DE10347399B4

DE10347399B4 - Bisulfit-Umwandlung zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen in DNA mittels optimierter Aufreinigung

Info

Publication number: DE10347399B4
Application number: DE2003147399
Authority: DE
Inventors: Karen Albuquerque Cardon
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2003-10-09
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: CN1863929A; DE10347399A1

Abstract

Verfahren zur Bisulfit-Umwandlung von DNA, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufreinigung der umgewandelten DNA mittels Ultrafiltration erfolgt.

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Cytosin-Methylierungen in DNA. 5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt eine wichtige biologische Rolle, u.a. bei der Transkriptionsregulation, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese (zur Übersicht: Millar et al.: Five not four: History and significance of the fifth Base. In: S. Beck and A. Olek, eds.: The Epigenome. Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3-20). Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichen Interesse. Ein Nachweis der Methylierung ist allerdings schwierig, da Cytosin und 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweisen. Viele der herkömmlichen, auf Hybridisierung beruhenden Nachweisverfahren vermögen daher nicht zwischen Cytosin und Methylcytosin zu unterscheiden. Zudem geht die Methylierungsinformation bei einer PCR-Amplifikation vollständig verloren.

Die herkömmlichen Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im wesentlichen nach zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylierungsspezifische Restriktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (sog.: Bisulfit-Behandlung, siehe etwa: DE 101 54 317 A1 ; DE 100 29 915 A1 ). Die enzymatisch oder chemisch vorbehandelte DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise analysiert werden (zur Übersicht: WO 02/072880 S. 1 ff; Fraga and Esteller: DNA Methylation: A Profile of Methods and Applications. Biotechniques 33: 632-649, Sept. 2002).

Da die Behandlung mit methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen durch die Sequenzspezifität der Enzyme auf bestimmte Sequenzen beschränkt ist, wird für die meisten Anwendungen eine Bisulfit-Behandlung durchgeführt (zur Übersicht DE 100 29 915 A1 S.2, Zeilen 35-46).

Die Bisulfitbehandlung erfolgt klassischerweise in folgenden Schritten: Die genomische DNA wird isoliert, durch Scherung oder durch Behandlung mit Restriktionsenzymen fragmentiert, mit Natriumhydroxid denaturiert, mit einer konzentrierten Bisulfit-Lösung für mehrere Stunden umgesetzt und anschließend desulfoniert und entsalzen (siehe: Frommer et al.: A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1; 89(5): 1827-31).

In der letzten Zeit wurden mehrere technische Verbesserungen dieser Methode entwickelt. So wird die zu untersuchende DNA bei dem sog. Agarose-Bead-Verfahren in einer Agarose-Matrix eingeschlossen. Hierdurch werden Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert. Alle Fällungs- und Reinigungsschritte werden anschließend durch ein schnelle Dialyse ersetzt. Mit dieser Methode ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner Zellen zu untersuchen. Allerdings gibt es Schwierigkeiten bei sehr kleinen Fragmenten, die durch Diffusion verloren gehen (Olek et al.: A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064-6.). In der Patentanmeldung DE 100 29 915 A1 (WO 01/98528) ist ein Bisulfit-Verfahren beschrieben, bei dem eine DNA-Probe mit einer Bisulfit-Lösung im Konzentrationsbereich von 0,1 mol/l bis 6 mol/l in Anwesen heit eines denaturierenden Reagenzes und/oder Lösemittel sowie mindestens eines Radikalfängers inkubiert wird. Dabei sind in dieser Patentanmeldung viele unterschiedliche geeignete denaturierende Stoffe und Radikalfänger beschrieben. In der Patentanmeldung DE 101 54 317 (WO 03/038121) ist ein Verfahren offenbart, bei dem die zu untersuchende DNA während der Bisulfit-Behandlung an eine Oberfläche gebunden wird, wodurch Aufreinigungs- und Waschschritte vereinfacht werden.

