JP7190209B2 - 抗菌ペプチド誘導体及びその使用 - Google Patents
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Description
飾抗菌ペプチドDP7誘導体及びその使用に関する。
00個のアミノ酸残基から構成されており、その大部分は、正電荷を帯びた塩基性ポリペ
プチドである。抗菌ペプチドは、その広域スペクトル抗菌効果により、真菌、ウイルス、
及び寄生虫等の病原体を効果的に阻害及び殺傷することができ、また、腫瘍細胞を選択的
に殺傷することができる。更に、抗菌ペプチドは薬剤耐性を発現しにくいため、病原性微
生物の侵入に対する宿主防御のための最初の障壁を構成し、体の免疫系の重要な構成要素
である。抗菌ペプチドは、疾患の予防及び管理のための潜在的な薬物となり、抗生物質の
代用として広範な開発の見込みがある。大きな適用可能性にもかかわらず、主にその安定
性及び毒性のために、臨床的に広く使用されている抗菌ペプチドは僅かに過ぎない。いく
つかの研究は、ナノ結晶化により抗菌ペプチドがより良い安定性を得、毒性を減らすこと
ができることを示唆し、これは抗菌ペプチドの応用のための新しい研究方向を提供する。
イン及びケモカインの産生誘導、食細胞を含むエフェクター細胞の直接的又は間接的な動
員、細胞内及び細胞外細菌殺傷の増強、樹状細胞成熟及びマクロファージ分化の促進、並
びに創傷修復及びアポトーシスの媒介を含め、ますます注目されている。多くの抗菌ペプ
チドは、その優れた免疫調節効果によりアジュバント活性を示し、これは主に生来の免疫
応答を活性化し後天的免疫応答を媒介することによって達成される。
抗菌ペプチドであり、コンピュータ援用設計に基づく新規抗菌ペプチドスクリーニング法
に従ってテンプレート抗菌ペプチドHH2(特許番号:特許文献1)の2つのアミノ酸を
置換することによって得られる。研究では、抗菌ペプチドDP7がHH2よりも優れた抗
菌活性を有し、赤血球の溶血毒性が低く、免疫調節活性が強いことが示されている。イン
ビトロでの抗菌活性の研究では、抗菌ペプチドDP7は明らかに細菌細胞壁を破壊し細胞
膜を崩壊させることができ、従って抗菌機能を実現することができる。インビボでの抗菌
活性の研究では、病原性黄色ブドウ球菌に感染したマウスの腹腔モデルから、DP7が免
疫細胞を誘導して細菌を除去することにより非常に良好な治療効果を有することが分かっ
た。しかしながら、高濃度のDP7は、赤血球の溶血を引き起こし、静脈内注射による投
与後にマウスを殺傷する可能性があり、これは、高濃度のDP7が赤血球に対して有毒で
あり、赤血球を破壊する可能性があることを示す。DP7は、正電荷を帯びた親水性抗菌
ペプチドであり、疎水性フラグメントで修飾して両親媒性化合物を得ることができ、この
化合物は、ナノ粒子に自己集合することができ、静脈内投与の毒性を大幅に減少させ、イ
ンビボでその抗菌性及び免疫調節効果を維持し、小さな核酸薬のための送達システムとし
て機能する。従って、DP7は薬品分野で広く使用されている。
新規免疫アジュバントの調製、及び当該分野におけるsiRNA担体の調製を提供するこ
とである。
性修飾抗菌ペプチドを提供することであり、疎水的修飾は、抗菌ペプチドの窒素末端に疎
水性フラグメントを結合させること(又は窒素末端に疎水性化合物を結合させること)で
ある。抗菌ペプチドDP7のアミノ酸配列はVQWRIRVAVIRK(配列番号1)で
ある。構造がVQWRIRVAVIRK-NH2である場合、DP7のC末端は通常その
安定性を改善するためにアミド化によって修飾される。
化合物又は飽和直鎖脂肪酸である。好ましくは、ステロール化合物はコレステロール化合
物又はコール酸化合物である。
、コール酸、又はデオキシコール酸である。
くは、飽和直鎖脂肪酸はC8~C18の少なくとも1つである。
酸(C16)、ラウリン酸(C12)、又はn-オクタン酸(C8)のうちの少なくとも
1つである。
水性化合物)の-CO-OHと抗菌ペプチドの-NH2とのアミド化反応によって、疎水
性セグメント(疎水性化合物)に結合される。
らに搭載する。
a ポリペプチドVQWRIRVAVIRK-NH2を提供する工程と、
b ポリペプチドVQWRIRVAVIRK-NH2の窒素末端に疎水性フラグメントを
結合させる工程と
を含む。
する。
us aureus)、大腸菌(Escherichia colibacillus)
、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumanmii)、
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、又はチフス菌(Salmo
nella typhi)のうちの少なくとも1つである。
Albicans)又はカンジダ・パラプシローシス(Candida parapsi
losis)のうちの少なくとも1つである。
る。
質、マクロライド系抗生物質、及びβ-ラクタム系抗生物質のうちの少なくとも1つであ
る。
ポリン系抗生物質の少なくとも一方である。
オキサシリン、アンピシリン、カルボキシベンジルペニシリン、ピバムピシリン、スルベ
ニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、又はアモキシシリンのうちの少なくとも1つで
ある。セファロスポリン系抗生物質は、セファドロキシル、セファレキシン、セファゾリ
ン、セフラジン、セフプロジル、セフロキシム、セファクロル、セファマンドール、セフ
ォタキシム、セフトリアキソン、セフィキシム、セフジニル、セフピロム、セフェピム、
又はセフゾナムのうちの少なくとも1つである。
ン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネオマイシン、シソマイシン、トブラ
マイシン、アミカシン、ネチルマイシン、リボザイム、ミクロノマイシン、又はアジスロ
マイシンのうちの少なくとも1つである。
リミキシンB、又はテイコプラニンのうちの少なくとも1つである。
臭エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、アセチルスピラマイシン、ミデカ
マイシン、ジョサマイシン、又はアジスロマイシンのうちの少なくとも1つである。
使用を提供する。
から調製された免疫アジュバントを提供する。
に含む。更に、疎水性修飾抗菌ペプチド対CpG ODNの比は、1:0.5~1:5で
ある。
ルの使用を提供する。
渉のためのsiRNA(低分子干渉RNA)、又はゲノム編集のためのsgRNA(低分
子ガイドRNA)のものである。
核酸トランスポーターを提供する。
ためのsiRNA(低分子干渉RNA)、又はゲノム編集のためのsgRNA(低分子ガ
イドRNA)である。
20:1である。
a.請求項1~9のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチドの適切な量を秤量し
、溶解するための溶液を添加し、自発的にミセルを形成する工程、又は溶液を形成するた
めに請求項9~12のいずれか1項に記載のミセルを取る工程と、
b.ミセル溶液に核酸を添加し、室温でインキュベートする工程と、
を含む。
存することができ、使用時に滅菌水又は生理的食塩水に直接溶解することができる。
は、分子量が小さいため、Fmoc固相ポリペプチド合成法によって都合よく合成するこ
とができ、化学合成法によってシンプル且つ簡単な方法で疎水性セグメントに結合させる
ことができる。本発明の疎水性修飾抗菌ペプチドDP7は、ミセルに自己集合し、より良
好な単分散性及びゼータ電位を発現し、凍結乾燥及び再溶解後に安定を維持することがで
きる。疎水性修飾抗菌ペプチドDP7のミセルは、赤血球溶解に対する抗菌ペプチドDP
7の毒性を有意に減少させ、静脈内投与を実現することができる。インビトロでの極めて
低い抗菌活性にもかかわらず、疎水性修飾抗菌ペプチドDP7は、ゼブラフィッシュ及び
マウスにおいて良好な抗菌活性を有する。インビボでの抗菌活性は、直接滅菌によってで
はなく、マクロファージ、単球、好中球、及び他のリンパ球を動員し、いくつかの免疫サ
イトカインの発現を調節して生物に免疫防御を与えることによって達成される。一方、疎
水性修飾抗菌ペプチドDP7は、標的抗原に対する高い免疫応答を誘導するための免疫ア
ジュバントとしても使用され得る。更に、本発明の疎水性修飾抗菌ペプチドDP7カチオ
ン性ミセルは、siRNAを効率的に合成し、それを結腸がん細胞及び黒色腫細胞等の腫
瘍細胞に導入し、腹腔内注射、腫瘍内注射、及び尾静脈注射によって腫瘍組織の増殖を阻
害し、高い安全性を示すことができる。
(1)バンコマイシン(VAN)
である。
(1)黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus):ATCC 3
3591、ATCC 25923、
(2)大腸菌(Escherichia colibacillus):ATCC 25
922、
(3)緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa):ATCC 1014
5、ATCC 10145GFP
である。
