CN116262138A - 一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体及其制备方法与应用。本发明提供的一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体，该外泌体载体由核部分和壳部分组成；所述核部分为外泌体负载药物组成；所述壳部分为含钙磷的无机盐。它的制备方法，包括如下步骤：将所述外泌体与所述药物在细胞培养基中共孵育或超声，然后离心；取所述离心后的沉淀加入含钙磷的无机盐溶液进行真空干燥或继续孵育，即得到具有核壳结构的pH响应型外泌体载体。本发明核壳结构具有缓释功能和pH敏感性，在感染或肿瘤等酸性环境中能响应性降解；磷酸钙外壳能促进硬组织修复，参与骨修复重建；此外，外泌体本身也具有生物学功能和治疗作用。

Description

一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体及其制备方法与应用，属于生物医药领域。
背景技术
常见的载体主要分为病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要包括逆转录病毒、腺病毒等。病毒载体虽然转染效率高，但在临床应用中存在着安全性问题，如致突变、致癌、致畸、高免疫反应、致细胞病变等，病毒载体的临床应用受很大的限制。在非病毒载体中，近年来研究较多的是聚合物和脂质体两大类。常见的聚合物如聚合物胶束、聚合物胶囊、聚合物纳米球等，具有细胞毒性高、有机溶剂残留、容易被单核吞噬系统快速清除等缺点。阳离子脂质体具有细胞毒性，其携带的正电荷破坏细胞膜结构，在血液系统中，会产生溶血现象。而且电荷越大，细胞毒性越大。因此，越来越多的研究关注在细胞或亚细胞结构的载体上，特别是细胞来源的外泌体受到了广泛的关注。
细胞外囊泡是目前细胞释放的一类天然纳米级载体。外泌体是由细胞通过多泡体与细胞膜融合而分泌的40-150nm的膜包裹的囊泡，具有脂质双层膜。外泌体是一种很有前途的药物递送系统，具有高生物相容性、高效率和低免疫原性。许多体外和体内研究显示了外泌体独特的靶向能力。外泌体能够克服自然障碍，利用内源性机制摄取、细胞内转运并随后在亲本细胞中传递其内容物。此外，外泌体的主要功能还通过其包含的DNA、RNA和蛋白质来传递信号分子，发挥促修复等功能。因此，外泌体因其体积优势和在药物治疗方面的巨大潜力，成为生物医学和生物材料领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体及其制备方法与应用。核壳结构具有缓释功能和pH敏感性，在感染或肿瘤等酸性环境中能响应性降解；磷酸钙外壳能促进硬组织修复，参与骨修复重建；此外，外泌体本身也具有生物学功能和治疗作用。
由于外泌体这一细胞囊泡，容易被各种细胞内吞，为了让外泌体在特定区域发挥其功能并释放药物，本发明在外泌体外层包裹了磷酸钙外壳，使其在感染或肿瘤等酸性环境中响应性降解，具有智能释放的载体。本发明的壳核结构的外泌体载体，核部分由外泌体负载药物组成，壳部分为磷酸钙，具有生物安全性高的特点。外壳磷酸钙在酸性环境中响应性降解，智能释放药物，且发挥外泌体的组织修复、细胞再生等作用；在骨组织中，磷酸钙是生物硬组织中最重要的无机成分，在胶原纤维的矿化过程中起着重要的作用，有助于骨组织的生理特性。
本发明提供的一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体，该外泌体载体由核部分和壳部分组成；
所述核部分为外泌体负载药物组成；
所述壳部分为含钙磷的无机盐。
上述的外泌体载体中，所述壳部分的厚度可为100nm～200nm，具体可为110nm～200nm；
所述外泌体负载药物的载药量可为10％～50％，具体可为19.1％±1.46％。
上述的外泌体载体中，所述外泌体来源包括细胞和/或体液。
上述的外泌体载体中，所述外泌体来源包括细胞和/或体液。
上述的外泌体载体中，所述细胞包括人、大鼠或小鼠等来源的干细胞、巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞中的至少一种。
上述的外泌体载体中，所述药物包括抗生素、核酸(包括miRNA、siRNA、mRNA等)、蛋白质和多肽中的至少一种；
所述含钙磷的无机盐包括磷酸钙。
本发明还提供了上述的具有核壳结构的pH响应型外泌体载体的制备方法，包括如下步骤：将所述外泌体与所述药物在细胞培养基中共孵育或超声，然后离心；取所述离心后的沉淀加入含钙磷的无机盐溶液进行真空干燥或继续孵育，即得到具有核壳结构的pH响应型外泌体载体。
