WO2008041703A1

WO2008041703A1 - Adjuvant pour vaccin contre la grippe et vaccin contre la grippe

Info

Publication number: WO2008041703A1
Application number: PCT/JP2007/069289
Authority: WO
Inventors: Mitsuru Akashi; Yasuko Mori; Shigefumi Okamoto; Koichi Yamanishi; Michiaki Takahashi; Takami Akagi
Original assignee: Osaka University; National Institute Of Biomedical Innovation; The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2007-10-02
Publication date: 2008-04-10
Also published as: JPWO2008041703A1

Description

技術分野

[0001] 本発明は、インフルエンザワクチン用アジュバントおよびインフルエンザワクチンに関する。詳しくは、生分解性ナノ粒子をアジュバントとして用いるインフルエンザヮクチンに関する。

背景技術

[0002] インフルエンザの発症を予防するためにインフルエンザ一へマグルチニン (HA)ワクチンが広く使用されている。しかし、 HAワクチンは接種局所の腫脹、疼痛および全身倦怠感などの副作用を惹起させることが問題点として指摘されている。この問題点を解決するための方法のひとつとして、効果的なアジュバントを用いて HA接種量を減少させる手段が挙げられる。

[0003] アジュバントとして、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、リボソームなどが知られている。前記アジュバントは、免疫の増強を誘導することが確認されている力ィンフルェンザワクチンに使用する場合に安全性や有効性に問題がある。より効果的なインフルエンザワクチンを供給するためには、安全性の高いアジュバントを用いて、体液性免疫と細胞性免疫の双方の活性化が必要とされる。

[0004] 最近、有機ナノ粒子を生分解性材料として用いて合成し、医薬品や化粧品の機能性材料として役立てようとする検討が進められている。例えば、ポリ —グルタミン酸 )は、納豆の粘りの成分であり（非特許文献 1)、様々な化合物を導入したポリ（ γ—グルタミン酸)誘導体が知られている（特許文献 1〜3、非特許文献 2、 3)。

特許文献 1 :特開 2002— 80593号公報

特許文献 2：特開 2003— 327693号公報

特許文献 3：特開 2003— 342367号公報

非特許文献 l : Biosci. Biotech. Biochem., 57(7)， pp.1212-1213, 1993

非特許文献 2 : Biomacromolecules, 4， pp.1132-1134， 2003

非特許文献 3： Macromol. Biosci. , 4， pp.407-411, 2004 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明の目的は、より効果的なインフルエンザワクチンを供給するため、体液性免疫と細胞性免疫の双方の活性化が可能なアジュバントおよびそれを用いたインフノレェンザワクチンの提供である。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明者らは、ポリ- γ -グルタミン酸 ( γ—PGA)のナノ粒子の研究開発に携わっており、当該ナノ粒子によるインフルエンザに対する感染防御免疫の増強の可能性について鋭意検討した結果、インフルエンザワクチンの新しいワクチンモデルの構築に成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。

[0007] 〔1〕ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるインフルエンザワクチン

〔2〕ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グノレタミン酸）、ポリ（ α —ァスパラギン酸）、ポリ（ ε — リジン）、ポリ（ α—グルタミン酸）、ポリ —リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔1 〕に記載のアジュバント。

〔3〕ポリアミノ酸力 S、ポリ（ γ—グノレタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔2〕に記載のアジュバント。〔4〕ポリアミノ酸が両親媒化されている、前記〔1〕〜〔3〕いずれかに記載のアジュバント。

〔5〕ポリアミノ酸がポリ ( γ グルタミン酸）とフエ二ルァラニンェチルエステルのダラフト共重合体である、前記〔4〕に記載のアジュバント。

〔6〕インフルエンザウイルス抗原、および前記〔1〕〜〔5〕いずれかに記載のアジュバントを含有してレ、るインフルエンザワクチン。

〔7〕インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、前記〔6〕に記載のインフノレェンザワクチン。

〔8〕インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、前記〔6〕に記載のインフノレェンザワクチン。〔9〕インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、前記〔6〕に記載のインフノレェンザワクチン。

〔10〕インフルエンザウイルス抗原が HA分子である、前記〔6〕〜〔9〕いずれかに記載のインフルエンザワクチン。

[11] インフルエンザウイルス抗原がウィルス全粒子である、前記〔6〕〜〔9〕いずれかに記載のインフルエンザワクチン。

[12] インフルエンザワクチンの製造のための、インフルエンザウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるアジュバントの使用。

〔13〕ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グノレタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε —リジン）、ポリ（ α—グルタミン酸）、ポリ（ α—リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔12〕に記載の使用。

〔14〕ポリアミノ酸力、ポリ（ γ グルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである前記〔13〕に記載の使用。〔15〕ポリアミノ酸が両親媒化されている、前記〔12〕〜〔； 14〕いずれかに記載の使用

