CN111599411B - 一种检测血液bcr重链和轻链的引物及免疫组库方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测血液BCR重链和轻链的免疫组库信息分析方法,具体包括参考序列构建、测序数据预处理、Paired Reads合并、Merge后的数据与参考序列进行比对、比对结果过滤及统计分析,同时,还提供了一种检测血液BCR的免疫组库方法,该方法中采用了上述信息分析方法,通过设计血液BCR重链和轻链的引物组合实现对CDR3区域序列的测序分析,是首次应用于兔子进行BCR的免疫组库重链和轻链的检测方法,通过对血液B细胞的免疫组库测序研究与抗体产生相关的CDR3序列信息,实现更深入的了解抗体产生的规律,同时结合基因克隆,细胞转染,蛋白测定与纯化等技术,探索出体外高效快速合成特异性抗体的新途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域的免疫组库测序技术方向,具体涉及一种基于多重PCR和高通量测序检测血液DNA的BCR重链和轻链专用引物组及免疫组库文库构建方法,进一步涉及一种检测血液BCR重链和轻链的引物及免疫组库方法、应用。
背景技术
人体内的免疫细胞主要包括T细胞和B细胞。T细胞抗原受体是特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构,大部分T细胞受体由α和β两种肽链组成,少数T细胞受体由γ和δ两种肽链组成,其中α和β两条肽链的可变区(V区)在免疫细胞成熟过程中发生基因重排,从而形成了多种重组序列片段,导致T细胞呈现出多样性。B细胞抗原受体是B细胞表面识别抗原的一种免疫球蛋白,具有抗原结合特异性,B细胞受体由两条重链和两条轻链组成,其中可变区(V区)由VH和VL两个结构域构成,它们排列顺序和氨基酸组成都呈现出高度多样性。
在任何特定时间内,某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞或者T细胞的多态性总和,被称为免疫组库(immune repertoire,IR)。它既是个体免疫状态的“快照”,又是个体免疫接触史的“全纪录”。T细胞、B细胞分别负责细胞免疫和体液免疫。人体的免疫能力很大程度上依赖于T细胞和B细胞的多样性。T细胞受体(T cell receptor,TCR)和B细胞受体(B cell receptor,BCR)由多条肽链组成,具有抗原结合特异性,每条肽链的互补决定区(complementarity-determining region,CDR,又称超变区)氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性,构成容量巨大的TCR和BCR库。TCR或BCR的基因多样性,一方面通过组合多样性、连接多样性等胚系基因重排而获得(即由多个不连续功能性的V、D、J、C基因片断重排),另一方面通过核苷酸的随机插入、剪接、二次重排等获得,形成多样性的抗原互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)。其中CDR3最能直接反应TCR或BCR的多样性。T细胞和B细胞对众多抗原的识别依赖于CDR3区的多样性,故对TCR CDR3区、BCR CDR3区序列的分析,可作为判别细胞抗原识别特性的重要指标。研究免疫组库有助于了解个体的免疫状态,分析疾病的发生、发展和预后。
至今免疫组库研究技术主要经历了3个阶段。从最初的流式细胞术分析T细胞各亚家族的分布与缺失,到免疫扫描谱系分析技术研究各亚家族CDR3基因长度的多态性,再到如今高通量测序技术能够完整的检测所有T细胞、B细胞的CDR3序列,并能实现T细胞α、β双链测序,B细胞轻重链(HL链)同时测序。前两种技术都只能从一定程度上反映T、B细胞的克隆性分布,而高通量测序技术能够同时分析所有T、B细胞CDR3序列,真实地反映所有TCR、BCR的遗传信息,较全面地揭示TCR、BCR免疫组库的复杂性和多样性,是免疫组库研究最具划时代意义的重要技术。高通量测序技术的发展将免疫组库研究推向新的阶段。免疫组库测序技术(immune repertoire sequencing,IR-SEQ)主要通过5’RACE或者多重PCR技术将免疫球蛋白重链(IGH)或者T细胞受体β区多态性最高的互补决定区(CDR3)捕获下来,然后进行高通量深度测序,在此基础上研究B细胞或者T细胞的多态性,是当今一大研究亮点。
