JP2000506125A - 免疫調節のための医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫調節活性を有する少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質（断片）をアジュバントと共に含む医薬組成物。前記ペプチドは病原体または腫瘍抗原から由来する。アジュバントは、治療される個体の細胞へのペプチドの結合を増加させることができるか、または、細胞内へのペプチドの移行を増加させることができ、ペプチドの免疫調節活性を増強する。好ましいアジュバントはポリアルギニンやポリリジンのような塩基性ポリアミノ酸であり、所望により炭水化物残基やトランスフェリンのような細胞リガンドと結合させてもよい。本組成物は特にワクチンとして、例えば腫瘍ワクチンとして使用することを意図している。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調節のための医薬組成物 本発明は免疫調節の分野に関する。 本発明は、以下の前提に本質的に依存する、腫瘍細胞を基礎とする治療ワクチ ンの開発である。すなわち、腫瘍細胞と正常細胞の間には質的または量的な違い があること、免疫系はその違いを根本的に認識でき、免疫系はワクチンによる能 動的、特異的な感作によって刺激され、腫瘍細胞をそれらの違いによって認識し 、腫瘍細胞を排除することができる、ということである。 抗腫瘍応答を起こすためには、少なくとも２つの条件が満足されなければなら ない。第１に、腫瘍細胞が正常細胞には出現しない抗原か、又は、正常細胞と腫 瘍細胞とをもっぱら質的に区別できる程度の抗原を発現していなければならない 。第２に、それらによって免疫系がそれらの抗原と反応すべく活性化されなけれ ばならない。腫瘍の免疫療法における重大な障害は、腫瘍の免疫原性が、特にヒ トでは弱いことである。 近年、このようなネオ・エピトープを構成し、従って当然に免疫系の攻撃目標 を構成し得る筈の腫瘍関連および腫瘍特異的抗原が発見されてきている。それに もかかわらず免疫系がこれらのネオ・エピトープを発現している腫瘍を排除する ことができないという事実は、明らかにネオ・エピトープが存在しないためでな く、これらのネオ・エピトープに対する免疫応答が不十分であるという事実によ るものである。 細胞を基礎とする癌の免疫療法のために、２つの一般的な戦略が開発されてき た。一方は、腫瘍反応性Ｔリンパ球をin vitroで拡大させ患者に再移入する養子 免疫療法であり、もう一方は、腫瘍抗原に対して新しい又はより強い免疫応答を 引き起こし、全身性の腫瘍応答を導くことを期待して腫瘍細胞を使用する能動免 疫療法である。 能動免疫療法を基礎とする腫瘍ワクチンは種々の方法により調製されてきた。 １例として、腫瘍抗原に対する免疫応答を呼び起こすためのコリネバクテリウ ム・パルバム（Corynebacterium parvum）やカルメット・ゲラン杆菌（Bacillus Calmette Guerin）(BCG)のような免疫刺激アジュバントと混合した放射線照射 腫瘍細胞が挙られる（Oettgen and Old,1991） 近年、特に遺伝的に改変された腫瘍細胞が癌に対する能動免疫療法に用いられ ている。種々の遺伝子を取り込ませることによってより強い免疫原性について腫 瘍細胞を異質化（alienise）するこれらの種々のアプローチの概説はZatloukal ら(1993)によって提供されている。これまで使われてきた戦略の一つでは、サイ トカインを産生するように遺伝的に改変された腫瘍細胞を用いる。 腫瘍抗原および腫瘍関連抗原（TAs）またはそれらに由来するペプチドを同定 Lehmannら(1989)、Tibbetsら(1993)、または公開国際出願WO 92/20356、WO 94/0 5304、WO 94/23031、WO 95/00159に記載されているように）タンパク質の形態お よびペプチドの形態のどちらの形態にしろ腫瘍ワクチンの免疫原として腫瘍抗原 を使用する他の戦略の必要条件である。Boonら(1992)、Boonら(1994)、Boonら(1 995)、van Peelら(1995)、van der Eynde(1995)の研究により悪性メラノーマがM HC-Iとの関係において腫瘍抗原由来ペプチドを提示していることが分かった。し かし、そのような腫瘍抗原の形態での腫瘍ワクチンは腫瘍抗原を保持する腫瘍細 胞を排除するに必要であろう細胞性免疫応答を誘発するために充分な免疫原性が ない(Marchandら、1995)。抗原提示細胞（APC）が特定のペプチド抗原をその表 面に提示することを保証するため、そのペプチドを「パルス」することが提案さ れたが、これは細胞にそのペプチドを負わせるのには不充分であった（Tykocins kiら、1996)。また、アジュバントを共投与しても免疫応答を増強するにはあま り成功しないことが示された（OettgenとOld、1991)。 腫瘍ワクチンの効力を高めるための能動免疫療法の３番目の戦略は、自家腫瘍 細胞の異種化(xenogenised)（異質化）に基づくものである。この考えは、免疫 系は外来性のタンパク質を発現している腫瘍細胞に反応し、この反応の過程で、 ワクチンの腫瘍細胞によって提示されている腫瘍抗原に対しての免疫応答も呼び 起こされるという仮定に基づいている。 特異的な免疫応答の制御における中心的役割は、Ｔ細胞抗原レセプター、MHC （主要組織適合複合体）分子およびタンパク質由来のペプチド断片であるそのリ ガンドを構成成分とする３分子複合体によって演じられる。 MHC分子（または対応するヒトの分子であるHLA）は多くの異なったリガンドを 結合しうるペプチドレセプターであり、厳密な特異性を有している。この必要条 件は以下の特異性基準を有するアレル特異的なペプチドモチーフによって与えら れる。すなわち、ペプチドがMHCハプロタイプに依存する特定の長さを有するこ とであり、この長さは通常MCH-Iハプロタイプ中の８から10のアミノ酸群である 。典型的にはアミノ酸位置のうちの２か所がいわゆる「アンカー」であり１つの アミノ酸または密接に関連する側鎖を持つアミノ酸群によってのみ占められる。 ペプチド中のアンカーアミノ酸の正確な位置およびその性質に要求されることは MHCハプロタイプによって変動する。このペプチドリガンドのＣ末はしばしば脂 肪族または電荷を持つ基である。このようなMCH-I−ペプチド−リガンドモチー フがこれまで知られており、特に、Ｈ−２Ｋ^d，Ｋ^b、Ｋ^k、Ｋ^km1、Ｄ^b、HLA-A^*0 201、A^*0205およびB^*2705ハプロタイプについて知られている。 細胞内のタンパク質変換の範囲内で、通常の、変性したおよび外来性の遺伝子 産物、例えばウイルスタンパク質または腫瘍抗原は小さなペプチドに壊され、そ れらのいくつかはMHC分子のリガンドとなりうるものを構成する。このことは、M HC分子によるそれらの提示、その結果として細胞性免疫応答を引き起こすための 必要条件を提供する。但し、細胞内でこのペプチドがMHCリガンドとしてどのよ うに作り出されるかは未だに明確には説明されていない。外来性の又は異質化さ れたタンパク質及びその断片は液性免疫応答を構成する免疫グロブリンにも認識 され、結合され、除去されるかもしれない。これは全ての腫瘍抗原についてあて はまる。腫瘍関連抗原MUC1、CEAおよびHER2/neuという例を用いて、これらのタ ンパク質に対して特異性を有する免疫グロブリンはこのタンパク質を保持する細 胞を認識し、殺すことができることが示されている。従って、腫瘍抗原特異的液 性免疫応答を引き起こすため、MUC1およびCEAの種々の形態のものが免疫原とし て（たとえば、組換えポックスベクター中で；Bronteら、J.lmmunol.154:5282、 1995）動物モデルおよび予備的な臨床試験において試されている。 本発明の範囲内で、細胞腫瘍ワクチン開発から生じたいくつかの着想を実行し た。非悪性の正常体細胞は免疫系により寛容化されているが、この細胞が身体に とって外来性のタンパク質、例えば、ウイルス感染の結果として外来性タンパク 質を合成していると身体は免疫応答によって正常細胞に反応する。この理由はMH C分子が外来性タンパク質に由来する外来性ペプチドを提示するからである。従 って、免疫系はこの細胞に望ましくない異質な何かが起こったことを記録する。 APC（これにはマクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞、が含 まれ、かつ、最近発見されたＢ細胞とマクロファージの両方の性質を有する複表 現形（biphenotypic）細胞（Tykocinskiら、1996）がおそらく含まれる）が活性 化され、新たな特異的免疫が生成されこの細胞は除去される。 腫瘍細胞は確かに問題の腫瘍特異的腫瘍抗原を含んでいるが、その免疫原性が 低い結果として免疫システムに無視されるためそれ自体は効果的なワクチンでな い。腫瘍細胞がもし外来性タンパク質でなく外来性ペプチドを装填(charge)させ られたならば、この外来ペプチドに加えてその細胞自身の腫瘍抗原がその細胞に よって外来性であると認識されるであろう。ペプチドによる異質化の意図は、外 来性ペプチドによって引き起こされる腫瘍抗原に対する細胞免疫応答を指令する ものである。 腫瘍細胞の免疫原性が低い原因は質的な問題ではなく、量的な問題であろう。 このことは、腫瘍抗原由来のペプチドについては、ペプチドは確かにMHC分子に よって提示されているが、細胞性腫瘍特異的免疫応答を引き起こすにはその濃度 が低すぎることを意味する。腫瘍細胞上の腫瘍特異的ペプチドの数が増加すると 、その腫瘍細胞の異質化も生じさせ、その結果細胞性免疫応答を引き起こすはず である。腫瘍抗原またはそれに由来するペプチドを、その問題としているタンパ ク質またはペプチドをコードするDNAをトランスフェクションすることにより細 胞表面上に提示させることが、国際出願WO 92/20356、WO 94/05304、WO 94/2303 1およびWO 95/00159に記載されているように、提案されてきた。 ドイツ国特許出願P 195 43 649.0は活性な構成成分として１以上のペプチドを 装填された腫瘍細胞を含み、その腫瘍細胞がペプチドとの関連において患者の免 疫系に外来性であると認識され、細胞性免疫応答を引き起こすような細胞性ワク チンを開示する。このペプチドの本質的特徴は、それらが患者のMHC-ハプロタ イプのリガンドであることである。従って、このペプチドは一方では「外来性ペ プチド」または「異種ペプチド」、すなわち患者の腫瘍細胞が発現しているタン パク質由来のペプチドとは異なるかもしれないので、患者の免疫系に外来性であ ると認識される。他のカテゴリーのペプチドは患者の細胞が発現している腫瘍細 胞に由来するものである。これらのペプチドは、患者の腫瘍細胞上の同じペプチ ドの濃度よりも大きな濃度でワクチンの腫瘍細胞上に存在するという事実により 免疫原性の増加をもたらす。 本発明の目的は免疫調節活性を有する新規な医薬組成物、特にワクチンを提供 することである。 ドイツ国特許出願P 195 43 649.0に開示された細胞性ワクチンの考え方を進め て、本発明の範囲内の医薬組成物が開発されている。それには、病原体に対する 細胞性及び／又は液性の、好ましくは全身性の免疫応答又は抗腫瘍応答を誘発し 又は増強し、または自己免疫活性のあるタンパク質に対するトレランスをもたら すために、細胞との関係においてだけではなく、アジュバントと合わせた関係に おいて免疫調節的効果を有するペプチドが含まれる。 驚くべきことに、ある種のアジュバント、例えばポリカチオンがタンパク質の 細胞内への移行を増加させ得ることは1965年に最初に示されたが（Ryserら、196 5;Ryserら、1978;Shenら、1981)、それらがペプチドの免疫原性を高めることが 分かってきた。 本発明は、アジュバントと共に、免疫調節効果を有する１以上のペプチド、タ ンパク質またはタンパク質断片を含む医薬組成物に関する。本組成物は、このア ジュバントが、治療される個体の細胞に対するペプチド又はタンパク質又はタン パク質断片の結合を増強することができ、または、このペプチドの細胞内への移 行を促進することができ、このペプチド又はタンパク質又はタンパク質断片の免 疫調節効果の増大をもたらすことを特徴とする。 簡略化のため、一般に上述した免疫調節効果のあるペプチド、タンパク質また はタンパク質断片の例を以後「ペプチド」と称することにする。「ペプチド」の 語は、特にリガンドを言うのでない場合は、そのペプチドが由来する、より大き なタンパク質断片またはタンパク質、または細胞の分解産物をもいうことがある 。 「免疫調節効果」の語は、一方では、細胞性及び／又は液性の、好ましくは全 身性の免疫反応の誘発又は増強を意味する。この実施態様では、本発明の医薬組 成物はワクチンとして機能する。 好ましい実施態様では、このペプチドは治療される個体が発現している少なく とも１つのMHC分子のリガンドである。 ヒトのMHC分子は、以後国際的慣習に従いHLA（ヒト白血球抗原(Human Leucocy te Antigen)ともいう。 「細胞性免疫応答」の語は、特に細胞障害性CD8陽性Ｔ細胞およびCD4陽性ヘル パーＴ細胞の生成の結果として腫瘍細胞の破壊または病原体に冒された細胞の破 壊をもたらす、細胞障害性Ｔ細胞免疫を言う。 「液性免疫応答」という表現は、腫瘍細胞または病原体に由来する構造を選択 的に認識し、続いて、他のシステム、例えば補体、ADCC（抗体依存性細胞障害） または食作用のようなシステムと一緒に、これらの腫瘍細胞または病原性媒介物 に冒された細胞の破壊をもたらす免疫グロブリンの産生を言う。 ワクチンに含まれるペプチドは抗原に由来し、またはタンパク質の場合はそれ に対して細胞性および／または液性免疫応答が誘発される抗原である。このこと は、この抗原および／または抗体を有する病原体または腫瘍細胞を認識するＴ細 胞または他の細胞障害性エフェクター細胞の生成を保証するものである。 