Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre
in der Molekularbiologie gut studierten
Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in
RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe
der Entwicklung eines Individuums welches Gen
angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter
Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist
mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw.
des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene
Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster
einzelner Gene oder des Genoms.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte
Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der
Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese.
Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil
genetischer Information ist daher von erheblichem
Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht
durch Sequenzierung identifiziert werden, da
5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist
wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-
Amplifikation die epigenetische Information, welche die
5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf
5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von
Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer
Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht.
5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht
modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so
umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein
Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden
werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise
durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung
nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen
auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der
Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird
durch ein Verfahren definiert, welches die zu
untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch
die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit
reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle
Fällung- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse
ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and
improved method for bisulphate based cytosine methylation
analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 1524(24): 5064-6).
Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht
werden, was das Potential der Methode veranschaulicht.
Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa
3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale
Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus
geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen
trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden
Übersichtsartikel entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML,
Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related
modifications in DNA genomes. Nucleic Acids Res. 1998 May
15; 26(10): 2255-64.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen
(z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Dörfler W,
Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of
Angelman and Prader-Willi syndrome based an allelic
methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum
Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung
angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines
bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung
amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter
J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation
imprint. Nat Genet. 1997 Nov.; 17(3): 275-6) oder einzelne
Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion"
(Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation
differences at specific sites using methylation-sensitive
single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic
Acids Res. 1997 Jun. 15; 25(12): 2529-31, WO-Patent
95 00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW.
COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation
assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25(12): 2532-4)
nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch
Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
Harnstoff verbessert die Effizienz der Bisulfit-
Behandlung vor der Sequenzierung von 5-Methylcytosin in
genomischer DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA.
Urea improves efficiency of bisulphate-mediated
sequencing of 5'-methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids
Res. 1998 Nov. 1; 26(21): 5009-10).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der
Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen
Genen befassen, sind:
Grigg G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in
genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun.; 16(6):431-6, 431;
Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke
B, Dörfler W. Imprinted segments in the human genome:
different DNA methylation patterns in the Prader-
Willi/Angelman syndrome region as determined by the
genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997
Mar; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J,
Reik W. Methylation analysis an individual chromosomes:
improved protocol fort bisulphate genomic sequencing.
Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25; 22(4): 695-6; Martin V,
Ribieras S. Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic
sequencing indicates a correlation between DNA
hypomethylation in the 5' region of the p52 gene andin its
expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May
19; 157(1-2): 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO
95/45560.
Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sogenannte
methylierungssensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen
S. Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific
PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG
islands. Proc Natl Acad Sci USA Sep 393(18): 9821-6).
Für dieses Verfahren werden Primer verwendet, die
entweder nur an eine Sequenz hybridisieren, die durch die
Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position
unmethylierten DNA entsteht, oder aber umgekehrt Primer,
welche nur an eine Nukleinsäure bindet, die durch die
Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position
unmethylierten DNA entsteht. Mit diesen Primer können
demnach Amplifikate erzeugt werden, deren Detektion wiederum
Hinweise auf das Vorliegen einer methylierten oder
unmethylierten Position in der Probe liefern, an welche die
Primer binden.
Ein neueres Verfahren ist auch der Nachweis von Cytosin-
Methylierung mittels einer Taqman PCR, das als Methyl-
Light bekannt geworden ist (WO 00/70090). Mit diesem
Verfahren ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner
oder weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR
nachzuweisen, so dass sich eine nachfolgende Analyse der
Produkte erübrigt.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer
Array Herstellung lässt sich aus einer im Januar 1999
erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature
Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), der dort
zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden
zur Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie
Oligonucleotide bei vermindertem nichtspezifischen
Hintergrundsignal entnehmen.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind
vielfach fluoresziert markierte Sonden verwendet worden.
Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das
einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH
der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der
hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein
Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben
vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-
Massenspektro-metrie (MALDI-TOF) ist eine sehr
leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of
proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.
Anal Chem. 1988 Oct. 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird
in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch
einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das
Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase
befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation
des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung
beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund
ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich
stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor
früher als größere.
MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur
Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von
Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S.
(1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current
Innovations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren
ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße
überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ
geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozess
durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-
TOF Spektroskopie spielt die Wahl der Matrix eine eminent
wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind
einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die
eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es
zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch
wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht
verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass
sie einem Peptid ähnlicher wird.
Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des
Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich
durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale
DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A
procedure for selective DNA alkylation and detection by mass
spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die
Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA
resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den
gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein
weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte
Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den
Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von
Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie
Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 1989.
Nach der Erfindung der PCR sind in den folgenden Jahren
zahlreiche Varianten bekannt geworden, die diese Technik
zur Amplifikation der DNA verfeinern. Insbesondere ist
hier die Multiplexierung der PCR (Multiplex-PCR) zu
erwähnen, wobei man mehr als 2 spezifische Primer einsetzt
und dabei in einem Reaktionsgefäß eine Vielzahl von
verschiedenen, spezifischen Amplifikationen erzeugen kann.
Besonders interessant ist auch die sogenannte Nested PCR,
welche unter anderem zum Nachweis besonders geringer DNA
Mengen verwendet wird. Diese Art der PCR besteht aus zwei
aufeinanderfolgenden Amplifikationen, wobei die Primer
der zweiten Amplifikation innerhalb des ersten
Amplifikates liegen und nicht mit den Primern der ersten
Amplifikation identisch sind. Dadurch wird eine besondere
Spezilität erreicht, da die Primer der zweiten Amplifikation
nur dann funktionieren, wenn in der ersten Amplifikation
das beabsichtigte Fragment erzeugt wurde. Dagegen ist die
Vermehrung etwaiger Nebenprodukte der ersten
Amplifikation in der zweiten so gut wie ausgeschlossen.
Die vorliegenden Verfahren zur Methylierungsanalyse,
welche eine Bisulfitreaktion beinhalten, haben durchweg den
Nachteil, dass die Reaktionslösung nicht unmittelbar für
eine nachfolgenden Polymerasekettenreaktion eingesetzt
werden kann, da der hohe Salzgehalt der Bisulfitreaktion
sich störend auswirkt. Es müssen also in der Praxis
mehrere Aufreinigungs- und/oder Waschschritte durchgeführt
werden, was insbesondere bei kleinen DNA-Probenmengen zu
schlechter Reproduzierbarkeit der Protokolle,
umständlicher Handhabung und geringer Empfindlichkeit der Methode
beiträgt. Zudem muss die DNA erst, wie auch für andere
molekularbiologische Assays, isoliert werden, bevor sie
in der Bisulfitreaktion eingesetzt werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die
Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Analyse von
Cytosin-Methylierungsmustern in genomischen DNA-Proben
gelöst, wobei man die folgenden Verfahrensschritte
ausführt:
- a) die genomische DNA wird aus Zellen oder anderen
begleitenden Materialien isoliert und im wesentlichen
irreversibel an eine Oberfläche gebunden,
- b) die an die Oberfläche gebundene DNA wird, bevorzugt
mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) derart
behandelt, dass Cytosin in eine vom Basenpaarungsverhalten
in der DNA-Duplex her unterschiedliche Base umgewandelt
wird, während 5-Methylcytosin unverändert bleibt,
- c) die in Schritt b) verwendeten Reagenzien werden in
einem Waschschritt entfernt,
- d) ausgewählte Abschnitte der immobilisierten DNA werden
in einer Polymerasereaktion amplifiziert,
- e) die Amplifikate werden hinsichtlich ihrer Sequenz
untersucht.
Vorteilhaft ist es, dass man folgende zusätzliche
Schritte ausführt:
- a) die Reagenzien und Produkte der Polymerasereaktion
werden in einem Waschschritt entfernt,
- b) weitere ausgewählte Abschnitte, welche von denen in
Schritt d) verschieden sind, der immobilisierten DNA
werden in einer Polymerasereaktion amplifiziert,
- c) die Amplifikate werden hinsichtlich ihrer Sequenz
untersucht.
