CN109852689A - 一组脉管畸形相关的生物标志物及相关检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一组生物标志物及相关检测试剂盒。本发明提供用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质、用于检测MMP9基因或其活性片段中Q279R/R574P突变的物质、用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质、和用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断脉管性疾病和/或评估脉管性疾病风险。而本发明所提供的生物标志物可以避免全基因组测序，大大节约了需要的测序数据量，具有优良的检测敏感性和特异性，且成本低、深度高、对相关突变的检测更加准确。

Description

一组脉管畸形相关的生物标志物及相关检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一组脉管畸形相关的生物标志物及相关检测试剂盒。

背景技术

静脉畸形(Venous Malformation，VM)是一种常见的先天性血管发育异常，人群发病率约1％，其中近40％位于头面部。该疾病自患者出生起即发病，无法自行消退，会随年龄增长而逐渐进展加重，轻则影响美观，重则引起出血、感染、肿胀、疼痛、窒息等，甚至导致严重的功能性损害或死亡。其中，部分患者可呈家族遗传性，而家族遗传性静脉畸形的病变形式更为多样、位置多变、范围更广，给患者的家庭和社会生活造成极大的困扰和负担。

在多型先天发育性脉管畸形中，静脉畸形属于最常见的低流速型脉管畸形，临床表征及部位存在多样性，既可单发也可多发，好发于头面部的颊、唇、颈、舌、腭等部位，深在可无明显皮肤及黏膜颜色改变，而浅表病损可呈蓝色或紫色，当哭闹或头低于心脏平面时，局部病损区会明显肿胀充血，体位恢复后则恢复原状，即体位实验阳性。在组织病理学方面，静脉畸形的多存在管壁发育异常，见大量大小不一的血窦样改变，血窦局部主要表现为平滑肌-弹力膜层菲薄且分布不均，血管管腔因此呈现持续的非生理性扩张。多数静脉畸形患者会处于一个自发性血栓形成和血栓溶解的循环中，部分血栓会继续发展钙化，演变为静脉石。

目前，针对静脉畸形的治疗主要是以硬化剂的局部注射治疗为主，多数患者可通过该治疗方案得以缓解，但该疗法难以彻底改变异常的管腔形态及组织内部的遗传缺陷，因此，该治疗方法存在复发率高、病损范围缩小不理想、病变难以根治的困扰，硬化效果不佳或弥漫性静脉畸形患者更因终生治疗而承受了巨大的经济及精神压力。由于该疾病的发生、发展机制尚不明确，对于相关机制的深入探索具有十分重要的临床及科研意义。

随着人类基因组计划的完成，作为先天发育性疾病，针对以静脉畸形为代表的多种脉管畸形，致病基因的研究和探寻也在不断开展，定位克隆、定位候选克隆、基因表达谱研究、候选基因分析、家系分析等研究也在逐步开展，这些对于发现复杂疾病关联基因发挥了重要的作用。新近发展的以第三代DNA多态位点——单核苷酸多态位点(Singlenucleotide polymorphism，SNP)为标记的基于全基因组的关联研究策略，利用多态位点SNP在基因组中分布广、密度高、易于分型的特点，对于鉴定复杂疾病的关联基因及相关突变具有巨大的潜力，通过连锁或关联分析定位相关突变后，在早期预测、早期预防、早期诊断、早期治疗方面具有很高的应用价值，而高通量测序也大大加快了相关突变的鉴定。但是，由于人类基因组的大小约为3Gb，全基因组测序更是高达90Gb，巨大的数据量必然导致了高昂的测序成本，进而导致相关测序工作的推广应用受到了极大限制，同时，受限于测序的成本和数据量，全基因组测序也难以达到很深的测序深度。因此，基于相关既有的遗传研究成果，设计靶向针对特定基因进行高深度的准确测序产品具有重要的远期应用前景。

通过突变筛查及基因单倍型鉴定，根据国内外相关学者的多个研究结果表明，近60％的患者患有TIE2基因突变，而20％的患者则患有PIK3CA基因突变，两类突变会引发血管内皮细胞中相关信号通路的异常活化，尤其是相关内皮细胞受体下游的mTOR通路，继而引发内皮细胞的不受控增殖及异常的外周细胞及平滑肌细胞附着，其中，家族遗传性静脉畸形患者更是普遍存在特定的TIE2编码蛋白突变，其中最常见便是胞内区第849位精氨酸突变成色氨酸(R849W)，该突变呈常染色体单倍体显性遗传。此外，除上述基因外，部分球形细胞静脉畸形的患者携带有GVM基因突变。认识和定义先天性脉管畸形一直是学术界具有挑战性的任务，基于各国专家对于该疾病的交流与共识，血管发育异常研究国际学会(International Society for the Study of Vascular Anomalies，ISSVA)一直致力于进一步提高对先天性血管畸形的病因、诊断和治疗的认识。

