WO2006112477A1

WO2006112477A1 - アジュバントとしてのポリアミノ酸

Info

Publication number: WO2006112477A1
Application number: PCT/JP2006/308218
Authority: WO
Inventors: Mitsuru Akashi; Masanori Baba
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2006-04-19
Publication date: 2006-10-26
Also published as: EP1872793A4; US7785612B2; US20090285901A1; US8017154B2; EP1872793A1; US20090092633A1; JP5050144B2; EP1872793B1; ES2396240T3; JPWO2006112477A1

Abstract

　本発明は、アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用、ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法、アジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチン、ウイルス抗原を固定化した生分解性ナノ粒子、およびそれを含むワクチンを提供する。

Description

明細書技術分野

[0001] 本発明は、アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用、ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法、ならびにアジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチンに関する。さらに、本発明は、抗原を固定ィ匕したナノ粒子、およびそのワクチンとしての使用にも関する。

背景技術

[0002] ウィルス性疾患をはじめとする種々の疾患の予防および治療のために、様々なワクチンが開発され用いられている。しかし、ウィルス蛋白質などの抗原を単独で生体に投与したとしても、抗原分子は生体内安定性に乏しく細胞への取り込み効率が不十分なため、現行のワクチン療法では適当な粒子状キャリアーや免疫賦活物質 (アジュバント）とェマルジヨンィ匕して混合投与するなどの工夫が施されている。しかしながら、例えば、 HTLV— 1感染症においては、生体の HTLV— 1に対する細胞傷害性 T細胞 (CTL)の活性ある、は存在頻度が低!、ことに起因し、既存のアジュバントを用いた HTLV— 1ワクチンの成功例は報告されていない。また例えば、 HIVなどによるゥィルス感染症または癌患者にぉ、て、感染細胞または癌細胞を特異的に攻撃する C TLを誘導することで治療する試みが成されている。この治療においては効果的に C TLを誘導できるかが重要とされ、そのためにフロイントアジュバント、水酸化アルミ- ゥムなどのアジュバントが通常用いられて、るが、安全性や有効性にぉ、て満足すべき結果は得られていない。従って、本願発明のように、ポリアミノ酸、特にポリ（γ— グルタミン酸）がアジュバントとして優れた効果を発揮すると、う報告はな、。

[0003] 近年、ナノ粒子は、その大きさ故、様々な分野において新たな働きを担うと期待され、研究'開発が進められている。ナノ粒子を治療目的で利用する試みもなされている。例えば、ナノ粒子を薬物の担体として利用する研究があるが (特許文献 1および 2 参照）、ナノ粒子の体内挙動は解明されていないため毒性、安全性が疑わしぐ生体への影響が懸念されている。実際の医療に貢献するためには、非分解性ナノ粒子に代わりうる生分解性ナノ粒子の応用展開が必要不可欠である。さらに、ナノ粒子と抗原を結合させるときに、変性、分解などにより抗原の活性が失われてしまい、アジュバントとしての機能を発揮できないという心配もあった。したがって、本願発明のように、ナノ粒子化したポリアミノ酸、特にポリ（γ グルタミン酸)のアジュバントとしての使用、さらには、抗原を固定ィ匕したナノ粒子、およびそのワクチンとしての使用については報告がない。

特許文献 1：特開平 6— 92870号公報

特許文献 2：特開平 6 - 256220号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明の解決課題は、安全かつ有効なワクチン用アジュバントを提供すること、ならびにそれを利用したワクチンを提供することである。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ポリアミノ酸、特にポリ（ γ グルタミン酸)が榭状細胞の分化成熟を促進すること、すなわちアジュバントとして作用すること、ならびにその作用がナノ粒子化により増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。

[0006] すなわち、本発明は、

(1)アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用、

(2)ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε リジン）、ポリ —グルタミン酸）、ポリ —リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物力もなる群より選択されるものである、 (1 )記載の使用、

(3)ポリアミノ酸がポリ（ γ グルタミン酸)である（2)記載の使用、

(4)ポリアミノ酸が両親媒ィ匕されて、る、（1)記載の使用、

(5)ポリアミノ酸がナノ粒子化されて、る、 (1)から (4) V、ずれか記載の使用、

(6)ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法、

(7)ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε リジン）、ポリ —グルタミン酸）、ポリ —リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物力もなる群より選択されるものである、 (6

)記載の使用方法、

(8)ポリアミノ酸がポリ（ γ グルタミン酸)である（7)記載の使用方法、

(9)ポリアミノ酸が両親媒ィ匕されて、る、 (6)記載の使用方法、

(10)ポリアミノ酸がナノ粒子化されて、る、 (6)から（9) V、ずれか記載の使用方法、

(11)アジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチン、

(12)ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε リジン）、ポリ —グルタミン酸）、ポリ —リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物力もなる群より選択されるものである、 (1 1)記載のワクチン、

(13)ポリアミノ酸がポリ ( γ グルタミン酸)である（ 12)記載のワクチン、

(14)ポリアミノ酸が両親媒ィ匕されている、（11)記載のワクチン、

(15)ポリアミノ酸がナノ粒子化されて！/、る、（ 11)から（ 14) 、ずれか記載のワクチン、

(16)ウィルス抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子、

(17)ウィルス抗原がレトロウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、フラビウィルス抗原、下痢症ウィルス抗原、およびコロナウィルス抗原カゝらなる群カゝら選択されるものである、（16)記載の生分解性ナノ粒子、

(18)ウィルス抗原がレトロウイルス抗原である、 (17)記載の生分解性ナノ粒子、

(19)レトロウイルス抗原が HIV抗原である、 (18)記載の生分解性ナノ粒子、

(20)ポリアミノ酸を骨格とする、（ 16)から（ 19)の、ずれか記載の生分解性ナノ粒子

(21)ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ —グルタミン酸）、ポリ —リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物力もなる群より選択されるものである、 (2 0)記載の生分解性ナノ粒子、

(22)ポリアミノ酸がポリ ( γ グルタミン酸)である、 (21)記載の生分解性ナノ粒子、

(23)ポリアミノ酸が両親媒化されて!/、る、 (20)記載の生分解性ナノ粒子、 (24)抗原がナノ粒子に内包されて、る、 (16)から（23)の、ずれか記載の生分解性ナノ粒子、

(25)抗原がナノ粒子表面に存在する、（16)カゝら（23)のいずれか記載の生分解性ナノ粒子、

(26) (16)から（25)の、ずれか記載の生分解性ナノ粒子を含むワクチン、

(27)抗 HIVワクチンである、（26)記載のワクチン、

(28) (26)記載のワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の免疫方法、

(29) (26)記載のワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象における疾病の治療および Zまたは予防方法、

(30)疾病が HIVである、（29)記載の方法、

(31)疾病の治療および Zまたは予防のためのワクチンを製造するための、（16)から (25)記載の生分解性ナノ粒子の使用、

(32)疾病が HIVである、（31)記載の使用、

を提供するものである。

発明の効果

[0007] 本発明によれば、生分解性であるため安全性の高いポリアミノ酸のアジュバントとしての使用、ワクチンを製造するためのその使用方法、ならびにアジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチンが提供される。

