JP5522486B2 - 疎水化ポリアミノ酸からなるポリイオンコンプレックスとその用途 - Google Patents
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Description
本発明はドラッグデリバリーシステム（DDS）の分野に関する。詳細には、本発明は、高い免疫誘導効果を示すキャリアまたは免疫療法剤として有用なポリイオンコンプレックスおよび粒子形状を有するポリイオンコンプレックスナノ粒子に関する。
薬物の効果を最大限に発揮させるためのドラッグデリバリーシステム（DDS）は、医薬品開発分野において必要不可欠であり、薬物を運搬するためのキャリア開発が重要となる。高分子ナノ会合体を利用したキャリアシステムは、高分子鎖の精密な分子設計による多機能性高分子デバイスの構築が可能であり、DDSキャリアとしての応用が期待されている。ここで用いる高分子キャリアとしては、ミセル、ナノゲル粒子、ナノスフェア、ナノカプセルなどが知られており、これらナノキャリアの調製には高分子鎖の分子間および分子内での相互作用による自発的な会合が粒子形成の駆動力として利用されている。そして、この自発的な会合に働く相互作用としては、疎水性相互作用、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワースル力などが挙げられる（特許文献１〜１３）。
特に反対電荷（カチオンおよびアニオン）を有する高分子からなるポリイオンコンプレックス（以下、「PIC」と略す）および粒子形状を有するPICナノ粒子は、任意の割合で２種類の高分子を混合するのみで簡便に調製できるという利点を有しており、合成および天然由来高分子を用いた様々なPICおよびPICナノ粒子が報告されている（例えば、特許文献１４）。しかしながら、これらのPICおよびPICナノ粒子は、クーロン力をナノ粒子形成の駆動力に用いているため、緩衝溶液中などの高い塩濃度やpH変化に対する安定性が低く、生理的環境下での使用が制限されるという問題がある。
一方、疎水化ポリアミノ酸を用いて調製したPICおよびPICナノ粒子は、静電的相互作用によりポリマーが会合し、さらに疎水性相互作用により安定な構造が形成され、生理的環境下でも機能を発現できる。従来のPICナノ粒子や高分子ミセルでは、粒子形成後に、コア（内部）およびシェル（外部）を化学架橋する方法により生体内における安定化が図られている。
しかしながら、これらの方法は架橋条件によりPICやPICナノ粒子の構造や機能が変化しやすいといった問題がある。また、生体内での使用を考慮すると、生体内分解性の観点よりその架橋様式が制限されるという問題がある。
そのため、生体内でも高い安定性を示すとともに高い機能性を有するPICおよびPICナノ粒子の開発が求められている。
そのため、生体内でも高い安定性を示すとともに高い機能性を有するPICおよびPICナノ粒子の開発が求められている。
このような状況の下、本発明者らは、生体内でも高い安定性を示すとともに適当な生体内分解性をも有するPICおよびPICナノ粒子について鋭意検討した結果、疎水性アミノ酸残基を導入した負電荷を有する水溶性のポリアミノ酸（疎水化ポリ酸性アミノ酸）と正電荷を有するポリアミノ酸（塩基性ポリペプチド）を混合することにより得られるPICおよびPICナノ粒子がこれらの要件を満足し、また、抗原をかかるPICナノ粒子にコンジュゲートないし取り込ませて生体に投与すると高い免疫誘導活性が示されることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドとを含むポリイオンコンプレックス（PIC）。
［２］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドとを20：1〜1：20（重量比）で含むPIC。
［３］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸が、一般式（I）：
で表される構成単位（A）と、一般式（II）：
で表される構成単位（B）
［式中、R1は非置換型または置換型のフェニル基またはインドリル基であり；
R2は直鎖型または分枝鎖型の炭素数1〜5を有するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；l = 1または2であり；m + n = 40〜40,000である］
とからなり、構成単位（A)と構成単位（B）とのモル比（（m）：（n））が10：90〜90：10である［１］または［２］記載のPIC。
［４］ 塩基性ポリペプチドが平均分子量1.0×103〜1.0×104のポリ（ε−リシン）である［１］ないし［３］のいずれか１に記載のPIC。
［５］ 塩基性ポリペプチドがプロタミンである［１］ないし［３］のいずれか１に記載のPIC。
［６］ モル比（（m）：（n））が15：85〜85：15である［１］ないし［５］のいずれか１に記載のPIC。
［７］ 粒子形状を有する［１］ないし［６］のいずれか１に記載のPIC。
［８］ 平均粒径が0.01μm〜1μmである［７］に記載のPIC。
［９］ （１）ポリ酸性アミノ酸に疎水性アミノ酸を導入することによって疎水化ポリ酸性アミノ酸を調製し；
（２）調製した疎水化ポリ酸性アミノ酸を緩衝液に溶解し、緩衝液に溶解した塩基性ポリペプチドと混合する
工程を含むPICの調製方法。
［１０］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドとを20：1〜1：20（重量比）で混合する［９］記載の調製方法。
［１１］ 塩基性ポリペプチドが平均分子量1.0×10３〜1.0×104のポリ（ε−リシン）である［９］または［１０］記載の調製方法。
［１２］ 塩基性ポリペプチドがプロタミンである［９］または［１０］記載の調製方法。
［１３］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸中の疎水性アミノ酸が導入されなかったポリ酸性アミノ酸が一般式（I）：
で表され、疎水性アミノ酸が導入されたポリ酸性アミノ酸が一般式（II）：
で表され
［式中、R1は非置換型または置換型のフェニル基またはインドリル基であり；
R2は直鎖型または分枝鎖型の炭素数1〜5を有するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；l = 1または2であり；m + n = 40〜40,000である］
モル比（（m）：（n））が15：85〜85：15である［９］ないし［１２］のいずれか１に記載の調製方法。
［１４］ 有機溶媒を用いないことを特徴とする［９］ないし［１３］のいずれか１に記載の調製方法。
［１５］ 調製したPICが粒子形状を有する［９］ないし［１４］のいずれか１に記載の調製方法。
［１６］ 平均粒径が0.01μm〜1μmである［１５］に記載の調製方法。
［１７］ 抗原をコンジュゲートないし取り込ませおよび／または混合した［７］または［８］に記載のPICを含む免疫療法剤。
