CZ20001934A3 - Způsob přípravy komplexních DNA methylačních peptidových map - Google Patents

Description

Způsob podle vynálezu se týká možnosti diferenciální diagnózy nádorových onemocnění. To vede k hlubšímu pochopení karcinogeneze a patogeneze polygenních dědičných onemocnění. Způsob se dále týká identifikace všech genů podílejících se na rozvoji onemocnění.

Stejně jako dříve zůstává buněčná diferenciace a diferenciace vyšších organismů v podstatě nepochopena. Způsob slibuje významný přínos vědomostí i v této oblasti.

Úrovně, na kterých byl prováděn výzkum pomocí metodologického vývoje posledních let v molekulární biologii, zahrnují samostatný gen, přepis genů do RNA a výsledné proteiny. Zda se v průběhu vývoje individua gen aktivuje, a jak je aktivace a inhibice určitých genů v určitých buňkách a tkáních kontrolována, může souviset s vysokým stupněm pravděpodobnosti, míry a charakteru methylace genu nebo genomu. Z tohoto hlediska se důvodně předpokládá, že patogenní podmínky jsou projeveny modifikovaným methylačním vzorem jednotlivých genů nebo genomu.

Uvádí se zde způsob, který umožňuje studium methylačního vzoru jednotlivých genů. Další nedávné pokroky ve vývoji tohoto způsobu také umožňují analýzu minimálních množství výchozího vzorku, kdy však celkový počet měřených bodů dosahuje maximálně hodnot dvojmístného čísla v teoretickém rozmezí hodnot alespoň 10⁷ měřených bodů. Díky použití způsobu podle vynálezu je nyní poprvé možné studovat jakékoli žádané úseky genomu jakýmkoli počtem měřených bodů. Tento způsob tak umožňuje identifikaci příčin genetických onemocnění všech typů, které nemohou být detekovány jiným způsobem, a to umožňuje rozvoj nových léčebných postupů a identifikaci cílových proteinů pro nová léčiva.

Dosavadní stav techniky.

Molekulární analýza buněčných fenotypů.

Studium genové exprese může být prováděno na úrovni RNA nebo na úrovni proteinu. Obě úrovně v podstatě odrážejí důležité fenotypové parametry. Analýza proteinu za použití dvourozměrných gelů (metoda McFarrela) je známa přibližně 15 let. Za použití těchto analýz je možné provést analýzu chromatografického měření několika tisíc proteinů. Již velmi dávno byly takovéto elektroferogramy zpracovány nebo vyhodnoceny postupy zpracovávajícími data.

Spolehlivost této metody je v podstatě vysoká, avšak ze dvou hledisek podřadná vzhledem k moderním metodám genové exprese, založeným na analýze RNA.

Přesněji, detekce proteinů, které mají regulační význam, z malého množství buněk selhává, protože citlivost použitých metod je příliš nízká. Na rozdíl od nukleových kyselin nelze proteiny amplifikovat. Metoda je navíc velmi komplexní, neumožňující automatizaci, a velmi nákladná. Naopak, analýza RNA představuje významné výhody a díky použití PCR je citlivější. Nejvýznamnější výhodou je to, že u každého důležitého úseku RNA, je možné ihned identifikovat jeho sekvenci.

Míra exprese určité RNA o známé sekvenci je většinou snadno detekovatelná. Avšak v souvislosti se zde diskutovaným využitím je uplatnitelná pouze ve výjimečných případech.

Metoda „diferenciálního zobrazení“ nejlépe umožňuje semikvantitativní studii exprese. Produkty exprese amplifikované pomocí PCR se oddělí gelovou elektroforézou. Spolehlivost je omezena rozlišitelností gelové elektroforézy. Metoda je navíc nedostatečně citlivá a rozsáhlá pro použití v rutinní diagnóze (Liang, P. a Pardee, A.B., Science 257, 967-971).

Geny s vysokou nebo nízkou mírou exprese jsou často identifikovány odčítacími technikami. Studované cDNA klony buněčných nebo tkáňových vzorků jsou umístěny na destičce. Oproti klonům se hybridizuje cDNA jako srovnávací vzorek. Za použití této metody není možné docílit spolehlivého dosažení expresních vzorů.

Jednou ze součástí amerického „projektu o lidském genomu“ je systematické sekvenování exprimováných genů. Takto získaná data je možné použít k sestavení expresních čipů, které umožňují studium prakticky všech exprimovaných sekvencí buněčného nebo tkáňového typu v jednom experimentu.

Oblast analýzy nádorových onemocnění.

Mutace genů vždy spouští nádorová onemocnění [sic], což znamená buněčnou degeneraci. Příčinou těchto mutací mohou být exogenní vlivy nebo změny v buňce. V několika výjimečných případech způsobí individuální mutace, které často postihují větší oblasti genomu (translokace, delece), degeneraci buňky; ale ve většině případů zahrnuje řetězec mutací různých genů a pouze kombinace jejich účinku vede k nádorovému onemocnění. Tyto výsledky na úrovni DNA se také odrážejí na úrovni RNA a proteinů. V této souvislosti je velmi pravděpodobné, že se projevuje násobný efekt, protože je zřejmé, že v mnoha případech množství a typ RNA má vliv na syntézu několika dalších úseků RNA. To vede ke změně poměru v syntéze odpovídajících proteinů, což může vést k deregulaci metabolismu a tím vyvolání mechanismu regulace a vícenásobné regulace.

Výsledkem je změněný expresní vzor buněk, který byl změněn velice specifickým (ale nedetekovatelným) způsobem; specifita závisí na druhu karcinomu, jeho stavu a míry malignity karcinomu. Tento fenomén byl tak mimo dosah studia přírodních věd. Bylo opravdu nemožné zkoumat genovou expresi nebo metabolismus buňky v jeho úplnosti. Čipová technologie jako první toto umožňuje (Schena, M. a kol., Science 270,467-470).

Pokud chceme řešit diagnostický problém časné dignózy tumorů na molekulární úrovni, setkáme se dnes ve velmi výjimečných případech s určitou nepřekonatelnou obtížností, protože u většiny tumorů je znalost molekulárních dějů, to znamená různých mutací, pouze částečná; vědcům není známo, co hledat v biologických vzorcích. To znamená, že je absolutně nemožné použití významně citlivé a specifické polymerázové řetězcové reakce. Příkladem jsou určité vnitřní tumory, Ewingův sarkom, určité formy leukémie, z nichž každá je v podstatě definována na základě jedné, přesně popsané mutace. V těch případech je možné identifikovat degenerovanou buňku mezi miliony normálních buněk. Avšak dokonce u těchto, zdánlivě jednoznačně definovaných skupin tomorů, jsou takové rozdíly v chování, že je třeba připustit další neznámé genetické parametry (například genetickou výbavu jedince), hrající důležitou roli. Imunologické markéry tumorů jsou užitečnými pomocnými parametry, ale stále hrají roli pouze částečného příspěvku, kromě dalších běžných diagnostických parametrů. Mohou se však použít za účelem předběžné identifikace postižených buněk.

Histologie hraje důležitou a nezaměnitelnou roli v identifikaci degenerovaných tkání, ale není přesná v časných diagnózách.

Protože většina tumorů tak není dostatečně přesně charakterizována pro diagnostické účely na molekulární úrovni, neexistují žádné možnosti pro rozdělení do stádií, dokonce ani pro rozdělení podle stupně rizika. Takovéto rozdělení je však zcela předběžné pro zlepšení výběru léčby a hlavně pro vývoj nových účinných léčiv a genové terapie.

Oblast výzkumu, typu a vlastností možných stabilních stavů buněk vyšších organismů.

V poslední době se zvýšilo množství identifikací komplexních regulačních systémů (výborným příkladem je buněčná regulace), které sami o sobě mohou existovat pouze v omezeném počtu stabilních stavů, nad kritickým minimem komplexnosti a pod kritickým maximem souvislosti (průměrného počtu složek, se kterými je každá složka spojena) (Kaufíman,

S.A., Origins of Order, Oxford University Press, 1993). V této souvislosti by měl tento popis být chápán jako představa výběru obecného fenoménu. V souvislosti s buňkami, jako biologickými regulačními systémy, je možné také mluvit o diferenciačním stavu buněčného typu. Ačkoli nebyla žádná taková souvislost popsána, a dokonce nebyla popsána ani další omezení možných stavů biologických systémů, praktické důsledky by byly velice důležité. Pokud by, s ohledem na konstantní informační obsah buněk v organismu (tato neměnnost de facto existuje výhradně v rámci jednoho druhu), existoval pouze určitý počet stabilních stavů, pak by to znamenalo, že degenerované buňky mohou být také pouze v jednom z těchto stavů, nebo v přechodu mezi možnými stavy. V současnosti není možné definovat tyto stavy na molekulární úrovni. Je obtížné najít souvislost mezi individuálními stavy a chováním buněk na základě dosavadního stavu techniky. Takováto analýza však může být rozhodujícím příspěvkem v diagnóze a prognóze onemocnění. Je dokonce možné nalezení vztahu mezi možnými stavy postižených buněk a nejlepší možnou léčbou. Je navíc možné, že takováto metoda by měla rozhodující vliv na výběr a časové zahájení léčby. Kdyby se například zjistilo, že nádorové buňky jsou v přechodu mezi možnými stavy, mohli bychom se domnívat, že tato populace buněk by snadněji způsobila selekční tlak, výsledkem populačního tlaku buněk následkem léčby, a mohla by tak snadněji uniknout. Buněčná populace by za těchto okolností v těchto přechodných stavech měla významně zvýšenou flexibilitu a byla by snadněji převedena do jednoho z možných stabilních stavů, ve kterém by byl selekční tlak eliminován a léčba by tak neměla žádný vliv. Metoda, která by umožnila rozlišit buňky a buněčné skupiny podle stavů, by tak také přispěla k rozpoznání, pochopení a možnému řešení těchto problémů. Na základě dosavadního stavu techniky je však nemožné stanovit, zda existuje pouze omezený počet stavů. To znamená, že není možné rozlišit skupiny buněk podle abstraktních kritérií týkajících se jejich stavů a předpovědět tyto stavy s určitým chováním buněk.

Dědičná onemocnění.

V současné době obsahuje genetická mapa lidského genomu 2500 takzvaných mikrosatelitů. Tyto oblasti se používají pro lokalizaci mnoha genů, většinou takových genů, jejichž defekt vyvolá genetické onemocnění, pro vazebnou analýzu, a pak pro jejich identifikaci. Všechna genetických onemocnění způsobených jedním defektním genem jsou tak objasněna z hlediska genetického principu, tímto způsobem mohou být také chápána polygenní onemocnění. Mnohá polygenní onemocnění jsou velmi častá, tak častá, že jsou zařazena mezi takzvaná rozšířená onemocnění. Například astma a diabetes. Patří sem také mnohé typy karcinomů. Použitím výše popsaného postupu vazebné analýzy se původně dosáhlo výjimečného úspěchu. V mnoha případech bylo nalezeno mnoho genů zapříčiňujících důležitá polygenní onemocnění, například diabetes, schizofrenii, aterosklerózu a obezitu. Kromě dostupnosti používaných laboratorních technik molekulární biologie je pro genetické objasnění zásadní nutností dostupnost relativně vysokého počtu pacientů a příbuzných postižených daným onemocněním Za poslední dva roky je zřejmé, že počet několika set pacientů, kteří byli původně zahrnuti ve vazebné analýze polygenních onemocnění, je často velmi malý. Toho se v některém případě využívá pro nalezení oblasti původního spektra příčinných genů. Protože tato vazebná analýza vyžaduje mimořádně vysoký podíl manuální práce, je možné očekávat pouze velmi pomalý vývoj v analýze polygenních onemocnění. Protože právě tato onemocnění mají významnou sociální a ekonomickou důležitost, uvažuje se o alternativních postupech.

Techniky DNA čipů.

