CN111588865A - 一种内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,由磷脂聚合物纳米颗粒外接抗菌肽组成,还提供制备方法,抗菌肽溶解于去离子水,悬浮在2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,加1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑N‑羟基琥珀酰亚胺,制备得到混合物c,制备磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液加入混合物c、20×磷酸缓冲盐溶液,摇床后透析,用聚乙二醇粉末吸水浓缩,得到内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的浓缩液;内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中。本发明的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物可增加药物抗菌活性,减少耐药菌株产生,对呼吸系统性病原菌、皮肤黏膜感染性病菌、消化系统性病原菌有抗菌作用。
Description
技术领域
本发明属于抗菌药物技术领域,具体涉及一种内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物及其制备方法。
背景技术
由于抗生素长期不合理使用导致动物食品中抗生素残留和细菌耐药性增加等问题日渐突出,严重威胁人类健康和畜牧业健康发展。因此,迫切需要寻找新的抗生素替代品。
抗菌肽是宿主基因编码的一类小分子活性多肽,能够抵御病原微生物入侵,是先天免疫系统的重要组成部分。一般由12-50个氨基酸组成,具有抗细菌、抗病毒、抗寄生虫、抗癌等多种生物学功能,被认为是抗生素的最佳替代品之一,但是单一的抗菌肽容易被体内的酶消化降解。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足,提供一种内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物及其制备方法,该内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物中抗生素和抗菌肽具有良好的协同作用,将抗生素和抗菌肽连接起来联合用药,可以增加药物的抗菌活性,减少耐药菌株的产生,对呼吸系统性病原菌、皮肤黏膜感染性病菌、消化系统性病原菌均有较好的抗菌作用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物由磷脂聚合物纳米颗粒外接抗菌肽组成,所述磷脂聚合物纳米颗粒由大豆卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2构成的外壳内包抗生素和聚乳酸-羟基乙酸共聚物而成;本发明中的所述抗生素和所述抗菌肽包括现有市售的所有抗生素和抗菌肽。
优选地,所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的粒径为0.3μm~13μm;所述磷脂聚合物纳米颗粒的粒径为0.05μm~1μm。
本发明还提供了一种制备上述的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的方法,该方法为:
S1、将吲哚菁绿、大豆磷酸酯、抗生素和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2溶于质量分数为4%的乙醇溶液中,得到混合溶液a;
S2、向S1中得到的混合溶液a中边搅拌边滴加聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液,得到混合溶液b;所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为4mg/mL;
S3、将S2中得到的混合溶液b放入透析袋中,用聚乙二醇粉末吸水浓缩,对透析袋内剩余的液体进行提纯和浓缩,当透析袋中的水体积少于5%时停止吸附,将透析袋中的剩余的液体收集到离心管,得到磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液;所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中;
S4、将抗菌肽溶解于去离子水中,再悬浮在pH为5.5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺,混合均匀后在温度为4℃的条件下放置15min,然后在温度为15℃~25℃、摇速为130rpm的摇床上活化15min,得到混合物c;
S5、将S3中得到的磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液加入至S4中得到的混合物c中,加入20×磷酸缓冲盐溶液至pH值为7.0~8.0时止,在室温的条件下、摇速为130rpm的摇床上摇2h,然后在温度为4℃的条件下放置12h,得到混合物d;
S6、将透析袋在温度为80℃的水中浸泡20min后,用超纯水冲洗,将S5中得到的混合物d放入处理后的透析袋中,置于超纯水中透析3h,每隔0.5h换水一次,透析的同时搅拌所述混合物d,透析结束后,用聚乙二醇粉末吸水浓缩,得到内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的浓缩液;所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中。
优选地,S1中所述混合溶液a中吲哚菁绿和大豆磷酸酯的浓度均为2.5mg/mL、抗生素和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2的浓度均为1mg/mL。
优选地,S2中所述混合溶液a和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液的体积比为8:1。
优选地,S2和S6中搅拌的速率均为750r/min~1000r/min。
优选地,S2中滴加的速率为5滴/min。
优选地,S4中所述抗菌肽、去离子水、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为10:1:37.5:7.5。
优选地,S5中所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液、混合物c和20×磷酸缓冲盐溶液的体积比为13:64:3.5。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
