JPWO2015075939A1 - T細胞受容体およびb細胞受容体レパトアの解析システムならびにその治療および診断への利用 - Google Patents
T細胞受容体およびb細胞受容体レパトアの解析システムならびにその治療および診断への利用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
<インシリコ>
1つの局面では、本発明は、生体試料に由来する一群の発現TCRもしくはBCR遺伝子配列を元に、そのTCRもしくはBCRレパトアを解析する手法に関する。
<1>TCRもしくはBCRレパトアを解析する方法であって、以下のステップ:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出するステップ;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップ;
(6)(5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出するステップ;
を包含する、方法。
<2>前記遺伝子領域は、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の全部を含む、項目<1>に記載の方法。
<3>前記参照データベースは、各配列に一意のIDが割り振られたデータベースである、項目<1>〜<2>のいずれか1項に記載の方法。
<4>前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである、項目<1>〜<3>のいずれか1項に記載の方法。
<5>前記配列セットはトリミングされたものである、項目<1>〜<4>のいずれか1項に記載の方法。
<6> 前記トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し;リード両端からアダプタ配列と10bp以上マッチする領域を削除し;および残った長さが200bp以上(TCR)もしくは300bp以上(BCR)なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される、項目<1>〜<5>のいずれか1項に記載の方法。
<7>前記低クオリティーは、QV値の7bp移動平均が30未満のものである、項目<6>に記載の方法。
<8>前記近似する配列は、最も近しい配列である、項目<1>〜<7>のいずれか1項に記載の方法。
<9>前記近似する配列は、1. 一致塩基数、2. カーネル長、3. スコア、4. アラインメント長の順位によって決定される、項目<1>〜<8>のいずれか1項に記載の方法。
<10>前記相同性検索は、ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件で行われる、項目<1>〜<9>のいずれか1項に記載の方法。
<11>前記相同性検索は、デフォルト条件に比べて(1)ウィンドウサイズの短縮、(2)ミスマッチペナルティの低減、(3)ギャップペナルティの低減および(4)指標の優先順位のトップが一致塩基数の少なくとも1つの条件を含む、項目<1>〜<10>のいずれか1項に記載の方法。
<12>前記相同性検索は、BLASTまたはFASTAにおいて以下の条件
V ミスマッチペナルティ=−1、最短アラインメント長=30、最短カーネル長=15
D ワード長=7(BLASTの場合)またはK−tup=3(FASTAの場合)、ミスマッチペナルティ=−1、ギャップペナルティ=0、
最短アラインメント長=11、最短カーネル長=8
J ミスマッチペナルティ=−1、最短ヒット長=18、最短カーネル長=10
C 最短ヒット長=30、最短カーネル長=15
で実施される、項目<1>〜<11>のいずれか1項に記載の方法。
<13>前記D領域の分類は、前記アミノ酸配列の出現頻度によってなされる、項目<1>〜<12>のいずれか1項に記載の方法。
<14>前記ステップ(5)において、D領域の参照データベースが存在する場合は、前記CDR3の核酸配列との相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする、項目<1>〜<13>のいずれか1項に記載の方法。
<15>前記ステップ(5)において、D領域の参照データベースが存在しない場合、前記アミノ酸配列の出現頻度のみによって分類がなされる、項目<1>〜<14>のいずれか1項に記載の方法。
<16>前記出現頻度は、遺伝子名単位および/またはアリル単位でなされる、項目<1>〜<15>のいずれか1項に記載の方法。
<17>前記ステップ(4)は該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、参照V領域上のCDR3先頭および参照J上のCDR3末尾を目印に、CDR3配列を抽出するステップを包含する、項目<1>〜<16>のいずれか1項に記載の方法。
<18>前記ステップ(5)は、該CDR3の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップを包含する、項目<1>〜<17>のいずれか1項に記載の方法。
<19>TCRもしくはBCRレパトアを解析するシステムであって、該システムは:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段;
(6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段;
を包含する、システム。
<19A>項目<1>〜<18>のいずれか1項または複数の特徴を有する、項目<19>に記載のシステム。
<20>TCRもしくはBCRレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであって、該方法は以下のステップ:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出するステップ;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップ;
(6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出するステップ;
を包含する、プログラム。
<20A>項目<1>〜<18>のいずれか1項または複数の特徴を有する、項目<20>に記載のプログラム。
<21>TCRもしくはBCRレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は以下のステップ:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出するステップ;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップ;
(6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出するステップ;
を包含する、記録媒体。
<21A>項目<1>〜<18>のいずれか1項または複数の特徴を有する、項目<21>に記載の記録媒体。
<ウェット>
別の局面では、本発明は、(1)複数のゲノム上の遺伝子断片から遺伝子再構成により生成されたTCRまたはBCR遺伝子配列を、バイアスをかけることなく均一に増幅する技術(非バイアス遺伝子増幅技術)、(2)その非バイアス遺伝子増幅技術により増幅したTCRまたはBCR遺伝子を次世代シーケンス法により大規模に塩基配列決定し、V、D、J、C領域のアサインメントを行ってTCRレパトアやBCRレパトアを解析する手法である。
<A1>データベースを用いた遺伝子配列解析により、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)の定量解析を行うための試料を調製するための方法であって、
(1)標的となる細胞に由来するRNA試料を鋳型として相補的DNAを合成する工程;
(2)該相補的DNAを鋳型として二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(3)該二本鎖相補的DNAに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(4)該アダプター付加二本鎖相補的DNAと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第1のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、
該TCRまたはBCRの目的とするC領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
(5)(4)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第2のPCR増幅反応を行う工程であって、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程;および
(6)(5)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第1の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第2の追加アダプター核酸配列および分子同定(MID Tag)配列を第3のTCRまたはBCRのC領域特異的配列に付加したアダプター付の第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第3のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
該第1の追加アダプター核酸配列は、DNA捕捉ビーズへの結合およびemPCR反応に適切な配列であり、
該第2の追加アダプター核酸配列は、emPCR反応に適切な配列であり、
該分子同定(MID Tag)配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程;
を包含する、方法。
<A2>BCRである場合、前記C領域特異的プライマーは、IgM、IgA、IgG、IgEおよびIgDからなる群より選択される目的とするアイソタイプC領域に完全マッチの配列を含み、かつ他のC領域に相同性を持たず、IgAまたはIgGについては、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4のいずれか、またはIgA1もしくはIgA2のいずれかであるサブタイプに完全マッチする配列であるか、あるいはTCRである場合、前記C領域特異的プライマーは、α鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖からなる群より選択される目的とする鎖のC領域に完全マッチし、かつ他のC領域に相同性を持たない配列である、項目<A1>に記載の方法。
<A3>前記C領域特異的プライマーは、前記データベース中の同じアイソタイプのC領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列部分を選択する、項目1または<A2>に記載の方法。
<A4>前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して2本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのTCR遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該C領域特異的プライマーと同じ程度の融解温度(Tm)になるように設計される、項目<A1>〜<A3>のいずれか1項に記載の方法。
<A5>前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造をとらないよう設計され、BCRまたはTCRを含む他の遺伝子に対して相同性がないものを選択される、項目<A4>に記載の方法。
<A6>前記共通アダプタープライマーは、P20EA(配列番号2)および/またはP10EA(配列番号3)である、項目<A5>に記載の方法。
<A7> 前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、BCRのレパトア解析のためのものであり、IgM,IgG,IgA,IgD,またはIgEの各アイソタイプC領域に完全マッチする配列であって、該IgGおよびIgAの場合は、サブタイプについても完全マッチし、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、
該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して2本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのTCR遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該C領域特異的プライマーと同じ程度のTmになるように設計される、項目<A1>〜<A6>のいずれか1項に記載の方法。
<A8> 前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、TCRまたはBCRのレパトア解析のためのものであり、各プライマーは1種のα鎖(TRAC)、2種のβ鎖(TRBC01およびTRBC02)、2種のγ鎖(TRGC1およびTRGC2)、1種のδ鎖(TRDC1)に対して完全マッチする配列であり、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、
該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して2本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのTCR遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該C領域特異的プライマーと同じ程度のTmになるように設計される項目<A1>〜<A7>のいずれか1項に記載の方法。
<A9>前記第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーはC領域5’末端側から約150塩基までの領域に設定され、第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーおよび第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーはC領域5’末端側から約300塩基までの間に設定される、項目<A1>〜<A8>のいずれか1項に記載の方法。
<A10>前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、BCRの定量解析を行うためのものであり、
5種のアイソタイプ配列には別個に特異的プライマーを設定し、標的配列には完全マッチして、かつ他のアイソタイプには5塩基以上のミスマッチを確保するよう設計され、類似するIgGサブタイプ(IgG1,IgG2,IgG3およびIgG4)あるいはIgAサブタイプ(IgA1およびIgA2)に対しては、それぞれ1種のプライマーで対応できるようすべてのサブタイプに完全マッチするよう設計される、項目<A1>〜<A9>のいずれか1項に記載の方法。
<A11>プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長18―22塩基、融解温度54−66℃、%GC(%グアニン・シトシン含量)は40−65%に設定される、項目<A1>〜<A10>のいずれか1項に記載の方法。
<A12>プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長18―22塩基、融解温度54−66℃、%GC(%グアニン・シトシン含量)は40−65%に設定し、自己アニーリングスコア26、自己末端アニーリングスコア10、二次構造スコア28に設定される、項目<A1>〜<A11>のいずれか1項に記載の方法。
<A13>以下の条件
1.複数のサブタイプ配列および/またはアレル配列を塩基配列解析ソフトに取り込み、アライメントすること;
2.プライマーデザイン用のソフトウェアを用いて、C領域内にパラメータ条件を満たすプライマーを複数検索すること;
3.1のアライメント配列の中で不一致塩基のない領域にあるプライマーを選択すること;
4.3により決定されたプライマーの下流に各サブタイプおよび/またはアレル毎に不一致配列が複数あることを確認し、ない場合は、さらに上流にプライマーを検索し、必要に応じてさらにこれを反復すること
により、前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列が決定される、項目<A1>〜<A12>のいずれか1項に記載の方法。
<A14>第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、スプライシングにより生じるC領域配列の第一コドンの第一塩基を基準として41−300塩基まで、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として21−300塩基まで、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として150塩基以内で、かつサブタイプおよび/またはアレルの不一致部位を含む位置で設定される、項目<A1>〜<A13>のいずれか1項に記載の方法。
<A15>第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM1(配列番号5)、CA1(配列番号8)、CG1(配列番号11)、CD1(配列番号14)、CE1(配列番号17)、CA1(配列番号35)、またはCB1(配列番号37)を有する、項目<A1>〜<A14>のいずれか1項に記載の方法。
<A16>第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM2(配列番号6)、CA2(配列番号9)、CG2(配列番号12)、CD2(配列番号15)、CE2(配列番号18)、CA2(配列番号35)、またはCB2(配列番号37)を有する、項目<A1>〜<A15>のいずれか1項に記載の方法。
<A17>第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM3−GS(配列番号7)、CA3−GS(配列番号10)、CG3−GS(配列番号13)、CD3−GS(配列番号16)またはCE3−GS(配列番号19)を有する、項目<A1>〜<A16>のいずれか1項に記載の方法。
<A18>前記TCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、いずれも、TCRまたはBCRのすべてのサブクラスに対応するセットで提供される、項目<A1>〜<A17>のいずれか1項に記載の方法。
<A19>項目<A1>〜<A18>のいずれか1項に記載の方法で製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法。
<A20> 前記遺伝子解析は、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)の定量解析である、項目<A19>に記載の方法。
<解析システム>
<B1>データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析する方法であって、該方法は、
(1)該被験者から非バイアス的に増幅した、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程;
(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程;および
(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程
を包含する、方法。
<B2>前記核酸試料は、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含み、前記(2)は単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、項目<B1>に記載の方法。
<B3>前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がC領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする、項目<B2>に記載の方法。
<B4>前記単一の配列決定は、共通アダプタープライマーを用いて行われることを特徴とする、項目<B2>または<B3>に記載の方法。
<B5>前記非バイアス的な増幅が、V領域特異的な増幅ではない、項目<B1>〜<B4>のいずれか1項に記載の方法。
<B6>前記レパトアはBCRの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はBCRの核酸配列である、項目<B1>〜<B5>のいずれか1項に記載の方法。
<B7>項目<B1>〜<B6>のいずれか1項に基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する方法。
<B8>前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍および大腸がんからなる群より選択される、項目<B7>に記載の方法。
<B9>項目<B7>または<B8>に記載の方法で決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける工程、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する工程を含む、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するための方法。
<B10>前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍および大腸がんからなる群より選択される、項目<B9>に記載の方法。
<B11>データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
(1)該被験者から非バイアス的に増幅した、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット;
(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置;および
(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出するための装置
を備えるシステム。
<B12>前記核酸試料は、前記核酸配列を複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含み、前記(2)は単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、項目<B11>に記載のシステム。
<B13>前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がC領域と同一配列を有することを特徴とする、項目<B12>に記載のシステム。
<B14>前記単一の配列決定は、共通アダプタープライマーを用いて行われることを特徴とする、項目<B12>または<B13>に記載のシステム。
<B15>前記非バイアス的な増幅が、V領域特異的な増幅ではない、項目<B11>〜<B14>のいずれか1項に記載のシステム。
<B16>前記レパトアはBCRの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はBCRの核酸配列である、項目<B11>〜<B15>のいずれか1項に記載のシステム。
<B17>項目<B11>〜<B16>のいずれか1項に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するシステム。
<B18>前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍および大腸がんからなる群より選択される、項目<B17>に記載のシステム。
<B19>項目<B17>または<B18>に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。
<B20>前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍および大腸がんからなる群より選択される、項目<B19>に記載のシステム。
<B21>TRAV10/TRAJ15/CVVRATGTALIFG(配列番号1450)もしくはこれをコードする核酸を含むTCRα、および/またはTRBV29−1/TRBJ2−7/CSVERGGSLGEQYFG(配列番号1500)もしくはこれをコードする核酸を含むTCRβを発現する、T細胞大顆粒リンパ球性白血病(T−LGL)に関するモノクローナルなT細胞。
<B22>TCRαにおいてTRAV10/TRAJ15/CVVRATGTALIFG(配列番号1450)もしくはこれをコードする核酸、および/またはTCRβにおいてTRBV29−1/TRBJ2−7/CSVERGGSLGEQYFG(配列番号1500)もしくはこれをコードする核酸の、T細胞大顆粒リンパ球性白血病(T−LGL)の診断指標としての使用。
<B23>TCRαにおいてTRAV10/TRAJ15/CVVRATGTALIFG(配列番号1450)もしくはこれをコードする核酸、および/またはTCRβにおいてTRBV29−1/TRBJ2−7/CSVERGGSLGEQYFG(配列番号1500)もしくはこれをコードする核酸を検出する工程を包含する、T細胞大顆粒リンパ球性白血病(T−LGL)の検出する方法。
<B24>TCRαにおけるTRAV10/TRAJ15/CVVRATGTALIFG(配列番号1450)またはこれをコードする核酸の検出剤、および/またはTCRβにおけるTRBV29−1/TRBJ2−7/CSVERGGSLGEQYFG(配列番号1500)またはこれをコードする核酸の検出剤。
<B25>TCRαにおけるTRAV10/TRAJ15/CVVRATGTALIFG(配列番号1450)またはこれをコードする核酸の検出剤、および/またはTCRβにおけるTRBV29−1/TRBJ2−7/CSVERGGSLGEQYFG(配列番号1500)またはこれをコードする核酸の検出剤を含む、T細胞大顆粒リンパ球性白血病(T−LGL)の診断薬。
<B26>配列番号1627〜1647に示す配列のいずれかを含む、新規インバリアントTCRであるペプチド。
<B27>配列番号1648〜1651、1653〜1654、1666〜1667、1844〜1848、および1851からなる群より選択されるの配列を含む、粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞の指標であるペプチド。
<B28>項目<B27>に記載のペプチドをコードする核酸。
<B29>項目<B27>または<B28>に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸の、大腸がんの診断指標としての使用。
<B30>配列番号1668に示す配列を含む、ナチュラルキラーT細胞(NKT)の指標であるペプチド。
<B31>項目<B30>に記載のペプチドをコードする核酸。
<B32>項目<B30>または<B31>に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸の、大腸がんの診断指標としての使用。
<B33>配列番号1652、1655〜1665、1669〜1843、1849〜1850、および1852〜1860からなる群より選択される配列を含む、大腸がん特異的であるペプチド。
<B34>項目<B33>に記載のペプチドをコードする核酸。
<B35>項目<B33>または<B34>に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸の、大腸がんの診断指標としての使用。
<B36>配列番号1861〜1865、および1867〜1909からなる群より選択される配列を含む、大腸がん特異的であるペプチド