Princip Affimetrix byl zahájením veškerého dalšího rozvoje (například, U.S.Patenty číslo 5,593,839, 5,999,695 nebo 5,631,734). Avšak mnoho dalších společností a vědeckých projektů produkuje DNA čipy s různými vlastnostmi pro speciální použití (například, U.S.Patenty číslo 5,667,667, 5,525,464 nebo 5,492,806 nebo například Goffeau, A., Nátuře 385, 202-203; Weiler, J. a Hoheisel, J., Anal. Biochem. 243, 218-227; Chee, M. a kol., Science 274, 610-614). Poslední publikace již uvádějí komerčně dostupné HIV čipy, které umožňují výzkum celého HIV genomu. Fluorescenčně značené PCR produkty zkoumaného vzorku se hybridizují až s 400 000 oligonukleotidy. Detekce signálů se provádí za použití CCD kamer. Dlouho se používala určitá kapacita takovýchto systémů pro alelově specifickou hybridizaci. To znamená, že pouze v místech, kde je vzorek zcela komplementární k ukotvenému oligonukleotidu, vznikne po hybridizaci a promytí signál. Vyšetření známé genové sekvence pro detekci mutací je úspěšné, protože každá oblast určité sekvence je přítomna ve formě oligonukleotidových sekvencí na matrici, a totéž je možné říci o každé možné odchylce od normální sekvence. Čipový postup je účinný vzhledem k faktu, že informace o sekvenci velkého počtu genů nebo genových lokusů se získá na základě dvou jednoduchých kroků, přesněji hybridizace a promytí.

Analytické metody pro měření délky.

Některé možnosti provedení způsobu podle vynálezu vyžadují na konci postupu velice rychlé a přesné stanovení hmotnosti. Protože měření délky fragmentů musí být provedeno pro desítky tisíc měřených bodů, je třeba velice účinného měřícího systému. Podle dosavadního stavu techniky zahrnují možné systémy automatické sekvenační přístroje (U.S.Patent 4,811,218), kapilární elektroforézu (například Woolley, A. T., a kol., Anal. Chem. 68, 4081-4086), MALDITOF (Siegert, C.W., a kol., Anal. Biochem. 253, 55-65) a separaci pomocí chemického značení (WO 95/04160). Stav techniky umožňuje účinné nahrazení těchto metod, ačkoli je třeba významných modifikací a přídavků do nové logiky způsobu podle vynálezu.

Metody hmotnostní spektrometrie.

Hmotnost krátkých sekvencí DNA se může stanovit přesně pomocí hmotnostních spektrometrů MALDI-TOF. V dosavadním stavu techniky dále existují metody, které kombinují tyto analytické metody s reakcemi za použití primerů. V těchto postupech je například hybridizován oligonukleotid o specifické sekvenci se vzorkem DNA, a do rekce se přidá pouze jeden ze čtyř nukleotidů. Pokud je známo, který z nukleotidů se po hybridizaci použil, pomocí polymerázy ke 3’ konci oligonukleotidu, pak je možné stanovit bázi za 3’ koncem nukleotidu. Varianty této metody zahrnují takovou, která umožňuje stanovení délky těchto repetitivních sekvencí, které obsahují pouze dvě ze čtyř možných bází. V tomto postupu se použijí přirozené nukleotidy, které jsou komplementární s přítomnými bázemi, a navíc se přidá jeden nebo oba takto modifikované nukleotidy, které ukončí polymerázovou reakci, aby se reakce zastavila po opakujcí se sekvenci. Běžně se jako terminátory používají ddNTPs. Z měření délek se může odvodit délka opakující se sekvence.

Methylační analýzy.

Modifikace genomové báze cytosinu na 5’-methylcytosin představuje epigenetický parametr, který je jedním z nejdůležitějších, a je dosud nejlépe prozkoumán. Nicméně, v současné době existují metody pro stanovení obsáhlých genotypů buněk a individuí, ale dodnes neexistují srovnatelné metody pro vytvoření a vyhodnocení epigenotypové informace ve velkém měřítku.

V podstatě existují tři metody, které se liší principem stanovení 5-methylace cytosinu ve smyslu sekvence.

První metoda je v podstatě založena na použití restrikčních endonukleáz (RE), které jsou „citlivé na methylaci“. RE jsou charakteristické tím, že způsobují štěpení DNA v určité sekvenci DNA, většinou o délce 4-8 bází. Místo těchto štěpem je možné stanovit pomocí gelové elektroforézy, přenosem na membránu a hybridizaci. Citlivost na methylaci znamená, že určité báze v rozeznávané sekvenci musí být nemethylované, aby k tomuto kroku došlo. Vzorec proužků se tak po restrikčním štěpení a gelové elektroforéze mění v závislosti na methylačním vzooru DNA. Avšak většina CpG, které mohou být methylovány, se nachází vně rozeznávaných sekvencí RE a nemohou tak být studovány.

* .

Citlivost této metody je velmi nízká (Bird, A. P., Southern, Ε. M., J. Mol. Biol. 118, 2747). Obměny kombinují PCR s touto metodou; amplifíkace pomocí dvou primerů umístěných na obou koncích rozeznávané sekvence, proběhne po rozštěpení pouze pokud je rozeznávaná sekvence v methylované formě. V tomto případě se cithvost teoreticky zvyšuje na jednu molekulu cílové sekvence; avšak, mohou se však studovat pouze určité pozice při vysoké ceně (Shemer, R. a kol., PNAS 93, 6371-6376).

Druhá varianta je založena na částečném chemickém štěpení celé DNA, za použití modelu Maxam-Gilbertovy sekvenační reakce, ligace adaptorů k takto vytvořeným koncům, amplifiakci pomocí generických primerů a separaci pomocí gelové elektroforézy. Při použití této metody je možné studovat určité oblasti o velikosti méně než tisíc párů baží. Tato metoda je však tak komplikovaná a nespolehlivá, že se již prakticky nepoužívá (Ward, C, a kol., J. Biol. Chem. 265, 3030-3033).

Nový způsob výzkumu DNA pro stanovení přítomnosti 5-methylcytosinu je založen na specifické reakci bisulfitu s cytosinem. Výsledný produkt se přemění za příslušných podmínek na uráčil, který je ve smyslu párování bází ekvivalentní thymidinu, a který také odpovídá jiné bázi. 5methylcytosin není modifikován. Výchozí DNA se takto přemění takovým způsobem, že methylcytosin, který původně nelze rozlišit od cytosinu podle svého chování při hybridizaci, je možné nyní detekovat pomocí „normálních“ technik molekulární biologie. Všechny tyto techniky jsou založeny na párování bází, které může být nyní kompletně využito. Stav techniky z hlediska citlivosti, je definován metodou, která zahrnuje DNA studovanou v agarósové matrici, aby se zabránilo difúzi a renaturaci DNA (bisulfit reaguje pouze s jednořetězcovou DNA) a nahrazení všech precipitačních a purifikačních kroků rychlou dialýzou (Olek, A., a kol., Nucl. Acids. Res. 24, 5064-5066). Za použití této metody je možné studovat jednotlivé buňky, což představuje její výhodu. Avšak dosud byly studovány pouze určité oblasti, přibližně do 3000 párů baží a obecně výzkum buněk k identifikaci tisíců možných methylačních dějů není možný. Tato metoda však není vhodná pro spolehlivou analýzu nepatrných fragmentů z malých množství vzorků. I přes ochranu proti difúzi se tyto vzorky ztratí v matrici.

Oblasti použití bisulfítové techniky.

V současné době se bisulfitová technika až na několik výjimek (například Zeschnigk, M. a kol., Eur. J. Hum. Gen. 5, 94-98; Kubota, T. a kol., Nat. Genet. 16, 16-17) používá pouze ve výzkumu. Krátké, specifické úseky známého genu se však po bisulfítové reakci rutinně amplifikují, a buď zcela sekvenují (Olek, A. a Walter, J., Nat. Genet. 17, 275-276) nebo se • · pomocí „příměrové extenzní reakce“ (Gonzalgo. M.L. a Jones, P. A., Nucl. Acids. Res. 25, 25292531) nebo enzymatickým štěpením (Xiong, Z. a Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 25, 2532-2534) detekuje přítomnost určitých pozicí cytosinu. Všechny tyto odkazy jsou z roku 1997. Koncepce použití komplexních methylačních vzorů pro nalezení souvislosti s údaji o fenotypů, mnohem méně pomocí vyhodnocovacího algoritmu, například neuronové sítě; která je dosud neuvedena v literatuře; týkající se komplexních genetických chorob tak nemůže být provedena pomocí metod dosavadního stavu techniky.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je odstranit nedostatky a nevýhody stávajících řešení a nalézt výhodný způsob, který slouží k charakterizaci, klasifikaci a diferenciaci tkání a buněčných typů, pro předpověď chování tkáně a skupin buněk, a pro identifikaci genů se změněnou expresí, jehož podstatou je, že v genomové DNA, která se získá z kteréhokoli tkáňového vzorku, a která může být zpracována, nastříhána nebo rozštěpena pomocí restrikční endonukleázy známým postupem, se báze cytosin, ne však 5-methylcytosin, přemění reakcí s roztokem bisulfitu na uráčil známým postupem, dále se frakce takto zreagované genomové DNA se naamplifikují za použití velmi krátkých nebo degenerovaných oligonukleotidů nebo oligonukleotidů, které jsou komplementární k adaptérovým oligonukleotidům, které byly připojeny ligací ke konci štěpené DNA před bisulfítovou reakcí, přičemž se celkově množství zbývajícího cytosinu na guanin-bohatém řetězci DNA a/nebo guaninů na cytosin-bohatém řetězci DNA z amplifikovaných frakcí detekuje hybridizací nebo polymerázovou reakcí tak, že data získaná touto analýzou se automaticky použijí ve zpracovávajícím algoritmu, což umožňuje vytvořit závěr vzhledem k fenotypů analyzovaného buněčného materiálu.

Podle vynálezu je výhodné uvést data získaná z této analýzy několika nebo mnoha takových testů DNA vzorků z fenotypově identických nebo podobných buněk nebo tkání v souvislost v přípravné fázi za použití neuronové sítě nebo jiného vyhodnocovacího algoritmu s fenotypem buněk, jejichž DNA byla studována. Data vytvořená v této přípravné fázi ve vyhodnocovacím vzorci se uvedou v souvislost mezi fenotypem a methylačním stupněm, pro použití při odvození, získání methylačního stavu vzorku DNA neznámého původu, fenotypů buněk, jejichž DNA byla zkoumána, nebo data vytvořená v této přípravné fázi ve vyhodnocovacím vzorci methylačního stupně DNA známého buněčného typu, se použijí k identifikaci cytosinových pozic, které se liší u studované DNA od methylačního stupně stanoveného v přípravné fázi.

• ·

Výhodou podle vynálezu je navíc štěpení DNA před reakcí s bisulfitem a restrikčními endonukleázami, které obsahují cytosin v 5’-CpG-3’ sekvenci ve své rozpoznávací sekvenci a štěpení takto rozštěpeného fragmentu DNA v těchto rozpoznávacích sekvencích, kde je cytosin v 5’-CpG-3’ sekvenci v nemethylované formě v 5’ pozici.

Výhodou podle vynálezu je navíc to, že před modifikací genomové DNA známým způsobem, pomocí bisulfitového roztoku, se genomová DNA rozštěpí restrikění endonukleázou, výsledné konce se pomocí ligázové reakce, známým způsobem spojí s krátkými a dvouvláknovými sekvencemi DNA, zvanými též adaptory. Oligonukleotidy, které jsou komplementární k adaptorům, které reagovaly s bisulfitem, se využívají pro amplifikaci celých fragmentů DNA nebo subpopulací takto vytvořených, ze všech fragmentů takto vytvořených po reakci s bisulfitem.

V této souvislosti je výhodné, pokud probíhá reakce genomové DNA próby s roztokem bisulfitu pro konverzi cytosinu na uráčil při současném zachování methylcytosinu při cyklických změnách reakěních teplot v rozmezí 0°C a 100°C.

Je též výhodné, pokud je DNA před reakcí s bisulfitem umístěna do vytopitelné pórovité kapiláry, která je propustná pouze pro malé molekuly, v které následující reakční kroky s bisulfitem probíhají přidáváním a odstraňováním reagencií dialýzou.

Dále je výhodné, podle vynálezu, umístit vzorek před reakcí s bisulfitem do vytopitelné pórovité kapiláry, která není propustná pro malé molekuly, ve které následující reakční kroky s disulfitem probíhají přidáváním a odstraňováním reagencií pomocí připojených kapilár.

Výhodou je navíc podle vynálezu to, že polymerázové reakce, které následují po reakci s bisulfitem, probíhají ve stejné kapiláře jako reakce s bisulfitem, nebo v kapiláře připojené k této kapiláře, nebo v nádobce připojené k této kapiláře.

Je též výhodné, pokud v kapiláře, ve které probíhají polymerázové rekce, probíhající se vzorkem DNA po reakci s bisulfitem, se provádí rozdělení populace fragmentů podle délky.