バクテリア、ウイルスおよび寄生虫などの疾病の病原体に対する感作のために 、その問題の病原体タンパク質を構成する、またはそれらに由来するタンパク質 またはペプチドが用いられる。特に適切なものは、これらの病原体の、一般に高 い変異率に影響を受けないタンパク質である。公表されている例としては、HPV1 6/17（ヒト・パピローマウイルス；Feltkampら、1995)、Ｂ型肝炎ウイルスコア 抗原(Vitielloら、1995)、プラスモディウム・ベルゲイィ(Plasmodium bergheii )(Widmannら、1992)、インフルエンザウイルス核タンパク質およびＣ型肝炎ウイ ルスが挙られる。 本発明の一つの実施態様では、抗腫瘍応答を誘発することを意図して、このタ ンパク質は腫瘍抗原であり、またはペプチドは腫瘍抗原に由来し、医薬組成物は 腫瘍ワクチンとして用いられる。この場合、ワクチンが治療に用いられる際には 、 このペプチドは患者の腫瘍細胞が発現している腫瘍抗原に由来する。これらの腫 瘍抗原は、例えば、患者が発現している抗原の濃度が低すぎて、その腫瘍細胞が 外来性であると認識されないような抗原である。 患者の腫瘍抗原は、患者の診断と治療計画を立てる過程で通常の方法に従って 決定することができる：腫瘍抗原は抗体を用いた免疫組織化学によって容易に検 出できる。腫瘍抗原が酵素、例えばチロシナーゼ、である場合は酵素アッセイに よって検出できる。既知の配列の腫瘍抗原の場合は、RT-PCR法を用いることがで きる(Boonら、1994；Coulie,RG.ら、1994、Weynants.P.ら、1994)。検出の他の 方法は、検出すべき腫瘍抗原に対して特異性のあるCTLに基づくアッセイであ 4)、Rivoltiniら(1995)、Kawakamiら(1995)に記載されており、WO 94/14459に記 載されている。これらの文献は本発明の範囲内の、適切な種々の腫瘍抗原および それに由来するペプチドエピトープも開示している。適切な腫瘍抗原の例は最近 発刊されたRosenberg（1996）およびHendersonとFinn（1996）の総説記事中でも 与えられている。利用可能な腫瘍抗原に関しては、本発明はいかなる制限も受け ない。 腫瘍抗原または腫瘍抗原に由来するペプチドを含む腫瘍ワクチンは治療的にだ けでなく予防的に用いてもよい。予防的使用の場合は、通常生じる腫瘍抗原の代 表的なものに由来するペプチドの混合物を使用するのが好ましい。本発明による 腫瘍ワクチンが治療的に用いられる場合は、患者の腫瘍抗原に含まれていると期 待される１以上のペプチドが用いられる。 本発明による腫瘍ワクチンは、疾病のかなり初期の段階（ステージＩおよびII ）にあって細胞ワクチンを作るに充分な腫瘍細胞を持たない患者に対してさえ治 療的に有用であるという点で、自家腫瘍細胞に基づく細胞ワクチンに対して有利 である。 本発明の好ましい実施態様において、ペプチドは、細胞性免疫応答を誘発する ために、ワクチン接種される患者のMCH-IまたはMHC-IIサブタイプと一致する。 従って、このペプチドはMHC分子に結合することが保証される配列であるかまた はその配列を含む。 他の実施態様では、腫瘍ワクチンの形での医薬組成物はまた免疫刺激効果のあ るポリペプチド、特にサイトカインをも含む。本発明の好ましい実施態様におい て使用されるサイトカインは、インターロイキン２（IL-2）またはGM-CSFであり 、例えば約1000ユニットの投与量で用いる。他のサイトカインの例としては、IL -4、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、TNF-αおよびそれらの組み合わ せ、例えばIL-2＋IFN-γ、IL-2＋IL-4、IL-2＋TNF-αまたはTNF-α＋IFN-γが挙 られる。 本発明の一つの実施態様では、本医薬組成物は自己免疫性疾患を誘発するタン パク質またはその断片に対するトレランスを与えるのに役立ち、すなわち自己免 疫疾患の治療に役立つ。この実施態様で用いられるペプチドは自己免疫疾患の原 因となるタンパク質に由来するものである。 腫瘍ワクチンまたは病原体に対するワクチンとして本発明が適用される場合に は、本ペプチドが「原抗原」として認識される程度に元のタンパク質（腫瘍抗原 または病原体のタンパク質）の一部と本質的に一致しているのに対して、本発明 が自己免疫疾患の治療に応用されるときには、いくつかの重要な点で特に元のタ ンパク質のアミノ酸配列と異なるペプチドが用いられる。これらのペプチドは、 アンカー位置がある結果としてMHC分子に確かに結合するが、その配列中に活性 化された特異的Ｔ細胞を再びスイッチ・オフするアンタゴニストとして働かせる 変異を持つ(KershとAllen,1996)。 ウイルスで発見された「天然」アンタゴニスト（Bertolettiら、1994）も系統 的な探索、例えばペプチドライブラリーのスクリーニングなどによって発見され るアンタゴニストも共に適切なペプチドアンタゴニストである。ペプチドアンタ ゴニストの例としては、ミエリン塩基性タンパク質に特異的なＴ細胞をスイッチ ・オフすることのできるペプチドが挙られる。これらは動物実験でその有効性を テストされた(Brockeら、1996)。 細胞性免疫応答を誘発すると考えられているペプチドはMHC分子に結合できな くてはならない。患者の中で免疫応答が誘発されるために、治療される個体はそ のレパートリーの中に対応するHLA分子を有していなければならない。従って患 者のHLAサブタイプの決定は、細胞性免疫応答を得るという点に関して、患者に このペプチドを効果的に投与するための最も重要な前提条件のひとつを構 成する。 患者のHLAサブタイプはマイクロ細胞障害性試験（micro lymphotoxicity test ）などの標準的な方法を用いて検出できる(Practical Immunol.,1989)。この試 験は、まず患者の血液から単離したリンパ球をウサギ補体（Ｃ）の存在下で特定 のHLA分子に対する抗血清またはモノクローナル抗体と混合するという原理に基 づいている。陽性の細胞は溶解し指示染色剤を吸収するが、損傷を受けない細胞 は未染色のままである。 RT-PCRも患者のHLA-IまたはHLA-IIハプロタイプ決定に用いることができる(Cu rr．Prot.Mol.Biol.第２および第15章)。このために患者から血液を採取し、そ れからRNAを単離する。このRNAをまず逆転写にかけ、患者からのcDNAを形成させ る。このcDNAは、一定のHLAハプロタイプを示すDNA断片の特異的な増幅をもたら すプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応のための基質として利用される。 アガロースゲル電気泳動の後、DNAバンドが現れれば、その患者は対応するHLA分 子を発現している。バンドが現れなければ、それに対してその患者は陰性である 。 HLA分子を使って本発明によって使用されるペプチドを同定すると、そのアン カーアミノ酸および長さに関する特徴が明らかにされる。明らかにされたアンカ ー位置と長さはこのペプチドが問題にしているHLA分子のペプチド結合フォーク に適合することを保証する。このことは、もし腫瘍抗原に由来するペプチドが使 用されると、免疫系が刺激され患者の腫瘍細胞に対する細胞性免疫反応が呼び起 こされるであろうことを意味する。 本発明の目的に適したペプチドは広く入手可能である。それらの配列は天然に 存在する免疫原タンパク質またはその細胞分解産物、例えばウイルス又はバクテ リアのペプチドに由来してもよく、または、腫瘍抗原に由来してもよく、または 自己免疫疾患を引き起こすタンパク質に由来するペプチドのアンタゴニストであ ってもよい。 適切なペプチドは、例えば文献により知られているペプチド配列に基づいて選 んでもよい。 細胞性免疫応答を誘発するために、例えば種々のHLAモチーフに対する、Ram menseeら(1993)、Rammenseeら(1995)、Falkら(1991)6によって記載されたペプチ ド、種々の起源の免疫原性タンパク質に由来するペプチドによって、種々のHLA サブタイプ分子の結合フォークに適合するペプチドが同定されるかもしれない。 免疫原性作用のあるタンパク質の部分配列を有するペプチドについては、すでに 知られた、または確定されるはずのポリペプチドを用いてHLA特異的要求性を考 慮しつつ配列を比較することによって、どのペプチドが適切な候補であるかを確 証することができる。適切なペプチドは、例えばRammenseeら(1993)、Falkら（1 991）およびRammenseeら（1995）およびWO 91/09869（HIVペプチド）に見ること ができ、特に、腫瘍抗原に由来するペプチドは公開国際特許出願WO 95/00159お よびWO 94/05304に見られる。ペプチドについて、これらの文献および引用した 論文の開示は本明細書で参照するものとする。好ましい候補は、その免疫原性が 既に証明されているペプチド、すなわち、ウイルスまたはバクテリアのタンパク 質のような既知の免疫原に由来するペプチドである。 MHC-IまたはMHC-II分子の結合フォークに適合する元のペプチド、すなわち、 天然のタンパク質に由来する未改変のペプチドを用いる代わりに、もとのペプチ ド配列に基づいて特定されるアンカー位置と長さに関する最小限の必要条件を用 い、望みの変異をいれることが可能である。ただし、これらの変異が、MHC分子 への結合アフィニティーとＴ細胞レセプターを刺激する能力によるこのペプチド の効果的な免疫原性を損なわないだけでなく、好ましくは増強する限りにおいて である。従って、この場合、MHC-I分子への結合に関する必要条件に従って設計 される合成ペプチドが本発明によって使用される。従って、例えばH2-K^dリガン ドLeu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe lle(LFEAIEGFI)から始めて、Phe Phe lle Gly Ala Leu Glu Glu lle(FFIGALEEI)というペプチド配列を得るようなやり方で 、アンカーアミノ酸でないアミノ酸を変化させることができる。さらにアンカー アミノ酸である位置９のアミノ酸lleはLeuに置換することができる。MHC-Iまた はMHC-IIリガンドまたはその変異体のエピトープの決定は、例えばRammenseeら （1995）によって記載された原理を用いて行なわれるだろう。そのペプチドの長 さは好ましくは、必要なアンカーアミノ酸を一緒に含む、MHC-I分子に結合する ために必要な８から10アミノ酸という最少配列に一致する。９アミノ酸以上にわ たるMH C-II結合モチーフはアンカー位置についてより高度な縮退を有している。MHC-II 分子のＸ線構造解析を初めとして、MHC-II結合モチーフおよび、それらを基礎と して、ペプチド配列における変異の正確な解析を可能とする方法が近年開発され ている(Rammenseeら、1995、およびその中で引用されている原文献)。 所望であれば、ペプチドはＣ末及び／またはＮ末を長くしてもよいが、長くす ることがMHC分子への結合能に干渉しない、すなわち、伸びたペプチドが細胞レ ベルで最少配列にプロセッシングされ得ることが条件である。 本発明のひとつの実施態様では、ペプチドは負に帯電している。この実施態様 では、ポリリジンのようなポリカチオン性アジュバントに対するペプチドの静電 的結合を達成するために、ペプチドは負に帯電したアミノ酸によって延長されて もよく、または、負に帯電したアミノ酸がペプチド中に取り込まれてもよく、そ の位置は特異的CTLによる認識またはアンカーアミノ酸として必須でないことが 好ましい。 本発明のひとつの実施態様では、抗原はペプチドの形ではなく、タンパク質ま たはタンパク質断片またはタンパク質もしくはタンパク質断片の混合物として用 いられる。 本発明の範囲で、患者のAPCが作用してMHC分子に適合するペプチドヘプロセッ シングされることが保証されている、より大きなタンパク質断片またはタンパク 質全体は適切である。 このタンパク質は、プロセッシング後に得られる断片が由来する抗原または腫 瘍抗原である。この実施態様では、細胞、特に樹状細胞やマクロファージのよう なAPCに腫瘍抗原または断片を装填（「移行装填(transloading)」）することがで きる、または増強するようにアジュバントは働く。このように吸収されたタンパ ク質またはタンパク質断片は細胞によってプロセッシングされMHCとの関連にお いて免疫エフェクター細胞に対して提示され得るものであり、免疫応答を誘発ま たは増強する(BracialeとBraciale,1991;Kovacsovics BankowskiとRock,1995;Yo rkとRock,1996)。 タンパク質またはより大きなタンパク質断片が抗原として用いられる本発明の 実施態様では、そのタンパク質は複数の断片にプロセッシングされ、その結果ペ プチドの「適合形態」に関してより大きな変異性があるため、患者のHLAタイプ への依存性が少ないという点で有利である。 タンパク質またはタンパク質断片が投与されると、プロセッシングされた最終 産物の特徴（identity）は化学的分析（プロセッシングされた断片のエドマン分 解またはマススペクトロメトリー；Rammenseeら、１９９５年の総説およびそこ で引用されている原論文を参照せよ）または生物学的分析（プロセッシングされ た断片に特異的なＴ細胞を刺激するAPCの能力）によって示すことができる。 原則として細胞性免疫応答を生み出すために適切なペプチド候補はいくつかの 段階で選択される。通常、これらの候補は先ず、MHC分子への結合能についての ペプチド結合テストでテストされ、複数のテストによるのが好ましい。 研究のための適切な方法の一つは、例えばStuberら(1994)およびMclntyreら(1 996)に記載されているように、ペプチドが空のMHC分子を安定化できることに基 づいている。