上述的制备方法中，所述外泌体的制备如下：将细胞或体液差速离心，收集得到所述外泌体。
本发明中，所述外泌体的一个制备例子中，采用细胞进行所述差速离心的具体步骤如下：300g，4℃离心15min去除死细胞；3000g，4℃离心15min去除细胞碎片；10000g，4℃离心70min去除其他大细胞外囊泡；0.22μm滤器过滤，120000g，4℃离心120min，去除上清，沉淀即为外泌体，适量NaCl重悬外泌体，-80℃冰箱保存备用。
上述的制备方法中，所述外泌体与药物孵育的时间为1～5小时，反应温度为37℃；
超声方法：所述外泌体与所述药物混合，在冰浴条件下将超声探头没入混合液内超声；所述超声可为10个周期，设置条件500v，2kHz；
所述离心的离心力可为5000g～20000g，具体可为14000g，所述离心的时间可为5～20min，具体可为10min；所述离心具体采用100kDa的超滤管进行，以离心去除未结合药物。
上述的制备方法中，在所述含钙磷的无机盐溶液孵育时间为1～5小时，反应温度为37℃。
上述的制备方法中，所述外泌体的浓度可为0.1mg/ml～100mg/ml；
所述药物的浓度可为0.1mg/ml～100mg/ml；
所述含钙磷的无机盐溶液的浓度可为1mmol～100mol；
所述外泌体、所述药物、所述含钙磷的无机盐的质量比可为1～3：1：0.001～3，具体可为1：1：1.11、1～1.5：1：0.001～1.5、1～2：1：0.001～2或1～2.5：1：0.01～1.5。
本发明中，所述外泌体、所述药物、所述含钙磷的无机盐的浓度均为加入体系之前的浓度。
上述的制备方法中，在所述含钙磷的无机盐溶液孵育后还包括如下后处理的步骤：离心和/或沉淀用缓冲液洗涤。
所述含钙磷的无机盐具体为磷酸钙。
上述的制备方法中，所述离心的转速具体可为5000g～20000g，更具体可为14000g，离心的时间为5～20min；
所述缓冲液具体可包括生理盐水和/或PBS缓冲液；
所述洗涤次数可为1～6次，具体可为3次。
本发明所述的具有核壳结构的pH响应型外泌体载体应用于制备治疗炎症疾病、癌症、创面愈合和感染性疾病中任一种的药物中。
本发明具有以下优点：
1、本发明通过磷酸钙在生物体表面沉积生物矿化的方法得到一种具有核壳结构的外泌体。
2、通过磷酸钙层的结晶阻挡了内部药物扩散，从而实现药物的缓释和保护。
3、本方法对外泌体进行保护，使其不会随意被其他细胞内吞，而且达到了pH敏感性响应型释放的效果，因为磷酸钙在酸性环境下能够快速降解，在一些病变组织中，如感染、肿瘤、炎症组织，pH值在6.5-5.5之间，在病变组织中能达到pH敏感性响应型释放。
4、当载体用于骨组织中时，因为磷酸钙是骨组织中的主要成分，有助于生物矿化，参与骨组织重建，因此具有促进骨修复的作用。
5、外泌体本身也具有一定的作用，外泌体携带的一些物质如DNA、RNA和蛋白质，对某些病变也有治疗作用。
6、外泌体来源于细胞，人体内含有磷酸钙的成分，因此本发明具有更高的生物安全性，在血液中的稳定性较高。
7、本发明外泌体的膜表面来自细胞，这种结构有利于避免被网状内皮系统捕获，具有较长的血液半衰期。
8、本发明外泌体的免疫原性极低，细胞毒性低，解决了病毒载体的生物安全的问题。
附图说明
图1为TEM观察外泌体形态。
图2为Western Blot检测外泌体特异蛋白表达。
图3为核壳结构外泌体载体在不同pH PBS条件下的药物释放情况。
图4为不同pH值下生理盐水缓冲液孵育12h后壳核结构外泌体的大小变化。
图5为壳核结构外泌体稳定性研究结果。
图6为壳核结构外泌体抗菌性能实验结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、矿化骨髓间充质干细胞来源外泌体负载万古霉素的制备及表征
(1)骨髓间充质干细胞在加体积分数10％胎牛血清(Gibco公司，货号：16000-044)和1％含100U/ml青霉素-0.1mg/ml链霉素抗生素的α-MEM培养基(Hyclone公司，货号：SH30256.01)中培养。生长至细胞密度70％～80％后，将培养基换至体积分数5％无外泌体血清培养基(SBI公司，货号：EXO-FBS-50A-1)，继续常规培养48h；收集细胞上清液差速超速离心。具体步骤如下：300g，4℃离心15min去除死细胞；3000g，4℃离心15min去除细胞碎片；10000g，4℃离心70min去除其他大细胞外囊泡；0.22μm滤器过滤，120000g，4℃离心120min，去除上清，沉淀即为外泌体，适量NaCl重悬外泌体，-80℃冰箱保存备用。BCA蛋白浓度试剂盒(商购于Thermofisher scientific公司，货号：23225)检测外泌体浓度。