Je dále výhodné, pokud se zreagovaná DNA oddělí oddělením bisulfitu od ostatních složek.

Dále je výhodné, podle vynálezu, pokud se pro amplifikaci vzorků genomové DNA, zreagované s bisulfitem, použijí oligonukleotidy dvou tříd, kdy oligonukleotidy jedné třídy neobsahují bázi cytosin nebo jeho analogy, kromě obsahu v 5’-CpG-3’ sekvenci, nebo v pouze velice malém množství, nebo pouze v těch oblastech oligonukleotidů, které nejsou důležité pro amplifikaci, a kde oligonukleotidy druhé třídy neobsahují bázi guanin nebo jeho analogy, kromě obsahu 5’-CpG-3’, nebo v pouze velice malém množství, nebo pouze v těch oblastech oligonukleotidů, jako například v 5’ oblastech, které nejsou důležité pro amplifikaci, a kde dvě třídy oligonukleotidů jsou buď

a) tak krátké, že při amplifikaci, kdy každý obsahuje pouze jeden reprezentativní ze dvou tříd, se amplifikuje více než 100 různých fragmentů, nebo

b) tyto oligonukleotidy obsahují tak mnoho takzvaných degenerovaných pozic, že při amplifiakaci pouze s jedním reprezentativním z každé ze dvou tříd se amplifikuje více než 100 různých fragmentů, nebo

c) se při amplifikaci použije tak mnoho reprezentativních oligonukleotidů obou tříd, že se amplifikuje více než 100 různých fragmentů.

Výhodou je, pokud se za optimální řešení považuje smíchání zreagované a naamplifikované DNA v oddělených přípravách za účelem polymerázové reakce s různými oligonukleotidy v každé reakci, které jsou komplementární na svém 5’ konci k adaptorům nebo obecně komplementární pro amplifikaci oligonukleotidů zreagovaných s bisulfitem, a které jsou různé na svých 3’koncích v každé s reakcí a jejichž variabilní 3’ konec začíná reakci od známé adaptorevé sekvence nebo oligonukleotidové sekvence a jejich variabilní 3’konec je rozšířený za známou adaptorevou sekvencí o 2 až 12 oligonukleotidů do neznámé sekvence DNA templátu.

V této souvislosti je opět zvláště výhodné, pokud takové rekce, kdy polymerázová rekce je zahájena oligonukleotidy, které jsou komplementární k DNA zreagované s bisulfitem, obsahují kromě tří nukleotidů dATP, dTTP a dCTP nebo analogů těchto tří nukleotidů, analog nukleotidu, který je komplementární k bázi cytosin, a který po inkorporaci pomocí polymerázy blokuje jakékoli další prodlužování řetězce, nebo žádný nukleotid nebo nukleotidový analog, který je komplementární k bázi cytosinu.

Dále je podle vynálezu výhodné, pokud takové rekce, kde polymerázová rekce je zahájena oligonukleotidy, které jsou komplementární k DNA zreagované s bisulfitem, obsahují kromě tří nukleotidů dATP, dTTP a dGTP nebo analogů těchto tří nukleotidů, také analog nukleotidu, který je komplementární k bázi guanin, a který po inkorporaci pomocí polymerázy blokuje jakékoli další prodlužování řetězce, nebo žádný nukleotid nebo nukleotidový analog, který je komplementární k bázi guanin.

V této souvislosti je zvláště výhodné, pokud k zakončení polymerázové rekce dojde v místě, které původně obsahovalo methylcytosin ve vzorku ve smyslu ukončujícím reakci, které byly modifikovány takovým způsobem, že umožňují detekci specifických produktů po ukončení polymerázové reakce.

• · • · ·· ··· ·· ··· · _ν φ • · · ♦ ·· · · ·· · ·· ·· ·· · · ··

Dále se podle vynálezu různé směsi fragmentů z určitých reakcí, vyplývajících z příslušných kombinací, použijí v určitých měřeních iontového zdroje MALDI-TOF nebo jiného hmotnostního spektrometru, a složení fragmentů jednotlivých reakcí se určí na základě stanovém hmotnosti všech fragmentů DNA.

Dále je výhodné, pokud se různé směsi fragmentů jednotlivých reakcí vyplývajících z příslušné kombinace, použijí v oddělených bězích gelové elektroforézy a složení fragmentů jednotlivých rekcí se stanoví meřením délek všech fragmentů DNA.

Oligonukleotidy podle vynálezu, pomocí nichž se zahajují polymerázové reakce, jsou navíc spojeny jednotlivě s oligonukleotidem rozdílné sekvence a různých chemických znáčem a jejich chemické/fyzikální vlastnosti umožňují detekci a rozlišení různých značení pomocí standardních chromatografických nebo hmotnostně spektrometrických postupů.

V této souvislosti je zvláště výhodné, když se fragmentová frakce, připravená v prvním amplifikačním kroku, zkoumané DNA, která zreagovala s bisulfitem, současně smíchá s dvěma nebo více chemicky různě značenými oligonukleotidy. Tyto oligonukleotidy se používají v přípravné reakci jako primery pro polymerázovou reakci. U výsledné komplexní směsi fragmentů se v prvním analytickém kroku provede elektroforetická separace podle délky a u jednotlivých délkových frakcí fragmentové směsi po elektroforéze se provede chromatografická nebo hmotnostní spektrometrická analýza, která detekuje v každé délkové frakci přítomnost nebo nepřítomnost chemických znáčem', která charakterizují oligonukleotidy.

Dále se podle vynálezu aplikují na povrch oligonukleotidy, které nebsahují bázi cytosin nebo jeho analogy, nebo pouze v souvislosti s 5’-CpG-3’, nebo pouze v oblastech, které nejsou důležité pro hybridizaci ze vzorkem DNA, nebo které neobsahují bázi guanin nebo pouze v souvislosti s 5’-CpG-3’, nebo v oblastech, které nejsou důležité pro hybridizaci se vzorkem DNA.

V této souvislosti je podle vynálezu výhodné, pokud se vzorek DNA, který reagoval s bisulfitem a byl amplifíkován, hybridizuje s oligonukleotidy, které jsou ukotveny na povrchu známým způsobem, pro každý bod na povrchu, jejichž oligonukleotidová sekvence je lokalizována přesně do tohoto místa a dojde k hybridizaci amplifikovaného vzorku DNA s ukotvenými oligonukleotidy, nebo zůstane pouze po příslušném vymývacím kroku, pokud oligonukleotidy a vzorek DNA jsou zcela komplementární v těchto oblastech, které jsou důležité pro hybridizaci.

Dalším předmětem podle vynálezu je set, kde alespoň dvě složky definovány výše (například kombinace oligonukleotidů pro amplifikaci DNA, která zreagovala s bisulfitem, a

*« «· *· ·« • · · · · · · · • · · · · · · · • ·· · · · ·· · • · · · · ·· · ·· ·· ·· ·· oligonukleotidy chráněné ukotvením k matrici) se smíchají před reakcí DNA s bisulfitem a amplifikací této zreagované DNA, výslednou detekcí methylačního stavu více než 100 CpG nukleotidů savčího genomu lze takto provést reakci, která odpovídá klinické diagnóze nádorového onemocnění.

Způsob podle vynálezu řeší problém stanovém parametrů, které jsou diagnostické pro chování buněk v extrémně velkých množstvích. Pro tento účel je třeba vypracovat zcela novou představu buněčné analýzy, s touto analýzou musí být spojeny zcela nové vyhodnocovací mechanismy, a navíc musí být zajištěna technická báze pro vytváření dat. Tento způsob poprvé využívá informační obsah cytosinové methylace a umožňuje tak použití analytických metod a spojení s vyhodnocovacími algoritmy nutnými pro tento účel. Způsob podle vynálezu je tak použitelný za účelem nalezení, v případě postižených buněk pomocí dědičných defektů, sekundárně zahrnutého genového lokusu, který za použití metod dosavadního stavu techniky je teoreticky nedetekovatelný nebo pouze velmi obtížně: způsob uvádí geneticky modifikované lokusy, jejichž (možné epi-) genetické změny nezahrnují jakékoli aktuální změny v sekvenci bází. Způsob podle vynálezu takto umožňuje zaměření na nové terapeutické postupy. Způsob dále řeší problém klasifikace degenerovaných buněk takovým způsobem, že umožňuje stále přesnější vytrváření souvislostí mezi (epi-)genotypem a fenotypem, než bylo možné podle dosavadního stavu techniky. Způsob podle vynálezu navíc umožňuje předpovědět chování degenerovaných buněk a reakce těchto buněk na stimul z organismu nebo vnějšího prostředí. Způsob konečně pomáhá při výběru nejlepší terapeutické metody pro nádorová onemocnění. Způsob dále umožňuje stanovení společných genetických a/nebo biochemických rysů nádorových buněk, které jsou fenotypově podobné, ale genotypově rozdílné (navíc kromě toho, že rozdíly je možné stanovit podle dosavadního stavu tehcniky). Předpoklad, na kterém je nárok tohoto způsobu založen, je ten, že většina různých genotypů může vést k velmi podobným epigenotypům a tak k velmi podobným fenotypům. Předkládaný způsob následně umožňuje detekci těchto změn v genetické expresi nádorových buněk, které nejsou způsobeny, nebo pouze nepřímo způsobeny změnami v sekvenci.

Předložený způsob řeší uvedený problém novátorským způsobem kombinací a zlepšením různých metod dosavadního stavu techniky. Určité modifikace těchto metod, které jsou známy, předkládají možnost jejich uzpůsobení na nové požadavky, čímž je dosaženo zcela nového obecného způsobu podle vynálezu, který je popsán níže s odkazem na výhodné varianty tohoto způsobu, a který bude popsán na základě příkladů.

• »

·«····♦»· ^A“' · ·· · « · _e » ·· ·· ·· ··

Příklady provedení vynálezu

Přípravná reakce vzorku DNA pro reakci s roztokem bisulfitu.

Základní kroky celého postupu, jako je izolace tkání nebo buněk, a následná izolace DNA se provádí známým postupem. Avšak izolace DNA pro další analýzy se provádí v případě výhodných variant způsobu v minimálním objemu, většinou podobně jako reakce s bisulfitem, ve vrstvě oleje, která zabraňuje kontaktu s prostředím. Cílem tohoto přístupu je dosažení co nejmenších ztrát DNA, aby byly zaručeny reprodukovatelné výsledky i v případě příliš malých výchozích množství. Extrakce DNA z buněk nebo tkání se může též provést přímo v kapiláře, jak je popsáno níže, ve které pak mohou proběhnout všechny následné reakce. Omezení extrakčního objemu však není nezbytnou součástí navrženého způsobu.

Vyizolovaná DNA pak může reagovat spolu s bisulfitem v neupravené sekvenci, za následného sestřihu nebo štěpení restrikčními endonukleázami.

Způsob podle vynálezu se z tohoto hlediska může rozdělit na dvě různé varianty. Jedna z variant, kdy se poslední detekce jednotlivých pozic methylcytosinu provádí hybridizací s oligonukleotidy, většinou v tomto kroku nevyžaduje žádnou další přípravnou úpravu DNA. Druhá varianta, kdy se provede genomová amplifikace vzorku DNA pomocí oligonukleotidu se vzorky, které jsou komplementární k adaptorům, které se připojují ligací ke konci DNA, reagující s bisulfitem, vyžaduje ligaci těchto adaptorů k jednotlivým fragmentům štěpené DNA. Adaptory jsou krátké, dvouřetězcové molekuly DNA, představující zpravidla jednořetězcovou sekvenci. Tato sekvence je komplementární ke koncům vzorků štěpené DNA, takže na obou koncích DNA fragmentů vzorku může být připojen tento adaptor pomocí příslušné ligázy. V tomto případě se musí přidat takové možství adaptorů, aby byly v přebytku vzhledem k počtu konců fragmentu. Ligace adptorů k fragmentům vzorku se může však v podstatě provést také bez komplementárních jednořetězcových přeměn. Jednotlivé reakce jsou v podstatě známy z dosavadního stavu techniky (Sambrook a kol., Molecular Cloning; A laboratory manual, CSHLP, 1989) a nebudou proto dále popsány. Kombinace ligace adaptorů s bisulfitovou reakcí a následná amplifikace v genomu je v podstatě jedinečná a není uvedena v literatuře nebo patentové literatuře.

Modifikace bisulfitové metody podle vynálezu.