目前,免疫组库测序技术尽管还不能作为疾病诊断或治疗的依据,然而显示出在某些疾病的微小残留检测、疗效评估、预后监测、疫苗的研发和评估、生物标志物的发现中具有参考价值和积极意义。然而,免疫组库测序技术本身仍然具有一些缺陷,例如:(1)常规的T细胞和B细胞的免疫组库测序技术有5’RACE和多重PCR。5’RACE技术只能基于细胞RNA,先通过TCR/BCR的C区(恒定区)的通用引物序列向V(D)J区域(可变区)扩增,然后引入的接头序列进行第二次无偏好的PCR扩增。该方法操作复杂,对TCR/BCR的C区通用引物的特异性要求高,检测结果常包含非特异性序列造成有效数据量降低,影响有效数据的分析。多重PCR技术可以基于细胞DNA或RNA,在TCR/BCR的V区设置上游引物,J区或C区设置下游引物,通过PCR扩增获得目的区域的基因片段信息。该方法可以保证扩增产物区域的特异性,但如果扩增引物数量过多会造成扩增产物不均一的情况。(2)一般设计的引物组合是一种V区亚型对应一组引物对,如果包含多种V区亚型会使引物组合的复杂程度增加,在多重PCR扩增时容易造成不同引物对扩增的效率存在差异,进而影响后续对CDR3区域序列变化分析的准确性。
发明内容
本发明旨在建立一种血液BCR免疫组库检测的方法,通过设计血液BCR重链和轻链的引物组合实现对CDR3区域序列的测序分析,同时可以得到V(D)J亚型的组合信息,推进对抗体生成与CDR3序列变化关系的技术发展,本发明具体提供了一种检测血液BCR重链和轻链的免疫组库信息分析方法,包括以下步骤:
(1)参考序列构建
从国际免疫遗传信息系统IMGT数据库中下载V、D、J基因的所有序列构成模板序列,再将特异性的引物与V、D、J所有序列进行比对,引物与模板序列小于等于3个错配的位置都保留下来,从引物的起始位置开始至能形成PCR产物的部分作为参考序列,若引物与模板序列存在错配,则生成2条参考序列;对于构建成的参考序列库,进行合并,去除重复的参考序列,保留一条;参考序列构建完成后,序列id上已经明确了CDR3起始、终止位置信息;
(2)测序数据预处理
获得测序数据后,对其进行预处理,数据预处理包括去除接头adapter污染序列、低质量序列、N比率过高序列;
(3)双端序列Paired Reads合并:
利用拼接原理,把测序得到的双端末尾序列Paired-end reads进行拼接合并,即重叠区Contigs;
(4)双端末尾序列Paired-end reads合并后的数据与参考序列进行比对:
拼接好的序列重叠区contigs与构建好的参考序列进行序列对位的比对,序列与V、D、J分开比对;重新比对,找出最佳比对及精确比对位置,方法为:根据序列对位blast的比对结果,V向3’端延伸,D向两端延伸,J向5’端延伸,进行重新比对、计算得分和identity;对V、D、J分别选出得分最高的比对结果作为最佳比对;为了精确V、D、J的比对位置,在特定区域设定有限的错配mismatch数目;对V、J,属于CDR3的部分设定一定的错配mismatch,对D,在整个比对区域设定一定的错配mismatch;具体设定的错配mismatch数目因不同的链而有区别;
(5)比对结果过滤:
过滤过程包括但不限于以下任意一种:低频率序列、缺少V基因或者J基因的序列、V基因与J基因比对正负链不一致的序列、比对到假基因上的序列、翻译成氨基酸序列,如果含有终止子、开发阅读框内的碱基长度不为3的倍数;
(6)统计分析:根据CDR3的位置,把DNA序列翻译成氨基酸序列,并统计多肽的频率信息;经过过滤,得到可靠的比对结果,统计V、D、J基因的使用频率、插入缺失、长度、碱基组成,免疫多样性情况信息,绘制V、J基因表达的2D、3D图,呈现免疫组库多样性。
作为本发明的具体实施方式,还提供一种血液BCR重链和轻链的免疫组库检测方法,包括BCR重链和轻链的多重PCR扩增、根据illumina测序仪适配接头序列进行的第二次PCR扩增、高通量测序、上述免疫组库信息分析方法进行的信息分析。
作为改进,PCR扩增含有2组引物,第一组P1为混合引物mix,是多重PCR扩增的引物对,第二组P2为上游引物、下游引物,是根据illumina测序仪适配接头序列进行的第二次PCR扩增的引物对。