<B37>項目<B36>に記載のペプチドをコードする核酸。
<B38>項目<B36>または<B37>に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸の、大腸がんの診断指標としての使用。
<B39>項目<B33>、<B34>、<B36>または<B37>に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸配列を有するT細胞を高頻度に誘導した細胞集団、T細胞株、または組み換え発現させたT細胞。
<B40>項目<B39>に記載の細胞集団、T細胞株またはT細胞を含む大腸がんの治療剤。
<B41>項目<B39>に記載の細胞集団、T細胞株またはT細胞を用いる大腸がんの治療または予防のための方法。
<B42>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>のいずれか1項に記載のシステムを用いて、V遺伝子の使用頻度を検出する方法。
<B43>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、J遺伝子の使用頻度を検出する方法。
<B44>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、サブタイプの頻度解析(BCR)の使用頻度を検出する方法。
<B45>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、CDR3配列長のパターンを分析する方法。
<B46>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、TCRあるいはBCRのクローナリティを分析する方法。
<B47>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、重複リードを抽出する方法。
<B48>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、疾患特異的TCRあるいはBCRクローンを検索する方法。
<B49>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、多様性指数を使って対象を分析する方法。
<B50>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、多様性指数を使って対象を分析を支援する方法。
<B51>骨髄移植後の免疫系の回復度を測る指標、または、造血器腫瘍に伴う免疫系細胞の異常を検出する指標として前記多様性指数を使用する、項目<B49>または<B50>に記載の方法。
<B52>前記多様性指数は、Shannon−Wienerの多様性指数(H’)、Simpsonの多様性指数(λ、1−λあるいは1/λ)、Pielou均等度指数(J’)およびChao1指数からなる群より選択されるものである、項目<B49>または<B50>に記載の方法。
<B53>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、類似性指数を使って対象を分析する方法。
<B54>項目<B1>〜<B10>のいずれか1項に記載の方法、または項目<B11>〜<B20>に記載のシステムを用いて、類似性指数を使って対象を分析を支援する方法。
<B55>HLA型一致あるいは不一致間のレパトアの類似度の評価、骨髄移植後のレシピエントとドナー間のレパトアの類似度の評価として前記類似性指数を使用する、項目<B53>または<B54>に記載の方法。
<B56>前記類似性指数は、Morisita―Horn指数、木元のCπ指数およびPiankaのα指数からなる群より選択されるものである、項目<B53>または<B54>に記載の方法。
<B57>前記(1)は、以下の工程
(1−1)標的となる細胞に由来するRNA試料を鋳型として相補的DNAを合成する工程;
(1−2)該相補的DNAを鋳型として二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(1−3)該二本鎖相補的DNAに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(1−4)該アダプター付加二本鎖相補的DNAと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第1のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該TCRまたはBCRの目的とするC領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
(1−5)(1−4)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第2のPCR増幅反応を行う工程であって、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程;および
(1−6)(1−5)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第1の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第2の追加アダプター核酸配列および分子同定(MID Tag)配列を第3のTCRまたはBCRのC領域特異的配列に付加したアダプター付の第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第3のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
該第1の追加アダプター核酸配列は、DNA捕捉ビーズへの結合およびemPCR反応に適切な配列であり、
該第2の追加アダプター核酸配列は、emPCR反応に適切な配列であり、
該分子同定(MID Tag)配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程;
を包含する、
項目<B1>に記載の方法。
<B58>前記(1)キットは、以下:
(1−1)標的となる細胞に由来するRNA試料を鋳型として相補的DNAを合成する手段;
(1−2)該相補的DNAを鋳型として二本鎖相補的DNAを合成する手段;
(1−3)該二本鎖相補的DNAに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的DNAを合成する手段;
(1−4)該アダプター付加二本鎖相補的DNAと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第1のPCR増幅反応を行う手段であって、
該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該TCRまたはBCRの目的とするC領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段
(1−5)(1−4)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第2のPCR増幅反応を行う手段であって、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段;および
(1−6)(1−5)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第1の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第2の追加アダプター核酸配列および分子同定(MID Tag)配列を第3のTCRまたはBCRのC領域特異的配列に付加したアダプター付の第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第3のPCR増幅反応を行う手段であって、
該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
該第1の追加アダプター核酸配列は、DNA捕捉ビーズへの結合およびemPCR反応に適切な配列であり、
該第2の追加アダプター核酸配列は、emPCR反応に適切な配列であり、
該分子同定(MID Tag)配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、手段;
を包含する、
項目<B11>に記載のシステム。
<B58−2>BCRである場合、前記C領域特異的プライマーは、IgM、IgA、IgG、IgEおよびIgDからなる群より選択される目的とするアイソタイプC領域に完全マッチの配列を含み、かつ他のC領域に相同性を持たず、IgAまたはIgGについては、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4のいずれか、またはIgA1もしくはIgA2のいずれかであるサブタイプに完全マッチする配列であるか、あるいはTCRである場合、前記C領域特異的プライマーは、α鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖からなる群より選択される目的とする鎖のC領域に完全マッチし、かつ他のC領域に相同性を持たない配列である、項目<B57>に記載の方法または<B58>に記載のシステム。
<B58−3>前記C領域特異的プライマーは、前記データベース中の同じアイソタイプのC領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列部分を選択する、項目<B57>もしくは<B58−2>に記載の方法または<B58>もしくは<B58−2>に記載のシステム。
<B58−4>前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して2本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのTCR遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該C領域特異的プライマーと同じ程度の融解温度(Tm)になるように設計される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−3>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−3>のいずれかに記載のシステム。
<B58−5>前記共通アダプタープライマーは、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造をとらないよう設計され、BCRまたはTCRを含む他の遺伝子に対して相同性がないものを選択される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−4>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−4>のいずれかに記載のシステム。
<B58−6>前記共通アダプタープライマーは、P20EA(配列番号2)および/またはP10EA(配列番号3)である、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−5>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−5>のいずれかに記載のシステム。
<B58−7> 前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、BCRのレパトア解析のためのものであり、IgM,IgG,IgA,IgD,またはIgEの各アイソタイプC領域に完全マッチする配列であって、該IgGおよびIgAの場合は、サブタイプについても完全マッチし、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、
該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して2本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのTCR遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該C領域特異的プライマーと同じ程度のTmになるように設計される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−6>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−6>のいずれかに記載のシステム。
<B58−8> 前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、TCRまたはBCRのレパトア解析のためのものであり、各プライマーは1種のα鎖(TRAC)、2種のβ鎖(TRBC01およびTRBC02)、2種のγ鎖(TRGC1およびTRGC2)、1種のδ鎖(TRDC1)に対して完全マッチする配列であり、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択され、
該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して2本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのTCR遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該C領域特異的プライマーと同じ程度のTmになるように設計される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−7>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−7>のいずれかに記載のシステム。
<B58−9>前記第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーはC領域5’末端側から約150塩基までの領域に設定され、第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーおよび第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーはC領域5’末端側から約300塩基までの間に設定される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−8>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−8>に記載のシステム。
<B58−10>前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、BCRの定量解析を行うためのものであり、
5種のアイソタイプ配列には別個に特異的プライマーを設定し、標的配列には完全マッチして、かつ他のアイソタイプには5塩基以上のミスマッチを確保するよう設計され、類似するIgGサブタイプ(IgG1,IgG2,IgG3およびIgG4)あるいはIgAサブタイプ(IgA1およびIgA2)に対しては、それぞれ1種のプライマーで対応できるようすべてのサブタイプに完全マッチするよう設計される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−9>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−9>のいずれかに記載のシステム。
<B58−11>プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長18―22塩基、融解温度54−66℃、%GC(%グアニン・シトシン含量)は40−65%に設定される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−10>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−10>のいずれかに記載のシステム。
<B58−12>プライマー設計におけるパラメータは、塩基配列長18―22塩基、融解温度54−66℃、%GC(%グアニン・シトシン含量)は40−65%に設定し、自己アニーリングスコア26、自己末端アニーリングスコア10、二次構造スコア28に設定される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−11>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−11>のいずれかに記載のシステム。
<B58−13>以下の条件
1.複数のサブタイプ配列および/またはアレル配列を塩基配列解析ソフトに取り込み、アライメントすること;
2.プライマーデザイン用のソフトウェアを用いて、C領域内にパラメータ条件を満たすプライマーを複数検索すること;
3.1のアライメント配列の中で不一致塩基のない領域にあるプライマーを選択すること;
4.3により決定されたプライマーの下流に各サブタイプおよび/またはアレル毎に不一致配列が複数あることを確認し、ない場合は、さらに上流にプライマーを検索し、必要に応じてさらにこれを反復すること
により、前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列が決定される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−12>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−12>のいずれかに記載のシステム。
<B58−14>第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、スプライシングにより生じるC領域配列の第一コドンの第一塩基を基準として41−300塩基まで、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として21−300塩基まで、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは該第一塩基を基準として150塩基以内で、かつサブタイプおよび/またはアレルの不一致部位を含む位置で設定される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−13>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−13>のいずれかに記載のシステム。
<B58−15>第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM1(配列番号5)、CA1(配列番号8)、CG1(配列番号11)、CD1(配列番号14)、CE1(配列番号17)、CA1(配列番号35)、またはCB1(配列番号37)を有する、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−14>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−14>のいずれかに記載のシステム。
<B58−16>第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM2(配列番号6)、CA2(配列番号9)、CG2(配列番号12)、CD2(配列番号15)、CE2(配列番号18)、CA2(配列番号35)、またはCB2(配列番号37)を有する、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−15>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−15>のいずれかに記載のシステム。
<B58−17>第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM3−GS(配列番号7)、CA3−GS(配列番号10)、CG3−GS(配列番号13)、CD3−GS(配列番号16)またはCE3−GS(配列番号19)を有する、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−16>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−16>のいずれかに記載のシステム。
<B58−18>前記TCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、いずれも、TCRまたはBCRのすべてのサブクラスに対応するセットで提供される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−17>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−17>に記載のシステム。
<B58−19>項目<B57>および<B58−2>〜<B58−18>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−18>のいずれかに記載のシステムで製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法またはシステム。
<B58−20> 前記遺伝子解析は、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)の定量解析である、項目<B58−19>のいずれかに記載の方法またはシステム。
<B59>(3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出は以下の工程
(3−1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程:
(3−2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程;
(3−3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程;
(3−4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する工程;
(3−5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する工程;
(3−6)(3−5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する工程;
を包含する方法によって達成される、項目<B57>および<B58−2>〜<B58−20>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>のいずれかに記載のシステム。
<B60>(3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は以下
(3−1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段:
(3−2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段;
(3−3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段;
(3−4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段;
(3−5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段;
(3−6)(3−5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段;
を備える、項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>または59に記載のシステム。
<B60−2>前記遺伝子領域は、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の全部を含む、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>および<B59>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>および<B60>のいずれかに記載のシステム。
<B60−3>前記参照データベースは、各配列に一意のIDが割り振られたデータベースである、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−2>のいずれかに記載のシステム。
<B60−4>前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−3>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−3>のいずれかに記載のシステム。
<B60−5>前記配列セットはトリミングされたものである、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−4>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−4>のいずれかに記載のシステム。
<B60−6> 前記トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し;リード両端からアダプタ配列と10bp以上マッチする領域を削除し;および残った長さが200bp以上(TCR)もしくは300bp以上(BCR)なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−5>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−5>のいずれかに記載のシステム。
<B60−7>前記低クオリティーは、QV値の7bp移動平均が30未満のものである、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−6>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−6>のいずれかに記載のシステム。
<B60−8>前記近似する配列は、最も近しい配列である、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−7>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−7>のいずれかに記載のシステム。
<B60−9>前記近似する配列は、1. 一致塩基数、2. カーネル長、3. スコア、4. アラインメント長の順位によって決定される、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−8>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−8>のいずれかに記載のシステム。
<B60−10>前記相同性検索は、ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件で行われる、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−9>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−9>のいずれかに記載のシステム。
<B60−11>前記相同性検索は、デフォルト条件に比べて(1)ウィンドウサイズの短縮、(2)ミスマッチペナルティの低減、(3)ギャップペナルティの低減および(4)指標の優先順位のトップが一致塩基数の少なくとも1つの条件を含む、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−10>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−10>のいずれかに記載のシステム。
<B60−12>前記相同性検索は、BLASTまたはFASTAにおいて以下の条件
V ミスマッチペナルティ=−1、最短アラインメント長=30、最短カーネル長=15