Základem všech variant způsobu podle vynálezu je způsob modifikace jednořetězcové

DANN [sic; DNA] pomocí bisulfitu. Pro uskutečnění některých variant způsobu podle vynálezu je však nezbytné provést některé modifikace bisulfitové metody.

• · • ·

Základní varianty způsobu jsou založeny nejen na skutečnosti, že celkové množství výchozího vzorku by mělo být minimální (v krajním případě pouze jedna nebo několik desítek buněk), ale také na tom faktu, že několik variant tohoto způsobu v podstatě vyžaduje použití velmi krátkých fragmentů. Rutinní použití způsobu podle vynálezu navíc pro klinické diagnózy vyžaduje automatizaci všech kroků postupu takovým způsobem, aby bylo dosaženo co nejvyššího stupně reprodukovatelnosti.

Všechny kroky bisulfitové metody by proto měly být prováděny v minimálních objemech s maximálním chráněním od „vnějšího prostředí“. Uzavření bisulfitové reakce do agarózové matrice již znamená pokrok s ohledem na difúzi fragmentů, ale reakce stále probíhá ve velmi velkém objemu vodného roztoku bisulfitu. Malé, důležité fragmenty DNA tak mohou difundovat do roztoku a uniknout tak další analýze.

Způsob podle vynálezu zahrnuje provedení bisulfitové metody bez použití jakéhokoli vnějšího objemu. Bisulfitová reakce se například provádí v oleji o objemu pouze l-10ml a složky se tak mohou napipetovat přesně pomocí robotu pod olej, kde vytvoří jednu kapku, v které proběhnou všechny následující reakce. Obtížnost přípravy roztoku bisulfitu o požadovaných koncentracích vyžadovaných podle dosavadního stavu techniky a skutečnost, že roztok podle dosavadního stavu techniky, za použití kratších reakčních časů s nižší koncentrací bisulfitu, má za následek významné poškození vzorku DNA, jsou řešeny způsobem podle vynálezu.

Tento způsob využívá faktu, že různé reakční kroky bisulfitové reakce jsou rovnovážnými reakcemi. Tyto rovnováhy jsou zachovány (sulfonace a deaminace) při různých teplotách, během dvou důležitých reakčních krocích, sulfonace cytosinu a následné deaminace. Pokud vezmeme v úvahu kinetiku, která se uplatňuje při stanovování jednotlivých rovnováh, pak je zřejmé, že je výhodné provádět bisulfitovou reakci za cyklických podmínek při změně teplot. Výhodná varianta metody zahrnuje změnu od 4°C (10 minut) do 50°C (20 minut). Všechny ostatní teploty a reakční časy při určitých teplotách by však měly být zahrnuty ve způsobu podle vynálezu. Za určitých podmínek by například bylo výhodné, pokud by byly významně zkráceny reakční časy. Je též užitečné, a v podstatě nové, zařazení kroku, při kterém by studovaná DNA byla opět denaturována při velmi vysoké teplotě mezi deaminačním krokem (při vysoké teplotě, >50°C) a následně by se opakoval sulfonační krok. Pro vysokomolekulární DNA jsou denaturační teploty zpravidla > 90°C, ale v následujících cyklech mohou být též nižší, což se nevymyká rozsahu způsobu podle vynálezu. Toto má dva důvody. Na jedné straně existují varianty tohoto způsobu, kdy se zkoumají velmi krátké fragmenty DNA. Na druhé straně se v každém reakčním cyklu snižuje komplementarita mezi řetězci, jako výsledek přeměny cytosinů na uráčily. Protokol » » • ·.

* € ř · • · · fc ·* fcfc ♦ ·

cyklické reakce může mít proto velmi komplexní podobu. V prvních cyklech může být denaturační teplota například vyšší než 90°C, ale v následujících cyklech může být snížena. Několikanásobné reakce mohou být vždy optimalizovány pouze provedením sérií testů za extrémních podmínek. Způsob podle vynálezu proto obecně zahrnuje cyklicky prováděné bisulfitové reakce.

Další řešení výše uvedených problémů dosavadního stavu techniky je založeno na provedení jednoho nebo více kroků způsobu v kapiláře. V podstatě se jedná o dvě varianty: kapilára může být 1) nepropustná nebo 2) může být propustná pro určitá rozpouštědla, jako v případě velmi tenké dialyzační trubice.

Varianta v případě 1) ukazuje, že kapka, jak je popsáno výše v příkladech, obsahující DNA, bisulfit a radikálový lapač, se může zavést do vodného roztoku zevně pomocí vyhřívatelné nebo chladící kapiláry. Při tomto postupu může být kapka v kapiláře izolována kapalnou nebo plynnou fází. Všechny reakce pak probíhají v kapiláře a další reagencie se pak mohou přidat pomocí vstupních přípojek. Protože je kapilára ve variantě 1) zcela uzavřená zevně, je nezbytné v dalších krocích přidat roztok matrice, čímž vzniknou výše uvedené problémy vyžadující řešení podle vynálezu.

Varianta podle 2) ukazuje, že přes porézní kapiláru, která byla nejprve ošetřena příslušnou předběžnou reakcí podle jednotlivých kroků způsobu podle vynálezu nebo jiným postupem, přechází pouze roztok DNA. Kapilára vede přes roztoky v kontejnerech, které jsou nezbytné pro reakční kroky v kapiláře. V určitých krocích vede roztok DNA v kapiláře v některé z variant nejprve přes roztok bisulfitu, který může mít konstantní teplotu, nebo zde může docházet k cyklické změně teplot. V dalším kroku po zakončení bisulfitové rekce vede kapilára přes dialytický roztok, pak přes alkalický roztok, a konečně přes další dialytický roztok. Po těchto krocích bisulfitové reakce v kapiláře se provádí další varianta tohoto způsobu, kdy všechny další PCR a kroky využívající primery, probíhají v jedné kapiláře. V případě, kdy jsou různé primery pro reakce, které je vyžadují, podle vynálezu, značeny speciální chemickou modifikací, se může ihned po všech těchto PCR a krocích vyžadujících primery, provést kapilární elektroforéza ve stejné kapiláře. Při elektroforéze jsou produkty extenze rozděleny podle délky a následně hmotnostní spektrometrií, chromatografií nebo optickou analýzou, se oddělí nashromážděné délkové frakce podle jejich značení, a tak se získá výsledné spektrum nebo výsledný chromatogram v rozsahu sekundární analýzy.

Použití kapiláry pro bisulfitovou reakci a PCR a/nebo extenzní reakce též usnadňuje použití jiné detekční varianty podle vynálezu. Fragmenty se vskutku mohou po amplifikací ihned převést do kapiláry, která, jak je popsáno níže, obsahuje na vnitřní straně oligonukleotidy, specifické pro jednotlivé methylcytosiny, používané pro hybridizaci.

Další varianta způsobu je založena na odstranění vysokomolekulámího roztoku bisulfitu jiným způsobem než dialýzou. Výhody této varianty odstraňují další nevýhodu dalších níže popsaných variant.

Každá dialýza na agaróze umožňuje provedení části postupu ve velkém objemu vodného roztoku. Výsledkem je riziko ztráty fragmentů DNA difúzí. Jedním problémem variant, které probíhají v kapiláře je to, že malé procento fragmentů DNA, které v případě minimálního množství DNA může být významné, se může vázat na vnitřní stěnu kapiláry a tak uniknout analýze.

Proto je navržen následující způsob. Provede se izolace DNA, jak je popsáno, v minimálním objemu pod vrstvou oleje. Ve výhodné variantě způsobu podle vynálezu je tento objem 1 ml. Způsob se, přirozeně, významně nezmění použitím menších nebo větších objemů. Tyto způsoby jsou proto v rozsahu nároků. DNA je denaturovaná (jak je uvedeno). Doporučené koncentrace bisulfitu se pak dosáhne přídavkem většího množství roztoku bisulfitu (například 4 ml), který je mírně větší, než je nezbytné pro úplnou reakci, takže požadovaných výsledných koncentrací a pH se automaticky dosáhne pod vrstvou oleje. Bisulfitová reakce se následně provede jedním z popsaných postupů.

V následujícím metodickém kroku (ve výhodné variantě způsobu podle vynálezu) se do roztoku přidá malé množství soli, například hydroxidu bamatého, jejíž kation vytvoří nerozpustnou sůl s bisulfitem, a tak se vysráží z roztoku. Přídavek tohoto roztoku také zvýší pH, při kterém probíhá desulfonace cytosinu, který byl sulfonován a deaminován v prvních reakčmch krocích. Během desulfonační reakce, která probíhá velmi rychle, se může vysrážená bisulfitová sůl odstranit rychlou centrifiigací z vodného roztoku vzorku. Je však výhodné použít sůl, která má následující vlastnosti. Kation tvoří sůl s bisulfitem, která zůstane nerozpustná dokonce za podmínek amplifikačního kroku, a která nemá škodlivý vliv na amplifikační krok. Množství každého z iontů, který neprecipituje z roztoku v tomto postupu, musí být navíc takové, že množství, v kterých jsou pak ionty přítomny, brání amplifikaěnímu kroku. Možné vzájemné působení těchto solí v amplifikačním postupu však může být také překonáno použitím velmi přesně připravených roztoků sob, které se mohou také přesně napipetovat. Použití stejných množství solí vede ke kvantitativnímu odstranění potenciálně rušivých iontů. Použití bisulfitu draselného a jiných opačných iontů komplementárních k následným amplifikačním pufrům též usnadňuje změny pufru popsané níže pro amplifikační reakci.

V následujícím metodickém kroku se pod olejovou vrstvu přidá další objem roztoku, který má následující vlastnosti. Složení soli je takové, že během míchání s roztokem zreagované DNA pod vrstvou oleje se dosáhne koncentrací solí a pH hodnot takových, které umožňují enzymatický amplifikační proces. V tomto případě se mohou použít všechny termostabilní polymerázy jakéhokoli původu. Typ použité polymerázy není důležitý a může se též měnit v závislosti na existujících pufrovacích podmínkách, a tím je ochrana vstažena na použití všech těchto polymeráz. Následně roztok obsahuje tuto polymerázu, všechny oligonukleotidy a požadované oligonukleotidové primery. Po přídavku tohoto roztoku tak může proběhnout amplifikace přímo ve stejné reakční nádobce. Při tomto způsobu není možný během všech procesů kontakt s „okolním prostředím“; nemůže dokonce ani dojít k nejmenší ztrátě vzorku.

Genomová generická amplifikace DNA po reakci s bisulfitem.

Detekce tisíců až milionů methylcytosinových pozic v každém případě vyžaduje amplifiakci vysokého procenta všech možných sekvencí vzorku genomu. Tato část způsobu podle vynálezu by měla být rozdělena, jak tomu bylo v části „ přípravná reakce“, do dvou variant, které se v principu Uší.

První varianta těchto kroků je založena na ligaci adaptorů k fragmentované DNA před bisulfitovou reakcí. V nejjednodušší formě se použije k tomuto účelu oligonukleotid, který je komplementární k adaptorovým sekvencím, a je přítomen po reakci s bisulfitem.

V tomto postupu může tento oligonukleotid hybridizovat s jakoukoli oblastí adaptorové sekvence. V případě polymerázové reakce s těmito komponenty teoreticky dochází k amplifikaci všech fragmentů s adaptory na obou koncích. To mohou být například všechny fragmenty, které se nejdříve štěpí restrikční endonukleázou. Kvůli omezenému počtu určitých fragmentů vzniklých po jedné takovéto amplifikaci jsou však nezbytné některé varianty způsobu, pro rozdělení reakce na různé dílčí rekce po malém počtu amplifikačních cyklů. Tyto dílčí reakce se mohou provést pomocí oligonukleotidů, z nichž některé přesahují rozsah adaptorové sekvence přesněji, jednou až čtyřmi bázemi zasahují do neznámé sekvence různých fragmentů. Tyto oligonukleotidy různých reakcí jsou vybrány tak, že každý obsahuje část možných neznámých sekvencí, takže všechny tyto nukleotidy v různých reakcích zahrnují všechny možné sekvence, které se mohou teoreticky vyskytovat mimo známé adaptorové sekvence. Mohou se například provést čtyři reakce, kdy je oligonukleotid první reakce na 3’ konci, za známou adaptor-komplementámí sekvencí, obsahující bázi adenin, jako druhou cytosin, třetí guanin a čtvrtou tymidin. Tento princip je možné přirozeně uskutečnit pomocí více než čtyř různých reakcí, kdy sekvence na 3’ konci oligonukleotidů pak obsahuje více než jednu bázi. Pozice na 3’ konci oligonukleotidů mohou též představovat takzvané degenerované pozice. To znamená, že v jedné pozici je více než jedna báze s podobným účinkem připojena k oiigonukleotidu, nebo se dva nebo více oligonukleotidů smíchají s nedegenerovanou sekvencí. Mohou se tak pokrýt všechny možné sekvence s celkovým počtem reakcí nižším než čtyři.