作为改进,多重PCR的扩增条件为98℃预变性45s;98℃变性10s,60℃退火1min,72℃延伸45s,共15-25个循环,优选25个循环;72℃终延伸5min;4℃保持;第二步PCR的扩增条件为PCR扩增条件为:98℃预变性45s;98℃变性10s,63℃退火30s,72℃延伸30s,共15-25个循环,优选25个循环;72℃终延伸5min;4℃保持。
作为改进,步骤(1)中,PCR产物含有2组引物,第一组P1为混合引物mix,用于第一步PCR的扩增引物对,第二组P2为上游引物、下游引物,用于根据illumina测序仪适配接头序列进行的第二次PCR扩增的引物对。
作为改进,第一步PCR的扩增条件为98℃预变性45s;98℃变性10s,60℃退火1min,72℃延伸45s,共15-25个循环,优选25个循环;72℃终延伸5min;4℃保持;第二步PCR的扩增条件为PCR扩增条件为:98℃预变性45s;98℃变性10s,63℃退火30s,72℃延伸30s,共15-25个循环,优选25个循环;72℃终延伸5min;4℃保持。
作为改进,第一组P1的混合引物mix,包含有至少一组引物对,该引物对包含多个血液BCR的V区亚型。
作为改进,第一组P1的上游引物共24条,序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.24所示,下游引物共10条,序列分别如SEQ ID NO.25~SEQ ID NO.34所示。
作为改进,各条上游引物和下游引物按照IGH组、IGK组、IGL组,分组后设定的浓度比例依次为1:1~1.5:1~1.5;其中设置IGH组为正向序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.8所示;反向序列如SEQ ID NO.25~SEQ ID NO.31所示;IGK组为正向序列如SEQ ID NO.9~SEQID NO.14所示;反向序列如SEQ ID NO.32~SEQ ID NO.33所示;IGL组为正向序列如SEQ IDNO.15~SEQ ID NO.24所示;反向序列如SEQ ID NO.34所示作为改进,第二组P2的上游引物,其序列如SEQ ID NO.35;下游引物,其序列如SEQ ID NO.36所示。
作为本发明的具体实施方式,还提供了上述检测方法或信息分析方法在制备单克隆抗体、或分析血液BCR功能变化试剂盒、或挖掘血液BCR序列与其编码的抗体之间一一对应关系、或用于检测血液BCR重链和轻链的免疫组库引物的应用。
有益效果:
本发明首次建立了BCR免疫组库重链和轻链的检测方法,通过对B细胞的免疫组库测序研究可以了解与抗体产生相关的CDR3序列信息,可以更深入的了解抗体产生的规律,同时结合基因克隆,细胞转染,蛋白测定与纯化等技术,获得体外高效快速合成特异性抗体的新途径。
本发明在多重PCR的基础上对引物设计进行了优化,将部分多个V区或C区亚型引物合并为一条引物,通过引物下游的基因序列对不同亚型进行区分,降低了引物组合的繁杂程度和引物组合数量过多引起PCR扩增产物不均一现象的发生,进而提高对CDR3区域序列变化分析的准确性。相比与目前常用的制备单克隆特异性抗体方法,该方法从基因水平分析与抗体表达可能相关的BCR重链和轻链的CDR3序列区域,该区域与抗体的多样性相关,能实现对抗体表达生成的精准分析,同时为体外合成抗体新方法的提供理论基础。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为本发明免疫组库BCR重链多样性分析图表示意图。
图3为本发明免疫组库BCR轻链(K链和L链)多样性分析示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
1.本发明的技术原理
本发明中针对引物进行了改进,改进后提供引物组合简洁,明确:一般设计的引物组合是一种V区亚型对应一组引物对,如果包含多种V区亚型会使引物组合的复杂程度增加,在多重PCR扩增时容易造成不同引物对扩增的效率存在差异,进而影响后续对CDR3区域序列变化分析的准确性。该方法改进了引物组合的设计,使部分引物组合可以包含多个V区亚型,减少了引物组合的数量,降低了引物组合的繁杂程度,因此可以避免引物组合过多产生的引物扩增不均一,进而降低对CDR3区域序列变化分析的准确性的影响。
(1)引物组设计原理:
多重PCR引物组设计信息来源于IMGT数据库,根据IMGT数据库提供的兔子BCR的重链和轻链的序列信息设计V区和C区亚型多重PCR的P1引物对,用于第一步PCR的扩增,然后根据illumina测序仪适配接头序列设计第二次PCR扩增所需的P2通用引物对。引物体系名称如下:
BCR重链和轻链的多重PCR引物采用上游共24条引物,序列分别如SEQIDNO.1-24所示,下游共10条引物,序列分别如SEQIDNO.25-34所示,见上表所示。
第二步PCR扩增引物信息如下:
K代表G/T,W代表A/T,Y代表C/T,N代表A/T/C/G。
根据设计的引物组,可鉴定B细胞中免疫球蛋白受体重链(IGH)V区39个亚型,免疫球蛋白受体免疫球蛋白轻链K链(IGK)V区68个亚型,免疫球蛋白受体免疫球蛋白轻链L链(IGL)V区20个亚型。
(2)免疫组库测序原理:
常规的T细胞和B细胞的免疫组库测序技术有5’RACE和多重PCR。5’RACE技术只能基于细胞RNA,先通过TCR/BCR的C区(恒定区)的通用引物序列向V(D)J区域(可变区)扩增,然后引入的接头序列进行第二次无偏好的PCR扩增。该方法操作复杂,对TCR/BCR的C区通用引物的特异性要求高,检测结果常包含非特异性序列造成有效数据量降低,影响有效数据的分析。
多重PCR技术可以基于细胞DNA或RNA,在TCR/BCR的V区设置上游引物,J区或C区设置下游引物,通过PCR扩增获得目的区域的基因片段信息。该方法可以保证扩增产物区域的特异性,但如果扩增引物数量过多会造成扩增产物不均一的情况。
因此本发明在多重PCR的基础上对引物设计进行了优化,将部分多个V区或C区亚型引物合并为一条引物,通过引物下游的基因序列对不同亚型进行区分,降低了引物组合数量过多引起PCR扩增产物不均一现象的发生。
基于多重PCR扩增技术,将B细胞中免疫球蛋白受体重链和轻链的V区和C区之间的区域序列扩增富集出来,该区域内包含与抗体多样性相关的CDR3序列。然后将第一步多重PCR富集的目的片段再加入测序接头进行第二步PCR扩增,随后对新的扩增片段进行磁珠纯化和琼脂糖电泳后切胶回收纯化,获得待测序的免疫组库文库。将免疫组库文库按一定比例混合后放入高通量测序仪中对DNA片段的序列信息进行检测,通过分析后得到B细胞中免疫球蛋白受体重链和轻链的V区和J区亚型组合,同时得到CDR3序列的DNA碱基信息。
2.实施技术:
本发明在进行检测血液BCR的免疫组库方法时,具体步骤为:血液中RNA的提取及逆转录为cDNA;BCR重链和轻链的多重PCR引物的混合,包含有至少一组引物对,该引物对包含多个V区亚型;cDNA的BCR重链和轻链多重PCR扩增;多重PCR产物加入测序接头进行第二次PCR扩增及胶回收产物纯化,包含至少一条引物,该引物为至少两个V区或C区亚型引物合并的引物,通过引物下游的基因序列对不同亚型进行区分;高通量测序;血液BCR重链和轻链的免疫组库信息分析。具体为:
(1)兔子血液RNA的提取:采用天根生化科技(北京)有限公司的高效血液总RNA提取试剂盒并按说明书操作提取兔子血液总RNA,得到RNA溶液,提出来的RNA用Nanodrop(Thermo)进行浓度测定,提取的RNA浓度不低于50ng/ul。
(2)RNA逆转录成cDNA:取200ng-2μg的RNA模板,采用天根生化科技(北京)有限公司的Quantscript RT试剂盒并按说明书操作。反应体系如下:
上述混合液在37℃孵育60min,得到cDNA模板。
(3)多重PCR引物的混合:将用于第一步PCR反应的引物按如下比例混合得到混合引物Mix。
设置IGH组为正向序列如SEQIDNO.1-8所示;反向序列如SEQIDNO.25-31所示;IGK组为正向序列如SEQIDNO.9-14所示;反向序列如SEQIDNO.32-33所示;IGL组为正向序列如SEQIDNO.15-24所示;反向序列如SEQIDNO.34所示)之间的浓度比例1:1~1.5:1~1.5。
优选地,可设计如下的实施例:
(4)取离心管,使用武汉爱博泰克公司的Gloria HiFi 2X PCR预混液按如下表反应体系,配置第一步多重PCR扩增试剂,并将配置好的试剂,颠倒混匀,短暂离心,放入PCR仪中,并按如下PCR扩增反应条件进行:
反应体系:
第一步PCR扩增反应条件:
(5)1.0倍XP磁珠纯化:将PCR反应混合物转移至1个1.5mL离心管中,用AMPure XPDNA Purification kit(Thermo)纯化扩增后的样品。