D ワード長=7(BLASTの場合)またはK−tup=3(FASTAの場合)、ミスマッチペナルティ=−1、ギャップペナルティ=0、
最短アラインメント長=11、最短カーネル長=8
J ミスマッチペナルティ=−1、最短ヒット長=18、最短カーネル長=10
C 最短ヒット長=30、最短カーネル長=15
で実施される、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−11>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−11>のいずれかに記載のシステム。
<B60−13>前記D領域の分類は、前記アミノ酸配列の出現頻度によってなされる、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−12>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−12>のいずれかに記載のシステム。
<B60−14>前記ステップ(5)において、D領域の参照データベースが存在する場合は、前記CDR3の核酸配列との相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−13>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−13>のいずれかに記載のシステム。
<B60−15>前記ステップ(5)において、D領域の参照データベースが存在しない場合、前記アミノ酸配列の出現頻度のみによって分類がなされる、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−14>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−14>のいずれかに記載のシステム。
<B60−16>前記出現頻度は、遺伝子名単位および/またはアリル単位でなされる、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−15>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−15>のいずれかに記載のシステム。
<B60−17>前記ステップ(4)は該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、参照V領域上のCDR3先頭および参照J上のCDR3末尾を目印に、CDR3配列を抽出するステップを包含する、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−16>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−16>のいずれかに記載のシステム。
<B60−18>前記ステップ(5)は、該CDR3の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップを包含する、項目<B57>、<B58−2>〜<B58−20>、<B59>および<B60−2>〜<B60−17>のいずれかに記載の方法または<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−17>のいずれかに記載のシステム。
<B60−19>(3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は以下
(3−1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段:
(3−2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段;
(3−3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段;
(3−4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段;
(3−5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段;
(3−6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段;
を包含する、項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>または<B59>、<B60>〜<B60−18>のいずれかにに記載のシステム。
<B60−20>
前記TCRもしくはBCRレパトアを解析する方法の処理は、以下のステップ:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出するステップ;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップ;
(6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出するステップ;
を含むコンピュータに実行させるコンピュータプログラムによって実現される、
項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−19>のいずれかに記載のシステム。
<B60−21>TCRもしくはBCRレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させる項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、<B60>〜<B60−20>のいずれかに記載のシステムであって、該方法は以下のステップ:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出するステップ;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップ;
(6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出するステップ;
を包含する、システム。
<C1>
被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法を付与する方法であって、該方法は、
(1)項目<B1>〜<B10>、<B57>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載の方法および/または項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載のシステムによって、該被験者のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)レパトアを解析する工程;
(2)該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のTCRまたはBCRを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のTCRまたはBCR遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のTCRまたはBCRとして選択することによってなされる、工程;
(3)決定された該がん由来のTCRまたはBCRに基づいて、HLA検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、HLA結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程;
(4)決定されたペプチドを合成する工程;
必要に応じて(5)合成したペプチドを用いて治療を行う工程
を包含する、方法。
<C2>
前記(3)工程のHLA検査ペプチドの候補は、BIMAS、SYFPEITHI、RANKPEPまたはNetMHCを用いて決定される、項目<C1>に記載の方法。
<C3><改良型CTL法>
前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のCD8+T細胞とを混合して培養する工程、および該培養後の混合物を患者に投与する工程を包含する、項目<C1>または<C2>に記載の方法。
<C4><DCワクチン療法>
前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程、および該培養された混合物を患者に投与する工程を包含する、項目<C1>〜<C3>のいずれか1項に記載の方法。
<C5><患者自己免疫細胞療法>
前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のCD8+T細胞とを混合して培養してCD8+T細胞−樹状細胞/抗原提示細胞−ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞−ペプチド混合物を生産する工程を行い、該CD8+T細胞−樹状細胞/抗原提示細胞−ペプチド混合物、および該樹状細胞−ペプチド混合物を患者に投与する工程を包含する、項目<C1>〜<C5>のいずれか1項に記載の方法。
<D1><オーダーメイドがん特異的T細胞受容体遺伝子の単離、in vitro抗原刺激によるがん特異的TCR遺伝子の単離>
(A)被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または項目<C1>〜<C5>のいずれかに記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程;
(B)該腫瘍特異的T細胞のTCRを項目<B1>〜<B10>、<B57>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載の方法および/または項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載のシステムによって解析する工程;および
(C)該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的T細胞を単離する工程
を包含する、in vitro抗原刺激によるがん特異的TCR遺伝子の単離方法。
<D1−1>
(A)工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、項目<D1>に記載の方法。
<D1−2>
(A)工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、項目<D1>〜<D1−1>のいずれかに記載の方法。
<D1−3>
(A)工程は、項目C1に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、項目<D1>〜<D1−2>のいずれかに記載の方法。
<D2>
<オーダーメイドがん特異的T細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的TCR遺伝子の単離>
(A)共通のHLAを有する被験体からリンパ球またはがん組織を単離する工程;
(B)該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的T細胞のTCRを項目B1に記載の方法によって解析する工程;および
(C)腫瘍特異的T細胞に共通する配列を有するT細胞を単離する工程
を包含する、共通配列検索によるがん特異的TCR遺伝子の単離する方法。
<E1><CPC>
A)患者からTリンパ球を採取する工程;
B)該Tリンパ球を抗原刺激した後に、項目<B1>〜<B10>、<B57>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載の方法および/または項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載のシステムに基づいてTCRを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程;
C)解析された該TCRにおいて最適抗原および最適TCRを選択する工程;
D)該最適TCRのTCR遺伝子の腫瘍特異的αおよびβTCR発現ウイルスベクターを生産する工程;
E)該腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を該患者に導入する工程;
を包含する細胞加工療法。
<E1−1>
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる、項目<E1>に記載の細胞加工療法。
<E1−2>
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる、項目<E1>または<E1−1>に記載の細胞加工療法。
<E1−3>
前記抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、項目<E1>、<E1−1>〜<E1−2>のいずれかに記載の細胞加工療法。
<E1−4>
C)工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む、項目<E1>、<E1−1>〜<E1−3>のいずれかに記載の方法。
<E1−5>
C)工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くT細胞を活性させる抗原を選択することを含む、項目<E1>、<E1−1>〜<E1−4>のいずれかに記載の方法。
<E1−6>
C)工程は、抗原刺激前後において項目<B1>〜<B10>、<B57>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載の方法および/または項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載のシステムに基づいて行ったレパトア解析から特定のTCRの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む、項目<E1>、<E1−1>〜<E1−5>のいずれかに記載の方法。
<E2><CPCのRAC>
項目<D2>に記載の方法で単離されたがん特異的TCR遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および/または安全性評価を行う方法。
<CC1>
被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法であって、該方法は、
(1)項目<B1>〜<B10>、<B57>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載の方法および/または項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載のシステムによって、該被験者のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)レパトアを解析する工程;
(2)該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のTCRまたはBCRを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のTCRまたはBCR遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のTCRまたはBCRとして選択することによってなされる、工程;
(3)決定された該がん由来のTCRまたはBCRに基づいて、HLA検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、HLA結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程;および
(4)決定されたペプチドを合成する工程;
を包含する、方法。
<CC2>
前記(3)工程のHLA検査ペプチドの候補は、BIMAS、SYFPEEITHI、RANKPEEPまたはNEEtMHCCを用いて決定される、項目<CC1>に記載の方法。
<CC3><改良型CTL法>
前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のCD8+T細胞とを混合して培養する工程を包含する、項目<CC1>または<CC2>に記載の方法。
<CC4><DCワクチン療法>
前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程を包含する、項目<CC1>〜<CC2>のいずれかに記載の方法。
<CC5><患者自己免疫細胞療法>
前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のCD8+T細胞とを混合して培養してCD8+T細胞−樹状細胞/抗原提示細胞−ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞−ペプチド混合物を生産する工程を包含する、項目<CC1>〜<CC4>のいずれかに記載の方法。
<DD1><オーダーメイドがん特異的T細胞受容体遺伝子の単離、in vitro抗原刺激によるがん特異的TCR遺伝子の単離>
(A)被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または項目<CC1>〜<CC5>のいずれかに記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程;
(B)該腫瘍特異的T細胞のTCRを項目<B1>〜<B10>、<B57>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載の方法および/または項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載のシステムによって解析する工程;および
(CC)該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的T細胞を単離する工程
を包含する、in vitro抗原刺激による単離されたがん特異的TCR遺伝子を調製する方法。
<DD1−1>
(A)工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、項目<DD1>に記載の方法。
<DD1−2>
(A)工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、項目<DD1>または<DD1−1>に記載の方法。
<DD1−3>
(A)工程は、項目CC1に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、項目<DD1>〜<DD1−2>のいずれかに記載の方法。
<DD2>
<オーダーメイドがん特異的T細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的TCR遺伝子の単離>
(A)共通のHLAを有する被験体から単離されたリンパ球またはがん組織を提供する工程;
(B)該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的T細胞のTCRを項目<B1>〜<B10>、<B57>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載の方法および/または項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載のシステムによって解析する工程;および
(C)腫瘍特異的T細胞に共通する配列を有するT細胞を単離する工程
を包含する、共通配列検索による単離されたがん特異的TCR遺伝子を調製する方法。
<EE1><CCPCC>
A)患者から採取されたTリンパ球を提供する工程;
B)該Tリンパ球を抗原刺激した後に、項目<B1>〜<B10>、<B57>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載の方法および/または項目<B11>〜<B20>、<B58>〜<B58−20>、<B59>、または<B60>〜<B60−21>のいずれかに記載のシステムに基づいてTCCRを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程;
CC)解析された該TCRにおいて最適抗原および最適TCRを選択する工程; および
DD)該最適TCRのTCCR遺伝子の腫瘍特異的αおよびβTCR発現ウイルスベクターを生産する工程
を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を調製する方法。
<EE1−1>
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる、項目<EE1>に記載の方法。
<EE1−2>
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる、項目<EE1>または<EE1−1>に記載の方法。
<EE1−3>
前記抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、項目<EE1>〜<EE1−2>のいずれかに記載の方法。
<EE1−4>
C)工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む、項目<EE1>〜<EE1−3>のいずれかに記載の方法。
<EE1−5>
C)工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くT細胞を活性させる抗原を選択することを含む、項目<EE1>〜<EE1−4>のいずれかに記載の方法。
<EE1−6>
C)工程は、抗原刺激前後において項目B1に基づいて行ったレパトア解析から特定のTCCRの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む、項目<EE1>〜<EE1−5>のいずれかに記載の方法。
<EE2><CCPCCのRACC>
項目<DD2>に記載の方法で単離されたがん特異的TCCR遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および/または安全性評価を行う方法。この有効性および/または安全性評価の具体的なステップを以下を例示することができる。
精確度の高い非バイアスでの大規模遺伝子解析のための試料が提供され、定量的な分析が特に必要とされる臨床応用場面において特に有用である。また、本発明では、「低頻度」(1/10000−1/100000)遺伝子を同定できることで、たとえば白血病のより正確な診断、治療につながることになる。これは、従来技術(アダプターにプレート法を組み合わせる方法、またはSMART法にプレート法を組み合わせる方法)では検出限界(1%程度)のためできなかった。
従来汎用されるIMGT/High−V−QUESTとの大きな相違点は以下が挙げられる:IMGT/High−V−QUESTでは、C領域の分類機能は無く、レパトア分類は「遺伝子名単位」「アリル単位」どちらかである(すなわち、(*)V(遺伝子名)−D(遺伝子名)−J(遺伝子名)、もしくは、V(アリル)−D(アリル)−J(アリル)となる)。また、CDR3分類は、上記レパトアとは別個に行うことなら可能であるが、自由度がない。他方、本発明の解析方法ではC領域の分類が可能であり、レパトア分類では領域ごとに「遺伝子名単位」「アリル単位」を選択可能である。また、Dの代わりにCDR3を用いることも可能である。
標的となる癌細胞において治療に有効な特異的マーカー(分子標的)が存在しない、あるいは既存の特定の分子標的薬による治療では効果がない患者に対して、本発明のがんイディオタイプペプチド療法は有効である。すなわち、個別患者由来の癌細胞の遺伝子情報に基づいてペプチドが作製されるため、TCRもしくはBCRを発現する多くの腫瘍に対して効果を発揮する。リンパ腫細胞や白血病細胞はその起源からT細胞系腫瘍とB細胞系腫瘍が存在し、いずれの腫瘍型においても本技術が適応可能であり、多くの患者の治療に有用である。また、腫瘍化したB細胞亜集団を標的とする場合、抗CD20抗体のような大部分のB細胞に発現する細胞表面分子を標的とした抗体医薬が使用される。こららの抗体医薬は正常B細胞にも働くため、癌細胞のみならず正常細胞にも働き免疫能の低下などの副作用を引き起こす。他方、本発明のように癌細胞だけを標的とした治療は安全性も高い。癌ペプチドを利用する場合も、癌細胞に対するより特異性の高いペプチドを使用することにより、安全性の高い治療を実現することができる。また、既存のがんペプチドを使用した治療は、その結合する特定のHLAを有する患者に限定される。他方、本発明のように患者の遺伝情報に基づいてペプチドが設計されるため、HLA型に限定されず、広範な患者に適応できる利点がある。
TCRのβ配列:配列番号1377(図18)の塩基番号278〜塩基番号300
TCRのγ配列:配列番号1378(図19)の塩基番号184〜塩基番号201
TCRのδ配列:配列番号1379(図19)の塩基番号231〜塩基番号249
BCRのIgM重鎖配列:配列番号1380(図20)の塩基番号77〜塩基番号95
BCRのIgA重鎖配列:配列番号1381(図21)の塩基番号189〜塩基番号208
BCRのIgG重鎖配列:配列番号1382(図22)の塩基番号262〜塩基番号282
BCRのIgD重鎖配列:配列番号1383(図23)の塩基番号164〜塩基番号183
BCRのIgE重鎖配列:配列番号1384(図24)の塩基番号182〜塩基番号199
BCRのIgκ鎖定常領域配列:配列番号1385(図25)の塩基番号230〜塩基番号248
BCRのIgλ鎖配列:配列番号1386(図25)の塩基番号273〜塩基番号291。
TCRのβ配列:配列番号1377(図18)の塩基番号69〜塩基番号91
TCRのγ配列:配列番号1378(図19)の塩基番号34〜塩基番号53
TCRのδ配列:配列番号1379(図19)の塩基番号61〜塩基番号78
BCRのIgM重鎖配列:配列番号1380(図20)の塩基番号7〜塩基番号25
BCRのIgA重鎖配列:配列番号1381(図21)の塩基番号115〜塩基番号134
BCRのIgG重鎖配列:配列番号1382(図22)の塩基番号109〜塩基番号129
BCRのIgD重鎖配列:配列番号1383(図23)の塩基番号78〜塩基番号96
BCRのIgE重鎖配列:配列番号1384(図24)の塩基番号45〜塩基番号64
BCRのIgκ鎖定常領域配列:配列番号1385(図25)の塩基番号75〜塩基番号92
BCRのIgλ鎖配列:配列番号1386(図25)の塩基番号52〜塩基番号69(この配列番号はCMにも使っている。)。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)の定量解析を行うための試料の調整を行うことができる。これらのシークエンシング技術は、妥当なコストで、試料から100万またはそれ以上のリードを得ることができる。1/1,000,000またはそれよりも低い頻度で存在する遺伝子型でさえ、これらの技術を用いて特異的様式で、しかもバイアスのかかっていない様式で検出することができる。血液または骨髄等のDNA由来の試料から、遺伝子または転写物の特定部分の配列の異なる型をすべて増幅するための非バイアス増幅方法が達成される。
別の局面において、本発明は、本発明の方法で製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法を提供する。
本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)の定量解析を行うためのバイオインフォマティクスを提供する。
V ミスマッチペナルティ=−1、最短アラインメント長=30、最短カーネル長=15
D ワード長=7(BLASTの場合)またはK−tup=3(FASTAの場合)、ミスマッチペナルティ=−1、ギャップペナルティ=0、最短アラインメント長=11、最短カーネル長=8
J ミスマッチペナルティ=−1、最短ヒット長=18、最短カーネル長=10
C 最短ヒット長=30、最短カーネル長=15で実施される。この条件は、例えば、より短い(〜200bp)配列を用いて一部の領域だけでも分類する状況(「好ましい例」から外れる状況)であれば使用することができ、イルミナ製シーケンサを利用する状況でも使用することができる。この場合は、相同性検索にbwaもしくはbowtieを用いる可能性が考えられる。