Tímto způsobem může být v každé reakci amplifikována subpopulace všech fragmentů, čímž se zvýší spolehlivost a amplifíkace jednotlivých fragmentů. V podstatě je možné také rozdělení reakce, takže počáteční počet amplifikačních cyklů se provede pouze s jedním oligonukleotidem, zahrnujícím včechny sekvence, a následující rekce se rozdělí, například do čtyř reakcí s jednou specifickou 3’ bází na reakci a pak následuje několik dalších amplifikačních cyklů, které jsou rozděleny na jednu nebo dvě podskupiny. Důležité je přesné měření množství přidaných oligonukleotidů. Ideálně se do každé série amplifikačních cyklů přidá množství oligonukleotidů, které je tak vysoké, že je zcela nebo téměř zcela spotřebováno během reakce. Reakční směs každého cyklu se pak může přemístit přímo a automaticky do dalších kroků.

Alternativní varianta, která se principiálně liší, nevyžaduje před ligací adaptorů předchozí naštěpení DNA. Dosavadní stav techniky popisuje některé metody, které dosahují genomových amplifikací DNA s různým úspěchem. Všechny tyto metody je třeba změnit na způsob podle vynálezu. Testovalo se použití tří různých metod. Nejprve se jako výhodná varianta použila modifikace popsané „DOPE“ techniky. Na rozdíl od metody uvedené v literatuře se použilo dvou nebo více různých oligonukleotidů v každé amplifikací, které je možné rozdělit do dvou tříd. Třídy jsou typické, že v jedné třídě není přítomna nebo velice slabě zastoupena báze guanin a v druhé báze cytosin, nebo je pouze přítomna v 5’ oblasti. Pokud jsou tyto báze vůbec přítomny v sekvenci těchto oligonukleotidů, pak jsou běžně součástí 5’-CpG-3’ sekvence. Účelem je to, aby každá z těchto tříd oligonukleotidů hybridizovala na dvou (G-bohatých) řetězcích přítomných po bisulfitové reakci nebo (C-bohatých) opačných řetězcích vytvořených kopírováním ve smyslu polymerázové reakce z těchto řetězců. Kombinací představitelů těchto dvou sekvenčních tříd je tak možné dosáhnout amplifíkace s bisulfitem zreagované DNA. Cytosiny mimo 5’-CpG-3’ sekvenci by měly být ve většině případů přeměněny v templátové DNA na uráčil, takže pro účinnou amplifikací v oligonukleotidů, který hybridizuje s bisulfidem zreagovaným řetězcem, nemusí být guanin přítomen. Na opačném řetězci platí totéž pro guanin. Pokud je v těchto třídách oligonukleotidů guanin nebo cytosin přítomen v sekvenci 5’-CpG-3’, pak je možné, že tyto oligonukleotidy mohou hybridizovat s potenciálně methylovanými pozicemi. U navrhovaného způsobu podle vynálezu se tohoto nevyužívá. Může se však stát, že nevýhody jsou tak malé, že důležité součásti této metody se mohou použít tímto způsobem. Rozsah vynálezu by měl proto obsahovat i takovéto oligonukleotidy. Je stejně tak možné, ačkoli by to bylo v podstatě na újmu účinného použití způsobu, aby byly jednotlivé guaniny přítomny na pozicích mimo oblast 5’-CpG3’. Normálně to vede během hybridizace oligonukleotidu s cílovou DNA, nutné pro ampliíikaci, k pozicím, které nejsou spárované, což ve většině případů snižuje účinnost amplifikace, a proto není žádané. Nicméně amplifikace s oligonukleotidy, které obsahují jeden nebo více guaninových bází tohoto řetězce je možná, ačkoli ne ideální. Protože tato amplifiakace může stále splňovat podstatu vynálezu, použití těchto oligonukleotidů, které, kvůli použití několika guaninů, nepatří přesně do této třídy, by též měly být zahrnuty do rozsahu vynálezu. Přesně se jedná o druhou techniku, která byla použita, vyžadující výjimky tohoto typu. V této technice jsou použity oligonukleotidy, které v principu svojí 3’ oblastí spadají do jedné z popsaných sekvenčních tříd. Avšak v 5’ oblasti těchto oligonukleotidů je připojena takzvaná „sekvence tag“, která se používá v následujících krocích pro další amplifikaci. V této variantě se v prvních cyklech amplifikace používá 3’ oblast oligonukleotidů, která spadá v podstatě do jedné z výše uvedených tříd pro amplifikaci velkého spektra fragmentů. V následujících krocích má každý amplifikovaný fragment 3’ konec a sekvenci, která odpovídá sekvenci tag. Tyto sekvence se pak mohou analogicky použít k amplifikaci podle oligonukleotidů, které jsou komplementární k adaptorům pro hybridizací s oligonukleotidem, který se používá pro další amplifikaci. Sekvence tag tohoto prvního oligonukleotidu může přirozeně obsahovat guanin v 5’ oblasti oligonukleotidů patřící 3’ oblastí do první třídy, a cytosin v 5’ oblasti oligonukleotidů patřících do druhé třídy.

Oligonukleotidy nebo oligonukleotidy, které podle své 3’ oblasti patří do jedné ze dvou tříd, se mohou připravit jiným způsobem. Varianta DOPE metody využívá kombinaci oligonukleotidů dvou sekvenčních tříd, které představují na 3’ konci předurčenou sekvenci bází. Tato sekvence bází může dosahovat, podle způsobu podle vynálezu, délky 2 až 20 bází. Před touto sekvencí je přítomna většinou 5-20 bází dlouhá oblast ,Jí“ pozic u první třídy a „D“ pozic u druhé třídy. To u pozic v syntéze oligonukleotidů znamená, že jedna ze tří bází A,C nebo T byla včleněna v případě třídy ,JJ“ a jedna báze A,G nebo T v případě třídy „D“ (kdy výše uvedené výjimky, které nepostihují princip vynálezu, by měly být zahrnuty v nárocích). Před touto oblastí (5’) může být přítomna další oblast se specifickou sekvencí (ale nemusí). Pokud se tyto oligonukleotidy použijí za příslušných podmínek pro amplifikaci DNA zreagované s bisulfitem, pak se může amplifikovat frakce výchozího genomu, který byl definován specifickými oblastmi oligonukleotidů, reprodukovatelným způsobem. V případě použití sekvencí tag může 5’ oblast oligonukleotidů představovat definovanou sekvenci, která přesahuje definici dvou sekvenčních tříd. Oligonukleotidy by též měly být zahrnuty v rozsahu patentových nároků za účelem celistvosti způsobu, pokud oligonukleotidy obsahují oblasti ,.IP' a „D“ v 3'oblasti, nebo pokud obsahují pozice definovaných bází, které nahrazují báze tříd ..IT' nebo „D“ v jakékoli formě.

Rozsah patentových nároků by měl též zahrnovat oligonukleotidy používané jako amplifikační primery, které se používají v rozsahu způsobu, a které tvoří „vlásenkové“ struktury na svých 5’ koncích; molekuly, které představují chování párů bází, které je analogické chování párů bází podle uvedeného popisu výše, jako například oligonukleotidy na základě PNA (proteinnucleic acid), chemicky modifikované oligonukleotidy; a modifikované nebo nemodifikované oligonukleotidy, které byly syntetizovány pomocí nukleotidů jiných než přírodních.

Detekce methylaěního stavu CpG dinukleotidů.

Detekce methylovaných CpG dinukleotidů na DNA čipech.

V konečné sekvenci je možné, že způsob podle vynálezu bude založen na použití DNA čipů. Použití DNA čipů proto představuje výhodnou variantu způsobu. V podstatě jsou možné všechny popsané varianty způsobu až po amplifikaci DNA zreagované s bisulfitem. Čip, použitelný pro provedení způsobu výhodnou variantou má následující provedení. Na jednom z povrchů upravených pro tento účel se syntetizuje in šitu známým postupem nebo aplikuje pomocí mikropipety nebo nanopipety pomocí značkovací aparatury nebo mikrofluidního systému, alespoň jeden tisíc, zpravidla více než sto tisíc oligonukleotidů. Každý oligonukleotid je specifický pro jednu CpG pozici; to znamená, že hybridizuje pouze s cílovou DNA, pokud CpG pozice obsažená v nukleotidu je methylovaná, nebo pouze pokud je tato pozice specificky nemethylovaná. Pro každou pozici se proto mohou použít alespoň dva oligonukleotidy (viz níže). Počet různých oligonukleotidů nemá horní hranici a může být dokonce vyšší než osminásobek všech CpG dinukleotidů obsažených v genomu. Pro každý bod DNA čipu je přesně známá jeho sekvence.

Způsob podle vynálezu vede k základní modifikaci normálního obsazení těchto DNA čipů. Na DNA čipu jsou podle dosavadního stavu techniky umístěny oligonukleotidy, které jsou komplementární ke genomové nebo exprimo váné sekvenci. To znamená, že všechny oligonukleotidy v průměru odpovídají pozici báze genomové DNA nebo exprimované sekvenci organismu. U většiny oligonukleotidů umístěných na těchto DNA čipech, to znamená u všech čtyř bází, odpovídá v průměru podíl bází guaninu a cytosinu genomové a/nebo exprimované sekvenci.

Tato situace je jiná v souvislosti se způsobem podle vynálezu. Pro každou sekvenci zahrnutou v nukleotidech může být syntetizováno v podstatě osm tříd oligonukleotidů.

• «· · · · · · ··

Výsledkem bisulfitové reakce je to, že DNA je modifikována takovým způsobem, že původně komplementární řetězce (Watson - Crickovy řetězce, též nazývané kódující templátové řetězce) již nejsou komplementární. To znamená, že mohou být syntetizovány oligonukleotidy pro oba řetězce. Tato možnost existuje díky tomu, že tyto dva řetězce se mohou použít vzájemně jako interní kontroly. Hybridizační chování dvou různých řetězců s oligonukleotidy, které jsou v každém případě vhodné, je různé kvůli místy významným rozdílům v sekvenci. Výsledkem je to, že pokud je dosaženo stejného výsledku na obou řetězcích, můžeme se domnívat, že toto bylo dosaženo nezávisle. Mělo by též být stanoveno množství methylcytosinu a cytosinu v každé testované pozici. Použití obou řetězců umožňuje, jako výsledek vyhodnocení různých hybridizačních reakcí pro každou jednotlivou CpG pozici, vyhodnocení množství podle výsledků, které je nezávislé na rozdílných hybridizačních parametrech oligonukleotidů. Chyba stanovení je tak minimalizována.