図面の簡単な説明

[0008] [図 1]図 1は、 γ — PGAのナノ粒子化による、 Tリンパ球の³ H—チミジン取り込み量の変化を示すグラフである。

[図 2]図 2は、フローサイトメーターによる榭状細胞表面分子の測定結果を示す図である。

[図 3]図 3は、 ELISA法による榭状細胞力分泌されたサイト力イン量を示すグラフである。

[図 4]図 4は、 γ—PGAナノ粒子により分ィ匕誘導された iDCの Τリンパ球活性ィ匕作用を、 Tリンパ球の³ H—チミジン取り込み量により示す図である。

[図 5]図 5は、 HIV— 1抗原を内包する γ— PGAナノ粒子により誘導された γ—インターフェロン産生細胞数を示すグラフである。

[図 6]図 6は、 HIV 抗原を内包する γ—PGAナノ粒子により誘導された抗体価を示すグラフである。

[図 7]図 7は、 OVA固定ィ匕 γ— PGAナノ粒子を用いた腫瘍生着予防実験の結果を示す図である。

[図 8]図 8は、 OVA固定ィ匕 γ— PGAナノ粒子を用いた CTL誘導実験の結果を示す図である。

[図 9]図 9は、 Tax 固定ィ匕 γ— PGAナノ粒子を用いた CTL誘導実験の結果を示

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す図である。

[図 10]図 10は、 OVA固定ィ匕 γ— PGAナノ粒子を用いた肺転移抑制試験の結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0009] 本発明は、 1の態様において、アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用に関するものである。アジュバントとは、免疫系を刺激し、免疫反応を増強させる物質を意味する。アジュバントにより、例えば、榭状細胞の分化成熟を促進すること、 T細胞を活性化すること、種々のサイト力インの分泌を促進すること、 CTL誘導率が上昇することなどが可會になる。

[0010] 本発明に用いるポリアミノ酸は、、ずれのアミノ酸力構成されて、てもよ、。ァミノ酸以外の構成成分、例えば、糖類、脂質等を含んでいてもよい。好ましいポリアミノ酸は、アミノ酸力もなるポリペプチドを主材料あるいは骨格とし、構成成分の 50%以上がアミノ酸である。本発明に用いるポリアミノ酸の構成アミノ酸は 1種類であってもよく、複数種類であってもよい。したがって、本発明に用いるポリアミノ酸は 1種またはそれ以上の天然アミノ酸または 1種またはそれ以上の非天然アミノ酸のいずれかから構成されていてもよぐあるいはそれらの両方力構成されていてもよい。ここで、非天然アミノ酸は天然に存在するアミノ酸以外のものをいい、化学合成されたもの、天然アミノ酸を化学的に修飾したもの等が含まれる。さらに構成アミノ酸は L 体であっても D 体であってもよいが、 L一体が好ましい。従って、本発明のポリアミノ酸は、その修飾体および誘導体も包含する。ここで、ポリアミノ酸の「修飾体」、「誘導体」という語は当該分野において通常に使用される意味を有する。本発明のポリアミノ酸の修飾体および誘導体の例としては、構成アミノ酸の一部を別のアミノ酸としたもの、あるいは構成アミノ酸の利用可能な官能基を用いて修飾したもの等が挙げられる。具体的には、ポリ（γ —グルタミン酸)のペプチド鎖中に 1種またはそれ以上の他のアミノ酸（またはその修飾体もしくは誘導体)を導入したもの、グラフト重合体となっているもの、あるいはポリ（ ε—リジン）の構成アミノ酸たるリジンの利用可能な α—位の一部をメチルイ匕したもの等が挙げられる。本発明のポリアミノ酸の修飾体、誘導体の種類およびその製造方法については、当業者が容易に選択し、行うことができるものである。安全性または毒性の面、特に生体内で分解された際の産物の安全性または毒性（無毒であるかあるいは低毒性であること）を考慮すると、本発明のポリアミノ酸は生分解性で、かつ天然アミノ酸力構成されているものが好ましい。本発明のポリアミノ酸を構成する好ましい構成アミノ酸としてはグルタミン酸、ァスパラギン酸、リジン、ァスノラギン、アルギニン等が挙げられる。本発明のポリアミノ酸中の構成アミノ酸の結合は一般的にはペプチド結合である力それ以外の結合あるいはリンカ一により構成ァミノ酸が結合されていてもよい。ペプチド結合以外の結合としては、例えば、エステル結合、エーテル結合等があり、リンカ一としては、例えば、ダルタルアルデヒド、ジイソシァネート等があるが、これらに限らない。さらに、本発明のポリアミノ酸の官能基間において架橋されていてもよい。架橋することにより、ポリアミノ酸の物性を変化させ、所望のアジュバント特性を得ることも可能である。架橋剤としては、例えば、カルポジイミド、ジグリシジルエステル等がある力これらに限らない。ポリアミノ酸は可溶性のものが好ましいが、経時的に徐々に溶解するものであってもよい。またポリアミノ酸の分子量も特に限定されないが、所望の粘度や溶解度に応じて変更され得る。通常は 10 00な!ヽし 500万の範囲、好ましく ίま 5000な!ヽし 200万の範囲である。本発明【こ用ヽられる好ましいポリアミノ酸は、ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ（ α—グルタミン酸）、ポリ（ α—リジン）、ポリアスパラギン等であり、さらに好ましいポリアミノ酸は、ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ ε—リジン)またはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物等であり、特に好ましいポリアミノ酸は、ポリ（γ —グルタミン酸)である。好ましいポリアミノ酸の選択は、使用する抗原その他の成分との相互作用も考慮すべきである。さらに、本発明に用いる好ましいポリアミノ酸はナノ粒子化されたものである。ナノ粒子化することによりアジュバント作用が増強される（実施例 1参照)。ポリアミノ酸の製造は、化学合成法、発酵法などの公知の方法を適宜選択して行うことができる。ナノ粒子の製造方法にっ、ては後で説明する。

[0012] 本発明は、もう 1つの態様において、ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法に関する。ワクチンを製造するためのいずれの工程において、ポリアミノ酸を添加してもよいし、あるいは使用時にポリアミノ酸を他のワクチン構成成分と混合することにより、ワクチンを製造してもよい。ポリアミノ酸の構成成分、構成アミノ酸の結合、好ましいポリアミノ酸、好ましいポリアミノ酸の形態等については上述の通りである。添加するポリアミノ酸の量は、抗原の種類、疾病の種類、対象の状態等に応じて適宜変更することができる。製造されるワクチンは、下記のように様々なものであってよい。ポリアミノ酸のアジュバントとしての能力は高ぐポリアミノ酸に由来する毒性はないか、あるいは低いものであるので、本発明の方法を用いて得られるワクチンは、効果が高ぐ副作用が低い。

[0013] 本発明は、別の態様において、アジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチンに関するものである。本発明のワクチンにおいて含まれるポリアミノ酸の構成成分、構成ァミノ酸の結合、好ましい種類および形態等については上述の通りである。本発明のヮクチンは、アジュバントとしてポリアミノ酸、および抗原を含む以外に、例えば、賦形剤、または担体、所望により懸濁化剤、等張化剤、防腐剤などを含んでいてもよい。本発明のワクチンは、本発明のポリアミノ酸以外のアジュバントをさらに含んでいてもよい。その剤形は特に限定されず、いずれのものであってもよぐ対象の状態、疾病の種類等の種々の因子に応じて選択することができる。例えば、適当な水性担体中の懸濁液または溶液であってもよぐ粉末、カプセル剤、錠剤等であってもよい。ヮクチンは凍結乾燥形態であってもよぐこれを使用前に適当な賦形剤に懸濁または溶解して用いることができる。本発明のワクチンの投与方法、投与経路および投与回数も特に限定はなぐ剤形、対象の状態、疾病の種類等の種々の因子に応じて選択することができる。例えば、本発明のワクチンを注射、輸液、または経口投与により投与してもよく、患部に局所的に投与してもよい。