次に、図42の機能ブロック図を参照して、本発明のシステム1の構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示している。
1つの局面において、本発明は、データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析する方法を提供する。この方法は、(1)該被験者から非バイアス的に増幅した、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程;(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程;および(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程を包含する。この方法および本明細書で説明される1つまたは複数の更なる特徴を含む方法を、本明細書において「本発明のレパトア解析法」とも呼ぶ。そして本発明のレパトア解析法を実現するシステムを「本発明のレパトア解析システム」ともいう。
1つの局面では、本発明は、被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法を提供する。この方法は、(1)本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって、該被験者のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)レパトアを解析する工程;(2)該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のTCRまたはBCRを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のTCRまたはBCR遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のTCRまたはBCRとして選択することによってなされる、工程;(3)決定された該がん由来のTCRまたはBCRに基づいて、HLA検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、HLA結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程;および(4)決定されたペプチドを合成する工程を包含する。ここで合成されたペプチドは、がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用することができる。この方法は、本明細書において「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」と呼ばれることがある。
別の局面において、本発明は、オーダーメイドがん特異的T細胞受容体遺伝子の単離、in vitro抗原刺激によるがん特異的TCR遺伝子の単離技術を提供する。したがって、本発明は、(A)被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または本発明の「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程;(B)該腫瘍特異的T細胞のTCRを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程;および(C)該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的T細胞を単離する工程を包含する、in vitro抗原刺激による単離されたがん特異的TCR遺伝子を調製する方法を提供する。このようなin vitro抗原刺激による単離されたがん特異的TCR遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このような単離されたオーダーメイドがん特異的T細胞受容体遺伝子およびがん特異的TCR遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
さらなる局面において、本発明は、細胞加工療法を提供する。詳細には、本発明は、A)患者から採取されたTリンパ球を提供する工程;B)該Tリンパ球を抗原刺激した後に、本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいてTCRを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程;C)解析された該TCRにおいて最適抗原および最適TCRを選択する工程; およびD)該最適TCRのTCR遺伝子の腫瘍特異的αおよびβTCR発現ウイルスベクターを生産する工程を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を調製する方法を提供する。この腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を用いた細胞加工療法は、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
一つの実施形態として、本発明のレパトア解析法を用いてBCR遺伝子レパトア解析を行い、以下に記載の方法で標的抗原に特異的なヒト型抗体を迅速に取得することができる
(A)標的となる抗原タンパクまたは抗原ペプチドをマウスに免疫し、該マウスより抗体産生B細胞を含む細胞集団(例えば脾臓、リンパ節、末梢血細胞)を分離し、本発明のレパトア解析法によるBCRレパトア解析により免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を解析する方法
(A1)免疫するマウスが抗体多様性を維持したまま完全ヒト抗体を産生することができるKMマウスであるAの方法
(A2)免疫するマウスがNOD/scidマウスにIL-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを交配して作製された重度な複合型免疫不全を呈するNOG(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull)マウスにヒト幹細胞を移植して作製されたヒト化マウスであるAの方法
(B)対照マウスと免疫マウス、あるいは抗原免疫前と後のマウス由来の試料から得られた免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子配列とその頻度を比較する
(C)免疫マウスで強く発現する、あるいは免疫後に増加する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を同定する
(D)Cの工程から選択した免疫グロブリン重鎖と軽鎖遺伝子を選択し、1種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に2種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法
(E)Dの工程で作製した免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子発現ベクターをCHO(Chinese HamsterOvary)などの真核細胞に導入し、細胞培養を行う
(F)遺伝子組換え細胞により産生、分泌された抗体分子を分離・精製し、標的抗体タンパクあるいはペプチドに対する特異性を検証する
上記A−Fの工程により、動物由来の抗体遺伝子を取得した後にヒト抗体とのキメラ型抗体あるいはヒト化抗体に改変することなく、直接的かつ迅速に抗原特異的ヒト型抗体を取得する方法であり、ヒト型抗体から成る抗体医薬品の開発と製造に用いることができる。
一つの実施形態として、当該BCR遺伝子レパトア解析法を利用して、以下に記載の方法で標的抗原に特異的なヒト型抗体を迅速に取得することができる
(A)標的となる抗原タンパクまたは抗原ペプチドをマウスに免疫し、該マウスより抗体産生B細胞を含む細胞集団(例えば脾臓、リンパ節、末梢血細胞)を分離し、BCRレパトア解析法により免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を解析する方法
(A1)免疫するマウスが抗体多様性を維持したまま完全ヒト抗体を産生することができるKMマウスであるAの方法
(A2)免疫するマウスがNOD/scidマウスにIL-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを交配して作製された重度な複合型免疫不全を呈するNOG(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull)マウスにヒト幹細胞を移植して作製されたヒト化マウスであるAの方法
(B)対照マウスと免疫マウス、あるいは抗原免疫前と後のマウス由来の試料から得られた免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子配列とその頻度を比較する
(C)免疫マウスで強く発現する、あるいは免疫後に増加する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を同定する
(D)Cの工程から選択した免疫グロブリン重鎖と軽鎖遺伝子を選択し、1種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に2種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法
(E)Dの工程で作製した免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子発現ベクターをCHO(Chinese HamsterOvary)などの真核細胞に導入し、細胞培養を行う
(F)遺伝子組換え細胞により産生、分泌された抗体分子を分離・精製し、標的抗体タンパクあるいはペプチドに対する特異性を検証する
上記A−Fの工程により、動物由来の抗体遺伝子を取得した後にヒト抗体とのキメラ型抗体あるいはヒト化抗体に改変することなく、直接的かつ迅速に抗原特異的ヒト型抗体を取得する方法であり、ヒト型抗体から成る抗体医薬品の開発と製造に用いることができる。
1.KMマウスに実験的自己免疫性脳脊髄炎の抗原ペプチドであるMyelinOligodendrocyte Glycoprotein(MOG35-55, MOG)を免疫する。等量の2mg/mL MOGペプチドと完全フロイントアジュバントを混合し、エマルジョンを作成し、200μgのMOGを皮下に免疫し、同時に400ngの百日咳毒素を腹腔に免疫する。対PBSと完全フロイントアジュバントによる免疫を行い、対照マウスとする。
2.初回免疫後2日目に400ngの百日咳毒素を免疫し、免疫後10日目に発症を確認した後、脳脊髄炎発症マウスより脾臓を摘出する。
3.発症マウスと対照マウスの脾臓を用いて、次世代BCRレパトア解析を実施する。IgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖について、個々のBCR配列の出現頻度の集計とランキングを行う。
4.対照ウスに比し、発症マウスにおいて出現頻度が大きく増加したBCR配列を抽出し、ランキングする。これら抗体投与によって誘導されたBCR配列のランキング上位のものの組み合わせについて、MOG特異的抗体遺伝子として同定する。
5.発症マウスから増幅したBCR遺伝子増幅産物からPCR-cloning法により全長ヒト免疫フロブリン配列をクローニングする。抗体発現用ベクターにIgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のそれぞれをクローニングする。1種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に2種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法がある。
6.これら構築した発現ベクターでリポフェクタミン3000(Life Science)を用いてCHO(Chinese Hamster Ovary)細胞を形質転換し、IgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を導入する。
7.CHO細胞培養液を回収し、ProteinAアフィニティーカラムによる精製、ゲル濾過による濃縮により、分泌された抗体蛋白を回収する。
8.回収した抗体を用いたELISAアッセイにより、MOG35-55またはMOG蛋白に対する結合活性を測定し、抗体の特異性を検証する。
9.十分な特異性が得られたら、抗体発現安定発現細胞株を取得し、大量培養系によりヒト型抗MOG抗体を製造する。
本発明のペプチドまたはそれをコードする核酸は、免疫療法に用いることができる。以下に説明する。
本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン(phenoxazine−modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体(例えば、縮重コドン置換体)および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上の選択された(または、すべての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る(Batzeret al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossoliniet al., Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。本明細書に
おいて「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
、25、30、40、50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーまたは標的分子として機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーまたは標的分子としての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
該製剤の容器は、繰り返し投与(例えば2〜6回の投与)に使うことができる多用途バイアル瓶でもよい。該キットは、さらに、適切な希釈剤(例えば重曹溶液)を有する第2の容器を有することができる。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F. M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al.(1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al.(1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G. T. (I996). Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
(調製実施例1:健常人末梢血におけるBCRレパトアの解析) 本実施例では、健常人末梢血におけるBCRレパトアの解析を行った。
試料:健常人末梢血単核球細胞
方法:
(1.RNA抽出)
例の健常人から全血5mLをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)を分離した。単離した5×106細胞のPBMCからRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。取得されたRNAは、吸光度計を用いてA260の吸光度により定量された。溶出液量30μLにおいて濃度232ng/μLであった。
抽出されたRNA試料を用いて、adaptor−ligation PCRを実施した。最初に、相補的DNAを合成するため、BSL−18Eプライマー(表1−1)と 3.5 μL(812ng)のRNAを混和して、70℃で8分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてRNase阻害剤(RNAsin)の存在下で逆転写反応を行い、相補的DNAを合成した。
二本鎖相補的DNAからの一次PCR増幅(1st PCR)は、共通アダプタープライマーのP20EAと各々の免疫グロブリンアイソタイプC領域特異的プライマー(CM1、CA1、CG1、CD1、CE1)を用いて、次に示す反応組成で、95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを20サイクル行った。用いたプライマー配列は表1−1に示す。
至適条件下におけるGS−PCR増幅の後、2%アガロースゲル電気泳動を実施し、目視化において目的のサイズ(500bp〜700bp)のバンドを切り出し、DNA精製キット(QIAEX II Gel Extraction Kit、QIAGEN)を用いて精製した。回収されたDNAをQuant−iTTM PicoGreen(登録商標) dsDNA Assay Kit(Invitrogen)を用いてDNA量を測定した。回収された各アイソタイプ由来の増幅産物のDNA量は、それぞれIgM(1611ng/mL)、IgG(955ng/mL)、IgA(796ng/mL)、IgD(258ng/mL)、IgE(871ng/mL)であった。これらアイソタイプ増幅産物のDNA量が均等になるよう混和し、1000万DNAをエマルジョンPCRに用い、ロシュ社製次世代シーケンス解析装置(GS Juniorベンチトップシステム)によるシーケンス解析を行った。
シーケンスリードの解析は、IMGT (the international ImMunoGeneTics information system, http://www.imgt.org)データベースから入手されるV、D、J、C配列をリファレンス配列として各リード配列のV、D、J、C配列をアサインした。アサインメントにはIMGTのHighV−Questおよび新規に開発したレパトア解析ソフトウェア(Repertoire Genesis、同日付で出願される特許出願を参照。この内容は本明細書において参考として援用される)を用いた。
たことが示された。
本実施例では、健常人末梢血におけるTCRレパトアの解析を行った。
(試料)
10例の健常人末梢血単核球細胞
(方法)
(1.RNA抽出)
10例の健常人から全血5mLをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)を分離した。単離したPBMCからRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。取得されたRNAは、Agilent 2100バイオアナライザ(Agilent)を用いて定量された。獲得されたRNA量を次の表1−4に示す。
抽出されたRNA試料を用いて、adaptor−ligation PCRを実施した。方法は調製実施例1に示した方法に従って実施した。すなわち、BSL−18Eプライマー(表1−5)とRNAを混和してアニーリング後、逆転写酵素を使って相補鎖DNAを合成した。続いて、二本鎖相補的DNAを合成し、T4 DNA polymeraseによる5’末端平滑化反応を行った。High Pure PCR Cleanup Micro Kit(Roche)によりカラム精製した後、P20EA/P10EAアダプターをLigation反応にて付加した。カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖相補的DNAは、NotI制限酵素により消化された。
二本鎖相補的DNAから、表1−1に示す共通アダプタープライマーP20EAとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー(CA1またはCB1)を用いて、第1のPCR増幅反応の産物である1st PCR増幅を行った。PCRは次に示す組成で、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
ロシュ社製GS Juniorシーケンス解析装置による次世代シーケンスを実施した。具体的には、GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib−L)を用いて、メーカーのプロトコールに従ってemPCRを実施した。ビーズとDNAの割合(copy per beads:cpb)0.5で実施した。emPCR後、ビーズエンリッチメントにて回収されたビーズは、シーケンスラン試薬であるGS Junior Titanium Sequencing KitおよびPicoTiterPlate Kitを用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスランを実施した。
得られたシーケンスデータ(SFFファイル)をGS Junior付属ソフトウェア(sfffileもしくはsffinfo)により、MID Tag別のリード配列に分類し、Fasta形式のシーケンスファイルを生成した。得られた平均リード数はTRA:17840リード、TRB:5122リードで、200bp以上のRaw dataの割合はTRA:34.9−63.7%(平均42.2%)、TRB:68.8−78.7%(平均73.1%)であった(表1−8)。次に、新規に開発したレパトア解析ソフトウェア(Repertoire Genesis、特許出願中)を用いて、IMGT(the international ImMunoGeneTics information system, www.imgt.org)データベースのリファレンス配列との照合を行い、各リードのV領域、D領域、J領域のアサインメントとCDR3配列の決定を行った。アサインされたリード数は表1−8に示した。また、同一リードの頻度解析、V、D、J鎖の使用頻度を調べた。Repertoire Genesisにより得られたリードを用いて生成したTRVおよびTRJレパトアについて図13(A〜D)、14(A〜D)、15(A〜D)、図16に示す。
本実施例では、非バイアスAdaptor−ligation PCR法によるTCRおよびBCR遺伝子の増幅を行う。
(試料)
健常人末梢血単核球細胞
(方法)
(1.RNA抽出)
1例の健常人から全血5mLをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)を分離した。単離した5×106細胞のPBMCからRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。
抽出されたRNA試料を用いて、adaptor−ligation PCRを実施した。最初に、相補的DNAを合成するため、BSL−18Eプライマー(表1−1)と 3.5 μL(812ng)のRNAを混和して、70℃で8分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてRNase阻害剤(RNAsin)の存在下で逆転写反応を行い、相補的DNAを合成した。
二本鎖相補的DNAからの1st PCRは、共通アダプタープライマーのP20EAとTCR C領域特異的プライマー(CA1、CB1、CG1、CD1)または免疫グロブリンアイソタイプC領域特異的プライマー(CM1、CA1、CG1、CD1、CE1、CK1、CL1)を用いて行った。C領域の全長を含む配列を増幅できるようC領域の3′末端側、中央部あるいは5′側にプライマーを設定した。示す反応組成で、95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを20サイクル行った。用いたプライマー配列は表1−1に示す。
(試料)
健常人末梢血単核球細胞、MOLT−4ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株
(方法)
(1.T細胞系白血病細胞株の培養)
T細胞受容体(TCR)を発現するT細胞系細胞株として、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株Molt−4を用いた。10%ウシ胎児血清、100 IU/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、2mM L−グルタミンを含むRPMI−1640培地で、37℃、5%CO2下において培養し、全細胞数として1 x 107細胞を回収した。RPMI−1640培地で洗浄し、1 x 106細胞/mLになるように細胞を懸濁した。
1例の健常人から全血5mLをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)を分離した。RPMI1640培地で洗浄後、細胞数をカウントして1 x 106細胞/mLになるように懸濁した。
得られた1x106 細胞/mLのPBMCと1 x 106 細胞/mLのMolt−4細胞を下記の細胞数となるように混合し、Molt−4段階希釈細胞懸濁液を調製した。
段階希釈細胞懸濁液からRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。20 μLの溶出液で溶出し、Agilent 2100バイオアナライザ(Agilent)を用いてA260の吸光度によりRNA量を定量した。RNA電気泳動像を図26に示し、各試料から得られたRNA量を表1−4Bに示した。
抽出されたRNA試料を用いて、adaptor−ligation PCRを実施した。最初に、相補的DNAを合成するため、BSL−18Eプライマーと3.5 μLのRNAを混和して、70℃で8分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてRNase阻害剤(RNAsin)の存在下で逆転写反応を行い、相補的DNAを合成した。
二本鎖相補的DNAから、表1−1に示す共通アダプタープライマーP20EAとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー(CB1)を用いて、1st PCR増幅を行った。PCRは次に示す組成で、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
ロシュ社製GS Juniorシーケンス解析装置による次世代シーケンスを実施した。具体的には、GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib−L)を用いて、メーカーのプロトコールに従ってemPCRを実施した。ビーズとDNAの割合(copy per beads:cpb)2で実施した。emPCR後、ビーズエンリッチメントにて回収されたビーズは、シーケンスラン試薬であるGS Junior Titanium Sequencing KitおよびPicoTiterPlate Kitを用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスランを実施した。
Agilent 2100 バイオアナライザによるRNA電気泳動像を図26に示す。細胞段階希釈液より全RNAを抽出して、Agilent社製バイオアナライザを用いてRNA量を測定した。マイクロチップ型電気泳動装置でRNAを分離し、RNAの品質チェックを行った。いずれの試料においても、28S(上バンド)および18S rRNA(下バンド)が検出され、分解を受けていないRNAが得られたことを示している。
(解析試験例1 健常者のBCRレパトア解析)
本実施例では、健常者のBCRレパトアの比較を行った。
(材料)
健常者1検体の末梢血単核球細胞より得られるRNAより、非バイアス的に得られたBCRのcDNAをRoche GS−Juniorで配列決定したリードセットを使用した。IgM、IgG、IgA、IgD、IgEのクラスごとのリードセットとなっている。
方法の全体像を図30(図29にはTCRの解析スキームを示す)に示す。
D ワード長=7、ミスマッチペナルティ=−1、ギャップペナルティ=0、 最短アラインメント長=11、最短カーネル長=8
J ミスマッチペナルティ=−1、最短ヒット長=18、最短カーネル長=10