［１８］ 液性免疫および細胞性免疫を惹起しうる［１７］に記載の免疫療法剤。
［１９］ 抗原が卵白アルブミンである［１７］また［１８］に記載の免疫療法剤。
［２０］ 抗原がインフルエンザ・ヘマグルチニンである［１７］または［１８］記載の免疫療法剤。
［２１］ 抗原を［７］または［８］に記載のPICにコンジュゲートないし取り込ませおよび／または混合させる免疫療法剤の調製方法。
［２２］ 抗原が卵白アルブミンである［２１］に記載の免疫療法剤の調製方法。
［２３］ 抗原がインフルエンザ・ヘマグルチニンである［２１］に記載の免疫療法剤の調製方法。
［１］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドとを含むポリイオンコンプレックス（PIC）。
［２］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドとを20：1〜1：20（重量比）で含むPIC。
［３］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸が、一般式（I）：
［式中、R1は非置換型または置換型のフェニル基またはインドリル基であり；
R2は直鎖型または分枝鎖型の炭素数1〜5を有するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；l = 1または2であり；m + n = 40〜40,000である］
とからなり、構成単位（A)と構成単位（B）とのモル比（（m）：（n））が10：90〜90：10である［１］または［２］記載のPIC。
［４］ 塩基性ポリペプチドが平均分子量1.0×103〜1.0×104のポリ（ε−リシン）である［１］ないし［３］のいずれか１に記載のPIC。
［５］ 塩基性ポリペプチドがプロタミンである［１］ないし［３］のいずれか１に記載のPIC。
［６］ モル比（（m）：（n））が15：85〜85：15である［１］ないし［５］のいずれか１に記載のPIC。
［７］ 粒子形状を有する［１］ないし［６］のいずれか１に記載のPIC。
［８］ 平均粒径が0.01μm〜1μmである［７］に記載のPIC。
［９］ （１）ポリ酸性アミノ酸に疎水性アミノ酸を導入することによって疎水化ポリ酸性アミノ酸を調製し；
（２）調製した疎水化ポリ酸性アミノ酸を緩衝液に溶解し、緩衝液に溶解した塩基性ポリペプチドと混合する
工程を含むPICの調製方法。
［１０］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドとを20：1〜1：20（重量比）で混合する［９］記載の調製方法。
［１１］ 塩基性ポリペプチドが平均分子量1.0×10３〜1.0×104のポリ（ε−リシン）である［９］または［１０］記載の調製方法。
［１２］ 塩基性ポリペプチドがプロタミンである［９］または［１０］記載の調製方法。
［１３］ 疎水化ポリ酸性アミノ酸中の疎水性アミノ酸が導入されなかったポリ酸性アミノ酸が一般式（I）：
［式中、R1は非置換型または置換型のフェニル基またはインドリル基であり；
R2は直鎖型または分枝鎖型の炭素数1〜5を有するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；l = 1または2であり；m + n = 40〜40,000である］
モル比（（m）：（n））が15：85〜85：15である［９］ないし［１２］のいずれか１に記載の調製方法。
［１４］ 有機溶媒を用いないことを特徴とする［９］ないし［１３］のいずれか１に記載の調製方法。
［１５］ 調製したPICが粒子形状を有する［９］ないし［１４］のいずれか１に記載の調製方法。
［１６］ 平均粒径が0.01μm〜1μmである［１５］に記載の調製方法。
［１７］ 抗原をコンジュゲートないし取り込ませおよび／または混合した［７］または［８］に記載のPICを含む免疫療法剤。
［１８］ 液性免疫および細胞性免疫を惹起しうる［１７］に記載の免疫療法剤。
［１９］ 抗原が卵白アルブミンである［１７］また［１８］に記載の免疫療法剤。
［２０］ 抗原がインフルエンザ・ヘマグルチニンである［１７］または［１８］記載の免疫療法剤。
［２１］ 抗原を［７］または［８］に記載のPICにコンジュゲートないし取り込ませおよび／または混合させる免疫療法剤の調製方法。
［２２］ 抗原が卵白アルブミンである［２１］に記載の免疫療法剤の調製方法。
［２３］ 抗原がインフルエンザ・ヘマグルチニンである［２１］に記載の免疫療法剤の調製方法。
本発明によれば、簡便に調製することができ、かつ、生体内で高い安定性を示しつつ適当な生体内分解性により最終的には消失するPICおよびPICナノ粒子が提供される。また、本発明によれば、簡便に種々の抗原タンパク質・ペプチドをコンジュゲートないし取り込ませ得るおよび／または混合し得るPICおよびPICナノ粒子を含む感染症・癌・自己免疫疾患などに対する免疫療法剤が提供される。
第１の態様において、本発明は、疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドからなるポリイオンコンプレックス（PIC）を提供する。
本発明に使用する疎水化ポリ酸性アミノ酸は、通常、一般式（Ｉ）：
［式中、R1は非置換型または置換型のフェニル基またはインドリル基であり；
R2は直鎖型または分枝鎖型の炭素数1〜5を有するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；l = 1または2であり；m + n = 40〜40,000である］
とからなり、構成単位（A）と構成単位（B）とのモル比（（m）：（n））が10：90〜90：10である。また、一般的には、pKaが約7以下、好ましくは約6以下、より好ましくは約4以下の酸性アミノ酸を重合して得られるポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基に、部分的に芳香族アミノ酸のアルキル、アルケニルまたはアルキニルエステルのアミノ基をアミド結合させることによって得ることができるものであってもよい。ここで用いる酸性アミノ酸の例としては、グルタミン酸、アスパラギン酸またはそれらの誘導体が挙げられ、ポリ酸性アミノ酸はそれらのうちの1種を重合したものであっても、それらの2種以上をランダム共重合体、交互共重合体、周期的共重合体またはブロック共重合体したものであってもよいが、好ましくはグルタミン酸のみが重合した微生物由来のポリ（γ-グルタミン酸）である。ポリ酸性アミノ酸の重合度は通常約40〜40,000、好ましくは約400〜15,000、より好ましくは約800〜8,000、最も好ましくは約1,500〜6,000であり、平均分子量としては通常約5.0×103〜5.0×106、好ましくは約5.0×104〜2.0×106、より好ましくは約1.0×105〜1.0×106、最も好ましくは約2.0×105〜8.0×105である。また、得られたポリ酸性アミノ酸に結合する芳香族アミノ酸のエステルの例としては、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはそれらの誘導体の直鎖型または分岐鎖型の炭素数1〜5のアルキル、アルケニルまたはアルキニルエステルが挙げられ、それらのうちの1種以上をポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基にアミド結合することができる。ポリ酸性アミノ酸の構成単位（A)と構成単位（B）とのモル比（（m）：（n））は、通常約10：90〜90：10、好ましくは約15：85〜85：15、より好ましくは約20：80〜80：20、さらに好ましくは約30：70〜80：20、最も好ましくは約45：55〜80：20である。
