JPWO2008041703A1 - インフルエンザワクチン用アジュバントおよびインフルエンザワクチン - Google Patents
インフルエンザワクチン用アジュバントおよびインフルエンザワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2008041703A1 JPWO2008041703A1 JP2008537535A JP2008537535A JPWO2008041703A1 JP WO2008041703 A1 JPWO2008041703 A1 JP WO2008041703A1 JP 2008537535 A JP2008537535 A JP 2008537535A JP 2008537535 A JP2008537535 A JP 2008537535A JP WO2008041703 A1 JPWO2008041703 A1 JP WO2008041703A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- influenza
- poly
- influenza virus
- virus antigen
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本発明は、より効果的なインフルエンザワクチンを供給するため、体液性免疫と細胞性免疫の双方の活性化が可能なアジュバントおよびそれを用いたインフルエンザワクチンの提供を課題とする。本発明は、ポリアミノ酸を骨格とする生分解性ナノ粒子からなるインフルエンザワクチン用アジュバント、ならびに、インフルエンザウイルス抗原、および前記アジュバントを含有してなるインフルエンザワクチンを解決手段とする。ポリアミノ酸は、ポリ（γ−ポリグルタミン酸）を主体とするものが好ましい。
Description
本発明は、インフルエンザワクチン用アジュバントおよびインフルエンザワクチンに関する。詳しくは、生分解性ナノ粒子をアジュバントとして用いるインフルエンザワクチンに関する。
インフルエンザの発症を予防するためにインフルエンザ−ヘマグルチニン(ＨＡ)ワクチンが広く使用されている。しかし、ＨＡワクチンは接種局所の腫脹、疼痛および全身倦怠感などの副作用を惹起させることが問題点として指摘されている。この問題点を解決するための方法のひとつとして、効果的なアジュバントを用いてＨＡ接種量を減少させる手段が挙げられる。
アジュバントとして、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、リポソームなどが知られている。前記アジュバントは、免疫の増強を誘導することが確認されているが、インフルエンザワクチンに使用する場合に安全性や有効性に問題がある。より効果的なインフルエンザワクチンを供給するためには、安全性の高いアジュバントを用いて、体液性免疫と細胞性免疫の双方の活性化が必要とされる。
最近、有機ナノ粒子を生分解性材料として用いて合成し、医薬品や化粧品の機能性材料として役立てようとする検討が進められている。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）は、納豆の粘りの成分であり（非特許文献１）、様々な化合物を導入したポリ（γ−グルタミン酸）誘導体が知られている（特許文献１〜３、非特許文献２、３）。
特開２００２−８０５９３号公報
特開２００３−３２７６９３号公報
特開２００３−３４２３６７号公報
Biosci. Biotech. Biochem., 57(7), pp.1212-1213, 1993
Biomacromolecules, 4, pp.1132-1134, 2003
Macromol. Biosci., 4, pp.407-411, 2004
本発明の目的は、より効果的なインフルエンザワクチンを供給するため、体液性免疫と細胞性免疫の双方の活性化が可能なアジュバントおよびそれを用いたインフルエンザワクチンの提供である。
本発明者らは、ポリ-γ-グルタミン酸(γ−ＰＧＡ)のナノ粒子の研究開発に携わっており、当該ナノ粒子によるインフルエンザに対する感染防御免疫の増強の可能性について鋭意検討した結果、インフルエンザワクチンの新しいワクチンモデルの構築に成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕 ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるインフルエンザワクチン用アジュバント。
〔２〕 ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔１〕に記載のアジュバント。
〔３〕 ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔２〕に記載のアジュバント。
〔４〕 ポリアミノ酸が両親媒化されている、前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載のアジュバント。
〔５〕 ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、前記〔４〕に記載のアジュバント。
〔６〕 インフルエンザウイルス抗原、および前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載のアジュバントを含有しているインフルエンザワクチン。
〔７〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、前記〔６〕に記載のインフルエンザワクチン。
〔８〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、前記〔６〕に記載のインフルエンザワクチン。
〔９〕 インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、前記〔６〕に記載のインフルエンザワクチン。
〔１０〕 インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、前記〔６〕〜〔９〕いずれかに記載のインフルエンザワクチン。
〔１１〕 インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、前記〔６〕〜〔９〕いずれかに記載のインフルエンザワクチン。
〔１２〕 インフルエンザワクチンの製造のための、インフルエンザウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるアジュバントの使用。
〔１３〕 ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔１２〕に記載の使用。
〔１４〕 ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔１３〕に記載の使用。
〔１５〕 ポリアミノ酸が両親媒化されている、前記〔１２〕〜〔１４〕いずれかに記載の使用。
〔１６〕 ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、前記〔１５〕に記載の使用。
〔１７〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、前記〔１２〕に記載の使用。
〔１８〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、前記〔１２〕に記載の使用。
〔１９〕 インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、前記〔１２〕に記載の使用。
〔２０〕 インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、前記〔１２〕〜〔１９〕いずれかに記載の使用。
〔２１〕 インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、前記〔１２〕〜〔１９〕いずれかに記載の使用。
〔２２〕 インフルエンザウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるアジュバントを含有しているインフルエンザワクチンの有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザの予防または軽減方法。
〔２３〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２５〕 インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２６〕 インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、前記〔２２〕〜〔２５〕いずれかに記載の方法。
〔２７〕 インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、前記〔２２〕〜〔２５〕いずれかに記載の方法。
〔２８〕 前記〔６〕〜〔１１〕いずれかに記載のインフルエンザワクチン、および当該ワクチンをインフルエンザの予防または軽減のために使用し得るか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