Es ist erfindungsgemäß weiterhin besonders vorteilhaft,
dass man die Schritte f)-g) mehrmals wiederholt, wobei in
jeder Amplifikation nach Schritt g) andere Abschnitte
amplifiziert werden als in einer der vorangegangenen
Amplifikationen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Bindung der
DNA an die Oberfläche kovalent ist.
Besonders vorteilhaft ist es dabei, dass man die DNA
unmittelbar in dem Immobilisierungsschritt auch isoliert.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Isolierung der
DNA aus Vollblut oder Serum erfolgt. Vorteilhaft ist es
erfindungsgemäß auch, dass die Isolierung der DNA aus
lysiertem Gewebe erfolgt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es dabei, dass man die
Lysis mittels Proteinase K durchführt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es insbesondere, dass die
Immobilisierung in den Gefäßen einer Mikrotiterplatte mit
96 Gefäßen oder 384 Gefäßen erfolgt, wobei in den Gefäßen
unterschiedliche DNA-Proben immobilisiert werden.
Besonders vorteilhaft ist es erfindungsgemäß auch, dass
die Immobilisierung in PCR-Reaktionsgefäßen erfolgt,
wobei in den Gefäßen unterschiedliche DNA-Proben
immobilisiert werden. Bevorzugt ist es erfindungsgemäß, dass die
Immobilisierung der DNA an einem Metalloxid, bevorzugt
Aluminiumoxid, erfolgt.
Vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren auch, wenn
die Immobilisierung an einem hydrophoben Material erfolgt
und die Bindung nur unter den gewählten Pufferbedingungen
im wesentlichen irreversibel ist.
Es ist erfindungsgemäß auch bevorzugt, dass ein
Amplifikationsschritt mit mehreren Primerpaaren als Multiplex-
PCR ausgeführt wird.
Bevorzugt ist es erfindungsgemäß dabei, dass alle oder
ein großer Teil der Amplifikate einer immobilisierten DNA
Probe gepoolt werden und so gemeinsam einer weiteren
Analyse zugeführt werden. Ein großer Teil sind etwa 50% und
mehr der Amplifikate. Es können aber auch bis zu 75% und
mehr sein.
Bevorzugt ist beim erfindungsgemäßen Verfahren auch, dass
es sich bei dieser weiteren Analyse um die Hybridisierung
an einen Oligonukleotidarray oder PNA (Peptide Nucleic
Acids)-Array handelt.
Bevorzugt ist es erfindungsgemäß auch, dass die Analyse
während der Amplifikation durch eine Realtime PCR Methode
erfolgt.
Erfindungsgemäß vorteilhaft ist es auch, dass die Analyse
nach der Amplifikation im gleichen Reaktionsgefäß durch
die Aufnahme einer Schmelzkurve erfolgt.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, dass die
Analyse durch allelspezifische Hybridisierung von
Oligonukleotiden oder PNAs (Peptide Nucleic Acids) an die zu
untersuchenden Positionen in den Amplifikaten erfolgt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner, dass die Analyse
durch Hybridisierung von Oligonukleotidprimern und einer
nachfolgenden Primerextensionsreaktion oder einer
Sequenzierreaktion erfolgt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose
und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse
mindestens einer der folgenden Kategorien angehören:
unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-
Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit;
Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische
und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen;
psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz
und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung
oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes;
Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems;
Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des
Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion,
Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des
Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische
Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen
oder sexuelle Fehlfunktion.