Ein grundsätzliches Problem der Bisulfit-Behandlung besteht allerdings darin, dass lange Reaktionszeiten erforderlich sind, um eine vollständige Umwandlung sicherzustellen und so beispielsweise falsch-positive Resultate auszuschließen. Gleichzeitig aber kommt es durch die langen Reaktionszeiten zu einer Degradation der DNA. Dabei führen höhere Reaktionstemperaturen zwar zu einer höheren Umwandlungsrate, aber auch zu einem stärkeren Abbau der DNA. Die Wechselwirkungen zwischen Temperatur, Reaktionsdauer, Umwandlungs- und Abbaurate wurden kürzlich systematisch untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die höchsten Konversionsraten bei Temperaturen von 55°C (bei Reaktionszeiten zwischen 4 und 18 Stunden) sowie bei 95°C (bei einer Reaktionszeit von einer Stunde) erreicht werden. Ein großes Problem besteht allerdings in der Degradation der DNA. So werden bei einer Reaktionstemperatur von 55°C 84-96% der DNA abgebaut. Bei 95°C ist die Degradation sogar noch höher (Grunau et al.: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1; 29(13): E65-5). Dementsprechend verwenden die meisten Autoren Reaktionstemperaturen von etwa 50°C (vgl.: Frommer et al. a.a.o. 1992, S. 1827; Olek et al., a.a.o. 1996, S. 5065; Raizis et al: A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20; 226(1): 161-6, 162). Neben der hohen Abbaurate der DNA besteht ein weiteres Problem der herkömmlichen Bisulfitverfahren darin, dass eine schlagkräftige Aufreinigungsmethode der umgewandelten DNA bisher nicht beschrieben ist. So benutzen viele Autoren Fällungen (Vgl.: Grunau et al. a.a.o.). Auch eine Aufreinigung über DNA-bindende Oberflächen ist beschrieben (Vgl.: Kawakami et al.: Hypermethylated APC DNA in Plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma Journal of the National Cancer Institute, Vol 92, No. 22, 2000, pp. 1805-11). Die Ausbeute dieser Aufreinigungen ist aber begrenzt.

Die WO 02/38811 A2 beschreibt Assays zur Detektion und quantitativen Bestimmung von Hemimethylierungen. Ferner werden Reagenzien zur Bisulfitumwandlung, darunter Reagenzien zur Widergewinnung von DNA beschrieben.

Die DE 101 32 211 A1 beschreibt einen Nachweis spezifischer Dinukleotide in DNA-Proben durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET).

Ferner beschreibt die DE 197 54 482 A1 ein Verfahren zur Herstellung komplexer DNA-Methylierungs-Fingerabdrücke.

Durch die hohen Verluste der herkömmlichen Bisulfitbehandlung ist es problematisch, diese Verfahren für Untersuchungen einzusetzen, in denen die Menge der zu analysierenden DNA limitiert ist. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet der Methylierungsanalyse liegt jedoch gerade darin, mittels DNA aus Körperflüssigkeiten, etwa aus Blut oder Urin, Krebserkrankungen oder andere mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierte Krankheiten zu diagnostizieren. In Körperflüssigkeiten kommt die DNA jedoch nur in geringen Konzentrationen vor, so dass die Anwendbarkeit der Methylierungsanalyse durch die geringe Ausbeute der herkömmlichen Bisulfitbehandlung beschrankt ist.

Demnach besteht aufgrund der besonderen Bedeutung der Cytosinmethylierung und aufgrund der erwähnten Nachteile der konventionellen Methodik ein großen technisches Bedürfnis an verbesserten Verfahren zur Bisulfitumwandlung.