ペプチドを、問題としているMHC分子を発現できるが遺伝的欠損の ためにMHCとの関連においていかなる内在性ペプチドも結合しない細胞に加える 。このタイプの適切な細胞株はRMA-S（マウス）およびＴ２（ヒト）およびその トランスフェクションされた変異体である。従って、問題としているペプチドに よって安定化されたMHC分子のみが検出可能であり、これはフローサイトメトリ ーに基づくFACS解析によるのが好ましい(Flow Cytometry,1989;FACS Vantage TM User's Guide,1994;CELL Quest^TM User's Guide,1994)。安定なMHC分子は適切 な抗MHC抗体および、例えばFITC（フルオレセインイソチオシアネート）のよう な蛍光色素で印をつけた２次（例えば、ポリクローナル）抗体によって検出され る。フロー中、個々の細胞は特定の波長のレーザーで励起される。放射される蛍 光が測定され、蛍光はその細胞に結合したペプチドの量に依存する。 結合したペプチドの量を測定する他の方法は、Setteら(1994)に記載されてい るようにスキャッチャードブロットである。例えば、Ｉ¹²⁵でラベルしたペプチ ドがこのために用いられ、そのペプチドの種々の一定濃度のものが、単離したま たは組換えで作られたMHC分子と４℃で一晩インキュベーションされる。ペプチ ドの非特異的な相互作用を測定するために、サンプルのいくつかには過剰の未ラ ベルペプチドを加え、ラベルしたペプチドの非特異的な相互作用を阻止する。次 に、 非特異的に結合したペプチドは、例えばゲルクロマトグラフィーによって除去さ れる。次に、結合したペプチドの量は放出される放射能を利用してシンチレーシ ョンカウンターで測定される。このようにして得られたデータは標準的な方法で 評価される。 MHC／ペプチド相互作用の特徴を明らかにする方法の概略、すなわち本発明の 範囲内で用いてもよいMHCリガンドの解析およびペプチド結合アッセイはRammens eeら(1995)によって提供されている。 第２段階では、優れた結合特性を有するペプチド候補がその免疫原性について テストされる。 細胞性免疫応答の誘発は、例えばCurrent Protocols in lmmunology第３章ま たはBlombergら(1993)にあるように、ペプチド特異的CTLを検出することによっ て確かめられる。細胞性免疫応答が存在することのもう一つの指標が、Ｔ細胞の 非存在下、実験動物において免疫応答がない場合に提供される（これはその動物 をCD4細胞またはCD8細胞を消滅させる抗体で処理することにより達成される）(C urrent Protocols in Immunology第３章)。 細胞性免疫応答はまた感作された動物における「遅延型過敏」(DTH)反応を検 出することによっても証明される。この目的のためには、ペプチドはマウスの足 の裏に注射され注射部位の腫れが測定される(Grohmanら1995;Puccettiら,1994) 。 治療される生体に対して外来性の抗原または生体によって低濃度で発現されて いる抗原であるペプチドによる液性免疫応答の誘導は、血清中の特異的な抗体の 検出によって測定できる。血清中の抗体レベルを検出する適切な方法は酵素結合 免疫測定法（ELISA）である。特異的な抗体は、感作に用いたペプチドに結合後 、染色反応によって検出される。もう一つの方法はウエスタンブロットである。 これによれば、特異的な血清抗体は膜上に固定化されたペプチドに結合する。結 合した抗体はここでも最終的には染色反応で検出される（両方法に関する参照文 献：Current Protocols in Immunology.編集者：Coliganら、1991) 特に、外来性抗原、例えばウイルス起源の外来抗原でワクチン接種すると、抗 体の形成が期待される。しかしながら、特異的抗体が細胞性の腫瘍抗原に由来す る変異した又は過剰に発現したペプチドに対して形成されるかもしれないことを 排除することができない。そのような抗体による腫瘍の破壊は抗体が腫瘍細胞に 結合した後、例えば、補体、抗体依存性細胞障害（ADCC）またはマクロファージ による食作用のような、免疫系の他の構成要素によって引き起こされるだろう(R oitt I.M.,Brostoff J.,Male D.K.lmmunology,Churchill Livingstone)。 例えばRvoltiniら（1995）またはKawakamiら（1994a）に記載されたように、 免疫原性が不明のタンパク質に由来するペプチドによる細胞性免疫応答をテスト してもよい。このためには、求めるペプチドがMHC分子によって提示されたとき にこれを認識できるＴ細胞が必要である。腫瘍細胞に由来するペプチドの場合は 、Kawakamiら（1994b）に記載されているように、対応するＴ細胞は腫瘍浸潤性 リンパ球(TIL)から得られる。外来性ペプチドの場合は、この種のＴ細胞は末梢 血から同様にして得られる。Ｔ細胞は問題としているペプチドと混合されていた Ｔ２ ンキュベーションされ、もしそれが免疫原性ペプチドであればＴ細胞はそれらを 破壊する。 MHC結合ペプチド候補をその免疫原性についてテストする他の可能な方法は、 そのペプチドのＴ２細胞への結合を調べることにある。こうしたテストの一つは 、TAPペプチド輸送機構を欠損しておりMHCとの関係において提示されるペプチド が与えられたときにのみ安定なMHC分子を提示するというT2細胞（Alexander 細胞またはRMA-S細胞はHLA遺伝子、例えば、HLA-A1および／またはHLA-A2遺伝子 で安定にトランスフェクションされ、このテストに用いられる。この細胞がHLA の良いリガンドであるペプチドと混合されると、免疫系に外来性であると認識さ れるような形でHLAとの関係において提示される事により、これらのペプチドはH LA分子を細胞表面にかなりの量で出現させる。例えばモノクローナル抗体により 細胞表面上のHLAを検出することにより適切なペプチドを同定することが可能と なる(Malnatiら、1995；Sykulevら、1994)。ここでもまた、よいHLA結合能を有 することが知られている標準的なペプチドは使用に適当である。 本発明による医薬組成物の可能な最も広範囲な応用のためには、いくつかのペ プチドの混合物を用いるのが好ましく、その各々は別のMHC分子、好ましくは 最も一般的に生じるMHCサブタイプの２，３の一つに結合するのが好ましい。そ れらのハプロタイプに結合できるペプチド混合物に基づくワクチンは広範囲の患 者をカバーするのに用いることができる。 本発明の一つの実施態様では、ワクチンは異なる配列の多数のペプチドを含ん でいてもよい。この場合、使用されるペプチドは一方では異なるHLAサブタイプ に結合するという点で互いに異なっていてもよい。この方法で、一人の患者の、 または患者のより大きな集団のいくつかの、又は全てのHLAサブタイプを検出す ることが可能である。 使用されるペプチドに関する可能な付加的な他の可変性は、特定のHLAサブタ イプに結合するペプチドはHLA結合に重要でない配列に相違があり、例えば同じ 病原体又は異なる病原体に由来する異なるタンパク質に由来するという事実にあ るかもしれない。この種の可変性は免疫応答に対する刺激を増強するかまたは種 々の病原体に対する免疫を与えることが期待され得る。 本発明による組成物中の効果的なペプチドの量は広い範囲で変り得る。ペプチ ドの量は、とりわけ、投与方法と使用する特定の製剤形に依存する。投与するペ プチドの量は１回の投与量あたり約1.0μgから約5000μgであってよく、通常1.0 μgから約1000μgであり、特に約10μgから約500μgである。１回または数回投 与されてもよく、数回投与される場合は、少なくとも３回が好ましい。特に治療 用途には、このペプチドは患者の特定の免疫状態や病気の進行によって定める必 要な期間にわたって、間隔をおいて（例えば、週に１回から月に１回）投与して もよい。 本発明による医薬組成物はex vivoで用いてもよい。可能なex vivo投与の原理 はAPC、例えば樹状細胞をex vivoで培養し、その培養細胞を本発明による組成物 と共にインキュベーションし、ペプチドをMHCとの関連で提示するようになったA PCを治療される個体に投与することにある。文献的に知られた方法を、例えば、 Porgador とGilboa(1995);Youngとlnabe(1996)に記載されているように、このタ イプの応用例に用いてもよい。 本発明による組成物に含まれるアジュバントは、細胞内へのペプチドの移入を 助け、または患者の細胞へペプチドを結合させ、かつそのペプチドの免疫原性を 高めるという性質を有する。このアジュバントは、例えば、ペプチドが貫通する はずの標的細胞の膜を、ペプチドがそこを通って細胞内に移送されるように少な くとも短期間の間、透過性にするかもしれない。ペプチドがアジュバントに結合 すること、例えば負に帯電したペプチドとポリカチオン性アジュバントの間の静 電的相互作用により結合することは有利であろうが、絶対に必要なわけではない 。ペプチドの細胞内への移行はまた、ペプチドが、空間的に細胞膜に接近してい るために、アジュバントが細胞膜を透過性にすると直に細胞膜を通過することが できるという事実により達成されうる。アジュバントの効果は、細胞内への吸収 に重要な、細胞表面におけるペプチドの濃度を増加させるという事実、またはア ジュバントが食作用または細胞内へのペプチドの液体移送（飲作用）を引き起こ すという事実によるものかもしれない。 驚いたことに、アジュバントの存在は細胞内へのペプチドの取り込みを増加さ せるだけでなく、ペプチドの免疫調節効果の賦活化も生じさせる。これはペプチ ドのMHC分子による正確な提示によるものであろう。 一つの実施態様では、アジュバントは、とりわけ理論的には全て核酸を細胞内 に輸送するために用いられる膜透過性化（membrane-permeabilising）物質であ る。これについては、そのような物質について述べているWO 93/19768を参照の こと。 本発明の好ましい実施態様では、アジュバントは塩基性ポリアミノ酸または塩 基性ポリアミノ酸の混合物である。 ポリアミノ酸の重合度は広い範囲にわたってよい。その範囲は約５から約1000 、より具体的には約15から500であろう。 好ましくは、本発明の範囲内でアジュバントとしてポリアルギニンが用いられ る。 本発明の目的のための他の好ましいアジュバントはポリリジンである。 他の適切な、特にポリカチオン性の有機化合物（塩基性アミノ酸）の例として 、ポリオルニチン、ヒストン、プロタミン、ポリエチレンイミンまたはそれらの 混合物が挙られる。 アジュバントは任意的に細胞リガンドと結合されてもよい。例えば、トランス フェリン、gp120、LDL(低密度リポタンパク質)、α-フェチュイン、EGF（上皮成 長因子）ペプチドと結合されてもよく、または、レセプター介在エンドサイトー シスによるDNAの輸送に関するとしてWO 93/07283に記載されている他の細胞リガ ンドの代表的なもの、マンノースまたはフコース（マクロファージのリガンド） のような炭水化物残基または細胞表面タンパク質に対する抗体若しくは抗体断片 と結合されてもよい。 ポリアルギニンまたはポリリジンのようなポリカチオン性アジュバントは、細 胞リガンドと結合していてもよいが、DNAとの複合体要素、例えばプラスミドDNA の形で存在してもよい。このDNAは機能のあるペプチドをコードする配列を含ま なくてよく、この場合DNAは空のプラスミドである。 本発明の一つの実施態様では、このDNAは免疫調節タンパク質、特にIL-2、イ ンターフェロンおよびGM-CSFのようなサイトカインをコードしている。 塩基性ポリアミノ酸によって媒介されるペプチド輸送の機構を調べるために、 本発明の範囲において乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を測定した。ポリア ルギニン処理したサンプルでは放出されるLDHの量はほとんど検出できないが、 ポリリジンとインキュベーションの後に高いLDH濃度が細胞上清に検出された。 これらの結果により、ポリリジンの効果は細胞膜の透過性化によるものであると 結論することができる。 理論に拘束されるつもりはないが、本発明による医薬組成物の効果は、ペプチ ドがアジュバントの助けを借りて標的細胞中に浸透するか、または細胞に結合す ること、これは皮膚の内皮領域で生じるが、この事実によるものであるように考 えられる。標的細胞には、例えば、ペプチドを、場合によってはプロセッシング 後、Ｂ細胞および／またはＴ細胞に提示する抗原提示細胞が含まれる。標的細胞 の例としては、マクロファージ、繊維芽細胞、ケラチン細胞、ランゲルハンス細 胞、樹状細胞またはＢ細胞が挙られる。 本発明の範囲内であるが、小さなペプチドが、塩基性ポリアミノ酸またはポリ カチオンのグリコシル化型の存在下でマクロファージ様抗原提示細胞（APC）に 強く吸収されるかどうか明らかにするための研究を行った。使用する糖残基につ いては、レセプター媒介エンドサイトーシスを利用してマクロファージに吸収さ れることが知られている。（APCについては、in vivoではそれらはペプチドを吸 収して他の免疫細胞に提示するタイプの細胞を構成すると考えられている。テス トしたアジュバントの存在下でAPCエンドサイトーシスがペプチド抗原の量を増 加させることを示すin vitroテストの結果は、これらのアジュバントがin vivo で細胞障害性エフェクター細胞に対するペプチドの提示を増強し、エフェクター 細胞を活性化するのにも適切であり、ワクチンに含まれる標的に対して全体とし て、より強い免疫応答を起こすことを示すものである。 上述したアジュバントに加えて、任意であるが、使用するアジュバントは粒子 形成分であってもよい。この粒子は理論的にはペプチド合成用のカラム材料を作 るためにも用いられるどんな物質であってもよく、例えばシリカゲル又は合成樹 脂であってよいが、但し、生理学的に許容できるものであり、それから作られる 粒子が細胞内に入るほど充分に小さいことが条件である。