Bevorzugt ist erfindungsgemäß dabei, die Verwendung des
erfindungsgemäßen Verfahrens zur Unterscheidung von
Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der
Zelldifferenzierung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Kit,
bestehend aus einem Reagenz zur Behandlung der DNA gemäss
Schritt b, mindestens zwei Primeroligonukleotiden zur
Herstellung der Amplifikate, einer Festphase zur
Immobilisierung der Proben-DNA, sowie optional weiteren
Lösungen und einer Anleitung zur Durchführung eines Assays
nach einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Lösung
des Problems besteht darin, dass DNA, die im Rahmen ihrer
ohnehin angestrebten Isolierung aus beispielsweise
Vollblut, Serum oder Gewebe ohnehin an eine Festphase
gebunden wird, direkt auf dieser Festphase nachfolgend auch
einer Bisulfitreaktion unterworfen wird. Nach der in
diesem Falle sehr einfachen, durch Nachwaschen mit Wasser
oder einem geeigneten Puffer zu erzielenden Abtrennung
der Bisulfit-Reaktionsmischung kann die immobilisierte
DNA unmittelbar auch direkt für die Amplifikation
eingesetzt werden. Alternativ kann sie in dieser
immobilisierten Form gelagert werden und erst bei Bedarf für eine
Amplifikation verwendet werden. Da die immobilisierte DNA
bei der Amplifikation nicht wesentlich verändert wird,
ist es auch möglich, mit der immobilisierten DNA als
Templat mehrere nachfolgende Amplifikationen
durchzuführen, nachdem die Reaktionskomponenten der jeweils
vorangegangenen Amplifikation durch Waschschritte entfernt
wurden.
Insgesamt stellt die vorliegenden Erfindung also ein
Verfahren zur Verfügung welches hinsichtlich der
Durchführung beliebiger, auf Bisulfitbehandlung zurückgreifender
Methylierungsassays eine erhebliche Vereinfachung
darstellt. Die Proben-DNA muss nur noch direkt an eine
Festphase gebunden werden, die Bisulfitbehandlung an dieser
Festphase durchgeführt und nachfolgend unter Verwendung
immer noch derselben Festphase eine Polymerasereaktion
durchgeführt werden. Dies erlaubt es auch, stabile Assays
ausgehend von sehr geringen DNA Mengen, etwa aus Serum,
durchzuführen.
Sinnvollerweise ist die Festphase eine modifizierte
Oberfläche eines Gefäßes, in welchem dann auch die PCR-
Reaktion durchgeführt wird und vorteilhafterweise ein
handelsübliches PCR Gefäß, welches auch als Ber Streifen
oder als Teil einer Mikrotiterplatte vorliegen kann.
Wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es
also unter anderem, Oberflächen bereitzustellen, welche zum
einen die DNA möglichst irreversibel binden können, zum
anderen aber auch unter den in der Bisulfitbehandlung
vorliegenden Bedingungen hinreichend stabil bleiben und
die DNA weiterhin gebunden halten.
Es wurden zwei Oberflächen identifiziert, die diesen
Zweck erfüllen. Zum einen handelt es sich um
Aluminiumoxid, zum anderen um C18-Alkylketten, welche in
Verbindung mit geeigneten Kationen wie Triethylammoniumionen
eine feste Anbindung der DNA erlauben. C18-Alkylketten
können durch dem Fachmann bekannte
Silanisierungsverfahren mittels einem Octadecyltrialkoxysilan aufgebracht
werden. Methoden zur Modifizierung von Oberflächen mit
Aluminiumoxid werden unter anderem in US 6,291,166
beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse von Cytosin-
Methylierungsmustern besteht aus den folgenden
Teilschritten:
- 1. Die genomische DNA wird aus Zellen oder anderen
begleitenden Materialien isoliert und im wesentlichen
irreversibel an eine Oberfläche gebunden.
- 2. Die an die Oberfläche gebundene DNA wird, bevorzugt
mit einem Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) derart
behandelt, dass Cytosin in eine vom Basenpaarungsverhalten
in der DNA-Duplex her unterschiedliche Base umgewandelt
wird, während 5-Methylcytosin unverändert bleibt.
- 3. die im zweiten Schritt verwendeten Reagenzien werden
in einem Waschschritt entfernt.
- 4. Ausgewählte Abschnitte der immobilisierten DNA werden
in einer Polymerasereaktion amplifiziert und
- 5. Die Amplifikate werden hinsichtlich ihrer Sequenz
untersucht.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
werden zusätzlich die folgenden Schritte ausgeführt:
- 1. Die Reagenzien und Produkte der Polymerasereaktion
werden in einem Waschschritt entfernt.
- 2. Weitere ausgewählte Abschnitte, welche von denen in
Schritt d) verschieden sind, der immobilisierten DNA
werden in einer Polymerasereaktion amplifiziert,
- 3. Die Amplifikate werden hinsichtlich ihrer Sequenz
untersucht.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des
Verfahrens werden die Schritte 6-8 mehrmals wiederholt.
