JPWO2017159686A1 - 免疫療法のためのモニタリングまたは診断ならびに治療剤の設計 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産するための方法であって、該方法は:
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のMHC型の情報を解析装置に入力するステップ;
B)該解析装置に、該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップ;ならびに
C)該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するステップ
を包含する、方法。
(2)前記B)ステップは、前記疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを前記解析装置に行わせ候補変異を同定するステップを含み、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型(WT)ペプチドおよび変異型(MT)ペプチドを生産し、その後前記MHC型と、該WTペプチドおよび該MTペプチドとを用いて該解析装置にエピトープ探索を行わせた上で、エピトープの順位付けを行って該解析装置にエピトープリストを出力させることを包含する、上記項目に記載の方法。
(3)前記疾患組織に特異的な変異は、前記被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報に基づいて導出されることを包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(4)前記ゲノムリードは、エキソームリードを包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(5)前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、それぞれ、前記被験体の正常な試料および前記被験体の前記疾患に罹患した試料から得られ、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索し、前記疾患組織に特異的な変異を同定する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(6)前記A)ステップは、さらに前記被験体のRNAリードの情報を前記解析装置に入力することを包含し、前記B)ステップは該解析装置に該RNAリードの情報にも基づいて前記変異に関するエピトープを解析させることを包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(7)前記RNAリードは疾患組織のRNAリードを含み、該疾患組織のRNAリードをマッピングして変異を探索し、および/または発現量を導出するステップをさらに包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(8)前記RNAリードの情報は正常組織のRNAリードを含み、該正常組織のRNAリードをマッピングして体細胞変異を探索し、および/または発現量を導出し、前記疾患組織のRNAリードに基づいて導出された発現量と比較するステップをさらに包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(9)前記MHC型は、前記被験体のゲノムリードから導出される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(10)前記B)ステップは、以下:
B−1)前記解析装置に前記疾患組織に特異的な変異に対して、既存のデータベースに基づくアノテーションおよび核酸アミノ酸変換を行わせて、野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出するステップ;
B−2)前記MHC型、該野生型ペプチドおよび該疾患特異的変異ペプチドを用いて、公知のデータベースを用いて該解析装置に該疾患に特異的なエピトープ探索を行わせるステップ;ならびに
B−3)該解析装置に、得られたエピトープのペプチド配列、MHC情報(遺伝子型および親和性)ならびに変異情報(染色体、位置、変異パターン(野生型/変異型)、信頼性、優先度、および該当遺伝子(遺伝子名、発現量))からスコアを算出させ、優先すべきエピトープの順位付けを行うステップ
から選択される少なくとも1つのステップを包含し、
前記C)ステップは、
C−1)該順位付けに基づきペプチドを生産するステップを包含する、
上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(11)前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は同じ被験体から得られる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(12)前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は異なる被験体から得られる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(13)前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、正常組織および前記疾患の組織から得られる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(14)前記ゲノムリードのマッピングはbwa、bowtie、またはnovoalign、あるいはそれらの組合せを用いて行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(15)前記ゲノムリードの変異の探索は、MuTect、VarScanまたはlofreqあるいはそれらの組合せを含む変異探索プログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(16)前記アノテーションは、refGene、ensEmblから選択される遺伝子構造データベース、および/またはdbSNP、cosmic、1000 