CN109929924B - 一种基于高通量测序的igh基因重排检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法，其包括：根据已知的IGH基因序列设计及合成扩增引物，对扩增片段进行多重扩增反应，获得IGH扩增引物；对IGH扩增产物进行纯化，并进行末端修饰；将修饰后的扩增产物与高通量测序平台的接头进行连接并进行连接修复、纯化，得到高通量测序文库；上机测序及数据分析；其中，所述扩增引物包括设计位置分别位于FR1、FR2和FR3区域的正向引物和设计位置位于J区的反向引物。本发明还涉及用于IGH基因重排的高通量测序检测的试剂盒和系统。本发明采用高通量测序的手段检测IGH基因重排，可以极大的提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到单克隆序列信息，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域，尤其涉及一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法。
背景技术
IGH基因主要由可变区(variabl V)、多变区(diversity D)、连接区(joining J)组成，每个基因区域均由多个基因片段组成，其中可变区(V)和连接区(J)中存在的相对保守的结构区(frame work region，FR)，其在V区有3个，分别称作FR1、FR2、FR3，J区也有1个。随着淋巴细胞从母细胞分化到成熟淋巴细胞，原始的IGH基因在重组酶的作用下，剪切各个基因区域中的某一片段，并重新连接，形成新的具有表达功能的基因，即发生基因重排。来源于不同基因片段重排后的基因，保证了表达蛋白的多样，如正常的B淋巴细胞呈现IGH基因重排的多克隆性。
目前IGH重排的检测主要的分子生物学手段为一代测序平台的毛细管电泳+片段分析，即利用带有荧光标记的引物序列，特异性的扩增IGH基因区域，通过跑毛细管电泳的方法，形成显示不同片段大小分布的峰图，从而得到IGH基因在体内的单克隆情况。但该分析方法存在以下缺点：
1.检测灵敏度低，由于技术平台的限制，单克隆检测灵敏度较低；
2.存在假阳性状况，由于判读标准是序列读长，会导致部分序列不同，长度相同的扩增片段混淆；
3.应用范围窄，目前主要应用于淋巴系统疾病肿瘤性或增生性的判断。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明采用高通量测序的手段检测IGH基因重排，相比于目前的方法，可以极大的提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到单克隆序列信息，具有广泛的应用前景，例如得到的受体识别区序列可以应用在细胞免疫研究领域；由于极高的灵敏度可以用于一些肿瘤性疾病的微小残留病灶监测等等。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法，其包括如下步骤：
步骤1)根据已知的IGH基因序列，设计及合成扩增引物；
步骤2)采用扩增引物对扩增片段进行多重扩增反应，获得IGH扩增引物；
步骤3)对IGH扩增产物进行纯化，并对纯化后的产物进行末端修饰；
步骤4)将修饰后的扩增产物与高通量测序平台的接头进行连接并进行连接修复，对连接修复产物进行纯化，得到高通量测序文库；
步骤5)将高通量测序文库上机测序及数据分析；
其中，所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的设计位置分别位于FR1、FR2和FR3区域，所述反向引物的设计位置位于保守区J区。
为了进一步优化上述IGH基因重排检测方法，本发明还包括如下技术措施：
进一步地，FR1区的正向引物为23条，扩增目的片段长度为370bp；FR2区的正向引物为34条，扩增目的片段长度为260bp；FR3区的正向引物为33条，扩增目的片段长度为370bp；J区的反向引物共4条。
进一步地，所述步骤2)中扩增片段的获得包括样本的采集及核酸提取。
进一步地，在所述步骤2)中，根据扩增片段进行分组多重扩增，扩增完成后将各组扩增产物进行混合，以得到完全的IGH扩增产物，所述多重扩增采用Taq DNA聚合酶。
进一步地，在所述步骤3)中，IGH扩增产物进行磁珠法纯化，采用T4多核苷酸激酶对纯化后的产物进行末端加A修饰。
进一步地，在所述步骤4)中，将修饰后的扩增产物与用T4DNA连接酶与高通量测序平台的接头P1和Barcode进行连接，并加入DNA聚合酶进行连接修复，对连接修复产物进行纯化，得到所述高通量测序文库；该步骤还包括使用文库定量试剂对建好的文库进行定量。
进一步地，在步骤5)中，数据分析得到的结果包括：用生物信息学方法可得到大量序列信息，存在单克隆的序列可得到具体的克隆比例，通过免疫数据库比对，还可得到IGH基因序列的结构信息。
更进一步地，所述基于高通量测序的IGH基因重排检测方法具体包括如下步骤：