って修飾される。本発明の実施形態において使用されるDP7は、QWRIRVAVIR
K-NH2である。コレステロール、コール酸、及び長鎖脂肪酸等の疎水性フラグメント
(又は疎水性化合物)は、親水性ポリペプチドに結合されてもよく、ナノ構造に自己集合
してもよい。本研究では、抗菌ペプチドDP7は、疎水性フラグメントとの結合によって
ナノ結晶化し、それによってその安定性が増加し、溶血毒性が減少し、その静脈内投与が
実現された。その直接的な抗菌効果及び免疫調節効果により、疎水性修飾DP7によって
形成されたナノ粒子は抗感染効果を有する。
でき、これによりワクチンのための免疫アジュバントとなる。抗原との同時免疫は、宿主
の細胞性免疫を増強し、抗原特異的免疫グロブリンの産生を媒介し得る。研究結果は、疎
水性抗菌ペプチドが良好なアジュバント特性を示すことを示している。インビトロ試験中
に、疎水性修飾DP7はナノ粒子に自己集合し、静電相互作用を介してCpGを吸収する
ことによって新しい免疫アジュバントとして作用し、抗原提示細胞による抗原取り込みを
増強し、抗原提示細胞の成熟及びサイトカインの発現を促進することができる。動物腫瘍
モデル試験において、疎水性修飾DP7/CpG複合体は腫瘍を接種したマウスの生存期
間を延長し、腫瘍の増殖を有意に阻害し、抗原特異的抗体のレベルを増強した。
7ミセルも水溶液中で正電荷を帯び、非ウイルス遺伝子伝達ベクター、特にsiRNA伝
達ベクターとしての可能性を示す。腫瘍標的に対するsiRNAサイレンシングと組み合
わせて、疎水性修飾DP7は、siRNAベースの腫瘍治療の研究と応用において重要な
役割を果たすであろう。
くの研究が行われているが、疎水性フラグメントと抗菌ペプチドとの結合に関する報告は
なされていない。抗菌効果及び免疫調節効果並びに疎水性フラグメントと抗菌ペプチドと
の結合のメカニズムが研究されるべきである。研究では、DP7-C共役体によって形成
されたカチオン性ミセルは、腫瘍細胞への効率的なsiRNA導入をうまく実現し、様々
な腫瘍モデルの増殖を効果的に阻害して新しいsiRNAトランスファーベクターを得た
。現在、抗菌ペプチド共役体に基づく遺伝子トランスファーベクターは報告されていない
。
ではなく、本発明の技術的スキームを説明するための例示に過ぎないとみなされることを
理解すべきである。
て合成し、ここで疎水性フラグメントはコレステロール、コール酸、パルミチン酸、ステ
アリン酸、及びラウリン酸を含む。
4’-ジメトキシフェニル-フルオレニルメトキシカルボニル-アミノメチル)-フェノ
キシル-アセトアミド-メチルベンズヒドリルアミン樹脂;Fmoc、フルオレニルメト
キシカルボニル;pbf、tbu、Otbu、Trt、及びBocは全て、それぞれ2,
2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル、第三級ブチル、
tert-ブトキシ、トリフェニルメチル、t-ブチルオキシカルボリルと名付けられた
保護基である。
メトキシカルボニル-アミノメチル)-フェノキシル-アセトアミド-メチルベンズヒド
リルアミン樹脂)樹脂(置換値:0.36mmol/g)1.0gを秤量し、ポリペプチ
ド合成装置の反応容器に入れ、膨潤活性化をDCM/DMF(1:1)で行い、反応容器
を上下に振盪して樹脂を完全に膨潤させ、膨潤プロセスの約20分後に溶媒を除去する。
を用いて、樹脂からFmoc保護基を除去し、15分の反応後、樹脂をDCM/DMF(
ジクロロメタン/N、N-ジメチルホルムアミド)で3回交互に洗浄し、少量の樹脂をメ
タノール/DCM/DMFで順次洗浄し、次いで5%ニンヒドリンを含有する無水エタノ
ール溶液を満たしたEPチューブに添加し、樹脂が青色に変わるまで(即ち、陽性反応)
チューブを沸騰水に3分間浸し、次いで2回洗浄して、次の反応を続けるか、あるいは脱
保護工程を続ける。
し、DMF(約5ml)に溶解した後に反応容器に入れ、5mlのHBTu(ベンゾトリ
アゾール-N、N、N’、N’-トラメチルウロニウムヘキサフルオホスファート)(1
.44mmol、0.54g、4当量)及び5mLのDIEA(ジイソプロピルエチルア
ミン)(2.88mmol、0.474mL、8当量)をDMF溶液に添加し、最後に5
mlのDMFを補充して反応を開始させた。反応容器を50分間上下に振盪し、反応液を
取り除く。少量の樹脂をCH3OH/DCM/DMFで順番に洗浄し、5%ニンヒドリン
を含む無水エタノール溶液を満たしたEPチューブに加える。樹脂が黄色又は淡青色に変
わるまで、即ち反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に3分
間浸す。その後、反応容器内の樹脂をDCM/DMFで3回交互に洗浄し、溶媒を除去し
て次の反応を行う。樹脂が濃青色又は赤褐色に変わった場合、反応は完了しておらず、縮
合反応を繰り返す必要がある。しかし、縮合反応を行うのは容易であるため、一般的には
完了している。この工程で使用される原材料は、Fmocに結合したMBHA樹脂によっ
て修飾されたRinkアミンリンカーを含むFmoc-RinkアミドMBHA樹脂であ
る。本発明では、置換度は0.36mmol/gであるが、他の置換度も同じ又は類似の
技術的効果を達成することができ、それらも本発明の範囲内である。本発明で用いられる
置換度0.36mmol/gは、合成フラグメントの収率、純度、樹脂利用率等の諸要因
をバランスさせて得られる最良の値である。
後、N、N-ジメチルホルムアミド、Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-ヒドロキ
シベンゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール-N、N、N’、N’-テトラメチルウロニ
ウムヘキサフルオロホスファート及びN、N’-ジイソプロピルエチルアミンを添加し、
それらを窒素保護下で反応させてFmoc-Arg(pbf)-Lys(Boc)-MB
HA樹脂を得る。次に、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-
Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc
-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-O
H、Fmoc-Gln(Trt)-OH、及びFmoc-Val-OHを同じ方法に従っ
て、順に接続する。
ないように、一般に以下の工程が必要である。遊離アミノ基に対してアセチル化ブロッキ
ングを行い、樹脂で満たした反応容器に調製ブロッキング溶液(無水酢酸:ピリジン:D
MF:3:3:4)を加え、反応容器を上下に約20分間振盪し、ニンヒドリンで試験す
る。樹脂が黄色に変わったら、反応は完了しており、次の反応を実施することができる。
ブロッキングが不完全である場合には、ブロッキング時間を長くするか、又はブロッキン
グ溶液の比率を調整して反応をできるだけ完全にする必要がある。
、DCM(約10ml)に溶解し、反応容器に加えた。次に、5mLのHBTu(1.4
4mmol、0.54g、4当量)及びDIEA(2.88mmol、0.474mL、
8当量)をDMF溶液にそれぞれ添加した。反応容器を50分間上下に振盪し、反応液を
取り除いた。少量の樹脂をCH3OH/DCM/DMFで順番に洗浄し、次いで5%ニン
ヒドリンを含む無水エタノール溶液を満たしたEPチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡
青色に変わるまで、即ち、反応が完了したことを示す陽性反応になるまで、チューブを沸
騰水に3分間浸した。その後、反応容器内の樹脂をDCM/DMFで3回交互に洗浄し、
溶媒を除去した。得られた樹脂を、ライセートを満たした反応容器に入れ、反応容器を密
閉し、クレードルに固定して反応させた。約2時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除
去し、樹脂をDCMで数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりTFA及び溶媒を除去
し、残りの液体に氷の無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白
色沈殿物を高速(4000r/分)で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をHPLC
で更に精製し不純物を取り除いて標的生成物、即ち、コレステロール含有DP7(DP7
-C)を得た。その質量スペクトルを図2Aに示し、測定された分子量は予想通りである
。
l)に溶解し、反応容器に入れ、次いで5mlのHBTU(1.44mmol、0.54
g、4当量)及びDIEA(2.88mmol、0.474ml、8当量)をそれぞれD
MF溶液中に加えた。反応容器を50分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量の樹
脂をCH3OH/DCM/DMFで順番に洗浄し、次いで5%ニンヒドリンを含む無水エ
