CN104263818A - 基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，该方法包括以下步骤：(1)全血样本中直接提取RNA(2)从RNA逆转录产生单链cDNA，将寡核苷酸接头序列连接到单链cDNA的3'末端，采用通用引物和序列为GAC CTC GGG TGG GAA CAC的特殊靶向引物P-VDJ为PCR反应的特殊引物对、连接寡核苷酸接头序列后的单链cDNA为PCR模板进行PCR反应，对免疫受体基因组进行扩增(3)高通量测序。该方法所用RNA直接从全血液样本中提取更适用于临床，使用单一的靶特异性引物，去均一地扩增亚型T细胞受体基因的可变区域，通过Illumina公司的Hi-SEQ 2500加条形码方式测序，确保了相对较低的成本,少于48小时的测序时间和良好的测序深度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法。
背景技术
监测TCR在人类健康和疾病的重要性已被日益认识。最近的研究表明，T细胞受体库已被发现能影响广泛的疾病种类，包括恶性肿瘤，自身免疫性疾病和感染性疾病，而且，如果考虑免疫系统广泛影响几乎所有的人类健康和疾病，免疫系统的影响范围预计会更大。近期通常使用的方法，如多参数流式细胞仪，谱型或定制设计的实时PCR检测，尽管能提供一定的分辨率，但这些方法都是劳动密集型的，无法提供更深层次的解析，以确定患者的V(D)J重组模式。
随着大规模并行DNA测序技术的发展，表征人类受试者的免疫组库已成为一种可行的新一代手段去测定V(D)J重组。大部分的研究人员都集中在Illumina公司的Genome Analyzer测序仪或者HiSeq2000，能产生从50个碱基至100个碱基的读取长度，但是从短的读取序列推断出长的序列,因而不方便直接。并且现有的TCR测序研究几乎都是使用T-细胞的DNA或RNA作为第一原料，且都采用多重PCR反应，去扩增出V(D)J重组区再结合高通量测序。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，该方法直接从全血中提取RNA,使用单一的PCR引物对免疫受体基因组进行扩增后测序。
基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，该方法包括以下步骤：
(1)全血样本中直接提取RNA
(2)从RNA逆转录产生单链cDNA，将寡核苷酸接头序列连接到单链cDNA的3'末端，采用通用引物和序列为GAC CTC GGG TGGGAA CAC的特殊靶向引物P-VDJ为PCR反应的特殊引物对、连接寡核苷酸接头序列后的单链cDNA为PCR模板进行PCR反应，对免疫受体基因组进行扩增；
(3)高通量测序。
本发明提供的基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法的有益效果是：首先，RNA直接从全血液样本中提取更适用于临床；第二，使用单一的靶特异性引物,去均一地扩增亚型T细胞受体基因的可变区域。最后，通过Illumina公司的Hi-SEQ 2500加条形码方式测序，确保相对较低的成本,少于48小时的测序时间和良好的测序深度。
附图说明
图1是全血免疫组库探索方案流程图，PU代表一个通用引物目标连接子序列，P-VDJ代表TRB恒定区的靶向引物
图2是DNA的凝胶图像，显示PCR反应后在不同条件下健康个体血液中TRB基因的可变区(V区)
图3是恶性和良性患者扩增子的DNA凝胶图像
图4是脑膜瘤患者的高通量读取序列在T细胞受体V区亚型上的分布图
图5是含有PU和P-VDJ V区段使用情况的分层热图
图6是可用于蛋白编码V(D)J区域的V段使用图
图7是在脑膜瘤的血液样本检测到的FR3和CDR3部分序列标识，FR3的最后20个核苷酸和CDR3的前60个核苷酸的可视化的DNA序列的标识，方框突出碱基54至56的DNA序列
图8是在脑膜瘤的血液样本检测到的FR3和CDR3部分序列标识，在FR3的端部，一个高度保守的半胱氨酸C是在翻译序列的位置上排第六，方框突出保守的QXFGXGTRL蛋白质序列。
图9是010_M样本的Circos图
图10是221_M样本的Circos图
图11是347_B样本的Circos图
图12是392_B样本的Circos图
具体实施方式
本发明提供的基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，该方法包括以下步骤：
(1)全血样本中直接提取RNA；