Po bisulfitové reakci nejsou rozdílné pouze dva řetězce, protože po reakci amplifikace probíhá v každém případě s účinkem na každém z obou řetězců, kde probíhá nová syntéza komplementárního řetězce. Stejně jako původní řetězce nejsou komplementární po bisulfitové reakci k sobě navzájem, nejsou ani tyto dva řetězce komplementární k sobě navzájem. Nově syntetizovaný řetězec během amplifikace není též komplementární k původně rozdílnému řetězci (tomu, ke kterému opačný řetězec nebyl syntetizován). Pro každou jednotlivou CpG pozici jsou tak vytvořeny dva různé hybridizační vzorky. Všechny tyto čtyři řetězce obsahují (předpokládáme symetrickou methylaci, což je methylace CpG pozice na obou řetězcích) stejnou informaci, ale hybridizují s oligonukleotidy o různých sekvencích. Tímto způsobem je každá informace o CpG pozici potvzena nezávisle čtyřikrát. Nicméně síla signálu čtyř různých oligonukleotidů nemůže přesně odpovídat (až na případ experimentálního vyhodnocení vytvořeného na základě použití tohoto systému) stupni methylace v dané pozici. Situace je skutečně taková, že různé fragmenty jsou též amplifikovány s různou účinností při enzymatické amplifikaci a intenzita signálu tak vždy nutně neodpovídá stupni methylace, což odpovídá i účinku amplifikace fragmentu obsahujícího CpG pozici. V každém případě je nutné oba možné oligonukleotidy pro všechny čtyři řetězce analyzovat, na jedné straně, oligonukleotid, který hybridizuje pouze se zkoumanou CpG pozicí, je methylován (který obsahuje CpG) a na druhé straně, oligonukleotid, který hybridizuje pouze v případě nemethylované CpG pozice (která tak neobsahuje CpG). Dvě možné varianty DNA řetězce, přesněji methylované a nemethylované varianty, se amplifikují s velmi podobnou účinností a umožňují tak srovnání. Protože je nyní dostupná komplementární informace pro všechny čtyři řetězce, mohou se použít všechny čtyři řetězce pro potvrzení celkového výsledku. V souvislosti se způsobem podle vynálezu je hlavním kritériem, které odlišuje oligonukleotidy od jiných metod, to, že v každém případě obsahují pouze tři ze čtyř bází. Oligonukleotidy, které jsou komplementární k původním DNA řetězcům, obsahují pouze bázi C a ne bázi G. Pouze polovina všech těchto oligonukleotidů obsahuje přesně jeden guanin, přesněji v sekvenci CpG, přesně v pozici, jejíž methylační stav je testován. Druhá třída oligonukleotidů, která je komplementární k opačnému řetězci původní DNA, který vznikl amplifikací, naopak obsahuje bázi cytosin pouze v těch místech, jejichž methylační stav se testuje. Tyto oligonukleotidy, které hybridizují pouze s cílovou DNA, pokud nimi testovná pozice je nemehylovaná, neobsahují (v závislosti na řetězci) cytosin nebo guanin. V tomto navrhovaném způsobu se přirozeně popisovaných osm tříd oligonukleotidů může také z jiných hledisek lišit. Pro studium jednotlivých pozic, které mohou být methylovány, se také může použít současně několik představitelů jedné třídy. Například, není vždy zřejmé, kolik bází je zahrnuto na každém konci potenciální methylované pozice na každém konci oligonukleotidů. Pozice, která může být methylovaná, nemusí ležet přesně uprostřed oligonukleotidů. U každé testované pozice je proto mnoho možností.

V extrémních případech je testovaná pozice umístěna na jednom konci oligonukleotidů nebo (ačkoli je toto již součástí další varianty metody), jedna pozice je dokonce za 3’ koncem, takže přítomnost cytosinu nebo guaninu (a tím přítomnost methylace původního vzorku) se nedetekuje jednoduchou hybridizací, ale stanovením primerové extenze. V této variantě metody, modifikované nukleotidové trifosfáty (tímto způsobem), ačkoli je veleném tohoto nukleotidu na 3’ konci možné, není možné žádné další prodloužení za tento nukleotid. Jako modelový příklad jsou zde použity 2’3’-dideoxy analogy čtyř nukleotidových trifosfátů), každý s různým značením čtyř nukleotidů se přidá k cílové DNA, která pak hybridizuje na čipu s oligonukleotidy. Místo přímé detekce hybridizace se přidá polymeráza, a přesně na každé pozici se na 3’ konci oligonukleotidů syntetizuje jeden nukleotid, který je komplementární k nukleotidu včleněném na 3’ konci nukleotidu, přesně odpovídající nukleotidu, který je umístěn na cílové DNA hybridizované s oligonukleotidem na 5’ pozici před oligonukleotidem. V tomto způsobu je tato pozice, která může být methylována, na původní DNA. Pokud (v závislostí na řetězci) byla pozice ve vzorku DNA methylována, pak je C umístěn v této pozici; a G je pak „přidán“ k oligonukleotidů. Pokud jsou nyní dGTP (nebo analogy tohoto nukleotidu) jednoznačně označeny a (toto je nezbytné) a sekvence oligonukleotidů na všech pozicích jsou známy, může se v tomto případě použít detekce inkorporace guaninu k detekci přítomnosti methylové skupiny v původním vzorku. Pokud je adenin připojen ke stejnému oligonukleotidů, pak byla detekce tymidinu úspěšná a současně to znamená, že zkoumaná pozice nebyla methylována. Stejný výsledek až na značený ddNTP cytosin a thymidin, se může projevit na opačných řetězcích vytvořených amplifikací. V této variantě způsobu oligonukleotidy obou sekvenčních tříd neobsahují cytosin ani guanin. Nicméně, mohou existovat výjimky (například, pokud je známo, že jedna pozice je vždy methylována nebo vždy nemethylována, nebo pokud methylace pozice nemá vliv na hybridizační chovám oligonukleotidu). Jedna nebo několik „mismatch pozicí“ v oligonukleotidu, nehledě na fakt, že mají v podstatě škodlivý účinek, mohou být pro tento způsob zvláště doporučeny. Oligonukleotidy, které přesně nepatří do sekvenčních tříd, ale které splňují důležité podmínky metody, by proto měly být zahrnuty v patentových nárocích. Přípojem nukleotidů na povrch DNA čipů se může provést pomocí oligonukleotidových tag sekvencí oligonukleotidů, které jsou komplementární ke generické sekvenci oligonukleotidů připojených k povrchu. Tyto oligonukleotidy patří do definovaných sekvenčních tříd pouze v oblastech vhodných pro hybridizaci se vzorkem DNA. Oligonukleotidy, které se používají při hybridizaci, ukotvené na povrchu DNA čipů, by navíc měly být též zahrnuty v rozsahu patentových nároků, jestliže představují chování párů bází, které je analogické chovám párů bází zahrnutém v popisu uvedeném výše, jako například oligonukleotidy založené na PNA (protein-nukleová kyselina), chemicky modifikované oligonukleotidy a modifikované nebo nemodifikované oligonukleotidy, které byly syntetizovány pomocí nukleotidů jiných než přírodních.

Tohoto se přirozeně využívá u všech variant tohoto způsobu, které jsou založeny na hybridizaci oligonukleotidů přímo v testované pozici nebo pouze s jednou bází v příměrové extenzi: Jedna pozice je zpravidla testovaná a tato pozice také obsahuje vstupní obsah cytosinu a guaninu v oligonukleotidu. Výjimky z tohoto pravidla nicméně nemusí vyplývat z jednotlivých případů, a proto jsou též předmětem vynálezu.

Detekce různě značených nukleotidových analogů v reakci příměrové extenze na DNA čipech (které mohou být vždy degenerované) mohou být též v mnoha způsobech velmi ovlivněny. Výhodnou variantou je detekce za použití CCD kamery, pomocí metody, která je známa, zaznamenávající fluorescenční signály, které ukazují, že (přirozeně fluorescenčně značený) nukleotid byl navázán k čipu. V této souvislosti ve výše uvedené variantě způsobu je každý nukleotidový analog značen různou barvou, takže je možné detekovat, který nukleotid byl začleněn do které pozice.

Jiné důležité varianty však zahrnují značení každého ze čtyř nukleotidových analogů chemickou molekulou, která se pak oddělí fotochemicky (nebo tepelně nebo jiným podobným postupem) pomocí laserového přístroje MALDI-TOF od nukleotidu, je pak přímo ionizována a stanoví se její molekulová hmotnost. Laser přístroje MALDI-TOF může být přesně zaměřen na • «· e · · · · · · · · • · · » · ··· · ·· · • ·· ··· · · · · · ·· · • ·· · · · β · · · · · každou pozici čipu a může tak také stanovit pro každou pozici čipu její hmotnostní modifikaci. Často (protože v této metodě hybridizují methylované a nemethylované cílové DNA se stejnými oligonukleotidy a methylačm stav se detekuje značením včleněného nukleotidu), jsou detekována dvě značení v každé pozici (to přirozeně platí i pro fluorescenční znáčem) a dva signály musí být kvantifikovány a vzájemně srovnány pro stanovení methylačního stupně.

V této variantě způsobu, která je běžně výhodná, se používá fluorescenční detekce. Hybridizace jsou navíc přesně detekovány a neprobíhá žádná reakce primerové extenze.

Detekce methylačního stavu cytosinu měřením délky produktů „primerové extenze“ hmotnostní spektrometrií.

Byla vyvinuta varianta způsobu, která umožňuje detekci velmi velkého počtu cytosinů a/nebo guaninů v DNA po bisulfitové reakci pomocí hmotnostní spektrometrie měřením délek v hmotnostním spektrometrech založených na MALDI. Podstata této technologie, která byla změněna pro tento způsob, byla popsána výše.

V navrhované metodě se používají nukleotidy, které, protože patří k jedné ze dvou výše definovaných sekvenčních tříd, hybridizují s velkou pravděpodobností pouze s jedním ze dvou řetězců DNA po bisulfitové reakci. Oligonukleotidy, které se používají v této variantě způsobu, mohou dosáhnout detekce cytosinu a/nebo guaninu z amplifikační směsi připravené jakýmkoli z výše popsaných způsobů amplifikace. To v podstatě znamená, že se mohou použít oligonukleotidy, které jsou komplementární s adaptory, připojenými k fragmentům vzorku před reakcí s bisulfitem, a také takové oligonukleotidy, které hybridizují na nedefinovaných pozicích fragmentů, které se amplifikovály jinými způsoby. Výhodné varianty způsobu zahrnují použití vzorků DNA, ke kterým byly připojeny restrikční fragmenty adaptorů (a pak amplifikovány po reakci s bisulfitem) nebo vzorky DNA, které byly amplifikovány s oligonukleotidy, které obsahují konstantní sekvence tag v 5’ oblasti. Adaptory pro toto použití jsou syntetizovány takovým způsobem, že po reakci obou řetězců s bisulfitem, to znamená původního řetězce mofifikovaného bisulfitem a řetězce, který byl nově syntetizován během amplifikace, se jejich obsah ve smyslu obsahu cytosinu nebo guaninu liší takovým způsobem, že oligonukleotidy pro reakci primerové extenze se mohou připravit jako specificky rozeznávající jeden ze dvou řetězců. To znamená, že v tomto případě mohou být taktéž rozlišeny dvě sekvenční třídy oligonukleotidů. Použité nukleotidy mají tu vlastnost, že jejich 3’ oblast je rozšířena za známou adaptore vou sekvenci, za sekvenci rozeznatelnou restrikční endonukleázou, a proto za známou sekvenci, do neznámé oblasti vzorků DNA. Generická amplifikace jak je popsáno výše, s elongačním krokem • · oligonukleotidů, probíhá postupně v jednotlivých dílčích oddělených reakcích, pak oligonukleotidy popsané výše jsou též rozšířeny za tuto známou oblast. V této souvislosti se oligonukleotidy mohou rozšířit o 2 až 20 bází do neznámé oblasti. Směs fragmentů z první nebo z první generické amplifikace je nyní rozdělena a smíchána s různými oligonukleotidy pro každou (pod)reakci. U každé podreakce je známo, který oligonukleotid se přidává, a podreakce se liší pouze v sekvenci oligonukleotidů, které byly přidány. Není důležité, zda sekvence oligonukleotidů je definována přesně, nebo zda jsou jednotlivé pozice zastoupeny výše uvedenými pozicemi degenerovaných nukleotidů „H“ nebo „D“. Použití degenerovaných pozic umožňuje použití delších oblastí, které jsou prodlouženy do neznámé oblasti, a to umožňuje přesnější regulaci a zvýšení počtu a typu extenzních fragmentů vytvořených touto rekcí.

Pomocí všech různých podreakcí se provede polymerázová rekce s následujícími složkami. Tyto rekce, které obsahují oligonukleotidy, které hybridizují s řetězci obsahujícími malé množství cytosinu, (odpovídající původním řetězcům DNA zreagované s bisulfitem) obsahují nukleotidy dATP, dCTP, dTTP a terminátor, který je podobný, podle chování párů baží, nukleotidu dGTP, jako například ddGTP nebo funkčně podobný nukleotid. Reakce s oligonukleotidy jiné sekvenční třídy zahrnují směs obsahující dATP, dGTP, dTTP a terminátor, který je analogický vzhledem k chovám páru bází k nukleotidu dGTP, jako například ddCTP nebo funkčně podobný nukleotid. Polymerázová reakce se pak využije k syntéze nového řetězce DNA, započatého nukleotidy na jednom řetězci (chudém na cytosin) pouze po první cytosin a na druhém řetězci po první guanin.