〇

[16] ポリアミノ酸がポリ ( γ グルタミン酸）とフエ二ルァラニンェチルエステルのグラフト共重合体である、前記〔15〕に記載の使用。

〔17〕インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、前記〔12 〕に記載の使用。

〔18〕インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、前記〔12〕に記載の使用。

〔19〕インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、前記〔1 2〕に記載の使用。

〔20〕インフルエンザウイルス抗原が ΗΑ分子である、前記〔12〕〜〔； 19〕いずれかに記載の使用。

〔21〕インフルエンザウイルス抗原がウィルス全粒子である、前記〔12〕〜〔； 19〕いずれかに記載の使用。〔〔2222〕〕イインンフフルルエエンンザザウウイイルルスス抗抗原原、、おおよよびびポポリリアアミミノノ酸酸をを主主成成分分ととすするる生生分分解解性性ナナノノ粒粒子子かかららななるるアアジジュュババンントトをを含含有有ししてていいるるイインンフフルルエエンンザザワワククチチンンのの有有効効量量をを対対象象にに投投与与すするるここととをを含含むむ、、イインンフフルルエエンンザザのの予予防防ままたたはは軽軽減減方方法法。。

〔〔2233〕〕イインンフフルルエエンンザザウウイイルルスス抗抗原原がが生生分分解解性性ナナノノ粒粒子子にに内内包包さされれてていいるる、、前前記記〔〔2222 〕〕にに記記載載のの方方法法。。

〔〔2244〕〕イインンフフルルエエンンザザウウイイルルスス抗抗原原がが生生分分解解性性ナナノノ粒粒子子表表面面にに固固定定さされれてていいるる、、前前記記〔〔2222〕〕にに記記載載のの方方法法。。

〔〔2255〕〕イインンフフルルエエンンザザウウイイルルスス抗抗原原とと生生分分解解性性ナナノノ粒粒子子ととがが混混合合さされれてていいるる、、前前記記〔〔22 22〕〕にに記記載載のの方方法法。。

〔〔2266〕〕イインンフフルルエエンンザザウウイイルルスス抗抗原原がが HHAA分分子子ででああるる、、前前記記〔〔2222〕〕〜〜〔〔2255〕〕 VV、、ずずれれかかにに記記載載のの方方法法。。

〔〔2277〕〕イインンフフルルエエンンザザウウイイルルスス抗抗原原ががウウィィルルスス全全粒粒子子ででああるる、、前前記記〔〔2222〕〕〜〜〔〔2255〕〕いいずずれれかかにに記記載載のの方方法法。。

〔〔2288〕〕前前記記〔〔66〕〕〜〜〔〔；； 1111〕〕いいずずれれかかにに記記載載ののイインンフフルルエエンンザザワワククチチンン、、おおよよびび当当該該ワワククチチンンををイインンフフルルエエンンザザのの予予防防ままたたはは軽軽減減ののたためめにに使使用用しし得得るる力力、、、、ままたたはは使使用用すすべべききででああるるここととをを記記載載ししたた書書類類をを含含むむ商商業業的的パパッッケケーージジ。。

発発明明のの効効果果

[[00000088]] 本本発発明明ののイインンフフルルエエンンザザウウイイルルスス用用アアジジュュババンントトにによよるるとと、、従従来来ののアアジジュュババンントトでではは達達成成ででききなな力力、、つつたた細細胞胞性性免免疫疫ををもも誘誘導導すするるここととがが可可能能ででああるる。。すすななわわちち、、本本発発明明ののァァジジュュババンントトはは、、イインンフフルルエエンンザザウウイイルルスス抗抗原原ととととももにに生生体体内内にに投投与与ししたた場場合合にに、、当当該該抗抗原原にに対対すするる抗抗体体産産生生効効果果ののみみななららずず、、当当該該抗抗原原特特異異的的 CCTTLL ((細細胞胞傷傷害害性性 TT細細胞胞））のの誘誘導導とといいうう効効果果ををもも奏奏すするるここととがが可可能能ととななりり、、イインンフフルルエエンンザザ感感染染にに対対すするる有有効効なな予予防防手手段段をを提提供供すするるここととががででききるる。。

本本発発明明ののイインンフフルルエエンンザザワワククチチンンにによよるるとと、、体体液液性性免免疫疫とと細細胞胞性性免免疫疫ととにに有有効効にに作作用用しし、、少少なないい抗抗原原量量ででイインンフフルルエエンンザザ感感染染をを有有意意にに予予防防すするるここととががででききるる。。

図図面面のの簡簡単単なな説説明明

[[00000099]] [[図図 11]]図図 11はは、、 HHAA特特異異的的リリンンパパ球球のの増増殖殖反反応応をを調調べべたたググララフフででああるる。。