C 最短ヒット長=30、最短カーネル長=15
最も近しい参照アリルを選択する際の指標は以下の優先順位で適用した。
IgM、IgG、IgA、IgD、IgEのリードセットごとにC遺伝子名の出現頻度を導出した結果を図31に示す。各クラスに対応する遺伝子名が専ら出現しており、また、no−hitがほとんど見られないことから、解析対象であるリードセットのクオリティは十分であることが示唆される。
(表2−3)クラス間のDレパトアの比較 縦軸:頻度(%)、横軸:遺伝子名
本実施例では、検体間のBCRレパトアの比較を行った。
(材料)
解析実施例1と同様の手法で得られた5検体のリードセットで、4検体(No.1−4)が健常人、1検体(No.5)が白血病患者である。
解析実施例1と同様の方法で各検体について、クラスごと、領域ごとのレパトアを導出し、検体間で比較を行った。
結果の一例としてIgMにおけるVレパトアの比較結果を図36(AおよびB)に、Jレパトアの比較結果を図37に示す。No.5の検体のみ大きく異なることが示されている。
本実施例では、健常人のTCRレパトアの比較を行った。
(材料)
実施例1と同様の手法で得られた10検体のリードセットで、10検体(No.1−10)とも健常人である。
実施例1と同様の方法で各検体について、クラスごと、領域ごとのレパトアを導出し、検体間で比較を行った。
結果を図38〜41に示す。図38(A〜D)は、検体間のTRAVのレパトア比較の結果を示し、図39(A〜D)は、検体間のTRBVのレパトア比較の結果を示し、図40(A〜D)は、検体間のTRAJレパトア比較の結果を示し、図41は、検体間のTRBJレパトア比較の結果を示す。
(解析システムの実施例1:T細胞大顆粒リンパ球性白血病(T−LGL)の診断応用)
本実施例では、本発明のシステムのT細胞大顆粒リンパ球性白血病(T−LGL)の診断への応用を確認する実験を行った。
試料:T細胞大顆粒リンパ球性白血病由来末梢血単核球細胞
方法
(RNA抽出)
1例のT細胞大顆粒リンパ球性白血病を罹患した患者から全血7mLをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)を分離した。単離した1.66x107細胞のPBMCからRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。取得されたRNAは、吸光度計を用いてA260の吸光度により定量され、全RNA量は15μgであった。
抽出されたRNA試料を用いて、adaptor−ligation PCRを実施した。最初に、相補的DNAを合成するため、BSL−18Eプライマー(表3−1A)と 3.5 μLのRNAを混和して、70℃で8分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてRNase阻害剤(RNAsin)の存在下で逆転写反応を行い、相補的DNAを合成した。
二本鎖相補的DNAから、共通アダプタープライマーP20EAとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー(CA1またはCB1)を用いて、1stPCR増幅を行った。PCRは次に示す組成で、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
Roche社製GSJuniorシーケンス解析装置による次世代シーケンスを実施した。具体的には、GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib-L)を用いて、メーカーのプロトコールに従ってemPCRを実施した。ビーズとDNAの割合(copyper beads:cpb)0.5で実施した。emPCR後、ビーズエンリッチメントにて回収されたビーズは、シーケンスラン試薬であるGS JuniorTitanium Sequencing KitおよびPicoTiterPlateKitを用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスランを実施した。
得られたシーケンスデータ(SFFファイル)をGS Junior付属ソフトウェア(sfffileもしくはsffinfo)により、MID Tag別のリード配列に分類し、Fasta形式のシーケンスファイルを生成した。シーケンスリードの解析は、IMGT(the international ImMuno Gene Ticsinformation system, http://www.imgt.org)データベースから入手されるV、D、J、C配列をリファレンス配列として各リード配列のV、D、J、C配列をアサインした。アサインメントには新規開発ソフトウェア(RepertoireGenesis)を用いた。TCRαにおいては、22833のリードが得られ、16407リード(71.9%)がアサインされた。ユニークリード数は1705リードであった。TCRβにおいては、121080のリードが得られ、81542リード(67.3%)がアサインされた。ユニークリード数は9224リードであった。得られたリードについて、同一のTRAV遺伝子、TRAJ遺伝子およびCDR3配列をもつリードをユニークリードとして、その頻度を調べた(表3−1)。また、同様に、同一のTRBV遺伝子、TRBJ遺伝子およびCDR3配列をもつリードについて頻度を調べた(表3−2)。その結果、TRAレパトアでは、TRAV10、TRAJ15およびCVVRATGTALIFG(配列番号1450)をもつリードが1971リード(12.53%)を占め、特定のTCRを発現する細胞がクローナルに増加している可能性を示唆した。また、TRBレパトアでは、TRBV29−1、TRBJ2−7およびCSVERGGSLGEQYFG(配列番号1500)をもつリードが22568リード(28.57%)を占めた。これらの結果から、TRAV10およびTRAJ15を有するTCRαとTRBV29−1およびTRBJ2−7を有するTCRβからなるTCR分子を発現するT細胞がモノクローナルに増殖している可能性が示唆された。健常人10例とLGL患者の間で種々の多様度指数について比較した(表3−3)。多様度を示すシャノン・ウェーバー指数(H')、シンプソン指数(λ)、逆シンプソン指数(1/λ)およびPielouの指数(J)は健常人と比べ低い値を示し、多様性が減少していることが示された。
本LGL患者においては、薬物療法などの治療を施行した後、TRAV10/TRAJ15/CVVRATGTALIFG(配列番号1450)あるいはTRBV29−1/TRBJ2−7/CSVERGGSLGEQYFG(配列番号1500)を持つシーケンスリードを指標として、微少残存病変の検出ができると期待される。また、リード頻度を用いた定量的解析から白血病細胞に対する治療効果を測ることができると考えられる。また、種々の多様度指数を用いて、クローナリティの増加疾患の有無を推測できる可能性が示唆された。
(表3−1) TRAリード(上位50位)(配列番号1450−1499)
試料:外科手術にて摘出された大腸がん患者の腫瘍組織、健常人末梢血
方法
(大腸がん組織の採取と保存)
60例の大腸がん患者における腫瘍摘出手術において腫瘍組織を採取した。摘出臓器のがん病変部から大豆大の大きさに相当する100mgの組織を採材し、5mm四方に切断したものをただちにRNA安定化試薬(RNAlater(登録商標)、Ambion)に浸漬した。一晩、4℃で保管した後、RNAlater(登録商標)を除去した後−80℃で保管した。
コントロールとして、健常人末梢血細胞を用いた。10例の健常人から全血5mLをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞(peripheral bloodmononuclear cells, PBMC)を分離した。単離した5×106細胞のPBMCからRNeasyLipid TissueMini Kit (QIAGEN, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。取得されたRNAは、吸光度計を用いてA260の吸光度により定量された(表3−3A)。表3−3A 健常人末梢血細胞の全RNA量
がん組織におけるHLAの発現およびHLAハプロタイプを同定するため、HLA-Aタイピングを実施した。RNAlater(登録商標)に浸漬したがん組織を一部取り出し、QIAampDNA Mini Kit(Qiagen, Germany)を用いてゲノムDNAを抽出した。次にWAKFlow HLAタイピング試薬 HLA-A(Wakunaga)を用いて増幅および標識を行い、Luminex(LuminexCorp.)で解析した。その結果、HLA-A2402遺伝子は60検体中25検体でホモもしくはヘテロで発現し
ていた(表3−4)。
表3−4 HLA−A2402を発現した大腸がん組織の一覧
HLA-A2402遺伝子を発現する25検体においてTCRレパトアを解析するため、RNAlater(登録商標)に浸漬した組織を一部取り出し、RNeasyLipidTissue Mini Kit (QIAGEN, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。カラムからの溶出はRNAaseフリーの滅菌水50 μLで実施した。各試料から得られたRNA量を表3−5に示した。
表3−5 大腸がん試料の全RNA量
抽出されたRNA試料を用いて、adaptor-ligationPCRを実施した。最初に、相補的DNAを合成するため、BSL-18Eプライマーと3.5 μLのRNAを混和して、70℃で8分間アニーリングした。氷上で冷却後、下記の組成においてRNase阻害剤(RNAsin)の存在下で逆転写反応を行い、相補的DNAを合成した。
二本鎖相補的DNAから、共通アダプタープライマーP20EAとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー(CB1)を用いて、1stPCR増幅を行った。PCRは次に示す組成で、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
Roche社製GSJuniorシーケンス解析装置による次世代シーケンスを実施した。具体的には、GS Junior Titanium emPCR Kit (Lib-L)を用いて、メーカーのプロトコールに従ってemPCRを実施した。ビーズとDNAの割合(copyper beads:cpb)2で実施した。emPCR後、ビーズエンリッチメントにて回収されたビーズは、シーケンスラン試薬であるGS JuniorTitanium Sequencing KitおよびPicoTiterPlateKitを用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスランを実施した。
得られたシーケンスデータ(SFFファイル)をGS Junior付属ソフトウェア(sfffileもしくはsffinfo)により、MID Tag別のリード配列に分類し、Fasta形式のシーケンスファイルを生成した。レパトア解析ソフトウェア(RepertoireGenesis)を用いて、IMGTデータベースのリファレンス配列との照合を行い、各リードのAV、BV領域およびAJ、BJ、領域のアサインメントとCDR3配列の決定を行った。
正常コントロールとして、10例の健常人末梢血単核球のTCRシーケンスを調べた。各健常人から得られたTCRαおよびTCRβシーケンスリードについて、V、JおよびCDR3配列を指標にして個体間で重複するリードを検索し、抽出した。TCRα鎖とTCRβ鎖の間で、重複するユニークリード数ならびにその重複ユニーリードをもつ個体数を調べた(表3−6)。TCRβ鎖に比べ、TCRα鎖において著しく重複ユニークリードの数が多く(809対39)、その割合も高かった(2.37%対0.19%)。また、TCRα鎖は最大10個体中8個体に重複するリードが存在し、一方でTCRβ鎖のすべての重複リードは2個体だけに重複していた。これらの結果は、TCRαレパトアは個体間でより類似していることを示唆している。表3−6 健常人における重複ユニークリード数
TCRβ鎖に対比し高い個体間での重複度を示すTCRα鎖について、重複リードの塩基配列を詳細に調べた。その結果、高い重複度を示すTCRリードの多くは、インバリアント鎖を発現するとして知られるナテュラルキラーT細胞(Natural killer T,NKT)あるいは粘膜関連インバリアントT細胞(Mucosal−associated invariant T、MAIT)由来のTCRα遺伝子であることが分かった(表3−7)。NKT細胞はTRAV10(Vα24)−TRAJ18を、MAITはTRAV1−2(Vα7.2)−TRAJ33からなるTCRを主に発現する。最近、MAITのTCRは、MR1分子によって提示された細菌のビタミンB代謝物を認識することが報告され、免疫監視機能における役割が注目されている(Nature. 2012 Nov 29;491(7426):717-23;JExp Med. 2013 Oct21;210(11):2305-20)。重複個体数が4以上の重複リードについて、既報のインバリアントTCRと照合した結果、その45%がインバリアントTCRで占められることが分かった(表3−7)。TCRα鎖において高頻度重複リードが存在するのとは対称的に、TCRβ鎖の重複個体数は最大2であった(表3−8)。従って、TCRαでの高い重複度はインバリアントTCRの存在によると推測される。4個体以上に重複する38種の高頻度重複リードのうち既報のインバリアントTCRと照合できなかったTCRαリードを21種類特定できた(表3−9)。これらは、新規インバリアントTCRである可能性が示唆される。
表3−7 健常人における重複TCRα鎖リード配列
がん患者のがん組織にはがん抗原特異的T細胞が存在し、抗腫瘍効果に重要な働きをすることが知られている。がん抗原特異的TCR遺伝子を同定するため、特定のHLAを有する患者を対象にTCRレパトアを解析して、特定の抗原に反応して増殖するTCR遺伝子を同定する。本実験では、25例の共通のHLA−A2402を有する大腸がん患者のがん組織を用いてTCRレパトア解析を実施し、がん患者サンプル間で重複して存在するユニークリードを検索した(表3−10)。その結果、TCRα鎖においては213リード(1.65%)、TCRβ鎖では49リード(0.11%)が複数の患者に重複して存在することが分かった。健常人と同様に、TCRα鎖においては最大25例中12例に存在する高頻度重複リードが存在する一方で、TCRβ鎖は最大2個体で重複するのみであった。TCRα鎖では、最大12検体の間で共通するリードが存在し、4検体以上のがん組織で重複する7リードの配列は1例を除きMAITに由来するTRAV1−2/TRAJ33を有するTCRα鎖であった(表3−11)。(表3−10 がん組織における重複ユニークリード数とがん特異的リード数)
高頻度に重複するTCRαリードはインバリアントTCRを多く含んでいる。これらの配列は正常コントロールである健常人にも存在し、腫瘍抗原に反応するTCRではない。がん特異的TCRを抽出する目的で、がん組織で重複するリードのうち健常人試料で検出されないものをがん特異的TCRとして分類した(表3−12)。健常人にも存在する重複リードはTCRα鎖では56リード、一方TCRβ鎖ではわずか1リードであった。重複個体数が4個体以上のリードはインバリアントTCRまたは健常人にも存在するリードであった。がん特異的リードは3個体間以内で重複し、TCRα鎖では157リード(1.22%)、TCRβ鎖では48リード(0.11%)検出された。(TCRαβペアリードの推定方法については図49も参照)。
表3−12 がん患者における重複TCRβリード配列とがん特異的TCRβ
抽出されたRNA試料を用いて、adaptor−ligation PCRを実施した。方法は実施例1に示した方法に従って実施した。すなわち、BSL−18Eプライマー(表3−14)とRNAを混和してアニーリング後、逆転写酵素を使って相補鎖DNAを合成した。続いて、二本鎖相補的DNAを合成し、T4 DNA polymeraseによる5’末端平滑化反応を行った。High Pure PCR Cleanup Micro Kit(Roche)によりカラム精製した後、P20EA/P10EAアダプターをLigation反応にて付加した。カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖相補的DNAは、NotI制限酵素により消化された。
二本鎖相補的DNAから、表3−14に示す共通アダプタープライマーP20EAとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー(CA1またはCB1)を用いて、第1のPCR増幅反応の産物である1st PCR増幅を行った。PCRは次に示す組成で、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
Ion OneTouch ES(IonTorrent社)を用いてサンプルのエンリッチメントを行う。新しいチューブをチップローダーにセットし、チップアームを取り付ける。次に、下記のMelt-Off溶液を調整する。
本実施例では、Illumina MiSeqシステムを用いたTCRシーケンスでも本発明のシステムが実施可能かを実証する。
健常人から全血5mLをヘパリン含採血管に採取し、フィコール密度勾配遠心分離により末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)を分離した。単離したPBMCからRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Germany)を用いて、全RNAを抽出・精製した。取得されたRNAは、Agilent 2100バイオアナライザ(Agilent)を用いて定量された。
抽出されたRNA試料を用いて、adaptor−ligation PCRを実施した。方法は実施例1に示した方法に従って実施した。すなわち、BSL−18Eプライマー(表3−21)とRNAを混和してアニーリング後、逆転写酵素を使って相補鎖DNAを合成した。続いて、二本鎖相補的DNAを合成し、T4 DNA polymeraseによる5’末端平滑化反応を行った。High Pure PCR Cleanup Micro Kit(Roche)によりカラム精製した後、P20EA/P10EAアダプターをLigation反応にて付加した。カラムにより精製されたアダプター付加二本鎖相補的DNAは、NotI制限酵素により消化された。
二本鎖相補的DNAから、表1に示す共通アダプタープライマーP20EAとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的プライマー(CA1またはCB1)を用いて、第1のPCR増幅反応の産物である1st PCR増幅を行った。PCRは次表3−22に示す組成で、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分のサイクルを20サイクル行った。
10倍希釈した2nd PCR増幅産物を鋳型として、図50のようにP20EAアダプタープライマーにP5配列、R1 Seq Primer配列、Index2配列を付加したP5−P20EAプライマーとTCRα鎖またはβ鎖C領域特異的配列にP7配列、R2 Seq Primer配列、Index1配列を付加したP7−CA3またはP7−CB3を用いて、PCR増幅反応を行う。異なるIndex1配列とIndex2配列を使って増幅プライマーに標識し、複数の試料から増幅したTCR遺伝子増幅産物を識別する。使用するプライマー配列は、表3−24に示した。PCRサイクルは、95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分を10サイクル行う。
E-Gelアガロースゲル電気泳動システムを用いて、増幅したPCR産物を電気泳動する。高感度蛍光染色剤入りプレキャストゲルを電気泳動装置に設置し、2%アガロースゲルにウェル当たり20μLの試料を入れ、電気泳動を行う。500−600bpに相当する目的バンドが溶出された時点で、増幅産物を回収する。回収されたPCR増幅産物はQuant-TTMPicoGreen(登録商標) dsDNA AssayKit (Invitrogen)によりDNA量を測定する。得られたDNA量をもとに、複数の試料を等モル量ずつ混合し、シーケンス反応を行う。
MiSeq サンプルシートを作成する。PhiXコントロールを5−50%の範囲で加え、MiSeq Reagent Kit v.3 (600ccyle、イルミナ社)をインストールしたMiSEQシーケンス装置でシーケンスを開始する。約65時間後に、シーケンスデータを得ることができる。
解析システムの実施例1〜4に記載の手法をまとめる実施例として以下に総合した実施例を記載する。
これまでに述べてきたように、近年では、次世代配列決定(NGS)として公知のハイスループット配列決定技術における進歩が急激に進み、ラージスケールのシーケンスデータの分析が可能となった(Shendure J etal. (2008) Nat Biotechnol 26: 1135-1145; Metzker ML et al. (2010) Nat Rev Genet11: 31-46)。いくつかのNGSに基づくTCRレパトア解析システムが、他の研究者らによって開発されてきたが、多くの増幅技術が、各可変領域に特異的な異なるプライマーを含むMultiple PCRに基づいている。そのため、異なる標的遺伝子に対する可変領域特異的プライマー間の示差的なハイブリダイゼーション動態に起因して、バイアスは最も一般的であるため、PCR増幅中のバイアスが回避できない。それゆえ、Multiple PCRアッセイを用いる場合、補正およびさらなる計算的な標準化法が、PCRバイアスを最小化するために必要とされる(Carlson CS etal. (2013) Nat Commun 4: 2680)。プライマーの単一セットの使用は、配列の5’末端が高度に多様である未知の変異体を含むすべてのTCR遺伝子の非バイアスで定量的な増幅を達成する好ましい方法である。T4 RNAリガーゼを含むcDNAの3’末端に対する一本鎖オリゴヌクレオチドアンカーライゲーション(Troutt AB et al.(1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89: 9823-9825)、cDNAのホモポリマーテーリング、cDNA末端の5’急速増幅(RACE)(Frohman MA et al. (1988)Proc Natl Acad Sci U S A 85: 8998-9002)およびテンプレートスイッチングPCR(TS−PCRまたはSMART PCR)(Zhu YY et al.(2001) Biotechniques 30: 892-897)は、TCRレパトアを分析するために使用されてきた(Freeman JD etal. (2009) Genome Res 19: 1817-1824; Warren RL et al. (2011) Genome Res 21:790-797)。TS−PCRは、単純で便利だが、TSプライマーは、非特異的にRNAのランダムな領域にアニーリングするか、TSプライマーを繰り返し付加させるため、高いレベルのバックグラウンド増幅が生じる(Alon S et al.(2011) Genome Res 21: 1506-1511; Kapteyn J (2010) BMC Genomics 11: 413)。そこで、本明細書は、TCR転写物ならびにアダプタープライマーおよび定常領域特異的プライマーによるその後のPCR増幅物に由来する二本鎖相補的DNAの5’末端に対するアダプターの付加によって開発されたadaptor−ligation媒介PCR(Tsurutaら(Tsuruta Y et al.(1993) J Immunol Methods 161: 7-21; Tsuruta Y et al. (1994) J Immunol Methods169: 17-23)によって初めて報告された)を記載している。平滑末端化された二本鎖相補的DNAへのadaptor−ligationは、特定のcDNAの配列にほとんど影響されず、他方で、T4 RNAリガーゼを用いた5’adaptor−ligationの効率は、配列依存的である(Jayaprakash AD et al. (2011) Nucleic Acids Res 39:e141)。さらに、T4リガーゼを用いた二本鎖DNAのライゲーションは、ライゲーションアンカー(ligation anchored)PCR(LA−PCR)におけるT4 RNAリガーゼを用いたssDNAライゲーションよりも効率的である。したがって、この非バイアスAL−PCR法は、補正または標準化を必要としないTCRレパトアの正確な分析を可能とする。
(本実施例における実証)
T細胞レセプター(TCR)遺伝子のハイスループット配列決定は、抗原特異性、Tリンパ球のクローナリティおよび多様性の分析に強力なツールとなる。ここで、発明者らは、adaptor−ligation媒介ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と組み合わせた454DNA配列決定技術を用いた新規TCRレパトア解析法を開発した。この方法は、PCRに通常生じるバイアスをかけることなく、SMART PCR法で達成し得る擬似バイアス程度のレベルではなく、真の意味での非バイアスの様式ですべてのTCR遺伝子の増幅が可能となった。
末梢血単核球細胞およびRNA抽出物の単離
インフォームドコンセントを得た後、全血を20例の健常人から回収した。本研究は、独立行政法人国立病院機構相模原病院臨床研究センターの倫理委員会によって承認された。全血10mLをヘパリン処置したチューブに回収した。末梢血単核球細胞(PBMC)をFicoll−Paque PLUSTM(GE Healthcare Health Sciences、Uppsala、Sweden)の密度勾配遠心により単離し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。細胞数をカウントして1 × 106細胞をRNA抽出に使用した。全RNAを単離して、RNeasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen、Hilden、Germany)によりメーカーの説明書に従って精製した。RNA量および純度を、Agilent 2100バイオアナライザ(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)を用いて測定した。
全RNA1μgを、Superscript III逆転写酵素(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて相補的DNA(cDNA)に変換した。poly18およびNotI部位を含むBSL−18EプライマーをcDNA合成に使用した。cDNA合成後、二本鎖(ds)−cDNAを、E.Coli DNA polymerase I(Invitrogen)、E.coli DNAリガーゼ(Invitrogen)、およびRNase H(Invitrogen)を用いて合成した。ds−cDNAをT4 DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いて平滑末端化した。P10EA/P20EAアダプターをds−cDNAの5’末端に連結させ、その後NotI制限酵素で切断した。MinElute Reaction Cleanup kit(Qiagen)を用いてアダプターおよびプライマーを除いた後、TCRα鎖定常領域特異的プライマー(CA1)またはTCRβ鎖定常領域特異的プライマー(CB1)のいずれかとP20EA(表4−1)とを使用して、PCRを行った。PCR条件は以下のとおりである:95℃(30秒)、55℃(30秒)、および72℃(1分)を20サイクル。2nd PCRを、同じPCR条件を使用して、CA2またはCB2のいずれかとP20EAプライマーとにより行った。