[0014] 本発明のワクチンにおいて、抗原がポリアミノ酸に固定ィ匕されていてもよぐあるいは固定化されていなくてもよい。抗原を固定ィ匕しない場合、抗原の選択の幅は著しく広い。疾病の種類、対象の状態等の因子に応じて抗原を適宜選択することにより、所望のワクチンを容易に製造することができる。抗原を固定ィ匕した場合にっ、ては後で説明する。

[0015] 本発明は、 1の態様において、抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子に関するものである。ここで抗原とは免疫反応を惹起できるものを意味し、その形態は、例えば、ヒト免疫不全ウィルス (HIV)のごときウィルス、結核菌のごとき病原微生物などの病原体自体またはその一部、あるいは蛋白質またはペプチド、あるいは核酸であってもよい。本発明に用いられる好ましい抗原はウィルス抗原であり、その種類は特に限定されず、いずれのウィルス抗原であってもよい。例えば、 HIV抗原（例えば、 HTLV— 1抗原）または HTLV抗原（例えば、 HTLV—1抗原）のようなレトロウイルス抗原、インフル工ンザウィルス抗原、 C型肝炎ウィルス抗原または西ナイルウィルス抗原のようなフラビウィルス抗原、ロタウィルス抗原またはノロウィルス抗原のような下痢症ウィルス抗原、および SARSウィルスのようなコロナウィルス抗原などが好ましぐ HIV抗原または HTLV抗原のようなレトロウイルス抗原がより好ましぐそして HIV抗原が最も好ましい。本発明の生分解性ナノ粒子に固定化される抗原は、複数種類、あるいは異なる形態の抗原であってもよ、。

[0016] 本発明において抗原を生分解性ナノ粒子に固定ィ匕するとは、抗原と生分解性ナノ粒子とが物理的にくっついていることを意味し、好ましくは、抗原を内包すること、あるいは抗原を粒子表面に存在させることである。抗原を生分解性ナノ粒子に固定ィ匕する方法は種々の公知方法にて行うことができる。詳しくは後述のとおりである。

[0017] 本発明に用いる生分解性ナノ粒子の材料は種々のものを用いることができる力生体に投与することからナノ粒子自体およびその分解産物または代謝産物が安全なものが好ましい。本発明の生分解性ナノ粒子の好ましい主成分 (好ましくは、抗原を固定化しない状態で 50重量％以上）は、ポリアミノ酸である。さらに、好ましいポリアミノ酸は、ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ（ α グルタミン酸）、ポリリジン）、ポリアスパラギン、またはそれらの混合物であり、より好ましくは、ポリ（γ グルタミン酸)である。これらのポリアミノ酸を構成するァミノ酸間の結合は同じ種類あるいは異なる種類のものであってもよぐ例えば、全ての構成アミノ酸がペプチド結合により結合したものであってもよぐあるいは部分的または全体的にペプチド結合以外の結合によりアミノ酸同士が結合したものであってもよい。リンカ一を介して結合したものであってもよい。ポリアミノ酸に関しては、前述のアジュバントとしてのポリアミノ酸についての説明も参照のこと。

[0018] 生分解性ナノ粒子の種類、組成、製造方法、形状、サイズ等にっヽての詳細は後述のとおりである。

[0019] 本発明は、もう 1つの態様において、上記の抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子を含むワクチンに関するものである。上述のようにして得られる、抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子をワクチンとして用いることができる。生分解性ナノ粒子に固定ィ匕される抗原を適宜選択して、種々のワクチンを得ることができる力好ましくは、 HIV抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子を含む抗 HIVワクチンである。本発明のワクチンにおいて、抗原の固定ィ匕担体およびアジュバントとして用いられるのは生分解性ナノ粒子であり、最終的には生体内の分解酵素により分解されて無毒化あるいは低毒性化されるものである。本発明のワクチンは、抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子および賦形剤または担体、所望により懸濁化剤、等張化剤、防腐剤などその他の成分を含むものである。担体または賦形剤は、例えば、水、エタノール、またはグリセリンのような水性媒体、あるいは脂肪酸、脂肪配エステルなどの油脂類のような非水性媒体が挙げられる。本発明のワクチンの剤形はいずれのものであってもよぐ対象の状態、疾病の種類等の因子に応じて選択することができる。例えば、適当な水性担体中の懸濁液であってもよぐ粉末、カプセル剤、錠剤等であってもよい。凍結乾燥したヮクチンを、投与前に適当な担体または賦形剤に懸濁して用いるものであってもよい。本発明のワクチンの投与方法、投与経路および投与回数も特に限定はなぐ剤形、対象の状態、疾病の種類等の因子に応じて選択することができる。例えば、本発明のワクチンを注射、輸液等、あるいは経口投与により対象に投与してもよぐ患部に局所的に投与してもよい。 [0020] さらに、生分解性ナノ粒子の材料や、構成成分、分子量、サイズ、その他のパラメ一ターを適宜変更して、抗原の放出速度および放出時間をコントロールすることもできる。そのための方法も当該分野において公知である。例えば、ポリ（γ —グルタミン酸 )と疎水性アミノ酸のグラフト共重合体力なるナノ粒子の場合、疎水性アミノ酸の種類、含量を制御することにより、徐放性のワクチンを得ることもできる。また、例えば、特定の臓器または部位に局在する酵素により分解されうる結合を、生分解性ナノ粒子と免疫原との結合、あるいは生分解性ナノ粒子中に導入して、特定の臓器または部位で免疫原が放出されるようにしてもょ、。

[0021] 本発明のワクチンを種々の疾病の予防および治療を目的として種々の対象に投与することができる。本発明のワクチンを適用しうる疾病ならびに投与対象は特に限定されない。カゝかる予防および治療は、例えば、抗原提示細胞 (APC)に抗原を MHC クラス I分子と共に提示させ、これを特異的に認識する CTLを誘導させ、この CTLにより癌細胞または感染細胞などを傷害することによるものであってもよい。したがって、本発明により予防および治療される疾患は、悪性腫瘍、またはウィルス、細菌などの病原体により生じる感染症などである。悪性腫瘍は、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、膀胱癌、白血病、悪性黒色腫などを含み、感染症は、成人 Τ細胞白血病、肝炎、後天性免疫不全症などを含む。例えば、本発明のワクチンを成人 Τ 細胞白血病の治療に使用することもできる（実施例 8参照)。

[0022] 本発明はまた、上記ウィルス抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の免疫方法を提供するものである。本発明のワクチンに含まれる生分解性ナノ粒子に固定化されるウィルス抗原を適宜選択することで、対象にお!、て当該ウィルス抗原に特異的な CTLまたは抗体の誘導などの免疫反応を誘導することができる。本発明のワクチンの投与方法、投与経路、投与回数等は、対象の状態、ウィルス抗原の種類等種々の因子に応じて適宜選択できる。

[0023] 本発明はまた、上記ウィルス抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象における疾病の治療および Ζまたは予防方法を提供するものである。本発明のワクチンに含まれる生分解性ナノ粒子に固定化されるウィルス抗原を適宜選択することで、例えば、後天性免疫不全症候群、ヒト Τ細胞白血病、レトロウイルス感染症、インフルエンザ、 C型肝炎、西ナイルウィルス感染症、ロタウィルス感染症、ノロウィルス感染症、および SARS、ならびに種々の腫瘍などの広範囲の疾病を治療および Zまたは予防することができる。本発明のワクチンの投与方法、投与経路、投与回数等は、例えば、対象の状態、疾病の種類、ウィルス抗原の種類等の種々の因子に応じて適宜選択できる。