genomes、およびwhole exome featuresからなる群より選択される変異既知情報のデータベースを用い、ANNOVARおよびsnpEffからなる群より選択されるプログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(17)前記RNAリードのマッピングは、TopHatおよびSTARからなる群より選択されるプログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(18)前記RNAの変異の探索は、MuTect、VarScan、GATKおよびsamtoolsからなる群より選択される変異探索プログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(19)前記RNAの発現量の導出は、CuffLinksおよびErangeからなる群より選択される変異探索プログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(20)前記MHCタイピングはHLAminer、Athlates、Sting HLA、HLA caller、OptiType、およびomixonからなる群より選択されるソフトウエアを用いて行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(21)前記被験体はヒトであり、前記MHCはHLAである、上記項目のいずれか1項のいずれか1項に記載の方法。
(22)前記エピトープ探索は、NetMHCpan、NetHMC、NetMHCcons,およびPickPocketからなる群より選択されるエピトープ探索プログラムを用いて行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(23)前記順位付けは、前記変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも1つの要素を考慮して行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(24)前記変異の優先順位付けは、ヒットが見出される変異探索プログラムの数の多少およびRNAレベルでの変異の証拠の有無からなる群より選択される少なくとも1つの要素が考慮される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(25)前記遺伝子発現の有無は、前記RNAリードをマッピングし算出されたfpkmもしくはrpkmの値が正であるか否かで判断される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(26)前記ペプチドの優先順位付けは、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数の多少、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の多少およびHLA−ペプチド間のIC50<500nMの値からなる群より選択される少なくとも1つの要素が考慮される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(27)前記順位付けは、HLA−ペプチド間のIC50の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(28)前記疾患は腫瘍または自己免疫疾患である、上記項目のいずれか1項のいずれか1項に記載の方法。
(29)前記ステップA)は、
A−1)前記解析装置に前記被験体のゲノムの配列決定を行って該被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報を得、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索させ、前記疾患組織に特異的な変異を得るステップ、
A−2)該解析装置に該被験体のRNAの配列決定を行って該被験体のRNAリードの情報を得、該疾患組織のRNAリードをマッピングして変異を探索させ、および/または発現量を導出させ、必要に応じて正常組織のRNAリードをマッピングして体細胞変異を探索させ、および/または発現量を導出させ、該疾患組織のRNAリードに基づいて導出された発現量と比較するステップ、および
A−3)該解析装置に必要に応じて該被験体のゲノムリードを用いて該被験体のMHCタイピングを行わせて該被験体のMHC型の情報を得るステップ
からなる群より選択される少なくとも1つを行うことを包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(30)被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する方法であって、
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のMHC型の情報を解析装置に入力するステップ;および
B)該解析装置に該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップを包含する、方法。