* [図 3]図 3は、脾臓リンパ球中のインフルエンザ感染細胞特異的細胞傷害性を示すグラフである。

[図 4]図 4は、 IFN- γ -ELISPOTアツセィを指標としたインフルエンザ感染細胞特異的細胞傷害性 Τ細胞数につ!/、ての結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0010] 本発明は、ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるインフルエンザヮクチン用アジュバントを提供する。

[0011] 本発明のアジュバントを構成する「生分解性ナノ粒子」とは、ポリアミノ酸を主成分とし、生体内で酵素等の作用を受け、所定の時間経過後に粒子の崩壊およびポリアミノ酸骨格がアミノ酸のモノマーまたはオリゴマーに分解可能な粒子をいう。

[0012] 本発明における生分解性ナノ粒子の「主成分」とは、ナノ粒子を構成する骨格をい

5。

[0013] 本発明における生分解性ナノ粒子の形状は特に限定されるものではないが、一般的には球状である。球状の粒子のサイズは通常 10nm〜； 100 m程度であり、好ましくは 80nm〜500nmである。このようなサイズにすることによって、単位重量当りの粒子表面積増加に伴うインフルエンザウイルス抗原の固定化量の増加、抗原提示細胞への抗原の取り込み促進、それに伴う CTLの活性化、抗体産生の誘導などの効果が生じる。

[0014] 前記粒子の形状は、顕微鏡にて観察し、確認すること力 Sできる。前記粒子のサイズは、ナノ粒子の水分散液を動的光散乱により測定した平均粒子径をいう。なお、球状以外の形状のナノ粒子のサイズは、球状のナノ粒子に準じて求めることができる。

[0015] 前記生分解性ナノ粒子の骨格となるポリアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸または人工アミノ酸の重合体であってもよい。安全性または毒性の面から、天然に存在するアミノ酸からなるポリアミノ酸が好ましいが、その由来は天然物であっても合成品であつてもよい。天然に存在するアミノ酸としては、グルタミン酸、ァスパラギン酸、リジンまたはァスパラギンが好ましい。また、アミノ酸は L一体であっても D 体であってもよい。ポリアミノ酸中に L 体と D 体が所定の割合で含まれて!/、てもよレ、。

[0016] 天然に存在するアミノ酸からなるポリアミノ酸としては、ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ ( a—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ —グノレタミン酸）、ポリ（ α—リジン）またはポリアスパラギンが好ましい。所期の目的を達成し、ナノ粒子に様々な特性を付与するためには、前記ポリアミノ酸の修飾体、それらの誘導体またはそれらの混合物も本発明の好ましいポリアミノ酸に含まれる。特に好ましいポリアミノ酸は、ポリグルタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体またはそれらの混合物である。

[0017] 「修飾アミノ酸」、「アミノ酸誘導体」、ポリアミノ酸の「修飾体」および「誘導体」という用語は、当該分野において通常使用される意味を有するものとする。ポリアミノ酸の「修飾体」および「誘導体」の例としては、構成アミノ酸の一部を別のアミノ酸としたもの、構成アミノ酸の利用可能な官能基を用いて修飾したもの等があげられる。具体的には、ポリ（ Ί グルタミン酸）のペプチド鎖中に 1種またはそれ以上の他のアミノ酸、その修飾体もしくは誘導体を導入したもの、グラフト共重合体となっているもの、またはポリ —リジン）の構成アミノ酸リジンの利用可能な α 位の一部をメチル化したもの等があげられる。

[0018] ポリアミノ酸の「混合物」とは、 2種以上のアミノ酸を構成成分とするものであり、前記例示したポリアミノ酸、それらの修飾体およびそれらの誘導体を構成するアミノ酸から 2種以上選択することが好まし!/、。

[0019] 好ましい「修飾体」または「誘導体」の例として、ポリアミノ酸が両親媒化されるように、ポリアミノ酸を修飾または誘導したものがあげられる。例えば、親水性ポリアミノ酸の側鎖に疎水性アミノ酸を導入して、所望の親水性疎水性のバランスとすることもできる。ポリ（γ グルタミン酸）とフエ二ルァラニンェチルエステルのグラフト共重合体であるポリアミノ酸が好適な具体例としてあげられる。力、かるポリアミノ酸は、分子内および分子間の疎水性基の会合によりナノ粒子化が容易である点からも好ましい。

[0020] ポリアミノ酸は、アミノ酸以外の構成成分、例えば、糖質、脂質等を含んでいてもよい。好ましいポリアミノ酸は、構成成分の 50重量％以上がアミノ酸である。