タノール溶液を満たしたEPチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、即
ち、反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に3分間浸した。
その後、反応容器内の樹脂をDCM/DMFで3回交互に洗浄し、溶媒を除去した。ライ
セートを満たした反応容器に得られた樹脂を入れ、反応容器を密閉し、クレードルに固定
して反応させた。約2時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をDCMで数
回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりTFA及び溶媒を除去し、残りの液体に氷の無
水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速(400
0r/分)で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をHPLCで更に精製し不純物を取
り除いて標的生成物、即ち、コレステロールDP7(DP7-CA)を得た。
0ml)に溶解し、反応容器に入れ、次いで5mlのHBTU(1.44mmol、0.
54g、4当量)及びDIEA(2.88mmol、0.474ml、8当量)をそれぞ
れDMF溶液中に加えた。反応容器を50分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量
の樹脂をCH3OH/DCM/DMFで順番に洗浄し、次いで5%ニンヒドリンを含む無
水エタノール溶液を満たしたEPチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで
、即ち、反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に3分間浸し
た。その後、反応容器内の樹脂をDCM/DMFで3回交互に洗浄し、溶媒を除去した。
ライセートを満たした反応容器に得られた樹脂を入れ、反応容器を密閉し、クレードルに
固定して反応させた。約2時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をDCM
で数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりTFA及び溶媒を除去し、残りの液体に氷
の無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速(4
000r/分)で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をHPLCで更に精製し不純物
を取り除いて標的生成物、即ち、ステアリン酸DP7(DP7-SA)を得た。その質量
スペクトルが図2Bに示されており、測定された分子量は予想通りである。
ml)に溶解し、反応容器に入れ、次いで5mlのHBTU(1.44mmol、0.5
4g、4当量)及びDIEA(2.88mmol、0.474ml、8当量)をそれぞれ
DMF溶液中に加えた。反応容器を50分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量の
樹脂をCH3OH/DCM/DMFで順番に洗浄し、次いで5%ニンヒドリンを含む無水
エタノール溶液を満たしたEPチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、
即ち、反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に3分間浸した
。その後、反応容器内の樹脂をDCM/DMFで3回交互に洗浄し、溶媒を除去した。ラ
イセートを満たした反応容器に得られた樹脂を入れ、反応容器を密閉し、クレードルに固
定して反応させた。約2時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をDCMで
数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりTFA及び溶媒を除去し、残りの液体に氷の
無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速(40
00r/分)で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をHPLCで更に精製し不純物を
取り除いて標的生成物、即ち、パルミチン酸DP7(DP7-PA)を得た。
ml)に溶解し、反応容器に入れ、次いで5mlのHBTU(1.44mmol、0.5
4g、4当量)及びDIEA(2.88mmol、0.474ml、8当量)をそれぞれ
DMF溶液中に加えた。反応容器を50分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量の
樹脂をCH3OH/DCM/DMFで順番に洗浄し、次いで5%ニンヒドリンを含む無水
エタノール溶液を満たしたEPチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、
即ち、反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に3分間浸した
。その後、反応容器内の樹脂をDCM/DMFで3回交互に洗浄し、溶媒を除去した。ラ
イセートを満たした反応容器に得られた樹脂を入れ、反応容器を密閉し、クレードルに固
定して反応させた。約2時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をDCMで
数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりTFA及び溶媒を除去し、残りの液体に氷の
無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速(40
00r/分)で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をHPLCで更に精製し不純物を
取り除いて標的生成物、即ち、ソフトラウリン酸DP7(DP7-DA)を得た。
との共役体も関連会社によって合成され得る。例えば、スクシニル化コレステロールで修
飾されたDP7-C(Chol-suc-VQWRIRVAVIRK-NH2)は、固相
ペプチド合成法に基づいてShanghai Ketai Biotechnology
Co., Ltdにより合成される。合成されたDP7-CはHPLCによって精製さ
れ、純度は95%以上であり、DP7-Cの分子量はMSによって決定される。合成した
ポリペプチドは-20℃で保存し、MillQ水で5mg/mlの母液に調製して使用す
る。固相ペプチド合成法によって合成されたDP7-C(Chol-suc-VQWRI
RVAVIRK-NH2)において、N末端はDP7に基づいてエステル結合を介して疎
水性コレステロールに結合され、C末端は保護のための分子-NH2に結合される。DP
7-Cの質量分析図を図2に示す。その分子量は1991.3408であり、MS上の主
ピークは996.1748であり、これは正しいDP7-Cが合成されたことを示す。
いるため、以下の実施例は、コレステロールDP7(DP7-C)と組み合わせて詳細に
記載されている。
光法により、DP7-Cの臨界ミセル濃度(CMC)を検出した。
ールやジエチルエーテルには容易に溶解する。水溶液中のピレンの蛍光発光スペクトルは
5つの蛍光ピークを有し、水溶液中の第1発光スペクトル光強度I1と第3発光スペクト
ル光強度I3との比(373nmと384nmの蛍光強度の比)は約1.8である。文献
によれば、界面活性剤は非極性有機化合物を可溶化し得、異なる濃度の界面活性剤はピレ
ンを様々な程度に可溶化し得る。従って、溶液の可溶化能力は、界面活性剤の濃度が臨界
ミセル濃度(CMC)を超えた後に明らかな変異点を有するであろう。界面活性剤濃度に
よるI1/I3の変化に従って曲線が描かれる場合、曲線変異の中点は試験される基質の
CMCである。従って、溶液中のピレンのCMCは、異なる濃度のDP7-C溶液中のピ
レンの蛍光スペクトルを測定することによって決定することができる。CMCの検出方法
:DP7-Cを秤量し、37℃の水浴中でMilliq水に溶解し、濃度1.5mg/m
LのDP7-C母液を得た。溶媒としてメタノールを使用して6×10-5mol/Lの
ピレン溶液を調製した。メタノールを揮発させ、換気の良い暗い場所で乾燥させた後、1
.5mg/mLのDP7-C溶液を4mL加え、37℃で4時間超音波処理し、クレード
ル上で8時間振盪した。その後、蛍光分光光度計でI1とI3を検出した。微量のピレン
を含むBDチューブに、それぞれ0.0001、0.001、0.01、0.025、0
.05、0.10、0.125、0.25、0.5、1.0、及び1.5mg/mlの濃
度に達するように、異なる量の試料母液を加え、各溶液の蛍光スペクトルを決定した。臨
界ミセル濃度は蛍光スペクトルに従って計算することができ、ここで蛍光走査の励起波長
は334nmであり、発光波長は373nm及び384nmであり、励起スリットは8.