なお、酸性アミノ酸の重合方法、芳香族アミノ酸をエステル化する方法、ポリ酸性アミノ酸に芳香族アミノ酸エステルを導入する方法、重合度や導入率を制御する方法などは、当該技術分野における自体公知の方法によって行うことができる。
本発明に使用する塩基性ポリペプチドとしては、pKaが約7以上、好ましくは約7.5以上、より好ましくは約8以上の塩基性アミノ酸を重合することにより、あるいは天然のポリペプチドとして得ることができる。ここで用いる塩基性アミノ酸の例としては、リシン、ヒドロキシリシン、アルギニン、ヒスチジンまたはそれらの誘導体が挙げられ、塩基性ポリペプチドはそれらのうちの1種を重合したものであっても、それらの2種以上をランダム共重合体、交互共重合体、周期的共重合体またはブロック共重合体したものであってもよいが、好ましくはリシンのみが重合した微生物由来のポリ（ε-リシン）である。また天然の塩基性ポリペプチドとしては、プロタミンが含まれる。塩基性ポリペプチドの重合度は通常約8〜80、好ましくは約10〜70、より好ましくは約20〜60、最も好ましくは約30〜50であり、平均分子量としては通常約1.0×103〜1.0×104、好ましくは約1.3×103〜9.0×103、より好ましくは約2.5×103〜7.5×103、最も好ましくは約3.8×103〜6.4×103である。
本発明にかかるPICは、上記の疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドとを純水、生理食塩水および緩衝液に溶解して混合するだけで容易に調製することができる。また、好ましい形態において、PICは粒子形状を有するPICナノ粒子であり、かかるPICナノ粒子も本発明の範囲に含まれる。使用する緩衝液としては、上記の疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドの変性を起こさずに均一に溶解し得るものであれば特に限定されるものではないが、例えばpH6〜8.5のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）などが挙げられる。PICおよびPICナノ粒子は、このような同一または異なる緩衝液に疎水化ポリ酸性アミノ酸および塩基性ポリペプチドを各々別々に溶解し、常温で混合することにより調製することができる。各溶液を混合する比率は等量とすることができる。混合する疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドの比率（疎水化ポリ酸性アミノ酸：塩基性ポリペプチド）は、重量比で通常約20：1〜1：20、好ましくは約10：1〜1：10、より好ましくは約8：1〜1：8、最も好ましくは約6：1〜1：6ないし約6：1〜1：1、さらに最も好ましくは約6：1〜3：1である。また、ある種の形態において、本発明のPICおよびPICナノ粒子の調製は、有機溶媒を使用しないで行うことができる。
本発明にかかるPICナノ粒子の粒径は、平均粒径として通常約0.01〜1 μm、好ましくは約0.02〜0.8 μm、より好ましくは約0.05〜0.6 μm、最も好ましくは約0.1〜0.4 μmである。PICナノ粒子の粒径が0.01 μm未満の場合は抗原の担体としての能力が低下し、一方1 μmを超える場合はアジュバント活性が低下するので好ましくない。
PICナノ粒子の平均粒径は、疎水化ポリ酸性アミノ酸鎖中の疎水性アミノ酸残基の割合および／または疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドの分子量とその混合比率を変化させることにより制御することができる。生成したPICナノ粒子の平均粒径は、動的光散乱（DLS）法によって測定することができる。
また、第２の態様において、本発明は、上述のようにして得られるPICナノ粒子に抗原をコンジュゲートないし取り込ませて調製される抗原−コンジュゲートPICナノ粒子を含む免疫療法剤を提供する。本発明の免疫療法剤において抗原の担体およびアジュバントとして使用するのは、上述のようにして得られるPICナノ粒子であり、最終的に生体内の分解酵素により分解されて代謝、無毒化または低毒性化されるものである。一方、抗原としては特に限定されないが、例えば、卵白アルブミンなどの食品含有タンパク質抗原、悪性腫瘍抗原、病原性のウイルスまたは細菌などの病原体抗原などが挙げられ、悪性腫瘍としては、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、膀胱癌、白血病、悪性黒色腫などが含まれ、病原体としては成人T細胞白血病ウイルス、肝炎ウイルス、ヒト後天性免疫不全症候群（AIDS）ウイルス（HIV）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルスなどが含まれる。
また、PICナノ粒子の材料や構成比率、分子量、平均粒径、その他のパラメーターを適宜変更して、抗原の放出速度および放出時間やPICナノ粒子自体の生体内における消失速度を制御することもできる。このようなPICナノ粒子および抗原の調製方法は当該技術分野において知られている。例えば、PICナノ粒子を構成する疎水化ポリ酸性アミノ酸および塩基性ポリペプチドの分子量もしくは重合度、導入疎水基の種類および疎水基の導入率、抗原をコンジュゲートないし取り込ませる様式、コンジュゲートないし取り込ませる濃度および部位、ならびにPICナノ粒子の平均粒径、粒度分布、形状などを制御することにより徐放性の免疫療法剤を調製することができる。また、例えば、特定の臓器または部位に局在する酵素によって分解される結合をPICナノ粒子と抗原との結合またはPICナノ粒子中に導入して、特定の臓器または部位で抗原が放出されるように設計することができる。