[0021] ポリアミノ酸においてすベての構成アミノ酸間の結合は、同一種類のものであってもよぐ異なる種類のものであってもよい。例えば、すべての構成アミノ酸がペプチド結合によって結合したものであってもよぐ部分的または全体的にペプチド結合以外の結合またはリンカ一によりアミノ酸が結合したものであってもよい。ペプチド結合以外の結合としては、エステル結合、エーテル結合等があげられ、リンカ一としては、ダルタルァノレデヒド、ジイソシァネート等があげられる力これらに限定されない。さらに、ポリアミノ酸の官能基間において架橋されていてもよい。架橋することにより、ポリアミノ酸の物性を変化させ、所望のアジュバント特性を得ることも可能である。架橋剤としては、カルポジイミド、ジグリシジルエステル等があげられる力これらに限定されない

〇

[0022] ポリアミノ酸の分子量は、特に限定されるものではないが、所望の粘度や溶解度に応じて変更されうる。分子量は、通常 1000〜500万の範囲である。好ましくは 5000 〜200万の範囲である。前記分子量は、水溶液もしくは有機溶媒中でゲルろ過クロマトグラフィ一により測定された値である。

[0023] ポリアミノ酸の製造は、化学合成法、発酵法などの公知の方法を適宜選択して行うこと力 Sできる。ポリアミノ酸のナノ粒子化は、公知の方法により行うことができる。例えば、液中乾燥法、噴霧乾燥法、球形晶析法、溶媒置換法 (沈殿 ·透析法)、直接超音波分散法を用いることができる。例えば、ポリ（τ /—グルタミン酸)またはポリ（ ε—リジン)からなる生分解性ナノ粒子は、溶媒置換法により製造することができる。このような方法を適宜選択または組合わせて、生分解性ナノ粒子の材料、構成成分、分子量、サイズ、電荷その他のパラメータを目的に応じたものとすること力 Sできる。

[0024] 本発明は、前記アジュバントおよびインフルエンザウイルス抗原を含有するインフルェンザワクチンを提供する。

[0025] 本発明においてインフルエンザウイルスとは、オルソミクソウィルス科に属する直径約 lOOnmの粒子サイズを有する RNAエンベロープウィルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、 A、 Bおよび C型に分けられる。インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウィルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキヤプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸 (RNA)のコアと、外部糖タンパク質からなる。ゥィルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。インフルエンザウイルスの RNAは、分節構造をとる。世界中で大流行するインフルエンザは、 A型インフルエンザウイルスによるものである。 A型は、へマグルチニン（HA)およびノィラミニダーゼ（NA)の 2種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによって HAでは 16種、 NAでは 9 種の亜型に区別されている。本発明においては、 A型インフルエンザウイルスが好ましい。 A型インフルエンザウイルスの亜型は、特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよ!/、。

[0026] 本発明においてインフルエンザウイルス抗原とは、前記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなぐ精製ウイノレス粒子を脂質エンベロープが可溶化されるように有機溶媒/界面活性剤もしくは他の試薬で分解されたサブビリオン、または HAおよび NAを始めとするウィルスサブユニットでもよく、ウィルス全粒子でもよい。免疫原性の観点から、 HAまたは全ウィルス粒子が好ましい。ウィルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。

[0027] インフルエンザウイルス抗原の調製方法は、特に限定されるものではなぐ公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物またはインフルエンザの患者から単離されたウィルス株をニヮトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウィルス原液から抗原を調製してもよい。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウィルス由来の抗原を用レ、てもよレ、。

[0028] 本発明のインフルエンザワクチンは、前記インフルエンザウイルス抗原と前記アジュバントとしての生分解性ナノ粒子とが単純に混合された状態で含有されて!/、てもよ!/ヽ

(以下、混合ワクチンと称する）。あるいは、本発明のインフルエンザワクチンは、前記インフルエンザウイルス抗原が前記生分解性ナノ粒子内に包含されていてもよく（以下、内包ワクチンと称する）、前記インフルエンザウイルス抗原が前記生分解性ナノ粒子表面に固定されていてもよい（以下、外包ワクチンと称する）。ワクチンに含まれるィンフルェンザウィルス抗原は、 1種または 2種以上を適宜選択して用いることができる。また、複数の亜型に由来する 1種の抗原（例、 HA)を用いてもよい。

[0029] 本発明のワクチンに含まれるインフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子との比は、抗原の種類やナノ粒子の特性により一概には規定できないが、例えば、 HA抗原とポリ —グルタミン酸）とを用いた場合、重量比で;!：;!〜 1 : 1000が例示され、好ましく (ま 1： 10〜1： 500である。 [0030] 前記混合ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とを所定の割合で溶液中で混合して製造することができる。この場合、抗原と生分解性ナノ粒子は、イオン結合、分子間力による結合、吸着による結合などにより、ワクチン中で互いに結合して!/、てもよ!/、し、単純に混在して!/、る状態であっても問題はなレ、。