0nmに設定し、発光スリットは2.5nmに設定し、走査速度は1200nm/分であ
る。
定値は3.47μg/mLである(結果については図3Bを参照)。
等のいくつかの物理的特性を検出した。
て自然乾燥させた。DP7-Cでコーティングしたマイカシートを原子間力顕微鏡に置き
、写真を撮影した。
2.粒径とゼータ電位の検出:DP7-CをMilliq水に溶解し、Malvin粒度
計で粒径とゼータ電位を測定し、各試料を4回検出して平均値を得た。
3.DP7-Cの外観と溶液状態:MilliQ水、DP7-C水溶液、及び凍結乾燥粉
末の外観を観察し、カメラで写真を撮影した。ここで、aはMilliQ水、bは水溶液
に溶解したDP7-C、Cは再溶解後のDP7-C凍結乾燥粉末の状態、dはDP7-C
凍結乾燥粉末の形状及び色である。
、DP7-Cミセルの粒径は約24.3±1.5nmであり(図4A)、ゼータ電位は約
28.8±0.27mVである(図4B)。DP7-C凍結乾燥粉末は、白色の綿毛状で
あり、水に溶けて無色透明である。
。
2.抗凝固剤を取り出し、等尺性生理食塩水を加え、ゆっくりと均一に混ぜ合わせ、40
0×gで10分間遠心し、上清を捨てた。
3.赤血球をゆっくり混合してPBSで洗浄し、400×gで10分間遠心し、上清を捨
て、細胞沈殿物をPBSで3回洗浄した。
4.PBSで希釈して20%(v/v)の赤血球溶液を得、これはすぐに使用するか、又
は4℃で約2週間保存することができる(溶血なし)。
5.薬物をPBSで一連の濃度勾配に希釈し、100μLの薬物を96ウェルプレートに
加え、100μLの2%Twain 20を陽性対照として取り、100μLのPBSを
陰性対照に加えた。この過程を各濃度の薬物について3回繰り返した。
6.20:1の体積比に従って20%(v/v)の赤血球溶液をPBSで希釈し、均一に
混合し、それぞれ100、200、400、600、800、1000、1200、16
00μg/mLの薬物濃度で96ウェルプレートに加え、37℃で1時間インキュベート
した。
7.薬物と赤血球の混合液をインキュベートし、900×gで10分間遠心し、160μ
Lの上清を新しい96ウェルプレートに加え、OD450nmの吸光度の値を読んだ。
8.A450の吸光度の値に基づいて、薬物の各濃度に対応する溶血の割合を計算した。
するDP7-Cミセルの溶解度はDP7よりもはるかに低く、これは、抗菌ペプチドDP
7が、コレステロールと結合して赤血球に対する毒性を大幅に低減することができること
を示している。図5Bは、異なる条件下での赤血球の溶血を視覚的に示す。具体的には、
陰性対照群(PBS)(群a)では溶血は観察されず、赤血球は容器の底に沈降する。陽
性対照群(2%Tween-20)(群b)及びDP7溶液群(群c)では、赤血球は溶
解する。DP7-Cミセル(群d)では、赤血球は溶解されないが、ミセルの特徴により
溶液中に均一に懸濁する。
有することが示されている(複数の菌株においてMIC>1024mg/L)。本発明者
らは更に、インビボで腹腔内感染マウス及びゼブラフィッシュモデルの抗菌活性を検出し
た。
NS群:マウス1匹あたり通常生理食塩水100μL、
DP7-C群:0.3mg/kg、
VAN陽性対照群:10mg/kg
とした。
(1)実験前日に黄色ブドウ球菌33591をMHBで活性化し、実験当日に活性化株を
通常生理食塩水で2回洗浄し、後で使用するために細菌液の濃度を測定した。
(2)腹部感染マウスモデルを確立するために、1.5×108cfu/0.5mLの細
菌溶液を各マウスに腹腔内注射した。
(3)1時間の感染後、群ごとに0.1mL/マウスで薬物を静脈内注射した。
(4)24時間後、5mLの通常生理食塩水をマウスに腹腔内注射し、腹部を軽くマッサ
ージし、マウスを屠殺し、75%アルコールで消毒した。5分後、腹腔上皮をはさみで切
り、腹腔に小さな開口部を作り、1mlの注射器で開口部からできるだけ多くの腹水を引
き、次に、混合するために滅菌EPチューブに移した。
(5)通常生理食塩水で例えば10倍、100倍、1000倍、及び10000倍の希釈
度で希釈し、各々20μLの適切な濃度の3つの細菌性溶液を取り、MHAプレートにコ
ーティングし、バクテリアインキュベーターで一晩インキュベートした。
(6)20~200コロニーを有するプレートを選択し、腹水5mL中のmLあたりの細
菌の量を変換し計算した。
静脈内投与後のDP7-C群(1mg/kg)及び陽性薬物群(20mg/kg VAN
)における黄色ブドウ球菌の平均コロニー形成単位(CFU)が、NS群よりも有意に低
いことを示した(p<0.01)。また、DP7-C群の抗菌効果は、陽性薬物群と基本
的に同じであり、統計的な差異はない。このことは、DP7-Cが全身感染マウスモデル
において良好な抗菌活性を有することを示す。
-GFP)を介して腹部感染ゼブラフィッシュモデルを確立した。
卵を集め、28℃のインキュベーターに入れ、PTUを含む海水中でインキュベートした
。PTUを含む海水は一日一回交換した。ゼブラフィッシュを48時間インキュベートし
た時に、DP7-Cと通常生理食塩水で希釈した蛍光を有する緑膿菌(PAO1-GFP
)を腹腔内注射し、蛍光顕微鏡下で3時間、8時間、及び18時間目に写真を撮影して、
ゼブラフィッシュの腹部内のPAO1-GFPの成長を観察した。
緑色蛍光の全強度と正の相関があり、DP7-C群のPAO1-GFPの成長率はNS群
よりもはるかに低く、低濃度(1mg/mL)のDP7-Cミセルが、ゼブラフィッシュ
において良好な抗菌活性を有することを示す。
いインビボ抗菌活性を有することが見出された。考えられる理由は、DP7-Cが生物の
免疫系を調節することによって抗菌効果を達成したことにある。細胞レベルとサイトカイ
ンレベルから免疫機能に対するDP7-Cの効果を検出した。
の各マウスには200μLの通常生理食塩水を注射した。両群のマウスを24時間後に屠
殺した。各マウスに5mLの通常生理食塩水を腹腔内注射した。腹部を穏やかにマッサー
ジすることによって腹腔内の腹水を吸引して、腹水中の細胞濃度及び全細胞数を計算した
。腹水のリンパ球分類をフローサイトメトリーにより検出し、全細胞中のマクロファージ
、好中球、及び炎症性単球の割合を分析し、フローサイトメトリーの結果及び腹水中の細
胞の総数に従って、マクロファージ、好中球、及び炎症性単球の数を計算した。
有意に増加し、マクロファージ、好中球、及び単球の数は有意に異なる。特に、単球の割
合は2.7%から32.8%に増加し(図7A)、マクロファージの割合は38.8%か
ら50.8%に増加した(図7B)。
DP7-C刺激後のマウスPBMC中のサイトカインの変化を決定するために、単離し
たマウスPBMCを1×106細胞/mLに希釈し、6ウェルプレートに2ml/ウェル