〔２〕 ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔１〕に記載のアジュバント。
〔３〕 ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔２〕に記載のアジュバント。
〔４〕 ポリアミノ酸が両親媒化されている、前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載のアジュバント。
〔５〕 ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、前記〔４〕に記載のアジュバント。
〔６〕 インフルエンザウイルス抗原、および前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載のアジュバントを含有しているインフルエンザワクチン。
〔７〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、前記〔６〕に記載のインフルエンザワクチン。
〔８〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、前記〔６〕に記載のインフルエンザワクチン。
〔９〕 インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、前記〔６〕に記載のインフルエンザワクチン。
〔１０〕 インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、前記〔６〕〜〔９〕いずれかに記載のインフルエンザワクチン。
〔１１〕 インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、前記〔６〕〜〔９〕いずれかに記載のインフルエンザワクチン。
〔１２〕 インフルエンザワクチンの製造のための、インフルエンザウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるアジュバントの使用。
〔１３〕 ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔１２〕に記載の使用。
〔１４〕 ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔１３〕に記載の使用。
〔１５〕 ポリアミノ酸が両親媒化されている、前記〔１２〕〜〔１４〕いずれかに記載の使用。
〔１６〕 ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、前記〔１５〕に記載の使用。
〔１７〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、前記〔１２〕に記載の使用。
〔１８〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、前記〔１２〕に記載の使用。
〔１９〕 インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、前記〔１２〕に記載の使用。
〔２０〕 インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、前記〔１２〕〜〔１９〕いずれかに記載の使用。
〔２１〕 インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、前記〔１２〕〜〔１９〕いずれかに記載の使用。
〔２２〕 インフルエンザウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるアジュバントを含有しているインフルエンザワクチンの有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザの予防または軽減方法。
〔２３〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕 インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２５〕 インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２６〕 インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、前記〔２２〕〜〔２５〕いずれかに記載の方法。
〔２７〕 インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、前記〔２２〕〜〔２５〕いずれかに記載の方法。
〔２８〕 前記〔６〕〜〔１１〕いずれかに記載のインフルエンザワクチン、および当該ワクチンをインフルエンザの予防または軽減のために使用し得るか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
本発明のインフルエンザウイルス用アジュバントによると、従来のアジュバントでは達成できなかった細胞性免疫をも誘導することが可能である。すなわち、本発明のアジュバントは、インフルエンザウイルス抗原とともに生体内に投与した場合に、当該抗原に対する抗体産生効果のみならず、当該抗原特異的ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）の誘導という効果をも奏することが可能となり、インフルエンザ感染に対する有効な予防手段を提供することができる。
本発明のインフルエンザワクチンによると、体液性免疫と細胞性免疫とに有効に作用し、少ない抗原量でインフルエンザ感染を有意に予防することができる。
本発明のインフルエンザワクチンによると、体液性免疫と細胞性免疫とに有効に作用し、少ない抗原量でインフルエンザ感染を有意に予防することができる。
本発明は、ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるインフルエンザワクチン用アジュバントを提供する。
本発明のアジュバントを構成する「生分解性ナノ粒子」とは、ポリアミノ酸を主成分とし、生体内で酵素等の作用を受け、所定の時間経過後に粒子の崩壊およびポリアミノ酸骨格がアミノ酸のモノマーまたはオリゴマーに分解可能な粒子をいう。
本発明における生分解性ナノ粒子の「主成分」とは、ナノ粒子を構成する骨格をいう。
本発明における生分解性ナノ粒子の形状は特に限定されるものではないが、一般的には球状である。球状の粒子のサイズは通常１０ｎｍ〜１００μｍ程度であり、好ましくは８０ｎｍ〜５００ｎｍである。このようなサイズにすることによって、単位重量当りの粒子表面積増加に伴うインフルエンザウイルス抗原の固定化量の増加、抗原提示細胞への抗原の取り込み促進、それに伴うＣＴＬの活性化、抗体産生の誘導などの効果が生じる。
前記粒子の形状は、顕微鏡にて観察し、確認することができる。前記粒子のサイズは、ナノ粒子の水分散液を動的光散乱により測定した平均粒子径をいう。なお、球状以外の形状のナノ粒子のサイズは、球状のナノ粒子に準じて求めることができる。
前記生分解性ナノ粒子の骨格となるポリアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸または人工アミノ酸の重合体であってもよい。安全性または毒性の面から、天然に存在するアミノ酸からなるポリアミノ酸が好ましいが、その由来は天然物であっても合成品であってもよい。天然に存在するアミノ酸としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンまたはアスパラギンが好ましい。また、アミノ酸はＬ−体であってもＤ−体であってもよい。ポリアミノ酸中にＬ−体とＤ−体が所定の割合で含まれていてもよい。
天然に存在するアミノ酸からなるポリアミノ酸としては、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）またはポリアスパラギンが好ましい。所期の目的を達成し、ナノ粒子に様々な特性を付与するためには、前記ポリアミノ酸の修飾体、それらの誘導体またはそれらの混合物も本発明の好ましいポリアミノ酸に含まれる。特に好ましいポリアミノ酸は、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体またはそれらの混合物である。
「修飾アミノ酸」、「アミノ酸誘導体」、ポリアミノ酸の「修飾体」および「誘導体」という用語は、当該分野において通常使用される意味を有するものとする。ポリアミノ酸の「修飾体」および「誘導体」の例としては、構成アミノ酸の一部を別のアミノ酸としたもの、構成アミノ酸の利用可能な官能基を用いて修飾したもの等があげられる。具体的には、ポリ（γ−グルタミン酸）のペプチド鎖中に１種またはそれ以上の他のアミノ酸、その修飾体もしくは誘導体を導入したもの、グラフト共重合体となっているもの、またはポリ（ε−リジン）の構成アミノ酸リジンの利用可能なα−位の一部をメチル化したもの等があげられる。
ポリアミノ酸の「混合物」とは、２種以上のアミノ酸を構成成分とするものであり、前記例示したポリアミノ酸、それらの修飾体およびそれらの誘導体を構成するアミノ酸から２種以上選択することが好ましい。