[0024] 本発明はさらに、疾病の治療および Zまたは予防のためのワクチンを製造するための、上記ウィルス抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子の使用に関するものである。生分解性ナノ粒子に固定ィ匕するウィルス抗原を適宜選択することで、例えば、上述の疾病のような様々な疾病の治療および Zまたは予防のためのワクチンを製造することが可能となる。

[0025] 本発明はさらに、対象を免疫するためのワクチンを製造するための、上記ウィルス抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子の使用に関するものである。生分解性ナノ粒子に固定化するウィルス抗原を適宜選択することで、対象において当該ウィルス抗原に特異的な免疫反応を誘導するワクチンを製造することが可能となる。

[0026] 本発明は、もう 1つの態様において、抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子に関するものである。本発明に用いる生分解性ナノ粒子の材料は種々のものを用いることができ、それらは当該分野においてよく知られており、適宜選択して用いることができる。生体に投与することから当該ナノ粒子自体およびその分解産物または代謝産物が安全なもの、あるいは無毒または低毒性であるものが好ましい。力かる好ましい材料として、ポリペプチド、多糖、ポリ有機酸、あるいはこれらの混合物などがある。

[0027] ポリペプチドを主材料とする生分解性ナノ粒子（「生分解性ポリペプチドナノ粒子」と称する）は天然アミノ酸、修飾アミノ酸 (例えば、エステルイ匕アミノ酸など）、アミノ酸誘導体または合成アミノ酸、あるいはこれらの混合物を含むポリアミノ酸を骨格とするものであってよ!/、が、天然アミノ酸力もなるものが安全性や毒性の面力もより好ま、。そのような天然アミノ酸力もなる好ましいポリアミノ酸の例としてはポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ ε—リジン、ポリ（ (X— L—リジン）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ α—グルタミン酸）、ポリアスパラギン、並びにそれらの修飾体や誘導体等が挙げられる。「修飾アミノ酸」、「アミノ酸誘導体」、「修飾体」、「誘導体」≥\ヽぅ語は当該分野にぉヽて通常使用される意味を有するものとする。また、生分解性ポリペプチドナノ粒子は単一種のアミノ酸力もなつていてもよぐ 2種以上のアミノ酸力もなつていてもよい。生分解性ポリペプチドナノ粒子においてすベての構成アミノ酸間の結合が同じ種類のものであってもよぐ異なる種類のものであってもよい。例えば、すべての構成アミノ酸がペプチド結合によって結合したものであってもよぐ部分的あるいは全体的にぺプチド結合以外の結合によりアミノ酸が結合したものであってもよ、。アミノ酸の結合はリンカ一を介するものであってもよい。例えば、親水性ポリアミノ酸の側鎖に疎水性ァミノ酸を導入して、所望の親水性疎水性のバランスとすることもできる。したがって、例えば、ポリペプチドが γ グルタミン酸とフエ-ルァラニンェチルエステルのグラフト重合体であってもよい。なお、本発明の生分解性ポリペプチドナノ粒子は、ポリぺプチドを主成分 (好ましくは、抗原を固定ィ匕しない状態で 50重量％以上）とするものであり、好ましくは、ポリペプチドを骨格とするものである。本発明の生分解性ポリべプチドナノ粒子は、その骨格やその他の部分にポリペプチドやアミノ酸以外の成分を含んでいてもよぐ含んでいなくてもよい。本発明の生分解性ポリペプチドに関しては、前述のアジュバントとしてのポリアミノ酸についての説明も参照のこと。

多糖を主材料とする生分解性ナノ粒子（「生分解性多糖ナノ粒子」と称する）は天然多糖、修飾多糖、または多糖誘導体または合成多糖、あるいはこれらの混合物を含むものであってよ!、が、天然多糖からなるものが安全性や毒性の面力もより好まヽ。そのような天然多糖からなる好ましい生分解性ナノ粒子の例としては、プルラン、キトサン、アルギン酸、ぺクチン、ガードラン、デキストラン等が挙げられる。「修飾多糖」、「多糖誘導体」という語は当該分野において通常使用される意味を有するものとする。また、生分解性多糖ナノ粒子は単一種の糖からなっていてもよぐ 2種以上の糖力もなつていてもよい。さらに、生分解性多糖ナノ粒子はすべての構成糖が同じ種類の結合によって結合したものであってもよぐ部分的あるいは全体的に異なる種類の結合によって構成糖が結合したものであってもよい。例えば、 α— 1, 6結合と a—1 , 4結合が混在していてもよい。また、糖の結合はリンカ一を介するものであってもよい。なお、本発明の生分解性多糖ナノ粒子は、多糖を主成分 (好ましくは、抗原を固定化しない状態で 50重量％以上）とするものであり、好ましくは、多糖を骨格とするものである。本発明の生分解性多糖ナノ粒子は、その骨格やその他の部分に糖類以外の成分を含んでいてもよぐ含んでいなくてもよい。

[0029] ポリ有機酸 (ポリペプチドにつヽては上述のごとし)を主材料とする生分解性ナノ粒子（「生分解性ポリ有機酸ナノ粒子」と称する）は天然ポリ有機酸、修飾ポリ有機酸、ポリ有機酸誘導体または合成ポリ有機酸、ある、はこれらの混合物からなるものであつてよいが、天然ポリ有機酸力もなるものが安全性や毒性の面力もより好ましい。そのような天然ポリ有機酸力もなる好まし、生分解性ナノ粒子の例としては、ポリ乳酸ナノ粒子、ポリグリコール酸ナノ粒子、ポリ力プロラタトンナノ粒子等が挙げられる。「修飾ポリ有機酸」、「ポリ有機酸誘導体」という語は当該分野において通常使用される意味を有するものとする。また、生分解性ポリ有機酸ナノ粒子は単一種の有機酸カゝらなつていてもよぐ 2種以上の有機酸カゝらなっていてもよい。さらに、生分解性ポリ有機酸ナノ粒子は、同じ結合により有機酸が結合したものであってもよぐ部分的あるいは全体的に異なる結合によって有機酸が結合したものであってもよい。また、有機酸の結合はリンカ一を介するものであってもよい。なお、本発明の生分解性ポリ有機酸ナノ粒子は、ポリ有機酸を主成分 (好ましくは、抗原を固定ィ匕しない状態で 50重量％以上）とするものであり、好ましくは、ポリ有機酸を骨格とするものである。本発明の生分解性ポリ有機酸ナノ粒子は、その骨格やその他の部分にポリ有機酸やアミノ酸以外の成分を含んでいてもよぐ含んでいなくてもよい。

[0030] 本発明に用いる生分解性ナノ粒子の形状は特に限定されないが、一般的には球状である。そのサイズは通常 100ηπι〜10 /ζ πιであり、好ましくは 100nm〜500nm である。このようなサイズにすることによって、例えば、単位重量あたりの粒子表面積増加に伴う抗原固定ィ匕量の増カロ、抗原提示細胞への抗原の取り込み促進、それ〖こ伴う CTLの活性化、抗体産生の誘導などの効果が生じる。球状以外の形状のナノ粒子についても、好まし、サイズは球状のナノ粒子に準じるものとする。

[0031] 本発明に用いる生分解性ナノ粒子は公知の方法を適用することにより製造することができる。生分解性ポリペプチドナノ粒子の製造には、例えば、液中乾燥法、噴霧乾燥法、球形晶析法、溶媒置換法 (沈殿，透析法)、直接超音波分散法を用いることができる。例えば、ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ ε—リジン)力もなる生分解性ナノ粒子は、溶媒置換法により製造することができる。生分解性多糖ナノ粒子の製造には、例えば、直接分散法を用いることができる。生分解性ポリ有機酸ナノ粒子の製造には、例えば、ェマルジヨン液中乾燥法を用いることができる。このような方法を適宜選択あるいは組み合わせて、生分解性ナノ粒子の材料、構成成分、分子量、サイズ、電荷その他のパラメーターを目的に応じたものとすることができる。さらに、所望によりナノ粒子を結合するマトリクス間を架橋してもよヽ。