(31)上記項目のいずれか1項または複数に記載の特徴をさらに有する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(32)被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産する装置であって、該装置は:
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力する情報入力ユニット;
B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析するエピトープ解析ユニット;ならびに
C)該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するペプチド生産ユニットを包含する、装置。
(33)前記ユニットBにおいて、上記項目のいずれか1項または複数に規定される手順がなされる、上記項目に記載の装置。
(34)前記ユニットAは、前記被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体の疾患組織に特異的な変異を決定する手段、前記被験体のRNAの配列決定手段および前記被験体のMHCタイピングの手段の少なくとも1つを含む、上記項目のいずれか1項に記載の装置。
(35)被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する装置であって、
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力する情報入力ユニット;ならびに
B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するエピトープ解析ユニットを包含する、装置。
(36)前記ユニットBにおいて、上記項目のいずれか1項または複数に規定される手順がなされる、上記項目のいずれか1項に記載の装置。
(37)前記ユニットAは、前記被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体の疾患組織に特異的な変異を決定する手段、前記被験体のRNAの配列決定手段および前記被験体のMHCタイピングの手段の少なくとも1つを含む、上記項目のいずれか1項に記載の装置。
(38)被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力するステップ;ならびに
B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップを包含する、プログラム。
(39)上記項目のいずれか1項または複数に記載の特徴をさらに有する、上記項目に記載のプログラム。
(40)被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを格納したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力するステップ;ならびに
B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップを包含する、記録媒体。
(41)上記項目のいずれか1項または複数に記載の特徴をさらに有する、上記項目に記載の記録媒体。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
1つの局面において、本発明は、被験体における疾患の処置(治療および予防を含む)、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する方法を提供する。この方法は、A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のMHC型の情報を解析装置に入力するステップ;B)該解析装置に、該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップ;ならびにC)該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するステップを包含する。本発明で使用される「解析装置」は、解析すべき情報の入力を受け、解析し、通信などによって他のユニットと連絡を取り、結果を出力する機能などを有し得、(免疫療法解析装置・システム、および解析プログラム)においても詳述されており、その任意の実施形態を採用することができ、各種ユニットはこの解析装置を構成し得る。解析装置の模式的図は図7に示されており、(システム構成)において詳述されている。
1.全ての系統(syngenic)のマウスを対象にして、自然発症、化学発症、放射線発症に由来する腫瘍(癌、肉腫、白血病)に対してネオ抗原の探索が可能である。
2.担癌マウスの癌部位からの組織採取、正常マウスにおいて腫瘍部位と同一臓器・組織の採取を行う。この際には、担癌マウス個体では、腫瘍部位と非腫瘍部位(例えば、大腸癌の際には、腫瘍部位と非腫瘍部位)。マウスは同一系統の場合は、正常組織は正常マウスから採取できる。
3.採取された組織・臓器からDNAおよびRNAを抽出し、エキソームseqおよびRNAseq解析を行う。
4.系統毎にMHC(major histocompatibility complex; 主要組織適合遺伝子複合体)は分かっているため、本発明で使用され得るmutanomeを探索し、更にはMHC(マウスではH−2)上に提示されるネオ抗原を同定する。
5.ネオ抗原の選択に関しては、実施例で例示されるヒト腫瘍で記載している方法論と同一のものを例示することができる。
6.同定されたネオ抗原に対しては、ペプチドを人工的に合成し、同系マウスの脾臓細胞に添加培養して、培養後のIFNγ産生誘導を活性の指標とすることができる。