Pro analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie je též vhodné místo přírodních nukleotidů použít nukleotidy, které byly modifikovány známým způsobem chemickými postupy pro usnadnění následující analýzy extenzních produktů hmotnostní spektrometrií. Pro tento účel se v této variantě používají fosfothioátové analogy přirozených nukleotidů. Mohou být alkylovány v následujícím kroku, který odstraňuje ztrátu DNA a zvyšuje kvalitu a citlivost analýzy. Jiné modifikace by však také mohly být zařazeny do rozsahu patentových nároků, pokud jsou vytvořeny pro tento účel. Navíc se mohou modifikace přidávání použitých oligonukleotidů, stejně jako jejich hybridizační vlastnosti, zlepšit nebo upravit.

Účelem této varianty způsobu je příprava populací fragmentů v určitých reakcích, které jsou tak komplexní, nebo pouze tak komplexní, že mohou být odděleny gelovou elektroforézou nebo přesněji analýzou délky pomocí hmotnostní spektrometrie. Konečně je nezbytné regulovat počet syntetizovaných fragmentů v délce za oblastí oligonukleotidů rozšířených do rozsahu neznámé sekvence a stupeň degenerace takovým způsobem, že představuje na reakci jednen až několik tisíc různých fragmentů.

Jednotlivé reakce se využívají ve výhodných variantách odděleně na definovaných souřadnicích iontového zdroje hmotnostního spektrometru. Analýza na hmotnostním spektrometru pak zobrazuje spektrum fragmentů pro jednotlivé souřadnice. V případě několika tisíc koordinát na iontovém zdroji hmotnostního spektrometru a několika set fragmentů na spektrum, z nichž každý stanovuje pozici cytosinu nebo guaninu jako indikátor methylace, je též možné stanovit až několik stovek tisíc jednotlivých CpG dinukleotidů.

Podobným způsobem je možné provést detekci fragmentu spektra vytvořeného z populace fragmentu, tyto populace fragmentu byly naamplifikovány bez ligace adaptorů pomocí výše popsaných oligonukleotidových primerů. V tomto mpřípadě se vynechá sekvence, která je komplementární k adaptorům, a místo toho se použije 5’ oblast obsahující několik degenerovaných oblastí.

V případě, kdy se předběžně naamplifíkuje DNA po reakci s bisulfitem pomocí oligonukleotidů, které obsahují výše popsanou (5’) sekvenci tag na 3’ pozici, se může DNA též použít analogicky k adaptorovým sekvencím jako konstantní oblast pro hybridizaci s oligonukleotidy, jak je popsáno výše.

Detekce methylačního stavu cytosinu detekcí chemicky modifikovaných oligonukleotidů pomocí hmotnostní spektrometrie.

Jiná varianta způsobu využívá známou metodu, která umožňuje identifikaci určitých sekvencí nepřímo na základě detekce chmických modifikací použitých na oligonukleotidů pomocí hmotnostní spektrometrie.

Ve výše popsaných variantách detekce pomocí hmotnostní spektrometrie se používá mnoho různých příměrových extenzních reakcí, každá zahrnuje jednu nebo několik oligonukleotidových sekvencí. Extrémního počtu různých analyzovatelných fragmentů se dosáhne v podstatě pouze rozdělením na mnoho různých reakcí (a koordinát na iontovém zdroji MALDI).

Pokud se použije chemické modifikace na každé primerové sekvenci, pak může být v případě použití jiné analytické metody než MALDI tato separace vynechána.

V praxi to znamená, že všechny různé použité primery jsou chemicky upraveny již během syntézy nebo následně; tak, že chemie splňuje dva požadavky. Zaprvé, nesmí být zabráněno rozdělení vytvořeného fragmentu podle délky. Zadruhé, typ modifikace musí umožňovat rozpoznání separace podle délky v druhém analytickém kroku po kapilární elektroforéze. Typ modifikace tak závisí na typu analýzy v druhém kroku. Ve variantě výhodného provedení nesou

5’konce primeru krátké peptidové sekvence, které mohou být v následujícím kroku odděleny pomocí mnoha metod běžné analýzy. Jednou z velkých výhod této varianty je ta, že již v prvním kroku nespecifické amplifikace se musí použít významně menší celkové množství DNA, protože toto množství nemusí již být rozděleno do dalších rekcí. Dalšího způsobu rozdělení, kterého se dosáhne pomocí výše uvedených variant pomocí rozdělení na jednotlivé reakce, se může dosáhnout výhodnou variantou způsobu provedením způsobu podle vynálezu, kdy dojde k první separaci vytvořeného fragmentu pomocí kapilární elektroforézy. V této souvislosti není pro správný výsledek důležité, zda chemické modifikace fragmentů mají nebo nemají vliv na migrační chovám fragmentů, pokud je možná alespoň jedna separace podle délky. V každé „frakci“, která dosáhne konce kapilární elektroforézy, je nalezeno mnoho fragmentů se stejným migračním chováním při elektroforéze, které se liší pouze v chemické modifikaci své 5’ oblasti (v oblasti primeru, který byl použit pro extenzní reakci). Tyto populace fragmentů, které jsou odděleny podle svého migračního chování při elektroforéze, jsou nyní studovány v dalším kroku na přítomnost chemických modifikací. Výhodnou variantou způsobu je přímé vstříknutí průchozího objemu z kapilární elektroforézy do rychlého „atomového bombardování“ (FAB-MS), elektronové sprejové ionizace (ESI-MS), aplikace do hmotnostního spektrometru MALDI nebo podobného analytického zařízení.

V konkrétních případech se tyto varianty provádějí například následovně. DNA se vyizoluje z buněk, jak je popsáno, předem rozštěpí restrikční endonukleázou pomocí adaptorů, a převede se přes zahřívatelnou kapiláru, která je průchozí pro malé molekuly, v které probíhají reakční kroky bisulfitové reakce přídavkem a odstraněním reagencií dialýzou. Objem celkové reakce je zde minimální. Po proběhnuté bisulfitové reakci mohou kapiláry přijímat, propojeny s dalšími vstupními kapilárami, reagencie nezbytné pro amplifíkaci a amplifikace se může provádět ve stejných vyhřívatelných kapilárách. Je též možné neprovádět amplifíkaci přímo v kapiláře, ale v nádobce připojené k těmto kapilárám. Po generické amplifíkaci genomické frakce probíhá druhý lineární elongační krok, jak je popsáno, který probíhá se směsí chemicky modifikovaných oligonukleotidů, které mohou být následně rozlišeny podle hmotnosti, a které jsou komplementární k bisulfitem modifikovaným adaptorům. Následujícím krokem je rozdělení elongačních produktů podle délky v následující části kapiláry a možnost další dialýzy oproti pufru, který je kompatibilní s hmotnostní spektrometrickou analýzou, jako například síranu amonném.

Každá jednotlivá reakce se zaznamená na koordinátě iontového zdroje hmotnostního spektrometru, a pak se každá koordináta testuje na přítomnost chemických modifikací, které se Uší v hmotnosti. V této variantě, z důvodů týkajících se zařízení, je výhodné použití MALDI28

TOF, který má velmi objemný iontový zdroj, což umožňuje použít velmi velký počet různých koordinát ve velmi krátké době.

Je možné získat další varianty způsobu, protože popsaný způsob obecně vytváří všechny naměřené body ve dvou rozměrech, kvůli nezbytnosti zpracování mnoha měřených bodů, jak je popsáno výše. Na DNA čipech jsou tyto dimenze nastaveny prostorově, jako v popisované variantě analýzy jednotlivých „podreakcí“ na iontovém zdroji MALDI-TOF. U varianty kapilární elektroforézy je těchto dvou dimenzí dosaženo následným propojením dvou separačních metod, které separují na základě různých kritérií. Existují některé další varianty této metody, které, protože souvisí s obecnou myšlenkou podle vynálezu, by měly být zahrnuty v patentových nárocích. Pro provádění měření velmi velkého počtu bodů v souvislosti se způsobem podle vynálezu, není zcela nezbytné vědět, co je původem každého měřeného bodu. Pro mnohé aplikace této metody stačí vytvořit souvislost mezi velkým počtem abstraktních dat s fenotypovými vlastnostmi buněk. Výsledkem je významně velké spektrum možných analytických metod. Zpravidla je však u všech variant nezbytná kapilární elektroforéza, u které je nepřímým způsobem detekován vzniklý výsledek po hybridizaci (samotný výsledek je rozměrem analýzy).

Analýza generických dat.

Hlavní nároky se obecně týkají způsobu přípravy komplexních methylačních peptidových map a podle vyhodnocovacího algoritmu nalezení souvislosti mezi fenotypovými charakteristikami zkoumaných buněk. Patentové nároky by se však měly též týkat všech metod, které jsou vhodné pro získání methylačních dat s cílem provedení vyhodnocení těchto dat podle vynálezu, protože kombinace tvorby a použití dat je faktorem, který v podstatě dosahuje stupně vynálezecké aktivity.

Výsledkem všech výše popsaných kroků postupu je velké množství naměřených hodnot. Lze získat tři typy naměřených hodnot. Čisté plus-minus signály udávající pozice, které jsou přítomny v methylované nebo nemethylované formě ve všech analyzovaných chromozómech, pravděpodobně netvoří největší skupinu detekovatelných pozic, které mohou být methylovány. Velmi velký počet pozic vytvoří ty signály, které musí být popsány výše uvedenými způsoby.

Analýza čistých plus-mínus signálů je značně jednodušší. Postup analýzy by měl být následující. Z velkého počtu různých vzorků DNA známého původu (například z protilátkami značených buněk stejného fenotypu, izolovaných imunofluorescenčně) se získají data na základě velkého počtu měření a testuje se jejich reprodukovatelnost. Pozice, které nedávají reprodukovatelné výsledky, se rozliší od všech ostatních logickým způsobem, protože v prvním kroku není nutné vyhodnocení, zda rozdíly v jednotlivých pozicích mají biologický význam. Tyto série testů se provádí na buňkách různých typů. Výsledkem těchto sérií testů by měl být rozsáhlý, dodnes stále neznámý počet CpG dinukleotidů, které ve srovnání s jakýmkoli párem buněčných typů ukazují reprodukovatelný rozdíl v jejich methylačním stavu. Ne všechny pozice, které se liší v přímém srovnání, dvou buněčných typů, jsou informativní ve všech těchto srovnáních vzhledem k jejich odlišnosti. Když se analyzují všechny pozice, které jsou rozlišné ve srovnání s alespoň jedním buněčným typem, pak se může vytvořit charakteristický vzorec pro každý testovaný buněčný typ. Takto může být neznámý vzorek DNA přidělený k buněčnému typu. Tyto vzorce nejsou nezbytně konstantní pro všechny testované pozice. V takovém případě není možné vyhodnotit (způsob podle vynálezu v podstatě jako první řeší takovéto vyhodnocení), do jaké míry se methylační vzorec buněčného typu jednotlivého vzorku liší od charakteristického.

V ideálním případě je vytvořený vzorec buněčného typu individua natolik konstantní, že tato tkáň může být identifikována bez velkých nákladů. Daná matrice s definovaným charakteristickým signálem koordinát se může přímo použít pro stanovení vzorku buněčného typu. Ve většině komplikovaných případů není individuálně definovatelný vzorec signálů, které jsou charakteristické pro buněčný typ, existuje mnoho takových vzorců, které jsou v podstatě charakteristické, ale zřejmě nemohou být identifikovatelné jako takové. Toto může být opravdu odvozeno od stavu techniky v methylační analýze, je možné, že vzorce, které se zdají být velmi rozdílné, představují velmi podobné funkce. Nyní však není možné vytvořit nějaké pravidlo kvůli této obtížnosti, protože způsob podle vynálezu v podstatě jako první předkládá možnost vyhodnocení takovéto situace. V tomto případě může být tak příčinou to, že při použití konvenčních metod z hlediska „vizuálního vyhodnocení“, není možné zjistit původ vzorku. V tomto případě navržený způsob zahrnuje možnost „tréningu“ „neuronové sítě“ (NN) s vyhodnocením dat v sérii testů. V praxi to vypadá následovně: U vzorku buněčné DNA se provede velký počet sérií testů a použijí se jako vstup pro NN. Methylační data vzorku i a NN představují informaci o původu vzorku. Neuronová síť tak může po dostatečném počtu testů pomoci vyhodnotit, které vzorce patří ke kterému buněčnému typu. Takto mohou být zařazeny velmi komplexní a zdánlivě nezřetelné vzorce, které se zdají být pro lidské chápání a běžné algoritmy zcela chaotické.