で加え、DP7-Cの刺激濃度は200μg/ml、刺激時間は4時間とした。刺激後、
細胞を集めて-80℃の冷蔵庫に保存した。一方、DP7-CがLPS誘発炎症反応を逆
転させることができるかどうかを検証するために、LPSと共にPBMCを刺激するよう
に実験を設定した。PBMCを1×106細胞/mlに希釈し、6ウェルプレートに2m
L/ウェルで加え、DP7-Cの刺激濃度を200μg/mLとし、1時間後、LPSで
4時間刺激し、細胞を集め、-80℃の冷蔵庫に保存した。全てのサンプルを収集した後
、遠心分離、洗浄、全RNA抽出、逆転写、及びリアルタイム定量的PCRを含むその後
の工程を行った。
。IL-1、IL-6、MCP-1、M-CSF、TNF-α、及び免疫活性化に関連す
る他のサイトカインの発現は大幅に増加している。一方、DP7-CとLPSが共にPB
MCを刺激すると、IL-1β、MCP-1、TNF-α等のサイトカインストームに関
連する主要なサイトカインの遺伝子発現が有意に減少することがわかった。これは、DP
7-Cが敗血症及び他の関連する感染症によって引き起こされる損傷の程度を軽減できる
ことを示している。
有意に上方制御できることがわかった。従って、CpG ODNと組み合わせたDP7-
Cは新規免疫アジュバントとして使用することができ、且つDP7-Cは自発的にミセル
を形成することができることが予測され、これはまた、DP7-Cをアルミニウムアジュ
バントの可能性のある代替物として使用することを本発明者らに想起させる。本研究にお
いて、本発明者らは、モデル抗原としてOVAを採用することによって、DP7-C/C
pG複合体アジュバントの免疫調節効果、並びにマウスの予防的及び治療的腫瘍モデルに
おける抗腫瘍効果を研究した。
C57BL/6J雌性マウスを、各群10匹の4群に無作為に分け、
NS群:通常生理食塩水100μL、
CpG群:10μgのOVA+20μgのCpG、
DP7-C群:10μgのOVA+40μgのDP7-C、
CpG/DP7-C群:10μgのOVA+40μgのDP7-C+20μgのCpG
とした。
5週目に腫瘍ワクチン接種の前に総抗体価を検出した。各マウスの背部に腫瘍細胞EG7
-OVA:2×106を皮下接種した。腫瘍が増殖した後、3日間隔で測定した。腫瘍体
積の計算式は、0.52×長さ×幅2である。
細胞を皮下接種し、5日目に免疫した(週1回、3回連続)。3日間隔で測定し、腫瘍が
増殖した後の生存期間を観察した。
されたOVA特異的抗体は、5週目に他の群において産生されたものよりも有意に高く、
統計的差異を示す。DP7-C/CpG群における腫瘍増殖は、腫瘍接種後26日目に有
意に阻害された。治療モデル(C及びD)では、腫瘍を接種したマウスの生存期間は、D
P7-C/CpG群で有意に延長され、腫瘍の増殖は大きく阻害される。結果は、DP7
-C/CpGが良好な免疫賦活活性を有する新規免疫アジュバントであることを示してい
る。
原の取り込み及びプロセシングを改善することにある。本発明者らはインビトロでDC活
性に対するDP7-Cミセルの効果を研究した。
樹状細胞(DC)の成熟は、免疫応答又は身体の耐性を主に決定する。それらの表面抗
原CD80、CD86、及びMHC-IIは明らかに、DCの成熟と共に上方制御されて
いる。従って、本発明者らは、フローサイトメトリーによって樹状細胞成熟に対するDP
7-Cアジュバントの効果を検出した。
(1)C57/BLマウス初代骨髄細胞を単離し、10ng/mlのGM-CSF及び1
0ng/mlのIL-4を含有する誘導培地中で5日間インキュベートした。
(2)DP7-CアジュバントをDC細胞培養液に添加し、よく混合して16時間インキ
ュベートした。
(3)刺激したDC細胞を集め、PBSで2回洗浄し、100μLのPBSに細胞を再懸
濁し、1μLの抗マウスCD16/CD32を加え、4℃で30分間ブロッキングした。
(4)PBSで3回洗浄し、1μgのFITC-抗CD80、APC-抗CD86、及び
PE-抗MHC-IIを加え、室温で30分間インキュベートし、PBSを3回洗浄し、
フローサイトメトリーのために200μLのPBSに再懸濁した。
MHC II並びに共発現したCD80及びCD86の発現は増加し、NS群とのそれら
の差異は統計的に有意である。
DC細胞は体内で最も強力な抗原提示細胞であり、異物を吸収し、それらを処理し、T
細胞に提示して免疫応答を刺激することができる。DC細胞は、T細胞免疫応答及びT細
胞依存性抗体の産生において重要な役割を果たす。本発明者らは、フローサイトメトリー
によって、DC提示抗原に対するDP7-Cの効果を調べた。
(1)C57/BLマウス初代骨髄細胞を単離し、10ng/mlのGM-CSF及び1
0ng/mlのIL-4を含有する誘導培地中で5日間インキュベートした。
(2)DC細胞培養液にOVAタンパク質マーカーFITC、OVA、又はDP7-C/
OVAを添加し、よく混合し、3時間インキュベートした。
(3)刺激したDC細胞を回収し、PBSで2回洗浄し、300μLのPBSに細胞を再
懸濁し、フローサイトメトリーを行った。
よるOVAの取り込みは、40μg/mlのDP7-Cによってある程度までわずかに増
強される。しかしながら、2.5μg/mlのDP7-Cは、DC細胞による抗原の取り
込みを有意に増加させることができ、取り込み効果はDP7-C濃度と共に増加する。
した後のマウスNK細胞の殺傷活性を検出した。
一次免疫の48時間後、頸椎脱臼によってマウスを屠殺し、エフェクター細胞としてリ
ンパ球分離培地から脾臓リンパ球を単離した。
YAC-1細胞を蘇生し、インキュベートし、実験の前日に移し、2×106/20m
lを保った。トリパンブルーで染色した。活性が95%以上の場合に利用可能である。
1.96ウェルプレートに標的細胞とエフェクター細胞を加え(標的細胞対エフェクター
細胞の比率は、1ウェルあたり10,000個の標的細胞について1:25、1:50、
1:100、1:200)、37℃で4時間インキュベートした。
2.250gで遠心し、上清を取り出してLDH放出試験を行った。
とDP7-C群はやや強いNK細胞殺傷活性を示し、CpG/DP7-C複合体はNK細
胞活性を効果的に増強することができた。これらの差異は有意である。
し、腫瘍の成長及び転移を効果的に阻害し、マウスの生存期間を延長することができるこ
とがわかる。更に、DP7-CとCpGは、OVA抗原の特異的抗体価を有意に上方制御
し、体液性免疫応答を増強することができた。そこで本発明者らは、DP7-C活性化細
胞性免疫応答を更に検出した。
1.7日間で3回免疫した後、マウスの脾臓リンパ球を分離し、計数し、5×106/m
lまで希釈した。
2.6ウェルプレートに5×106/ウェルで入れ、各ウェルに10μg/mlのOVA
ホロタンパク質を加え、37℃で1時間刺激した(陰性対照:DMSO、陽性対照:5μ