(1)扩增引物的设计，通过在IMGT数据库下载得到目前已知的IGH基因序列，使用BIOMED-2.0软件设计多重引物。正向引物设计位置分别位于FR1，FR2，FR3区域，反向引物设计位置位于保守区J区。FR1区的正向引物设计23条，扩增目的片段长度约为370bp。FR2区的正向引物设计34条，扩增目的片段长度约为260bp。FR3区的正向引物设计33条，扩增目的片段长度约为370bp。J区反向引物共4条；
(2)多重扩增反应，为保证扩增效率的均一性，将根据扩增片段长度分为3组，进行同时扩增，并选用thermo Fisher公司生产的专门用于多重扩增酶AccuPrimeTM Taq DNAPolymerase System。扩增完成后将3组产物进行混合，得到完全的IGH扩增产物；
(3)产物纯化及修饰，将得到的混合产物进行磁珠法纯化，去除引物序列；采用T4Polynucleotide Kinase对纯化后的产物进行末端加A修饰；
(4)文库构建及定量，将修饰后产物用T4DNA Ligase与ion torrent高通量测序平台的接头P1和Barcode进行连接，并加入DNA聚合酶进行连接修复；并对连接修复产物进行纯化得到最终文库；使用文库定量试剂Ion Library TaqMan Quantitation Kit对建好的文库进行定量；
(5)上机测序，测序仪为ion torrent S5，测序芯片型号为Ion 530TM Chip Kit，将测序参数设置为400bp读长，每个样本的测序读数设置为一百万条(1M reads)进行上机测序反应；
(6)数据分析，对测序数据质量进行分析，数据合格后，用生物信息学方法可得到大量序列信息，存在单克隆的序列还可以得到具体的克隆比例，通过免疫数据库比对，还可以得到IGH基因序列的结构信息。
本发明的第二个目的是提供一种用于IGH基因重排的高通量测序检测的试剂盒，其包括：FR1区的正向引物、FR2区的正向引物、FR3区的正向引物、J区的反向引物、多重PCR扩增试剂、磷酸化试剂、测序接头连接试剂；其中，FR1区的正向引物为23条；FR2区的正向引物为34条；FR3区的正向引物为33条；J区的反向引物为4条。
进一步地，所述FR1区的正向引物的序列如SEQ ID No.1～23所示，FR2区的正向引物的序列如SEQ ID No.24～57所示；FR3区的正向引物的序列如SEQ ID No.58～90所示；J区的反向引物如SEQ ID No.91～94所示。
进一步地，所述多重PCR扩增试剂包括Taq DNA聚合酶和扩增缓冲液；磷酸化试剂包括T4多核苷酸激酶、dNTP和反应缓冲液；测序接头连接试剂包括T4DNA连接酶、DNA聚合酶、接头P1、接头Barcode及缓冲液。
上述引物的具体序列如下：
本发明的第三个目的是提供一种用于IGH基因重排的高通量测序检测的系统，其包括上述用于IGH基因重排的高通量测序检测的试剂盒和高通量测序平台。
进一步地，所述高通量测序平台为ion torrent高通量测序平台，测序读长为400bp。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明所涉及的高通量测序方法检测IGH重排系统，在临床领域，使B细胞淋巴系统疾病患者能够在最早的时间内得到体内IGH重排水平准确评估，及时接受治疗和调整治疗方案。在免疫研究领域，可以准确提供核酸水平上的的结构信息，为深入了解人体的免疫调节机制提供了新的技术支持。因此，本发明所述的IGH重排的高通量测序方法具有广泛的市场前景和巨大的社会价值。
附图说明
图1为本发明所述的高通量测序方法的步骤示意图；
图2为本发明一实施例中采用B淋巴细胞株-RAJI和正常人外周血作为样本所得的测序质量分析的结果示意图。
图3为本发明一实施例中采用B淋巴细胞株-RAJI和正常人外周血作为样本通过对测序数据行进比对分析所得到的单克隆序列的结果示意图；
图4为对图3中所示的单克隆序列进行结构分析所得的序列结构的示意图；
图5为本发明一实施例中采用多发性骨髓瘤病人的骨髓涂片作为样本进行测序分析所得的序列结构的示意图。
具体实施方式
本发明涉及一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法，其所涉及的步骤如图1所示，主要包括如下步骤：根据已知的IGH基因序列，设计及合成扩增引物；采用扩增引物对扩增片段进行多重扩增反应，获得IGH扩增引物；对IGH扩增产物进行纯化，并对纯化后的产物进行末端修饰；将修饰后的扩增产物与高通量测序平台的接头进行连接并进行连接修复，对连接修复产物进行纯化，得到所述高通量测序文库；将所述高通量测序文库上机测序及数据分析；其中，所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的设计位置分别位于FR1、FR2和FR3区域，所述反向引物的设计位置位于保守区J区。本发明还涉及用于IGH基因重排的高通量测序检测的试剂盒和系统。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为采用B淋巴细胞株-RAJI和正常人外周血作为样本采用高通量测序方法对IGH基因重排进行检测，其步骤包括：