好ましい「修飾体」または「誘導体」の例として、ポリアミノ酸が両親媒化されるように、ポリアミノ酸を修飾または誘導したものがあげられる。例えば、親水性ポリアミノ酸の側鎖に疎水性アミノ酸を導入して、所望の親水性−疎水性のバランスとすることもできる。ポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体であるポリアミノ酸が好適な具体例としてあげられる。かかるポリアミノ酸は、分子内および分子間の疎水性基の会合によりナノ粒子化が容易である点からも好ましい。
ポリアミノ酸は、アミノ酸以外の構成成分、例えば、糖質、脂質等を含んでいてもよい。好ましいポリアミノ酸は、構成成分の５０重量％以上がアミノ酸である。
ポリアミノ酸においてすべての構成アミノ酸間の結合は、同一種類のものであってもよく、異なる種類のものであってもよい。例えば、すべての構成アミノ酸がペプチド結合によって結合したものであってもよく、部分的または全体的にペプチド結合以外の結合またはリンカーによりアミノ酸が結合したものであってもよい。ペプチド結合以外の結合としては、エステル結合、エーテル結合等があげられ、リンカーとしては、グルタルアルデヒド、ジイソシアネート等があげられるが、これらに限定されない。さらに、ポリアミノ酸の官能基間において架橋されていてもよい。架橋することにより、ポリアミノ酸の物性を変化させ、所望のアジュバント特性を得ることも可能である。架橋剤としては、カルボジイミド、ジグリシジルエステル等があげられるが、これらに限定されない。
ポリアミノ酸の分子量は、特に限定されるものではないが、所望の粘度や溶解度に応じて変更されうる。分子量は、通常１０００〜５００万の範囲である。好ましくは５０００〜２００万の範囲である。前記分子量は、水溶液もしくは有機溶媒中でゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された値である。
ポリアミノ酸の製造は、化学合成法、発酵法などの公知の方法を適宜選択して行うことができる。ポリアミノ酸のナノ粒子化は、公知の方法により行うことができる。例えば、液中乾燥法、噴霧乾燥法、球形晶析法、溶媒置換法（沈殿・透析法）、直接超音波分散法を用いることができる。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）またはポリ（ε−リジン）からなる生分解性ナノ粒子は、溶媒置換法により製造することができる。このような方法を適宜選択または組合わせて、生分解性ナノ粒子の材料、構成成分、分子量、サイズ、電荷その他のパラメータを目的に応じたものとすることができる。
本発明は、前記アジュバントおよびインフルエンザウイルス抗原を含有するインフルエンザワクチンを提供する。
本発明においてインフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、ＢおよびＣ型に分けられる。インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものである。Ａ型は、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種の亜型に区別されている。本発明においては、Ａ型インフルエンザウイルスが好ましい。Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。
本発明においてインフルエンザウイルス抗原とは、前記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、精製ウイルス粒子を脂質エンベロープが可溶化されるように有機溶媒／界面活性剤もしくは他の試薬で分解されたサブビリオン、またはＨＡおよびＮＡを始めとするウイルスサブユニットでもよく、ウイルス全粒子でもよい。免疫原性の観点から、ＨＡまたは全ウイルス粒子が好ましい。ウイルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。
インフルエンザウイルス抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物またはインフルエンザの患者から単離されたウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製してもよい。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。
本発明のインフルエンザワクチンは、前記インフルエンザウイルス抗原と前記アジュバントとしての生分解性ナノ粒子とが単純に混合された状態で含有されていてもよい（以下、混合ワクチンと称する）。あるいは、本発明のインフルエンザワクチンは、前記インフルエンザウイルス抗原が前記生分解性ナノ粒子内に包含されていてもよく（以下、内包ワクチンと称する）、前記インフルエンザウイルス抗原が前記生分解性ナノ粒子表面に固定されていてもよい（以下、外包ワクチンと称する）。ワクチンに含まれるインフルエンザウイルス抗原は、１種または２種以上を適宜選択して用いることができる。また、複数の亜型に由来する１種の抗原（例、ＨＡ）を用いてもよい。
本発明のワクチンに含まれるインフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子との比は、抗原の種類やナノ粒子の特性により一概には規定できないが、例えば、ＨＡ抗原とポリ（γ−グルタミン酸）とを用いた場合、重量比で１：１〜１：１０００が例示され、好ましくは１：１０〜１：５００である。
前記混合ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とを所定の割合で溶液中で混合して製造することができる。この場合、抗原と生分解性ナノ粒子は、イオン結合、分子間力による結合、吸着による結合などにより、ワクチン中で互いに結合していてもよいし、単純に混在している状態であっても問題はない。
前記内包ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子の内部に包含されるように公知の方法により製造することができる。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）に疎水性アミノ酸を共有結合により導入し、これを有機溶媒に溶解し、次に抗原水溶液に滴下することにより、ナノ粒子化と同時に抗原が当該粒子内に包含され、固定化することができる。
前記外包ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子の表面に結合するように公知の方法により製造することができる。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）ナノ粒子の表面に存在するカルボキシ基とタンパク質抗原のアミノ基とを常法により共有結合させることにより、ナノ粒子の表面に抗原を固定化することができる。したがって、本発明においては、外包ワクチンはナノ粒子と抗原とが共有結合しているワクチンを意味し、それ以外の結合様式で抗原がナノ粒子の表面に存在するか、もしくは抗原とナノ粒子が単純に溶液中に混在している状態のワクチンは混合ワクチンである。
本発明のワクチンは、さらに医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。前記医薬として許容されうる担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を限定なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せがあげられる。また、これに乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）等が適宜配合される。
本発明のワクチンは、全身に投与されてもよく、局所投与でもよい。全身投与の場合、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、腹腔内等への投与があげられ、投与方法としては、注射または点滴などがあげられる。局所投与の場合、鼻腔内、口腔内への投与があげられ、投与方法としては、噴霧、塗布、経口などがあげられる。
本発明のワクチンの投与対象は、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類、鳥類等があげられる。
本発明のワクチンは、ワクチンの投与様式に適合した形態を有することが好ましく、例えば、注射可能な形態として、溶液、懸濁液または乳化液が挙げられる。あるいは、液体溶液、懸濁液または乳化液に供せられる形態として、凍結乾燥製剤等の固体形態が挙げられる。
本発明のワクチンを用いて、インフルエンザを予防またはその症状を軽減することができる。本発明は、有効免疫感作量の本発明のワクチンを対象に投与する工程を含むインフルエンザの予防または軽減方法を提供する。
ワクチンの投与方法としては、前記例示した通りである。投与量は、対象の年齢、性別、体重等を考慮して決められるが、抗原としてＨＡを用いた場合、通常５μｇ〜５０μｇを１回または２回以上投与することができる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、１〜４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。抗原としてウイルス全粒子を用いた場合、ＨＡ換算で投与量を設定すればよい。前記ＨＡの重量は、ＳＲＤ力価もしくはＬｏｗｒｙ法により測定した値である。