(2)从RNA逆转录产生单链cDNA，将寡核苷酸接头序列连接到单链cDNA的3'末端，采用通用引物和序列为GAC CTC GGG TGGGAA CAC的特殊靶向引物P-VDJ为PCR反应的特殊引物对、连接寡核苷酸接头序列后的单链cDNA为PCR模板进行PCR反应，对免疫受体基因组进行扩增；
(3)高通量测序。
下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。
使用来自两个恶性肿瘤患者和两个良性患者先前收集的全血样本，该样本储存在-80℃下超过一年，评估本发明的方法的稳定性以及是否适用于在医学临床实践中捕获和表征TRB基因。
基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法步骤如下：
(1)从全血样本中直接提取RNA
从冰解冻的冷冻血液中取出400μL，用Trizol提取试剂对样品进行处理。对于每一个TRIzol提取的RNA样品，通过的RNeasy迷你柱进行纯化，用DNase I酶去除血液DNA片段，使用双蒸水将迷你柱上的RNA分子洗脱，并储存于-20℃。
(2)对免疫受体基因组进行PCR扩增，方案见图1。
用逆转录技术从RNA产生单链cDNA。使用M-MuLV逆转录酶试剂盒的推荐方案对RNA进行进一步的cDNA合成，并储存于-20℃。对于每个反向转录产物，加入AMPure XP磁珠到混合物产物中，然后用80％乙醇洗涤，以除去在反转录步骤中引入的引物。每个样品用30μL EB缓冲液洗脱。加入1μL 10μg/μL的RNA酶H和2μL5μg/μL的RNA酶A,在37℃消化RNA模板1小时，随后在95℃下进行5分钟的热失活。
接下来将一段合成的寡核苷酸接头序列连接到单链cDNA的3'末端，用T4 RNA连接酶试剂盒推荐的方案进行反应。在60μL的总体积中,合成的连接子引物与RNA连接酶和cDNA模板在20℃下过夜反应。作为阴性对照反应，不使用T4 RNA连接酶，加入双蒸水于溶液中。过夜反应后，将连接产物用AMPure XP珠磁性纯化，每个样品用20μL双蒸水洗脱。
最后，基于特殊引物对的PCR反应对免疫受体基因组进行了扩增。使用热启动PCR试剂盒与2μL连接后单链DNA作为PCR模板进行PCR反应。反应中首先加入序列为GCG GCC GCT TAT TAACCC的通用引物，95℃下变性2.5min，70℃下退火延伸5min，然后加入TRB恒定区的靶向引物P-VDJ，序列为GAC CTC GGG TGGGAA CAC，65℃退火70℃下延伸，进行40个循环。
(3)将纯化的PCR扩增产物加上Illumina公司TruSeq套件中的条形码，用于高通量测序。Illumina公司TruSeq样品制备试剂盒用于文库制备，将含条形码的文库用10个循环的PCR反应富集，并用AMPure XP珠清洗。采用Illumina的HiSeq-2500测序器进行测序，在48小时的机读时间后,过滤收集序列数据，并用IgBLAST进行和标准免疫组库序列的比对。
步骤(2)所述PCR扩增过程中采用的P-VDJ引物的具体设计,使得它比对TCR基因之外的任何其它区域不具有高的序列同源性，并且，它避免了任何已知的SNP。在实验中，用来自健康捐赠者的全血提取总RNA去扩增TRB可变区，扩增结果见图2。对于同时被反转录以及合成寡核苷酸接头序列连接的样品，PCR反应产生的DNA片段主要集中500bp左右的大小，与预期TRB可变区的大小大致符合。对于没有逆转录的对照样品，这一片段是不可见的。此外，虽被逆转录但无寡核苷酸接头序列连接的对照样品也没有产生这种特定大小的DNA片段。因此，本发明使用的是不经过T细胞的分离就能够从全血中直接捕获被转录的TRB基因的方法。相比于无接头连接的对照反应，所有的四个被无寡核苷酸接头序列连接的反转录样品显示了预期的主要条带，这表明了该方法的稳定性，见图3，图中010_M、221_M为恶性样品，347_B、392_B为良性样品。
对高通量测序数据结果的分析显示，64％～91％含有PU或P-VDJ尾端标记的T细胞受体基因读取序列属于TRB亚型，见图4，T细胞受体的其他亚型，如TRA，TRD，TRG，仅读取T细胞受体序列的一小部分，证明了本发明的方法能有效获取特定亚型的免疫组库。
选取采用PU或P-VDJ引物标签进行两端标记的读取数据，比较恶性和良性脑膜瘤患者对于TRB的V型段的使用，2恶性样品组合在一起的PU和P-VDJ标签的V区段分布热图，见图5。虽然大多数的V段没有在恶性和良性样本之间呈现一致变化，一个V型段TRBV29-1显示的百分比在恶性组显著增加，揭示了恶性肿瘤患者的全血在这个特殊的V区段上有扩张。与此一致的，当再整理出可用于蛋白编码的V(D)J读取片段，发现恶性肿瘤中的TRBV29-1水平增加5倍到7倍，见图6。除了TRBV29-1，另一V区段TRBV15也显示增加的恶性表型，TRBV29-1克隆扩增的检测可能反映到脑膜瘤恶变人体的免疫反应。