(1)样本信息：B淋巴细胞株-RAJI，正常人外周血。
(2)样本处理：对样本B淋巴细胞株-RAJI和正常人外周血分别进行核酸DNA提取，对提取所用RAJI细胞进行细胞含量估算约为50万个。对提取外周血细胞进行细胞数估算约为400万个。在此基础上设计若干稀释度，分别得到RAJI的梯度：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
(3)PCR扩增：分别取RAJI浓度为100、10-2、10-4、10-6的样本，标记为RO，R2，R4，R6进行分组扩增。扩增试剂为：AccuPrimeTM Taq DNA Polymerase System。扩增体系及程序如下：
多重PCR扩增体系：
| Component | 25ul Reaction |
| 10xAccPrime Buffer | 2.5ul |
| Primer Mix(10uM each) | 0.5ul |
| Template DNA | 2ul |
| AccPrime Taq | 0.5ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 19.5ul |
扩增程序：
其中，所述引物混合物(Primer Mix)中包含SEQ ID No.1～SEQ ID No.94所示序列的引物。
(4)PCR产物纯化
1)使用AgencourtTM AMPureTM磁珠进行纯化。预先将磁珠取出室温静置30min；
2)准备新的Eppendorf 1.5mL低吸附离心管，充分悬浮磁珠，在每个EP管中分装45μL磁珠；
3)短暂离心连接产物，然后将其转移到EP管中，用移液器吹打混匀，室温静置5min；
4)将EP管置于磁力架上(开口朝外)，静置2min或等溶液变清澈，小心吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；
5)加入150μL新鲜配制的70％乙醇，在磁力架上左右旋转离心管洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动磁珠；
6)重复5)，进行第二次洗涤；
7)将EP管中残余的液体吸走，磁力架上室温静止干燥5min，注意不要过度干燥；
8)在EP管加入50μL Low TE充分浸润磁珠，用移液器吹打混匀或充分振荡混匀，轻度离心，室温静置2min；
9)将EP管置于磁力架上(开口朝外)，静置2min或等溶液变清澈，吸取48μL上清至新的离心管中保存。
(5)纯化产物修饰
进行纯化产物末端加A修饰，采用T4磷酸激酶的方式进行修饰。修饰体系及程序如下：
磷酸化体系：
| Component | 50ul Reaction |
| 10x Kinase Buffer | 5ul |
| DNTP(2mM each) | 12.5ul |
| 纯化产物 | 20ul |
| T4Polynucleotide Kinase | 2ul(20unit) |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.5ul |
反应程序：
| Rep1：1 | 37℃，30min |
| Rep2：1 | 65℃，20min |
| Rep3：1 | 4℃，∞ |
(6)文库接头连接
产物修饰后进行连接测序接头反应，反应体系和程序如下：
连接体系：
| Component | 100ul Reaction |
| 10x Ligase Buffer | 10ul |
| P1 | 2ul |
| Barcode X | 2ul |
| T4DNA Ligase | 6ul |
| DNA聚合酶 | 1ul |
| 修饰产物 | 50ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 29ul |
反应程序：
| Rep1：1 | 25℃，15min |
| Rep2：1 | 65℃，5min |
| Rep3：1 | 4℃，∞ |
连接反应完成后，产物进行纯化，操作步骤同(5)。
(7)文库鉴定
1)标准品稀释(梯度稀释10倍)：
准备3个200μL PCR管，取1.1μL E.coli DH10B标准文库(浓度68pM)，加入9.9μL无核酸水，梯度稀释10倍，稀释成浓度分别为6.8pM，0.68pM，0.068pM的标准品；
2)文库稀释(稀释100倍)：
将文库振荡混匀，短暂离心，准备文库稀释管子，在管中加入198μL无核酸水及2μL文库，振荡混匀，短暂离心；
3)配制qPCR反应液：
取新的1.5mL离心管，在管中按下表加入相应反应数的试剂，振荡混匀，短暂离心；
4)准备qPCR反应排管，每孔分装11μL的反应液；