以下、実施例等により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等により何ら限定されるものではない。
実施例１
ワクチンの製造
精製インフルエンザウイルスとして、Ａ/ニューカレドニア/２０/９９（Ｈ１Ｎ１）株の原液（原液番号ＦＴＨＡ Ｋ０５１９、財団法人大阪大学微生物病研究会観音寺研究所）を用いた。前記ウイルス原液中のタンパク質量は、１８７０μｇ/ｍＬであり、ＨＡは６４２μｇ/ｍＬであった。前記濃度はＬｏｗｒｙ法とＳＲＤ力価より測定した値である。
（１）内包型ワクチンの製造
ＨＡ（ウイルス原液の１、２、４または８倍希釈物）のＰＢＳ溶液５０μＬに、０．６Ｍ塩化ナトリウム５０μＬおよび１０ｍｇ/ｍＬのポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体（J. Control. Release 108, 226 (2005)、Chem. Lett. 33, 398 (2004)、Biomacromolecules 7, 297 (2006)、J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 875 (2006)）のＤＭＳＯ液１００μＬを加え、１４５００ｒｐｍ（14000×ｇ）で１０分、室温で遠心分離した。得られたペレットに２００μＬの再蒸留水を加えて前記と同じ条件で遠心分離する操作を２回繰り返し、ペレットを洗浄した。洗浄後のペレットに９５μＬの再蒸留水および５μＬの２０ｘＰＢＳを加え、目的の内包型ワクチン（１０ｍｇアジュバント/ｍＬ）を得た（粒子径２００−４００ｎｍ）。
（２）外包型ワクチンの製造
２０ｍｇ/ｍＬのポリ（γ−グルタミン酸）ナノ粒子（粒子径８０−３００ｎｍ、大阪大学大学院工学研究科教授、明石満博士により製造、製法：J. Control. Release 108, 226 (2005)、Chem. Lett. 33, 398 (2004)、Biomacromolecules 7, 297 (2006)、J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 875 (2006)）の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）５０μＬに、２ｍｇ/ｍＬのＷＳＣ（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（水溶性カルボジイミド））の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）５０μＬを加え、室温で２０分静置した後、１４５００ｒｐｍ（14000×ｇ）で１０分遠心分離した。得られたペレットに１００μＬの再蒸留水および１００μＬのＨＡ（ウイルス原液の１、２、４または８倍希釈物）を加え、４℃で一晩放置した。次いで、１４５００ｒｐｍ（14000×ｇ）で１０分室温で遠心分離し、ナノ粒子を回収した。得られたペレットに９５μＬの再蒸留水および５μＬの２０ｘＰＢＳを加え、目的の外包型ワクチン（１０ｍｇアジュバント/ｍＬ）を得た。
（３）混合型ワクチンの製造
２０ｍｇ/ｍＬのポリ（γ−グルタミン酸）ナノ粒子（粒子径１５０−３００ｎｍ、大阪大学大学院工学研究科教授、明石満博士より製造、製法：J. Control. Release 108, 226 (2005)、Chem. Lett. 33, 398 (2004)、Biomacromolecules 7, 297 (2006)、J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 875 (2006)）含有ＰＢＳ懸濁液２５μＬに、４μＬのＨＡ（ウイルス原液）とＰＢＳを１ｍＬを加えて数分間ゆるやかに攪拌することによって、目的の混合型ワクチン（ＨＡ７．５μｇ，アジュバント５００μｇ/ｍＬ溶液）を得た。
ワクチンの製造
精製インフルエンザウイルスとして、Ａ/ニューカレドニア/２０/９９（Ｈ１Ｎ１）株の原液（原液番号ＦＴＨＡ Ｋ０５１９、財団法人大阪大学微生物病研究会観音寺研究所）を用いた。前記ウイルス原液中のタンパク質量は、１８７０μｇ/ｍＬであり、ＨＡは６４２μｇ/ｍＬであった。前記濃度はＬｏｗｒｙ法とＳＲＤ力価より測定した値である。
（１）内包型ワクチンの製造
ＨＡ（ウイルス原液の１、２、４または８倍希釈物）のＰＢＳ溶液５０μＬに、０．６Ｍ塩化ナトリウム５０μＬおよび１０ｍｇ/ｍＬのポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体（J. Control. Release 108, 226 (2005)、Chem. Lett. 33, 398 (2004)、Biomacromolecules 7, 297 (2006)、J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 875 (2006)）のＤＭＳＯ液１００μＬを加え、１４５００ｒｐｍ（14000×ｇ）で１０分、室温で遠心分離した。得られたペレットに２００μＬの再蒸留水を加えて前記と同じ条件で遠心分離する操作を２回繰り返し、ペレットを洗浄した。洗浄後のペレットに９５μＬの再蒸留水および５μＬの２０ｘＰＢＳを加え、目的の内包型ワクチン（１０ｍｇアジュバント/ｍＬ）を得た（粒子径２００−４００ｎｍ）。
（２）外包型ワクチンの製造
２０ｍｇ/ｍＬのポリ（γ−グルタミン酸）ナノ粒子（粒子径８０−３００ｎｍ、大阪大学大学院工学研究科教授、明石満博士により製造、製法：J. Control. Release 108, 226 (2005)、Chem. Lett. 33, 398 (2004)、Biomacromolecules 7, 297 (2006)、J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 875 (2006)）の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）５０μＬに、２ｍｇ/ｍＬのＷＳＣ（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（水溶性カルボジイミド））の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）５０μＬを加え、室温で２０分静置した後、１４５００ｒｐｍ（14000×ｇ）で１０分遠心分離した。得られたペレットに１００μＬの再蒸留水および１００μＬのＨＡ（ウイルス原液の１、２、４または８倍希釈物）を加え、４℃で一晩放置した。次いで、１４５００ｒｐｍ（14000×ｇ）で１０分室温で遠心分離し、ナノ粒子を回収した。得られたペレットに９５μＬの再蒸留水および５μＬの２０ｘＰＢＳを加え、目的の外包型ワクチン（１０ｍｇアジュバント/ｍＬ）を得た。
（３）混合型ワクチンの製造
２０ｍｇ/ｍＬのポリ（γ−グルタミン酸）ナノ粒子（粒子径１５０−３００ｎｍ、大阪大学大学院工学研究科教授、明石満博士より製造、製法：J. Control. Release 108, 226 (2005)、Chem. Lett. 33, 398 (2004)、Biomacromolecules 7, 297 (2006)、J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 875 (2006)）含有ＰＢＳ懸濁液２５μＬに、４μＬのＨＡ（ウイルス原液）とＰＢＳを１ｍＬを加えて数分間ゆるやかに攪拌することによって、目的の混合型ワクチン（ＨＡ７．５μｇ，アジュバント５００μｇ/ｍＬ溶液）を得た。
実施例２
インフルエンザワクチンの免疫原性
実施例１で製造したインフルエンザＨＡワクチンを用いて、ポリ（γ−グルタミン酸）（γ-ＰＧＡ）のアジュバント効果を、ＨＡに対する免疫原性を増強し得るか否かの観点から、下記（１）〜（３）について検討した。
インフルエンザワクチンの免疫原性
実施例１で製造したインフルエンザＨＡワクチンを用いて、ポリ（γ−グルタミン酸）（γ-ＰＧＡ）のアジュバント効果を、ＨＡに対する免疫原性を増強し得るか否かの観点から、下記（１）〜（３）について検討した。
マウスの免疫方法
マウス(ＢＡＬＢ／ｃ ４週齢、雌)を以下の６グループ（一群５〜８匹）に分け、皮下注射によりワクチンまたは抗原を投与した。対照群は、ＰＢＳを皮下注射した。
i)ＰＢＳを皮下注射
ii)ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
iii)Ａｌ(ＯＨ)３ (100μg) + ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
iv)内包型γ-ＰＧＡ(100μg) + ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
v)外包型 γ-ＰＧＡ(100μg) + ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
vi)混合型γ-ＰＧＡ(100μg) + ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