本発明にかかる免疫療法剤は、抗原をコンジュゲートないし取り込ませたPICナノ粒子および賦形剤もしくは担体、ならびに所望により懸濁化剤、等張化剤、防腐剤などの他の成分を含むことができる。賦形剤または担体としては、生体に投与して悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されるものではないが、例えば、水、エタノールまたはグリセリンのような水性媒体、または脂肪酸、脂肪酸エステルなどの油類のような非水性媒体が挙げられる。また、本発明にかかる免疫療法剤の剤形はいずれのものであってもよく、対象の状態、疾病の種類などの因子に応じて適宜選択することができる。例えば、液剤、懸濁剤、乳化剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることができる。あるいは、凍結乾燥した免疫療法剤を、使用する前に適当な賦形剤または担体に溶解または懸濁して用いることもできる。
また、第３の態様において、本発明は、抗原とPICナノ粒子とを混合して含む免疫療法剤を提供する。この態様において、免疫療法剤に使用する抗原およびPICナノ粒子ならびに他の配合成分および剤型は、抗原をPICナノ粒子にコンジュゲートないし取り込ませる代わりに混合して含有する以外は上述した抗原コンジュゲートPICナノ粒子を含む免疫療法剤の場合と同様である。
本発明にかかる免疫療法剤は、その投与方法、投与経路および投与回数に特に限定はなく、剤形、対象の状態、疾病の種類などの因子に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の免疫療法剤は注射、輸液などにより非経口投与しても、経口投与することもできる。
上述したように、本発明にかかる免疫療法剤は、種々の疾病の予防および治療を目的として対象に投与することができる。したがって、別の態様において、本発明はPICナノ粒子の免疫療法剤としての使用および免疫療法剤を製造するためのPICナノ粒子の使用方法も提供する。また、別の態様において、本発明は抗原をコンジュゲートないし取り込ませたPICナノ粒子を含む免疫療法剤を対象に投与することを特徴とする、対象における疾病の治療または予防方法を提供する。
また、第４の態様において、本発明は、上述したPICおよびPICナノ粒子の調製方法を提供する。
本発明にかかるPICおよびPICナノ粒子の調製方法は、水溶性の疎水化ポリ酸性アミノ酸の調製と、それら疎水化ポリ酸性アミノ酸水溶液と塩基性ポリペプチド水溶液の混合の工程からなる。疎水化ポリ酸性アミノ酸の調製は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（WSC）や1-シクロヘキシル-3-[2-(4-メチルモルホリニル)エチル]カルボジイミド-p-トルエンスルホネートのような脱水縮合剤を用いてポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基に芳香族アミノ酸エステルのアミノ基をアミド結合させることができ、ポリ酸性アミノ酸に対する疎水性アミノ酸の導入率は、脱水縮合剤の濃度、芳香族アミノ酸エステルの濃度、反応時間などの反応条件を適宜変化させることによって調節することができる。
本発明にかかるPICおよびPICナノ粒子の調製方法は、水溶性の疎水化ポリ酸性アミノ酸の調製と、それら疎水化ポリ酸性アミノ酸水溶液と塩基性ポリペプチド水溶液の混合の工程からなる。疎水化ポリ酸性アミノ酸の調製は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（WSC）や1-シクロヘキシル-3-[2-(4-メチルモルホリニル)エチル]カルボジイミド-p-トルエンスルホネートのような脱水縮合剤を用いてポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基に芳香族アミノ酸エステルのアミノ基をアミド結合させることができ、ポリ酸性アミノ酸に対する疎水性アミノ酸の導入率は、脱水縮合剤の濃度、芳香族アミノ酸エステルの濃度、反応時間などの反応条件を適宜変化させることによって調節することができる。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。また、実施例においては、ポリ（γ-グルタミン酸）をγ-PGA、ポリ（ε-リジン）をε-PLと略称する。
調製例１
疎水化ポリアミノ酸の調製
607 mgの微生物（Bacillus subtilis）由来のγ-PGA（明治製菓（株）、分子量3.8×105、pKa=2.3）を100 mlの50 mM炭酸水素ナノトリウム水溶液に均一に溶解した。その溶液に225〜901 mgの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC)、1080 mgのL-フェニルアラニンエチルエステル（PheE）を添加して、氷冷下1時間、その後、室温で24時間反応させた。反応後、生じた溶液を透析膜（分子量分画50,000）を用いて水で3日間透析を行い、次に凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物をエタノール100 mlに添加し、一晩攪拌した。生じた溶液を遠心分離（1,500×g、20分間）し、沈殿物を減圧乾燥し、疎水化γ-PGAを得た。γ-PGAへのPheE導入量は、WSC濃度を変化させることで調節した。このようにして調製した疎水化γ-PGAのPheE導入率を1H-NMRによって測定したところ、PheE導入率はそれぞれ16%、28%、36%および49%であることが判明した（以下、各々、γ-PGA-PheE-16、-28、-36および-49と略称する）。
疎水化ポリアミノ酸の調製
607 mgの微生物（Bacillus subtilis）由来のγ-PGA（明治製菓（株）、分子量3.8×105、pKa=2.3）を100 mlの50 mM炭酸水素ナノトリウム水溶液に均一に溶解した。その溶液に225〜901 mgの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (WSC)、1080 mgのL-フェニルアラニンエチルエステル（PheE）を添加して、氷冷下1時間、その後、室温で24時間反応させた。反応後、生じた溶液を透析膜（分子量分画50,000）を用いて水で3日間透析を行い、次に凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物をエタノール100 mlに添加し、一晩攪拌した。生じた溶液を遠心分離（1,500×g、20分間）し、沈殿物を減圧乾燥し、疎水化γ-PGAを得た。γ-PGAへのPheE導入量は、WSC濃度を変化させることで調節した。このようにして調製した疎水化γ-PGAのPheE導入率を1H-NMRによって測定したところ、PheE導入率はそれぞれ16%、28%、36%および49%であることが判明した（以下、各々、γ-PGA-PheE-16、-28、-36および-49と略称する）。
調製例２
ポリイオンコンプレックス（PIC）ナノ粒子の調製