5)将9μL已稀释好的标准品及9μL100倍稀释的文库加到qPCR反应管内(每个样重复2次)，总反应体系20μL；
6)定量PCR仪的反应程序如下：
a)输入已稀释好的标准文库的浓度；
b)R0XTM参考荧光作为背景参考荧光；
c)选择反应体系20μL；
d)TaqMan探针报告子和淬灭子：FAMTMdye/MGB；
e)Ion Library
qPCR Mix可用在多种定量PCR仪器上。下表的循环程序可作为应用该试剂盒的通用守则。快速循环模式是StepOnePlusTM系统的推荐模式。
7)qPCR反应结束后，计算未稀释过的文库浓度(将文库检测的平均浓度乘以稀释倍数)。
文库鉴定结果：
经qPCR检测，文库质量合格，浓度符合上机标准，结果如下：
(8)上机测序
(9)测序数据分析
1)测序质量分析
如图2所示，测序质量合格。
2)分析得到单克隆序列
通过对测序数据行进比对得到单克隆数最高的序列，其结果如图3所示。
3)计算单克隆读数比例
将引物序列去除后，得到中间完全一致的序列，以此序列作为标签，计算在测序中的比例如下表：
4)对单克隆序列进行结构分析
如图4所示，本实施例测序得到的序列结构符合预期，分析单克隆序列结构，得到CDR3区。
实施例2
本实施例为为采用多发性骨髓瘤病人初诊时骨髓涂作为样本采用高通量测序方法对IGH基因重排进行检测，其步骤包括：
(1)样本信息：多发性骨髓瘤病人初诊时骨髓涂片4例。
(2)样本处理：将4例多发性骨髓瘤临床标本分别标记为P1，P2，P3，P4。使用微量DNA提取试剂盒对骨髓涂片进行核酸提取。提取浓度信息如下
| 样本名称 | DNA提取浓度(ng/ul) | OD260/280 |
| P1 | 148.32 | 1.89 |
| P2 | 42.01 | 1.91 |
| P3 | 37.03 | 1.88 |
| P4 | 99.25 | 1.90 |
(3)PCR扩增：分别取将4例标本DNA进行稀释至10ng/ul，然后分组扩增。扩增试剂为：AccuPrimeTM Taq DNA Polymerase System。扩增体系及程序如下：
多重PCR扩增体系：
| Component | 25ul Reaction |
| 10xAccPrime Buffer | 2.5ul |
| Primer Mix(10uM each) | 0.5ul |
| Template DNA | 2ul |
| AccPrime Taq | 0.5ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 19.5ul |
扩增程序：
其中，所述引物混合物(Primer Mix)中包含SEQ ID No.1～SEQ ID No.94所示序列的引物。
(4)PCR产物纯化
1)使用AgencourtTM AMPureTM磁珠进行纯化。预先将磁珠取出室温静置30min；
2)准备新的Eppendorf 1.5mL低吸附离心管，充分悬浮磁珠，在每个EP管中分装45μL磁珠；
3)短暂离心连接产物，然后将其转移到EP管中，用移液器吹打混匀，室温静置5min；
4)将EP管置于磁力架上(开口朝外)，静置2min或等溶液变清澈，小心吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；
5)加入150μL新鲜配制的70％乙醇，在磁力架上左右旋转离心管洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动磁珠；
6)重复5)，进行第二次洗涤；
7)将EP管中残余的液体吸走，磁力架上室温静止干燥5min，注意不要过度干燥；
8)在EP管加入50μL Low TE充分浸润磁珠，用移液器吹打混匀或充分振荡混匀，轻度离心，室温静置2min；
9)将EP管置于磁力架上(开口朝外)，静置2min或等溶液变清澈，吸取48μL上清至新的离心管中保存。
(5)纯化产物修饰
进行纯化产物末端加A修饰，采用T4磷酸激酶的方式进行修饰。修饰体系及程序如下：
磷酸化体系：
反应程序：
| Rep1：1 | 37℃，30min |
| Rep2：1 | 65℃，20min |
| Rep3：1 | 4℃，∞ |
(6)文库接头连接
产物修饰后进行连接测序接头反应，反应体系和程序如下：
连接体系：
| Component | 100ul Reaction |
| 10x Ligase Buffer | 10ul |
| P1 | 2ul |
| Barcode X | 2ul |
| T4DNA Ligase | 6ul |
| DNA聚合酶 | 1ul |
| 修饰产物 | 50ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 29ul |
反应程序：
| Rep1：1 | 25℃，15min |
| Rep2：1 | 65℃，5min |
| Rep3：1 | 4℃，∞ |
连接反应完成后，产物进行纯化，操作步骤同(5).