マウス(ＢＡＬＢ／ｃ ４週齢、雌)を以下の６グループ（一群５〜８匹）に分け、皮下注射によりワクチンまたは抗原を投与した。対照群は、ＰＢＳを皮下注射した。
i)ＰＢＳを皮下注射
ii)ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
iii)Ａｌ(ＯＨ)３ (100μg) + ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
iv)内包型γ-ＰＧＡ(100μg) + ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
v)外包型 γ-ＰＧＡ(100μg) + ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
vi)混合型γ-ＰＧＡ(100μg) + ＨＡ(1.5μg)を皮下注射
免疫スケジュールは、下記の通りであった。
0日目 BALB/c (4週齢、雌)に初回免疫
7日目 2回目免疫
14日目 血液、脾臓回収
0日目 BALB/c (4週齢、雌)に初回免疫
7日目 2回目免疫
14日目 血液、脾臓回収
（１）ＨＡ免疫後のマウスリンパ球のＨＡ再刺激に対する増殖活性の変化
上記免疫スケジュールで免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾臓単核球を採取した。前記単核球を５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるように懸濁し、９６穴プレートに２００μＬずつ細胞懸濁液を分注した。抗原刺激は、９６穴プレート中の単核球に各種濃度のＨＡ液（１μｇ／ｍＬ−１０ｎｇ／ｍＬ）を加えて３日間培養（３７℃、５％ＣＯ２下）することにより行った。次いで、９６穴プレートに３Ｈ-ＴｄＲ（０．５μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加して１８時間培養を続け、セルハーベスターにて細胞を採取し、抗原刺激した単核球への３Ｈ-ＴｄＲの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した（図１）。
上記免疫スケジュールで免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾臓単核球を採取した。前記単核球を５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるように懸濁し、９６穴プレートに２００μＬずつ細胞懸濁液を分注した。抗原刺激は、９６穴プレート中の単核球に各種濃度のＨＡ液（１μｇ／ｍＬ−１０ｎｇ／ｍＬ）を加えて３日間培養（３７℃、５％ＣＯ２下）することにより行った。次いで、９６穴プレートに３Ｈ-ＴｄＲ（０．５μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加して１８時間培養を続け、セルハーベスターにて細胞を採取し、抗原刺激した単核球への３Ｈ-ＴｄＲの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した（図１）。
図１より、ＨＡ抗原をγ-ＰＧＡともに動物に皮下接種した場合、Ａｌ(ＯＨ)３とともに接種した場合と同レベルのＨＡ特異的リンパ球の増殖反応を増強または誘導することがわかった。
（２）ＨＩ活性の変化（抗ウイルス血清によるヘマグルチニンの赤血球凝集に対する抑制）
上記免疫スケジュールで免疫したマウスの血液を採取し、血清を分離した。前記血清をReceptor destroying enzyme (RDE) で処理し、生理食塩水で２．５倍に希釈した。希釈した血清に血球を入れ、血清中の非特異的凝集反応因子を処理した後、４ＨＡ／２５μＬのウイルス抗原を添加し、室温にて３０分反応させ、次いで、ニワトリ赤血球液を添加し、室温で４０分反応させ、凝集能を判定した（図２）。
上記免疫スケジュールで免疫したマウスの血液を採取し、血清を分離した。前記血清をReceptor destroying enzyme (RDE) で処理し、生理食塩水で２．５倍に希釈した。希釈した血清に血球を入れ、血清中の非特異的凝集反応因子を処理した後、４ＨＡ／２５μＬのウイルス抗原を添加し、室温にて３０分反応させ、次いで、ニワトリ赤血球液を添加し、室温で４０分反応させ、凝集能を判定した（図２）。
図２より、ＨＡ抗原をγ-ＰＧＡともに動物に皮下接種した場合、ＨＡに対する抗体産生を増強させることができることがわかった。ＨＡに対する抗体産生能は、ＨＡ抗原をＡｌ(ＯＨ)3とともに皮下接種した場合の方が高かった。
（３）ＣＴＬ誘導の変化
１）ＣＴＬの調製
上記免疫スケジュールで免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾臓単核球を２ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ 取りだし、遠沈管にてインフルエンザウイルス（１０−２０ ＰＦＵ／Ｃｅｌｌ／０．２ ｍＬ 無血清ＲＰＭＩ−１６４０）を６０分感染させた。感染細胞を洗浄し、新たに５ｍＬ ５％ＦＢＳ含有 ＲＰＭＩ−１６４０を添加し、３時間おき、上清を除去した。２５ｃｍ２カルチャーフラスコに２ｘ１０６ｃｅｌｌｓの感染細胞と５ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓの脾臓細胞を加え、５％ ＦＢＳ、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ ｘ １０−５Ｍ β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、１００ Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．０３％ グルタミン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地１０ ｍＬにて培養した。
培養６日後に生細胞を回収し（Ficoll-paque 1.078, ４９０×ｇ, ３０分, 室温下での比重遠心による）、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地にて１０７ｃｅｌｌｓ ／ｍＬに調製し、ＣＴＬとした。
２）標的細胞の調製
１０５ｃｅｌｌｓのＰ８１５細胞に、インフルエンザウイルス１０ ＰＦＵ／ｃｅｌｌを１時間感染させた。次いで、前記細胞を無血清ＭＥＭ培地で３回洗浄した。完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ ｘ １０−５Ｍ β−ＭＥ、１００ Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．０３％グルタミン含有）にて１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬになるように調製した。
３)細胞傷害試験
９６穴マルチプレート（丸底）の左側３−１２行に完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を１００μＬずつ分注し、次に、９６穴マルチプレート（丸底）の左２行にエフェクターＣＴＬ懸濁液を１５０μＬずつ分注した。３倍希釈法により２wellずつ希釈し、希釈系列を作製した。
各wellに標的細胞１００μＬずつ分注し、４時間培養した（３７℃、５％ ＣＯ２下）。培養終了４５分前にTarget 100% killing sample(標的細胞だけのサンプル８wellのうちの左半分)とVolume correction control(培地だけ入っている８wellのうちの左半分)に溶解溶液を１／１０量を入れた。培養終了後、遠心機で２５０ ｘ ｇで４分間遠心分離し、各サンプル５０μＬずつ新しい９６穴平底マルチプレートに移した。
Cytotox96のアッセイバッファーを３７℃水浴中で融解し、遮光下で基質混合液とあわせてよく混ぜた。混合液５０μＬずつを上記９６穴平底プレートに入っているサンプルに入れた後、３７℃で３０分培養した。次いで、前記プレートに停止溶液を５０μＬずつ入れて反応を停止した。４９０ｎｍで吸光度を測定した（図３）。
１）ＣＴＬの調製
上記免疫スケジュールで免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾臓単核球を２ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ 取りだし、遠沈管にてインフルエンザウイルス（１０−２０ ＰＦＵ／Ｃｅｌｌ／０．２ ｍＬ 無血清ＲＰＭＩ−１６４０）を６０分感染させた。感染細胞を洗浄し、新たに５ｍＬ ５％ＦＢＳ含有 ＲＰＭＩ−１６４０を添加し、３時間おき、上清を除去した。２５ｃｍ２カルチャーフラスコに２ｘ１０６ｃｅｌｌｓの感染細胞と５ ｘ １０６ ｃｅｌｌｓの脾臓細胞を加え、５％ ＦＢＳ、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ ｘ １０−５Ｍ β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、１００ Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．０３％ グルタミン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地１０ ｍＬにて培養した。