从对高通量测序数据的分析，推导出FR3-CDR3的交界部分的独特DNA序列标识，包含FR3最后20个核苷酸和CDR3前60个核苷酸在内，进行评价以找出恶性和良性的患者的不同。如图7所示，在碱基位置54和56的初步观察表明，恶性样品中最常见的碱基是C和G，但是，在良性样品中它们切换为碱基T。位置54到56的碱基在TRB编码序列中编码为一个氨基酸，恶性样品中，所编码的氨基酸为谷氨酰胺Q，而在良性组，它改变为酪氨酸Y。因此，进一步比较所产生的FR3-CDR3的蛋白质序列的标识，见图8。一个保守的半胱氨酸C在FR3区的端部，在恶性和良性样本组,它分别与CDR3区的一个QXFGXGTRL基序相隔11和10个氨基酸。已有研究表明，一个汇集正常人白细胞RNA样品中确定出两个主要的CDR3亚群是42和45个碱基长度。在本研究中，脑膜瘤血液样本的蛋白质序列标志显示在良性组主要的42碱基的子集，并在恶性组是45碱基的子集，可能是不同患者的免疫应答下产生的FR3-CDR3免疫特征。
为研究V(D)J重组中VJ所有的配对方式，在Circos图中展示了不同的V型和J分部之间的归一化配对频率，各样本Circos图见图9、图10、图11及图12。对比良性样本中只有少数几个主要的VJ配对事件，恶性样本呈扩张开来的VJ配对活动。此外，TRBV5-6与TRBJ1-1的配对是所有样品中检测到的主要配对事件之一。三个配对的事件，包括TRBV7-3与TRBJ2.2，TRBV30与TRBJ2-6，TRBV16与TRBJ1-3，更常在恶性样品中发生，可能代表这两个恶性样品中特异性TCR表达T细胞的克隆扩增。在151bp序列的长度长度下，能有效地对VJ区段配对予以划分。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，该方法包括以下步骤：
(1)全血样本中直接提取RNA；
(2)从RNA逆转录产生单链cDNA，将寡核苷酸接头序列连接到单链cDNA的3'末端，采用通用引物和序列为GAC CTC GGG TGGGAA CAC的特殊靶向引物P-VDJ为PCR反应的特殊引物对、连接寡核苷酸接头序列后的单链cDNA为PCR模板进行PCR反应，对免疫受体基因组进行扩增；
(3)高通量测序。
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，其特征在于：步骤(1)所述全血样本为新鲜血液样本或冰冻的全血样本。
3.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，其特征在于：步骤(2)所述逆转录方法为：采用M-MuLV逆转录酶试剂盒对RNA进行逆转录，去除反转录引入的引物，消化RNA模板得单链cDNA。
4.根据权利要求3所述的逆转录方法，其特征在于：所述去除反转录引入的引物的方法为加入AMPure XP磁珠，以80％乙醇洗涤。
5.根据权利要求3所述的逆转录方法，其特征在于：所述消化RNA模板采用RNA酶H和RNA酶A在37℃下消化RNA模板1小时。
6.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，其特征在于：步骤(2)所述寡核苷酸接头序列连接到单链cDNA的3'末端采用T4 RNA连接酶试剂盒进行。
7.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，其特征在于：步骤(2)所述通用引物序列为GCG GCC GCTTAT TAA CCC。
8.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR反应条件为：93℃-97℃下变性2min-3min，68℃-72℃下退火延伸4min-6min，加入特殊靶向引物P-VDJ后63℃-67℃下退火，68℃-72℃下延伸，30-40个循环。
9.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的全血免疫组库探测方法，其特征在于：步骤(2)所述高通量测序采用IIIumina的HiSeq-2500测序器。
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