透射电镜(TEM)观察外泌体形态，外泌体用体积百含量为1％戊二醛固定15分钟，将外泌体放置在200目铜网上，用体积百含量为2％醋酸铀酰染色30秒，之后用PBS洗涤两次，使用120kV的透射电子显微镜下获得图像，100nm左右，如图1所示；如图2所示，通过纳米粒度分析仪(Malvern Zetasizer Nano ZS90)检测粒径分布，结果显示粒径大小为55.52±1.02nm，zeta电位为﹣6.34±0.93mV；Western blot检测外泌体标志蛋白CD63和TSH101的表达，结果显示与细胞总蛋白相比，外泌体表达的CD63和TSH101蛋白表达水平更高。
(2)将质量比等量的外泌体(1mg/ml)和万古霉素(1mg/ml)共混于1mLα-MEM培养基(Gibco公司)中，37℃孵育2小时，超滤管14000g离心10分钟，去除未结合药物，之后加入10μl CaCl2(1mol/L)继续37℃孵育2小时(添加的氯化钙和α-MEM培养基中的磷生成的磷酸钙，外泌体、万古霉素与磷酸钙质量比1:1:1.11)。孵育结束后14000g离心10分钟，用超纯水洗3次。矿化的外泌体负载万古霉素用生理盐水或超纯水重悬，得到矿化骨髓间充质干细胞来源外泌体负载万古霉素，即为具有核壳结构的pH响应型外泌体载体(简称矿化EXO万古霉素)。
(3)万古霉素标准曲线的测定：利用HPLC法测定万古霉素的含量。称取万古霉素，DMSO溶解配成1mg/ml储液，配成0.5,1，2，4，10，20，50，100μg/ml的万古霉素溶液。紫外检测波长240nm，进样量20μl。以样品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标。回归方程为y＝102.1x+13.5，r＝0.9993(n＝5)。
载药量测定：HPLC测定万古霉素载药量。矿化EXO万古霉素溶液加入等体积乙腈，按标准曲线条件检测。公式计算载药率：载药率(％)＝(万古霉素/矿化EXO万古霉素)×100％。载药率为29.1％±1.46％，载药率指的是重量百分含量计。
(4)矿化EXO万古霉素体外释放量测定：使用透析袋测定矿化EXO万古霉素的体外释放。将矿化EXO万古霉素装入透析袋中，置于37℃，40rpm转速恒温摇床水浴。分别放置于不同pH的释放环境，pH7.4的磷酸盐缓冲液和pH5.5的磷酸盐缓冲液，如图3所示。
通过图3可知，低pH条件下，矿化EXO万古霉素能快速释放，且成时间依赖的方式释放。
(5)不同pH值大小变化：将矿化EXO万古霉素在pH7.4和Ph5.5生理盐水中孵育12小时后，用纳米粒径分析仪检测粒径大小变化，结果如图4所示。由图4中结果显示，纳米颗粒的尺寸从200nm减小到110nm左右。表明矿化EXOLL-37外壳矿化层在轻度酸性感染微环境下可快速降解。
实施例2、矿化人脐静脉血管内皮细胞来源外泌体负载阿霉素制备
人脐静脉内皮细胞(HUVECs，购于武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0122)培养于含10％胎牛血清、1％抗生素、1％生长因子的ECM培养基(Sciencell公司)。以1:4传代，每两天换一次液，生长至70％-80％后，将培养基换至5％无外泌体血清培养基，继续常规培养48h；收集细胞上清液差速超速离心。具体步骤如下：300g，4℃离心15min去除死细胞；3000g，4℃离心15min去除细胞碎片；10000g，4℃离心70min去除其他大细胞外囊泡；0.22μm滤器过滤，120000g，4℃离心120min，去除上清，沉淀即为外泌体，适量NaCl重悬外泌体，-80℃冰箱保存备用。
外泌体和阿霉素共混于1mL ECM培养基中，37℃孵育2小时，之后加入10μlCaCl2(5mmol)继续37℃孵育2小时。孵育结束后14000g离心10分钟，用超纯水洗3次。矿化的外泌体负载阿霉素，用生理盐水或超纯水重悬，得到矿化人脐静脉血管内皮细胞来源外泌体负载阿霉素(即具有核壳结构的pH响应型外泌体载体)。
实施例3、壳核结构外泌体稳定性能、生物安全性和抗菌性能
(1)将壳核结构外泌体分散在生理盐水中，用DLS(Nanoseries,Malvern)测量1-7天的大小变化情况，所得数据用Zetasizer软件进行分析，结果如图5所示。由图5中结果显示壳核结构外泌体在生理盐水中至少1周稳定，说明其稳定性能好。