上述したように調製した種々の疎水化γ-PGA（γ-PGA-PheE-16、-28および-49）または未修飾γ-PGA（明治製菓（株）、分子量3.8×105、pKa=2.3）と微生物（Streptomyces albulus 346）由来のε-PL（チッソ（株）、分子量4.7×103）とを25℃のPBS（pH 7.4）に各々最終濃度10 mg／mlおよび0〜5 mg／mlで別々に溶解し、それらを等量混合した。動的光散乱法（機器名、ゼータサイザー Nano ZS, Malvern社）により混合直後の平均粒径および粒度分布を測定するとともに、粒子の状態を走査型電子顕微鏡で観察した。その結果を表1および図1に示す。
ポリイオンコンプレックス（PIC）ナノ粒子の調製
上述したように調製した種々の疎水化γ-PGA（γ-PGA-PheE-16、-28および-49）または未修飾γ-PGA（明治製菓（株）、分子量3.8×105、pKa=2.3）と微生物（Streptomyces albulus 346）由来のε-PL（チッソ（株）、分子量4.7×103）とを25℃のPBS（pH 7.4）に各々最終濃度10 mg／mlおよび0〜5 mg／mlで別々に溶解し、それらを等量混合した。動的光散乱法（機器名、ゼータサイザー Nano ZS, Malvern社）により混合直後の平均粒径および粒度分布を測定するとともに、粒子の状態を走査型電子顕微鏡で観察した。その結果を表1および図1に示す。
aγ-PGAおよびγ-PGA-PheEはPBSに溶解（10mg/mL）し、その溶液を等量のε-PL溶液に添加した。
b測定せず。
表1および図1から明らかなように、混合直後にナノ粒子の形成が認められた。ε-PL濃度が高くなるにつれて生成する粒子の粒径が大きくなる傾向が認められ、疎水化ポリアミノ酸の疎水性基の導入率の変化もε-PL濃度との組み合わせによって粒径の大きさに影響した。すなわち、本発明のPICナノ粒子の粒径は、疎水化ポリ酸性アミノ酸への疎水性基の導入率ならびに疎水化ポリ酸性アミノ酸および塩基性ポリペプチドの混合比率を変化させることにより制御し得ることが示された。
実施例１
PICナノ粒子の安定性
つぎに、上述のように形成されるPICナノ粒子の安定性を測定した。種々の割合で疎水基を導入したγ-PGA-PheE-16、-28または-49（10 mg／mL）およびε-PL（2 mg／mL）を1 mlのPBS（pH7.4）に別々に溶解し、等量混合後、4℃で静置して経時的に平均粒径を動的光散乱法（機器名、ゼータサイザー Nano ZS, Malvern社）により測定した。その結果を図2に示す。
PICナノ粒子の安定性
つぎに、上述のように形成されるPICナノ粒子の安定性を測定した。種々の割合で疎水基を導入したγ-PGA-PheE-16、-28または-49（10 mg／mL）およびε-PL（2 mg／mL）を1 mlのPBS（pH7.4）に別々に溶解し、等量混合後、4℃で静置して経時的に平均粒径を動的光散乱法（機器名、ゼータサイザー Nano ZS, Malvern社）により測定した。その結果を図2に示す。
図2から明らかなように、疎水化ポリ酸性アミノ酸と塩基性ポリペプチドとを一定の割合で混合した場合、γ-PGA-PheE-16を用いた場合には1日後には粒子の崩壊および凝集が認められ、動的光散乱法により単分散のピークは認められなかった。一方、γ-PGA-PheE-28を用いた場合には粒子の膨潤により粒径の増加がみられたが調製後３日間にわたって単分散が維持されていた。また、γ-PGF-PheE-49を用いた場合には高い安定性が示され、調製後３日間にわたって大きな粒径の変化は認められなかった。この高い安定性は、粒子内部でのPheE基による疎水性ドメインの形成に起因していた。
実施例２
抗原-コンジュゲートPICナノ粒子の免疫誘導効果
抗原-コンジュゲートPICナノ粒子の調製
γ-PGA-PheE-36 10 mg/ml、ε-PL 4 mg/mlおよび卵白アルブミン (OVA) 2 mg/mlのPBS溶液を調製した。まず、各250 μlのε-PLとOVA溶液を等量混合し、ε-PL + OVA混合溶液を作製した（ε-PL 2 mg/ml + OVA 1 mg/ml in PBS, 500 μl）。この溶液に500 μlのγ-PGA-PheE-36溶液を加えて混合し、OVA-コンジュゲートPICナノ粒子（OVA-PIC NP）を調製した。OVA-PIC NPの粒径は213 nmであった。
抗原-コンジュゲートPICナノ粒子の免疫誘導効果
抗原-コンジュゲートPICナノ粒子の調製
γ-PGA-PheE-36 10 mg/ml、ε-PL 4 mg/mlおよび卵白アルブミン (OVA) 2 mg/mlのPBS溶液を調製した。まず、各250 μlのε-PLとOVA溶液を等量混合し、ε-PL + OVA混合溶液を作製した（ε-PL 2 mg/ml + OVA 1 mg/ml in PBS, 500 μl）。この溶液に500 μlのγ-PGA-PheE-36溶液を加えて混合し、OVA-コンジュゲートPICナノ粒子（OVA-PIC NP）を調製した。OVA-PIC NPの粒径は213 nmであった。
PICナノ粒子の免疫誘導効果
つぎに、このようにして調製したOVAコンジュゲートPICナノ粒子（OVA-PIC NP）の免疫誘導効果を評価した。6週齢のC57BL／6マウスの皮下に、PBSのみ、PBSに溶解したOVA（0.5 mg/ml）のみ、OVA（0.5 mg/ml）を加えた完全フロイントアジュバント（CFA）のみ、またはOVA-PIC NP（OVA: 0.5 mg/ml, γ-PGA-PheE-36: 5 mg/ml, ε-PL: 1 mg/ml）のみを1週間間隔で2回免疫した（各々、0.2 mL接種）。最終免疫から1週間後にマウスから脾臓を取り出し、脾細胞中のOVAに特異的なCD8+T細胞（細胞性免疫）の存在についてH-2kb/SIINFEKL（OVA 257-264ペプチド）−Pro5 MHC Pentamer（ProImmune社）およびFITC標識抗-CD8+抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにより解析した。その結果を図3に示す。
つぎに、このようにして調製したOVAコンジュゲートPICナノ粒子（OVA-PIC NP）の免疫誘導効果を評価した。6週齢のC57BL／6マウスの皮下に、PBSのみ、PBSに溶解したOVA（0.5 mg/ml）のみ、OVA（0.5 mg/ml）を加えた完全フロイントアジュバント（CFA）のみ、またはOVA-PIC NP（OVA: 0.5 mg/ml, γ-PGA-PheE-36: 5 mg/ml, ε-PL: 1 mg/ml）のみを1週間間隔で2回免疫した（各々、0.2 mL接種）。最終免疫から1週間後にマウスから脾臓を取り出し、脾細胞中のOVAに特異的なCD8+T細胞（細胞性免疫）の存在についてH-2kb/SIINFEKL（OVA 257-264ペプチド）−Pro5 MHC Pentamer（ProImmune社）およびFITC標識抗-CD8+抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにより解析した。その結果を図3に示す。