Im ersten Verfahrensschritt wird die bevorzugt genomische
DNA aus Zellen oder anderen begleitenden Materialien
isoliert und im wesentlichen irreversibel an eine Oberfläche
gebunden.
Eine irreversible Bindung in Sinne der vorliegenden
Erfindung meint eine Bindung, die mit den üblicherweise zur
Verfügung stehenden Mitteln unter den in der Reaktion
vorhandenen Bedingungen nicht wieder vollständig gelöst
werden kann. Diese Bindung kann bevorzugt eine kovalente
Bindung, eine Ionenpaarbindung oder aber eine Bindung
sein, die auf elektrostatischen oder hydrophoben Effekten
beruht.
Die Isolierung der DNA erfolgt bevorzugt derart, dass
eine Körperflüssigkeit oder aber ein Lysat eines Gewebes
mit der Oberfläche kontaktiert wird, die wiederum
bevorzugt die DNA irreversibel bindet. Dazu ist im Falle des
C18 Materials ein spezieller Puffer erforderlich
(beispielsweise Triethylammoniumacetat). Der Überstand wird
entfernt und es wird entweder mit Puffer oder Wasser
(oder beidem) nachgewaschen, um die nachfolgende Bisulfit
Reaktion mit so reinem Ausgangsmaterial wird möglich
durchzuführen.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
ist die Bindung der DNA an die Oberfläche kovalent. In
einer weiteren besonders bevorzugten Verfahrensvariante
wird die DNA unmittelbar in dem Immobilisierungsschritt
auch isoliert. Die Isolierung der DNA erfolgt bevorzugt
aus Vollblut oder Serum.
In einer weiteren besonders bevorzugten
Verfahrensvariante erfolgt die Isolierung der DNA aus lysiertem Gewebe.
Die Lysis wird besonders bevorzugt mittels Proteinase K
durchgeführt.
In einer weiteren besonders bevorzugten
Verfahrensvariante wird die Immobilisierung in den Gefäßen einer
Mikrotiterplatte mit 96 Gefäßen oder 384 Gefäßen durchgeführt,
wobei in den Gefäßen unterschiedliche DNA-Proben
immobilisiert werden.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird
die Immobilisierung in PCR-Reaktionsgefäßen durchgeführt,
wobei in den Gefäßen unterschiedliche DNA-Proben
immobilisiert werden.
Besonders bevorzugt erfolgt die Immobilisierung der DNA
an einem Metalloxid, bevorzugt Aluminiumoxid. In einer
weiteren besonders bevorzugten Verfahrensvariante erfolgt
die Immobilisierung an einem hydrophoben Material und die
Bindung ist nur unter den gewählten Pufferbedingungen im
wesentlichen irreversibel.
Die zu analysierende DNA wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut,
Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in
Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von
Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust
oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen
Kombinationen hiervon.
Im zweiten Schritt des Verfahrens behandelt man die an
die Oberfläche gebundene DNA bevorzugt mit Bisulfit,
(= Disulfit, Hydrogensulfit) derart, dass alle nicht an der
5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert
werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten
unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position
methylierten Cytosine unverändert bleiben.
Wird ein Bisulfitreagenz verwendet, so ist im Falle der
C18 Oberfläche Trialkylammoniumbisulfit besonders
bevorzugt, um eine feste Anbindung der DNA an die Oberfläche
zu gewährleisten. Im Falle der Aluminiumoxidoberfläche
wird bevorzugt Natriumbisulfit verwendet.
Die DNA-Probe denaturiert man besonders bevorzugt vor der
Behandlung thermisch oder unter Verwendung eines
alkalischen Reagenzes wie beispielsweise verdünnter (bevorzugt
0.1 bis 0.3 molarer) Natronlauge.
Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an
den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren sind zudem bevorzugt
ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein
Radikalfänger zugegen.