本发明以大豆卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2构成外壳将抗生素包裹在内,聚乳酸-羟基乙酸共聚物帮助抗生素稳定内包于大豆卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2构成外壳内。通过活化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2的氨基端,使抗菌肽与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2的氨基端相连接,从而完成抗生素和抗菌肽的联合。另外,本发明的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物中使用的抗生素和抗菌肽具有良好的协同作用,将抗生素和抗菌肽连接起来联合用药,可以增加药物的抗菌活性,减少耐药菌株的产生,对呼吸系统性病原菌、皮肤黏膜感染性病菌、消化系统性病原菌均有较好的抗菌作用,两者药物联合使用,抗菌肽对膜的破坏作用结合抗生素对细菌细胞壁合成的抑制作用,更是有望解决临床上一些易产生耐药性菌株的耐药问题,且将抗生素包裹后能有望延长抗生素的半衰期,减少给药次数和剂量,更有望解决临床上因使用抗生素所引起的肠道菌群紊乱等问题。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的扫描电镜图。
图2是实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的透射电镜图。
图3是实施例1的空白对照不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的扫描电镜图。
图4是实施例1的空白对照不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的透射电镜图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物由磷脂聚合物纳米颗粒外接抗菌肽组成,所述磷脂聚合物纳米颗粒由大豆卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2构成的外壳内包抗生素和聚乳酸-羟基乙酸共聚物而成;所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的粒径为0.3μm~13μm;所述磷脂聚合物纳米颗粒的粒径为0.05μm~1μm;本实施例使用的抗生素为氨苄西林,市购;使用的抗菌肽为蜂毒素MPX,市购。
本实施例还提供了一种制备上述的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的方法,该方法为:
S1、将吲哚菁绿、大豆磷酸酯、抗生素和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2溶于质量分数为4%的乙醇溶液中,得到混合溶液a;所述混合溶液a中吲哚菁绿和大豆磷酸酯的浓度均为2.5mg/mL、抗生素和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2的浓度均为1mg/mL;
S2、向S1中得到的混合溶液a中边以速率为750r/min搅拌边以5滴/min的速率滴加聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液,得到混合溶液b;所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为4mg/mL;所述混合溶液a和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液的体积比均为8:1;
S3、将S2中得到的混合溶液b放入透析袋中,用聚乙二醇粉末PEG20000吸水浓缩,对透析袋内剩余的液体进行提纯和浓缩,当透析袋中的水体积少于5%时停止吸附,将透析袋中的剩余的液体收集到离心管,得到磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液;所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中;
S4、将抗菌肽溶解于去离子水中,再悬浮在pH为5.5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺,混合均匀后在温度为4℃的条件下放置15min,然后在温度为15℃、摇速为130rpm的摇床上活化15min,得到混合物c;所述抗菌肽、去离子水、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为10:1:37.5:7.5;
S5、将S3中得到的磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液加入至S4中得到的混合物c中,加入20×磷酸缓冲盐溶液至pH值为7.0~8.0时止,在室温的条件下、摇速为130rpm的摇床上摇2h,然后在温度为4℃的条件下放置过夜12h,得到混合物d;所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液、混合物c和20×磷酸缓冲盐溶液的体积比为13:64:3.5;
S6、将透析袋在温度为80℃的水中浸泡20min后,用超纯水冲洗,将S5中得到的混合物d放入处理后的透析袋中,置于超纯水中透析3h,每隔0.5h换水一次,透析的同时以速率为750r/min搅拌所述混合物d,透析结束后,用聚乙二醇粉末PEG20000吸水浓缩,在透析袋外壁吸附透析袋内的未反应物,得到内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的浓缩液;所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中。
本实施例同时设置不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒作为空白对照,该不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的制备方法为:
S1、将吲哚菁绿、大豆磷酸酯和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2溶于质量分数为4%的乙醇溶液中,得到混合溶液a';所述混合溶液a'中吲哚菁绿和大豆磷酸酯的浓度均为2.5mg/mL、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2的浓度为1mg/mL;
S2、向S1中得到的混合溶液a'中边以速率为750r/min搅拌边以5滴/min的速率滴加聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液,得到混合溶液b';所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为4mg/mL;所述混合溶液a'和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液的体积比均为8:1;
S3、将S2中得到的混合溶液b'放入透析袋中,用聚乙二醇粉末PEG20000吸水浓缩,对透析袋内剩余的液体进行提纯和浓缩,当透析袋中的水体积少于5%时停止吸附,将透析袋中的剩余的液体收集到离心管,得到不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液;所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中。