(7)文库鉴定
1)标准品稀释(梯度稀释10倍)：
准备3个200μL PCR管，取1.1μL E.coli DH10B标准文库(浓度68pM)，加入9.9μL无核酸水，梯度稀释10倍，稀释成浓度分别为6.8pM，0.68pM，0.068pM的标准品；
2)文库稀释(稀释100倍)：
将文库振荡混匀，短暂离心，准备文库稀释管子，在管中加入198μL无核酸水及2μL文库，振荡混匀，短暂离心；
3)配制qPCR反应液：
取新的1.5mL离心管，在管中按下表加入相应反应数的试剂，振荡混匀，短暂离心；
4)准备qPCR反应排管，每孔分装11μL的反应液；
5)将9μL已稀释好的标准品及9μL100倍稀释的文库加到qPCR反应管内(每个样重复2次)，总反应体系20μL；
6)定量PCR仪的反应程序如下：
a)输入已稀释好的标准文库的浓度；
b)R0XTM参考荧光作为背景参考荧光；
c)选择反应体系20μL；
d)TaqMan探针报告子和淬灭子：FAMTMdye/MGB；
e)Ion Library
qPCR Mix可用在多种定量PCR仪器上。下表的循环程序可作为应用该试剂盒的通用守则。快速循环模式是StepOnePlusTM系统的推荐模式。
7)qPCR反应结束后，计算未稀释过的文库浓度(将文库检测的平均浓度乘以稀释倍数)。
文库鉴定结果：
经qPCR检测，文库质量合格，浓度符合上机标准，结果如下：
(8)上机测序
(9)测序数据分析
1)对临床标本进行IGH克隆性分析
| 样本编号 | 单克隆读数 | 总读数 | 单克隆序列比例 |
| P1 | 264512 | 1120040 | 23.62％ |
| P2 | 211219 | 1151776 | 18.34％ |
| P3 | 610139 | 1032382 | 59.10％ |
| P4 | 122298 | 1165007 | 10.50％ |
2)对单克隆序列进行结构分析
以测得的P2单克隆序列为例，其所得的IGH单克隆核酸序列结构如图5所示，通过分析，本实施例得到了一种未存在数据库中的新的IGH基因重排序列。
由上述实施例可知，本发明采用高通量测序的手段检测IGH基因重排，可以极大的提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到单克隆序列信息，具有广泛的应用前景。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何根据本发明原理进行修改和替代也可以达到同样效果。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海科医联创医学检验所有限公司
<120> 一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法
<130> IPI190841
<160> 95
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcagtgaa ggtctcctgc aagg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 2
cctcggtgaa ggtctcctgc aagg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 3
cctcagtgaa ggtttcctgc aagg 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 4
gggctacagt gaaaatctcc tgcaagg 27
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 5
aaacccacac agaccctcac gctgac 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacccacag agaccctcac gctgac 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacccacac agaccctcac actgac 26
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 8
ctggggggtc cctgagactc tcctg 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggggggtc ccttagactc tcctg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 10
cagggcggtc cctgagactc tcctg 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 11
cagggccgtc cctgagactc tcctg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 12
ctggggggtc cctgaaactc tcctg 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 13
ctggcaggtc cctgagactc tcctg 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 14
ctggagggtc cctgagactc tcctg 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgggaggtc cctgagactc tcctg 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 16
tgggggggcc ctgagactct cct 23
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 17
cttcggagac cctgtccctc acctg 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 18
cttcggacac cctgtccctc acctg 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 19
cttcacagac cctgtccctc acctg 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 20
cttcggagac cccgtccctc acctg 25
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 21
cggggaccct gtccctcacc tg 22
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 22
gatctcctgt aagggttctg gatacagct 29
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> FR1区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 23
tcgcagaccc tctcactcac ctgtg 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 24
tggatcaggc agtccccatc gagag 25
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 25
gctgggtgcg ccagatgccc 20
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 26
gtgtgagctg gatccgtcag cc 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 27
gtgtgggctg gatccgtcag cc 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 28
gtgcgacagg cccctggaca a 21
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 29
gggtgcgaca ggccactgga caa 23
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 30
gtgcgccagg cccccggaca a 21
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 31
gggtgcgaca ggctcgtgga caa 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 32
gggtgcaaca ggcccctgga aaa 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 33
