JP5131680B2 - 疎水化ポリ（γ−グルタミン酸）からなるナノ粒子の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、疎水化ポリ（γ−グルタミン酸）からなるナノ粒子の製造方法に関する。

ポリ（γ−グルタミン酸）はバチルス（Bacillus）属の微生物の発酵により非常に効率よく（例えば、培養液１ｌ当たり５０ｇ）生産され、α−カルボキシル基に由来するカルボキシル基を側鎖に有する直鎖の水溶性の生分解性ポリマーである。このような特性を生かし、ポリ（γ−グルタミン酸）（以下、γ−ＰＧＡと略す。）は、制ガン剤に化学結合を介して担持させるか、化学的な架橋によるゲル化を介してゲルマトリックス中に薬物を内包させるために薬物担体としての用途が提案されている（例えば、特許文献１と２）。

これに対し、本発明者らは、γ−ＰＧＡのさらなる機能化を目的として、γ−ＰＧＡの化学修飾の検討を行っているが、γ−ＰＧＡの側鎖カルボキシル基の一部を介して疎水性基を導入した疎水化γ−ＰＧＡが水性媒体中で平均粒径が２００ｎｍ程度のナノ粒子を生成することを見出し、新たな薬物担体として用いることを提案している（例えば、非特許文献１）。疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子は、水性媒体中で、表面にγ−ＰＧＡが局在し、内部には疎水性基が存在する構造をとっている。

その疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を製造するためには、一旦、疎水化γ−ＰＧＡを良溶媒に溶解させた後、その溶解した溶液と貧溶媒とを混合することにより、溶解した疎水化γ−ＰＧＡを不溶化させてナノ粒子を生成させる方法を用いている。その良溶媒には、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が知られている。特にジメチルスルホキシドは優れた溶解能を有しており、疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子の製造に一般に用いられている。
特開平６−９２８７０号公報 特開平６−２５６２２０号公報 Michiya Matsusaki, Ken-ichiro Hiwatari, Mariko Higashi, Tatsuo Kaneko, Mitsuru Akashi, Chem. Lett., 33, 398-399, 2004

しかしながら、ジメチルスルホキシドは、疎水化γ−ＰＧＡを溶解させる点では優れた溶媒であるが、毒性を有している。そして、ジメチルスルホキシドは、ナノ粒子回収時に残留溶剤としてナノ粒子中に残留し除去するのは容易ではない。そのため、無害であることを要求される医薬品の製造に用いることはできない。

そこで、本発明は、ジメチルスルホキシド等の有害な溶剤を用いることなく医薬品の製造に使用可能な疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を提供することが可能な、疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子の製造方法を提供することを目的とした。

上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、良溶媒として、弱アルカリ性と炭素数１から３のアルコールとの混合溶媒を用いることにより、疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を製造可能なことを見出して本発明を完成させたものである。
すなわち、本発明に係る疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子の製造方法は、疎水化γ−ＰＧＡを弱アルカリ性水溶液と炭素数１から３のアルコールとの混合溶媒からなる良溶媒に溶解させた溶液と、貧溶媒とを混合して、ナノ粒子を生成させることを特徴とする。

本発明では、弱アルカリ性水溶液に、溶質として、クエン酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１種を含むことができる。

また、炭素数１から３のアルコールには、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールからなる群から選択された少なくとも１種を用いることができる。

また、貧溶媒には、弱酸性水溶液を用いることができる。

本発明によれば、ジメチルスルホキシド等の有害な溶剤を用いることなく、疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を製造することができる。ジメチルスルホキシドに代えて用いる弱アルカリ性水溶液と炭素数１から３のアルコールとの混合溶媒は、それぞれ生体適合性と生物分解性を有しているので、医薬品製造に使用可能な疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を製造することが可能となる。

本発明に係る疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子の製造方法は、疎水化γ−ＰＧＡを弱アルカリ性水溶液と炭素数１から３のアルコールとの混合溶媒からなる良溶媒に溶解させた溶液と、貧溶媒とを混合して、ナノ粒子を生成させることを特徴とするものである。

本発明に用いる疎水化γ−ＰＧＡは、γ−ＰＧＡの側鎖カルボキシル基の一部を介して疎水性基を導入したものである。原料のγ−ＰＧＡには、微生物による培養法、すなわち、バチルス・ズブチルスの発酵により得られる高分子量のもの、あるいは必要に応じ、その発酵由来のものを機械的あるいは化学的に加水分解して分子量を低下させたものを用いることができる。本発明に用いるγ−ＰＧＡの分子量は特に限定されるものはないが、１０万Ｋｄａ〜５００万Ｋｄａの分子量のものを好適に用いることができる。