7.また、ネオ抗原で刺激し培養した脾臓細胞を用いて、腫瘍に対する細胞障害性を測定する。
8.試験管内での検討から、探索されたネオ抗原が腫瘍に対してT細胞の機能的な誘導を起こす事が明確になった場合には以下を行う。
9.すなわち、候補となったネオ抗原を用いたin vivoでの効果を検討する。
10.in vivo効果としては、担癌マウス(ネオ抗原探索に使用した腫瘍を移植したマウス)にネオ抗原を直接投与する。また、樹状細胞療法(in vitroで同系マウス由来の樹状細胞を刺激培養し、その樹状細胞を担癌マウスに投与する)を用いて治療することができる。
別の局面において、本発明は、被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産する装置またはシステムを提供する。この装置またはシステムは、A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力する情報入力ユニット;B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析するエピトープ解析ユニット;ならびにC)該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するペプチド生産ユニットを備える。ここで使用される情報入力ユニット、解析ユニットおよび合成ユニットは、(免疫療法ペプチドを特定および生産する方法)において説明される任意の特徴を備えることができる。本発明において使用される「解析装置」は、情報入力ユニットとエピトープ解析ユニットとを含みうる。さらに、本発明の解析装置は、このほかの機能を有する少なくとも1つのさらなるユニットを含んでいてもよく。これらのユニットは以下に説明される。
次に、図7のブロック図を参照して、本発明のシステムまたは装置の構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示しているが、これらは複数のユニットやコンポーネントから構成されていてもよい。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F. M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al.(1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al.(1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G. T. (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
(解析)
図2に例示されるフローに基づき変異ペプチド選別を行った。
(1)被験体群は以下を用いた。
対象患者:65歳日本人男性の肺ガン患者
本実施例を実施する前に、Luminex法でタイピングして以下のHLA型が同定されている。
HLAタイプ:HLA−A*02:01, 24:02
(2)正常組織および腫瘍組織よりDNA抽出し、イルミナ社シーケンサHiSeq2000により、TruSeq PEキットを用いてエキソームシーケンスした。使用機器はイルミナ社シーケンサHiSeq2000で、使用ソフトウエアは同シーケンサの制御ソフトウエアを使用した。
次に、正常組織および腫瘍組織由来のエキソームリードを、各々、bwaを用いて以下のパラメータでマップした。
algorithm: mem
read mode: paired end
minimum seed length: 19
band width: 100
off diagonal dropoff: 100
match score : 1
mismatch penalty: 4
gap open penalty: 6
gap extension penalty: 1
clipping penalty: 5
unpaired read penalty: 9。
次に、正常組織および腫瘍組織由来のエキソームリードのマップ結果を基に、muTect、VarScan、lofreqを用いて、腫瘍組織特異的な体細胞変異を探索した。
segment length: 16
maximum mismatch: 2
expected mate pair inner distance: 50
standard deviation of mate pair inner distance: 20。
(4)次に、mRNAマッピングの結果得られたデータを変異探索(または体細胞変異探索)および発現量導出を行った。腫瘍組織由来RNAリードのマップ結果を基に、muTect、VarScanを用いて変異を探索した。また、CuffLinksを用いて遺伝子発現量を算出した。
(5)(4)で得られたRNAリードに基づく結果について変異があるものを合わせて解析した。
(6)(2)で得られた腫瘍特異的変異について、遺伝子構造情報のデータベースとしてrefGeneおよびensEmblを用いて変異のアノテーションを実行し候補変異を特定した。特定された候補変異について核酸−アミノ酸返還を行って野生型(WT)ペプチドおよび変異(MT)ペプチドを画定した。
(7)また、次にエキソームリードからomixonを用いてHLAタイピングを実施した。
(8)(6)で得られたWTペプチドとMTペプチドとに加えHLA型の情報を合わせてエピトープ解析を行った。その結果を、以下の表に示す。表中MT配列中にあるハイフンはその間のまたは端部のアミノ酸が正常アミノ酸と比較して変異していることを示す。
HLA allele:HLA対立遺伝子
WT peptide sequence:野生型ペプチド配列
MT peptide sequence:変異型ペプチド配列