NGS用の増幅産物を、P20EAプライマーと融合タグプライマー(表4−1)とを使用した2nd PCR産物の増幅により調製した。アダプターA配列(CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC)を含む融合タグプライマー、4塩基配列のkey(TCAG)、分子同定(MID)タグ配列(10ヌクレオチド)、およびTCR定常領域特異的配列を、メーカーの説明書に従って設計した。PCR増幅後、増幅産物を分離して、アガロースゲル電気泳動により評価した。得られた断片(約600bp)をゲルから取り除き、QIAEX IIゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。精製された増幅産物の量をQuant−iTTM PicoGreen(登録商標)dsDNA Assay Kit(Life Technologies、Carlsbad、CA)によって定量した。10例の健常人から異なる融合タグプライマーを用いて得られた各増幅産物を、等モル濃度で混合した。エマルションPCR(emPCR)を、GS Junior Titanium emPCR Lib−L kit(Roche 454 Life Sciences、Branford、CT)により、増幅産物混合物を使用して、メーカーの説明書に従って行った。
すべてのリード配列をMID Tag配列によって分類した。人工的に付加された配列(タグ、アダプター、およびkey)および低い品質スコアを有する配列を、454配列決定システム上にインストールされたソフトウェアを使用してリード配列の両末端から取り除いた。残りの配列を、TRAVおよびTRAJのTCRα配列に対するアサインメントならびにTRBVおよびTRBJのTCRβ配列に対するアサインメントに使用した。配列のアサインメントを、偽遺伝子を含む54個のTRAV、61個のTRAJ、65個のTRBVおよび14個のTRBJ遺伝子についてのリファレンス配列のデータセット、ならびにImMunoGeneTics information system(登録商標)(IMGT)データベース(http://www.imgt.org)から利用可能なオープンリーディングフレーム(ORF)リファレンス配列のデータセットにおける最も高い同一性を用いた配列決定により行った。データ処理、アサインメント、データ集積を、本発明者らによって独自に開発されたレパトア解析ソフトウェア(Repertoire Genesis、RG)を使用して自動的に行った。RGは、BLATN、自動集積プログラム、TRVおよびTRJの使用についてのグラフィックプログラム、ならびにCDR3の鎖長分布を用いた配列相同性検索についてのプログラムを実行した。クエリー配列とエントリー配列との間のヌクレオチドレベルでの配列相同性を自動的に計算した。感受性および精度を増加させたパラメータ(E値閾値、最小カーネル、ハイスコアセグメントペア(HSP)スコア)を、それぞれのレパトア解析に対して慎重に最適化した。
104位の保存されたシステイン(Cys104)(IMGTの命名)から118位の保存されたフェニルアラニン(Phe118)までの範囲のCDR3のヌクレオチド配列およびその次のグリシン(Gly119)を、推定アミノ酸配列に翻訳した。ユニークシーケンスリード(USR)を、TRV、TRJおよび他のシーケンスリードを含むCDR3の推定アミノ酸配列において、同一性を有さないシーケンスリードとして定義した。同一のUSRのコピー数を、各試料においてRGソフトウェアによって自動的にカウントし、その後、コピー数の順位でランク付けした。全シーケンスリードにおけるTRAV、TRAJ、TRBVおよびTRBJ遺伝子を含むシーケンスリードの発生頻度の割合を計算した。
試料間で共有された配列を検索するために、個人のUSRの「TRV遺伝子名」_「CDR3領域の推定アミノ酸配列」_「TRJ遺伝子名」の文字列(例えば、TRBV1_CASTRVVJFG_TRBJ2−5)を、TCR識別子として使用した。試料中のTCR識別子を、すべての他の試料からのリードデータセットにおいて検索した。
ディープシーケンスデータにおいてTCR多様性を推定するために、いくつかの多様性指数、シンプソン指数およびシャノン・ウェーバー指数を、Rプログラムにおけるveganパッケージの関数「多様性(diversity)」を使用して計算した。これらの指数を、生態学における生物学的多様性についての尺度として、試料当たりの種の数および試料当たりの個人の数に基づいて計算した。ディープシーケンスデータにおいて、USRおよびコピー数を、種および個人にそれぞれ使用した。シンプソン指数(1−λ)を以下:
統計学的有意性を、GraphPad Prismソフトウェア(version4.0、San Diego、CA)を使用して、ノンパラメトリックなMann−WhitneyのU検定によって試験した。p<0.05の値を統計学的に有意であるとみなす。
レパトア解析ソフトウェア
本研究において開発されたクラウドベースのソフトウェアプラットフォームであるRGは、TCRレパトア解析のための高速で、正確で、便利な計算システムである。RGは、(1)V、DおよびJセグメントのアサインメント、(2)配列同一性の計算、(3)CDR3配列の抽出、(4)同一リードのカウント、(5)アミノ酸翻訳、(6)フレーム解析(ストップおよびフレームシフト)、ならびに(7)CDR3の長さの分析についての統合されたソフトウェアパッケージを提供する。NGSシーケンサから配列決定データをアップロードした後、V、DおよびJセグメントを、最適化されたパラメータを用いてそれらの配列類似性に基づいて同定することができる。リード数を自動的に集約し、その後、加工されたデータ、集計表、およびグラフを容易にダウンロードすることができる。
本発明者らは、20例の健常人由来のPBMCにおけるTCRαおよびTCRβ遺伝子のハイスループット配列決定を行った。全部で172,109個および91,234個のシーケンスリードを、RGプログラムを使用して、それぞれ、TCRαおよびTCRβのレパトア解析に対してアサインした(表4−2および4−3)。
TCRシーケンスリードにおけるTRVおよびTRJ遺伝子の使用を決定するために、TRVまたはTRJそれぞれを有するUSRのコピー数(リード数)をカウントした。個々のUSRをコピー数の順番でランク付けし、TRVおよびTRJそれぞれの頻度パーセンテージを計算した(図51および図52)。TCRαレパトアに関して、8つの偽遺伝子(AV8−5、AV11、AV15、AV28、AV31、AV32、AV33およびAV37)は、健常人において発現されなかった。ORFとして分類されるAV8−7(IMGTによるスプライシング部位、組換えシグナルおよび/または制御エレメントにおける変更に基づいて定義される)は、わずかに発現した(20個体のうち11個体において43リード)。AV18およびAV36の発現(機能遺伝子として分類される)は、健常人において観察されなかった。さらに、機能遺伝子であるAV7およびAV9−1は、1個体(9リード)および2個体(3リード)において、それぞれ十分に発現されなかった。ORF遺伝子として分類される8つのAJ遺伝子(AJ1、AJ2、AJ19、AJ25、AJ35、AJ58およびAJ61)のうち、AJ35およびAJ58の発現は、20個体すべてにおいて観察された。これらのうち、AJ25およびAJ61は、3個体(21リード)および7個体(35リード)において、それぞれわずかに発現した。AJ1、AJ2、AJ19およびAJ59は、いずれの個体にも存在しなかった。いずれの個体においても3つの偽遺伝子、AJ51、AJ55およびAJ60の発現は存在しなかった。機能遺伝子AJ14を、3個体から3リードだけ検出した。
41個のTRAVの50個のTRAJでの遺伝子組換え(偽遺伝子、ORF、および十分に発現されない遺伝子を除く)は、総数2,050個のAV−AJ組換えを生成することが可能であり(図53)、そのうち1,969個のAV−AJ組換え(96.0%)を20個体において検出した。これは、ほとんどすべてのAV−AJ組換えが、制限されずにTCR転写物において使用されたことを示した。特に、AV1−1〜AV6遺伝子を、AJ50〜AJ58で優先的には組換えられず、同様に、AV35〜AV41遺伝子のAJ3〜AJ16での組換えは、ほとんど観察されなかった。これらの遺伝子セグメントの染色体上の位置を考慮すると、これらの結果は、AV−AJ組換えは、近位AV遺伝子と遠位AJ遺伝子との間および遠位AV遺伝子および近位AJ遺伝子との間で、ほとんど起こらないことを示した。
全TCR転写物におけるTRVおよびTRJの使用を明らかにするため、TRVまたはTRJそれぞれを有するUSRの発生頻度を計算した(図51および図52)。いくつかのTRAV遺伝子における優先的使用は、ハイブリダイゼーションに基づく定量アッセイを使用して得られた以前の結果(6)と類似していた。いくつかのTRBV遺伝子をTRBVレパトアにおいて多く使用した。上位3位のTRAV9−2(ArdenによるBV4S1)、TRBV20−1(BV2S1)およびTRBV28(BV3S1)は、全シーケンスリードの3分の1を占めた。これは、マイクロプレートハイブリダイゼーションアッセイを使用した本発明者らの以前の研究で得られた結果(6)と似ていた。遺伝子の使用は、TRBJ遺伝子の間でかなり変動した。TRBJ2−1およびTRBJ2−7は非常に発現され、他方で、TRBJ1−3、TRBJ1−4、TRBJ1−6、TRBJ2−4およびTRBJ2−6の発現は低かった。
TRV遺伝子とTRJ遺伝子との組み合わせを有するTCRの使用を可視化するために、本発明者らは、TCRレパトアの3D描写を作製した(図54および図55)。3Dイメージの利点は、TRV遺伝子とTRJ遺伝子との特定の組み合わせの優位およびTCRの多様性の程度を容易に観察し得ることである。TCRβについては、TRBV遺伝子とTRBJ遺伝子との間の組換えの優先的な使用はほとんど存在しなかった。各組換えの頻度は、TRBVまたはTRBJの使用に依存した。BV29−1/BJ2−7、BV29−1/BJ2−1、BV29−1/BJ2−3およびBV20−1/BJ2−7は、すべての組み合わせにおいて高い頻度で使用され、他方で、その他は低い頻度で発現した。対照的に、TCRαレパトアの3Dイメージングは、TRAVおよびTRAJの広範な分布で、低いレベルでの発現を示した。占有率は、すべての組み合わせについて1%未満だった。注目すべきことに、AV1−2およびAJ33を有するTCRリードは、すべての健常人において高度に発現した(平均±SD:0.99±0.85)。
CDR3サイズスペクトラタイピング(Yassai M et al.(2000) J Immunol 165: 3706-3712; Yassai M et al. (2002) J Immunol 168:3801-3807)またはイムノスコープ解析(Pannetier C etal. (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90: 4319-4323; Pannetier C et al. (1995)Immunol Today 16: 176-181)と呼ばれるCDR3の鎖長分布の分析を効率的に使用し、TCRレパトアの多様性を推定した。この技術は、ゲル電気泳動による、CDR3配列を含むPCR増幅産物の実際のピーク分布に基づいている。本研究において、保存されたCys104(IMGTの命名)から118位の保存されたフェニルアラニン(Phe118)の範囲のTCRの決定されたヌクレオチド配列の長さを自動的に計算した。これは、NGSデータを使用することによってTCRの多様性およびクローナリティを推定するための可視的に容易な方法を提供する。RGは、各V領域についてのデジタルCDR3鎖長分布を表す図を生成することができる。TCRαおよびTCRβ両方のCDR3鎖長分布は、通常の分布と似ていたが、完全に対称的というわけではなかった(図56)。CDR3の鎖長は、TCRαにおいてTCRβよりも短く(平均±SD:41.2±8.3対42.8±6.1)、TCRαは、TCRβよりも正の歪度を有しており(歪度指数:11.1対5.41)、TCRαにおける分布が左側に集中したことを示した。さらに、TCRαは、TCRβよりも正の尖度を有しており、TCRαにおいて高い尖度を示した(尖度指数:282.4対176.7)。
TCRレパトアの多様性を示すために、本発明者らは、USRの平均コピー数および多様性指数(シンプソン指数およびシャノン・ウェーバー指数など)を計算した(図57)。USRの平均コピー数は、TCRαとTCRβとの間で顕著に異なった(2.0±0.72対1.70±0.57)。さらに、TCRαとTCRβとの間のシンプソン指数の逆数(D)およびシャノン・ウェーバー指数(H)において顕著な違いはなかった(D:710.3±433.0対729.7±493.9、H:7.02±0.33対6.97±0.43)。これらの結果は、健常人におけるTCRαおよびTCRβについての免疫多様性に違いがないことを示した。
個人間の遺伝子の使用の相関を明らかにするために、TRVおよびTRJの各々の頻度パーセンテージを、散布図によってすべての個体のペアの間でプロットした(図60)。各ペア間のスピアマンの相関係数を計算した。一致相関係数は、TRAVにおいてTRBVよりも低く(平均±SD、TRAVにおいて0.86±0.059、TRBVにおいて0.89±0.038、p<0.001)、TRAJにおいてTRBJよりも低かった(TRAJにおいて0.74±0.095、TRBJにおいて0.91±0.063、p<0.001)。これらの結果は、健常人の間のTRVおよびTRJの発現レベルが、TCRαと比較して、TCRβにおいて個人間でより類似していたことを示した。
少数のTCR配列は、異なる健常人の間で共有され、それらの共有されたTCRはパブリックTCRと呼ばれる。対照的に、ほとんどのTCRは各健常人に対して特異的であった(プライベートTCR)。20例の健常人におけるパブリックTCR配列を同定するために、本発明者らは、2以上の健常人の間で共有されたTCRαリードおよびTCRβリードを検索した。20例の健常人において、3041個のパブリックTCRαおよび206個のパブリックTCRβ配列が、それぞれ90,643個および57,982個のUSRから得られた(表4−8)。
パブリックTCRαは、健常人由来のPBLにおいて高頻度で観察された。パブリックTCRαの起源を決定するために、本発明者らは、以前に報告されたパブリックTCRαのCDR3配列を調べた。興味深いことに、複数の個体に対して共通であったパブリックTCRα配列は、iNKT細胞またはMAIT細胞を示す高い割合のインバリアントTCRαを含んでいた(表4−9)。
ハイスループット配列決定技術は、幅広い種類のNGSプラットフォームの開発により大きな飛躍をしてきた。NGSは、莫大な量のシーケンスデータの取得を促進するが、未だに、全ゲノムまたは遺伝子ライブラリの代わりに、目的の配列遺伝子のPCR増幅または遺伝子エンリッチメントを必要とする。多くの遺伝子セグメントの再構成によって生成された不均一なTCRまたはBCR遺伝子については、多くの遺伝子特異的プライマーによるマルチプレックスPCRが広く使用されていた。しかし、複数のプライマーの使用により、それぞれの遺伝子の間で増幅バイアスが生じ、遺伝子頻度の正確な推定を妨害する。ここで、本発明者らは、NGSに基づくTCRレパトア解析のために、非バイアスPCR技術であるadaptor−ligation媒介PCRを使用した。この方法は、単一セットのプライマーを使用し、PCRバイアスをかけることなく、理論上すべてのTCR遺伝子の増幅を可能とする。したがって、この方法は、幅広い試料からのTCR遺伝子のそれぞれの存在量を正確に推定するのに最も適している。
本実施例では、実際に応用した具体的な態様としては、BCRレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離例を行う。
ヒト化NOGマウスを用いたヒト型抗イディオタイプ抗体の取得
1.B細胞系白血病あるいは悪性リンパ腫患者においては腫瘍細胞に由来するモノクローナルBCRの高度な発現が観察される。
2.B細胞系白血病あるいは悪性リンパ腫患者の末梢血単核球細胞を採取し、本編記載のBCRレパトア解析を実施する。決定された数万リードの遺伝子配列からランキング最上位に位置し、優位に存在する腫瘍細胞由来の免疫グロブリンH鎖遺伝子を同定する。
3.決定された免疫グロブリンH鎖遺伝子配列を使って、多様性の高いCDR3領域のアミノ酸配列を推定し、その配列と同一のペプチドを合成する。
4.200μgの合成ペプチドを完全フロイントアジュバント(CFA,シグマ・アルドリッチ社)とよく混和し、シリンジを用いてヒト化NOGマウスの皮下に投与する(初回免疫)。同様に、対照マウスに対しPBSを投与する。さらに、初回投与後2週後に再度同量の抗原ペプチドを投与する。
5.初回免役から4週後に、マウスよりリンパ節または脾臓を摘出する。リン酸緩衝液(PBS、Invitrogen社)中で組織を細断し、セルストレイナー(0.75μm、BD社)でフィルターろ過し、シングルセルを調整する。
6.得られた細胞をTrizol溶液(Invitrogen社)に溶解し、本特許記載のBCRレパトア解析法により遺伝子配列を決定する。
7.得られた数万リードのBCR遺伝子配列について、その存在頻度(リード数)順にソートし、ランキング上位に位置する免疫グロブリンH鎖およびL鎖遺伝子配列を決定する。対照としてPBSを投与したマウスのリードランキングと比較して、存在頻度が有意に高い免疫グロブリンH鎖およびL鎖遺伝子配列を選択する。
8.得られた免疫グロブリンH鎖およびL鎖遺伝子配列について、P20EAアダプタープライマーとC末端primerを用いて全長免疫グロブリンH鎖および全長L鎖遺伝子をPCR増幅する。抗体発現ベクターであるpEHX1.1(抗体H鎖用、TOYOBO社)およびpELX2.2(抗体L鎖用、TOYOBO社)にLigation Kit(TAKARA社)を用いてLigation反応により、それぞれ全長遺伝子をベクター内のマルチクローニング部位に挿入する。大腸菌TOP10細胞株(One Shot(登録商標) TOP10 Chemically Competent E. coli、Invitrogen社)を形質転換し、H鎖発現プラスミドおよびL鎖発現プラスミドを得る。
9.両プラスミドについてBglIIおよびEcoRI制限酵素で二重消化し、次いでH鎖プラスミドのBglII−EcoRI切断部位に、L鎖プラスミドのBglII−EcoRI断片を挿入し、H鎖およびL鎖を共発現する抗体発現プラスミドを得る。
10.抗体発現プラスミドをQIAGEN Plasmid Mini kitを用いて大腸菌より抽出・精製し、TransIT(登録商標)-CHO Transfection Kit(TAKARA社)を用いてCHO細胞に導入する。
11.形質転換した抗体発現CHO細胞株を拡大培養し、培養上清を回収して、ProteinAアガロースアフィニティーカラム(HiTrap Protein A HP Columns、GEヘルスケア社)を用いて、使用方法に従い精製する。
12.得られた抗体蛋白量を吸光度計を用いて測定した後、抗原ペプチドとの結合反応性をELISA法で検証する。
本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法での実証例を行う。以下にその手順を説明する(図62参照)。
(1)悪性リンパ腫患者の全血10mLを採血し、Ficoll-Paque比重遠心分離(GEヘルスケアバイオサイエンス、17-1440-02)により末梢血単核球(PBMC)を分離する。
(2)患者PBMCよりTrizol Reagent(Invitrogen社)を用いて全RNAを抽出する。
(3)RNAから逆転写酵素(Superscript II, Invitrogen, 18064-014)によりcDNA合成し、その後、DNA Polymerase(Invitrogen, 18010-017)、E.coli Ligase(Invitrogen, 18052-019)、RNase H(Invitrogen, 18021071)によりdsDNA合成し、さらにT4 DNA Polymerase(Invitrogen, 18005-025)により末端の平滑化を行う。T4 ligase(Invitrogen, 15224-025)によりP20EA/P10EA adaptorのライゲーション反応(調製実施例2等を参照)を行なった後、NotI(TaKaRa, 1166A)で消化を行なう。
(4)BCR遺伝子のIgMのC領域特異的プライマー(CM1(配列番号5))とP20EAアダプター(配列番号2)により1st PCRを、CM2(配列番号6)とP20EAプライマー(配列番号2)により2nd PCRを実施する。PCR反応は、95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルをそれぞれ20サイクル行う。
(5)2nd PCR産物からプライマーを除去するため、High Pure PCR Cleanup Micro Kit(Roche)によりカラム精製を行った後、P20EAプライマー(配列番号2)にアダプターB配列(配列番号1375)を付加したB−P20EAプライマー(配列番号4)とIgM C領域特異的プライマー(CM3にアダプターA配列(配列番号39)および同定配列であるMID Tag配列(表1−6を参照)を付加したGS−PCRプライマー(配列情報は表1−1を参照)を用いてPCRを行う。
(6)GS−PCR増幅の後、2%アガロースゲル電気泳動を実施し、目視化において目的のサイズ(500bp〜700bp)のバンドを切り出し、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて精製した。回収されたDNAをQuant−iTTM PicoGreen(登録商標)dsDNA Assay Kit(Invitrogen)を用いてDNA量を測定した。1000万DNAをエマルジョンPCRに用い、Roche社製次世代シーケンス解析装置(GS Juniorベンチトップシステム)によるシーケンス解析を行う。
(7)得られた配列データについて本発明において新規に開発したTCR/BCRレパトア解析ソフトウェア(Repertoire Genesis、本明細書解析試験例、解析実施例1〜5等参照)を用いて、V及びJ配列のアサイメント並びにCDR3領域の推定アミノ酸配列を決定する。同時に、同一の塩基配列についてそのコピー数を集計し、出現頻度によるランキングを行なう。
(8)ランキング最上位のBCR遺伝子を決定し、そのBCRのリード数が全体の10%以上を占めることを著明に高いとして確認し、該BCR遺伝子を腫瘍由来BCR遺伝子として同定する。
(9)該腫瘍由来BCR遺伝子の推定アミノ酸配列について、HLA結合ペプチド予測プログラムであるBIMAS(www-bimas.cit.nih.gov/)を用いて、HLA結合ぺプチドを予測する。特に条件指定がなければデフォルトの条件を用いる。該BCRアミノ酸配列と患者HLA型をBIMASに入力し、CDR3アミノ酸配列内のペプチド、もしくはCDR3アミノ酸配列の一部を含むペプチドの中で、最も高いスコアを示した推定HLA結合ペプチドを決定する。
(10)ハイスコアHLA結合ペプチドを個別化がんペプチドとして用いて、細胞傷害性T細胞(CTL)療法または樹状細胞(DC)ワクチン療法を実施する。ここでは、DCワクチン療法を実施する。
(11)個別化がんペプチド配列を、全自動ペプチド合成装置(Protein Technologies, Inc.社)を用いて化学合成する。ペプチドは収量1mg以上、純度95%以上のものを獲得する。ペプチドは50%DMSOに溶解し、−20℃で保存する。
(12)成分採血装置(テルモアフェレーシス装置AC-555)を実施し、がん患者より単球細胞を分離する。単球を含む細胞をAIM-V培地(Invitrogen, 12055091)で洗浄した後、細胞数を計測する。
(13)プラスティックプレート上で付着しなかった細胞を除去した後、2000U/mLの顆粒球単球コロニー刺激因子(GM−CSF、和光純薬)及び400U/mLのインターロイキン−4(IL-4、ペトロテック)を含むAIM-V培地で約1週間培養し、樹状細胞(DC)に分化誘導させる。
(14)MHCクラスI&II分子、CD40,CD80またはCD86の発現をFACS解析を用いて調べることでDCに分化したことを確認した後、2×106 細胞に対して20μg/mLの個別化がんペプチドを添加し、刺激因子(ピシバニール(OK-432), ピシバニール注射用0.5KE, 中外製薬)とともにAIM-V培地(上記同様)でさらに1日培養する。
(15)ペプチド刺激したDC細胞を回収し、生理食塩水で洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入を行なう。
本実施例により、以下が達成される。
(1)悪性リンパ腫患者の末梢血においる次世代BCRレパトア解析によって、全体のBCRリードのうち50%以上を占める1種のIgM免疫グロブリン重鎖及び1種のIgM免疫グロブリン軽鎖が同定される。
(2)これら免疫グロブリン遺伝子のCDR3領域をRepertoire Genesisプログラムで特定される。
(3)BIMASプログラムに患者HLA型(例:HLA−A*02)及びIgM免疫グロブリン重鎖CDR3アミノ酸配列を入力し、結合スコアが最もハイスコアを示すペプチド配列が選択される。
(4)このペプチドを個別化がんペプチドとして、全自動ペプチド合成装置にて化学合成し、患者由来のDCをペプチドがin vitroで刺激活性化される。
(5)個別化ペプチド刺激DC細胞を患者に静脈移入し、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
(考察)
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)患者癌細胞由来のBCR配列を使って、治療用個別化がんぺプチドを作製することができ、HLA型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にDC療法やCTL療法を行なうことができる。
(2)患者のHLAに適合したペプチドを用いるため、より患者に適合し、癌細胞に特異性の高い、効果的なDC療法やCTL療法が実現できる。
(3)BCR解析から得られた遺伝子配列から直接抗原ペプチドを化学合成できるため、
安全性が高く、抗原同定などの必要がない。
本実施例では、本発明のレパトア解析を用いた改良型CTL法での実証例を行う。以下にその手順を説明する(図63参照)。
(1)応用実施例2(1)〜(9)に記載の方法でがんイディオタイプペプチドを同定する。
(2)既存のがんペプチド(NY-ESO-1ペプチド)またはがんイディオタイプペプチド(1)により同定されたペプチド)について、全自動ペプチド合成装置(Protein Technologies,Inc.社)を用いて化学合成する。ペプチドは収量1mg以上、純度95%以上のものを獲得する。ペプチドは50%DMSOに溶解し、−20℃で保存する。
(3)該がん患者より20mLの末梢血を採血し、Ficoll-Paque比重遠心分離(応用実施例2を参照)により末梢血単核球(PBMC)を分離する。
(4)CD8+T細胞分離用磁気ビーズ(Miltenyi Biotech)もしくはフローサイトメトリー装置(FACS Aria II, Beckton Dickinson)を用いて、CD8+T細胞を分離する。
(5)成分採血装置(テルモアフェレーシス装置AC-555)またはPBMCより分離した単球細胞を培養プレート(100mm ディッシュ、コーニング、353003)で培養し、非付着系の細胞を除去する。
(6)付着した単球細胞を、2000U/mLの顆粒球単球コロニー刺激因子(GM−CSF、和光純薬)及び400U/mLのインターロイキン−4(IL-4、ペトロテック)を含むAIM-V培地(応用実施例2と同じ)で約1週間培養し、樹状細胞(DC)に分化誘導させる。
(7)DCに分化したことを確認した後、2×106細胞に対して20μg/mLのペプチド(応用実施例2の「最も高いスコアを示した推定HLA結合ペプチド」)を添加し、刺激因子(ピシバニール(OK-432), ピシバニール注射用0.5KE, 中外製薬)とともにAIM-V培地でさらに1日培養する。
(8)さらに、DC培養液に対し、20μg/mLの合成ペプチド(応用実施例2の「最も高いスコアを示した推定HLA結合ペプチド」)、及び上記(3)で分離した2×106/mLのCD8+T細胞とAIM-V培地(応用実施例2等を参照)にて刺激培養する。