[0032] 生分解性ナノ粒子に固定ィ匕する抗原は種々のものを用いることができる。抗原としては、例えば、蛋白質またはペプチド、あるいは核酸であってもよぐウィルス、細菌、真菌などの病原体あるいはその一部分であってもよい。例えば、腫瘍抗原などを生分解性ナノ粒子に固定ィ匕してもよい。投与対象の状態、例えば、動物種、年齢、体重、健康状態、すでにかかっている疾病または素因の様な予防および Zまたは治療すべき疾病の種類などに応じて抗原を適宜選択して、生分解性ナノ粒子に固定化することができる。生分解性ナノ粒子に固定ィ匕する抗原は 1種類であってもよぐ 2種以上であってもよい。

[0033] 生分解性ナノ粒子への抗原の固定ィ匕は種々の公知方法にて行うことができる。例えば、共有結合、イオン結合、分子間力による結合法、吸着による方法、あるいは包括法などが知られている。例えば、生分解性ナノ粒子上の官能基と抗原が有する官能基とを共有結合させて固定ィ匕してもよぐ生分解性ナノ粒子の電荷と抗原の電荷が相反する場合にはイオン結合により固定ィ匕してもよい。包括法は、例えば、ポリ（0 —グルタミン酸)生分解性ナノ粒子に蛋白性の抗原を固定ィ匕する場合には、ポリ（ γ グルタミン酸）に疎水性アミノ酸を共有結合により導入し、これを有機溶媒に溶解し、次に抗原水溶液に滴下することにより、固定ィ匕することができる。また、結合法、吸着法および Ζまたは包括法を適宜組み合わせて抗原を生分解性ナノ粒子に固定ィ匕してもよい。したがって、抗原は生分解性ナノ粒子に内包されていてもよぐあるいは生分解性ナノ粒子の表面に存在していてもよぐこのような固定ィ匕様式は、ワクチンの使用目的 (例えば、対象、疾病の種類等）に応じて適宜選択することができる。本発明の抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子においては、抗原の立体構造は生分解性ナノ粒子との結合あるいは生分解性ナノ粒子における内包によっては影響されず、例えば凍結乾燥後であってもその固定ィヒ蛋白質の量や性質に変化が少なぐ長期間保存可能であると、う利点を有する。

[0034] 本発明は、さらなる態様において、ワクチンを製造するための、抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子の使用に関する。

[0035] 本発明は、もう 1つの態様において、上記抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の免疫方法に関するものである。生分解性ナノ粒子の材料等については上述の通りである。本発明のワクチンに含まれる生分解性ナノ粒子に固定化される抗原を適宜選択することで、対象において当該抗原に特異的な CTLまたは抗体の誘導などの免疫反応を誘導することができる。例えば、ウィルスなどの病原体またはその一部を抗原として用いて対象において種々の感染症に対する免疫を生じさせることができる。また例えば、腫瘍抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを用いた場合、対象にお!ヽて腫瘍特異的な免疫反応が誘導される。本発明のワクチンの投与方法、投与経路、投与回数等は対象の状態、抗原の種類等の種々の因子に応じて適宜選択できる。

[0036] 本発明は、もう 1つの態様において、上記抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の治療および Zまたは予防方法に関するものである。生分解性ナノ粒子の材料等については上述の通りである。本発明のワクチンに含まれる生分解性ナノ粒子に固定化される抗原を適宜選択することで、広範囲の疾病を予防および Zまたは治療することができる。例えば、ウィルスなどの病原体またはその一部を抗原として用いて対象にける種々の感染症を治療および Zまたは予防することができる。また例えば、腫瘍抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子を含むワクチンを用いることで、対象の腫瘍を治療および Zまたは予防することができる。本発明のワクチンの投与方法、投与経路、投与回数等は、例えば、対象の状態、疾病の種類、抗原の種類等の種々の因子に応じて適宜選択できる。

[0037] 本発明は、別の態様において、疾病の治療および Zまたは予防のためのワクチンを製造するための、上記抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子の使用に関するものである。生分解性ナノ粒子の材料等については上述の通りである。生分解性ナノ粒子に固定化する抗原を適宜選択することで、対象において当該抗原に特異的な免疫反応を有するワクチンを製造することが可能となる。

[0038] 本発明はさらに、担体としての生分解性ナノ粒子の使用を提供するものである。ここで、担体 (本明細書においてキャリアーともいう）とは、例えば、抗原のような物質を所望の部位へ運ぶことができる物質のことである。目的組織、細胞等に応じて生分解性ナノ粒子の大きさを適宜選択することで、担体としての生分解性ナノ粒子の効果を増強することができる。例えば、抗原提示細胞は直径 50ηπι〜3 /ζ πιの粒子状物質を効率よく取り込む性質を有してヽることが知られてヽることから、本発明の生分解性ナノ粒子を力かる大きさに調節してもよい。本発明のナノ粒子は生分解性であるため、生体にとって無毒である力、あるいは低毒性であるという利点を有する。生分解性ナノ粒子の材料、好ま、ポリアミノ酸等については上述の通りである。

[0039] 本発明はさらに、担体として生分解性ナノ粒子を含む医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は生分解性ナノ粒子を含んでヽれば、ずれのものであつてもよい。生分解性ナノ粒子の材料、好ましいポリアミノ酸等については上述の通りである。

[0040] 本発明は、さら〖こ、医薬組成物を製造するための担体としての生分解性ナノ粒子の使用方法を提供するものである。医薬組成物に含まれる物質は!、ずれのものであつてもよく、例えば、腫瘍抗原またはウィルス抗原などの抗原であってもよいし、抗原提示細胞活性化効果が知られて!/ヽる物質などであってもよ！ヽ。生分解性ナノ粒子の材料、好ま、ポリアミノ酸等にっ、ては上述の通りである。

[0041] 以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。実施例において、ポリ（γ グルタミン酸)を γ -PG Αと略称する。

実施例 1

[0042] γ PGAのアジュバント作用

マウスの下肢より単離した骨髄細胞を GM— CSF存在下で培養し、未熟榭状細胞（ iDC)を得た。次に、 iDCを 100 μ g/ml γ— PGA、 100 g/ml γ—PGAナノ粒子 (サイズ； 177nm)を含む培地で 2日間培養した後、得られた細胞を同種異系マウス由来 Tリンパ球と 3日間共培養した。その後、 Tリンパ球を³ H チミジンと 16時間インキュベーションし、取り込み量を測定することにより、 γ—PGAおよび γ—PGA ナノ粒子が iDCを成熟榭状細胞 (mDC)へと分化誘導し、さらにこの mDC力リンパ球を活性化するかを調べた。ネガティブコントロールとして、 γ—PGAを含まない培地で培養した iDCを用いた。結果を、ネガティブコントロールの³ H チミジン取り込み量を 100 (%)としたときの値として表す（図 1)。 γ—PGA力 Τリンパ球の³ Η チミジンの取り込み量を増大させること、すなわち iDCを mDCへと分化成熟させ、この mD C力リンパ球を活性ィ匕すること、さらに γ—PGAをナノ粒子化することにより、この作用、すなわちアジュバント作用が増強されることが分力つた。