[0031] 前記内包ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子の内部に包含されるように公知の方法により製造することができる。例えば、ポリ（γ—グルタミン酸）に疎水性アミノ酸を共有結合により導入し、これを有機溶媒に溶解し、次に抗原水溶液に滴下することにより、ナノ粒子化と同時に抗原が当該粒子内に包含され、固定ィ匕すること力 Sでさる。

[0032] 前記外包ワクチンは、インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子の表面に結合するように公知の方法により製造することができる。例えば、ポリ（τ —グルタミン酸 )ナノ粒子の表面に存在するカルボキシ基とタンパク質抗原のァミノ基とを常法により共有結合させることにより、ナノ粒子の表面に抗原を固定化することができる。したがつて、本発明においては、外包ワクチンはナノ粒子と抗原とが共有結合しているワクチンを意味し、それ以外の結合様式で抗原がナノ粒子の表面に存在する力、、もしくは抗原とナノ粒子が単純に溶液中に混在している状態のワクチンは混合ワクチンである。

[0033] 本発明のワクチンは、さらに医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。前記医薬として許容されうる担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体を限定なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組合せがあげられる。また、これに乳化剤、保存剤 (例、チメロサール）、等張化剤、 ρΗ調整剤および不活化剤 (例、ホルマリン)等が適宜配合される。

[0034] 本発明のワクチンは、全身に投与されてもよぐ局所投与でもよい。全身投与の場合、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、腹腔内等への投与があげられ、投与方法としては、注射または点滴などがあげられる。局所投与の場合、鼻腔内、口腔内への投与があげられ、投与方法としては、噴霧、塗布、経口などがあげられる。

[0035] 本発明のワクチンの投与対象は、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類、鳥類等があげられる。

[0036] 本発明のワクチンは、ワクチンの投与様式に適合した形態を有することが好ましぐ例えば、注射可能な形態として、溶液、懸濁液または乳化液が挙げられる。あるいは、液体溶液、懸濁液または乳化液に供せられる形態として、凍結乾燥製剤等の固体形態が挙げられる。

[0037] 本発明のワクチンを用いて、インフルエンザを予防またはその症状を軽減することができる。本発明は、有効免疫感作量の本発明のワクチンを対象に投与する工程を含むインフルエンザの予防または軽減方法を提供する。

[0038] ワクチンの投与方法としては、前記例示した通りである。投与量は、対象の年齢、性別、体重等を考慮して決められるが、抗原として HAを用いた場合、通常 5 _§〜50 を 1回または 2回以上投与することができる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、；!〜 4週間の間隔をあけて投与することが好ましい。抗原としてウィルス全粒子を用いた場合、 HA換算で投与量を設定すればよい。前記 HAの重量は、 SRD力価もしくは Lowry法により測定した値である。

実施例

[0039] 以下、実施例等により本発明を詳細に説明する力本発明はこれらの実施例等により ί可ら限定されるものではなレ、。

[0040] 実施例 1

ワクチンの製造

精製インフルエンザウイルスとして、 Α/ニューカレドニア/ 20/99 (H1N1)株の原液 (原液番号 FTHA Κ0519、財団法人大阪大学微生物病研究会観音寺研究所)を用いた。前記ウィルス原液中のタンパク質量は、 1870 _§/111しであり、 ΗΑは 642 g/mLであった。前記濃度は Lowry法と SRD力価より測定した値である。

(1)内包型ワクチンの製造

HA (ウィルス原液の 1、 2、 4または 8倍希釈物）の PBS溶液 50 しに、 0· 6M塩化ナトリウム 50〃しおよび 10mg/mLのポリ（γ—グルタミン酸）とフエ二ルァラニンェチルエステルのグラフト共重合体（J. Control. Release 108， 226 (2005)、 Chem. Lett. 33 ， 398 (2004)、 Biomacromolecules 7， 297 (2006)、 J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17， 87 5 (2006))の DMSO液 lOO ^ Lを加え、 14500rpm (14000 X g)で 10分、室温で遠心分離した。得られたペレットに 200 Lの再蒸留水を加えて前記と同じ条件で遠心分離する操作を 2回繰り返し、ペレットを洗浄した。洗浄後のペレットに 95 Lの再蒸留水および 5 しの 20xPBSをカロえ、目的の内包型ワクチン（lOmgアジュバント/ mL )を得た（粒子径 200— 400腹）。