Consensus percentile rank:コンセンサスの百分位数ランク
ANN IC50 : artificial neural network法により算出されたIC50 (NetMHCpanにおける最適値)
ANN rank : それをランク値に変換した値
SMM IC50 : stabilized matrix法により算出されたIC50 (算出できない場合はna)
SMM rank : それをランク値に変換した値
comblib sydney2008 score : sydney2008法により算出されたIC50 (算出できない場合はna)
comblib sydney2008 rank : それをランク値に変換した値
mutation information:変異情報
chromosome:染色体
start position:開始位置
end position:終了位置
gene name:遺伝子名
accession:アクセッション番号
exon ID:エキソン番号
position on transcript:転写物における位置
WT NA:野生型における核酸
MT NA:変異型における核酸
start pos. on peptide:ペプチド上の開始位置
mutation pos. on peptide:ペプチド上の変異位置
end pos. on peptide:ペプチド上の終了位置
WT AA:野生型アミノ酸
MT AA:変異型アミノ酸
upstream AA:上流アミノ酸
downstream AA:下流アミノ酸
log likelihood:対数尤度
read depth:読み深さ
num of WT on tumor : 腫瘍組織において、その位置をカバーするWT(変異の無い)リードの数
num of MT on tumor : 同上、MT(変異)リードの数
QV sum of WT on tumor : 腫瘍組織において、その位置をカバーするWTリードのクオリティ値(QV)の総和
QV sum of MT on tumor : 同上、MTリードのQVの総和
num of WT on normal : 正常組織において、その位置をカバーするWTリードの数
num of MT on normal : 同上、MTリードの数
QV sum of WT on normal : 正常組織において、その位置をカバーするWTリードのQVの総和
QV sum of MT on normal : 同上、MTリードのQVの総和
found in RNA : その変異がRNAでもみつかったか否かのフラグ
found by : その変異をコールしたソフトを列挙
all AA changes : アミノ酸置換パターンを、遺伝子名、遺伝子座のアクセッション、核酸変異パターン、アミノ酸変異パターンで記述
cytoband : その位置を染色体バンドの記述形式で示したもの
dbSNP 138 : その変異がdbSNP release.138に登録されている場合は、そのID
cosmic 70 : その変異がcosmid release.70に登録されている場合は、そのID
TSS : その変異が乗る遺伝子のTSS(Transcription Start Site)のID
gene location on genome : その変異の位置、chromosome、start position、end positionを連結しただけ
gene expression (FPKM) : 遺伝子発現量(fragments per kirobase of exon per million mapped reads)
95% conf low : FPKMの95%信頼区間の下限
95% conf high : 同上、上限
status : 発現量算出結果が有効(OK)か、低精度(LOWQUAL)か
解析した結果を以下に示す。
これらの44ペプチドをペプチド合成機にて合成した。本実施例では、以下にその手順を示す。GenScript社(東京、日本)に外注したものを使用した。
被験体資料(腫瘍患者)と同一のHLA−A*02:01を保有する健常人の末梢血を用いた。これに対して製造されたペプチドを用いて反応性の実験を行った。
実施したアッセイは、インターフェロンγELISPOTおよび細胞内インターフェロンγ染色を行った。インターフェロンγELISPOTには、MABTECH anti-human IFN-γ mAb 1-D1K、purified(3420-3-250)を捕捉抗体(Capture antibody)として使用し、MILLIPORE MultiScreen HTS 96-well Filtration Plateを使用した。
(1)サイトカイン(ここでは、インターフェロン−γ)特異的モノクローナル抗体(MABTECH anti-human IFN-γ mAb 1-D1K, purified (3420-3-250))を固層表面に固定化した。ここでは、MILLIPORE MultiScreen HTS 96-well Filtration Plateを使用した。
(2) 洗浄後に1x10*5個の細胞を16時間刺激培養した。分泌されたサイトカインであるインターフェロン−γは、産生細胞の周辺にある捕捉用抗体(Detection antibody ;MABTECH anti-human IFN-γ mAb 7-B6-1, biotinylated(3420-6-250))と結合させた。洗浄により細胞を除去した後、検出用の抗インターフェロンγ抗体を添加した。
(3)次に、BD ELISPOT AEC Substrate Set(551951)で発色させた。この方法により、インターフェロンγ(サイトカイン)産生細胞が位置した場所に相当するスポットを見ることができる。得られたスポットは、カールツァイス KS ELISPOT(ミネルバテック社)でスポット数をカウントし、陽性細胞の頻度を記録した。