実施例 2

[0043] γ PGAナノ粒子による榭状細胞 (DC)の分化成熟の促進

A. y PGAナノ粒子による DC表面分子の発現の増加

実施例 1記載の方法に従い得られた iDCを、 75、 150、 300 /z gZml γ—PGA ナノ粒子をそれぞれ含む培地で 2日間培養した後、 DCの分化成熟に伴い発現が増加する細胞表面分子（CD40、 CD80、 CD86、 MHCクラス I、および MHCクラス Π) をフローサイトメーターにより測定した。ネガティブコントロールとして、 γ—PGAナノ粒子を含まない培地で培養した iDCを、そしてポジティブコントロールとして、 DCの分化誘導物質として知られてヽる LPS (リポ多糖)を含む培地で培養して得られた m DCを用いた。 γ—PGAナノ粒子は、濃度依存的に CD40、 CD86、 MHCクラス Iの発現を増加させること、すなわち iDCを mDCへと分ィ匕誘導し、活性化させることができることが分力つた（図 2参照)。

[0044] B. γ—PGAナノ粒子による DCのサイト力イン産生量の増加

実施例 1記載の方法に従い得られた iDCを、 γ—PGAナノ粒子（75、 150または 3 00 gZml)と共にインキュベーションした。 2、 6、 24、 48時間後の培養上清を回収し、 DCより産生、分泌されたサイト力イン (IL— 1 j8、 IL 6、 IL— 12、および TNF— α )を ELISA法にて定量した。ネガティブコントロールとして、 γ—PGAナノ粒子を含まな、培地にて同じ時間インキュベーションした iDC、そしてポジティブコントロールとして、 LPSと共に同じ時間インキュベーションして得られた mDCを用いた。 γ— PGAナノ粒子は、 IL— 1 j8、 IL— 12および TNF— aの産生量を増大させることが分かった（図 3参照）。さらに、 IL 12ぉょびTNF—αの産生量の増大は、 γ—PGA ナノ粒子の濃度に依存して増強されることが分力つた。これらのサイト力インは、 DC の分ィ匕成熟に伴い産生量が増加するため、 Ί PGAナノ粒子は iDCを mDCへと分化誘導し、活性ィ匕することをさらに確認することができた。

実施例 3

[0045] γ—PGAナノ粒子により分ィ匕誘導された iDCの Τリンパ球活性ィ匕作用

実施例 1記載の方法に従い、 iDCを γ—PGAナノ粒子（75、 150または 300 gZ ml)を含む培地で 2日間培養して分化誘導した。次に、得られた細胞を同種異系マウス由来 Tリンパ球と 4日間共培養した。その後、 Tリンパ球を³ H チミジンと 16時間インキュベーションし、取り込み量を測定することにより、分化誘導された iDCの Tリンパ球活性化作用を調べた。ネガティブコントロールとして、 γ—PGAナノ粒子を含まない培地にて培養した iDCを、そしてポジティブコントロールとして、 LPSにより分ィ匕成熟させて得られた mDCを用いた。 Tリンパ球の³ H—チミジン取り込み量は iDCを分化誘導する際の γ— PGAナノ粒子の濃度に依存して増加すること、すなわち、 γ PGAナノ粒子の Τリンパ球活性ィ匕作用は濃度に依存して増強されることが確認できた (図 4参照)。

実施例 4

[0046] HIV- 1抗原（p24)を内包する γ—PGAナノ粒子による γ インターフェロン産生細胞の誘導

6から 8週齢の雌 BALB/c (H— 2d)マウスを、 p24抗原を内包する γ—PGA (p2 4— NP)を用いて 7日間隔で 3回免疫した。コントロールとして、 PBS (ネガティブコントロール）、 _Ύ—PGAナノ粒子（NP)または ρ 24抗原（ρ 24)単独、 p24抗原と γ— Ρ GAナノ粒子の混合物（ρ24+ΝΡ)を用いた。用いた γ— PGAナノ粒子および ρ24 抗原の量は、 1回の免疫当たりそれぞれ lmg、 25 gであった。最終免疫の 10日後、脾臓から細胞を回収し、 lOmg/ml p 24ペプチド (AMQMLKETI (配列番号： 1 ；) )または lOmgZml 組換え p24タンパク質と共に 24時間インキュベーションした。 p 24特異的 IFN— y産生細胞数を、 ELISPOTアツセィ（BD Bioscience)にて決定した。全データを 1 X 10⁶細胞当たりの平均スポット形成数 (SFU)士 SEを用いて表す。統計的有意性を t検定を用いて検定した。結果を図 5に示す。 p24単独免疫群および P24 + NP免疫群と比べて、 P24— NP免疫群において IFN— γ産生細胞が多く誘導されることが分かった。

実施例 5

[0047] HIV- 1抗原 (ρ24)を内包する γ — PGAナノ粒子による抗原特異的抗体の誘導

6から 8週齢の雌 BALBZc (H— 2d)マウスを、 p24抗原を内包する γ—PGAナノ粒子 (ρ24— ΝΡ)を用いて 2週間間隔で 2回免疫した (η=4)。コントロールとして、 Ρ BS (ネガティブコントロール）、 γ—PGAナノ粒子（ΝΡ)または ρ 24抗原（ρ 24)単独、および p24抗原とフロイントの完全アジュバントの混合物（p24 + CFA)を用いた。用いた γ— PGAナノ粒子および ρ24抗原の量は、それぞれ 1回の免疫当たり lmg、 25 μ gであった。最終免疫の 10日後、血液を採取し、その血清中に含まれる抗原特異的抗体レベルを測定した。最終抗体価を、免疫していないマウスより 2SD (約 0. 1) 大きい吸光度 (450nm)となる、最終希釈度の逆数として表す。統計的有意性を t検定を用いて検定した。結果を図 6に示す。 p24単独免疫群と比べて、 p24— NP免疫群の血清における抗体価が非常に高いことが分力つた。さらにこれは、既知のアジュバントである CFAを用いて免疫した群 (p24 + CFA)に匹敵する値であった。

[0048] 実施例 4および 5の結果から、本発明の抗原固定ィ匕生分解性ナノ粒子を含むワクチン、特に抗 HIVワクチンの有効性が明ら力となった。また、 γ—PGAナノ粒子がァジュバントとての効果を有することがさらに確認できた。

実施例 6

[0049] OVA固定ィ匕 γ—PGA (ポリ（ γ —グルタミン酸)）ナノ粒子を用いた腫瘍生着予防実験

Α.材料

C57ZBL6マウス（雌性、 6週齢）は日本 SLCより、フロイントの完全アジュバントは、和光純薬工業より購入した。 OVA発現細胞である EG7細胞は American Type Cult ure Collectionより購入し、培養には、 400 μ g/ml G418 (和光純薬工業）を含有する完全 RPMI1640培地（SIGMA社）を用いた。

[0050] B.方法 γ—PGA (分子量 300, 000) 607mg (4. 7unit mmol)を 54mM NaHCO水

3 溶液 (pH8. 5) 100mlに溶解した。次に、 1ーェチルー 3—（3 ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩 (WSC) 901mg (4. 7mmol)および L フエ-ルァラニンェチルエステル (L— PAE) 1080mg (4. 7mmol)を添カ卩し、攪拌しながら室温でー晚反応させた。反応後、生じた溶液を透析膜 (分子量分画 50, 000)を用いて水で 3日間透析を行い、次に、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物をエタノール 100mlに添加し、一晩攪拌した。生じた溶液を遠心分離（1, 500 X g、 20分間）し、沈殿物を減圧乾燥し、 γ— PGA— g— L— PAEを得た。 γ— PGA— g— L— PAE lOOmgを D MSO 10mlに溶解して lOmgZmlとし、次に lOmgZml γ— PGA— g— L— PA Eと 2mgZml OVA (SIGMA)溶液とを lmlずつ当量混合し、反応させた。反応後、 14, 000 X gにて 15分間遠心した。上清を除去し、 PBSにて再分散を行った。この操作を繰り返し、未反応の OVAを除去した。最終的に、 lOmg/ml OVA内包 γ — PGAナノ粒子を製造した。このように両親媒ィ匕 γ—PGAは、蛋白質溶液に分散させるだけで目的蛋白質を簡便かつ効率よぐ均一に内包し得ることが分力つた。