5.1取出4℃保存的Ampure XP Beads,室温放置30min平衡;
5.2使用前振荡均匀,按照样品体积1.0倍体积加入磁珠50ul并混匀,静置5min,瞬时离心3秒。
5.3将1.5mL离心管转移放置在磁力架上,静置3-5min至澄清;
5.4小心吸去上清,不要触及磁珠,1.5mL离心管放在磁力架上;
5.5加入500μL 75%乙醇,轻轻吹打磁珠2-3次,等待30秒,弃上清,加入乙醇时应缓缓加入,尽量不要让液体往磁珠方向添加,否则会使磁珠脱离管体而损耗。
5.6重复步骤5.5,尽量去除上清(此步不需要吹打磁珠)。
5.7置恒温混匀仪37℃干燥3-5min左右,磁珠表面没有水分即可。仔细观察磁珠情况,避免磁珠干裂之后再持续加热,持续加热有使磁珠崩离加样孔的潜在风险,造成损失和样品间污染,个别未干孔可取离干燥仪静置风干。
5.8往1.5mL离心管中加入31μL nuclease-free water,充分混匀,静置5min,然后置于磁力架约5min至澄清。
5.9将30μL澄清液转移至事先准备好的新1.5mL离心管中(转管时需要特别注意将转移至对应管中,避免出错)。
(6)使用XP磁珠片段选择:
6.1按照样品体积0.5(15ul)倍体积加入XP磁珠,至上一步得到的30μL样品中,并混匀,静置4min,瞬时离心3秒。
6.2将1.5mL离心管转移放置在磁力架上,静置3-5min至澄清;
6.3小心吸取上清至新的EP管内,再加入0.6(24ul左右)倍体积XP磁珠,混匀,室温静置5min,并将原来EP管的磁珠丢掉;
6.4加入500μL 75%乙醇,轻轻吹打磁珠2-3次,等待30秒,弃上清,加入乙醇时应缓缓加入,尽量不要让液体往磁珠方向添加,否则会使磁珠脱离管体而损耗。
6.5重复步骤6.4,尽量去除上清,此步不需要吹打磁珠。
6.6置恒温混匀仪37℃干燥3-5min左右,磁珠表面没有水分即可。仔细观察磁珠情况,避免磁珠干裂之后再持续加热,持续加热有使磁珠崩离加样孔的潜在风险,造成损失和样品间污染,个别未干孔可取离干燥仪静置风干。
6.7往1.5mL离心管中加入24μLnuclease-free water,充分混匀,静置5min,然后置于磁力架约5min至澄清。
6.8将23μL澄清液转移至事先准备好的新1.5mL离心管中,转管时需要特别注意将转移至对应管中,避免出错。
(7)PCR扩增目的产物,并加入测序引物:
将上一步得到的DNA在200μL的PCR管按以下体系配制PCR反应体系和反应条件如下
第二步PCR扩增反应条件:
(8)同(5)1倍磁珠纯化
(9)多重PCR产物片段选择,回收产物:
9.1配置2%的琼脂糖回收胶,并加入GelRed染料
9.2将上述多重PCR纯化后产物进行电泳,400mA,100V,电泳2h
9.4片段选择:根据DNA Marker选择性切取200-350bp的琼脂糖胶,放入2ml EP管中
9.5回收切胶:用Qiagen公司的QIAquick Gel Purification Kit纯化胶回收产物,回溶30ul。
(10)上机测序:采用Illumina Novaseq6000程序进行上机测序,测序实验按照制造商提供的操作说明书进行上机测序操作。
(11)生物信息分析:从成熟的IMGT数据库中下载V、D、J基因的所有序列。将特异性的引物primer与V/D/J所有序列进行比对,primer与模板序列小于等于3个mismatch的位置都保留下来。从primer的起始位置开始,之后能形成PCR产物的部分作为参考序列,若primer与模板序列存错配mismatch,则生成2条参考序列。对于构建成的参考序列库,进行合并,去除重复的参考序列,保留一条。参考序列构建完成后,序列id上已经明确了CDR3起始终止等位置信息。根据CDR3的位置,把DNA序列翻译成氨基酸序列,并统计多肽的频率信息。经过过滤,得到可靠的比对结果,统计V/D/J基因的使用频率、插入缺失、长度、碱基组成,V-J配对情况,即免疫多样性情况等信息。绘制V/J基因表达的2D、3D图,呈现免疫组库多样性。
实施方式举例-对正常兔子进行免疫组库BCR重链轻链分析:
(1)兔子血液RNA的提取:采用天根生化科技(北京)有限公司的高效血液总RNA提取试剂盒并按说明书操作提取兔子血液总RNA,得到RNA溶液,提出来的RNA用Nanodrop(Thermo)进行浓度测定,提取的RNA浓度不低于50ng/ul。