粒子形態のアジュバン トを用いると、局所的にペプチド濃度を高くすることができ、細胞内に吸収し易 くすることができる。 使用するアジュバントのタイプ、細胞リガンドまたはDNAの添加による改変の 適切性およびペプチドに対するアジュバントの必要量は経験的に決定されるであ ろう。例えば、選択したアジュバントに対する具体的なペプチドの比は、理論的 には広範囲に変動しうるが、タイトレーションによって決定し得る。 アジュバントは理論上はペプチドと同じ方法で、任意的な多数のステップでテ ストできるであろう。 APCへのペプチドの結合及び／または内部移行を増強させるアジュバントの能 力を測定してもよく、例えば、最初の段階としてAPCを蛍光ラベルペプチドとア ジュバントと共にインキュベーションしてもよい。アジュバントによってもたら される取込み又は結合の増加はスルーフローサイトメトリーによってペプチド単 独と混合した細胞と比較することによって測定できる。 第２段階で、テストすべきアジュバントは、その存在によってペプチドがAPC に提示されるかどうか、かつどの程度提示されるかをin vitroで調べることがで き、上述のペプチドをテストするために用いた方法を細胞上のMHC濃度を測定す るために用いてもよい。 アジュバントの有効性をテストするための他の可能な方法はin vitroモデル系 を使用することである。ここでは、APCはアジュバント及びペプチドと一緒にイ ンキュベーションされ、使用したペプチドを特異的に認識するＴ細胞クローンの 相対的活性化が測定される(Coliganら,1991；Lopezら、1993)。 この配合物の有効性は、感作された動物において遅延型過敏(DTH)反応が示さ れることによる、細胞性免疫応答によって明らかにすることもできるかもしれな い。 最後に、この配合物の免疫調節効果は動物実験で測定される。確立された腫瘍 モデルが、免疫細胞に認識されるペプチド配列と共に用いられてもよい。アジュ バントおよび全体量に対するペプチドの量について種々の割合のペプチドとアジ ュバントを含むワクチンが投与される。腫瘍増殖からの保護は腫瘍ワクチンの有 効性の測定値となる。 本医薬組成物は、非経口的に、局所的に、経口的にまたは部分的に投与されて よい。好ましくは非経口的に、例えば皮下、皮内または筋肉内経路で与えられ、 標的細胞として、皮膚細胞(ケラチン細胞、繊維芽細胞)、特に樹状細胞、ランゲ ルハンス細胞またはマクロファージに達するように、皮下又は皮内経路によるの が好ましい。腫瘍治療の範囲として腫瘍ワクチンは腫瘍内経路によって投与され てもよい。 非経口的投与のための本発明による組成物は通常はペプチドとアジュバントの 、製薬的に許容できる担体、好ましくは水性担体中の溶液又は懸濁液の形態であ る。使用してもよい水性担体の例には、水、緩衝化された水、生理食塩水(0.4％ )、グリシン溶液(0.3％)、ヒアルロン酸および類似の既知の担体が含まれる。水 性担体とは別に、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、ジメチルホル ムアミドおよびそれらの混合物のような溶媒も使用することができる。本組成物 は、正常な浸透圧及び／又は効率的な凍結乾燥化のために、緩衝剤および無機塩 類のような製薬上許容できる賦形剤を含んでもよい。そのような添加剤の例とし ては、ナトリウム塩およびカリウム塩、例えば塩化物およびリン酸塩、スクロー ス、グルコース、タンパク質加水分解物、デキストラン、ポリビニルピロリドン またはポリエチレングリコールが挙られる。本組成物は通常の方法、例えば濾過 滅菌に よって滅菌されてよい。本組成物はこの形態で直接移されてもよく、凍結乾燥さ れて使用前に滅菌溶液と混合されてもよい。 一つの実施態様では、本発明による医薬組成物は局所製剤の形、例えば、皮膚 または経皮的適用のための形態である。本医薬組成物は、例えば、ポリアクリル ように）をとってもよく、その形態は例えば、標準的な軟膏DAB 8(50％PEG 300 、50％PEG 1500)のようにポリエチレングリコール(PEG)を担体とする軟膏として 、又は、乳剤、特に油中水滴または水中油滴に基づく、リポソームが添加されて いてもよいマイクロ乳剤でよい。適切な透過促進剤（同調剤）には、ジメチルス ルホキシド（DMSO）やデシルメチルスルホキシド（デシル-DMSO）のようなスル ホキシド誘導体およびトランスクトール(transcutol)（ジエチレングリコールモ ノエチルエーテル）またはシクロデキストリン、およびピロリドン類、例えば2- ピロリドン、N-メチル-2-ピロリドン、2-ピロリドン-5-カルボン酸または生分解 性のN-(2-ヒドロキシエチル)-2-ピロリドンおよびその脂肪酸エステル、ドデシ ル尿素、1,3-ジドデシル尿素および1,3-ジフェニル尿素のような尿素誘導体、テ ルペン類、例えばD-リモネン、メントン、a-テルピノール、カルボール、リモネ ンオキシドまたは1,8-シネオールが含まれる。 他の製剤形は、例えば鼻内噴霧または吸入剤として投与するためのエーロゾル である。 本発明による組成物は、乳剤、フォーム、ミセル、不溶性単分子層、リン脂質 分散体、ラメラ層その他の形をとってもよいリポソームによって投与されるかも しれない。これらはペプチドを特定の組織の標的、例えばリンパ組織または腫瘍 組織へ移送するため、又はペプチドの半減期を伸ばすための担体として働く。 本発明による組成物が局所性剤の形態であるときには、例えばその製剤がメラ ノーマに対して予防的に用いられるならば、例えば日焼け止めクリームとして作 用させるためにＵＶ吸収剤を含んでもよい。 当業者はRemington's Pharmaceutical Sciences(1990)のような通常水準の研 究の中に適切な製剤形及びアジュバントを見いだすであろう。 図面の概要 図１：DBA/2マウスへの、肥満細胞腫P815に対するペプチドKYQAVTTTLによるワク チン接種。 図２：DBA/2マウスへの、肥満細胞腫P815に対するペプチドSYFPEITHIによるワク チン接種。 図３：DBA/2マウスへの、肥満細胞腫P815に対するペプチドSYFPEITHIによるワク チン接種。 図４：DBA/2マウスへの、メラノーマM-3に対するペプチド混合物によるワクチン 接種。 図５：DBA/2マウスへの、メラノーマM-3に対する局所的塗布によるワクチン接種 。 図６：DBA/2マウスへの、メラノーマM-3転移に対するワクチン接種。 図７：ペプチド混合物によるワクチン接種後のマウスにおけるM-3微小転移の治 癒。 図８：細胞のポリリジン媒介チロシナーゼ装填。 図９：治療モデルにおける、ワクチン接種後のＴ細胞活性化(ワクチン接種動物 の、M-3細胞に対する反応としての脾臓細胞からのIFN-γ放出)。 図１０：インフルエンザヌクレオキャプシドペプチドASNENMETMおよびアジュバ ントとしてフコシル化ポリリジンによる抗ウイルス免疫の誘導(CTL活性化)。 図１１：塩基性ポリアミノ酸による、APCへのペプチドの結合促進。 図１２：塩基性ポリアミノ酸による、細胞膜の透過性化(細胞のポリリジン又は ポリアルギニン処理後のLDH放出)。 図１３：ポリアルギニンによるペプチドの内部移行。 図１４：抗原提示骨髄細胞へのペプチドの輸送。 図１５：ポリカチオン性のポリアミノ酸及びヒストンによる、抗原提示細胞内へ のペプチド輸送の増加。 図１６：塩基性アミノ酸の重合度の関数としての輸送効率。 図１７：低分子量ポリアルギニンによるペプチド輸送。 図１８：ペプチド装填の関数としての輸送効率への影響。 以下の実施例では、ことわりのない限り、以下の材料と方法を用いた。 Ａ）細胞 ａ）細胞株 マウスメラノーマ細胞株Cloudman S91(クローンM-3；ATCC No．CCL 53.1)、肥 満腫瘍細胞株P815（ATCC No．TIB 64）および単球マクロファージ細胞株P388D1 （ATCC TIB 63）はATCCより入手した。細胞は、10％FCS、2mM L-グルタミンおよ び20μg/mlのゲンタマイシンを添加した高濃度グルコースのDMEM培地（High glu cose DMEM,Life Techonologies）で培養した。細胞は通常通りマイコプラズマ汚 染が無いことをテストした(PCR-Mycoplasma Detection Kit、Stratagene)。 90）に記載されている。 ｂ）骨髄の抗原提示細胞 まず、DBA/2マウスの大腿骨をリンスした。骨髄細胞を、10％FCS、５％ウマ血 清、２mM L-グルタミンおよび20μg/mlゲンタマイシンを含む高グルコースDMEM 培地で200ユニット/mlのマウスGM-CSF存在下で培養した（Liら、1989；Genzyme, Cambridge,MA,USA)。最初の５日間は24時間毎に培地の2/3を交換し、非接着性の 顆粒球とＢ細胞を除去した(lnabaら、1992)。８日と10日めの間で、PBS/5mM EDT Aとインキュベーションすることによって、接着している、および緩く接着して いる細胞の両方を集め、１ウェルあたり３ｘ１０⁴細胞の密度で８穴スライドガ ラス上に播いた(Nunc,Roskilde,Denmark)。90％以上の細胞が抗体F4/80と陽性反 応を示した(Endogen,Cambridge,MA,USA)。 Ｂ）ペプチド合成 性化、Fastmoc、スケール0:25mmol）を用いてペプチド合成機（フィードバック モニターの付いたモデル433A、Applied Biosystems,Foster City,Canada）で合 成し た。ペプチドは１Ｍ TEAA pH7.3に溶解し、Vydac Ｃ 18カラムの逆相クロマトグ ラフィーで精製した。配列はMAT Lasermat(Finnigan,San Jose,Canada)による 飛行時間型（flight time）質量分析法によって確かめた。 Ｃ）使用したペプチドのリスト ペプチド混合物： M-3メラノーマワクチン用のペプチド混合物Ｉ： kpep143、kpep145、kpep146、kpep150。 肥満細胞腫P815ワクチン用のペプチド混合物III： kpep117、kpep188、Kpep162、Kpep163、Kpep164。 Ｄ）ワクチンの調製 Ｄ１）個々のペプチドワクチン ａ）アジュバント無しの個々のペプチド対照ワクチンはペプチドを1mg/mlの濃 度でPBSに溶解することで調製した。注射までの時間は室温で４時間とした。 ｂ）ポリリジンをアジュバントとして含む個々のペプチドワクチンは（特にこと わらなければ200の鎖長のポリリジンを用いた）特定の量のペプチドとポリリジ ンをHBS中で混合して調製した。注射までの時間は室温で４時間とした。 i）16μgの有効なペプチドを含むワクチンを得るために、11.8μgのポリリジン を160μgのペプチドkpep117と全量１mlのHBS中で混合した。 ii)100μgの有効なペプチドを含むワクチンを得るため74μgのポリリジンを１mg のペプチドkpep117と全量１mlのHBS中で混合した。 ｃ）不完全フロイントアジュバント(IFA)を含む個々のペプチド対照ワクチンは 特定の量のペプチドとIFAを乳化することによって調製した。注射までのインキ ュベーション時間は室温で３０分とした。 i）16μgの活性なペプチドを含む対照ワクチンのために、600μlのHBSに溶解し た192μgのペプチドkpep117を600μlのIFAと共に乳化した。 ii）100μgの有効なペプチドを含む対照ワクチンのために、600μlのHBSに溶解 した1.2mgのペプチドkpep117を600μlのIFAと乳化した。 Ｄ２）ワクチンとしてのペプチド混合物 ａ）アジュバントを含まない対照ワクチンとしてのペプチド混合物Ｉには、kpep 143、kpep145、kpep146、およびkpep150のペプチドを全量１mlのPBS中に各々250 μg含めた。 ｂ）アジュバントを含まない対照ワクチンとしてのペプチド混合物IIIには、kpe p117、kpep118、Kpep162、Kpep163およびKpep164のペプチドを全量１mlのPBS中 に各々250μg含めた。 ｃ）ポリリジンをアジュバントとして含むワクチンとしてのペプチド混合物Ｉは 1mgのペプチド混合物Ｉ（各ペプチドを250μg含む）をHBS中で74μgのポリリジ ンと混合することによって調製した。注射までのインキュベーション時間は室温 で４時間とした。 ｄ）ポリリジンをアジュバントとして含むワクチンとしてのペプチド混合物III は1.25mgのペプチド混合物III（250μgの各ペプチドを含む）をHBS中で93μｇの ポリリジンと混合することによって調製した。注射までのインキュベーション時 間は室温で４時間とした。 ｅ）不完全フロイントアジュバントを含む対照ワクチンとしてのペプチド混合物 Ｉは600μlのHBSに溶解した1.2mgのペプチド混合物I（300μgの各ペプチドを含 む）を600μlのIFAと乳化することによって調製した。注射までのインキュベー ション時間は室温で30分とした。 ｆ）不完全フロイントアジュバントを含む対照ワクチンとしてのペプチド混合物 IIIは、600μlのHBSに溶解した1.5mgのペプチド混合物III（300μgの各ペプチド を含む）を600μlのIFAと乳化することによって調製した。注射までのインキュ ベーション時間は室温で30分とした。 ｇ）ポリリジンをアジュバントとする局所的な適用のために、１mgのペプチド混 合物I（250μgの各ペプチドを含む）を全量400μlのHBS中で74μｇのポリリジン と４時間インキュベーションした。得られた混合物を1.69のヒドロゲルDOLOBENE （Merckle）中に加えて撹拌した。 ｈ）アジュバントを含まない対照ワクチンの局所的投与のために、全量200μlの HBSに溶解した１mgのペプチド混合物Ｉ（250μgの各ペプチドを含む）を1.8gの ヒドロゲルDOLOBENE（Merckle）中に加えて撹拌した。 ｉ）フコース結合ポリリジン（鎖長240）の調製は、MacBroomら（1992）に記載 された方法を用いて行ない、約40％の置換を達成した(出発物質のβ-L-フコピラ ノシルフェニル-イソチオシアネートおよびポリリジンはSigmaから入手した)。 