(2)外包型ワクチンの製造

20mg/mLのポリ（γ —グルタミン酸）ナノ粒子（粒子径 80— 300nm、大阪大学大学院工学研究科教授、明石満博士により製造、製法: J. Control. Release 108， 226 ( 2005)、 Chem. Lett. 33， 398 (2004)、 Biomacromolecules 7， 297 (2006)、 J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17， 875 (2006))の 20mMリン酸緩衝液（ρΗ5· 8) 50 しに、 2mg/ mLの WSC (1-ェチル -3-(3-ジメチルァミノプロピル)カルポジイミド（水溶性カルポジイミド））の 20mMリン酸緩衝液（ρΗ5· 8) 50 Lをカロえ、室温で 20分静置した後、 1 4500rpm (14000 X g)で 10分遠心分離した。得られたペレットに 100 Lの再蒸留水および 100 Lの HA (ウィルス原液の 1、 2、 4または 8倍希釈物）を加え、 4°Cで一晚放置した。次いで、 14500rpm (14000 X g)で 10分室温で遠心分離し、ナノ粒子を回収した。得られたペレットに 95 μ Lの再蒸留水および 5 μ Lの 20xPBSをカロえ、目的の外包型ワクチン（lOmgアジュバント/ mUを得た。

(3)混合型ワクチンの製造

20mg/mLのポリ（γ —グルタミン酸）ナノ粒子（粒子径 150— 300nm、大阪大学大学院工学研究科教授、明石満博士より製造、製法: Control. Release 108， 226 ( 2005)、 Chem. Lett. 33， 398 (2004)、 Biomacromolecules 7， 297 (2006)、 J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17， 875 (2006))含有 PBS懸濁液 25 Lに、 4 Lの HA (ウィルス原液）と PBSを lmLを加えて数分間ゆるやかに攪拌することによって、目的の混合型ヮクチン（ΗΑ7· 5 u g,アジュノント 500 μ g/mL溶液）を得た。

実施例 2

インフルエンザワクチンの免疫原性

実施例 1で製造したインフルエンザ HAワクチンを用いて、ポリ（γ—グルタミン酸）（ γ -PGA)のアジュバント効果を、 HAに対する免疫原性を増強し得るか否かの観点から、下記（1)〜（3)について検討した。

[0042] マウスの免疫方法

マウス (BALB/c 4週齢、雌)を以下の 6グループ（一群 5〜8匹）に分け、皮下注射によりワクチンまたは抗原を投与した。対照群は、 PBSを皮下注射した。

i)PBSを皮下注射

ϋ)ΗΑ(1·5 ;^)を皮下注射

iii) Al(OH) (100 ^ g) + ΗΑ(1·5 μ g)を皮下注射

3

iv)内包型 _Ί -PGA(100 ^ g) + ΗΑ(1·5 μ g)を皮下注射

v)外包型 _Ί -PGA(100 ^ g) + ΗΑ(1·5 μ g)を皮下注射

vi)混合型 _Ί -PGA(100 ^ g) + ΗΑ(1·5 μ g)を皮下注射

[0043] 免疫スケジュールは、下記の通りであった。

0日目 BALBん（4週齢、雌)に初回免疫

7日目 2回目免疫

14日目血液、脾臓回収

[0044] (1) HA免疫後のマウスリンパ球の HA再刺激に対する増殖活性の変化

上記免疫スケジュールで免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾臓単核球を採取した。前記単核球を 5%FBS含有 RPMI— 1640培地に 2· 5xl0⁶cells/mLの濃度となるように懸濁し、 96穴プレートに 200 しずつ細胞懸濁液を分注した。抗原刺激は、 9 6穴プレート中の単核球に各種濃度の HA液（1 μ g/mL— 10ng/mUを加えて 3 日間培養（37°C、 5% CO下）することにより行った。次いで、 96穴プレートに³ H-Td

2

R (0. S Ci/well)を添加して 18時間培養を続け、セルハーべスターにて細胞を採取し、抗原刺激した単核球への³ H-TdRの取り込み量を液体シンチレーシヨンカウンターにて測定した（図 1)。

[0045] 図 1より、 HA抗原を γ _PGAともに動物に皮下接種した場合、 Al(OH)とともに接

3 種した場合と同レベルの HA特異的リンパ球の増殖反応を増強または誘導することがわかった。

[0046] (2) HI活性の変化（抗ウィルス血清によるへマグルチニンの赤血球凝集に対する抑制）上記免疫スケジュールで免疫したマウスの血液を採取し、血清を分離した。前記血清を Receptor destroying enzyme (RDE)で処理し、生理食塩水で ²· 5倍に希釈した。希釈した血清に血球を入れ、血清中の非特異的凝集反応因子を処理した後、 4Η

のウィルス抗原を添加し、室温にて 30分反応させ、次いで、ニヮトリ赤血球液を添加し、室温で 40分反応させ、凝集能を判定した（図 2)。

[0047] 図 2より、 ΗΑ抗原を γ _PGAともに動物に皮下接種した場合、 HAに対する抗体産生を増強させることができることがわ力た。 HAに対する抗体産生能は、 HA抗原を Al(OH)とともに皮下接種した場合の方が高力た。