g/ml conA)。
3.各ウェルに1μLのゴルジプラグを加えてよく混ぜ、6~12時間インキュベートし
た。
1.細胞を集めて2mlの1×BD Pharmlyseボルテックスに加え、暗所にて
室温で10分間インキュベートし、500gで5分間遠心し、上清を捨てた。
2.1×instaining bufferで洗浄後、100μLの1×instai
ning bufferに再懸濁し、1μLの抗マウスCD16/CD32を加え、4℃
で15分間インキュベートしてブロッキングした。
3.1×instaining bufferで洗浄後、100μlの染色バッファーに
再懸濁し、PE抗マウスCD8とperCP-cy5抗マウスCD4をそれぞれ1μl加
え、暗所にて4℃で30分間インキュベートした。
4.染色バッファーで2回洗浄した後、250μlの固定化/透過化ボルテックスを加え
て完全に懸濁させ、暗所にて室温で20分間インキュベートし、細胞を固定化し透過化し
た。
(7)2mLのBD Perm/洗浄バッファーを加え、500gで5分間遠心し、上清
を捨てた。
(8)100μLのBD Perm/洗浄バッファーに細胞を再懸濁し、細胞内抗原抗体
(FITC-IFN-γ又はPE-IL-17A)を添加し、暗所にて室温で30分間イ
ンキュベートした。その後、2mlのBD Perm/洗浄バッファーを加え、500g
で5分間遠心し、上清を捨てた。2%パラホルムアルデヒドを含む500μlのPBSに
再懸濁した。ボルテックスが完全に停止したら、フローサイトメトリーを実行することが
できる。
及びCD4+/IL-17A+細胞の割合は低く、一方、CpG及びDP7-Cアジュバ
ントで免疫したマウスではこれらの細胞の割合は増加する。しかしながら、CpG/DP
7-C複合体で免疫したマウス脾臓において、これら3種類の細胞の割合は高く、その差
はNS群と比較して統計的に有意である。
OVA腫瘍モデルにおいて阻害されることがわかる。本発明者らは、抗原としてNY-E
SO-1を更に使用してCpG/DP7-Cアジュバントでワクチンを形成し、ワクチン
が抗原の高発現と共に黒色腫の増殖を阻害できるかどうかを試験することを目的とする。
具体的な手順は次の通りである。
20μgのCpGと40μgのDP7-Cを37℃で15分間インキュベートし、5μ
gのNY-ESO-1タンパク質を加え、滅菌PBSを用いて100μlの容量になるま
で補充した。
本研究では、動物実験は、各群10匹のマウスをNS、CpG、DP7-C、及びCp
G/DP7-Cの5群に分け、各マウスの投与量は、
1.NS群:PBS100μl、
2.CpG群:NY-ESO-1タンパク質5μg+CpG20μg、
3.DP7-C群:NY-ESO-1タンパク質5μg+DP7-C40μg、
4.CpG/DP7-C群:NY-ESO-1タンパク質5μg+CpG20μg+DP
7-C40μg
とした。
BSを加えて100μlにすることができる。
、5週目に腫瘍を接種する前に総抗体価を検出した。各マウスの背部に腫瘍細胞NY-E
SO-1+B16:2×105を皮下接種した。腫瘍が増殖した後、3日間隔で測定した
。腫瘍体積の計算式は、0.52×長さ×幅2である。治療用免疫腫瘍モデル:0日目に
各マウスの背部に2×105個のNY-ESO-1+B16腫瘍細胞を皮下接種し、5日
目に免疫した(1週間に1回、3回連続)。3日間隔で測定し、腫瘍が増殖した後の生存
期間を観察した。
いて、NS群マウスの腫瘍は急速に増殖し、CpG単独又はDP7-Cアジュバントは、
ある程度腫瘍増殖を抑制することができ、免疫CpG/DP7-C複合体アジュバントは
、腫瘍の増殖を効果的に阻害することができ、これはNS群とは有意に異なる。
溶液中で正電荷を帯び、非ウイルス性遺伝子伝達ベクター、特にsiRNA伝達ベクター
としての可能性を示す。自己集合及びDP7-C/siRNA複合体によって形成された
DP7-Cミセルの形態を、透過型電子顕微鏡(H-6009IV、日立、日本)で観察
した。まず、1mg/mLのミセル溶液を蒸留水で希釈し、ニトロセルロースで覆った銅
メッシュ上にコーティングし、次いでリンタングステン酸でネガティブ染色し、室温で乾
燥させ、電子顕微鏡下で観察した。結果はDP7-Cミセルが球状であり均一に分布して
いることを示した。電子顕微鏡下で、DP7-Cミセルの粒径は約60nmであり、DP
7-Cミセル/siRNA複合体の粒径は約100nmである(結果については図14を
参照)。
の検出
腫細胞を、6ウェルプレートにウェルあたり5×104細胞の密度で置き、20%FBS
を含有するDMEM培地2mlを各ウェルに添加した。トランスフェクション効率を検出
するためのレポーター遺伝子としてFAM修飾無センスsiRNA(FAM-siRNA
)を使用し、PEI25Kとリポフェクタミン2000を陽性対照として使用した。トラ
ンスフェクションの間、培地を最初に1mlの無血清DMEM培地と交換した。続いて、
異なる比率で混合した遺伝子トランスフェクション複合体を各ウェルに添加し、各複合体
は1μgのFAM-siRNAを含む。これらのうち、siRNA/DP7-C、siR
NA/PEI25K、及びsiRNA/リポフェクタミン2000の比はそれぞれ1:5
、1:2、及び1:2である。培地を37℃で4時間インキュベートした後、それを20
%FBSを補充したDMEM培地と交換し、順次インキュベートした。24時間後、トラ
ンスフェクションを顕微鏡下で観察し、写真を撮影した。浮遊細胞及び接着細胞を含むウ
ェル中の全ての細胞を集め、予冷したPBSで2回洗浄し、各群の全蛍光強度をフローサ
イトメーター(EPICS Elite ESP、USA)により計数した。
AM修飾蛍光siRNAをCt26(図15c)及びB16(図15b)細胞にそれぞれ
42.4±3.5%及び53.3±4.0%のトランスフェクション効率でトランスフェ
クトできることを示す。PEI複合体の対応するトランスフェクション効率は、それぞれ
19.0±1.8%と72.0±4.1%であり、リポフェクタミン2000複合体の対
応するトランスフェクション効率は、それぞれ29.5±3.2%及び25.6±4.2
%であり、これは図15aに直接反映され得る。結果は、DP7-Cミセルが、PEI2
5Kおよびリポフェクタミン2000よりも高いsiRNAトランスフェクション効率を
有することを示す。
の1つである。正常細胞である293Tヒト胎児腎臓細胞株に対するDP7-Cミセルの
毒性を、細胞生存実験を通して検出した。293T細胞を96ウェルプレートに1ウェル
あたり3×103細胞の密度で置き、100μLのDMEM/20%FBS培地を各ウェ
ルに添加し、24時間インキュベートした。実験では、3群、即ち、DP7-C、PEI
25K、及びリポフェクタミン2000を設定し、各群はそれぞれ0、12.5、18.