また、疎水性基には、−(Ｘ)−ＣＨＲ^２Ｒ^３の一般式で表され、（Ｘ）は−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、Ｒ^２は水素またはＣ１−Ｃ２１アルキルを表し、かつ、Ｒ^３は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルオキシカルボニルを表す基や、カルボキシル基をエステル化した疎水性アミノ酸残基（以下、エステル化疎水性アミノ酸残基という。）を用いることができるが、エステル化疎水性アミノ酸残基を用いることが好ましい。生体分解性や生体適合性に優れるからである。ここで、疎水性アミノ酸残基には、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基を挙げることができる。より好ましくは、フェニルアラニン残基である。疎水性基は、カルボジイミド等の縮合剤を用いて、γ−ＰＧＡに導入することができる。エステル化疎水性アミノ酸残基のエステルには、炭素数１から６のアルキル基を含むエステルを用いることができるが、好ましくは、メチルエステル又はエチルエステルである。疎水性基の導入率は、全体の側鎖カルボキシル基に対する疎水性基が導入された側鎖カルボキシル基の比率（モル％）で定義され、ＮＭＲ測定に基づき算出することができる。本発明に用いる疎水化γ−ＰＧＡでは、原料のγ−ＰＧＡの分子量と導入する疎水性基の種類に応じて広い範囲で制御することが可能である。例えば、分子量３０万Ｋｄａのγ−ＰＧＡを用い、エステル化フェニルアラニン残基を導入した場合、１０〜８０モル％である。

疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を製造するには、一旦、疎水化γ−ＰＧＡを良溶媒に溶解させ、その溶液と貧溶媒とを混合することにより、疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を生成させる。本発明によれば、平均粒径１μｍ以下、より好ましくは０．５μｍ、さらに好ましくは０．３μｍ以下のナノ粒子を製造することができる。

本発明では、弱アルカリ性水溶液と炭素数１から３のアルコールとの混合溶媒を良溶媒に用いることができる。弱アルカリ性水溶液のみ、あるいは炭素数１から３のアルコールのみを用いても疎水化γ−ＰＧＡを溶解することはできないが、それらの混合溶媒を用いることにより、疎水化γ−ＰＧＡを溶解することができる。弱アルカリ性水溶液のｐＨは７．５〜１０、より好ましくは７．５〜９である。また、ｐＨ７．５〜１０が得られる溶質であれば特に限定されない。例えば、クエン酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１種を含むことができるが、医薬品添加物として認められているクエン酸ナトリウムが好ましい。また、炭素数１から３のアルコールには、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールからなる群から選択された少なくとも１種を用いることができるが、医薬品添加物としての使用が認められているエタノール又は２−プロパノールが好ましい。また、弱アルカリ性水溶液と炭素数１から３のアルコールとの混合比率は、アルコールの種類により異なるが、体積比率で、弱アルカリ性水溶液／メタノールでは、１／１〜１／５、弱アルカリ性水溶液／エタノールでは、１／１〜１／２、弱アルカリ性水溶液／２−プロパノールでは、２／１〜１／２、が好ましい。

なお、クエン酸ナトリウムと、炭素数１から３のアルコールが医薬品製造に使用可能な安全性を有することは、例えば、日本医薬品添加剤協会編，「医薬品添加物事典」，薬事日報社，２００５年や、厚生労働省発行通知文「医薬審第39号平成12年2月8日」に記載されている。

また、本発明に用いる貧溶媒は、疎水化γ−ＰＧＡを溶解させた良溶媒と混合することにより、疎水化γ−ＰＧＡの溶解性を低下させるものであれば特に限定されない。例えば、貧溶媒には、弱酸性水溶液やクエン酸緩衝液等を用いることができるが、弱酸性水溶液を用いることが好ましい。疎水化γ−ＰＧＡのカルボキシル基の解離を抑制して、疎水化γ−ＰＧＡの溶解性を低下させることができるからである。弱酸性水溶液のｐＨは３．０〜５．０、より好ましくは３．５〜４．０である。ｐＨ３．０より小さいと凝集が起こり易くなり、またｐＨ５．０より大きいと粒子が生成しにくくなるからである。この弱酸性水溶液は、さらに塩化物イオンを含む塩、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムを含むことが好ましい。疎水化γ−ＰＧＡのカルボキシル基の電荷反撥を抑制し、疎水性側鎖の核形成を促進できるからである。より好ましくは、塩化ナトリウムである。塩化ナトリウムの濃度は、５０〜２００ｍＭ、より好ましくは７５〜１００ｍＭである。塩濃度が５０ｍＭより小さいと粒子が生成せず、また塩濃度が２００ｍＭより大きいと粒子が凝集し易くなるからである。また、塩化カルシウムのように疎水化γ−ＰＧＡのカルボキシル基をキレートして沈殿を生成するような２価以上の金属イオンを含む塩化物は適さない。