Es wurde nun ein überraschend ein Weg gefunden, bei dem durch ein neues Aufreinigungsverfahren die Ausbeute der Bisulfitreaktion unerwartet deutlich gesteigert werden kann. Dabei wird die Reaktionslösung mittels einer Ultrafiltration aufgereinigt. Zwar ist eine DNA-Isolierung mittels Ultrafiltration bereits bekannt. Eine entsprechende Aufreinigung bisulfit-behandelter DNA ist jedoch noch nicht beschrieben und ermöglicht eine unerwartet hohe Ausbeute. Zudem kann der letzte Schritt der Bisulfit-Umwandlung, die Desulfonierung, ebenfalls auf der Ultrafiltrationsmembran erfolgen, so dass es zudem zu einer Zeitersparnis kommt. Durch eine Kombination mit neuen Lösemitteln und optimierten Reaktionsbedingungen lässt sich die Ausbeute der Bisulfit-Umwandlung zusätzlich deutlich steigern. Eine sensitive Methylierungsanalyse aus Gewebe oder aus Körperflüssigkeiten isolierter DNA ist möglich.

Der Begriff "Verfahren zur Bisulfit-Umwandlung" wird hier und insbesondere in Anspruch 1 so gebraucht, dass auch Verfahrensschritte nach der eigentlichen chemischen Umwandlung der DNA noch eingeschlossen sind.

Beschreibung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bisulfit-Umwandlung von DNA ist dadurch gekennzeichnet, dass die Aufreinigung der umgewandelten DNA mittels Ultrafiltration erfolgt. Die Ultrafiltration ermöglicht eine überraschend hohe Ausbeute (s.u.).

Die zu untersuchende DNA kann je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische Untersuchungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben, aber auch Körperflüssigkeiten, insbesondere Serum. Möglich ist auch, die DNA aus Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit zu verwenden. Bevorzugt wird die DNA aus den biologischen Proben isoliert. Die DNA-Extraktion erfolgt nach Standardmethoden, aus Blut etwa unter Verwendung des Qiagen UltraSens DNA Extraktions-Kits. Andere Methoden zur Aufreinigung von DNA sind dem Fachmann bekannt.

Anschließend kann die isolierte DNA etwa durch Umsatz mit Restriktionsenzymen fragmentiert werden. Die Reaktionsbedingungen und die in Frage kommenden Enzyme sind dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den von den Herstellern mitgelieferten Protokollen.

Die Bisulfit-Umwandlung kann nach den bekannten, oben angegebenen Protokollen erfolgen. Dabei kann die Umsetzung sowohl in Lösung wie auch an einer festen Phase stattfinden (Vgl.: DE 100 29 915 ; DE 101 54 317 ). Bevorzugt wird Natriumdisulfit (=Natriumbisulfit/Natriummetabisulfit) verwendet, da es über eine höhere Wasserlöslichkeit als Natriumsulfit verfügt. Das Disulfitsalz disproportioniert in wässriger Lösung zu den für die Cytosin-Umwandlung benötigten Hydrogensulfitanionen. Wird im folgenden von Bisulfitkonzentration gesprochen, so bezieht sich dies auf die Konzentration der Hydrogensulfit- und Sulfitanionen in der Reaktionslösung. Für das erfindungsgemäße Verfahren sind Konzentrationsbereiche von 0,1 bis 6 mol/l möglich (Vgl.: DE 100 29 915 ). Besonders bevorzugt ist ein Konzentrationsbereich von 1-6 mol/l. Bei Verwendung bestimmter Lösemittel kann die maximal einsetzbare Konzentration allerdings unter 6 mol/l liegen (s.u.). Bei der Wahl der Bisulfit-Konzentration ist zu berücksichtigen, daß eine hohe Konzentration an Bisulfit zu einer hohen Konversion, aber auch zu einer hohen Abbaurate führt.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Umsetzung in Gegenwart eines Radikalfängers sowie einer denaturierenden Reagenz oder eines entsprechenden Lösemittels (Vgl. ausführlich: DE 10029 915 A1 ). Dabei können unterschiedliche, dem Fachmann bekannte Radikalfänger eingesetzt werden (Vgl.: DE 100 29 915 A1 ). Besonders bevorzugt werden Chroman-Derivate verwendet, etwa 6-Hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carbonsäure. Als denaturierendes Lösemittel wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Dioxan, eines seiner Derivate oder ein ähnlicher, aliphatischer cyclischer Ether eingesetzt. Dioxan liegt im Reaktionsansatz bevorzugt in einer Konzentration von 10 bis 35 Vol.% vor. Ein höherer Dioxananteil als 35% ist problematisch, da es dann zu einer Zweiphasenbildung in der Reaktionsmischung kommt. Besonders bevorzugt ist eine Dioxankonzentration von 20-30%, insbesondere von 22-28%, wobei die Bisulfit-Konzentration zwischen 3,3 und 3,6 mol/l beträgt. Ganz besonders bevorzugt ist ein Dioxananteil von 25% bei einer Bisulfitkonzentration von 3,5 mol/l.