培養６日後に生細胞を回収し（Ficoll-paque 1.078, ４９０×ｇ, ３０分, 室温下での比重遠心による）、５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地にて１０７ｃｅｌｌｓ ／ｍＬに調製し、ＣＴＬとした。
２）標的細胞の調製
１０５ｃｅｌｌｓのＰ８１５細胞に、インフルエンザウイルス１０ ＰＦＵ／ｃｅｌｌを１時間感染させた。次いで、前記細胞を無血清ＭＥＭ培地で３回洗浄した。完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ ｘ １０−５Ｍ β−ＭＥ、１００ Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．０３％グルタミン含有）にて１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬになるように調製した。
３)細胞傷害試験
９６穴マルチプレート（丸底）の左側３−１２行に完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を１００μＬずつ分注し、次に、９６穴マルチプレート（丸底）の左２行にエフェクターＣＴＬ懸濁液を１５０μＬずつ分注した。３倍希釈法により２wellずつ希釈し、希釈系列を作製した。
各wellに標的細胞１００μＬずつ分注し、４時間培養した（３７℃、５％ ＣＯ２下）。培養終了４５分前にTarget 100% killing sample(標的細胞だけのサンプル８wellのうちの左半分)とVolume correction control(培地だけ入っている８wellのうちの左半分)に溶解溶液を１／１０量を入れた。培養終了後、遠心機で２５０ ｘ ｇで４分間遠心分離し、各サンプル５０μＬずつ新しい９６穴平底マルチプレートに移した。
Cytotox96のアッセイバッファーを３７℃水浴中で融解し、遮光下で基質混合液とあわせてよく混ぜた。混合液５０μＬずつを上記９６穴平底プレートに入っているサンプルに入れた後、３７℃で３０分培養した。次いで、前記プレートに停止溶液を５０μＬずつ入れて反応を停止した。４９０ｎｍで吸光度を測定した（図３）。
図３より、ＨＡ抗原をγ-ＰＧＡともに動物に接種した場合、ＬＤＨ法で見られがちである非特異的な細胞傷害反応が高いために有意差がみられなかったものの、γ−ＰＧＡによるインフルエンザ感染細胞特異的な細胞傷害性の増強の傾向がみられた。
４）IFN-γ ELISPOTアッセイ
Cytoscreen 96穴プレートに抗IFN-γ抗体(クローンRA-6A2, 5μg/mL)を１００μＬずつ分注し、４℃で一晩被覆した。次いで、前記プレートをＰＢＳにて４回洗浄し、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を２００μＬずつ入れ、３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、培地を除去し、前記ＣＴＬアッセイと同じ要領で作製したエフェクター細胞（２ ｘ １０５, １０５, ５ ｘ １０４， ２．５ ｘ １０４cells）と標的細胞(Ｐ８１５細胞に１ ＦＦＵ／ｃｅｌｌの割合でウイルス感染させたもの、１０５cells)を入れて、３７℃、５％ ＣＯ２下で２４時間培養した。プレートを６回洗浄（PBS-0.1%Tween20）し、ビオチン結合抗IFN-γ抗体（クローンXMG-1.2）を10% FBS-PBS-0.1%Tween20で抗体濃度を１μg／mLに希釈したうえで１００μＬずつ播いて、室温下で２時間反応させた。プレートを５回洗浄(PBS-0.1%Tween 20)し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン(１：８００希釈)を１００μＬずつ播いて、室温下で１時間反応させた。プレートを５回洗浄(PBS-0.1%Tween20)し、ＴＭＢ−Ｈで発色させ(１５分〜３０分)、細胞傷害性Ｔ細胞から産生されるIFN-γのスポット数をカウントした（図４）。
Cytoscreen 96穴プレートに抗IFN-γ抗体(クローンRA-6A2, 5μg/mL)を１００μＬずつ分注し、４℃で一晩被覆した。次いで、前記プレートをＰＢＳにて４回洗浄し、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を２００μＬずつ入れ、３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、培地を除去し、前記ＣＴＬアッセイと同じ要領で作製したエフェクター細胞（２ ｘ １０５, １０５, ５ ｘ １０４， ２．５ ｘ １０４cells）と標的細胞(Ｐ８１５細胞に１ ＦＦＵ／ｃｅｌｌの割合でウイルス感染させたもの、１０５cells)を入れて、３７℃、５％ ＣＯ２下で２４時間培養した。プレートを６回洗浄（PBS-0.1%Tween20）し、ビオチン結合抗IFN-γ抗体（クローンXMG-1.2）を10% FBS-PBS-0.1%Tween20で抗体濃度を１μg／mLに希釈したうえで１００μＬずつ播いて、室温下で２時間反応させた。プレートを５回洗浄(PBS-0.1%Tween 20)し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン(１：８００希釈)を１００μＬずつ播いて、室温下で１時間反応させた。プレートを５回洗浄(PBS-0.1%Tween20)し、ＴＭＢ−Ｈで発色させ(１５分〜３０分)、細胞傷害性Ｔ細胞から産生されるIFN-γのスポット数をカウントした（図４）。
図４より、ＨＡ抗原をγ-ＰＧＡともに動物に２回皮下接種した場合、Ａｌ(ＯＨ)3とともに皮下注射した場合と比べて、IFN-γ産生する感染細胞特異的細胞傷害性Ｔ細胞数が増加することが示され、図３に示したγ-ＰＧＡ添加による細胞傷害性Ｔ細胞活性増強の傾向を支持する結果となった。これらのことから、γ-ＰＧＡは、Ａｌ(ＯＨ)3よりもはるかに強力な細胞傷害反応を誘導することがわかる。
γ−ＰＧＡナノ粒子をアジュバントとしてＨＡワクチンに用いることによりＨＡ単独の場合と比べて有意に高いＨＩ抗体価とＨＡ刺激に対する細胞増殖活性を示した。特にＨＡワクチンとγ−ＰＧＡナノ粒子を混合した標品を免疫した場合でのＨＩ抗体価、ＨＡ刺激に対する細胞増殖活性および、インフルエンザ感染細胞特異的な細胞傷害性Ｔ細胞誘導能は、ＨＡワクチンと水酸化アルミニウムを混合した場合と比べて高い傾向を示した。以上の結果より、γ−ＰＧＡナノ粒子はＨＡと混合することによって、ＨＡ抗原に対する体液性および細胞性免疫の誘導を増強させる新しいタイプのアジュバントとして有用である可能性が示唆された。
本発明のインフルエンザウイルス用アジュバントによると、従来のアジュバントでは達成できなかった細胞性免疫をも誘導することが可能である。本発明のインフルエンザワクチンによると、体液性免疫と細胞性免疫とに有効に作用し、少ない抗原量でインフルエンザ感染を有意に予防することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００６−２７１２７３（出願日：２００６年１０月２日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含される。
本出願は、日本で出願された特願２００６−２７１２７３（出願日：２００６年１０月２日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含される。
Claims (28)
- ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるインフルエンザワクチン用アジュバント。
- ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである請求項１に記載のアジュバント。
- ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである請求項２に記載のアジュバント。
- ポリアミノ酸が両親媒化されている、請求項１〜３いずれかに記載のアジュバント。
- ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、請求項４に記載のアジュバント。
- インフルエンザウイルス抗原、および請求項１〜５いずれかに記載のアジュバントを含有しているインフルエンザワクチン。
- インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、請求項６に記載のインフルエンザワクチン。
- インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、請求項６に記載のインフルエンザワクチン。
- インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、請求項６に記載のインフルエンザワクチン。
- インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、請求項６〜９いずれかに記載のインフルエンザワクチン。
- インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、請求項６〜９いずれかに記載のインフルエンザワクチン。
- インフルエンザワクチンの製造のための、インフルエンザウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるアジュバントの使用。
- ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである請求項１２に記載の使用。
- ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである請求項１３に記載の使用。
- ポリアミノ酸が両親媒化されている、請求項１２〜１４いずれかに記載の使用。
- ポリアミノ酸がポリ（γ−グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体である、請求項１５に記載の使用。
- インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、請求項１２に記載の使用。
- インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、請求項１２に記載の使用。
- インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、請求項１２に記載の使用。
- インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、請求項１２〜１９いずれかに記載の使用。
- インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、請求項１２〜１９いずれかに記載の使用。
- インフルエンザウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるアジュバントを含有しているインフルエンザワクチンの有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザの予防または軽減方法。
- インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、請求項２２に記載の方法。
- インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、請求項２２に記載の方法。
- インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、請求項２２に記載の方法。
- インフルエンザウイルス抗原がＨＡ分子である、請求項２２〜２５いずれかに記載の方法。
- インフルエンザウイルス抗原がウイルス全粒子である、請求項２２〜２５いずれかに記載の方法。
- 請求項６〜１１いずれかに記載のインフルエンザワクチン、および当該ワクチンをインフルエンザの予防または軽減のために使用し得るか、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006271273 | 2006-10-02 | ||
| JP2006271273 | 2006-10-02 | ||
| PCT/JP2007/069289 WO2008041703A1 (fr) | 2006-10-02 | 2007-10-02 | Adjuvant pour vaccin contre la grippe et vaccin contre la grippe |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2008041703A1 true JPWO2008041703A1 (ja) | 2010-02-04 |
Family
ID=39268557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008537535A Pending JPWO2008041703A1 (ja) | 2006-10-02 | 2007-10-02 | インフルエンザワクチン用アジュバントおよびインフルエンザワクチン |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPWO2008041703A1 (ja) |
| WO (1) | WO2008041703A1 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9492400B2 (en) | 2004-11-04 | 2016-11-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals |
| US9267937B2 (en) | 2005-12-15 | 2016-02-23 | Massachusetts Institute Of Technology | System for screening particles |
| ES2776100T3 (es) | 2006-03-31 | 2020-07-29 | Massachusetts Inst Technology | Sistema para el suministro dirigido de agentes terapéuticos |
| US9381477B2 (en) | 2006-06-23 | 2016-07-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Microfluidic synthesis of organic nanoparticles |
| US9217129B2 (en) | 2007-02-09 | 2015-12-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Oscillating cell culture bioreactor |
| WO2008124632A1 (en) | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Amphiphilic compound assisted nanoparticles for targeted delivery |
| AU2008314647B2 (en) | 2007-10-12 | 2013-03-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Vaccine nanotechnology |
| US8277812B2 (en) | 2008-10-12 | 2012-10-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen |
| US8343498B2 (en) * | 2008-10-12 | 2013-01-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics |
| US8343497B2 (en) * | 2008-10-12 | 2013-01-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics |
| US8591905B2 (en) * | 2008-10-12 | 2013-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Nicotine immunonanotherapeutics |
| EP2411039A4 (en) | 2009-03-23 | 2015-05-06 | Brigham & Womens Hospital | Glycoconjugate VACCINES |
| CN102369242B (zh) * | 2009-03-27 | 2014-09-24 | 国立大学法人鹿儿岛大学 | 包含疏水化聚氨基酸的聚离子复合物及其用途 |
| JP5554407B2 (ja) * | 2009-06-25 | 2014-07-23 | バイオリーダーズ コーポレーション | ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子を含有するアジュバント組成物 |
| WO2011105520A1 (ja) * | 2010-02-26 | 2011-09-01 | 国立大学法人 長崎大学 | 抗原または薬物送達複合体 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002540076A (ja) * | 1999-03-24 | 2002-11-26 | イギリス国 | ワクチン組成物 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0313916D0 (en) * | 2003-06-16 | 2003-07-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