本発明に用いる良溶媒と貧溶媒との好ましい組合せは、良溶媒にクエン酸ナトリウム水溶液とエタノール又は２−プロパノールとの混合溶媒を用い、貧溶媒に塩化ナトリウムの弱酸性水溶液を用いる組合せである。さらに好ましくは、貧溶媒にｐＨ３．７の１００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を用いる。

また、疎水化γ−ＰＧＡを溶解させた良溶媒と貧溶媒の混合方法は、良溶媒へ貧溶媒を滴下する方法、あるいは貧溶媒へ良溶媒を滴下する方法等、ナノ粒子が生成可能であれば特に限定されない。貧溶媒へ良溶媒を滴下する方法が好ましい。より短時間でナノ粒子を生成させることができるからである。また、良溶媒と貧溶媒の割合は、混合後の最終的な比率が３／１〜１／３となることが好ましい。

また、疎水化γ−ＰＧＡを溶解させた良溶媒と貧溶媒とを混合する際の温度は、２０〜３７℃が好ましい。２０℃より低いと凝集し易くなり、３７℃より高いと疎水性相互作用により疎水化γ−ＰＧＡが凝集し易くなるからである。

また、良溶媒に溶解させる疎水化γ−ＰＧＡの濃度は溶解する限り特に制限はない。ただ、凝集を抑制し単分散のナノ粒子を得るため、５〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、１５〜２５ｍｇ／ｍｌである。５ｍｇ／ｍｌより小さいと、ナノ粒子が生成するのに長時間を要し、５０ｍｇ／ｍｌより大きいと良溶媒に疎水化γ−ＰＧＡが溶けにくくなるからである。

また、疎水化γ−ＰＧＡを溶解させた良溶媒と貧溶媒とを混合することにより生成させたナノ粒子は乳白色の分散液の状態で存在する。この分散液を遠心分離により上澄みと沈殿とに分離し、上澄みを除去する。得られた沈殿を超純水中に再分散し、遠心分離を行い、沈殿を回収する洗浄操作を１回以上行う。回収した沈殿を凍結乾燥等の乾燥操作により乾燥してナノ粒子を得ることができる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
合成例１．
図１の反応式に示すように、γ−ＰＧＡにＬ−フェニルアラニンエチルエステル（ＰＡＥ）を縮合反応により導入した。すなわち、１．２１４ｍｇのγ−ＰＧＡ（分子量３８万）を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液２００ｍｌに溶解させ、１．８０２ｍｇのＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）を加え攪拌した。２．１６０ｍｇのＰＡＥを加え１時間氷冷下で攪拌した。その後室温で２４時間攪拌した。反応後、排除分子量（ＭＷＣＯ）５０，０００の透析膜を用い反応液を純水で３日間透析した。その後、反応液を凍結乾燥した。凍結乾燥した生成物にエタノール２００ｍｌを加え６時間攪拌した。その後、その溶液を遠心分離し、上澄みのエタノールを除去し、沈殿物を減圧乾燥して疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）を得た。ＮＭＲ測定に基づき算出したＰＡＥの導入率は５２％であった。

反応式中、ｎとｍとｌはそれぞれ１〜１００の整数を表し、ｍ＋ｌ＝ｎである。

実施例１．
疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）を０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８）１００μｌに分散させた。これにメタノール、エタノール、２−プロパノール、そして比較例として１−ブタノールを所定量添加して、疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）が溶解するかどうかを調べた。結果を表１に示す。ここで、溶解性の判定基準は、以下の通りである。
○：溶解する。△：若干不透明。×：溶解せず沈殿が生成。

クエン酸ナトリウム水溶液のみ、そしてアルコールのみでは溶解しなかった。しかし、クエン酸ナトリウム水溶液／メタノール比が１／１〜１／５、クエン酸ナトリウム水溶液／エタノール比が１／１〜１／２、クエン酸ナトリウム水溶液／２−プロパノール比が１／０．５〜１／２の範囲で疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）は溶解した。一方、１−ブタノールでは疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）を溶解させることはできなかった。