(9)抗原刺激により増殖したCD8+T細胞をプラスティック培養プレート(100mm ディッシュ、コーニング、353003)((5)のプレートと同様)に付着したDCと分離した後に、さらに5μg/mLの抗CD3抗体(OKT3、オルソクローンOKT3、ヤンセンファーマ)及び200U/mLのインターロイキン−2(IL−2)(Roche Applied Science、10799068001)の存在下で拡大培養する。
(9)活性化CD8+T細胞をCTL細胞として回収した後、生理食塩水にて洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入を行なう。
本実施例により、以下が達成される。
(1)悪性リンパ腫患者の腫瘍細胞由来BCR遺伝子のCDR3領域からHLA結合ペプチドが同定される。
(2)患者末梢血からCD8+T細胞分離用磁気ビーズにより2x106細胞のCD8陽性細胞を回収した。純度は98%である。
(3)患者単球由来DC細胞、CD8+細胞、ペプチドとの混合培養で抗原刺激を行い、さらに、抗CD3抗体、IL−2の存在下での拡大培養で、CD8+CTL細胞を50倍まで増殖することができる。
(4)培養CTL細胞を患者に静脈移入し、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)患者癌細胞由来のBCR配列を使って、治療用個別化がんぺプチドを作製することができ、HLA型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にCTL療法を行なうことができる。
(2)患者のHLAに適合したペプチドを用いるため、より患者に適合し、癌細胞に特異性の高い、効果的なCTL療法が実現できる。
(3)BCR解析から得られた遺伝子配列から直接抗原ペプチドを化学合成できるため、
安全性が高く、抗原同定などの必要がない。
本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたDCワクチン療法の実証例を行う。以下にその手順を説明する(図64参照)。
(1)応用実施例2(1)〜(9)に記載の方法でがんイディオタイプペプチドを同定する。
(2)既存のがんペプチド(NY-ESO-1ペプチド)またはがんイディオタイプペプチド(1)により同定されたペプチド)について、全自動ペプチド合成装置(Protein Technologies,Inc.社)を用いて化学合成する。ペプチドは収量1mg以上、純度95%以上のものを獲得する。ペプチドは50%DMSOに溶解し、−20℃で保存する。がん患者より成分採血(アフェレーシス)により単球細胞を分離する。
(3)成分採血装置(テルモアフェレーシス装置AC-555)を実施し、該がん患者より単球細胞を分離する。単球を含む細胞をAIM-V培地(応用実施例2等を参照)で洗浄した後、細胞数を計測した。
(4)プラスティックプレート(100mm ディッシュ、コーニング、353003)上で付着しなかった細胞を除去した後、2000U/mLの顆粒球単球コロニー刺激因子(GM−CSF、和光純薬)及び400U/mLのインターロイキン−4(IL-4、ペトロテック)を含むAIM-V培地(応用実施例2参照)で約1週間培養し、樹状細胞(DC)に分化誘導させる。
(5)MHCクラスI&II分子、CD40,CD80またはCD86の発現をFACSにて調べることでDCに分化したことを確認した後、2×106細胞に対して20μg/mLのペプチド((2)で合成したペプチド)を添加し、刺激因子(ピシバニール(OK-432), ピシバニール注射用0.5KE, 中外製薬)とともにAIM-V培地(応用実施例2等を参照)でさらに1日培養する。
(6)ペプチド刺激したDC細胞を回収し、生理食塩水で洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入(テルフュージョン輸液システム、テルモ)を行なう。
本実施例により、以下が達成される。
(1)悪性リンパ腫患者の腫瘍細胞由来BCR遺伝子のCDR3領域からHLA結合ペプチドを同定する。
(2)患者末梢血から単球を分離し、分化培養培地で培養することで、MHC DR+, CD40+,CD80/CD86+細胞を検出し、単球からDCへの分化が確認する。
(3)ペプチド刺激DC細胞を患者に静脈移入し、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)患者癌細胞由来のBCR配列を使って、治療用個別化がんぺプチドを作製することができ、HLA型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にDC療法を行なうことができる。
(2)患者のHLAに適合したペプチドを用いるため、より患者に適合し、癌細胞に特異性の高い、効果的なDC療法が実現できる。
(3)BCR解析から得られた遺伝子配列から直接抗原ペプチドを化学合成できるため、安全性が高く、抗原同定などの必要がない。
本実施例では、本発明のレパトア解析を用いた患者自己免疫細胞療法の実証例を行う。以下にその手順を説明する(図65参照)。
(1)応用実施例2(1)〜(9)に記載の方法でがんイディオタイプペプチドを同定する。
(2)既存のがんペプチドまたはがんイディオタイプペプチド(1)により同定されたペプチド)(について、全自動ペプチド合成装置(Protein Technologies,Inc.社)を用いて化学合成する。ペプチドは収量1mg以上、純度95%以上のものを獲得する。ペプチドは50%DMSOに溶解し、−20℃で保存する。
(3)該がん患者より20mLの末梢血を採血し、Ficoll-Paque比重遠心分離により末梢血単核球(PBMC)を分離する。
(4)CD8+T細胞分離用磁気ビーズ(Miltenyi Biotech)もしくはフローサイトメトリー装置(FACS Aria II, Beckton Dickinson)を用いて、CD8+T細胞を分離する。
(5)成分採血装置(テルモアフェレーシス装置AC-555)またはPBMCより分離した単球細胞を培養プレート(100mm ディッシュ、コーニング、353003)で培養し、非付着系の細胞を除去する。
(6)付着した単球細胞を、2000U/mLの顆粒球単球コロニー刺激因子(GM−CSF、和光純薬)及び400U/mLのインターロイキン−4(IL-4、ペトロテック)を含むAIM-V培地(応用実施例2等と同じ)で約1週間培養し、樹状細胞(DC)に分化誘導させる。
(7)DCに分化したことを確認した後、2×106細胞に対して20μg/mLのペプチド((2)で合成したペプチド)を添加し、刺激因子とともにAIM-V培地でさらに1日培養する。
(8)さらに、DC培養液に対し、20μg/mLの合成ペプチド((2)で合成したペプチド)、及び上記(3)で分離した2×106/mLのCD8+T細胞とAIM-V培地(応用実施例2等と同じ)にて刺激培養する。
(9)活性化CD8+T細胞とペプチド刺激DC細胞を共に回収した後、生理食塩水にて洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入を行なう。
本実施例により、以下が達成される。
(1)悪性リンパ腫患者の腫瘍細胞由来BCR遺伝子のCDR3領域からHLA結合ペプチドを同定する。
(2)患者末梢血からCD8+T細胞分離用磁気ビーズにより2x106細胞のCD8陽性細胞を回収する。純度は98%以上である。
(3)患者末梢血から単球を分離し、分化培養培地で培養することで、MHC DR+, CD40+,CD80/CD86+であるDCへの分化が確認する。
(4)患者単球由来DC、CD8+細胞、ペプチドを混合培養することで、腫瘍特異的CTL及びDCを増殖することができる。
(5)ペプチド刺激CD8+細胞とDC細胞を共に患者に静脈移入し、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)患者癌細胞由来のBCR配列を使って、治療用個別化がんぺプチドを作製することができ、HLA型や抗原の発現に関係なく幅広い患者に患者自己免疫細胞療法を行なうことができる。
(2)患者のHLAに適合したペプチドを用いるため、より患者に適合し、癌細胞に特異性の高い、効果的な患者自己免疫細胞療法が実現できる。
(3)BCR解析から得られた遺伝子配列から直接抗原ペプチドを化学合成できるため、安全性が高く、抗原同定などの必要がない。
(4)DC細胞とCTL細胞の相乗効果が期待でき、高い治療効果が見込める。
本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたオーダーメイドがん特異的T細胞受容体遺伝子の単離、in vitro抗原刺激によるがん特異的TCR遺伝子の単離の実証例を行う。以下にその手順を説明する(図66参照)。
(1)がん患者から常法により腫瘍細胞を摘出する。
(2)該患者由来腫瘍細胞を培養培地(RPMI1640,11875-093, Invitrogen、以下「培養液」と称することもある)中で細断した後、0.70μmのフィルター(Falconセルストレイナー、コーニング)でろ過することにより、単一細胞に分離する。培養液中に10μg/mlのマイトマイシンC(注射用マイトマイシンC、協和発酵キリン)により37℃で2時間不活化処理をする。
(3)該がん患者の全血10mLからFicoll-Paque比重遠心分離により末梢血単核球細胞(PBMC)を分離する。PBMCは培養培地(RPMI1640)で洗浄後2×106/mLの濃度で懸濁する。
(4)PBMCの一部(1×106)を未処理コントロール試料として、細胞よりRNAをTrizol RNA抽出キット(Invitrogen)により抽出する。
(5)不活化腫瘍細胞と末梢血細胞を低濃度IL−2の存在下10%FCS(16000-044, Invitrogen)を含むRPMI1640培地(RPMI1640,11875-093, Invitrogen)で1週間培養することにより腫瘍特異的T細胞を抗原刺激し、細胞増殖させる。
(6)T細胞活性化の後、培養培地から生細胞を回収し、PBS(045-29795, 和光純薬)にて洗浄後、細胞よりRNAを抽出する。
(7)(4)および(6)で抽出したRNA試料を用いて、本発明の次世代レパトア解析を実施する(その条件は、本明細書解析試験例、解析実施例1〜5に記載のものを使用することができる。)
(8)本発明の次世代レパトア解析により得られたTCR遺伝子配列データについて、コントロール試料に比し刺激試料で大きく増加したTCR遺伝子を抽出し、それらをランキング処理した後に、上位のTCRαおよびTCRβ遺伝子を選択する。
(9)これらの全長TCRαおよびTCRβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクター(Retro-X Vectors and Systems, Clonetech)にそれぞれ導入する。
(10)(9)で調製したこれらTCRα及びTCRβ組換えプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞GP2-293細胞株(631458, Clonetech)を形質転換し、遺伝子導入用レトロウイルスを作製する。
(11)成分採血装置(テルモアフェレーシス装置AC-555)により分離したリンパ球細胞を用いて、遺伝子組換えTCRαレトロウイルス及び遺伝子組換えTCRβレトロウイルスを単独で、連続して感染させることにより、機能的αβTCRを発現するリンパ球集団を得る。
(12)細胞表面におけるTCRα/TCRβヘテロダイマーの発現とその陽性細胞の割合をFACS(応用実施例5を参照、同じ条件を使用することができる)により確認する。
(13)目的のTCRα/TCRβを発現する腫瘍特異的患者リンパ球を患者に細胞移入する
(結果)
本実施例により、以下が達成される。
(1)患者腫瘍組織で刺激した試料とコントロール試料との対比から、腫瘍組織で増加するTCR遺伝子を選択し、ランキングした結果、末梢血細胞に多く存在するTCRが除かれ、腫瘍特異的TCR遺伝子が多数抽出される。
(2)これら抽出された遺伝子について、同程度のランキングにあるTCRαおよびTCRβ遺伝子を選択し、腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球の作製に利用する。
(3)レトロウイルス発現ベクター内に全長のTCRαおよびβ鎖遺伝子をクローニングすることができ、パッケージングにより高力価のTCRαレトロウイルス及びTCRβレトロウイルスが作製される。
(4)該患者リンパ球に混合レトロウイルスを感染させ、組換え型TCRα/TCRβの発現をFACSにて確認する。
(5)一連の工程により製造された腫瘍特異的TCR遺伝子組換えリンパ球を患者に移入することで、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)患者自身の癌細胞及びT細胞を使って、治療用の腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を作製することができ、HLA型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にTCR遺伝子治療を行なうことができる。
(2)患者試料に存在するTCR配列を利用するため、患者のHLAにあったTCR遺伝子を利用することができ、癌細胞に特異性の高い、効果的な治療が実現できる。
(3)患者試料に存在するTCR配列を利用するため、患者正常細胞に反応しない、安全性の高いTCR遺伝子治療が実現できる。
(3)TCR解析から得られた遺伝子配列を直接利用するため、抗原の同定が必要なく、特定の抗原を用いたTCR遺伝子の取得が必要ない。
本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたin vitro抗原刺激による単離されたがん特異的TCR遺伝子の調製の実証例を行う。以下にその手順を説明する(図67参照)。
(1)HLAが同一のがん患者からそれぞれ腫瘍細胞を摘出し、同時に末梢血を分離する。
(2)腫瘍細胞浸潤T細胞を含む腫瘍組織、あるいはリンパ球細胞からTrizol Reagent(invitrogen)を用いてRNAを抽出する。
(3)RNAから本明細書における調製実施例等で説明されているAdaptor-ligation PCR法でTCR遺伝子(調製実施例等と同じ)を増幅し、GS Juniorベンチトップシステム(Roche)等次世代シーケンスによるレパトア解析を行なう。
(4)それぞれの使用から得られたTCR遺伝子配列について新規に開発したTCR/BCRレパトア解析ソフトウェア(Repertoire Genesis、本明細書の解析実施例1〜5を参照)を用いて、V,DおよびCDR3領域の配列を決定し、同一配列の存在頻度に基づいてランキングする。
(5)個々の患者において末梢血細胞に比べ腫瘍細胞で高い存在頻度(ここでは、具体的な例として、存在頻度>10倍、かつ腫瘍組織でのランキング上位のもの)を示したTCR遺伝子を検索し、腫瘍特異的として同定する。
(6)それら腫瘍特異的TCR遺伝子について、複数の同一のHLAを有するがん患者間で共通するTCR遺伝子配列を検索する。
(7)最も多くの癌患者で共通する腫瘍特異的TCR遺伝子を治療用腫瘍特異的TCRとして選択する。
(8)これらの全長TCRαおよびTCRβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクターに導入する(応用実施例6と同じものを使用することができる)。
(9)これらTCRα及びTCRβ遺伝子発現レトロウイルスベクターから遺伝子導入用ウイルスを上記応用実施例6(10)の方法に従い作製する。
(10)該患者から採取したリンパ球に上記(9)により作製したTCRαレトロウイルスを含有する培養液とTCRβレトロウイルスを含有する培養液を等量混合し、37℃で4時間培養する。その後PBSにて細胞を洗浄し、さらに、37℃で24時間培養する。
(11)細胞表面における遺伝子組換えTCRαβ分子の発現を確認する。IOTest Beta MarkTCR Vβレパトワ解析キット(Multi-analysisTCR Vβ antibodies, IM3497, Beckman Courter)および抗ヒトCD8抗体(CD8α,6602385, Beckman Courter)を用いたFACS解析によって、CD8陽性細胞における遺伝子導入するTCRβ鎖陽性細胞の割合を確認する。
(12)(11)で目的TCRαβの発現が確認された細胞を、RPMI1640培地にて0.5 x 106細胞濃度で37℃の条件下で細胞培養を行なう。腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球ををPBSで洗浄した後、該がん患者に点滴による静脈注入(テルフュージョン輸液システム、テルモ)により細胞移入する。
本実施例により、以下が達成される。
(1)患者腫瘍組織間で共通するTCR遺伝子を選択し、ランキングした結果、末梢血細胞に多く存在するTCRが除かれ、腫瘍特異的TCR遺伝子が多数抽出される。
(2)これら抽出された遺伝子について、同程度のランキングにあるTCRαおよびTCRβ遺伝子のペア、かつ同一患者に存在するペアを選択し、腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球の作製に利用する。
(3)レトロウイルス発現ベクター内に全長のTCRαおよびβ鎖遺伝子をクローニングすることができ、パッケージングにより高力価のTCRαレトロウイルス及びTCRβレトロウイルスを作製する。
(4)該患者リンパ球に混合レトロウイルスを感染させ、組換え型TCRα/TCRβ発現をFACSにて確認する。
(5)一連の工程により製造された腫瘍特異的TCR遺伝子組換えリンパ球を患者に移入することで、腫瘍細胞数の減少、臨床症状の改善を見ることができる。
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)患者自身の癌細胞及びT細胞を使って、治療用の腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を作製することができ、HLA型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にTCR遺伝子治療を行なうことができる。
(2)患者試料に存在するTCR配列を利用するため、患者のHLAにあったTCR遺伝子を利用することができ、癌細胞に特異性の高い、効果的な治療が実現できる。
(3)患者試料に存在するTCR配列を利用するため、患者正常細胞に反応しない、安全性の高いTCR遺伝子治療が実現できる。
(3)TCR解析から得られた遺伝子配列を直接利用するため、抗原の同定が必要なく、特定の抗原を用いたTCR遺伝子の取得が必要ない。
本実施例では、本発明のレパトア解析を用いた細胞加工療法の実証例を行う。以下にその手順を説明する(図68参照)。
(1) 応用実施例6に従い遺伝子導入用レトロウイルスを作製し、機能的αβTCRを発現するリンパ球集団を作出する。
(2)応用実施例6(1)−(2)の手順に従って分離、不活化した患者由来腫瘍細胞をRPMI1640培地(11875-093, Invitrogen)で希釈する。
(3)ELISPOTキット(IFN-γ, Human,ELISpot Kit, EL285, R&D Systems社)を用いて、(1)で作製した腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球と不活化患者腫瘍細胞を、1x106/mLの細胞濃度で、リンパ球と腫瘍細胞の細胞比(E:T比)を2:1、1:1、0.5:1の比で混合したものを、37℃で24時間培養する。
(4)24時間後、細胞を除去し、PVFD膜上のINFγの産生を発色法により検出し、IFNγ産生細胞数をカウントすることで、腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球の腫瘍特異性について評価する。
(5)5%以下の細胞でIFNγの産生が見られない場合は、応用実施例6(8)で採用したTCR以外のTCR遺伝子の中で、ランキング上位で、かつTCRαとTCRβが同程度の存在比率を示すペアを選択し、応用実施例6(9)−(11)の工程を経て、新たな腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を作製する。
(6)このTCRαおよびTCRβについて、上記(1)−(4)の工程を実施し、腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球の腫瘍特異性について評価する。
本実施例により、以下が達成される。
(1)腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を作製し、不活化腫瘍細胞に対する反応性を調べる。該TCR遺伝子導入リンパ球が、腫瘍に反応して、IFNγを産生することがわかる。
(2)腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を患者に移入し、抗腫瘍効果並びに臨床症状の改善を見る。
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)患者自身の癌細胞及びT細胞を使って、治療用の腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を作製することができ、HLA型や抗原の発現に関係なく幅広い患者にTCR遺伝子治療を行なうことができる。
(2)患者試料に存在するTCR配列を利用するため、患者のHLAにあったTCR遺伝子を利用することができ、癌細胞に特異性の高い、効果的な治療が実現できる。
(3)患者試料に存在するTCR配列を利用するため、患者正常細胞に反応しない、安全性の高いTCR遺伝子治療が実現できる。
(3)TCR解析から得られた遺伝子配列を直接利用するため、抗原の同定が必要なく、特定の抗原を用いたTCR遺伝子の取得が必要ない
本実施例では、本発明のレパトア解析を用いたインビトロで刺激試験での有効性および/または安全性評価の実証例を提供する。以下にその手順を説明する(図69参照)。
(1) 応用実施例6に従い遺伝子導入用レトロウイルスを作製し、腫瘍特異的αβTCRを発現するリンパ球集団を作出する。
(1)有効性を評価する場合、患者由来の癌細胞を摘出・分離し、培養液(RPMI1640,11875-093, Invitrogen)中で細断した後、0.70μmのフィルター(Falconセルストレイナー、コーニングでろ過することにより、単一細胞に分離する。培養液中に10μg/mlのマイトマイシンC(注射用マイトマイシンC、協和発酵キリン)により37℃で2時間不活化処理をする。不活化処理を行なった後、応用実施例6に記載されるように作製した腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球と混合培養する。
(2)応用実施例8に示したELISPOT法によって、腫瘍細胞に対する反応性を評価する。すなわち、ELISPOTキット(IFN-γ, Human,ELISpot Kit, EL285, R&D Systems社)を用いて、応用実施例6に従い作製した腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球と不活化患者腫瘍細胞を、1x106/mLの細胞濃度で、リンパ球と腫瘍細胞の細胞比(E:T比)を2:1、1:1、0.5:1の比で混合したものを、37℃で24時間培養する。
(3)24時間後、細胞を除去し、PVFD膜上のINFγの産生を発色法により検出し、IFNγ産生細胞数をカウントすることで、腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球の腫瘍特異性について評価する。ELISPOT法以外に、MTT試験(CellProliferation Kit I, MTT assay, 11465007001, Roche Diagnostics)あるいはIL−2産生試験(ヒトIL-2 ELISAシステム, GEヘルスケア, RPN5965)などの細胞増殖試験によっても評価することができる。
本実施例により、以下が達成される。
(1)腫瘍特異的TCR遺伝子組換えリンパ球の不活化腫瘍細胞に対する反応性を調べた結果、高頻度なIFNγの産生が認められる。
(2)培養時間に経時的にIFNγ陽性細胞数は増加し、24時間でプラトーに達する。
(考察)
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を使った遺伝子治療を施す前に、患者自身の細胞を使った有効性の評価ができ、治療前に有効性を予測できる。
(2)有効性を評価することで、TCR遺伝子を選択して利用することができ、より効果的なTCR遺伝子治療ができる。
(1’)安全性を評価する場合、対照となる既存の細胞株、患者癌細胞を含んでいないと考えられる正常組織(腫瘍摘出の過程で採取される正常組織の一部)、あるいは固形腫瘍の場合は患者末梢血細胞を用いて(1)(2)に同様の試験を実施する。
(2’)正常組織に対する腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球の反応性をELISPOT法で定量し、評価する。
(3’)正常細胞への反応性が低く、腫瘍細胞への反応性が高い腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を選択し、患者治療に用いる。
本実施例により、以下が達成される。
(1)腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を作製し、不活化正常細胞に対する反応性を調べた結果、IFNγが産生されず、正常細胞に対してほとんど反応性を示さないことがわかる。
本実施例から、本発明により以下のような効果が達成されることが理解される。
(1)腫瘍特異的TCR遺伝子導入リンパ球を使ったハイリスクの遺伝子治療を施す前に、患者自身の細胞を使った安全性の評価ができ、より安全な治療を実現できる。
(2)安全性を評価することで、リスクの高いTCR遺伝子を除外でき、より安全なTCR遺伝子を使った治療ができる。
配列番号20〜31:BCRリードのCDR3アミノ酸配列
配列番号32〜38:実施例2で使用されるプライマー配列(表2)
配列番号39:Adaptor−Aの配列
配列番号40〜60:シーケンス用プライマー(表6)
配列番号61〜1164:BCRリードのCDR3アミノ酸配列(表1H)
配列番号1165〜1324:Molt−4細胞段階希釈試料におけるTCRリード
配列番号1325〜1374:分子同定(MID Tag)配列の例
配列番号1375:Adaptor−Bの配列
配列番号1376〜1379:TCRの各全長配列
配列番号1381〜1386:BCRの各全長配列
配列番号1387:CM3−GS(配列番号7)中の特異的配列(CM3)
配列番号1388:CA3−GS(配列番号10)中の特異的配列(CA3)
配列番号1389:CG3−GS(配列番号13)中の特異的配列(CG3)
配列番号1390:CD3−GS(配列番号16)中の特異的配列(CD3)
配列番号1391:CE3−GS(配列番号19)中の特異的配列(CE3)
配列番号1392:標的配列TRBC、名称TRBC2*01、膜結合型
配列番号1393:標的配列TRBC、名称TRBC2*02、膜結合型
配列番号1394:標的配列TRGC、名称TRGC1*02、膜結合型
配列番号1395:標的配列TRGC、名称TRGC2*01、膜結合型
配列番号1396:標的配列TRGC、名称TRGC2*02、膜結合型
配列番号1397:標的配列TRGC、名称TRGC2*03、膜結合型
配列番号1398:標的配列TRGC、名称TRGC2*04、膜結合型
配列番号1399:標的配列TRGC、名称TRGC2*05、膜結合型
配列番号1400:標的配列IGHA、名称IGHA2*01、分泌型
配列番号1401:標的配列IGHA、名称IGHA2*02s、分泌型
配列番号1402:標的配列IGHA、名称IGHA2*02、膜結合型
配列番号1403:標的配列IGHA、名称IGHA2*03、分泌型
配列番号1404:標的配列IGHD、名称IGHD*01、分泌型
配列番号1405:標的配列IGHD、名称IGHD*02、分泌型
配列番号1406:標的配列IGHD、名称IGHD*02、膜結合型
配列番号1407:標的配列IGHE、名称IGHE*01、膜結合型
配列番号1408:標的配列IGHE、名称IGHE*02、分泌型
配列番号1409:標的配列IGHE、名称IGHE*03、膜結合型