In einer anderer besonders bevorzugten Ausführungsform werden als denaturierende Lösemittel Verbindungen der nachfolgenden Formel verwendet:

wobei
n = 1-35000
m = 1-3
R1 = H, Me, Et, Pr, Bu
R2 = H, Me, Et, Pr, Bu
ist.

Besonders bevorzugt sind dabei n-Alkylenglykol-Verbindungen, inbesondere deren Dialkylether, insbesondere wiederum Diethylenglykoldimethylether (DME).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in unterschiedlichen Konzentration eingesetzt werden. DME wird bevorzugt in Konzentrationen zwischen 1-35% eingesetzt. Bevorzugt sind zwischen 5 und 25%, besonders bevorzugt 10% DME. Die Bisulfitkonzentration liegt dabei vorzugsweise zwischen 0,1-6 mol/l, besonders bevorzugt zwischen 1-6 mol/l, ganz besonders bevorzugt zwischen 3-4,5 mol/l.

Die Bisulfitumwandlung kann in einem weiten Temperaturspektrum durchgeführt werden (s.o.). Dabei verwendet das erfindungsgemäße Verfahren Reaktionsgrundtemperaturen von 0 bis 80°C. Bei Wahl der Reaktionsgrundtemperatur ist zu berücksichtigen, dass ein höhere Temperatur nicht nur zur einer Beschleunigung der Umwandlung, sondern auch zu einem Anstieg der Abbaurate führt. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt die Reaktionsgrundtemperatur daher zwischen 30-70°C. Besonders bevorzugt ist ein Bereich zwischen 45-60°C; ganz besonders bevorzugt sind 50-55°C.

Die optimale Reaktionszeit der Bisulfitbehandlung hängt von der Reaktionstemperatur ab. Die Reaktionszeit beträgt normalerweise zwischen 1 und 18 Stunden (Vgl.: Grunau et al. 2001 a.a.o.). Für eine Reaktionstemperatur von 50°C liegt die Reaktionszeit gewöhnlich bei 4-6 Stunden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren wird die Bisulfitumwandlung bei milden Reaktionstemperaturen durchgeführt, wobei im Laufe der Umsetzung die Reaktionstemperatur dann mindestens einmal kurzzeitig deutlich erhöht wird. Hierdurch lässt sich die Effektivität der Bisulfitumwandlung überraschend deutlich erhöhen. Die kurzzeitigen Temperaturerhöhungen werden im folgenden „Thermospikes" genannt. Die „normale" Reaktionstemperatur außerhalb der Thermospikes wird als Reaktionsgrundtemperatur bezeichnet. Die Reaktionsgrundtemperatur beträgt wie oben beschrieben zwischen 0 und 80°C, bevorzugt zwischen 30-70°C, besonders bevorzugt 45°-55°C. Die Reaktionstemperatur wird durch mindestens einen Thermospike auf über 85°C erhöht. Die optimale Anzahl der Thermospikes steht in Abhängigkeit von der Reaktionsgrundtemperatur. Dabei ist die optimale Anzahl der Thermospikes umso höher, je niedriger die Reaktionsgrundtemperatur ist. Erforderlich ist in jedem Falle zumindest ein Thermospike. Auf der anderen Seite sind prinzipiell beliebig viele Thermospikes denkbar. Zu berücksichtigen ist allerdings, dass bei einer großen Anzahl von Temperaturerhöhungen auch die Abbaurate der DNA steigt, und somit eine optimale Umsetzung nicht mehr gewährleistet ist. Die bevorzugte Anzahl der Thermospikes liegt daher je nach Reaktionsgrundtemperatur zwischen 1 und 10 Thermospikes. Besonders bevorzugt sind dabei 2 bis 5 Thermospikes. Die Thermospikes erhöhen die Reaktionstemperatur bevorzugt auf 85 bis 100°C, besonders bevorzugt auf 90-98°C, ganz besonders bevorzugt auf 94°C-96°C.