(2)细胞毒性实验：取对数生长BMSCs细胞，制备1×104个/孔加入96孔板中，置于5％CO2，37℃培养箱过夜。将不同浓度的外泌体、矿化EXO万古霉素加入培养板中，5％CO2，37℃培养72h后加入10μl CCK-8试剂，孵育3h，震荡1分钟，用全波长酶标仪测定450nm处吸光度。细胞活力(％)＝(处理组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100％。各组细胞存活率均大于96％，10-300μg/ml浓度的矿化EXO万古霉素对细胞无毒性，说明其具有良好的细胞相容性。
(3)抗菌测试：用大肠杆菌(eccherichia coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)来评估其防止生物被膜形成的能力。大肠杆菌在营养肉汤中，置于37℃120rpm的摇床上培养12小时至对数生长。将菌液在转数8000rpm下离心，再悬于灭菌营养肉汤中，浓度为1×103或1×106CFU ml-1，接种于10cm培养皿中，结果如图6所示。由图6中结果显示，与空白对照组相比，矿化EXO万古霉素组细菌数量显著降低，说明其具有良好的抗菌性能。

Claims (10)

1.一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体，其特征在于：该外泌体载体由核部分和壳部分组成；
所述核部分为外泌体负载药物组成；
所述壳部分为含钙磷的无机盐。
2.根据权利要求1所述的外泌体载体，其特征在于：所述壳部分的厚度为100nm～200nm；
所述外泌体负载药物的载药量为10％～50％。
3.根据权利要求1或2所述的外泌体载体，其特征在于：所述外泌体来源包括细胞和/或体液；
所述细胞包括人、大鼠或小鼠来源的干细胞、巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞中的至少一种；
所述药物包括抗生素、核酸、蛋白质和多肽中的至少一种；
所述含钙磷的无机盐包括磷酸钙。
4.权利要求1-3中任一项所述的具有核壳结构的pH响应型外泌体载体的制备方法，包括如下步骤：将所述外泌体与所述药物在细胞培养基中共孵育或超声，然后离心；取所述离心后的沉淀加入含钙磷的无机盐溶液进行真空干燥或继续孵育，即得到具有核壳结构的pH响应型外泌体载体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述外泌体的制备如下：将细胞和/或体液差速离心，收集得到所述外泌体。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述外泌体与药物孵育的时间为1～5小时，反应温度为37℃；
所述超声按照包括如下步骤的方法进行：所述外泌体与所述药物混合，在冰浴条件下将超声探头没入混合液内超声；所述超声为10个周期，设置条件500v，2kHz；
所述离心的离心力为5000g～20000g，所述离心的时间为5～20min。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：在所述CaCl2溶液孵育时间为1～5小时，反应温度为37℃。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述外泌体的浓度为0.1mg/ml～100mg/ml；
所述药物的浓度为0.1mg/ml～100mg/ml；
所述含钙磷的无机盐溶液溶液的浓度为1mmol～100mol；
所述外泌体、所述药物、所述含钙磷的无机盐的质量比为1～3:1：0.001～3。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述方法中，在所述含钙磷的无机盐溶液孵育后还包括如下后处理的步骤：离心和/或沉淀用缓冲液洗涤；
所述离心的转速具体为5000g～20000g，所述离心的时间可为5～20min；
所述缓冲液具体包括生理盐水和/或PBS缓冲液；
所述洗涤次数为1～6次。
10.权利要求1-3中任一项所述的具有核壳结构的pH响应型外泌体载体在制备治疗炎症疾病、癌症、创面愈合和感染性疾病中任一种的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117138123A (zh) * 2023-11-01 2023-12-01 北京大学口腔医学院 一种具有类骨结构的微米生物材料及其制备方法和应用

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