gggtgcgaca ggctcctgga aaa 23
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 34
gtgcgacagg cccccggaca a 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 35
gtgcgacagg cccccagaca a 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 36
tccgccagcc cccagggaag g 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 37
tccggcagcc cccagggaag g 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 38
tccggcagcc accagggaag g 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 39
tccgccagca cccagggaag g 21
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 40
tccggcagcc cgccgggaa 19
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 41
tccggcagcc gccggggaa 19
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 42
tccggcagcc cgctgggaag g 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 43
tccgccagcc cctagggaag g 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 44
ggtccgccag gctccaggga a 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 45
gttccgccag gctccaggga a 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 46
ggtccgccag gcttccggga a 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 47
ggtccgtcaa gctccgggga a 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 48
gatccgccag gctccaggga a 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 49
ggtccgccaa gctccaggga a 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 50
ggtccgccag gctccaggca a 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 51
ggtccgccag gccccaggca a 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 52
ggtccgccag gctccgggca a 21
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 53
gggtccgtca agctccaggg aagg 24
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 54
ctgggtccgc caagctacag gaaa 24
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 55
ggtccgccag cctccaggga a 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 56
ggtccggcaa gctccaggga a 21
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> FR2区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 57
gtgcgagctg gatccgtcag cc 22
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 58
ctctgtgact cccgaggaca cggct 25
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 59
agtggagcag cctgaaggcc tc 22
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 60
tgaccaacat ggaccctgtg gacac 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 61
acatggagct gagcagcctg agatc 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 62
acatggagct gagcaggctg agatc 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 63
acatggagct gaggagcctg agatc 25
<210> 64
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 64
acatggagct gaggagccta agatctga 28
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 65
gagctctgtg accgccgcgg ac 22
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 66
gagctctgtg accgccgtgg aca 23
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 67
gagctctgtg accgctgcag acacg 25
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 68
gagctctgtg accgctgcgg aca 23
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 69
gagctctgtg actgccgcag acacg 25
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 70
gagctctgtg actgcagcag acacg 25
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 71
gagctctgtg actgccgcgg aca 23
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 72
gagctctgtg accgcggacg cg 22
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 73
ggctctgtga ccgccgcgga c 21
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 74
gagctctgtg accgccgcag aca 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 75
gagctctgtg accgctgaca cgg 23
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 76
caaatgaaca gcctgagagc cgaggaca 28
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 77
caaatgaaca gcctgaaaac cgaggaca 28
<210> 78
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 78
caaatgaaca gtctgaaaac cgaggaca 28
<210> 79
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 79
caaatgatca gcctgaaaac cgaggaca 28