Dabei kommen als denaturierende Reagenzien oder
Lösungsmittel bevorzugt die folgenden Verbindungen oder
Verbindungsklassen in Frage:
Polyethylenglykoldialkylether, Dioxan und substituierte
Derivate, Harnstoff oder Derivate, Acetonitril, primäre
Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole,
Diethylenglykoldialkylether, Triethylenglykoldialkylether,
Tetraethylenglykol-dialkylether,
Pentaethylenglykoldiakylether, Hexaethylenglykoldialkylether, DMSO oder THF.
Allerdings ist auch die Einbettung der DNA in Agarose nach
der Denaturierung möglich durch Zugabe derselben in
gelöster Form und anschliessendes Abkühlen, analog zu der
von Olek et al veröffentlichten Methode. Die Agarose kann
nach der Bisulfitbehandlung mit heissem Puffer oder
Wasser thermisch entfernt.
Die anschließende alkalische Hydrolyse (bevorzugt: Tris
Puffer pH 10 oder Ammoniak) führt dann zur Umwandlung von
nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil.
Bevorzugt wird anschliessend die Desulfonierung der DNA (10-30
min. 90-100°C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt.
Im dritten Schritt des Verfahrens werden die zuvor
verwendeten Reagenzien in einem Waschschritt entfernt. Dabei
ist es wiederum entscheidend, dass die immobilisierte,
nunmehr chemisch behandelt vorliegende DNA an die
Oberfläche gebunden bleibt. Dies ist einfach im Falle einer
beispielsweise kovalenten Bindung an die Oberfläche.
Dagegen ist wiederum ein entsprechender Puffer
erforderlich, wenn eine Bindung über beispielsweise
Triethylammoniumkationen an eine C18-Phase erfolgt. Dies erfordert
dann auch in den Waschschritten einen Puffer, der die
Bindung der DNA an die hydrophobe Phase fördert, wie
beispielsweise ein Triethylammoniumacetat-Puffer.
Bevorzugt werden mehrere Waschschritte ausgeführt, die
besonders bevorzugt aus einem automatisierten
Pipettierschritt bestehen, in welchem Wasser oder Puffer
zugegeben wird, und aus einem nachfolgenden Pipettierschritt,
in dem der jeweilige Puffer oder das Wasser wieder
entfernt wird. Dies kommt beispielsweise bei einer
Immobilisierung der DNA in einer Mikrotiterplatte und bei
Verwendung eines handelsüblichen Pipettierroboters (z. B. von
den Firmen Tecan oder Qiagen) zum tragen.
Im vierten Verfahrensschritt werden ausgewählte
Abschnitte der immobilisierten, behandelten DNA amplifiziert.
Man amplifiziert die DNA-Probe in einer
Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-
Polymerase. Die Amplifikation von mehreren DNA-
Abschnitten wird vorzugsweise in einem Reaktionsgefäß
gemacht.
Den Verfahrensschritt kann man auch vorzugsweise in zwei
Teilschritten durchführen. Man beginnt mit einer PCR
Präamplifikation mit mindestens einem Primerpaar
unterschiedlicher Sequenz, die die vorbehandelte DNA Probe
unspezifisch hybridisieren und daher im PCR Schritt mehr
als ein Amplifikat ergeben. Danach führt man eine PCR
Amplifikation des in der Präamplifikation gebildeten
Produkts mit Primern unterschiedlicher Sequenz durch, die
jeweils zu einem Abschnitt der vorbehandelten DNA-Probe
[(+)-Strang oder (-)-Strang] identisch oder revers
komplementär sind und die zu amplifizierende DNA spezifisch
hybridisieren.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird
ein Amplifikationsschritt mit mehreren Primerpaaren als
Multiplex-PCR ausgeführt. Besonders bevorzugt ist es
auch, dass alle oder ein großer Teil der Amplifikate
einer immobilisierten DNA Probe gepoolt werden und so
gemeinsam einer weiteren Analyse zugeführt werden.