(2)RNA逆转录成cDNA:取200ng-2μg的RNA模板,采用天根生化科技(北京)有限公司的Quantscript RT试剂盒并按说明书操作。反应体系如下:
上述混合液在37℃孵育60min,得到cDNA模板。
(3)多重PCR引物的混合:将用于第一步PCR反应的引物按如下比例混合得到混合引物Mix。
(4)取离心管,使用武汉爱博泰克公司的Gloria HiFi 2X PCR预混液按如下表反应体系,配置第一步多重PCR扩增试剂,并将配置好的试剂,颠倒混匀,短暂离心,放入PCR仪中,并按如下PCR扩增反应条件进行:
反应体系:
第一步PCR扩增反应条件:
(5)1.0倍XP磁珠纯化:将PCR反应混合物转移至1个1.5mL离心管中,用AMPure XPDNA Purification kit(Thermo)纯化扩增后的样品。
5.1取出4℃保存的Ampure XP Beads,室温放置30min平衡;
5.2使用前振荡均匀,按照样品体积1.0倍体积加入磁珠(50ul)并混匀,静置5min,瞬时离心3秒。
5.3将1.5mL离心管转移放置在磁力架上,静置3-5min至澄清;
5.4小心吸去上清,不要触及磁珠(1.5mL离心管放在磁力架上);
5.5加入500μL 75%乙醇,轻轻吹打磁珠2-3次,等待30秒,弃上清(加入乙醇时应缓缓加入,尽量不要让液体往磁珠方向添加,否则会使磁珠脱离管体而损耗。)
5.6重复步骤5.5,尽量去除上清(此步不需要吹打磁珠)。
5.7置恒温混匀仪37℃干燥3-5min左右,磁珠表面没有水分即可。(仔细观察磁珠情况,避免磁珠干裂之后再持续加热,持续加热有使磁珠崩离加样孔的潜在风险,造成损失和样品间污染,个别未干孔可取离干燥仪静置风干)。
5.8往1.5mL离心管中加入31μL nuclease-free water,充分混匀,静置5min,然后置于磁力架约5min至澄清。
5.9将30μL澄清液转移至事先准备好的新1.5mL离心管中(转管时需要特别注意将转移至对应管中,避免出错)。
(6)使用XP磁珠片段选择:
6.1按照样品体积0.5(15ul)倍体积加入XP磁珠,至上一步得到的30μL样品中,并混匀,静置4min,瞬时离心3秒。
6.2将1.5mL离心管转移放置在磁力架上,静置3-5min至澄清;
6.3小心吸取上清至新的EP管内,再加入0.6(24ul左右)倍体积XP磁珠,混匀,室温静置5min。(并将原来EP管的磁珠丢掉);
6.4加入500μL 75%乙醇,轻轻吹打磁珠2-3次,等待30秒,弃上清(加入乙醇时应缓缓加入,尽量不要让液体往磁珠方向添加,否则会使磁珠脱离管体而损耗。)
6.5重复步骤6.4,尽量去除上清(此步不需要吹打磁珠)。
6.6置恒温混匀仪37℃干燥3-5min左右,磁珠表面没有水分即可。(仔细观察磁珠情况,避免磁珠干裂之后再持续加热,持续加热有使磁珠崩离加样孔的潜在风险,造成损失和样品间污染,个别未干孔可取离干燥仪静置风干)。
6.7往1.5mL离心管中加入24μL nuclease-free water,充分混匀,静置5min,然后置于磁力架约5min至澄清。
6.8将23μL澄清液转移至事先准备好的新1.5mL离心管中(转管时需要特别注意将转移至对应管中,避免出错)。
(7)PCR扩增目的产物,并加入测序引物:
将上一步得到的DNA在200μL的PCR管按以下体系配制PCR反应体系和反应条件如下
第二步PCR扩增反应条件:
(8)同(5)1倍磁珠纯化
(9)多重PCR产物片段选择,回收产物:
9.1配置2%的琼脂糖回收胶,并加入GelRed染料
9.2将上述多重PCR纯化后产物进行电泳,400mA,100V,电泳2h
9.4片段选择:根据DNA Marker选择性切取200-350bp的琼脂糖胶,放入2ml EP管中
9.5回收切胶:用Qiagen公司的QIAquick Gel Purification Kit纯化胶回收产物,回溶30ul。
(10)上机测序:采用Illumina Novaseq6000程序进行上机测序,测序实验按照制造商提供的操作说明书(参见Illumina/Solexa官方https://www.illumina.com.cn公布)进行上机测序操作。