また、得られたサンプルについて、細胞内インターフェロンγ染色を行った。5x105個のリンパ球を200μlの培地中で4時間刺激培養した。刺激にはネオ抗原(neoantigen)ペプチド、コントロールペプチドを終濃度1μg/mlになるように添加した。未刺激のコントロールも調製した。刺激中BioLegend Brefeldin A Solution(1,000X)を終濃度5.0μg/mlになるように加えた。培養終了後細胞を回収し、Fixable Viability Dye eFluor780(eBioscience 65-0865-18),FITC 標識抗CD4抗体(BD PharmingenTM557307)、ECD標識抗CD8抗体(BECKMAN COULTER 41116015)、PerCP・CY5.5標識抗CD3抗体(Biolegend 300430)で4℃30分染色した。
インターフェロンγ産生の解析結果を図6に示す。また、各種ペプチドについてインターフェロンγ産生が認められた変異ペプチドを以下にまとめる。表中変更のあるアミノ酸には下線を付した。
本実施例では、マウスを用いた場合でも実施することができる。
1.全ての系統(syngenic)のマウスを対象にして、自然発症、化学発症、放射線発症に由来する腫瘍(癌、肉腫、白血病)に対してネオ抗原の探索が可能である。ここでは、マウス系統:C57BL/6(MHC Haplotype. H2b )を用いて行う。腫瘍としては、腫瘍:B16メラノーマ細胞を用いる。
2.担癌マウスの癌部位からの組織採取、正常マウスにおいて腫瘍部位と同一臓器・組織の採取を行う。この際には、担癌マウス個体では、腫瘍部位と非腫瘍部位(例えば、大腸癌の際には、腫瘍部位と非腫瘍部位と言う意味)。マウスは同一系統の場合は、正常組織は正常マウスから採取する。
3.採取された組織・臓器からDNAおよびRNAを抽出し、エキソームseqおよびRNAseq解析を行う。
4.系統毎にMHC(major histocompatibility complex; 主要組織適合遺伝子複合体)は分かっているため、mutanomeを探索し、更にはMHC(マウスではH−2)上に提示されるネオ抗原を同定する。
5.ネオ抗原の選択に関しては、実施例1でヒト腫瘍で記載している方法論と同一のものを使用する。具体的には、B16メラノーマ細胞と同系のC57BL/6マウスから正常皮膚を採取し、それぞれDNAとRNAを抽出し、エキソームseq・RNAseqを行い、実施例1のネオ抗原探索ソフトにて候補ペプチドを同定する。
6.同定されたネオ抗原に対しては、ペプチドを人工的に合成し、同系マウスの脾臓細胞に添加培養して、培養後のIFNγ産生誘導を活性の指標とする。
7.また、ネオ抗原で刺激し培養した脾臓細胞を用いて、腫瘍に対する細胞障害性を測定する。
8.試験管内での検討から、探索されたネオ抗原が腫瘍に対してT細胞の機能的な誘導を起こす事が明確にする。
9.候補となったネオ抗原を用いたin vivoでの効果を検討する。
10.in vivo効果としては、担癌マウス(ネオ抗原探索に使用した腫瘍を移植したマウス)にネオ抗原を直接投与する。また、樹状細胞療法(in vitroで同系マウス由来の樹状細胞を刺激培養し、その樹状細胞を担癌マウスに投与する)を用いて治療することができる。
1.C57Bl/6マウス由来脾臓細胞を用いたElispotアッセイと細胞障害性を確認後にin vivoでの効果判定を行う。
2.C57BL/6マウスにB16メラノーマ細胞を皮下に移植し(1×106)、また、同数のB16メラノーマ細胞を静脈内投与する。
3.B16皮下投与後に、ネオ抗原(neoantigen)の治療効果に関しては、腫瘍の大きさと生存率を指標とする。
Claims (41)
- 被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産するための方法であって、該方法は:
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のMHC型の情報を解析装置に入力するステップ;
B)該解析装置に、該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップ;ならびに
C)該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するステップ
を包含する、方法。 - 前記B)ステップは、前記疾患組織に特異的な変異を参照情報データベースに基づきアノテーションを前記解析装置に行わせ候補変異を同定するステップを含み、その後、該候補変異の核酸情報をアミノ酸情報に変換して野生型(WT)ペプチドおよび変異型(MT)ペプチドを生産し、その後前記MHC型と、該WTペプチドおよび該MTペプチドとを用いて該解析装置にエピトープ探索を行わせた上で、エピトープの順位付けを行って該解析装置にエピトープリストを出力させることを包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記疾患組織に特異的な変異は、前記被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報に基づいて導出されることを包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノムリードは、エキソームリードを包含する、請求項3に記載の方法。
- 前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、それぞれ、前記被験体の正常な試料および前記被験体の前記疾患に罹患した試料から得られ、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索し、前記疾患組織に特異的な変異を同定する、請求項3に記載の方法。