Besonders bevorzugt wird die Reaktionsmischung nach der
Amplifikation aus dem Reaktionsgefäß, an welches die
immobilisierte DNA gebunden ist, entfernt. Damit steht die
immobilisierte DNA als Templat für weitere Amplifikationen,
bevorzugt wiederum mit zuvor nicht verwendeten Primern,
zur Verfügung.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird
daher die Amplifikation mehrmals mit unterschiedlichen
Primern wiederholt, so dass das Verfahren die folgenden
zusätzlichen Schritte aufweist:
- 1. die Reagenzien und Produkte der Polymerasereaktion
werden in einem Waschschritt entfernt.
- 2. weitere ausgewählte Abschnitte, welche von den zuvor
amplifizierten verschieden sind, der immobilisierten DNA
werden in einer Polymerasereaktion amplifiziert,
- 3. die Amplifikate werden hinsichtlich ihrer Sequenz
untersucht.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahren
werden diese Schritte mehrmals wiederholt, wobei in jeder
Amplifikation nach Schritt 2) andere Abschnitte
amplifiziert werden als in einer der vorangegangenen
Amplifikationen.
Im letzten Verfahrensschritt und auch wenn die obigen
zusätzlichen Schritte ausgeführt werden, werden die
Amplifikate jeweils hinsichtlich ihrer Sequenz untersucht.
Dadurch kann unmittelbar auf den Methylierungsstatus
ausgewählter Cytosinbasen in der DNA-Probe geschlossen werden.
Diese Sequenzanalyse und die nachfolgenden
Schlussfolgerungen hinsichtlich des Methylierungsstatus können
prinzipiell unter Verwendung vieler, dem Fachmann bekannter
Methoden erfolgen, welche auch im Stand der Technik
beschrieben sind.
Besonders bevorzugt erfolgt die Analyse durch
Hybridisierung der Amplifikate an einen Oligonukleotidarray oder
PNA (Peptide Nucleic Acids)-Array.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass die Analyse während der
Amplifikation durch eine Realtime PCR Methode erfolgt.
Besonders bevorzugt ist damit eine Erfindungsvariante, in
der von der DNA Extraktion, der Bisulfitbehandlung, der
Amplifikation und der Detektion bevorzugt durch Realtime-
PCR alle Schritte in einem Reaktionsgefäss ausgeführt
werden können. Besonders bevorzugt in diesem Zusammenhang
ist auch ein Verfahren, bei dem man die Analyse nach der
Amplifikation im gleichen Reaktionsgefäß durch die
Aufnahme einer Schmelzkurve durchführt und aus dem
Schmelzverhalten auf die Basenzusammensetzung des Fragmentes und
damit auf den Methylierungsstatus schließt.
Die Analyse kann auch durch Einbringen der Oberfläche in
ein Massenspektrometer erfolgen, welches die Molekülmasse
der Amplifikate, von Fragmenten der Amplifikate oder aber
von Sonden, die spezifisch an die Amplifikate
hybridisieren, bestimmt. Diese Information kann wiederum zur
Identifizierung von Sequenzen herangezogen werden, wenn die
Sequenz zum grossen Teil bereits bekannt ist. Es ist auch
möglich, die gelösten Amplifikate separat in ein
Massenspektrometer einzuführen und die Analyse nach dem
Fachmann bekannten Methoden durchzuführen.
Besonders bevorzugt ist auch ein Verfahren, bei dem die
Analyse durch allelspezifische Hybridisierung von
Oligonukleotiden oder PNAs (Peptide Nucleic Acids) an die zu
untersuchenden Positionen in den Amplifikaten erfolgt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des
Verfahrens wird die Analyse durch Hybridisierung von
Oligonukleotidprimern und einer nachfolgenden
Primerextensionsreaktion oder einer Sequenzierreaktion durchgeführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die
Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens zur Diagnose
und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse
mindestens einer der folgenden Kategorien angehören:
unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-
Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit;
Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische
und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen;
psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz
und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung
oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes;
Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems;
Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des
Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion,
Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des
Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische
Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen
oder sexuelle Fehlfunktion.
Ebenso bevorzugt ist die Verwendung eines Verfahrens zur
Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur
Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit,
bestehend aus einem Reagenz zur Behandlung der DNA,
mindestens zwei Primeroligonukleotiden zur Herstellung der
Amplifikate, einer Festphase zur Immobilisierung der
Proben-DNA, sowie optional weiteren Lösungen und einer
Anleitung zur Durchführung mindestens einer der oben
beschriebenen Verfahrensvarianten.