ｊ）トランスフェリン／ポリリジンコンジュゲート（WO 93/07283に記載された ように調製した）が用いられる場合は、ポリリジンの絶対量が１mgのペプチドあ たり75μｇであるように量を調整した。プラスミドDNA（空のプラスミドpSP65、 LPS-フリー、Boehringer Mannheim）を複合体に含めるときは、その比は37.5μg のDNA／75μgのポリリジン／１mgのペプチドとした。１mgのペプチドの代わりに 160μgが用いるときは、他の構成成分は同じ係数（6.25）で減少させた。 Ｅ）ワクチンの注射 皮下注射の前に、マウスを８体までの動物のグループにして、別々のエアーチ ャンバー内で麻酔した。3.5分間のハロタン処理（Ｏ₂中４％、流速４）を行なう と、マウスは約１分間麻酔された。この時間の間にワクチンを皮下注射した。 腹腔内注射は事前の麻酔をせずに行なった。注射量は各ワクチンについて動物 １体あたり100μlとしたが、これは動物１体あたり個々のペプチドまたはペプチ ド混合物lの100μgに相当する。ペプチド混合物IIIの場合は、各マウスに投与す るペプチドの全量を125μgとした。 Ｆ）ワクチンの局所的適用 各マウスに対して、100μgのペプチドまたはペプチド混合物Ｉまたは125μgの ペプチド混合物Ｉを毛をそった動物の、背中全体および耳にこすり付けた。正確 な量は秤で測定した。 Ｇ）マウスモデルにおける腫瘍増殖に対するワクチンの使用 予防又は治療マウスモデルにおける癌ワクチンの効力のテストは、特に述べな い限り、マウスモデルとしてDBA/2モデルを用い、WO 94/21808に記載された原理 に従った。 実施例１ 肥満細胞腫P815に対するDBN2マウスのワクチン接種 Letheら(1992)によって記載されている腫瘍抗原P815に由来する配列KYQAVTTTL (kpep118)のペプチド、これはＨ２-Ｋdのリガンドであるが、この160μgを11.8 μgのポリリジン300と500μlのHBS中で混合し室温で４時間インキュベーション した。次に500μlのEBSS（アールの緩衝化生理食塩水）を加えた。生じた混合物 の100μl分を１週間の間隔をおいて８体のマウスに皮下投与した。この予備免疫 の後、更に一週間後、100μlのEBSS中の５x１０⁴個の肥満細胞腫細胞株P815（Ar cc No．TIB 64,この細胞はペプチドP815が由来する腫瘍抗原を発現している）を 個々のマウスに対側性注射することにより、腫瘍を接種した。これらの テストの結果は図１に示した(黒塗りの四角)。 並行実験において、200μgのペプチドを500μlのHBSと混合し次に500μlのフ ロイントのアジュバントと乳化した。生じた乳剤の100μlで８体のマウスを予備 免疫し、上述のようにP815細胞で腫瘍を植えつけた(図１：黒丸)。 並行した別の実験のために、細胞腫瘍ワクチンを以下のように調製した。 160μgのペプチドkpep118を３μgのトランスフェリン-ポリリジン(TfpL)、10 μgのpLおよび６μgのプラスミドpsp65（LPSフリー）を500μlのHBSバッファー 中で混合した。室温で30分後、上記溶液を20mlのDMEM培地（10％FCS）20mMグル コース）中にアロジェニックな線維芽細胞株NKIH3T3（ATCC No.CRL 1658）細胞 を1.5x10⁶個含むT75培養フラスコに加え、37℃でインキュベーションした。３時 間後細胞を15mlの新しい培地と混合し37℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベーショ ンした。投与する４時間前に、細胞を20Gyで放射線照射した。ワクチンはWO 94/ 21808に記載されたように調製した。このワクチンによる予備免疫を10⁵個の細胞 で１週間の間隔で行なった。さらに１週間後、腫瘍細胞を上述したように植えつ けた(図１：黒三角)。ポリリジンと組み合わせた、ペプチドを含むワクチンは腫 瘍形成に対して最もよくマウスを防御することが分かった。 実施例２ DBA/2マウスの単一ペプチドワクチンによる肥満細胞腫P815に対するワクチン接 種 ａ）PBSに溶解したペプチドkpep117単独(図２ａ)、IFA中で乳化したペプチドkpe p117(図２ｂ)、ポリリジン（鎖長：２４０）をアジュバントとするペプチドkepe 117（図２ｃ）のいずれかを含む単一ペプチドワクチンを、P815腫瘍攻撃に対す る防御効果についてテストした。ワクチンは上述のD節に記載したように調製し た。注射用量は各場合に100μlとし、注射は皮下（sc）または腹腔内（ip）にし た。ナイーブ（naive）マウスを負対照として使用し、GM-CSF分泌P815細胞から なる全細胞ワクチンを正の対照とした(P815-GM-CSF；100μl中の10⁵個の細胞を 各動物に皮下注射した)。各実験群は８体の動物からなり、３回のワクチン 接種（sc）を７日間の間隔をおいて行なった。最後のワクチン接種から１週間後 、動物に５x10⁴個のP815細胞を対側性に接種した。動物を毎日観察し、１週間ご とにあらゆる腫瘍の出現を記録した。 ポリリジンをアジュバントとするペプチドkpep117は各動物に100μg皮下注射 したときに最もよい抗腫瘍効果を表した(８体の動物のうち、３体は防御された) 。この効果は、全細胞ワクチンで達成される効果(８体中４体の動物が防御され た)とほぼ同程度に優れている。ポリリジンと一緒にした１体あたり16μgのペプ チドは効果が劣っていたが(２体が防御された)、PBSに溶かした100μgのペプチ ド（図２ａ、防御効果なし）よりも有意に優れていた。また、IFA中で乳化して も、このペプチドはポリリジンと一緒にしたときに達する活性に達しなかった( 図２ｃ)。 ｂ）P815肥満細胞腫モデルに関する他の実験において、２種類の異なる鎖長の未 修飾ポリリジン、短い方はわずか16個のリジン残基しか含まず（pL16）長い方は 240残基を含む（pL240）が、これらを相互に比較した。対照群の動物にPBSに溶 解した、またはIFA中で乳化した、いずれかのペプチドkpep117を100μg注射した 。２種類のGM-CSF分泌細胞対照ワクチンを正の対照として用いた(a)を参照)。１ つのワクチンは、、安定にトランスフェクションされたP815から得たものであり 、２番目のワクチンはWagnerら(1992)によって記載された方法を用いて一過性ト ランスフェクションによって(AVET)得られたものである。この２種の全細胞ワク チンは全体で８体の動物のうち４から５体を防御した。ペプチド単独またはIFA 中に乳化したペプチドからなるペプチドベースのワクチンは防御効果を示さなか った。腫瘍接種のあと、全ての動物で腫瘍は急速に増殖した。しかしながら、ペ プチドをポリリジンと一緒に投与すると、ペプチドワクチンは動物を腫瘍攻撃か ら防御した。長いポリリジン（pL240）を用いた場合は８体の動物のうち２体が 防御され、短いポリリジンの場合には８体のうち４体であった。これらの結果は 図３に示したが、これは単一ペプチドをアジュバントとしてポリリジンと共に投 与すると、抗腫瘍ワクチン接種の標準として文献に記載されている(Dranoffら、 1993;Schmidtら、1995)、最も効果的なサイトカイン分泌全細胞ワクチンの効果 に匹敵する効果的な抗腫瘍防御を与えることを証明するものである。 実施例３ P815肥満細胞腫に対する、P815単一ペプチドまたはP815ペプチド混合物を含む腫 瘍ワクチンのDBA/2マウスへの接種 ワクチンを調製するために以下のペプチドを用いた： kpep118（注射あたり100μg） ペプチド混合物III(kpep117、kpep118、kpep162、kpep163、kpep164)：このペプ チド混合物はこれまで知られているP815の全てのペプチドを含んでおり、25μg の各ペプチドを各注射で投与した。 GM-CSF分泌P815細胞を正の対照として使用した。 予備的テストでは、kpep117はポリリジンと一緒に100μgのペプチドを用いる と（標準割合に対応して7.5gのポリリジン／100μgのペプチド；ポリリジン：鎖 長＝200）P815腫瘍接種に対して最も優れた防御効果を示すペプチドであること が分かった。より少ない量の（16μg）kpep117は効果が少なかった。この例では 、各動物に100μgのkpep118を、一つの場合はポリリジンのみと(グループＢ)、 トランスフェリン-ポリリジン（グループＣ）およびさらにトランスフェリン-ポ リリジン／ＤＮＡ（グループＤ）と一緒に注射した。IFAと一緒にしたkpep118を 対照として用いた。この実験では、kpep118単独では腫瘍接種に対して全く防御 効果を示さなかった。 実施例４において行った実験では、メラノーマペプチドのペプチド混合物を含 むワクチンはメラノーマに対して防御効果を示した。従って、この実施例をペプ PEチド混合物という考え方がP815細胞にも適切であるかをテストするために利用 した。 ペプチド混合物IIIを、ポリリジンのみと共に一度(Ｅグループ)、トランスフ ェリン-ポリリジンと共に一度(Ｆグループ)、トランスフェリン-ポリリジン／Ｄ ＮＡと共に一度（Ｇグループ）投与した。IFA中のペプチド混合物IIIを対照とし て用いた。ナイーブマウスを負対照として用い、GM-CSFトランスフェクションさ れたP815細胞を正の対照として（マウスあたり10⁵個の細胞）用いた。 本実施例でおこなった実験は他の実験に比べて典型的でないことが分かった： 正の対照群（GM-CSF分泌細胞）において、接種後の短期間全ての動物で腫瘍が増 殖し、その腫瘍の大部分は形成されたのと同じくらい急速に消失した。このこと の可能な説明一つは、腫瘍は破壊される前に暫く増殖したということである。２ つめの可能な説明は、腫瘍と診断された腫脹は腫瘍増殖に起因するものでなく、 免疫細胞の激しい浸潤（肉芽腫）であったということである。動物を解剖しなか ったので、この理由は完全に明確にはできなかった。いずれにしろ、生じた腫瘍 は最終的には破壊された。他の興味深い結果が、ペプチド混合物IIIとポリリジ ンの組み合わせで動物が処理されているグループＧにおいて得られた。すべての 動物において腫瘍が増殖したが、動物のうち２体において腫瘍（または免疫細胞 の浸潤）の腫脹の大きさはかなり小さく、大きくならず、マウスは健康でないよ うに見えなかった。この２体の動物は殺さずに観察下においた。驚くべきことに 、腫瘍接種から９週間後に腫瘍は検出できなくなったが、これはそれまで見られ なかった結果である。最後に、８体の動物のうち２体が腫瘍を破壊した。腫瘍の 破壊はペプチド混合物中の内容物であるkpep117のためのようであり、実施例２ と同じように、16μgのkpep117で８体の動物のうち２体が防御され、100μgのkp ep117で８体の動物のうち３体が防御された。しかしながら、防御効果は混合物 中の１以上のペプチドによって生じているかもしれない。 実施例４ ペプチド混合物を含む腫瘍ワクチンで予備免疫することによる、DBA/2マウスの メラノーマM-3からの防御 メラノーマペプチド混合物（ペプチド混合物Ｉ、Ｄ２節）を含む予防ワクチン を用いた。 このワクチンによる予備免疫と腫瘍の植え付け方法は実施例２に記載した方法 と同じであるが、腫瘍の接種はM3細胞で行なった(1体あたり10⁵個の細胞)。使用 する対照ワクチンは、最適量のIL-2（10⁵個の細胞あたり1000-2000ユニット）を 分泌する、Schmidtら(1995)に記載されたように調製したM-3細胞の全細胞ワク チンとした。用いたテスト条件下では、このワクチンは100％の防御を達成した( 図４)。実験動物の４つのグループにペプチド混合物のワクチンを投与した。２ つのグループにはIFAに乳化したペプチドをs.c.またはi.P.で与えた。他の２つ のグループにはペプチドをポリリジン（pL240）と共にs.c.またはi.p.のいずれ かにより与えた。 図４は、ポリリジン（pL240）をアジュバントとするペプチドワクチンの防御 効果を示すものである。処置したマウスの50％がM-3腫瘍攻撃から防御され、こ れに対して未処理の動物は固形腫瘍が急速に増殖した。この効果は、ペプチド- ポリリジンワクチンを皮下注射したとき又はヒドロゲルとして皮膚に塗布したと きに達成することができた(図５)。ペプチド／ポリリジンワクチンi.p.またはIF A中のペプチドで処理された、他の３つの対照群においては、ワクチンは実質的 に効果がなかった。ここでは接種された腫瘍は拒絶されず、未処理の対照動物に 比較して少し遅れるだけで腫瘍は増殖した。これらの結果はペプチド混合物を含 むワクチンは、ポリリジンを含むときに抗腫瘍性防御効果を達成することを示す ものである。選択したテスト条件下で、このペプチドワクチンは、最近なされた 報告（Zatloukao,1993,Zatloukao,1995）によれば10⁵個の生きたM3細胞による腫 瘍攻撃に対して動物を100％に達するまで防御したという細胞性IL-2ワクチンの 半分程度の効果しかなかった。 実施例５ DBA/2マウスのM-3転移に対する防御 ａ）メラノーマペプチドの混合物（Ｄ２節に記載したペプチド混合物１）を含む 治療ワクチンを使用した。３回のワクチン接種（sc）を１週間の間隔で行なった 。最初のワクチン接種は転移の開始（setting）から５日後に行ない、従ってワ クチン接種は５日後転移に対して行なわれた。WO 94/21808およびSchmidtら(199 6)に記載された方法を用いて、1.2x10⁴個のM-3細胞を転移開始のために注射した 。 使用したワクチンはペプチド混合物Ｉであって、アジュバント無し(pepmix1PB S)、アジュバントとしてIFA（IFA pepmix1）またはフコース修飾ポリリジン（f pL pepmix1）とした。対照群はワクチンを投与せず（ナイーブ）または実施例４ で述べたIL-2産生M-3全細胞ワクチンを投与した。