- 前記A)ステップは、さらに前記被験体のRNAリードの情報を前記解析装置に入力することを包含し、前記B)ステップは該解析装置に該RNAリードの情報にも基づいて前記変異に関するエピトープを解析させることを包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記RNAリードは疾患組織のRNAリードを含み、該疾患組織のRNAリードをマッピングして変異を探索し、および/または発現量を導出するステップをさらに包含する、請求項6に記載の方法。
- 前記RNAリードの情報は正常組織のRNAリードを含み、該正常組織のRNAリードをマッピングして体細胞変異を探索し、および/または発現量を導出し、前記疾患組織のRNAリードに基づいて導出された発現量と比較するステップをさらに包含する、請求項7に記載の方法。
- 前記MHC型は、前記被験体のゲノムリードから導出される、請求項1に記載の方法。
- 前記B)ステップは、以下:
B−1)前記解析装置に前記疾患組織に特異的な変異に対して、既存のデータベースに基づくアノテーションおよび核酸アミノ酸変換を行わせて、野生型ペプチドおよび疾患特異的変異ペプチドの情報を導出するステップ;
B−2)前記MHC型、該野生型ペプチドおよび該疾患特異的変異ペプチドを用いて、公知のデータベースを用いて該解析装置に該疾患に特異的なエピトープ探索を行わせるステップ;ならびに
B−3)該解析装置に、得られたエピトープのペプチド配列、MHC情報(遺伝子型および親和性)ならびに変異情報(染色体、位置、変異パターン(野生型/変異型)、信頼性、優先度、および該当遺伝子(遺伝子名、発現量))からスコアを算出させ、優先すべきエピトープの順位付けを行うステップ
から選択される少なくとも1つのステップを包含し、
前記C)ステップは、
C−1)該順位付けに基づきペプチドを生産するステップを包含する、
請求項2に記載の方法。 - 前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は同じ被験体から得られる、請求項3に記載の方法。
- 前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は異なる被験体から得られる、請求項3に記載の方法。
- 前記ゲノムリードおよびその変異に関する情報は、正常組織および前記疾患の組織から得られる、請求項11または12に記載の方法。
- 前記ゲノムリードのマッピングはbwa、bowtie、またはnovoalign、あるいはそれらの組合せを用いて行われる、請求項5に記載の方法。
- 前記ゲノムリードの変異の探索は、MuTect、VarScanまたはlofreqあるいはそれらの組合せを含む変異探索プログラムを用いて行われる、請求項5に記載の方法。
- 前記アノテーションは、refGene、ensEmblから選択される遺伝子構造データベース、および/またはdbSNP、cosmic、1000 genomes、およびwhole exome featuresからなる群より選択される変異既知情報のデータベースを用い、ANNOVARおよび snpEffからなる群より選択されるプログラムを用いて行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記RNAリードのマッピングは、TopHatおよびSTARからなる群より選択されるプログラムを用いて行われる、請求項7または8に記載の方法。
- 前記RNAの変異の探索は、MuTect、VarScan、GATKおよびsamtoolsからなる群より選択される変異探索プログラムを用いて行われる、請求項7または8に記載の方法。
- 前記RNAの発現量の導出は、CuffLinksおよびErangeからなる群より選択される変異探索プログラムを用いて行われる、請求項7または8に記載の方法。
- 前記MHCタイピングはHLAminer、Athlates、Sting HLA、HLA caller、OptiType、およびomixonからなる群より選択されるソフトウエアを用いて行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記被験体はヒトであり、前記MHCはHLAである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エピトープ探索は、NetMHCpan、NetHMC、NetMHCcons、およびPickPocketからなる群より選択されるエピトープ探索プログラムを用いて行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記順位付けは、前記変異の優先順位付け、遺伝子発現の有無およびペプチドの優先順位付けからなる群より選択される少なくとも1つの要素を考慮して行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記変異の優先順位付けは、ヒットが見出される変異探索プログラムの数の多少およびRNAレベルでの変異の証拠の有無からなる群より選択される少なくとも1つの要素が考慮される、請求項23に記載の方法。
- 前記遺伝子発現の有無は、前記RNAリードをマッピングし算出されたfpkmもしくはrpkmの値が正であるか否かで判断される、請求項23に記載の方法。
- 前記ペプチドの優先順位付けは、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数の多少、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の多少およびHLA−ペプチド間のIC50<500nMの値からなる群より選択される少なくとも1つの要素が考慮される、請求項23に記載の方法。