75、25、37、50、75、100、150、及び200μg/mLの10種類の濃
度勾配を有した。細胞の生存はCCK-8法により検出した。24時間投与後、10μL
のCCK-8溶液を各ウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。各ウェルの
吸収値は、マイクロプレートリーダーによって630nm及び450nmの波長で検出し
た。標準曲線を描き、IC50を算出し、6群の並行実験の平均値を最終結果とした。
り、IC50は20μg/mL未満であるが、DP7-Cミセルは毒性が弱く、IC50
は200μg/mLを超え、従って安全である。
6マウスモデル
ス結腸癌腹膜転移モデルを確立し、DP7-Cを使用して、治療研究のために抗VEGF
siRNA治療遺伝子を伝達した。
mlの細胞懸濁液(約1×105個のC26細胞を含む)を腹腔内注射した。
(2)3日目に、マウスを各群8匹ずつ4群に無作為に分け、標識した。
(3)4群のマウスにそれぞれ、10用量の通常生理食塩水(ブランク対照群)、ブラン
クDP7-Cミセル(17.5μg)、DP7-C/無センス対照siRNA(スクラン
ブルsiRNA)複合体(17.5μg/3.5μg)、又はDP7-C/VEGF s
iRNA複合体(17.5μg/3.5μg)を腹腔内注射した。
(4)20日目に、対照群のマウスが既に非常に弱っているときに、全てのマウスを頸椎
脱臼により屠殺し、腹腔内の腫瘍組織、並びに心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織を
直ちに採取し、秤量し、分析した。また、各群のマウスの腹水も収集及び測定し、CD3
1免疫組織化学的染色を各実験群の腫瘍組織に対して行った。採取した心臓、肝臓、脾臓
、肺、及び腎臓の組織をHE染色で分析した。
EGF siRNA複合体の治療効果を示す図である。図17aは、各群の動物における
代表的なマウスの腹腔の写真である。これらのうち、平均腫瘍重量は、DP7-C/VE
GF siRNA複合体処理群では1.07±0.5g、通常生理食塩水対照群では8.
82±0.63g、無負荷DP7-C群では7.94±0.53g、DP7-C/無セン
ス対照siRNA複合体群では5.3±0.72gである(図17c)。腹腔内の転移性
腫瘍結節の数は、他の処理群と比較して、DP7-C/VEGF siRNA複合体で処
理したマウスでは有意に少ない。従って、DP7-C/VEGF siRNA複合体で処
理したマウスにおいて、腫瘍増殖は大きく阻害される。
る。平均腫瘍重量は、DP7-C/VEGF siRNA複合体処理群では0.2±0.
1mL、通常生理食塩水対照群では1.17±0.4mL、ブランクDP7-Cミセル群
では1.17±0.51mL、DP7-C/無センス対照siRNA複合体群では0.5
8±0.11mLである。DP7-C/VEGF siRNA複合体で処理していない各
群のマウスでは、腹水は明らかな血赤色を示し、これらの群のマウスは重篤な腸間膜損傷
を有することが確認された。他の実験群と比較して、DP7-C/VEGF siRNA
複合体は、C26腹膜転移腫瘍モデルの増殖と付随する深刻な腫瘍浸潤及び炎症の発生を
効果的に阻害する。
合体処理群が他の3つの実験群よりも腫瘍組織内の新規血管が少ないことを示しており、
DP7-Cが、抗VEGF siRNAの伝達によって腫瘍組織の血管形成を効果的に阻
害できたことが確認される(図17d)。一方、HE染色の結果(図17e)は、DP7
-Cミセルを腹腔内注射した後に主要な臓器組織において有意な病理学的変化は観察され
ず、DP7-Cに副作用がほとんどないことが確認される。
移植腫瘍モデル
ウス結腸がんの皮下移植腫瘍モデルを確立し、DP7-Cを使用して、治療研究のために
抗VEGF siRNA治療遺伝子を伝達した。
(1)0日目に、6~8週齢の雌性BALB/cマウスに0.1mLの細胞懸濁液(約1
.5×106個のC26細胞を含む)を皮下接種した。
(2)8日目に、腫瘍が触診可能になったとき、マウスを各群8匹ずつ4群に無作為に分
け、標識した。
(3)4群のマウスにそれぞれ、10用量の通常生理食塩水(ブランク対照群)、ブラン
クDP7-Cミセル(25μg)、DP7-C/無センス対照siRNA複合体(25μ
g/5μg)、又はDP7-C/VEGF siRNA複合体(25μg/5μg)を腫
瘍内注射した。
(4)20日目に、対照群のマウスが既に非常に弱っているときに、全てのマウスを頸椎
脱臼により屠殺し、腹腔内の腫瘍組織、並びに心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織を
直ちに採取し、秤量し、分析した。また、各群のマウスの腹水も収集及び測定し、CD3
1免疫組織化学的染色を各実験群の腫瘍組織に対して行った。採取した心臓、肝臓、脾臓
、肺、及び腎臓の組織をHE染色で分析した。
EGF siRNA複合体の治療効果を示す。図18aは、各群の動物におけるマウス皮
下腫瘍の写真を示す。これらのうち、平均腫瘍重量は、DP7-C/VEGF siRN
A複合体処理群では261.4±115.51mm3、通常生理食塩水対照群では577
.21±107.46mm3、ブランクDP7-Cミセル群では357.64±30.5
6mm3、DP7-C/無センス対照siRNA複合体群では474.43±120.6
7mm3である。DP7-C/VEGF siRNA複合体で処理したマウスの皮下腫瘍
の体積は、他の処理群の体積よりも有意に小さい(図18b)。従って、DP7-C/V
EGF siRNA複合体で処理したマウスにおいて、腫瘍増殖は大きく阻害される。
siRNA複合体処理群が他の3つの実験群よりも腫瘍組織内の新規血管が少ないことを
示しており、DP7-Cが、抗VEGF siRNAの伝達によって腫瘍組織の血管形成
を効果的に阻害できたことが確認される。一方、HE染色の結果(図18d)は、DP7
-Cミセルを腹腔内注射した後に、主要な臓器組織において有意な病理学的変化が観察さ
れないことを示し、DP7-Cに副作用がほとんどないことが確認される。
マウスモデル
黒色腫のB16マウスモデルを確立し、DP7-Cを使用して、治療研究のために抗VE
GF siRNA治療遺伝子を伝達した。
(1)0日目に、6~8週齢の雌性C57マウスに0.1mLの細胞懸濁液(約2.5×
105個のB16細胞を含む)を皮下接種した。
(2)3日目に、マウスを各群8匹ずつ4群に無作為に分け、標識した。
(3)7用量の通常生理食塩水(ブランク対照群)、ブランクDP7-Cミセル(60μ
g)、DP7-C /無センス対照siRNA複合体(60μg/12μg)、又はDP
7-C/VEGF siRNA複合体(60μg/12μg)を、それぞれ尾静脈を通じ
てマウスに注射した。
(4)20日目に、対照群のマウスが既に非常に弱っているときに、全てのマウスを頸椎
脱臼により屠殺し、肺、並びに心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織中の腫瘍組織を直
ちに採取し、秤量し、分析した。採取した心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織をHE
染色で分析した。
P7-C/VEGF siRNA複合体の治療効果を示す。図19aは、各群の動物にお
けるマウスの肺腫瘍の写真を示す。このうち、腫瘍結節の平均数は、DP7-C/VEG
F siRNA複合体処理群では30±12、通常生理食塩水対照群では172±16、
ブランクDP7-Cミセル群では132±22、DP7-C/無センス対照siRNA複
合体群では106±15である。更に、肺組織の平均重量は、DP7-C/VEGF s
iRNA複合体処理群では0.22±0.02g、通常生理食塩水対照群では0.52±