[0048] (3) CTL誘導の変化

1) CTLの調製

上記免疫スケジュールで免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾臓単核球を 2xl0⁶ eel Is取りだし、遠沈管にてインフルエンザウイルス（10— 20 PFU/Cell/0. 2 mL 無血清 RPMI— 1640)を 60分感染させた。感染細胞を洗浄し、新たに 5mL 5%FB S含有 RPMI— 1640を添カロし、 3時間おき、上清を除去した。 25cm²カルチャーフラスコに 2xl0⁶cellsの感染細胞と 5 x 10⁶ cellsの脾臓細胞を加え、 5% FBS、 10 mM HEPES、 5 x 10— ⁵M β—メルカプトエタノール（ /3—ME)、 100 U/mLぺニシリン、 100〃 g/mLストレプトマイシン、 0. 03%グルタミン含有 RPMI— 1640 培地 10 mLにて培養した。

培養 6日後に生細胞を回収し（FicoU-paque 1.078， 490 X g， 30分，室温下での比重遠心による）、 5%FBS含有 RPMI— 1640培地にて 10⁷cells /mLに調製し、 CT しとした。

2)標的細胞の調製

10⁵cellsの P815細胞に、インフルエンザウイルス 10 PFU/cellを 1時間感染させた。次いで、前記細胞を無血清 MEM培地で 3回洗浄した。完全 RPMI— 1640培地 (10% FBS、 10mM HEPES、 5 x 10— ⁵M β— ME、 100 U/mLペニシリン、 1 00 [I g/mLストレプトマイシン、 0· 03%グルタミン含有）にて 10⁴cells/100 μしになるように調製した。

3)細胞傷害試験 96穴マルチプレート（丸底）の左側 3— 12ネ亍に完全 RPMI— 1640培地を 100 μ L ずつ分注し、次に、 96穴マルチプレート（丸底）の左 2行にエフェクター CTL懸濁液を 150 しずつ分注した。 3倍希釈法により 2wellずつ希釈し、希釈系列を作製した。各 wellに標的細胞 100 しずつ分注し、 4時間培養した（37°C、 5% CO下）。培養

2 終了 45分前に Target 100% killing sample (標的細胞だけのサンプル 8wellのうちの左半分)と Volume correction control (培地だけ入って!/、る 8wellのうちの左半分)に溶解溶液を 1/10量を入れた。培養終了後、遠心機で 250 X gで 4分間遠心分離し、各サンプル 50 Lずつ新しい 96穴平底マルチプレートに移した。

Cyt₀t₀x96のアツセィバッファーを 37°C水浴中で融解し、遮光下で基質混合液とあわせてよく混ぜた。混合液 50 H Lずつを上記 96穴平底プレートに入っているサンプルに入れた後、 37°Cで 30分培養した。次いで、前記プレートに停止溶液を 50 しずつ入れて反応を停止した。 490nmで吸光度を測定した（図 3)。

[0049] 図 3より、 HA抗原を γ _PGAともに動物に接種した場合、 LDH法で見られがちである非特異的な細胞傷害反応が高いために有意差がみられな力、つたものの、 Ί P GAによるインフルエンザ感染細胞特異的な細胞傷害性の増強の傾向がみられた。

[0050] 4) IFN- y ELISPOTアツセィ

Cytoscreen 96穴プレートに抗 IFN- γ抗体 (クローン RA-6A2, 5 μ g/mL)を 100 μ L ずつ分注し、 4°Cでー晚被覆した。次いで、前記プレートを PBSにて 4回洗浄し、 10 % FBS含有 RPMI—1640培地を 200 しずつ入れ、 37°Cで 1時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、培地を除去し、前記 CTLアツセィと同じ要領で作製したェフエクタ一細胞（2 X 10⁵, 10⁵, 5 X 10⁴, 2. 5 X 10⁴cells)と標的細胞 (P815細胞に 1 FFU/cellの割合でウィルス感染させたもの、 10⁵cells)を入れて、 37°C、 5% CO 下で 24時間培養した。プレートを 6回洗浄（PBS_0.1%Tween20)し、ビォチン結合抗 I

2

FN- γ抗体（クローン XMG-1.2)を 10% FBS-PBS_0.1%Tween20で抗体濃度を 1 μ g/ mLに希釈したうえで 100 Lずつ播いて、室温下で 2時間反応させた。プレートを 5 回洗浄 (PBS_0.1%Tween 20)し、 HRP ストレプトアビジン (1： 800希釈)を 100 しずっ播いて、室温下で 1時間反応させた。プレートを 5回洗浄 (PBS_0.1%Tween20)し、 T MB— Hで発色させ (15分〜 30分)、細胞傷害性 T細胞から産生される IFN- γのスポット数をカウントした（図 4)。