- 前記順位付けは、HLA−ペプチド間のIC50の値、ヒットが見出されるエピトープ探索プログラムの数、ヒットが見出される変異探索ソフトウエアの数の順に適用することでソートされる、請求項23に記載の方法。
- 前記疾患は腫瘍または自己免疫疾患である、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップA)は、
A−1)前記解析装置に前記被験体のゲノムの配列決定を行って該被験体のゲノムリードおよびその変異に関する情報を得、該ゲノムリードおよびその変異に関する情報をマッピングした後前記疾患組織に特異的な変異を探索させ、前記疾患組織に特異的な変異を得るステップ、
A−2)該解析装置に該被験体のRNAの配列決定を行って該被験体のRNAリードの情報を得、該疾患組織のRNAリードをマッピングして変異を探索させ、および/または発現量を導出させ、必要に応じて正常組織のRNAリードをマッピングして体細胞変異を探索させ、および/または発現量を導出させ、該疾患組織のRNAリードに基づいて導出された発現量と比較するステップ、および
A−3)該解析装置に必要に応じて該被験体のゲノムリードを用いて該被験体のMHCタイピングを行わせて該被験体のMHC型の情報を得るステップ
からなる群より選択される少なくとも1つを行うことを包含する、請求項1に記載の方法。 - 被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する方法であって、
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、および該被験体のMHC型の情報を解析装置に入力するステップ;および
B)該解析装置に該疾患組織に特異的な変異に関する情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析させるステップを包含する、方法。 - 請求項2〜29のいずれか1項または複数に記載の特徴をさらに有する、請求項30に記載の方法。
- 被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを生産する装置であって、該装置は:
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力する情報入力ユニット;
B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析するエピトープ解析ユニット;ならびに
C)該エピトープの情報に基づいてペプチドを生産するペプチド生産ユニット
を包含する、装置。 - 前記ユニットBにおいて、請求項2〜29のいずれか1項または複数に規定される手順がなされる、請求項32に記載の装置。
- 前記ユニットAは、前記被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体の疾患組織に特異的な変異を決定する手段、前記被験体のRNAの配列決定手段および前記被験体のMHCタイピングの手段の少なくとも1つを含む、請求項32に記載の装置。
- 被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定する装置であって、
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力する情報入力ユニット;ならびに
B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するエピトープ解析ユニット
を包含する、装置。 - 前記ユニットBにおいて、請求項2〜29のいずれか1項または複数に規定される手順がなされる、請求項35に記載の装置。
- 前記ユニットAは、前記被験体のゲノムを配列決定する手段、前記被験体の疾患組織に特異的な変異を決定する手段、前記被験体のRNAの配列決定手段および前記被験体のMHCタイピングの手段の少なくとも1つを含む、請求項35に記載の装置。
- 被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力するステップ;ならびに
B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップ
を包含する、
プログラム。 - 請求項2〜29のいずれか1項または複数に記載の特徴をさらに有する、請求項38に記載のプログラム。
- 被験体における疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドを特定するための方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを格納したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
A)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該被験体のRNAリードの情報および該被験体のMHC型の情報を入力するステップ;ならびに
B)該被験体の疾患組織に特異的な変異に関する情報、必要に応じて該mRNA配列情報、該MHC型の情報、および該疾患の情報に基づいて、該変異に関するエピトープを解析し、その結果を該疾患の処置、モニタリングまたは診断のためのペプチドとして出力するステップ
を包含する、
記録媒体。 - 請求項2〜29のいずれか1項または複数に記載の特徴をさらに有する、請求項40に記載の記録媒体。
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