図3から明らかなように、PBSのみ、OVAのみおよびOVA＋CFAを免疫した動物群においてはほとんど細胞性免疫の誘導が認められなかったのに対して、OVA-PIC NPを免疫した動物群において非常に高い免疫誘導効果が確認された。
以上の結果より、OVA-PIC NPは生体内において高い安定性を示し、抗原提示細胞に効率よく抗原をデリバリーすることで、優れた免疫誘導効果を示すと考えられる。
以上の結果より、OVA-PIC NPは生体内において高い安定性を示し、抗原提示細胞に効率よく抗原をデリバリーすることで、優れた免疫誘導効果を示すと考えられる。
実施例３
また、実施例2において、γ-PGA-PheE-36の代わりに新たに調製したγ-PGA-PheE-40を用い、また完全フロイントアジュバント（CFA）の代わりに水酸化アルミニウム（Alum）を用いる以外は実施例2の方法に従ってOVA-PIC NPの免疫誘導効果を評価した。その結果を図4に示す。
また、実施例2において、γ-PGA-PheE-36の代わりに新たに調製したγ-PGA-PheE-40を用い、また完全フロイントアジュバント（CFA）の代わりに水酸化アルミニウム（Alum）を用いる以外は実施例2の方法に従ってOVA-PIC NPの免疫誘導効果を評価した。その結果を図4に示す。
図4から明らかなように、PBSのみ、OVAのみおよびOVA＋Alumを免疫した動物群においてはほとんど細胞性免疫の誘導が認められなかったのに対して、OVA-PIC NPを免疫した動物群において非常に高い免疫誘導効果が確認された。
これら実施例2および実施例3の結果から、OVA-PIC NPは生体内において高い安定性を示し、抗原提示細胞に効率よく抗原をデリバリーすることによって従来のアジュバントを超える優れた細胞性免疫誘導効果を示すことが明らかとなった。
これら実施例2および実施例3の結果から、OVA-PIC NPは生体内において高い安定性を示し、抗原提示細胞に効率よく抗原をデリバリーすることによって従来のアジュバントを超える優れた細胞性免疫誘導効果を示すことが明らかとなった。
実施例４
つぎに、実施例2においてマウス脾臓から取り出した脾細胞を細胞傷害性T細胞エピトープペプチド（10 μg/ml）で刺激し、ELISPOT法により全CD8+T細胞に占めるインターフェロン（IFN）-γおよび腫瘍壊死因子（TNF）-αの産生細胞数を測定した。その結果を図5A−Dに示す。
つぎに、実施例2においてマウス脾臓から取り出した脾細胞を細胞傷害性T細胞エピトープペプチド（10 μg/ml）で刺激し、ELISPOT法により全CD8+T細胞に占めるインターフェロン（IFN）-γおよび腫瘍壊死因子（TNF）-αの産生細胞数を測定した。その結果を図5A−Dに示す。
図5A−Dから明らかなように、PBSのみ、OVAのみおよびOVA＋Alumを免疫した動物群においてはほとんどIFN-γおよびTNF-αを産生する細胞が認められなかったのに対して、OVA-PIC NPを免疫した動物群においては高い割合のサイトカイン産生細胞が認められた（各チャート右上部の数値は全CD8+T細胞に占めるサイトカイン産生細胞の割合を示す）。
この結果から、本発明のPIC NPにより実施例3で示された抗原特異的CD8+T細胞が実際に活性化されていることが明らかになり、それが従来のアジュバントを超える優れた細胞性免疫活性化効果を示すことが明らかとなった。
この結果から、本発明のPIC NPにより実施例3で示された抗原特異的CD8+T細胞が実際に活性化されていることが明らかになり、それが従来のアジュバントを超える優れた細胞性免疫活性化効果を示すことが明らかとなった。
実施例５
抗原-コンジュゲートPICナノ粒子の調製
γ-PGA-PheE-40 10 mg/ml、ε-PLまたはプロタミン 4 mg/ml、および卵白アルブミン (OVA) 2 mg/ml、のPBS溶液を調製した。各々 250 μlのε-PLまたはプロタミン溶液とOVA溶液を等量混合し、ε-PLまたはプロタミン+OVA混合溶液を作製した（ε-PLまたはプロタミン 2 mg/ml + OVA 2 mg/ml in PBS, 500 μl）。これらの溶液に 500 μlのγ-PGA-PheE-40 PBS溶液を加えて混合し、OVA-コンジュゲートPICナノ粒子を調製した（OVA-PIC NP）。OVA-PIC NPε-PLおよびOVA-PIC NP プロタミンの粒径はそれぞれ 220 および 187 nmであった。また、希釈溶液の調整はPBSを用いて行った。
抗原-コンジュゲートPICナノ粒子の調製
γ-PGA-PheE-40 10 mg/ml、ε-PLまたはプロタミン 4 mg/ml、および卵白アルブミン (OVA) 2 mg/ml、のPBS溶液を調製した。各々 250 μlのε-PLまたはプロタミン溶液とOVA溶液を等量混合し、ε-PLまたはプロタミン+OVA混合溶液を作製した（ε-PLまたはプロタミン 2 mg/ml + OVA 2 mg/ml in PBS, 500 μl）。これらの溶液に 500 μlのγ-PGA-PheE-40 PBS溶液を加えて混合し、OVA-コンジュゲートPICナノ粒子を調製した（OVA-PIC NP）。OVA-PIC NPε-PLおよびOVA-PIC NP プロタミンの粒径はそれぞれ 220 および 187 nmであった。また、希釈溶液の調整はPBSを用いて行った。
PICナノ粒子の免疫誘導効果
つぎに、このようにして調製したOVAコンジュゲートPICナノ粒子（OVA-PIC NP）の細胞性免疫誘導効果を評価した。6週齢のC57BL／6マウスの皮下に、PBSのみ100 μl、またはOVA-PIC NP（OVA: 0.5 mg/ml, γ-PGA-PheE-40: 5 mg/ml, ε-PLまたはプロタミン: 1 mg/ml）200μl、またはOVA-PIC NP（OVA: 0.1 mg/ml,γ-PGA-PheE-40: 1 mg/ml, ε-PLまたはプロタミン: 0.2 mg/ml）100μlを1週間間隔で2回免疫した。最終免疫から1週間後にマウスから脾臓を取り出し、脾細胞中のOVAに特異的なCD8+T細胞（細胞性免疫）の存在についてH-2kb/SIINFEKL（OVA 257-264ペプチド）−Pro5 MHC Pentamer（ProImmune社）およびFITC標識抗-CD8+T抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにより解析した。その結果を図6に示す。