[0051] 図 4より、 HA抗原を γ _PGAともに動物に 2回皮下接種した場合、 Al(OH)とともに皮下注射した場合と比べて、 IFN- γ産生する感染細胞特異的細胞傷害性 T細胞数が増加することが示され、図 3に示した γ -PGA添加による細胞傷害性 T細胞活性増強の傾向を支持する結果となった。これらのことから、 γ -PGAは、 Al(OH)よりもはるかに強力な細胞傷害反応を誘導することがわかる。

[0052] γ—PGAナノ粒子をアジュバントとして HAワクチンに用いることにより HA単独の場合と比べて有意に高!/ヽ HI抗体価と HA刺激に対する細胞増殖活性を示した。特に HAワクチンと γ—PGAナノ粒子を混合した標品を免疫した場合での HI抗体価、 HA刺激に対する細胞増殖活性および、インフルエンザ感染細胞特異的な細胞傷害性 T細胞誘導能は、 HAワクチンと水酸化アルミニウムを混合した場合と比べて高い傾向を示した。以上の結果より、 γ—PGAナノ粒子は HAと混合することによって、 HA抗原に対する体液性および細胞性免疫の誘導を増強させる新しいタイプのアジュバントとして有用である可能性が示唆された。

産業上の利用可能性

[0053] 本発明のインフルエンザウイルス用アジュバントによると、従来のアジュバントでは達成できな力、つた細胞性免疫をも誘導することが可能である。本発明のインフルェンザワクチンによると、体液性免疫と細胞性免疫とに有効に作用し、少ない抗原量でィンフルェンザ感染を有意に予防することができる。

本出願は、日本で出願された特願 2006— 271273 (出願日：2006年 10月 2日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含される。

Claims

請求の範囲

[I] ポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子からなるインフルエンザワクチン用ァジュバント。

[2] ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グノレタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε —リジン）、ポリ —グルタミン酸）、ポリ（ α—リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである請求項 1に記載のアジュバント。

[3] ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グノレタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである請求項 2に記載のアジュバント。

[4] ポリアミノ酸が両親媒化されている、請求項 1〜3いずれかに記載のアジュバント。

[5] ポリアミノ酸がポリ（ γ —グルタミン酸）とフエ二ルァラニンェチルエステルのグラフト共重合体である、請求項 4に記載のアジュバント。

[6] インフルエンザウイルス抗原、および請求項 1〜5いずれかに記載のアジュバントを含有して!/、るインフルエンザワクチン。

[7] インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、請求項 6に記載のインフルエンザワクチン。

[8] インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、請求項 6 に記載のインフノレェンザワクチン。

[9] インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、請求項 6に記載のインフルエンザワクチン。

[10] インフルエンザウイルス抗原が ΗΑ分子である、請求項 6〜9いずれかに記載のインフルェンザワクチン。

[I I] インフルエンザウイルス抗原がウィルス全粒子である、請求項 6〜9いずれかに記載のインフルエンザワクチン。

[13] ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グノレタミン酸）、ポリ（ α—ァスパラギン酸）、ポリ（ ε—リジン）、ポリ —グルタミン酸）、ポリ（ α—リジン）、ポリアスパラギン、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである請求項 12 に記載の使用。

[14] ポリアミノ酸力ポリ（ γ—グノレタミン酸）、それらの修飾体、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものである請求項 13に記載の使用。

[15] ポリアミノ酸が両親媒化されている、請求項 12〜； 14いずれかに記載の使用。

[16] ポリアミノ酸がポリ（ γ —グルタミン酸）とフエ二ルァラニンェチルエステルのグラフト共重合体である、請求項 15に記載の使用。

[17] インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、請求項 12に記載の使用。

[18] インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、請求項 1 2に記載の使用。

[19] インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、請求項 12に記載の使用。

[20] インフルエンザウイルス抗原が ΗΑ分子である、請求項 12〜； 19いずれかに記載の使用。

[21] インフルエンザウイルス抗原がウィルス全粒子である、請求項 12〜； 19いずれかに記載の使用。

[22] インフルエンザウイルス抗原、およびポリアミノ酸を主成分とする生分解性ナノ粒子力、らなるアジュバントを含有しているインフルエンザワクチンの有効量を対象に投与することを含む、インフルエンザの予防または軽減方法。

[23] インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子に内包されている、請求項 22に記載の方法。

[24] インフルエンザウイルス抗原が生分解性ナノ粒子表面に固定されている、請求項 2 2に記載の方法。

[25] インフルエンザウイルス抗原と生分解性ナノ粒子とが混合されている、請求項 22に記載の方法。

[26] インフルエンザウイルス抗原が ΗΑ分子である、請求項 22〜25いずれかに記載の方法。

[27] インフルエンザウイルス抗原がウィルス全粒子である、請求項 22〜25いずれかに記載の方法。

[28] 請求項 6〜； 11いずれかに記載のインフルエンザワクチン、および当該ワクチンをィンフルェンザの予防または軽減のために使用し得る力、、または使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。