実施例２．
疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）を０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８）５０ｍｌに分散させた。これにエタノール５０ｍｌを加え溶解させた。最終濃度は、０．１Ｍクエン酸ナトリウム／エタノール＝１／１（体積比）の混合溶媒を用いて、１０ｍｇ／ｍｌである。

疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）溶液を、同体積の弱酸性塩溶液（ｐＨ３．７、ＮａＣｌ１００ｍＭ）に滴下し、乳白色の分散液を得た。

得られた分散液を遠沈管に移し遠心分離し（１５，０００ｒｐｍで１５分）、上澄みを捨て沈殿物を得た。得られた沈殿に超純水を加え、ピペッティング操作で再分散させた。この再分散液をさらに遠心分離し、上澄みを捨て沈殿物を得た（沈殿１）。得られた沈殿に超純水を加え、ピペッティング操作で再分散させた。この再分散液をさらに遠心分離し、上澄みを捨て沈殿物を得た（沈殿２）。沈殿２に超純水を加え十分に分散させた状態にし、これを凍結乾燥した。

ナノ粒子の平均粒径は動的光散乱装置を用いて測定した。また、凍結乾燥したナノ粒子の形態を走査型電子顕微鏡を用いて観察した。

比較例１．
疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）を１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解した。そのＤＭＳＯ溶液１００μｌを３００ｍＭ ＮａＣｌ溶液１００μｌに滴下し、白濁した分散液を得た。その分散液を遠心分離し（１４，５００ｒｐｍで５分）、上澄みを捨て、沈殿を２００μｌの超純水に再分散させた（洗浄１）。再度遠心分離を行った後、上澄みを捨て、沈殿を２００μｌのＮａＣｌ溶液に再分散させた（洗浄２）。再度遠心分離を行った後、沈殿を１００μｌのＰＢＳに再分散させた。

（結果）
得られた沈殿についてＮＭＲ測定を行い、疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）中の残存ＤＭＳＯ量を測定したところ、２４ｎｍｏｌ／ｍｇであった。

比較例２．
疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）を１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解した後、当量の水を添加した。その後、透析膜を用い精製した。この溶液にｐＨ４．７〜４．９の１０ｍＭのＮａＣｌ溶液を添加し、白濁させた。その分散液を遠心分離して沈殿を生成させ、その沈殿を乾燥した。

（結果）
得られた沈殿についてＮＭＲ測定を行い、疎水化γ−ＰＧＡ（Ｉ）中の残存ＤＭＳＯ量を測定したところ、６ｎｍｏｌ／ｍｇであった。

図１と図２は、それぞれ、実施例２と比較例１で回収したナノ粒子の粒径分布を示す図である。本発明の方法によっても、ＤＭＳＯを用いた場合と同様に、平均粒径が２００ｎｍ程度のナノ粒子を得ることができた。また、図３と図４は、それぞれ、実施例２と比較例１で回収したナノ粒子のＳＥＭ写真である。本発明の方法によっても、ＤＭＳＯを用いた場合と同様の粒径の揃ったナノ粒子が得られた。

以上説明したように、本発明によれば、良溶媒に弱アルカリ性水溶液と炭素数１から３のアルコールとの混合溶媒を用いることにより、ＤＭＳＯを用いることなくＤＭＳＯを用いた場合と同様の平均粒径と粒径分布を有する疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を製造することができる。本発明によれば、ＤＭＳＯを用いることなく、医薬品製造に使用可能な疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子を製造することができる。

本発明の実施例２で製造した疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子の粒径分布の一例を示す図である。 比較例１で製造した疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子の粒径分布の一例を示す図である。 本発明の実施例２で製造した疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子のＳＥＭ写真の一例である。 比較例１で製造した疎水化γ−ＰＧＡのナノ粒子のＳＥＭ写真の一例である。

Claims (4)

1. 疎水化ポリ（γ−グルタミン酸）からなるナノ粒子の製造方法であって、上記疎水化ポリ（γ−グルタミン酸）を弱アルカリ性水溶液と炭素数１から３のアルコールとの混合溶媒からなる良溶媒に溶解させた溶液と、貧溶媒とを混合して、ナノ粒子を生成させることを特徴とする修飾ポリ（γ−グルタミン酸）からなるナノ粒子の製造方法。
2. 上記弱アルカリ性水溶液が、溶質として、クエン酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
3. 上記アルコールが、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールからなる群から選択された少なくとも１種であることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 上記貧溶媒が、弱酸性水溶液であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の製造方法。