つぎに、このようにして調製したOVAコンジュゲートPICナノ粒子（OVA-PIC NP）の細胞性免疫誘導効果を評価した。6週齢のC57BL／6マウスの皮下に、PBSのみ100 μl、またはOVA-PIC NP（OVA: 0.5 mg/ml, γ-PGA-PheE-40: 5 mg/ml, ε-PLまたはプロタミン: 1 mg/ml）200μl、またはOVA-PIC NP（OVA: 0.1 mg/ml,γ-PGA-PheE-40: 1 mg/ml, ε-PLまたはプロタミン: 0.2 mg/ml）100μlを1週間間隔で2回免疫した。最終免疫から1週間後にマウスから脾臓を取り出し、脾細胞中のOVAに特異的なCD8+T細胞（細胞性免疫）の存在についてH-2kb/SIINFEKL（OVA 257-264ペプチド）−Pro5 MHC Pentamer（ProImmune社）およびFITC標識抗-CD8+T抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにより解析した。その結果を図6に示す。
図6から明らかなように、PBSのみを免疫した動物群においてはほとんど細胞性免疫の誘導が認められなかったのに対して、プロタミンを用いて調製したOVA-PIC NPを免疫した動物群においては、ε-PLを用いて調製したOVA-PIC NPを免疫した動物群を超える非常に高い細胞性免疫誘導効果が確認された。
以上の結果より、ε-PLのみならずプロタミンを用いて調製したOVA-PIC NPも生体内において高い安定性を示し、抗原提示細胞に効率よく抗原をデリバリーすることで、優れた細胞性免疫誘導効果を示すことが明らかになった。
以上の結果より、ε-PLのみならずプロタミンを用いて調製したOVA-PIC NPも生体内において高い安定性を示し、抗原提示細胞に効率よく抗原をデリバリーすることで、優れた細胞性免疫誘導効果を示すことが明らかになった。
実施例６
つぎに、実施例5においてマウス脾臓から取り出した脾細胞を細胞傷害性T細胞エピトープペプチド（10 μg/ml）で刺激し、ELISPOT法により全細胞に占めるインターフェロン（IFN）-γおよび腫瘍壊死因子（TNF）−αの産生細胞数を測定した。その結果を図7A-Eに示す。
つぎに、実施例5においてマウス脾臓から取り出した脾細胞を細胞傷害性T細胞エピトープペプチド（10 μg/ml）で刺激し、ELISPOT法により全細胞に占めるインターフェロン（IFN）-γおよび腫瘍壊死因子（TNF）−αの産生細胞数を測定した。その結果を図7A-Eに示す。
図7A-Eから明らかなように、PBSのみで免疫した動物群においてはほとんどIFN-γおよびTNF-αを産生する細胞が認められなかったのに対して、プロタミンを用いて調製したOVA-PIC NPを免疫した動物群においては、ε-PLを用いて調製したOVA-PIC NPを免疫した動物群を超える非常に高い細胞性免疫活性化効果が認められた（各チャート右上部の数値は全CD8+T細胞に占めるサイトカイン産生細胞の割合を示す）。
この結果から、ε-PLのみならずプロタミンを用いて調製した本発明のPIC NPでも抗原特異的CD8+T細胞を実際に活性化し得ることが明らかになり、従来のアジュバントを超える優れた細胞性免疫活性化効果を示すことが明らかとなった。
この結果から、ε-PLのみならずプロタミンを用いて調製した本発明のPIC NPでも抗原特異的CD8+T細胞を実際に活性化し得ることが明らかになり、従来のアジュバントを超える優れた細胞性免疫活性化効果を示すことが明らかとなった。
実施例７
また、実施例5におけるマウスから血清を取り出し、産生されているOVA特異的な免疫グロブリンIgGの抗体価をELISA法により測定した。その結果を図8に示す。
図8から明らかなように、PBSのみで免疫した動物群においては低い抗原特異的な抗体価しか認められなかったが、ε-PLまたはプロタミンを用いて調製した本発明のPIC NPで免疫した動物群においては高いOVA特異的なIgG抗体価が認められた。
この結果から、本発明のPIC NPで免疫した動物においては高い抗体価で抗原特異的抗体が生成することが明らかとなり、それが細胞性免疫のみならず液性免疫をも誘導する効果を示すことが明らかとなった。
また、実施例5におけるマウスから血清を取り出し、産生されているOVA特異的な免疫グロブリンIgGの抗体価をELISA法により測定した。その結果を図8に示す。
図8から明らかなように、PBSのみで免疫した動物群においては低い抗原特異的な抗体価しか認められなかったが、ε-PLまたはプロタミンを用いて調製した本発明のPIC NPで免疫した動物群においては高いOVA特異的なIgG抗体価が認められた。
この結果から、本発明のPIC NPで免疫した動物においては高い抗体価で抗原特異的抗体が生成することが明らかとなり、それが細胞性免疫のみならず液性免疫をも誘導する効果を示すことが明らかとなった。
実施例８
インフルエンザ抗原に対する液性免疫および細胞性免疫の誘導性
有精卵（受精卵）を孵卵機内で約11日間、38〜39℃で保温し、胚の発生を確認した後、卵殻に注射針が通る程度の穴をあけ、そこから將尿液にワクチン製造株であるインフルエンザウイルス（A/広島株（H3N2）、A/ソロモン諸島株（H1N1）およびB/マレーシア株）を直接注入し、その穴をふさぎ、再度、孵卵機に戻し、32〜36℃で3日ほど保温した。その後、ウイルス接種卵を冷蔵庫に一晩入れ、卵殻を切り取り、將尿液を無菌的に採取した。採取液中の血液などの混入物を除いた後、ゾーナル遠心機を用いた蔗糖密度勾配遠心法によりウイルス粒子を精製濃縮した。このインフルエンザウイルス浮遊液をエーテル処理し、その後にホルマリンを添加した。
以上のように調製した3株のインフルエンザHA抗原量を生物学的製剤基準（厚生労働省）のインフルエンザHAワクチンに記載された力価試験法のうち、一元放射免疫拡散試験法に従い測定してインフルエンザHA抗原液とした。
調製したインフルエンザHA抗原3株のHA抗原含量は、A/広島株が502.4μg/ml、A/ソロモン諸島株が1262.5μg/ml、B/マレーシア株が611.0μg/mlであった。
インフルエンザ抗原に対する液性免疫および細胞性免疫の誘導性
有精卵（受精卵）を孵卵機内で約11日間、38〜39℃で保温し、胚の発生を確認した後、卵殻に注射針が通る程度の穴をあけ、そこから將尿液にワクチン製造株であるインフルエンザウイルス（A/広島株（H3N2）、A/ソロモン諸島株（H1N1）およびB/マレーシア株）を直接注入し、その穴をふさぎ、再度、孵卵機に戻し、32〜36℃で3日ほど保温した。その後、ウイルス接種卵を冷蔵庫に一晩入れ、卵殻を切り取り、將尿液を無菌的に採取した。採取液中の血液などの混入物を除いた後、ゾーナル遠心機を用いた蔗糖密度勾配遠心法によりウイルス粒子を精製濃縮した。このインフルエンザウイルス浮遊液をエーテル処理し、その後にホルマリンを添加した。
以上のように調製した3株のインフルエンザHA抗原量を生物学的製剤基準（厚生労働省）のインフルエンザHAワクチンに記載された力価試験法のうち、一元放射免疫拡散試験法に従い測定してインフルエンザHA抗原液とした。
調製したインフルエンザHA抗原3株のHA抗原含量は、A/広島株が502.4μg/ml、A/ソロモン諸島株が1262.5μg/ml、B/マレーシア株が611.0μg/mlであった。
マウスへの免疫方法