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 80
caaatgaaca gtctgagaac tgaggacacc 30
<210> 81
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 81
caaatgaaca gtctgagagc cgaggaca 28
<210> 82
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 82
caaatgaaca gcctgagagc tgaggaca 28
<210> 83
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 83
caaatgagca gcctgagagc tgaggaca 28
<210> 84
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 84
caaatgaaca gcctgagaga cgaggaca 28
<210> 85
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 85
caaatgggca gcctgagagc tgaggaca 28
<210> 86
<211> 26
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 86
caaatgaaca gcctgagagc cgggga 26
<210> 87
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 87
caaatgaaca gtctgagagc tgaggaca 28
<210> 88
<211> 28
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 88
caaatgagca gtctgagagc tgaggaca 28
<210> 89
<211> 24
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 89
gcagcctaaa ggctgaggac actg 24
<210> 90
<211> 24
<212> DNA
<213> FR3区正向引物(Artificial Sequence)
<400> 90
gcacgctaaa ggctgaggac actg 24
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> J区反向引物(Artificial Sequence)
<400> 91
ctcacctgag gagacggtga cc 22
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> J区反向引物(Artificial Sequence)
<400> 92
ctcacctgag gagacagtga cc 22
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> J区反向引物(Artificial Sequence)
<400> 93
cttacctgaa gagacggtga cc 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> J区反向引物(Artificial Sequence)
<400> 94
cttacctgag gagacggtga cc 22
<210> 95
<211> 268
<212> DNA
<213> IGH单克隆核酸序列(Artificial Sequence)
<400> 95
aggtgtccct ggccccagaa gtcaagtaag tccccgaact ccctggcaca gtaatacacg 60
gccgtgtcag cgtcagtcac agaggtcagc ctcagggaga cctggttctt ggtcgtgtcc 120
actgacatgg aagttcggcc ctggagggac gggttgtagt agctgctccc agtgtgatgg 180
atgtttccaa tccactccag gcccttccct gggggctggc gaatccaact ccagtggtgt 240
ccacaactac tgacggaggc gccagaga 268
Claims (10)
1.一种非诊断目的的基于高通量测序的IGH基因重排检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）根据已知的IGH基因序列，设计及合成扩增引物；
步骤2）采用扩增引物对扩增片段进行多重扩增反应，获得IGH扩增引物；
步骤3）对IGH扩增产物进行纯化，并对纯化后的产物进行末端修饰；
步骤4）将修饰后的扩增产物与高通量测序平台的接头进行连接并进行连接修复，对连接修复产物进行纯化，得到高通量测序文库；
步骤5）将高通量测序文库上机测序及数据分析；
其中，所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的设计位置分别位于FR1、FR2和FR3区域，所述反向引物的设计位置位于保守区J区；
所述FR1区的正向引物的序列如SEQ ID No. 1~23所示，FR2区的正向引物的序列如SEQID No.24~57所示；FR3区的正向引物的序列如SEQ ID No. 58~90所示；J区的反向引物如SEQ ID No.91~94所示。
2.根据权利要求1所述的IGH基因重排检测方法，其特征在于，在所述步骤2）中，根据扩增片段进行分组多重扩增，扩增完成后将各组扩增产物进行混合，以得到完全的IGH扩增产物，所述多重扩增采用Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的IGH基因重排检测方法，其特征在于，在所述步骤3）中，IGH扩增产物进行磁珠法纯化，采用T4多核苷酸激酶对纯化后的产物进行末端加A修饰。
4.根据权利要求1所述的IGH基因重排检测方法，其特征在于，在所述步骤4）中，将修饰后的扩增产物与用T4 DNA连接酶与高通量测序平台的接头P1和Barcode进行连接，并加入DNA聚合酶进行连接修复，对连接修复产物进行纯化，得到所述高通量测序文库；该步骤还包括使用文库定量试剂对建好的文库进行定量。
5.根据权利要求1所述的IGH基因重排检测方法，其特征在于，在步骤5）中，数据分析得到的结果包括：用生物信息学方法可得到大量序列信息，存在单克隆的序列可得到具体的克隆比例，通过免疫数据库比对，还可得到IGH基因序列的结构信息。
6.根据权利要求1所述的IGH基因重排检测方法，其特征在于，检测出的IGH基因重排序列包括SEQ ID No. 95。
7.一种基于权利要求1-6任一项所述IGH基因重排检测方法的用于IGH基因重排的高通量测序检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：FR1区的正向引物、FR2区的正向引物、FR3区的正向引物、J区的反向引物、多重PCR扩增试剂、磷酸化试剂、测序接头连接试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述FR1区的正向引物的序列如SEQ IDNo. 1~23所示，FR2区的正向引物的序列如SEQ ID No.24~57所示；FR3区的正向引物的序列如SEQ ID No. 58~90所示；J区的反向引物如SEQ ID No.91~94所示。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR扩增试剂包括Taq DNA聚合酶和扩增缓冲液；磷酸化试剂包括T4多核苷酸激酶、dNTP和反应缓冲液；测序接头连接试剂包括T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、接头P1、接头Barcode 及缓冲液。
10.一种用于IGH基因重排的高通量测序检测的系统，其特征在于，所述系统包括如权利要求7~9中任一项所述的用于IGH基因重排的高通量测序检测的试剂盒和高通量测序平台。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Denomination of invention: A high-throughput sequencing based IGH gene rearrangement detection method Effective date of registration: 20230920 Granted publication date: 20221108 Pledgee: Fengxian Branch of Shanghai Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: SHANGHAI BIOMED UNION MEDICAL LABORATORY CO.,LTD. Registration number: Y2023310000569 |