将本实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物和空白对照中的不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液分别用1×磷酸缓冲盐溶液稀释10倍后,分别滴加至无菌硅片上,硅片自然晾干后用离子溅射仪喷金,扫描电子显微镜进行结果观察。同时对本实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物和空白对照中的不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液分别进行样品处理,采用透射电子显微镜进行观察。图1-2分别是本实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的扫描电镜图和透射电镜图,图3-4分别是本实施例1的空白对照不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的扫描电镜图和透射电镜图。由图1可知,内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物是一个球形体,由于内包抗生素外联抗菌肽,扫描电镜图中球状外表能明显观察到包裹有一层物质,为外联的抗菌肽;同时用了比扫描电镜更加精准的透射电镜对内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物进行扫描,由图2可知,内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物为纳米级,粒径约为400nm;而由图3可知,不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒粒径较小且表面光滑;由图4可知,图中显示的3个球形微粒即为不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒,且粒径较小,约为100nm。通过图1和图3扫描电镜结果的对比我们发现,内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的粒径约为10μm,不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的粒径较小,约为1μm,而图2和图4透射电镜结果中两者大小的差距也很明显,内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物和不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的粒径分别约为400nm和100nm。说明实施例中成功地把抗生素包裹把抗菌肽连接上了。另外,图1中球状图像的表面能明显观察到包裹有一层物质,而图3中球状体表现比较光滑,且形状更加的规整,也可以证明实施例中成功地把抗生素包裹把抗菌肽连接上了。
抑菌活性试验:
一、实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物中抗菌肽和抗生素的联合抑菌活性:
将实施例1制备内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物中所用到的抗菌肽和抗生素采用双层琼扩测定抑菌活性,在超净工作台内用接种环挑取单克隆猪胸膜肺炎放线杆菌在BHI(脑心浸液肉汤)液体培养基中培养,在温度为37℃、摇速为180rpm的摇床上培养10h,然后将浓度为50μg/mL的菌液于15mL的BHI液体培养基继续活化4h后,将菌液在转速为8000rpm的条件下离心5min,弃去上清液,将沉淀物用磷酸缓冲盐溶液洗2次后,加入5mL的磷酸缓冲盐溶液重悬菌液,在培养温度为50℃的条件下,将每15mL的琼脂培养基加入约50μL的菌液混匀倒板,待琼脂培养基凝固后使用打孔器打孔,分别滴加浓度为1mg/mL的抗菌肽水溶液和浓度为1mg/mL的抗生素水溶液于药品敏片(药品敏片,市购)上,将平板放在温度为37℃的恒温培养箱倒置培养3h,再加一层覆盖琼脂培养基,将平板正置于温度为37℃的恒温箱过夜培养,并记录各孔抑菌圈直径。抑菌圈直径测量结果为2.8cm,说明抗菌肽和抗生素具有协同作用。
二、实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的抑菌活性:
将实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物采用改良微量肉汤稀释法测量抗菌活性,测定本实施例制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物对呼吸系统性病原菌(胸膜肺炎放线杆菌)、皮肤黏膜感染性病菌(金黄色葡萄球菌)和消化系统性病原菌(大肠埃希氏菌)的抗菌效果:
(1)试验1:实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌效果。
将内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的浓缩液用1×磷酸缓冲盐溶液定容至1.3mL,作为最终获得的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,将实施例1的空白对照中得到不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液用1×磷酸缓冲盐溶液稀释定容至1.3mL,作为最终获得的不含抗生素药物的磷脂聚合物纳米颗粒,作为的空白对照;
添加空白对照是因为抗生素和抗菌肽作为药物是对细菌有抑菌作用的,为了排除是抗生素之外的添加材料(即除了药物的复合物原材料)对菌产生的杀菌作用的影响,主要目的就是消除非药物成分的杀菌活性干扰。
将活化过后的胸膜肺炎放线杆菌菌液稀释涂板计数,使胸膜肺炎放线杆菌的数量达到2×105CFU/mL,将第一个96孔板中每孔加入100μL的胸膜肺炎放线杆菌菌悬液至第11排,随后吸取100μL的最终获得的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物添加到第一排孔中,反复吹打混匀,尽量不要有气泡,从第一排孔中吸取100μL至第二排,吹打混匀,重复以上操作稀释至第10排,将50μL的稀释后的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物与50μL的空白培养基混匀,添加于第12排,作空白对照,将96孔板置于37℃培养箱中培养16h~18h,命名为试验组a;
将第二个96孔板中每孔加入100μL的胸膜肺炎放线杆菌菌悬液至第11排,随后吸取100μL的最终获得的不含抗生素的磷脂聚合物纳米颗粒添加到第一排孔中,反复吹打混匀,尽量不要有气泡,从第一排孔中吸取100μL至第二排,吹打混匀,重复以上操作稀释至第10排,将50μL的稀释后的磷脂聚合物纳米颗粒与50μL的空白培养基混匀,添加于第12排,作空白对照,将96孔板置于37℃培养箱中培养16h~18h,命名为阴性对照组a;