| WO2006112476A2 (ja) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Osaka University | 抗原を固定化した生分解性ナノ粒子、およびそれを含むワクチン |
| ES2396240T3 (es) * | 2005-04-20 | 2013-02-20 | Mitsuru Akashi | Poliaminoácido para usar como adyuvante |
-
2007
- 2007-10-02 WO PCT/JP2007/069289 patent/WO2008041703A1/ja active Application Filing
- 2007-10-02 JP JP2008537535A patent/JPWO2008041703A1/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002540076A (ja) * | 1999-03-24 | 2002-11-26 | イギリス国 | ワクチン組成物 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6012043221; インフルエンザ Ｖｏｌ．７， Ｎｏ．１, 200601, ｐ５４-５９ * |
| JPN7012003424; 平成１４ 年度 戦略的創造研究推進事業研究年報 , 2004, ｐ．１-２ * |
| JPN7012003425; Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｐａｐｅｒｓ， ２３２ｎｄ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ , 200609, Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．ＰＯＬＹ-３２８ * |
| JPN7012003427; Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ Ｖｏｌ．４７， Ｎｏ．２, 2006, ｐ．１３４-１３５ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008041703A1 (fr) | 2008-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPWO2008041703A1 (ja) | インフルエンザワクチン用アジュバントおよびインフルエンザワクチン | |
| Chen et al. | Investigation of tunable acetalated dextran microparticle platform to optimize M2e-based influenza vaccine efficacy | |
| KR101342641B1 (ko) | 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 함유하는 면역보강제 조성물 | |
| US20090092633A1 (en) | Polyamino acid for use as adjuvant | |
| US20220233679A1 (en) | Universal influenza vaccine compositions | |
| Gómez et al. | Surface coating of PLGA microparticles with protamine enhances their immunological performance through facilitated phagocytosis | |
| Kapadia et al. | Reduction sensitive PEG hydrogels for codelivery of antigen and adjuvant to induce potent CTLs | |
| EA023397B1 (ru) | Комбинированные вакцины с синтетическими наноносителями | |
| US10245319B2 (en) | Lymph node-targeting nanoparticles | |
| Du et al. | Exploiting the lymph-node-amplifying effect for potent systemic and gastrointestinal immune responses via polymer/lipid nanoparticles | |
| US11628208B2 (en) | System and method for microneedle delivery of microencapsulated vaccine and bioactive proteins | |
| CN106110320A (zh) | 抗原性组合物和方法 | |
| Gallovic et al. | STING agonist-containing microparticles improve seasonal influenza vaccine efficacy and durability in ferrets over standard adjuvant | |
| Lin et al. | Enhanced immune responses to mucosa by functionalized chitosan-based composite nanoparticles as a vaccine adjuvant for intranasal delivery | |
| Wei et al. | An apoferritin–Hemagglutinin conjugate vaccine with encapsulated nucleoprotein antigen peptide from influenza virus confers enhanced cross protection | |
| Jiao et al. | Lentinan PLGA-stabilized pickering emulsion for the enhanced vaccination | |
| Wu et al. | Bio-mimic particles for the enhanced vaccinations: lessons learnt from the natural traits and pathogenic invasion | |
| Wusiman et al. | Cationic polymer-modified Alhagi honey polysaccharide PLGA nanoparticles as an adjuvant to induce strong and long-lasting immune responses | |
| Liu et al. | Bacteria-like tumor vaccines progressively initiate cascade reaction for precise antigen delivery and induction of anti-tumor cellular immune response | |
| Zou et al. | Acid-responsive immune-enhancing chitosan formulation capable of transforming from particle stabilization to polymer chain stabilization | |
| CN107200788B (zh) | 一种季鏻化壳聚糖及其作为疫苗免疫佐剂的应用 | |
| EP4373475A1 (en) | Nanoconstructs and nanoparticle-mediated delivery of immunogenic cell death inducers for enhancing cancer immunotherapy | |
| Chang et al. | Protein and peptide nanocluster vaccines | |
| Sunasee et al. | Carbohydrate nanotechnology applied to vaccine development | |
| Zhang et al. | Silk Fibroin-Coated Nano-MOFs Enhance the Thermal Stability and Immunogenicity of HBsAg |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100622 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120821 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121022 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121211 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130507 |