毒性：

将相当于10倍体内治疗剂量的单剂量给C3H/HeN小鼠(n＝6)口服，并观察动物发病率或死亡率24小时。小鼠没有表现出任何异常的临床症状，而且在重要器官没有检测到异常。

亚急性口服毒性：

用3倍的治疗剂量给小鼠口服持续14天。从第1至28天观察动物有无发病或死亡的任何临床症状。TP4没有在小鼠身上引发临床并发症，而且在第28天安乐死之后没有观察到异常(n＝6)。

兔眼刺激测试：

表4提供使用肽TP4的眼睛刺激实验之总结。

表4TP4的兔眼刺激

^*数据系依据OECD 405指导方针的分级体系分级

在测试期间(第1至7天)与正对照组相比时，没有观察到明显的临床症状；在第14天牺牲兔子，没有在重要器官观察到异常，也没有在眼睛观察到病变或菌块(图17A)。

皮肤毒性：

在使C3H/HeN的皮肤接触到TP4之后，不管是立即或在14天的观察期期间都没有观察到死亡或有害的影响(图17B)。此外，直到观察的最后一天，治疗过的动物体重都是正常的。在试验期期间，TP4治疗没有引发病变或刺激，而且没有观察到严重的行为变化。还发现头发生长是正常的，而且尸检没有在器官结构或构造上显现任何严重的异常。

总结来说，证明了TP4对幽门螺旋杆菌菌株(MDR临床分离物和标准菌株)施加有效的抗微生物活性。还首次经由膜微胞化证明了TP4的作用机制。使用TP4治疗的小鼠的幽门螺旋杆菌感染明显比未治疗的和传统抗生素治疗的小鼠减少。重要的是，高剂量的TP4并没有在小鼠或兔子身上造成任何毒性。此外，TP4藉由改变免疫反应基因的表现来选择性调节幽门螺旋杆菌引发的免疫反应。总而言之，这些结果支持TP4作为新颖类别的抗幽门螺旋杆菌疗法的发展潜力。

提供的描述和申请专利范围应被理解为具有示范的目的，而不是以任何方式限制本发明的范围。

Claims (4)

1.一种抗微生物胜肽、该抗微生物胜肽之功能性衍生物、片段或变体用于制造治疗胃溃疡药物之用途，其中该抗微生物胜肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽-1(Epinecidin-1,Epi-1)、吴郭鱼抗菌胜肽(tilapia piscidins,TPs)、及上述之组合所组成之群组。

2.一种抗微生物肽、该抗微生物肽之功能性衍生物、片段或变体用于制造预防或治疗幽门螺旋杆菌(H.pylori)感染药物之用途，其中该抗微生物肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽(Epi-1)、吴郭鱼抗菌胜肽(TPs)、及上述之组合所组成之群组。

3.一种抗微生物肽、该抗微生物肽之功能性衍生物、片段或变体用于制造预防或治疗多重抗药性幽门螺旋杆菌感染药物之用途，其中该抗微生物肽系选自由石斑鱼抗菌胜肽(Epi-1)、吴郭鱼抗菌胜肽(TPs)、及上述之组合所组成之群组。

4.如权利要求1，2或3之用途，其中该吴郭鱼抗菌胜肽(TP)为吴郭鱼抗菌蛋白4(TP4)。