Die Zeitdauer der Temperaturerhöhungen hängt auch von den Volumina der Reaktionsansätze ab. Es muss gewährleistet werden, dass die Temperatur gleichmäßig in der gesamten Reaktionslösung erhöht ist. Dabei sind bei Verwendung eines Thermocyclers für einen 20 μl Reaktionsansatz 30 Sekunden Temperaturerhöhung ausreichend. Bei einem Volumina von 100 μl sind 1,5 Minuten und bei 600 μl 3 Minuten Temperaturerhöhung erforderlich.

Nach Abschluß der Bisulfit-Umwandlung erfolgt eine Desulfonierung und eine Aufreinigung der DNA. Hierzu sind unterschiedliche Verfahren beschrieben (siehe etwa: DE 101 54 317 A1 ; DE 100 29 915 A1 ; Grunau et al. 2001, a.a.o.). Normalerweise wird die Reaktionslösung zunächst mit Natronlauge behandelt. Anschließend erfolgt eine Neutralisation und eine Alkoholfällung der DNA.

Erfindungsgemäß wird zur Aufreinigung eine Ultrafiltration verwendet. Eine solche Vorgehensweise hat mehrere technische Vorteile und führt zu einer überraschend effektiven Aufreinigung. So ist die Wiederfindungsrate der umgewandelten DNA sehr hoch (>85%, siehe Beispiel 1). Dies gilt sowohl für hochmolekulare DNA wie auch für fragmentierte DNA, wie sie etwa in Körperflüssigkeiten auftritt. Die herkömmlichen Verfahren zur Isolierung bisulfit-behandelter DNA führen dagegen nur zu einer Wiederfindungsrate von etwa 25%. Die Ultrafiltration hat zudem weitere Vorteile. So ist die Aufreinigung bezüglich der Volumina der einzusetzenden Proben sehr flexibel. Außerdem können die Bisulfitsalze nahezu vollständig entfernt werden. Nicht zuletzt ist eine Desulfonierung auf der Filtermembran möglich, was zusätzlich zu einer Zeitersparnis führt.

Dem Fachmann sind unterschiedliche kommerziell erhältliche Ultrafiltrationssysteme bekannt, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Microcon-Säulen von Millipore verwendet. Die Aufreinigung kann dabei nach einem modifizierten Herstellerprotokoll erfolgen. Dazu wird die Bisulfit-Reaktionslösung mit Wasser versetzt und auf die Ultrafiltrationsmembran gegeben. Anschließend wird die Reaktionslösung für etwa 15 Minuten abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer (Gemisch aus 10 mol/l Tris und 0,1 mol/l EDTA mit einem pH-Wert von 8) gewaschen. Die DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt die Desulfonierung. Hierzu wird 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min inkubiert. Anschließend erfolgt eine weitere Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt mit 1 × TE-Puffer. Anschließend wird die DNA eluiert. Hierzu wird die Membran für 10 Minuten mit 50 μl warmen 1 × TE-Puffer (50°C) versetzt. Die Membran wird nach Herstellerangaben gewendet und es erfolgt eine erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt wird. Das Eluat kann direkt für die Nachweisreaktionen eingesetzt werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass bei anderen Ultrafiltrationsystemen anderer Vorgehensweisen angezeigt sein können, und dass eine gute Ausbeute auch bei Variation der oben angegebenen Bedingungen erzielt werden kann. Die entsprechenden Ausführungsformen sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.