培养结束后,试验组a澄清至第7孔,对照组a无澄清孔,说明试验组对胸膜肺炎放线杆菌有抑菌效果,试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对胸膜肺炎放线杆菌无明显抑菌作用,排除了试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对胸膜肺炎放线杆菌的抑菌活性的影响。
(2)试验2:实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。
试验方法同试验1,不同之处为:试验1试验组a的胸膜肺炎放线杆菌替换为金黄色葡萄球菌,命名为试验组b;试验1对照组a的胸膜肺炎放线杆菌替换为黄色葡萄球菌,命名为对照组b。
培养结束后,试验组b澄清至第6孔,对照组b无澄清孔,说明试验组对金黄色葡萄球菌有抑菌效果,试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对金黄色葡萄球菌无明显抑菌作用,排除了试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对金黄色葡萄球菌的抑菌活性的影响。
(3)试验3:实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物对大肠埃希氏菌的抗菌效果。
试验方法同试验1,不同之处为:试验1试验组a的胸膜肺炎放线杆菌替换为大肠埃希氏菌,命名为试验组c;试验1对照组a的胸膜肺炎放线杆菌替换为大肠埃希氏菌,命名为对照组c。
培养结束后,试验组b澄清至第7孔,对照组c无澄清孔,说明试验组对大肠埃希氏菌有抑菌效果,试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对大肠埃希氏菌无明显抑菌作用,排除了试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对大肠埃希氏菌的抑菌活性的影响。
综上所述,实施例1制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物抗菌效果良好,对呼吸系统性病原菌、皮肤黏膜感染性病菌、消化系统性病原菌均有较好的抗菌作用。
实施例2
本实施例的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物由磷脂聚合物纳米颗粒外接抗菌肽组成,所述磷脂聚合物纳米颗粒由大豆卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2构成的外壳内包抗生素和聚乳酸-羟基乙酸共聚物而成;所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的粒径为0.3μm~13μm;所述磷脂聚合物纳米颗粒的粒径为0.05μm~1μm;本实施例使用的抗生素为氧氟沙星,市购;使用的抗菌肽为BSN37,市购。
本实施例还提供了一种制备上述的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的方法,该方法为:
S1、将吲哚菁绿、大豆磷酸酯、抗生素和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2溶于质量分数为4%的乙醇溶液中,得到混合溶液a;所述混合溶液a中吲哚菁绿和大豆磷酸酯的浓度均为2.5mg/mL、抗生素和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2的浓度均为1mg/mL;
S2、向S1中得到的混合溶液a中边以速率为1000r/min搅拌边以5滴/min的速率滴加聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液,得到混合溶液b;所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为4mg/mL;所述混合溶液a和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液的体积比为8:1;
S3、将S2中得到的混合溶液b放入透析袋中,用聚乙二醇粉末PEG20000吸水浓缩,对透析袋内剩余的液体进行提纯和浓缩,当透析袋中的水体积少于5%时停止吸附,将透析袋中的剩余的液体收集到离心管,得到磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液;所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中;
S4、将抗菌肽溶解于去离子水中,再悬浮在pH为5.5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺,混合均匀后在温度为4℃的条件下放置15min,然后在温度为25℃、摇速为130rpm的摇床上活化15min,得到混合物c;所述抗菌肽、去离子水、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为10:1:37.5:7.5;
S5、将S3中得到的磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液加入至S4中得到的混合物c中,加入20×磷酸缓冲盐溶液至pH值为7.0~8.0时止,在室温的条件下、摇速为130rpm的摇床上摇2h,然后在温度为4℃的条件下放置过夜12h,得到混合物d;所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液、混合物c和20×磷酸缓冲盐溶液的体积比为13:64:3.5;
S6、将透析袋在温度为80℃的水中浸泡20min后,用超纯水冲洗,将S5中得到的混合物d放入处理后的透析袋中,置于超纯水中透析3h,每隔0.5h换水一次,透析的同时以速率为1000r/min搅拌所述混合物d,透析结束后,用聚乙二醇粉末PEG20000吸水浓缩,在透析袋外壁吸附透析袋内的未反应物,得到内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的浓缩液;所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中。
抑菌活性试验:实施例2制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的抑菌活性:
将实施例2制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物采用改良微量肉汤稀释法测量抗菌活性,测定本实施例制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物对消化系统性病原菌(大肠杆菌、沙门氏菌)的抗菌效果:
(1)试验1:实施例2制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物对大肠杆菌的抗菌效果。