図６は、最良の防御は、アジ ュバントとしてフコース修飾ポリリジンと一緒にしたペプチド混合物Ｉで処理し た群において得られたことを示す(図６ａ)。この処置は50％のマウス（4/8）が 転移を拒絶することができた。この処置は33％のマウス（3/9）しか防御しなか った全細胞ワクチン処置よりも効果的であった。IFAを含む、またはアジュバン トを含まないペプチドワクチンは転移したものが腫瘍へと増殖するのを遅らせる だけであった(図６ｂ)。 ｂ）他の実験では、ペプチド混合物Ｉを含み、皮下投与したワクチンの防御効果 を、治療モデルにおいてテストした。対照群にはPBS（アジュバント無し）に溶 解したまたはIFAを含むペプチド混合物を投与した。未修飾のポリリジン240をア ジュバントとして使用した。加えて、フコース-修飾ポリリジン200（fpL 200） をアジュバントとして使用した。対照はIL-2発現細胞ワクチンを投与された動物 の群からなる。図７ａに示されたように、ペプチド／ポリリジンワクチンはM3- 転移の治療において効果的であった。この実験において有意な治癒率はフコース -修飾ポリリジンについてのみ達成された。この処置により、動物の50％は転移 を拒絶したが、これはこのケースで70％の動物を治癒したIL-2ワクチンと比較し て良好な結果である。 ｃ）他の実験では、抗腫瘍活性に対するポリカチオンの変化と修飾の効果を治療 モデルでテストした。未修飾の、およびフコース修飾ポリリジン200に加えて、 短い未修飾ポリリジンpL16、長いポリリジンpL450および他のポリカチオン、す なわちポリアルギニン（pArg720）をテストした。GM-CSFの最適量（10⁵個の細胞 あたり≧10ng）を分泌する細胞性M3ワクチンを正の対照としてテストした(Schmi dt,1995)。この実験でもまた、対照群にはIFA中の、またはいかなるアジュバン トも含まないペプチド混合物を投与した。実施例５ｂ）のように、フコース-ポ リリジンをアジュバントとして用いたときに最も優れた効果が達成された(図７ ｂ)。この群では、40％の動物が転移を拒絶し、これに対して短いポリリジンpL1 6では30％であった。ポリアルギニンと一緒にペプチドを投与されてきた群を別 にして、ペプチドワクチンを投与されていた他の群の動物は腫瘍形成までに 少しの遅延を示しただけである。未修飾のポリアルギニンはこのテストにおいて はフコース-修飾ポリリジンと同程度に効果的であり、10体の動物の４体におい て腫瘍の拒絶を起こさせた。 図７ｃは独立の実験においてポリアルギニンにより達成されるこの効果の再現 性を示すものである。ここでもまた、ポリアルギニンと一緒にしたペプチド混合 物のワクチン接種は、処置した８体の動物のうち４体において抗腫瘍活性を示し た。 実施例６ ポリリジンをアジュバントとして用いた、細胞のチロシナーゼ移行装填 この実施例は、M-3細胞を細胞の例として用いて、ポリリジンがより大きなタン パク質断片又はタンパク質全体を細胞に装填するためのアジュバントとして適切 であることを示すための実験である。 細胞に装填するため、まず160μgのFITCラベルしたチロシナーゼ（EC 1.14.18 .1;Sigma）を３μgのポリリジン（pL240）と混合し室温で３時間インキュベーシ ョンした。次に、得られた溶液を２x10⁶個のM-3細胞と共にT75細胞培養フラスコ に入れ37℃でインキュベーションした。次に細胞をPBSで２回洗浄し、PBS/2mM E DTAで剥がし、FACS解析のため１mlのPBS／5％FCSに溶かした。図８はチロシナー ゼによるM-3細胞の装填を示すものである(左側のカーブは対照を示し、右側のカ ーブはチロシナーゼの装填を示すものである)。 実施例７ 治療モデルにおける、感作後のＴ細胞活性化の測定 ペプチド／ポリカチオンワクチンがマウス治療モデルではっきりと効果を示し たので(実施例５を参照)、この処置がＴ細胞の活性化も引き起こすか否かを調べ るために研究を行なった。このため、マーカーとして機能する親のM3細胞と、ワ クチン接種した動物からの脾臓細胞とを一緒にインキュベーションした後のサ イトカイン分泌を用いた(Kawakamiら、1994b)。 脾臓単一細胞懸濁液をワクチン接種した、および未処置の動物から調製し、次 に低張バッファー（0.15NH₄Cl、1mM KHCO₃、0.1mM EDTA、pH7.4）により赤血球溶 血を起こさせた。接着細胞を、１mlのDMEM培地（10％FCS）あたり3x10⁶個の脾臓 細胞をいれたシャーレで37℃、90分インキュベーションすることによって除去し た。非接着細胞を注意深くピペッティングし１ｘ10³個の親細胞と種々の割合で 共培養した。細胞を200μlのDMEM培地(10％FCS)、2mM L-グルタミンおよび20μg /mlのゲンタマイシンをいれた96穴平底組織培養プレート中で培養した。９日目 に、100μlの上清を集めIFN-γ含量を、商業的に入手可能なELISAキット（Endog en,Cambridge,MA,USA）を用いて取扱説明書に従って測定した。９日間のインキ ューベーション後、ワクチン接種した動物の脾臓細胞のみが培地中に多量のIFN- γを分泌し、未処置の動物の脾臓細胞とM3細胞の共培養中にはほとんどIFN-γは 検出できなかった。これらの実験の結果は図９に示した。 実施例８ インフルエンザヌクレオキャプシドペプチドASNENMETMおよびアジュバントとし てフコシル化ポリリジンによる抗ウイルス免疫の誘導 １mgのペプチドASNENMETMあたり75μgのfpLysを含むワクチンを使用した。こ のワクチンは、方法の節のところで述べたように１回の注射で投与し、１体の動 物あたり100μgのペプチド／7.5μgのfpLysを注射した。対照として、100μgの ペプチドを単独（PBS）で注射するか、または全く注射しなかった(ナイーブ対照 )。 RMA-Sマウスリンパ腫細胞を無血清培地で10μg/mlのペプチドASNENMETMととも に一晩26℃でインキュベーションした。 ワクチン接種の10日後、脾臓細胞をワクチン接種した動物から単離し、ペプチ ド装填RMA-S細胞と5:1の比で混合しさらに５日間培養した(Stuberら、1994)。種 々の培養において生き残るエフェクター脾臓細胞の数を測定し、次に、標準的な ４ｈユーロピウム放出アッセイ（Blombergら、1993）によってCTL活性を測定 するために、この細胞を予めペプチドASNENMETMおよびユーロピウムキレートと 一緒にしておいたRMA-S細胞といろいろな割合で混合した。図１０に示したよう に、このテストにおいて、ペプチドとfpLysでワクチン接種したときにのみ特異 的な免疫が得られ、ペプチド単独で投与したときは得られなかった。 実施例９ 種々の塩基性ポリアミノ酸の、APCへのペプチドの内部移行及び／または結合を 促進する能力のテスト これらのテストのために蛍光アッセイを用いた：配列LFEAIEGFI（MHC Ｋｄ拘 束）のモデルペプチド抗原を蛍光色素フルオレセインイソチオシアネート（FITC ）で取扱説明書に従ってラベルした(Molecular Probes)。FITCラベルした（「パ ルス」された）ペプチド単独または塩基性アミノ酸の種々の濃度のもの（16から4 90の鎖長のポリリジン、鎖長15から720のポリアルギニン）と一緒にしたFITCラ ベルペプチドの、MHC Kd拘束単球マクロファージ細胞株P388D1による取込み又は 結合を、スルーフローサイトメトリーで測定した。これを行なうために１ｘ10⁶ 個のP388D1細胞を、遠心試験管の中で、５μgのFITC-ラベルペプチド単独または ペプチドとポリアミノ酸の混合物と共に最終体積１mlの培地（DMEM/10％FCS）中 で37℃、30分間インキュベーションし、その後いかなる遊離のペプチドも除去す るために徹底的に洗浄した。ポリアミノ酸は１mlの培地あたり50、25、12、6お よび3μgの濃度で加え、FITCラベルしたペプチドを５μg入れた。ペプチドの取 込み及び／または結合の効率を評価するために種々のサンプルの相対蛍光強度を 比較した。これらのテストの結果は図１１に示した。このテストはそれぞれ25μ gのpL450およびpArg450を用いて行なった。使用した条件下では、ポリアルギニ ンはポリリジンより約５倍効果的であることが分かった。 実施例１０ ペプチドがAPCに吸収されるメカニズムの研究 ペプチドはマクロ飲作用またはレセプター媒介エンドサイトーシスのような特 異的なメカニズムによって吸収されうる(Lanzavecchia,1996)。もう一つのメカ ニズムは、ポリアミノ酸が細胞膜を透過性にし、ペプチドが膜を通って培地から 細胞質へ拡散することができることにあるかもしれない。 ａ）商業的に入手可能なキット（Cytotox 96,Promega,Madison,Wisconsin,USA） を用い、取扱説明書に従い、P388D1細胞をポリアミノ酸（ポリリジンまたはポリ アルギニン）と共に等張条件下でインキュベーション後に細胞質性酵素の乳酸デ ヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を測定することにより、細胞膜の透過性化の可能 性をテストした。図１２ａの結果を基にすると、pLysの効果は細胞膜を透過性に すること、これは等張条件下での高濃度の細胞質性酵素の放出によって示される が、そこにあるとすることができる。これに対してpArg処理の後では(図１２ｂ) 、LDHはほとんど検出されなかった。ポリアミノ酸単独で処理したサンプルを比 較すると、ポリリジン又はポリアルギニンとペプチドの混合物による処理とLDH の放出に関して差異はみられなかった。ペプチド単独とのインキュベーション後 は、測定可能なLHD活性は検出できなかった。 ｂ）塩基性ポリアミノ酸の存在下又は非存在下におけるFITCラベルしたペプチド の内部移行の可能性をMidouxら(1993)によって公表された原理に基づいて調べた 。細胞によって内部移行される粒子はエンドソーム中で輸送される。中性pH値を 有する細胞質または細胞培養培地に比較して、pHが約５であるこれらのオルガネ ラは酸性である。FITCにより放出される蛍光は強いpH依存性である。エンドソー ムに見られるようなpH条件の環境では、蛍光は抑えられている。従って、細胞に よってエンドソームヘ吸収されたFITCラベルペプチド蛍光の減少を示す。モネン シンを加えると、エンドソームの低いpHは中和され、内部移行したFITCラベルペ プチドの、測定可能な強い蛍光が生じる。 細胞をポリアルギニン（平均分子量範囲100,000、鎖長490）と蛍光ラベルペプ チドとを一緒に４℃または37℃でインキュベーションした。37℃でインキュベー ションしたサンプルの一部をとっておき、スルーフローサイトメトリーによる解 析をする前に4℃で50μMのモネンシンで処理した。 APCをポリリジン（pLys）およびポリアルギニン（pArg）のような特定の塩基 性ポリアミノ酸と共にインキュベーションするとAPCへのペプチドの取込み又は 結合を増強することが見いだされた。 図１３から明らかなように、単独のペプチド及びモネンシンで処理した細胞で は僅かな蛍光の増加が見られただけであった。これに対して、モネンシンとポリ アルギニン及びペプチドの混合物とで処理したサンプルでは蛍光シグナルは大き く増大した。サンプルを4℃でインキュベーションした場合は取込みは全く見ら れなかった。モネンシン処理後の蛍光の有意な増大は、pArgによってもたらされ るペプチドの装填により、そのペプチドが細胞内の小胞へ蓄積することを示すも のである(Midouxら、1993、図１３)。予想したたように、ポリリジンを装填した サンプルをモネンシン処理しても、わずかな蛍光の増加が見られただけであった 。4℃でポリリジンを装填させると測定可能な程度に蛍光が増加したが、これは ポリリジンの効果は主として細胞膜の透過性化によって起こることを更に示すも のである(図１２ｂ)。 実施例１１ APCによる短いペプチド装填の研究 骨髄からGM-CSFによって得られたAPCを蛍光ラベルペプチドとポリリジン(pL20 0;Sigma)の組み合わせ、またはペプチド単独を用いて蛍光顕微鏡によって調べた 。ペプチド取込みの顕微鏡検出のために、APCをスライド上に播き、40μgのフル オレセインラベルペプチドLFEAIEGFI単独または50μg/mlのポリリジン（pL200） と40μg/mlペプチドLFEAIEGFIの混合物と共に37℃、30分間インキュベーション した。徹底洗浄後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、アンチフェイ デント(anti-Fadent)(Dako,Glostrup,Denmark)で覆い、蛍光顕微鏡(Zeiss)観察 下においた。核は4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI;Simga）でカウ ンター染色した。図１４の蛍光顕微鏡写真に示されているように、ペプチドとポ リリジンと共にインキュベーションした細胞（Ａ）は、ペプチド単独で処理した 細胞（Ｂ）よりもペプチド取込みの有意な増加を示した。蛍光はペプチド単独で 処理（「パルス」）された細胞内ではまばらにしか存在せず、かつ粒子形態でし か存在しないが、ポリリジン存在下でペプチドを装填させた細胞の強い蛍光は局 在しておらず、全体として一般に細胞全体に、より均一に分布していた。 実施例１２ スルーフローサイトメトリーによる、細胞のペプチド装填の定量的測定（移行装 填アッセイ） ａ）実施例１１において行なったテストによりAPCは小さなペプチドを装填する ための優れた標的細胞であることが分かったので、ペプチドワクチンに適切なア ジュバントを明らかにするためにin vitroでFACSアッセイを行なった。このアッ セイにより蛍光ラベルペプチドを迅速に定量的にテストをすることができる。配 列LFEAIEGFIのペプチドをモデルペプチドとして使用した。これらのテストでは 、マウス細胞株P388D1をAPCとして使用した。