0.18g、ブランクDP7-Cミセル群では0.41±0.1g、DP7-C/無セン
ス対照siRNA複合体群では0.42±0.17gである。DP7-C/VEGF s
iRNA複合体で処理したマウスの肺における転移性腫瘍肺結節の数は、他の処理群のも
のよりも有意に少なく(図19a)、マウスの平均肺重量は、他の処理群のものよりも有
意に軽い(図19b)。従って、DP7-C/VEGF siRNA複合体で処理したマ
ウスにおいて、腫瘍増殖は大きく阻害される。
要な臓器組織において有意な病理学的変化が観察されないことを示し、DP7-Cに副作
用がほとんどないことが確認される。
Claims (32)
- 疎水性修飾が、抗菌ペプチドの窒素末端に疎水性フラグメントを結合させることであり、前記抗菌ペプチドのアミノ酸配列がVQWRIRVAVIRKであり、前記疎水性フラグメントがスクシニル化コレステロールである、疎水性修飾抗菌ペプチド。
- 前記抗菌ペプチドVQWRIRVAVIRKが、C末端アミド化によって修飾されてVQWRIRVAVIRK-NH2を生成する、請求項1に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
- 前記抗菌ペプチドの前記窒素末端が、疎水性セグメントの-CO-OHと抗菌ペプチドの-NH2とのアミド化反応によって疎水性セグメントに結合されている、請求項1又は2に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチドから調製されたミセル。
- 前記ミセルが、溶液中で前記疎水性修飾抗菌ペプチドから自己集合している、請求項6に記載のミセル。
- 前記ミセルが、核酸、小分子薬、又はタンパク質のうちの少なくとも1つを更に搭載している、請求項6又は7に記載のミセル。
- 抗菌薬の調製における、請求項1~5のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項6~8のいずれか1項に記載のミセルの使用。
- 抗菌薬が抗細菌剤又は抗真菌剤である、請求項9に記載の使用。
- 細菌が、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、大腸菌(Escherichia colibacillus)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumanmii)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、又はまたはチフス菌(Salmonella typhi)のうちの少なくとも1つである、請求項10に記載の使用。
- 真菌が、カンジダ・アルビカンス(Canidia Albicans)又はカンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)のうちの少なくとも1つである、請求項10に記載の使用。
- 抗菌薬が、主たる有効成分、即ち請求項1~5のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項6~8のいずれか一項に記載のミセルから調製される、抗菌薬。
- 他の抗菌薬を更に含む、請求項13に記載の抗菌薬。
- 前記他の抗菌薬が抗生物質である、請求項14に記載の抗菌薬。
- 前記抗生物質が、グリコペプチド系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、及びβ-ラクタム系抗生物質のうちの少なくとも1つである、請求項15に記載の抗菌薬。
- ペニシリン系抗生物質が、ペニシリンG、ペニシリンV、フルクロキサシリン、オキサシリン、アンピシリン、カルボキシベンジルペニシリン、ピバンピシリン、スルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、又はアモキシシリンのうちの少なくとも1つであり、セファロスポリン系抗生物質が、セファドロキシル、セファレキシン、セファゾリン、セフラジン、セフプロジル、セフロキシム、セファクロル、セファマンドール、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフィキシム、セフジニル、セフピロム、セフェピム、又はセフゾナムのうちの少なくとも1つである、請求項16に記載の抗菌薬。
- アミノグリコシド系抗生物質が、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネオマイシン、シソマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、リボザイム、ミクロノマイシン、又はアジスロマイシンのうちの少なくとも1つである、請求項16に記載の抗菌薬。
- ポリペプチド抗生物質が、バンコマイシン、ノルバンコマイシン、ポリミキシンB、又はテイコプラニンのうちの少なくとも1つである、請求項16に記載の抗菌薬。
- マクロライド系抗生物質が、エリスロマイシン、アルボマイシン、無臭エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、ジョサマイシン、又はアジスロマイシンのうちの少なくとも1つである、請求項16に記載の抗菌薬。
- 免疫アジュバントの調製における、請求項1~5のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項6~8のいずれか1項に記載のミセルの使用。
- 免疫アジュバントが主成分、即ち、請求項1~5のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項6~8のいずれか1項に記載のミセルから調製される、免疫アジュバント。
- 一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドCpG ODNを更に含む、請求項22に記載の免疫アジュバント。
- 疎水性修飾抗菌ペプチド対CpG ODNの比が1:0.5~1:5である、請求項22又は23に記載の免疫アジュバント。
- 核酸トランスポーターの調製における、請求項1~5のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項6~8のいずれか1項に記載のミセルの使用。
- 前記核酸がRNAである、請求項25に記載の使用。
- 前記核酸が、mRNA、RNA干渉のためのsiRNA、又はゲノム編集のためのsgRNAのうちの少なくとも1つである、請求項25記載の使用。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項6~8のいずれか1項に記載のミセルに搭載された核酸によって得られる、核酸トランスポーター。
- 前記核酸がRNAである、請求項28に記載の核酸トランスポーター。
- 前記核酸がmRNA、siRNA、又はsgRNAである、請求項28に記載の核酸トランスポーター。
- 前記疎水性修飾抗菌ペプチド対前記核酸の質量比が、1:1~20:1である、請求項28~30のいずれか1項に記載の核酸トランスポーター。
- a.請求項1~5のいずれか1項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチドの適切な量を秤量し、溶解するための溶液を添加し、自発的にミセルを形成する工程;又は溶液を形成するために請求項6~8のいずれか1項に記載のミセルを取る工程と、
b.ミセル溶液に核酸を添加し、室温でインキュベートする工程と、
を含む、請求項28~30のいずれか1項に記載の核酸トランスポーターの調製方法。
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