试验方法同实施例1中的试验1,不同之处为:实施例1中的试验1试验组a的胸膜肺炎放线杆菌替换为大肠杆菌,实施例1最终获得的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物替换为实施例2最终获得的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,命名为试验组d;实施例1中试验1对照组a的胸膜肺炎放线杆菌替换为大肠杆菌,命名为对照组d。培养结束后,试验组d澄清至第6孔,对照组d无澄清孔,说明试验组对大肠杆菌有抑菌效果,试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对大肠杆菌无明显抑菌作用,排除了试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对大肠杆菌的抑菌活性的影响。
(2)试验2:实施例2制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物对沙门氏菌的抗菌效果。
试验方法同实施例1中的试验1,不同之处为:实施例1中的试验1试验组a的胸膜肺炎放线杆菌替换为沙门氏菌,实施例1最终获得的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物替换为实施例2最终获得的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,命名为试验组e;实施例1中试验1对照组a的胸膜肺炎放线杆菌替换为沙门氏菌,命名为对照组e。
培养结束后,试验组e澄清至第5孔,对照组e无澄清孔,说明试验组对沙门氏菌有抑菌效果,试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对沙门氏菌无明显抑菌作用,排除了试验添加的除抗生素和抗菌肽外的其他原材料对沙门氏菌的抑菌活性的影响。
本实施例制备的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物抗菌效果良好,对消化系统性病原菌具有较好的抗菌作用,也同时说明了本发明中内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的制备方法是通用的,大多数抗生素和抗菌肽均可通过此方法进行联合使用。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化,均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (9)
1.一种内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,其特征在于,所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物由磷脂聚合物纳米颗粒外接抗菌肽组成,所述磷脂聚合物纳米颗粒由大豆卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2构成的外壳内包抗生素和聚乳酸-羟基乙酸共聚物而成。
2.根据权利要求1所述的一种内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物,其特征在于,所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的粒径为0.3μm~13μm;所述磷脂聚合物纳米颗粒的粒径为0.05μm~1μm。
3.一种制备如权利要求1或2所述的内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的方法,其特征在于,该方法为:
S1、将吲哚菁绿、大豆磷酸酯、抗生素和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2溶于质量分数为4%的乙醇溶液中,得到混合溶液a;
S2、向S1中得到的混合溶液a中边搅拌边滴加聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液,得到混合溶液b;所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为4mg/mL;
S3、将S2中得到的混合溶液b放入透析袋中,用聚乙二醇粉末吸水浓缩,对透析袋内剩余的液体进行提纯和浓缩,当透析袋中的水体积少于5%时停止吸附,将透析袋中的剩余的液体收集到离心管,得到磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液;所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中;
S4、将抗菌肽溶解于去离子水中,再悬浮在pH为5.5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺,混合均匀后在温度为4℃的条件下放置15min,然后在温度为15℃~25℃、摇速为130rpm的摇床上活化15min,得到混合物c;
S5、将S3中得到的磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液加入至S4中得到的混合物c中,加入20×磷酸缓冲盐溶液至pH值为7.0~8.0时止,在室温的条件下、摇速为130rpm的摇床上摇2h,然后在温度为4℃的条件下放置12h,得到混合物d;
S6、将透析袋在温度为80℃的水中浸泡20min后,用超纯水冲洗,将S5中得到的混合物d放入处理后的透析袋中,置于超纯水中透析3h,每隔0.5h换水一次,透析的同时搅拌所述混合物d,透析结束后,用聚乙二醇粉末吸水浓缩,得到内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物的浓缩液;所述内包抗生素外联抗菌肽纳米复合物分散保存在1×磷酸缓冲盐溶液中。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,S1中所述混合溶液a中吲哚菁绿和大豆磷酸酯的浓度均为2.5mg/mL、抗生素和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2的浓度均为1mg/mL。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,S2中所述混合溶液a和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙腈溶液的体积比为8:1。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,S2和S6中搅拌的速率均为750r/min~1000r/min。
7.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,S2中滴加的速率为5滴/min。
8.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,S4中所述抗菌肽、去离子水、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为10:1:37.5:7.5。
9.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,S5中所述磷脂聚合物纳米颗粒的浓缩液、混合物c和20×磷酸缓冲盐溶液的体积比为13:64:3.5。
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