(11)生物信息分析:从IMGT(http://www.imgt.org/)数据库中下载V、D、J基因的所有序列。将特异性的引物(primer)与V/D/J所有序列进行比对,primer与模板序列小于等于3个mismatch的位置都保留下来。从primer的起始位置开始,之后能形成PCR产物的部分作为参考序列,若primer与模板序列存在mismatch,则生成2条参考序列。对于构建成的参考序列库,进行合并,去除重复的参考序列,保留一条。参考序列构建完成后,序列id上已经明确了CDR3起始终止等位置信息。根据CDR3的位置,把DNA序列翻译成氨基酸序列,并统计多肽的频率信息。经过过滤,得到可靠的比对结果,统计V/D/J基因的使用频率、插入缺失、长度、碱基组成,V-J配对情况(即免疫多样性情况)等信息。绘制V/J基因表达的2D、3D图,呈现免疫组库多样性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 谱天(天津)生物科技有限公司
<120> 一种检测血液BCR重链和轻链的引物及免疫组库方法、应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagacgtgtg ctcttccgat ctggatacgg ccacctattt ctg 43
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacacgacg ctcttccgat ctaagccccg gatcaggcag cc 42
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctacacgacg ctcttccgat ctaagccctg gatcaggcag cc 42
<210> 27
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacacgacg ctcttccgat ctaagccatc gatcaggcag cc 42
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacacgacg ctcttccgat ctaagtcccg cgccaggcag cc 42
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctacacgacg ctcttccgat ctaccaggtt cccatcggtc ag 42
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
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ctacacgacg ctcttccgat cttggtggga agakgaggac agtagg 46
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctacacgacg ctcttccgat cttggtggga agakgaggac agaagg 46
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacacgacg ctcttccgat ctccttgagy tcctcwgagg aggg 44
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
Claims (9)
1.一种检测血液BCR重链和轻链的免疫组库信息分析方法,其特征在于,包括步骤
(1)参考序列构建:
从国际免疫遗传信息系统IMGT数据库中下载 V、 D、 J 基因的所有序列构成模板序列,再将特异性的引物与 V、 D、 J所有序列进行比对, 引物与模板序列小于等于 3 个错配的位置都保留下来,从引物的起始位置开始至能形成 PCR 产物的部分作为参考序列,若引物与模板序列存在错配,则生成 2 条参考序列;对于构建成的参考序列库,进行合并,去除重复的参考序列,保留一条;参考序列构建完成后,序列 id 上已经明确了 CDR3 起始、终止位置信息;
(2)测序数据预处理:
获得测序数据后,对其进行预处理,数据预处理包括去除接头 adapter污染序列、低质量序列、N 比率过高序列;
(3)双端序列Paired Reads合并:
利用拼接原理,把测序得到的双端末尾序列Paired-end reads进行拼接合并,即重叠区Contigs;