[0051] マウスへの免疫は、 OVA 100 g、 10 gを含むサンプル 100 1を皮下注射することにより行った。フロイントの完全アジュバント（CFA)を当量の 2mgZml OV A蛋白質溶液と充分に混和し、ェマルジヨンィ匕したものをコントロールとして用いた。免疫の 1週間後、 EG7細胞をマウス 1匹当たり 1 X 10⁶細胞 Ζ50 /ζ 1にて腹部への皮内注射により播種した。 EG7細胞播種後、腫瘍径を経日的に測定し、以下に示す式に従い腫瘍体積を算出した。

(腫瘍体積: mm³) = (腫瘍の長径: mm) X (腫瘍の短径: mm) ² X 0. 5236

[0052] C.結果

図 7に示すように、 PBSで免疫した群と比較して、 OVA内包 γ—PGAナノ粒子で免疫した群（ γ—PGAZOVAナノ粒子（100)または（10) )では、顕著な腫瘍増殖遅延を確認した。 OVAを含まない γ—PGAナノ粒子および OVAにより免疫した群（ empty γ PGAナノ粒子 Z〇VA ( 100)または（10) )において、若干の腫瘍生着遅延が見られたが、これは γ— PGAナノ粒子表面に吸着した OVAが抗原提示細胞内に取り込まれたことによるものだと考えられる。これらの結果より、 y PGAナノ粒子が抗原提示細胞に取り込まれやすい性質を有していることが示される。さらに、本実施例で得られた OVA内包 γ— PGAナノ粒子は、現在動物実験レベルで最も強 Vヽ CTL誘導能を保持して、ることが知られて、るフロイント完全アジュバント免疫群（ CFAZOVA(IOO) )よりも、強力な抗腫瘍効果を示した。また、本実施例で得られた OVA内包 γ— PGAナノ粒子は凍結乾燥により保存が可能であり、細胞毒性も認められな、ことが確認され、ワクチン担体およびアジュバントとしての条件を十分に兼ね備えていることがわ力つた。

実施例 7

[0053] OVA固定ィ匕 γ— PGAナノ粒子を用いた CTL誘導実験

A.材料

OVA発現 EL4細胞は東北大学加齢研究所 ·癌細胞保存施設より供与いただき、培養には、 5 X 10^_5M 2—メルカプトエタノール（Invitrogen)、 100U/ml ぺ -シリン、 100 gZml ストレプトマイシン (和光純薬工業）、および 10% 牛胎児血清 (F BS)を含む、完全 RPMI 1640倍地（SIGMA社）を用いた。マイトマイシン Cは和光純薬工業、組換えマウス IL— 2は Peprotech社、そして Na ⁵¹CrOは Amersham Biosc

2 4

ience社より購入した。 C57ZBL6マウス、フロイントの完全アジュバント、 EG7細胞については、実施例 6に記載の通りである。

[0054] B.方法

OVA内包 γ— PGAナノ粒子を実施例 6に記載のように製造した。マウスへの免疫は、 OVA 100 g、 25 gを含むサンプル 100 μ 1を皮下注射することにより行つた。免疫の 10日後、脾臓細胞をナイロンメッシュに通し単一細胞とし、単核球を回収した。それぞれの免疫マウスより回収した単核球 (4 X 10⁶細胞 Zml)を、 30 gZml マイトマイシン Cで 30分間処理した EG7 (4 X 10⁵細胞 Zml)と、 lOU/ml マウス I L— 2を含む完全 RPMI 1640培地中で 5日間共培養（37°C、 5% CO )し、エフェク

2

ター細胞とした。標的細胞には、 Na ⁵¹CrOで標識 (0. 56 MBqZlO⁶細胞、 37°C

2 4

、 1時間）した EL4細胞および EG7細胞を用いた。標的細胞を 10⁴細胞 Zゥエルの濃度で 96ウエノレプレート【こ人れ、次【こ、エフェクター糸田胞を 12. 5、 25、 50、 100 X 10⁴ 細胞 Zゥエルの濃度でカ卩え、 37°Cにて 4時間インキュベーションし、上清中の⁵¹ Cr活性を測定した。 CTL活性を以下に示す式に従い算出した。

溶解 (％) = 100 X { (エフェクター細胞による⁵¹ Cr遊離量）—（自然⁵¹ Cr遊離量） }/{ (最大⁵¹ Cr遊離量) (自然 ⁵¹Cr遊離量) }

[0055] C.結果

y—PGAナノ粒子を用いて免疫したマウスの脾臓において、 OVA特異的 CTLの誘導が認められた（図 8 (a)および (b) )。これは、 CFAZOVA免疫群（図 8 (d) )よりも強力な抗腫瘍作用を示した。 OVA単独免疫群では CTL活性は全く認められなかつた（図 8 (e) )。 empty γ— PGAナノ粒子 ZOVA群（図 8 (c) )において、若干の C TL活性が見られた力これは γ—PGAナノ粒子表面に吸着した OVAが抗原提示細胞内に取り込まれたことによるものであると考えられる。これらの結果から、生分解性である γ—PGAナノ粒子が抗原提示細胞に取り込まれやすい性質を有していること、ならびに CTL誘導抗原キャリアーおよびアジュバントとして極めて優れた性能を有していることが示された。

実施例 8

[0056] Tax 固定ィ匕 γ— PGAナノ粒子を用いた CTL誘導実験

38-46

A.材料

C3HZHeJマウス (雌性、 6週齢）は日本 SLCより購入した。マウス繊維芽細胞 (L9 29)は ATCCより購入し、培養には、 100U/ml ペニシリン、 100 gZml ストレプトマイシン (和光純薬工業）、および 10% 牛胎児血清 (FBS)を含む、完全 MEM 培地（SIGMA社）を用いた。 Tax ペプチドは SIGMA Genosys社より購入した

38-46

。フロイントの完全アジュバント、 Na ⁵¹CrOに関しては、上記の通りである。

2 4

[0057] B.方法

ヒト T細胞白血病ウィルス (HTLV- 1)のマウス H— 2K^K拘束性ェピトープである、 Tax ペプチド内包 γ— PGAナノ粒子を実施例 6の記載のように製造した。マウ

38-46

スへの免疫は、 Tax ペプチド 100pmol、 lOpmolを含むサンプル 100 1ず

38-46

つ、 1週間おきに計 3回皮下注射するこで行った。最終免疫の 10日後、実施例 7に記載のように単核球を回収した。単核球（1 X 10⁷細胞 Zml)を、 30 μ g/ml マイトマイシン Cで 30分間処理し、 1 M Tax ペプチドを作用させた L929細胞（2. 5 X 10⁶細胞/ ml)と 4： 1の割合で混合し、 lOU/ml マウス IL 2を含む完全 RP MI1640培地中で 5日間共培養（37°C、 5% CO )し、エフェクター細胞とした。標