Die umgewandelte und aufgereinigte DNA kann über unterschiedliche Wege analysiert werden. Dazu sind dem Fachmann eine Vielzahl von möglichen Verfahren bekannt (zur Übersicht: Fraga and Esteller 2002, a.a.o. S. 634, 641 ff). Besonders bevorzugt ist es, die DNA zunächst mittels einer Polymerasekettenreaktion zu amplifizieren. Über unterschiedliche Verfahren lässt sich dabei eine selektive Amplifikation der ursprünglich methylierten bzw. unmethylierten DNA sicherstellen, etwa über die sog. „Heavy-Methyl"-Methode (zur Übersicht: WO 02/072880) oder die sog. „methylierungssensitive PCR" ("MSP"; vgl.: Herman et al.: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3; 93 (18) :9821-6) . Die Detektion der Amplifikate kann über herkömmliche Verfahren erfolgen, etwa über Primer-Extension-Reaktionen ("MsSNuPE"; siehe etwa: DE 100 10 280 ) oder über Hybridisierung an Oligomer-Arrays (Siehe etwa: Adorjan et al., Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 2002 Mar 1; 30(5): e21). In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Amplifikate unter Verwendung von PCR-Real-Time-Varianten analysiert (vgl.: US 6,331,393 „Methyl-Light"). Bevorzugte Varianten sind dabei das „Taqman"- und das „Lightcycler"-Verfahren).

Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Verwendung aller erfindungsgemäßen Ausführungsformen. Werden krankheitsspezifische Cytosinpositionen untersucht, so eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten. Hierzu gehören u.a. CNS-Fehlfunktionen, Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerdem besonders zur Vorhersage von unerwünschten Arznei mittelwirkungen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.

Erfindungsgemäß ist schließlich auch ein Kit, der eine Bisulfitreagenz und ein Ultrafiltrationsröhrchen enthält. Weitere Bestandteile können ein denaturierendes Lösemittel, ein Radikalfänger, Primer, eine Polymerase und weitere für eine Bisulfitumwandlung, Aufreinigung oder Amplifikation erforderliche Reagenzien sein.

Beispiel 1: DNA-Wiederfindungsrate im erfindungsgemäßen Verfahren.
Es soll gezeigt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr effektive Bisulfitumwandlung und Aufreinigung ermöglicht. Dazu wurden unterschiedliche Mengen an M13-DNA und humaner DNA in 100 μl Wasser gelöst. Die DNA-Lösungen wurden mit 354 μl Bisulfit-Lösung (5,89 mol/l) und 146 μl Dioxan (einschließlich Radikalfänger (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, 98,6 mg in 2,5 ml Dioxan) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 min bei 99°C denaturiert und anschließend bei folgendem Temperaturprogramm für insgesamt 5 h inkubiert: 30 min 50°C; ein Thermospike (99,9°C) für 3 min; 1,5 h 50°C; ein Thermospike (99,9°C) für 3 min; 3 h 50°C. Die Reaktionsgemische wurden anschließend per Ultrafiltration mittels einer Millipore-Microcon-Säule aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte im wesentlichen nach Herstellerangaben. Dazu wurde das Reaktionsgemisch mit 300 μl Wasser versetzt, auf die Ultrafiltrationsmembran gegeben, für 15 min abzentrifugiert und anschließend mit 1 × TE-Puffer gewaschen. Die DNA bleibt bei dieser Behandlung auf der Membran. Anschließend erfolgt die Desulfonierung. Hierzu wurde 0,2 mol/l NaOH zugesetzt und für 10 min inkubiert.
Anschließend erfolgte eine Zentrifugation (10 min) und ein Waschschritt mit 1 × TE-Puffer. Danach wurde die DNA eluiert. Hierzu wurde die Membran für 10 Minuten mit 50 μl warmen 1 × TE-Puffer (50°C) versetzt. Die Membran wurde nach Herstellerangaben gewendet. Anschließend erfolgte eine erneute Zentrifugation, mit der die DNA von der Membran entfernt wurde. Die DNA-Konzentrationen wurden anschließend fluorometrisch (oligreen) bestimmt. Die Daten sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Wiederfindungsrate der DNA beträgt mindestens 75%. Bei den bekannten Verfahren zur Bisulfitumsetzung und Aufreinigung von DNA liegt die Wiederfindungsrate dagegen unter 25%.
TABELLE 1:

Claims

Verfahren zur Bisulfit-Umwandlung von DNA, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufreinigung der umgewandelten DNA mittels Ultrafiltration erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bisulfit-Umwandlung in Gegenwart eines denaturierenden Reagenz durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem denaturierenden Reagenz um Dioxan, eines seiner Derivate oder einen ähnlichen, aliphatischen cyclischen Ether handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Dioxan 10-35% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem denaturierenden Reagenz um eine Verbindung mit der folgenden Formel handelt:
wobei n = 1-35000 m = 1-3 R1 = H, Me, Et, Pr, Bu R2 = H, Me, Et, Pr, Bu ist.
Verfahren nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem denaturierenden Reagenz um eine n-Alkylenglykol-Verbindung handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Verbindungen um Dialkylether handelt.
Verfahren nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem denaturierenden Reagenz um Diethylenglykoldimethylether (DME) handelt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das denaturierende Reagenz in Konzentrationen zwischen 5 und 25% vorliegt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Bisulfits 1 bis 6 mol/l beträgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgrundtemperatur 30-70°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgrundtemperatur 45-60°C beträgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur kurzzeitig erhöht wird, wobei die Anzahl der kurzzeitigen Temperaturerhöhungen, Thermospikes, 1 bis 10 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der kurzzeitigen Temperaturerhöhungen, Thermospikes, 2 bis 5 beträgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die kurzzeitigen Temperaturerhöhungen, Thermospikes, die Reaktionstemperatur auf 85 bis 100°C erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die kurzzeitigen Temperaturerhöhungen, Thermospikes, die Reaktionstemperatur auf 90 bis 98°C erhöhen.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufreinigung der umgewandelten DNA über Ultrafiltration erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die umgewandelte DNA mittels einer der folgenden Methoden analysiert wird: MSP, Heavy Methyl, MsSNuPE, Methyl-Light.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass DNA aus Gewebeproben oder aus Körperflüssigkeiten untersucht wird.
Verwendung eines der Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Methylierungsanalyse.
Verwendung eines der Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Cytosin-Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten, zur Vorhersage von unerwünschten Arzneimittelwirkungen, zur Festlegung einer spezifischen Arzneimitteltherapie, zur Überwachung des Erfolges einer Arzneimitteltherapie, zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben und zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Ein Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, der ein Bisulfitreagenz und ein Ultrafiltrationsröhrchen enthält.
Ein Kit nach Anspruch 22, der zusätzlich ein denaturierendes Reagenz enthält.
Ein Kit nach mindestens einem der Ansprüche 22 oder 23, der zusätzlich einen Radikalfänger enthält.
Ein Kit nach mindestens einem der Ansprüche 22 bis 24, der zusätzlich Primer enthält.
Ein Kit nach mindestens einem der Ansprüche 22 bis 25, der zusätzlich eine Polymerase enthält.
Ein Kit nach mindestens einem der Ansprüche 22 bis 26, der weitere für eine Bisulfitumwandlung, Aufreinigung oder Amplifikation erforderliche Reagenzien enthält.