１ｘ10⁶個の細胞を、最終体積1ml の１０％FCS高グルコースDMEM培地中、最終的なフルオレセイン濃度５nmol/mlで ５μgのペプチドとともに37℃、30分間インキュベーションした。細胞は、図１ ５に示したように細胞をペプチド単独または、ペプチドとポリカチオンの組み合 わせ、または、ペプチドとヒストンの組み合わせのいずれかにより、これらの濃 度を増加させて（3から50μg/ml）各濃度で処理した。以下の化合物を用いた： Ａ：ポリオルニチン（平均分子量範囲110,000、鎖長580)；Ｂ：アルギニン-リッ チヒストン；Ｃ：リジン-リッチヒストン；Ｄ：ポリアルギニン(平均分子量範囲 100,000、鎖長490)；Ｅ：ポリリジン(平均分子量範囲94,000、鎖長４50)。予備 テストにおいては、30分間のインキュベーションで最大のペプチド取込みがある ことが分かった。これより長い処理（４または８時間）は蛍光シグナルの有意な 増加を全く示さなかった。解析の前に細胞を0.2％BSAを含む多量のPBSで５回洗 浄した。細胞を１mlの氷冷却PBS/0.2BSAに溶かし、スルーフローサイトメトリー （FACScan;Becton Dickinson,San Jose,CA,USA）で調べた。 ポリアルギニンおよびポリリジンは最も効果的なアジュバントであることが分 かった。ポリオルニチンは選択した条件下で細胞障害性効果を示した。ポリアル ギニンおよびポリリジンによるペプチド取込みの増加は濃度と相関しており(図 １５ｄ，ｅ)、取込みは鎖長と共に増加する（図１６） ポリアルギニンは、対照に比べて10³の増加が見られ、最大10²に満たない増加 しか示さなかったポリリジンよりも適切な濃度範囲が広いことが観察され、使用 した全ての鎖長においてポリリジンよりもタンパク質輸送についてより効果的で あることが観察された(図１６)：ポリアルギニンは３μg/mlという低濃度で効率 的な輸送を可能とするが、ポリリジンについては蛍光の有意な増加を得るために は25μg/mlより大きな濃度が必要とされた(図１５ｄ，ｅ)。 ｂ）ペプチド輸送について鎖長の下限があるかどうかを明確にするために、異な る鎖長のポリアルギニン（１０〜３０残基）を合成し、このポリカチオンが高濃 度においてペプチド輸送を増加させ得るかをテストした(図１７)。これらの実験 にはペプチドLFEAIEGFIを用い、テストしたボリアルギニンポリマーは100μg/ml の濃度で使用した。 テストしたポリアルギニンの最も短いものでも、僅かではあったが、ペプチド 輸送の増加が見られた。 ｃ）塩基性アミノ酸は正に帯電した分子である。従って、負に帯電したペプチド は静電的相互作用によってこれらのポリカチオンに結合することができると仮定 することができ、これによってペプチド取込みが増加する可能性があるかもしれ ない。この仮説をテストするため、陽イオン性ポリアミノ酸の、その電荷の作用 としてP388D1細胞に短いペプチドを吸収させる能力を比較した。以下の表は、使 用した、MHC-I結合に要求される全ての条件（Rammenseeら、1995）を満足する、 負に帯電したペプチドを列挙したものである。ペプチド１はマウスTRP（チロシ ン関連タンパク質(tyrosine related protein)）に由来し，ペプチド２はインフ ルエンザ赤血球凝集素（Schmidtら、1996）に由来し、ペプチド３はマウスチロ シナーゼに由来し、ペプチド４はP198腫瘍抗原に由来し、ペプチド５はベータガ ラクトシダーゼ（Gavinら、1993）に由来する。(「Ｍｒ」は分子量範囲を表し、「 蛍光」はフルオレセインを表す。) フルオレセインでペプチドをラベルするために使用した方法のために、２個の 負電荷が導入された。ポリアルギニンとともにインキュベーションすると、負電 荷数の最も多いペプチド（各サンプル５nmol）がP388D1細胞に最も効率よく輸送 されることが分かり、これはペプチドとポリカチオン間のイオン性相互作用がペ プチドの細胞内への輸送を更に促進することを示すものである(図１８)。しかし ながら、ペプチド単独で処理した細胞と比較して、中性ペプチドについて、ポリ カチオンの存在下で、より多くの量が吸収された。ペプチド単独での処理は、テ ストした全てのペプチドについてほとんど同じ蛍光シグナルを生じた。代表的例 を示すため、ペプチドLFEAIEGFIで得られた蛍光シグナルを代表として「ペプチ ド単独」と図１８に示した。 参考文献 Alexander,J.et al.,1989,Immunogenetics 29,380 Allred,D.C.et al.,1992,J.Clin.Oncol.10(4),599-605 Avrameas,A.et al.,1996,Eur.J.Immunol.26,394-400 Behr,J.P,1994,Bioconjug-Chem.,Sept-Oct,5(5),382-9 Bertoletti,A.et al.,1994,Nature 369,407-410 Biologic Therapy of Cancer,Editors:DeVita,V.T.Jr.,Hellman,S.,Rosenberg, S.A.,Verlag J.B.Lippincott Company,Philadelphia,New York，London, Hagerstown Blomberg,K.und Ulfstedt,A.C.,1993,J.Immunol.Methods 160:27-34 Boon,T.,1992,Adv Cancer Res 58,177-210 Boon,T.,1993,Spektrum der Wissenschaft(Mai),58-66 Boon,T.et al.,1994,Annu.Rev.Immunol.12,337-65 Boon,T.und van der Bruggen,P., 1996,J Exp Med 183,725-729 Braciale,TJ.und Braciale,V.L.,1991,Immunol. Today 12,124-129 Brocke,S.et al.,1996,Nature 379(6563),343-346 Bronte,et al,1995,J.Immunol 154,5282 Carrel,S.und Johnson,J.P.,1993,Current Opinion in Oncology 5,383-389 Coligan,J.E.,et al.,1991,Nature 351,290-296 Coligan,J.E.,et al.,1991,Current Prot.in Immunol.,Wiley,New York Coulie,P.G.et al.,1992,Int.J.Cancer,50,289-297 Coulie,P.G.et al.,1995,Proc Natl Acad Sci ＵＳＡ92,7976-80 Coulie,P.G.et al.,1994,J.Exp.Med.180,35-42 Cox,A.L.et al.,1994,Science 264,5159,716-9 Current Protocols im Molecular Biology,1995,Herausgeber:Ausubel FM.,e t al.,John Wiley ＆ Sons,Inc. Dranoff,G.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,3539-3543 Dranoff,G.und Mulligan,R.C.,1995,Advances in Immunology 58,417 Falk,K.et al,1991,Nature 351,290-296 Felgner,J.H.et al,1994,J.Biol.Chem.269,2550-2561 Feltkamp,M.C.et al.,1995,Eur.J.Immunol.25(9),2638-2642 Fenton,R.G.et al,1993,J.Natl.Cancer Inst.85,16,1294-302 Fisk,B.et al.,1995,J.Exp.Med.1881,2109-2117 Flow Cytometry,Acad.Press,Methods in Cell Biology,1989,Vol.33,Herau sgeber:Darzynkiewicz,Z.und Crissman,H.A. Gedde Dahl,T.et al.,1992,Hum Immunol.33,4,266-74 Grohmann,U.et al.,1995,Eur.J.Immunol.25,2797-2802 Guarini,A.et al.,1995,Cytokines and Molecular Therapy 1,57-64 Han,X.K.et al,1995,PNAS 92,9747-9751 Handbuch:FACS Vantage ^TM User's Guide,April 1994,Becton Dickinson Handbuch:CELL Quest ^TM Software User's Guide,June 1994,Becton Dicki nson Henderson,R.A.,und Finn,O.J..1996,Advances in Immunology 62, 217-256 Hock,H.et al.,1993,Cancer Research 53,714-716 Houbiers,J.G.,et al.,1993;Eur J Immunol 23,2072-7 Huang,A.Y.C.,und Pardoll,D.M.(1996).Proc Natl Acad Sci ＵＳＡ93, 9730-5 Inaba,Ｋ,et al.,1992,J Exp Med 176,1693-1702 Jung,S.et al.,1991,J.Exp.Med 173,1,273-6 Kawakami,Y.et al.,1994,Proc.Natl Acad.Scl.USA 91,6458-62 Kawakami,Y.et al.,1994a,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,9,3515-9 Kawakami,Y.et al,1994b,J.Exp.Med.180,1,347-52 Kawakami,Y.et al.,1995,The Journal of Immunol.154,3961-3968 Kersh,G.J.et al,1996,Nature 380(6574),495-498 Kovacsovics Bankowski,M.und Rock,K.L.,1995,Science 267,243-246 Lanzavecchia,A.,1996,Curr.Opin.Immunol.8,348-354 Lehmann,J.M.et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,9891-9895 Lethe,B.et al.,1992,Eur.J.Immunol.22,2283-2288 Li,H.,et al,1989,J Exp Med 169,973-986 Lill,N.L.,Tevethia,M.J.,Hendrickson,W.G.,und Tevethia,S.S.(1992). J Exp Med 176,449-57 Ljunggren,H.G.,et al.,1990,Nature 346476-480 Loeffler,J.-P.et al.,1993,Methods Enzymol.217,599-618 Lopez,J.A.,et al.,1993,Eur.J.Immunol.23,217-223 MacBroom,C.R.et al.,1972,Meth.Enzymol.28,212-219 Mackiewicz,A.et al.,1995,Human Gene Therapy 6,805-811 Malnati,M.S.et al.,1995,Science 267,1016-1018 Mandelboim,O.et al,1994,Nature 369,5.May,67-71 Mandelboim,O.et al.,1995,Nature Medicine 1,11,1179-1183 Marchand,M.,et al.,1995,Int J of Cancer 63,883-5 Mclntyre,C.A.,et al.,1996 Cancer Immunol.Immunother.42:246-250. Midoux,P.,et al.,1993,NATO ASI Series H67,49-64 Morishita,R.et al.,1993,J.Clin.lnvest.91,6,2580-5 Nabel,G.J.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci USA 90,11307-11311 Noguchi,Y.et al.,1994.Proc Natl Acad Sci ＵＳＡ91,3171-3175 Oettgen,H.F.und Old,L.J.,1991,Biologic Therapy of Cancer,Editors:DeVi ta,V.T.Jr.,Hellman,S.,Rosenberg,S.A.,Verlag J.B.Lippincott Compan y,Philadelphia,New York,London,Hagerstown,87-119 Ostrand-Rosenberg.S.,1994,Current Opinion in Immunology6,722-727 Pardoll,D.M.，1993,Immunology Today 14,6,310 Practical Immunology,Editors:Leslie Hudson and Frank C.Hay,Blackwell S cientific Publications,Oxford,London,Edinburgh,Boston,Me1bourne Peace,D.J.et al.,1991,J.Immunol.146,6,2059-65 Peoples,G.E.et al.,1994,J.Immunol 152,10,4993-9 Plautz,G.E.