2

的細胞には、 Tax ペプチドを作用させた L929細胞を Na ⁵¹CrOで標

38-46 2 4 識 (0. 56 MBq/10⁶細胞、 37°C、 1時間）したものを用いた。標的細胞を 10⁴細胞 Zゥエルの濃度で 96ゥエルプレートに入れ、次に、エフェクター細胞を 12. 5、 25、 5 0、 100 X 10⁴細胞 Zゥエルの濃度でカ卩え、 37°Cにて 4時間インキュベーションし、上清中の⁵¹ Cr活性を測定した。 CTL活性を以下に示す式に従い算出した。

[0058] C.結果

図 9 (a)に示すように、 y—PGAナノ粒子を用いて免疫したマウスの脾臓において、 PBS免疫群（図 9 (d) )と比較して、 Tax 特異的 CTLの誘導が認められた。これ

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は、 CFAZTax 免疫群（図 9 (b) )よりも強力な抗腫瘍作用であった。また、 Tax

38-46 3 単独免疫群では CTL活性は全く認められなカゝつた（図 9 (c) )。この実施例で得ら

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れた Tax 固定ィ匕ナノ粒子もまた、実施例 6および 7で得られたものと同様の性質

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'特徴を有していた。

実施例 9

[0059] OVA固定ィ匕 γ— PGAナノ粒子を用いた腫瘍肺転移抑制試験

A.材料

B16メラノーマ細胞にハイグロマイシン B耐性遺伝子と共に OVA cDNAを導入した B16— OVA細胞は熊本大学大学院医学薬学研究部免疫識別学分野西村泰治先生より供与いただき、培養には 10% FBS、 50 M 2— MEおよび 200 μ g/ml ハイグロマイシン Bを含む DMEMを用いた。 C57ZBL6マウス（H— 2^b; 7〜10週齢、雌性）は日本 SLCより購入した。その他の材料は上述の通りである。

[0060] B.方法

C57BLZ6マウスの尾静脈内に B16— OVA細胞（1 X 10⁶細胞）を投与した。接種後 0、 3、 7日目に、上述の通り製造した OVA内包 γ—PGAナノ粒子（ γ—PGAナノ粒子 ZOVA)、 CFAによりェマルジヨン化した OVA (CFAZOVA)または OVA溶液 (OVA単独）を背部皮下に投与することで免疫した (n= 9)。用いた OVAは 100 μ gであった。ネガティブコントロールとして PBSを投与した。 25日目に肺を摘出してブアン溶液 (ピクリン酸飽和溶液:ホルムアルデヒド:氷酢酸 = 15 : 3 : 1)にて固定し、肺表面の転移コロニー数を実体顕微鏡下で計測した。統計的有意性をマン 'ホイットニー検定を用いて検定した。結果を、 PBS投与群における転移コロニー数に対する割合 (％)として表す (図 10)。

[0061] C.結果

y ー？0八ナノ粒子70¥八免疫群 < 0. 01)は、高い肺転移能を有する B16— OVA細胞の肺への生着を妨げる肺転移抑制効果を有することが確認できた。さらにその効果は CFAZOVA(pく 0. 01)よりも強力なものであった。また、 γ—PGAナノ粒子 ZOVAが治療においても有用であることが確認できた。

実施例 10

[0062] γ PGAナノ粒子投与局所の病理組織学的解析による γ— PGAナノ粒子の安全性の評価

A.方法

lOmg/ml γ—PGAナノ粒子、等量の PBSでエマルシヨン化した CFAおよび IF

A、または PBS (20 μ 1Ζマウス）をマウス足躕皮下に投与した。投与後 7日目に足躕を切断し、 10% 中性緩衝ホルマリンによる固定処理を行った後、ノラフィンブロックに包埋した。 5 mの組織切片を作製し、へマトキシリン—ェォシン染色した標本の病理組織学的観察を行った。

B.結果

CFAおよび IFAを投与したマウスの皮下組織にお、て炎症反応が誘導されて!、るのに対して、 y PGAナノ粒子は投与局所に若干の障害を与えるのみであり、観察された炎症性細胞の浸潤も僅かななものであった (データは示していない)。 γ -PG Αナノ粒子が高、安全性を有することが確認できた。

産業上の利用可能性

[0063] 本発明により、安全かつ有効なアジュバントおよびそれを利用したワクチンが得られるので、医薬品等の分野、例えば、疾病の予防薬、治療薬あるいは診断薬の製造分野において利用可能である。

Claims

請求の範囲

[I] アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用。

[2] ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ（ α—グルタミン酸）、ポリ —リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物力もなる群より選択されるものである、請求項 1記載の使用。

[3] ポリアミノ酸がポリ ( γ グルタミン酸)である請求項 2記載の使用。

[4] ポリアミノ酸が両親媒化されている、請求項 1記載の使用。

[5] ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、請求項 1から 4いずれか 1項記載の使用。

[6] ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法。

[7] ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ（ α グルタミン酸）、ポリ（ α リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物力もなる群より選択されるものである、請求項 6記載の使用方法。

[8] ポリアミノ酸がポリ ( y グルタミン酸)である請求項 7記載の使用方法。

[9] ポリアミノ酸が両親媒化されている、請求項 6記載の使用方法。

[10] ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、請求項 6から 9いずれか 1項記載の使用方法

[II] アジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチン。

[12] ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ（ α—グルタミン酸）、ポリ —リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物力もなる群より選択されるものである、請求項 11記載のワクチン。

[13] ポリアミノ酸がポリ ( γ グルタミン酸)である請求項 12記載のワクチン。

[14] ポリアミノ酸が両親媒ィ匕されている、請求項 11記載のワクチン。

[15] ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、請求項 11から 14いずれか 1項記載のヮクチン。

[16] ウィルス抗原を固定ィ匕した生分解性ナノ粒子。

[17] ウィルス抗原がレトロウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、フラビウィルス抗原、下痢症ウィルス抗原、およびコロナウィルス抗原カゝらなる群カゝら選択されるものである、請求項 16記載の生分解性ナノ粒子。

[18] ウィルス抗原がレトロウイルス抗原である、請求項 17記載の生分解性ナノ粒子。

[19] レトロウイルス抗原が HIV抗原である、請求項 18記載の生分解性ナノ粒子。

[20] ポリアミノ酸を骨格とする、請求項 16から 19のいずれか 1項記載の生分解性ナノ粒子。

[21] ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ —グルタミン酸）、ポリ —リジン）、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物力もなる群より選択されるものである、請求項 20記載の生分解性ナノ粒子。

[22] ポリアミノ酸がポリ ( γ グルタミン酸)である、請求項 21記載の生分解性ナノ粒子。

[23] ポリアミノ酸が両親媒化されて!/、る、請求項 20記載の生分解性ナノ粒子。

[24] 抗原がナノ粒子に内包されている、請求項 16から 23のいずれか 1項記載の生分解性ナノ粒子。

[25] 抗原がナノ粒子表面に存在する、請求項 16から 23のいずれか 1項記載の生分解性ナノ粒子。

[26] 請求項 16から 25のいずれか 1項記載の生分解性ナノ粒子を含むワクチン。

[27] 抗 HIVワクチンである、請求項 26記載のワクチン。

[28] 請求項 26記載のワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の免疫方法。

[29] 請求項 26記載のワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象における疾病の治療および Ζまたは予防方法。

[30] 疾病が HIVである、請求項 29記載の方法。

[31] 疾病の治療および Ζまたは予防のためのワクチンを製造するための、請求項 16から 25記載の生分解性ナノ粒子の使用。

[32] 疾病が HIVである、請求項 31記載の使用。