配列番号1410:標的配列IGHE、名称IGHE*04、分泌型
配列番号1411:標的配列IGHE、名称IGHE*04、膜結合型
配列番号1412:標的配列IGHG、名称IGHG1*02、分泌型
配列番号1413:標的配列IGHG、名称IGHG1*03、分泌型
配列番号1414:標的配列IGHG、名称IGHG2*0、分泌型
配列番号1415:標的配列IGHG、名称IGHG2*01、膜結合型
配列番号1416:標的配列IGHG、名称IGHG2*02、分泌型
配列番号1417:標的配列IGHG、名称IGHG2*03、分泌型
配列番号1418:標的配列IGHG、名称IGHG2*04、分泌型
配列番号1419:標的配列IGHG、名称IGHG2*05、分泌型
配列番号1420:標的配列IGHG、名称IGHG2*06、分泌型
配列番号1421:標的配列IGHG、名称IGHG2*06、膜結合型
配列番号1422:標的配列IGHG、名称IGHG3*01、分泌型
配列番号1423:標的配列IGHG、名称IGHG3*01、膜結合型
配列番号1424:標的配列IGHG、名称IGHG3*03、分泌型
配列番号1425:標的配列IGHG、名称IGHG3*03、膜結合型
配列番号1426:標的配列IGHG、名称IGHG3*04、分泌型
配列番号1427:標的配列IGHG、名称IGHG3*05、分泌型
配列番号1428:標的配列IGHG、名称IGHG3*06、分泌型
配列番号1429:標的配列IGHG、名称IGHG3*07、分泌型
配列番号1430:標的配列IGHG、名称IGHG3*08、分泌型
配列番号1431:標的配列IGHG、名称IGHG3*09、分泌型
配列番号1432:標的配列IGHG、名称IGHG3*10、分泌型
配列番号1433:標的配列IGHG、名称IGHG3*11、分泌型
配列番号1434:標的配列IGHG、名称IGHG3*12、分泌型
配列番号1435:標的配列IGHG、名称IGHG3*13、分泌型
配列番号1436:標的配列IGHG、名称IGHG3*14、分泌型
配列番号1437:標的配列IGHG、名称IGHG3*15、分泌型
配列番号1438:標的配列IGHG、名称IGHG3*16、分泌型
配列番号1439:標的配列IGHG、名称IGHG3*17、分泌型
配列番号1440:標的配列IGHG、名称IGHG3*18、分泌型
配列番号1441:標的配列IGHG、名称IGHG3*19、分泌型
配列番号1442:標的配列IGHG、名称IGHG4*01、分泌型
配列番号1443:標的配列IGHG、名称IGHG4*02、分泌型
配列番号1444:標的配列IGHG、名称IGHG4*03、分泌型
配列番号1445:標的配列IGHG、名称IGHG4*04、分泌型
配列番号1446:標的配列IGHG、名称IGHG4*04、膜結合型
配列番号1447:標的配列IGHM、名称IGHM*01、膜結合型
配列番号1448:標的配列IGHM、名称IGHM*03、分泌型
配列番号1449:標的配列IGHM、名称IGHM*03、膜結合型
配列番号1450〜1499:TRAリード(上位50位)(表3−1)
配列番号1500〜1549:TRBリード(上位50位)(表3−2)
配列番号1550〜1587:健常人における重複TCRα鎖リード配列(表3−7)
配列番号1588〜1626:健常人における重複TCRβ鎖リード配列(表3−8)
配列番号1627〜1647:インバリアントTCR候補遺伝子(表3−9)
配列番号1648〜1860:がん患者における重複TCRαリード配列とがん特異的TCR
αリード(表3−11)
配列番号1861〜1909:がん患者における重複TCRβリード配列とがん特異的TCR
β(表3−12)
配列番号1910〜1921:P5−P20EAプライマー
配列番号1922〜1929:P7−CA3プライマー
配列番号1930〜1937:P7−CB3プライマー
配列番号1938〜1992:解析システムの実施例5で同定されたパブリックTCRα配列において観察されるインバリアントTCRの配列
Claims (46)
- データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析する方法であって、該方法は、
(1)該被験者から非バイアス的に増幅した、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程;
(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程;および
(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程
を包含する、方法。 - 前記核酸試料は、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含み、前記(2)は単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がC領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記単一の配列決定は、共通アダプタープライマーを用いて行われることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記非バイアス的な増幅が、V領域特異的な増幅ではない、請求項1に記載の方法。
- 前記レパトアはBCRの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はBCRの核酸配列である、請求項1に記載の方法。
- データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
(1)該被験者から非バイアス的に増幅した、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット;
(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置;および
(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出するための装置を備えるシステム。 - 請求項7に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するシステム。
- 請求項8に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。
- 前記(1)は、以下の工程
(1−1)標的となる細胞に由来するRNA試料を鋳型として相補的DNAを合成する工程;
(1−2)該相補的DNAを鋳型として二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(1−3)該二本鎖相補的DNAに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(1−4)該アダプター付加二本鎖相補的DNAと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第1のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該TCRまたはBCRの目的とするC領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
(1−5)(1−4)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第2のPCR増幅反応を行う工程であって、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ
、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程;および
(1−6)(1−5)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第1の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第2の追加アダプター核酸配列および分子同定(MID Tag)配列を第3のTCRまたはBCRのC領域特異的配列に付加したアダプター付の第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第3のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
該第1の追加アダプター核酸配列は、DNA捕捉ビーズへの結合およびemPCR反応に適切な配列であり、
該第2の追加アダプター核酸配列は、emPCR反応に適切な配列であり、
該分子同定(MID Tag)配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程;
を包含する、
請求項1に記載の方法。 - 前記(1)キットは、以下:
(1−1)標的となる細胞に由来するRNA試料を鋳型として相補的DNAを合成する手段;
(1−2)該相補的DNAを鋳型として二本鎖相補的DNAを合成する手段;
(1−3)該二本鎖相補的DNAに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的DNAを合成する手段;
(1−4)該アダプター付加二本鎖相補的DNAと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第1のPCR増幅反応を行う手段であって、
該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該TCRまたはBCRの目的とするC領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段
(1−5)(1−4)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第2のPCR増幅反応を行う手段であって、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段;および
(1−6)(1−5)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第1の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第2の追加アダプター核酸配列および分子同定(MID Tag)配列を第3のTCRまたはBCRのC領域特異的配列に付加したアダプター付の第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第3のPCR増幅反応を行う手段であって、
該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
該第1の追加アダプター核酸配列は、DNA捕捉ビーズへの結合およびemPCR反応に適切な配列であり、
該第2の追加アダプター核酸配列は、emPCR反応に適切な配列であり、
該分子同定(MID Tag)配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、手段;
を包含する、
請求項7に記載のシステム。 - (3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出は以下の工程
(3−1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程:
(3−2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程;
(3−3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程;
(3−4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する工程;
(3−5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する工程;
(3−6)(3−5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する工程;
を包含する方法によって達成される、請求項1または10に記載の方法。 - (3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は以下
(3−1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段:
(3−2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段;
(3−3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段;
(3−4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段;
(3−5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段;
(3−6)(3−5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段;
を備える、請求項7または11に記載のシステム。 - TCRもしくはBCRレパトアを解析する方法であって、以下のステップ:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出するステップ;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップ;
(6)(5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出するステップ;
を包含する、方法。 - 前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである、請求項14に記載の方法。
- 前記トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し;リード両端からアダプタ配列と10bp以上マッチする領域を削除し;および残った長さが200bp以上(TCR)もしくは300bp以上(BCR)なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される、請求項14に記載の方法。
- 前記低クオリティは、QV値の7bp移動平均が30未満のものである、請求項16に記載の方法。
- TCRもしくはBCRレパトアを解析するシステムであって、該システムは:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段;
(6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段;
を包含する、システム。 - TCRもしくはBCRレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであって、該方法は以下のステップ:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出するステップ;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップ;
(6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出するステップ;
を包含する、プログラム。 - TCRもしくはBCRレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は以下のステップ:
(1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも1つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ:
(2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ;
(3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび/または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ;
(4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出するステップ;
(5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類するステップ;
(6)入力配列セットにおいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出するステップ;
を包含する、記録媒体。 - データベースを用いた遺伝子配列解析により、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)の定量解析を行うための試料を調製するための方法であって、
(1)標的となる細胞に由来するRNA試料を鋳型として相補的DNAを合成する工程;
(2)該相補的DNAを鋳型として二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(3)該二本鎖相補的DNAに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的DNAを合成する工程;
(4)該アダプター付加二本鎖相補的DNAと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第1のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該TCRまたはBCRの目的とするC領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
(5)(4)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第2のPCR増幅反応を行う工程であって、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程;および
(6)(5)のPCR増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第1の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第2の追加アダプター核酸配列および分子同定(MID Tag)配列を第3のTCRまたはBCRのC領域特異的配列に付加したアダプター付の第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを用いて第3のPCR増幅反応を行う工程であって、
該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、該第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該TCRまたはBCRのC領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計され、
該第1の追加アダプター核酸配列は、DNA捕捉ビーズへの結合およびemPCR反応に適切な配列であり、
該第2の追加アダプター核酸配列は、emPCR反応に適切な配列であり、
該分子同定(MID Tag)配列は、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である、工程;
を包含する、方法。 - 前記第1、第2および第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、TCRまたはBCRのレパトア解析のためのものであり、BCRである場合、IgM,IgG,IgA,IgD,またはIgEの各アイソタイプC領域に完全マッチする配列であって、該IgGおよびIgAの場合は、サブタイプについても完全マッチし、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に
不一致塩基が含まれるように選択され、
該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して2本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのBCR遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該C領域特異的プライマーと同じ程度のTmになるように設計される、請求項21に記載の方法。 - 第1のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM1(配列番号5)、CA1(配列番号8)、CG1(配列番号11)、CD1(配列番号14)、CE1(配列番号17)、CA1(配列番号35)、またはCB1(配列番号37)を有する、請求項14に記載の方法。
- 第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM2(配列番号6)、CA2(配列番号9)、CG2(配列番号12)、CD2(配列番号15)、CE2(配列番号18)、CA2(配列番号35)、またはCB2(配列番号37)を有する、請求項14に記載の方法。
- 第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、以下の構造:CM3−GS(配列番号7)、CA3−GS(配列番号10)、CG3−GS(配列番号13)、CD3−GS(配列番号16)またはCE3−GS(配列番号19)を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記TCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、いずれも、TCRまたはBCRのすべてのサブクラスに対応するセットで提供される、請求項14に記載の方法。
- 請求項14〜26のいずれか1項に記載の方法で製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法。
- 前記遺伝子解析は、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)の定量解析である、請求項27に記載の方法。
- 被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法であって、該方法は、
(1)請求項B1に記載の方法によって、該被験者のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)レパトアを解析する工程;
(2)該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のTCRまたはBCRを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のTCRまたはBCR遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のTCRまたはBCRとして選択することによってなされる、工程;
(3)決定された該がん由来のTCRまたはBCRに基づいて、HLA検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、HLA結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程;および
(4)決定されたペプチドを合成する工程;
を包含する、方法。 - 前記(3)工程のHLA検査ペプチドの候補は、BIMAS、SYFPEITHI、RANKPEPまたはNetMHCを用いて決定される、請求項29に記載の方法。
- 前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のCD8+T細胞とを混合して培養する工程を包含する、請求項29に記載の方法。
- 前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程を包含する、請求項29に記載の方法。
- 前記(4)工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のCD8+T細胞とを混合して培養してCD8+T細胞−樹状細胞/抗原提示細胞−ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞−ペプチド混合物を生産する工程を包含する、請求項29に記載の方法。
- (A)被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または請求項C1に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程;
(B)該腫瘍特異的T細胞のTCRを請求項1に記載の方法によって解析する工程;および
(C)該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的T細胞を単離する工程
を包含する、in vitro抗原刺激による単離されたがん特異的TCR遺伝子を調製する方法。 - (A)工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、請求項34に記載の方法。
- (A)工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、請求項34に記載の方法。
- (A)工程は、請求項C1に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するTリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的T細胞を生産する工程である、請求項34に記載の方法。
- (A)共通のHLAを有する被験体から単離されたリンパ球または癌組織を提供する工程;
(B)該リンパ球または癌組織について、該腫瘍特異的T細胞のTCRを請求項1に記載の方法によって解析する工程;および
(C)腫瘍特異的T細胞に共通する配列を有するT細胞を単離する工程
を包含する、共通配列検索による単離されたがん特異的TCR遺伝子を調製する方法。 - A)患者から採取されたTリンパ球を提供する工程;
B)該Tリンパ球を抗原刺激した後に、請求項1に記載の方法に基づいてTCRを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程;
C)解析された該TCRにおいて最適抗原および最適TCRを選択する工程; および
D)該最適TCRのTCR遺伝子の腫瘍特異的αおよびβTCR発現ウイルスベクターを生産する工程
を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を調製する方法。 - 前記抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる、請求項39に記載の方法。
- 前記抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる、請求項39に記載の方法。
- 前記抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、請求項39に記載の方法。
- C)工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む、請求項39に記載の方法。
- C)工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くT細胞を活性させる抗原を選択することを含む、請求項39に記載の方法。
- C)工程は、抗原刺激前後において請求項1に基づいて行ったレパトア解析から特定のTCRの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む、請求項39に記載の方法。
- 請求項38に記載の方法で単離されたがん特異的TCR遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および/または安全性評価を行う方法。
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