Je však zřejmé, že ještě nelze předpovědět, jak komplexně a zřejmě chaoticky budou vytvořené vzorce vypadat. Jsou možné i jiné případy kromě popsaných. Proto každý způsob, který používá v testovaných sériích buněčných typů neznámého vzorku navržení komplexních

methylačních vzorců, může být předmětem vynálezu za účelem klasifikace použitých buněčných typů neznámého původu.

Analýza dat bude jistě komplikovanější u analýzy buněk odlišného původu. Účelem navrhovaného způsobu podle vynálezu je umožnit klasifikaci buněčných typů neznámých chorob. S daty o methylaci zkoumaných vzorků musí být dostupné fenotypové parametry zkoumaných buněk během sérií testů u NN a/nebo jiného vyhodnocovacího systému, a v této souvislosti zaprvé není vůbec jasné, které z těchto fenotypových dat musí být upraveny podle methylačního vzorce, a které poskytují použitelné údaje ve vztahu s touto souvislostí. V těchto případech narůstají problémy, které prámem ze zřejmě chaotického, ačkoli v principu klasifikovatelného množství dat. Je možné, že v případě degenerovaných buněk vedou různé epigenotypové stavy k podobným fenotypovým charakteristikám. Tyto situace jsou velmi dobře rozlišitelné zejména pomocí NN a mohou tak vést k definování nových, přesně diferencovaných fenotypů, což je jedním z hlavních důvodů navrhovaného způsobu. Je proto žádoucí jednoznačně zahrnout do analýzy dat o methylaci do patentových nároků použití různých typů neuronových sítí pro souvislost methylačních vzorců s údaji o fenotypů. Avšak jednodušší situce mohou též splnit podstatu vynálezu a neměly by proto být vyčleněny z patentových nároků.

Claims (22)

1. Způsob charakterizace, klasifikace a diferenciace tkání a buněčných typů pro předpověď chování tkání a skupin buněk, a pro identifikaci genů se změněnou expresí, vyznačující se tím, že u genomové DNA, která se získá z jakéhokoli vzorku tkáně, a může být podrobena úpravě, sestřihu nebo štěpení restrikční endonukleázou, postupem, který je sám o sobě známý, se přemění báze cytosin, ne však 5-methylcytosin, reakcí s roztokem bisulfitu na uráčil, postupem, který je sám o sobě známý, načež se frakce takto zreagované genomové DNA naamplifikují za použití velmi krátkých nebo degenerovaných oligonukleotidú nebo oligonukleotidú, které jsou komplementární k adaptorovým oligonukleotidům, které se připojí ligaci ke konci štěpené DNA před reakcí s bisulfitem, poté se stanoví množství zbývajícího cytosinu na guanin bohatém řetězci DNA a/nebo guaninů na cytosin bohatém řetězci z amplifikovaných frakcí hybridizaci nebo polymerázovou reakcí, kdy data získaná touto analýzou a automaticky použitá k tvorbě algoritmu, umožňují vytvořit závěr s ohledem na fenotyp analyzovaného buněčného materiálu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že data získaná z této analýzy několika nebo mnoha takovýchto testů na DNA vzorcích z fenotypově identických nebo podobných buněk nebo tkání korelují v přípravné fázi použitím neuronové sítě nebo jiného vyhodnocovacího algoritmu s fenotypem buněk, jejichž DNA byla testována, přičemž data použitá v přípravné fázi ve vyhodnocovacím vzorci v souvislosti mezi fenotypem a methylačním stavem se použijí pro odvození, vyhodnocení methylačního stavu vzorku DNA neznámého původu, fenotypu buněk, jejichž DNA byla studována, nebo se data použitá v přípravné fázi ve vyhodnocovacím vzorci pro určení stavu methylace DNA známého buněčného typu využijí pro identifikaci pozicí cytosinu, které se liší u zkoumané DNA od methylačního stavu stavnoveného v přípravné fázi.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že DNA se štěpí před reakcí bisulfitem a restrikčními endonukleázami, které obsahují cytosin v 5’-CpG-3’ pozici ve své rozeznávající sekvenci, a tím, že DNA se štěpí pouze v rozeznávajících sekvencích, ve kterých je cytosin v 5’CpG-3’ sekvenci v nemethylováném stavu v 5’pozici.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že před modifikací genomové DNA s roztokem bisulfitu postupem, který je sám o sobě známý, se genomová DNA štěpí restrikční endonukleázou, načež se vytvoří se výsledné konce ligační reakcí se známými, krátkými a dvouřetězcovými sekvencemi DNA, zvanými též adaptory; přičemž oligonukleotidy, které jsou komplementární k adaptorům, které reagovaly s bisulfitem, se použijí za účelem amplifikace fragmentů DNA nebo subpopulací vytvořených tak ze všech fragmentů vzniklých tímto způsobem po reakci s bisulfitem.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakce vzorku genomové DNA s roztokem bisulfitu za účelem přeměny cytosinů na uráčily za současného získávání methylcytosinu, probíhá za cyklické změny reakční teploty mezi 0°C a 100°C.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tun, že vzorek DNA se před reakcí s bisulfitem převede do zahnvatelné porézní kapiláry, která je propustná pouze pro malé molekuly, ve které proběhnou následující reakční kroky reakce s bisulfitem, přidáváním a odstraňováním reagencií dialýzou.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se vzorek DNA před reakcí s bisulfitem převede do zahřívatelné porézní kapiláry, která je propustná pouze pro malé molekuly, ve které proběhnou následující reakční kroky reakce s bisulfitem, přidáváním a odstraňováním reagencií dodávkou reagencií přes připojené kapiláry.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že polymerázové reakce, které následují po reakci s bisulfitem, probíhají ve stejné kapiláře jako bisulfitová reakce, nebo v kapiláře připojené k této kapiláře, nebo v nádobce připojené k této kapiláře.

9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že v kapiláře, ve které se provádí polymerázové reakce se vzorkem DNA, zreagovaným s bisulfitem, se také provádí rozdělení populace fragmentů podle délky.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zreagovná DNA se odstraní precipitací bisulfitu z reakční směsi.

• · · · · ·· · ·«

11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro amplifikaci vzorků genomové DNA zreagovaných s bisulfitem se použijí oligonukleotidy dvou tříd, přičemž oligonukleotidy jedné třídy neobsahují bázi cytosin nebo jeho analogy, kromě formy 5’-CpG-3’, nebo jen velmi malé množství, nebo pouze v těch oblastech oligonukleotidů, které nejsou důležité pro amplifikaci, a kde oligonukleotidy druhé třídy neobsahují bázi guanin nebo jeho analogy, kromě formy 5’-CpG3’, nebo pouze ve velmi malém množství, nebo pouze v některých oblastech, jako například 5’oblastech, oligonukleotidů, které nejsou důležité pro amplifikaci, a kde dvě třídy oligonukleotidů

a) jsou tak krátké, že při amplifikaci, kdy každý obsahuje jeden charakteristický ze dvou tříd, se amplifikuje více než 100 různých fragmentů, nebo

b) obsahují tolik takzvaných degenerovaných pozic, že při amplifikaci pouze s jedním charakteristickým ze dvou tříd se amplifikuje více než 100 různých fragmentů, nebo

c) se použijí v takovém počtu, že se naamplifikuje více než 100 různých fragmentů.

12. Způsob podle nároku 4 nebo 11, vyznačující se tím, že zreagované a naamplifikované DNA se smíchají odděleně za účelem polymerázových reakcí s různými oligonukleotidy v každé reakci, které jsou komplementární na svém 5’ konci k adaptorům nebo obecně komplementární pro amplifikaci oligonukleotidů zreagovaných s bisulfitem, a které se Uší na svém 3’ konci v každé reakci a jejichž variabilní 3’ konec se začíná prodlužovat od známé adaptorové sekvence nebo oligonukleotidové sekvence, a jejichž variabilní 3’ konec se prodlužuje za známou adaptorovou sekvenci o 2-12 nukleotidů do neznámé templátové sekvence DNA.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že reakce, ve kterých se zahájí polymerázová reakce s oligonukleotidy, které jsou komplementární k DNA zreagované s bisulfitem, obsahují navíc kromě tří nukleotidů dATP, dTTP a dCTP nebo analogů těchto tří oligonukleotidů nukleotidový analog, který je komplementární k bázi cytosin, a který po začlenění polymerázou blokuje jakékoli další prodlužování řetězce, nebo neobsahuje žádný nukleotid nebo nukleotidový analog, který je komplementární k bázi cytosin.

14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že reakce, ve kterých se zahájí polymerázová reakce s oligonukleotidy, které jsou komplementární k DNA zreagované s bisulfitem, obsahují navíc kromě tří nukleotidů dATP, dTTP a dCTP nebo ananlogů těchto tří oligonukleotidů nukleotidový analog, který je komplementární k bázi guanin, a který po začlenění polymerázou blokuje jakékoli další prodlužování řetězce, nebo neobsahuje žádný nukleotid nebo nukleotidový analog, který je komplementární k bázi guanin.

15. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že závěr polymerázové reakce na pozicích, které dříve obsahovaly methylcytosin ve vzorku DNA, se provede pomocí takových terminátorů, které byly modifikovány tak, že umožňují detekci specificky zakončených produktů polymerázové reakce.

16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že různé směsi fragmentů jednotlivých reakcí vyplývající z příslušné kombinace nároků 3-15 se jednotlivě využijí v iontovém zdroji MALDITOF nebo jiném hmotnostním spektrometru, a složení fragmentů jednotlivých reakcí se určí stanovením hmotnosti všech fragmentů DNA.

17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že různé směsi fragmentů jednotlivých reakcí vyplývající z příslušné kombinace nároků 3-15 se použijí v jednotlivých bězích gelové elektroforézy a složení fragmentů jednotlivých reakcí se určí stanovením délek všech fragmentů DNA.

18. Způsob podle nároku 4 nebo 11, vyznačující se tím, že oligonukleotidy definované v nároku 12, důležité pro zahájení polymerázové reakce, se každý spojí s oligonukleotidem rozdílné sekvence a různého chemického značení, tak, že jejich chemické a/nebo fyzikální vlastnosti umožňují detekci a rozlišení různých znáčem pomocí standardních postupů chromatografie nebo hmotnostní spektrometrie.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že frakce fragmentů, testované DNA, připravená v prvním amplifikačním kroku, která zreagovala s bisulfitem, se smíchá současně se dvěma nebo více chemicky rozdílně značenými oligonukleotidy, které se používají v reakčním postupu jako primery pro polymerázovou reakci, poté se výsledná komplexní směs fragmentů podrobí v prvním analytickém kroku elektroforetickému rozdělení podle délek a jednotlivé délkové frakce směsí fragmentů získané z elektroforézy se použijí pro chromatografickou nebo spektrometrickou analýzu, která v každé frakci délek detekuje přítomnost nebo nepřítomnost chemického značení, které charakterizuje oligonukleotidy.

0·· · 0 · · « ·«· · f«0 · • »

20. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že na povrch se aplikují oligonukleotidy, které neobsahují bázi cytosin nebo jeho analogy, nebo pouze v sekvenci 5’-CpG-3’, nebo pouze v oblastech, které nejsou důležité pro hybridizaci se vzorkem DNA, nebo které neobsahují bázi guanin, nebo jeho analogy, nebo pouze v sekvenci 5’-CpG-3’, nebo v oblastech, které nejsou důležité pro hybridizaci se vzorkem DNA.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se vzorek DNA, který zreagoval s bisulfitem a amplifikoval se podle nároku 4 nebo nároku 11, hybridizuje s oligonukleotidy, které jsou ukotveny k povrchu, přičemž se oligonukleotidy ukotví k povrchu známým postupem a pro každý bod povrchu je přesně známa oligonukleotidová sekvence, hybridizace amplifikovaného vzorku DNA s ukotvenými oligonukleotidy se objevuje nebo zůstává pouze po přílušných promývacích krocích, pokud jsou oligonukleotidy a vzorek DNA zcela komplementární v oblastech, které jsou důležité pro hybridizaci.

22. Kit podle nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že alespoň dvě složky uvedné výše v nárocích, například kombinace oligonukleotidů pro amplifikaci DNA, která reagovala s bisulfitem a oligonukleotidy, chráněné ukotvením k matrici, se smíchají s DNA před reakcí s bisulfitem, a může se provést amplifikace této zreagované DNA a následná detekce methylačního stavu u více než 100 CpG dinukleotidů savčího genomu v reakci, která klinicky odpovídá diagnóze nádorového onemocnění.