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,4645-4649 Porgador,A，Gilboa,E.，1995,J.Exp.Med.182,255-260 Puccetti,P.et al.,1995,Eur.J.Immunol.24,1446-1452 Rammensee,H.G.,et al.,1993,Annu Rev Immunol 11,213-44 Rammensee,H.G.et al.,1993,Current Opinion in Immunology 5,35-44 Rammensee,H.G.,et al.,1995,Current Biology 7,85-96 Rammensee,H.G.,1995,Current Opinion in Immunology 7,85-96 Rammensee,H.G.,et al.,1995,Immunogenetics 41,178-228 Remington's Pharmaceutical Sciences,18.Auflage 1990,Mack Publishing C ompany,Easton,Penn.1990 Remy,J.S.et al.,1994,Bioconjug-Chem.,Nov-Dec,5(6),647-54 Rennie,J.und Rusting,R.,1996,Scientific American September,28-30 Rivoltinli,L et al,1995,The Journal of Immunology 154,5 2257-2265 Robbins,P.F.,et al.,1994,Cancer Res 54,3124-6 Robbins,P.F.,et al.,1995,J Immunol 154,5944-50 Robbins,P.F.und Rosenberg,S.A.,1996,Journ.Exp.Med.183,1185-92. Robbins,P.F.und Kawakami,Y,1996,Curr Opin Immunol 8,628-636 Roitt I.M.,Brostoff J.,Male D.K.Immunology,Churchill LiVingstone Rosenberg,S.A.,1996,Annual Reviews of Medicine,47,481−491 Ryser,H.J.und Hancock,R.,1965,Science 150,501-503 Ryser,H.J.und Shen,W.C,1978,Proc Natl Acad Sci.USA75,3867-3870 Schmidt,W,et al.,May 1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,4711-4714 Schmidt,W,et al.,1996,Proc Natl Acad Sci USA,93,9759-63 Sette,A.et al.,1994,Mol.Immunol 31(11)813-822, Shen,W.C.und Ryser,H.J.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1872-18 76 Shen,W.C.und Ryser,H.J.,1979,Mol.Pharmacol16,614-622 Shen,W.C.und Ryser,H.J.,1981,Proc.Natl Acad.Sci USA,78,7589-75 93 Skipper,J.,und Stauss,H.J.,1993,J.Exp.Med.177,5,1493-8 Slingluff,C.L.et al.,1994,Current Opinion in Immunology 6,733-740 Stein,D.et al.,1994,EMBO Journal,13,6,1331-40 Stuber,G.et al.,1994,Eur.J.Immunol 24,765-768 Sykulev,Y.et al.,1994,Immunity 1,15-22 Theobald,M,Levine,A.J,und Sherman,L.A.(1995)PNAS 92,11993-7 Tibbets,L.M.et al.,1993,Cancer,Jan.15.,Vol.71,2,315-321 Tykocinski,M.L.et al,1996,Am.J.Pathol 148,1-16 van der Bruggen,P.et al.,1994,Eur.J.Immunol.24,9,2134-401ssn:001 4-2980 Van der Eynde,B.und Brichard,V.G.,1995,Current Opinion Immunol.7,6 74-81 Van Pel,A.und Boon,T.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,4718-4722 Van Pel,A.,et al.,1995,Immunological Reviews 145,229-250 Vitiello,A.et al,1995,J.Clin.Inv.95,1,341-349 Wagner,Ｅ,et al.,1990,Proc Natl Acad Sci USA 87,3410-4 Wagner,Ｅ,et al.,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89,6099-103 Wang,R.F.,et al.,1995,J Exp Med 181,799-804 Weynants,P.et al.,1994,Int.J.Cancer 56,826-829 Widmann,C.et al.,1992,J.Immunol.Methods 155(1),95-99 York,I.A.und Rock,K.L.,1996,Ann.Rev.Immunol.14, 369-396 Yoshino,I.et al.,1994 a),J.Immunol 152,5,2393-400 Yoshino,I.et al.,1994 b),Cancer Res.,54,13,3387-90 Young,J.W.,Inaba,K.,1996,J.Exp.Med.,183,7-11 Zatloukal,K,et al.,1993,Gene135,199-20 Zatloukal,K.et al.,1995,J.Immun.154,3406-3419

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/21 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 39/00 39/02 39/12 39/02 37/02 39/12 37/66 Ｇ (31)優先権主張番号 １９６４８６８７．４ (32)優先日 平成８年11月25日(1996．11．25) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 シュタインライン ペーター オーストリア アー1020 ウィーン レン ブラントシュトラーセ 10―４ (72)発明者 ブッシュル ミハエル オーストリア アー2345 ブルン アム ゲビルゲ ヒュルトルシュトラーセ 35― １―１ (72)発明者 シュヴァイヒホッファー タマス オーストリア アー1180 ウィーン コロ ーレドガッセ ２―４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．免疫調節活性を有する、少なくとも１つのペプチド、タンパク質またはタン パク質断片をアジュバントと共に含む医薬組成物であって、前記アジュバントが 、治療される個体の細胞へのペプチドまたはタンパク質またはタンパク質断片の 結合を増大させることができ、または、細胞へのペプチドまたはタンパク質また はタンパク質断片の取込みを増加させることができ、かつ、ペプチドまたはタン パク質またはタンパク質断片の免疫調節活性を増大させることを特徴とする医薬 組成物。 ２．ペプチドまたはタンパク質の細胞分解物またはタンパク質断片が、治療され る個体が発現している少なくとも１つのMHC分子のリガンドであることを特徴と する、請求項１に記載の医薬組成物。 ３．ペプチドまたはタンパク質の細胞分解物またはタンパク質断片がMHC-I分子 のリガンドであることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。 ４．ペプチドまたはタンパク質の細胞分解物またはタンパク質断片がMHC-II分子 のリガンドであることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。 ５．病原体のタンパク質に由来するペプチドを含むことを特徴とする、請求項１ 〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。 ６．ペプチドがバクテリアのタンパク質に由来することを特徴とする、請求項５ に記載の医薬組成物。 ７．ペプチドがウイルスタンパク質に由来することを特徴とする、請求項５に記 載の医薬組成物。 ８．タンパク質が腫瘍抗原であるか、またはタンパク質断片若しくはペプチドが 腫瘍抗原に由来することを特徴とする、腫瘍ワクチンとしての請求項１〜４のい ずれか１項に記載の医薬組成物。 ９．腫瘍抗原が、治療される個体が発現している腫瘍抗原に由来することを特徴 とする、治療に使用される請求項８に記載の医薬組成物。 １０．腫瘍抗原が一般に生ずる腫瘍抗原の代表的なものに由来することを特徴と する、予防的に使用される請求項８に記載の医薬組成物。 １１．腫瘍抗原がメラノーマ抗原であることを特徴とする、請求項８〜１０のい ずれか１項に記載の医薬組成物。 １２．サイトカインをも含むことを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項 に記載の医薬組成物。 １３．サイトカインが、IL-2、IL-4、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω 、TNF-α、GM-CSFまたはそれらの混合物からなる群より選ばれることを特徴とす る、請求項１２に記載の医薬組成物。 １４．治療される個体の異なるMHCサブタイプに結合するという点で異なる複数 のペプチドを含むことを特徴とする請求項２〜１１のいずれか１項に記載の医薬 組成物。 １５．天然に生ずる免疫原性タンパク質または腫瘍抗原またはそれらの細胞分解 物に由来する１またはそれ以上のペプチドを含むことを特徴とする、請求項２〜 １４のいずれか１項に記載の医薬組成物。 １６．天然に生ずる免疫原性タンパク質または腫瘍抗原またはそれらの細胞分解 物に由来するペプチドと異なる１またはそれ以上のペプチドを含むことを特徴と する、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。 １７．ペプチドが、自己免疫疾患の原因となるタンパク質に由来するペプチドの アンタゴニストである、請求項１に記載の医薬組成物。 １８．アジュバントが有機ポリカチオンまたは有機ポリカチオンの混合物である ことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。 １９．ペプチドが負に帯電していることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬 組成物。 ２０．アジュバントが塩基性ポリアミノ酸または塩基性ポリアミノ酸の混合物で あることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。 ２１．アジュバントがポリアルギニンであることを特徴とする、請求項２０に記 載の医薬組成物。 ２２．アジュバントがポリリジンであることを特徴とする、請求項２０に記載の 医薬組成物。 ２３．アジュバントが細胞リガンドと結合していることを特徴とする請求項１８ 〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。 ２４．リガンドが炭水化物残基であることを特徴とする、請求項２３に記載の医 薬組成物。 ２５．リガンドがフコースであることを特徴とする、請求項２４に記載の医薬組 成物。 ２６．リガンドがトランスフェリンであることを特徴とする、請求項２３に記載 の医薬組成物。 ２７．機能のあるタンパク質をコードする配列を有しないDNAをも含むことを特 徴とする、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。 ２８．免疫調節タンパク質をコードするDNAをも含むことを特徴とする、請求項 １８〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。 ２９．免疫調節タンパク質がIL-2、IL-4、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN -ω、TNF-αまたはGM-CSFからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項２ ８に記載の医薬組成物。 ３０．非経口的投与のための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成 物。 ３１．製薬的に許容できる担体中の、ペプチドおよびアジュバントの溶液または 懸濁液の形態であることを特徴とする、請求項３０に記載の医薬組成物。 ３２．局所的な適用のための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成 物。 ３３．ヒドロゲルの形態である、請求項３２に記載の医薬組成物。