Beispiel
Bisulfit-Behandlung von Promega- und M13-DNA in
derivatisierten Reaktionsgefäßen
ANBINDUNG DER DNA
Für die Anbindung von DNA auf die mit Aluminiumoxid
beschichtete Oberfläche der Reaktionsgefäße wurde EcoR1
geschnittene genomische DNA (Promega) und M13 Plasmid-DNA
verwendet. Jeweils 160 ng wurden in die entsprechenden
Reaktionsgefäße pipettiert, mit Wasser auf ein
Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt, auf einem Shaker kurz gemischt
und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde die Lösung entfernt und die Gefäße
zweimal mit je 50 µl Wasser gewaschen. Um die Aktivität der
verbleibenden Bindungsstellen auf der Tubeoberfläche
herabzusetzen, wurden 10 µl einer 5%igen Bovin-Serum-Albumin
Lösung hinzu pipettiert, mit 40 µl Wasser aufgefüllt und
ebenfalls bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert.
Abschließend wurden die Gefäße einmal mit jeweils 50 µl
Wasser gewaschen.
BISULFIT-BEHANDLUNG
Die angebundene DNA wird bei 96°C ohne Zugabe von Wasser
für 20 Minuten in einem Eppendorf-Mastercycler
denaturiert. Die Gefäße werden alsdann schnellstmöglich
entfernt und mit 64 Dioxan versetzt, wodurch die
Denaturierung der DNA erhalten bleibt. Für die Bisulfitreaktion
wurden 10 µl einer 0.75 M Natriumbisulfit-Lösung, 24
Radikalfänger (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-
carbonsäure, 98,6 mg in /ml Dioxan) und 24 Wasser
zugegeben. Die Reaktionsgefäße wurden bei 50°C in einem
Eppendorf-Mastercycler für fünf Stunden inkubiert.
DESULFONIERUNG
Nach erfolgter Bisulfitreaktion wurden die Lösungen
herauspipettiert und die Gefäße mit 100 µl Wasser und,
vorbereitend auf die Desulfonierung, mit 100 µl einer 50 mM
Tris-HCl-Lösung gewaschen. Die Desulfonierung erfolgt mit
50 µl einer 50 mM Tris-HCl-Lösung bei pH9 für 20 Minuten
bei 96°C. Nach dreimaligem Waschen mit je 50 µl Wasser
sind die Reaktionsgefäße einsatzbereit für eine
Amplifikation mittels PCR.
PCR
Die PCR wurde in einem Maßstab von 25 µl angesetzt. Als
Primer dienten für die Promega DNA 5'-TAA GTA TGT TGA AGA
AAG ATT ATT GTA G-3' und 5'TAA AAA CTA TCC CAT AAT AAC
TCC CAA C-3', sowie 5'-ATT ACA AAA TCG CGC AAA-3' und 5'-
AAG TCG GAG GTT AAA AAG GT-3' (MWG) für die M13 Plasmid-
DNA. Die beiden jeweiligen Primer wurden in einer Lösung
mit einer Konzentration von 12.5 pmol/µl vorgelegt, 2 µl
dieser Primerpaarlösung in das entsprechende Tube
pipettiert. Für die PCR wurden 2.5 µl dNTP-Mix (Fermentas,
Konzentration je dNTP 2.5 µmol/µl), 0.3 µl Hot Star Taq
(Qiagen), 2.5 µl 10 × PCR Buffer Solution (Qiagen, 15 mMol MgCl2
im Puffer enthalten) und 17.7 µl Wasser (Fluka) pro Ansatz
in die Gefäße gegeben.
Die Kontrolle der PCR erfolgte mittels Gelelektrophorese.
Dazu wurden 5 µl Probe mit 34 Loading Dye auf ein 1.4%
Agarosegel (Eurogentec., Inc.)aufgetragen, als Laufpuffer
diente 1×TBE. Die Fragmente wurden mittels Ethidiumbromid
angefärbt, das Gel im UV abfotografiert.