4週齢（BALB/c、雌）を以下の6群（一群4匹）に分け、各群の下記成分を単独でまたは混合してマウス一匹当たり100μlで皮下より免疫した。
第一群：PBS投与群
第二群：HA抗原単独免疫群（各株0.3μg／マウス）
第三群：HA抗原（各株0.3μg／マウス）＋Imject Alum（100μg／マウス, PIERCE社
免疫群
第四群：HA抗原（各株0.3μg／マウス）＋γ-PGA NP（100μg／マウス）免疫群
第五群：HA抗原（各株0.3μg／マウス）＋PIC NP（100μg／マウス）免疫群
第六群：HA抗原（各株0.3μg／マウス）＋フロイントアジュバント（GERBU社、50μl
／マウス）免疫群
なお、フロイントアジュバントについては、初回免疫には完全アジュバントを、また二回目の免疫には不完全アジュバントを使用した。
免疫は1週間間隔で2回行い、二回目の免疫から一週間後に血液を採取して、血中のIgGおよびHI抗体価を評価した。A/広島株、A/ソロモン諸島株、B/マレーシア株についての結果を各々図9から11に示す。
4週齢（BALB/c、雌）を以下の6群（一群4匹）に分け、各群の下記成分を単独でまたは混合してマウス一匹当たり100μlで皮下より免疫した。
第一群：PBS投与群
第二群：HA抗原単独免疫群（各株0.3μg／マウス）
第三群：HA抗原（各株0.3μg／マウス）＋Imject Alum（100μg／マウス, PIERCE社
免疫群
第四群：HA抗原（各株0.3μg／マウス）＋γ-PGA NP（100μg／マウス）免疫群
第五群：HA抗原（各株0.3μg／マウス）＋PIC NP（100μg／マウス）免疫群
第六群：HA抗原（各株0.3μg／マウス）＋フロイントアジュバント（GERBU社、50μl
／マウス）免疫群
なお、フロイントアジュバントについては、初回免疫には完全アジュバントを、また二回目の免疫には不完全アジュバントを使用した。
免疫は1週間間隔で2回行い、二回目の免疫から一週間後に血液を採取して、血中のIgGおよびHI抗体価を評価した。A/広島株、A/ソロモン諸島株、B/マレーシア株についての結果を各々図9から11に示す。
図9から11から明らかなように、抗原として卵白アルブミン（OVA）を用いた前記実験の結果と同様に、PIC NPは全ての異なるウイルス株のHA抗原に対してAlumと同等以上のアジュバント活性を有することが認められた。
この結果から、本発明のPIC NPで免疫した動物においては高い抗体価の抗原特異的抗体が生成することが明らかとなり、インフルエンザ抗原に対する液性免疫誘導活性を有することが明らかとなった。
この結果から、本発明のPIC NPで免疫した動物においては高い抗体価の抗原特異的抗体が生成することが明らかとなり、インフルエンザ抗原に対する液性免疫誘導活性を有することが明らかとなった。
また、二回目の免疫から一週間後にマウスから採取した脾細胞を5×105細胞/100 μl/ウェルの密度でウェルに播き、ELISpotPLUS for Mouse Interferon-γキット（MABTECH社）を用いて、PBS、インフルエンザHA抗原（A/HI、A/SI、B/MAの3株混合物）、卵白アルブミン（OVA、シグマ社、A2512-250MG、GradeIV）を30 ng/mlの濃度で添加し、キットのプロトコールに従って約38時間培養した後に脾臓細胞のIFN-γ産生細胞数を測定した（各個体の各刺激抗原は3ウェルの平均で評価）。その結果を図12に示す。
図12から明らかなように、γ-PGA NP では高い細胞性免疫を誘導することができないことが示された。一方、PIC NPはフロイントアジュバントと同等以上の細胞性免疫の活性化効果を有することが示された。
これらの結果から、本発明のPIC NPはインフルエンザHA抗原に対しても高い免疫誘導効果および活性化効果を示すことが明らかとなり、本発明のポリイオンコンプレックスおよびポリイオンコンプレックスナノ粒子はキャリアまたは免疫療法剤として有用であることが示された。
これらの結果から、本発明のPIC NPはインフルエンザHA抗原に対しても高い免疫誘導効果および活性化効果を示すことが明らかとなり、本発明のポリイオンコンプレックスおよびポリイオンコンプレックスナノ粒子はキャリアまたは免疫療法剤として有用であることが示された。
本発明のポリイオンコンプレックスおよびポリイオンコンプレックスナノ粒子は、種々の抗原に対する生体の細胞性免疫および液性免疫の両方を高める効果を有し、免疫アジュバントとして医療分野ないし医薬分野において利用可能である。
Claims (14)
- 一般式（I）：
［式中、R1は非置換型のフェニル基であり；
R2は直鎖型の炭素数2を有するアルキル基であり；l = 2であり；m + n = 1,500〜6,000である］
とからなり、構成単位（A)と構成単位（B）とのモル比（（m）：（n））が72：28〜51：49である疎水化ポリ酸性アミノ酸と、ポリ（ε−リシン）（重量平均分子量3.8×10 3 〜6.4×10 3 ）またはプロタミンとを4：1〜16：1の重量比で含むポリイオンコンプレックス（PIC）。 - 粒子形状を有する請求項１に記載のPIC。
- 平均粒径が0.1〜0.4μmである請求項２に記載のPIC。
- （１）ポリ（γ−グルタミン酸）にフェニルアラニンエチルエステルを導入することによって、一般式（I）：
［式中、R1は非置換型のフェニル基であり；
R2は直鎖型の炭素数2を有するアルキル基であり；l = 2であり；m + n = 1,500〜6,000である］
とからなり、構成単位（A)と構成単位（B）とのモル比（（m）：（n））が72：28〜51：49である疎水化ポリ酸性アミノ酸を調製し；
（２）調製した疎水化ポリ酸性アミノ酸を緩衝液に溶解し、緩衝液に溶解したポリ（ε−リシン）（重量平均分子量3.8×10 3 〜6.4×10 3 ）またはプロタミンと4：1〜16：1の重量比で混合する
工程を含むPICの調製方法。 - 有機溶媒を用いないことを特徴とする請求項４に記載の調製方法。
- 調製したPICが粒子形状を有する請求項４または５に記載の調製方法。
- 調製したPICの平均粒径が0.1〜0.4μmである請求項６に記載の調製方法。
- 抗原をコンジュゲートないし取り込ませおよび／または混合した請求項２または３に記載のPICを含む免疫療法剤。
- 液性免疫および細胞性免疫を惹起しうる請求項８に記載の免疫療法剤。
- 抗原が卵白アルブミンである請求項８または９に記載の免疫療法剤。
- 抗原がインフルエンザ・ヘマグルチニンである請求項８または９に記載の免疫療法剤。
- 抗原を請求項２または３に記載のPICにコンジュゲートないし取り込ませおよび／または混合させる免疫療法剤の調製方法。
- 抗原が卵白アルブミンである請求項１２に記載の免疫療法剤の調製方法。
- 抗原がインフルエンザ・ヘマグルチニンである請求項１２に記載の免疫療法剤の調製方法。
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