(4)双端末尾序列Paired-end reads合并后的数据与参考序列进行比对:
拼接好的序列重叠区contigs与构建好的参考序列进行序列对位的比对,序列与 V、D、 J 分开比对;重新比对,找出最佳比对及精确比对位置,方法为:根据序列对位blast 的比对结果,V向 3’端延伸, D 向两端延伸, J 向 5’端延伸,进行重新比对、计算得分和identity;对 V、D、J分别选出得分最高的比对结果作为最佳比对;为了精确 V、D、J 的比对位置,在特定区域设定有限的错配mismatch数目;对V、 J,属于 CDR3 的部分设定一定的错配mismatch,对 D,在整个比对区域设定一定的错配mismatch;具体设定的错配mismatch数目因不同的链而有区别;
(5)比对结果过滤:
过滤过程包括但不限于以下任意一种:低频率序列、缺少 V 基因或者 J 基因的序列、V基因与 J 基因比对正负链不一致的序列、比对到假基因上的序列、翻译成氨基酸序列,如果含有终止子、开发阅读框内的碱基长度不为 3 的倍数;
(6)统计分析:根据 CDR3 的位置,把 DNA 序列翻译成氨基酸序列,并统计多肽的频率信息;经过过滤,得到可靠的比对结果,统计V、D、J基因的使用频率、插入缺失、长度、碱基组成,免疫多样性情况信息,绘制V、J基因表达的 2D、3D 图,呈现免疫组库多样性。
2.一种血液BCR重链和轻链的免疫组库检测方法,其特征在于,包括BCR重链和轻链的多重PCR扩增、根据illumina测序仪适配接头序列进行的第二次PCR扩增、高通量测序、权利要求1所述的免疫组库信息分析方法进行的信息分析。
3.根据权利要求2所述的免疫组库检测方法,其特征在于, PCR扩增含有2组引物,第一组P1为混合引物mix,是多重PCR扩增的引物对,第二组P2为上游引物、下游引物,是根据illumina测序仪适配接头序列进行的第二次PCR扩增的引物对。
4.根据权利要求3所述的免疫组库检测方法,其特征在于,多重PCR的扩增条件为98℃预变性45s;98℃变性10s,60℃退火1min,72℃延伸45s,共15-25个循环;72℃终延伸5min;4℃保持;第二步PCR的扩增条件为PCR扩增条件为:98℃预变性45s;98℃变性10s,63℃退火30s,72℃延伸30s,共15-25个循环;72℃终延伸5min;4℃保持。
5.根据权利要求3所述的免疫组库检测方法,其特征在于,第一组P1的混合引物mix,包含有至少一组引物对,该引物对包含多个BCR的V区或C区亚型。
6.根据权利要求3所述的免疫组库检测方法,其特征在于,第一组P1的上游引物共24条,序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.24所示,下游引物共10条,序列分别如SEQ IDNO.25~ SEQ ID NO.34所示。
7.根据权利要求6所述的免疫组库检测方法,其特征在于,各条上游引物和下游引物按照IGH组、IGK组、IGL组,分组后设定的浓度比例依次为1:1~1.5:1~1.5;其中设置IGH组为正向序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.8所示;反向序列如SEQ ID NO.25~ SEQ ID NO.31所示;IGK组为正向序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.14所示;反向序列如SEQ ID NO.32~SEQ ID NO.33所示;IGL组为正向序列如SEQ ID NO.15~ SEQ ID NO.24所示;反向序列如SEQ ID NO.34所示。
8.根据权利要求3所述的免疫组库检测方法,其特征在于,第二组P2的引物序列上游引物,其序列如SEQ ID NO.35;下游引物,其序列如SEQ ID NO.36所示。
9.根据权利要求1所述的免疫组库信息分析方法和/或权利要求2-8任一所述的免疫组库检测方法在制备单克隆抗体、分析血液BCR功能变化试剂盒、用于血液BCR重链和轻链的免疫组库引物检测或挖掘血液BCR序列与其编码的抗体之间一一对应关系中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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