但是，多数突变研究结果均为针对国外人群的研究，且仅涉及单个或少数几个基因的突变检测，检测部位涉及范围较广，更加无法代表局部病变体细胞突变的情况。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一组生物标志物及相关检测试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

本发明第一方面提供用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质、用于检测MMP9基因或其活性片段中Q279R/R574P突变的物质、用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质、和用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断脉管性疾病和/或评估脉管性疾病风险。

在本发明一些实施方式中，所述Y1213Y突变为其中G>A的突变，所述X278X突变为其中TA>T的突变。

在本发明一些实施方式中，所述脉管性疾病选自脉管畸形，优选为静脉畸形。

在本发明一些实施方式中，所述脉管性疾病为头部脉管性疾病和/或颈部脉管性疾病。

在本发明一些实施方式中，所述物质具体为用于检测外周或瘤内血液、新鲜组织、石蜡切片、粗针穿刺样本中基因或其活性片段中突变的物质。

在本发明一些实施方式中，所述用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质包括用于检测TEK基因或其活性片段中346位点的特异性探针；

所述用于检测MMP9基因中Q279R/R574P突变的物质包括用于检测MMP9基因或其活性片段中279位点和574位点的特异性探针；

所述用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质包括用于检测FLT1基因或其活性片段中1213位点的特异性探针；

所述用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质包括用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中278位点的特异性探针；

所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸。

本发明另一方面提供一种检测试剂盒，包括：用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质、用于检测MMP9基因或其活性片段中Q279R/R574P突变的物质、用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质、和用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质的组合。

在本发明一些实施方式中，所述检测试剂盒包括：用于检测TEK基因或其活性片段中346位点的特异性探针、用于检测MMP9基因或其活性片段中279位点和574位点的特异性探针、用于检测FLT1基因或其活性片段中1213位点的特异性探针、用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中278位点的特异性探针的组合，所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸。

本发明另一方面提供一组生物标志物，包括TEK基因、MMP9基因、FLT1基因、和TNFAIP6基因的组合。

在本发明一些实施方式中，包括TEK基因中Q346P突变、MMP9基因中Q279R/R574P突变、FLT1基因中Y1213Y突变、和TNFAIP6基因中X278X突变的组合。

本发明另一方面提供所述的生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断脉管性疾病和/或评估脉管性疾病风险。

具体实施方式

本发明发明人通过大量探索性研究，提供了一组用于诊断脉管性疾病的生物标志物，包括TEK基因、MMP9基因、FLT1基因、和TNFAIP6基因的组合。所述生物标志物具有优良的检测敏感性和特异性，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质、用于检测MMP9基因或其活性片段中Q279R/R574P突变的物质、用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质、和用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断脉管性疾病和/或评估脉管性疾病风险。所述Y1213Y突变、X278X突变是两个同义突变，同义突变是DNA 片段中某个碱基对的突变并不改变所编码的氨基酸的突变形式，在本发明一优选实施方式中，所述Y1213Y突变具体为Y1213Y突变(G>A)，所述X278X突变具体为X278X突变(TA>T)。本发明发明人发现，TEK基因中Q346P突变、MMP9基因段中Q279R/R574P突变、FLT1基因中Y1213Y突变、TNFAIP6基因中X278X突变与脉管性疾病的发生存在密切关系，发生脉管性疾病的患者，极大概率上会同时存在上述突变。所述脉管性疾病通常为脉管畸形，更具体可以为静脉畸形，所述脉管性疾病的部位通常为头部脉管性疾病和/或颈部脉管性疾病。

本发明所提供的用途中，所述活性片段通常指通过该物质的检测可以发现其对应的基因中相关突变是否存在的物质，具体可以是例如，DNA或其mRNA或保有其功能的同源物等，活性片段的选择方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。

本发明所提供的用途中，所述诊断脉管性疾病具体可以是用于确认个体是否患有脉管性疾病或者更加有可能患有脉管性疾病。例如，当个体的基因组中同时存在TEK基因中Q346P突变、MMP9基因段中Q279R/R574P突变、FLT1基因中Y1213Y突变、TNFAIP6基因中X278X突变时，则认为个体患有脉管性疾病或者更加有可能患有脉管性疾病。再例如，当个体的基因组中TEK基因中Q346P突变、MMP9基因段中Q279R/R574P突变、FLT1基因中Y1213Y突变、TNFAIP6基因中X278X突变至少一个未出现时，则认为个体未患有脉管性疾病或者更加有可能未患有脉管性疾病。由于脉管性疾病的早期诊断通常有较大难度，所以引入上述筛选以后可以更加准确地对个体进行脉管性疾病的诊断。

本发明所提供的用途中，所述用于评估脉管性疾病风险具体可以是评估个体是否易发脉管性疾病，更具体可以是用于确认个体是否更加有可能在患上脉管性疾病。例如，当个体的基因组中同时存在TEK基因中Q346P突变、MMP9基因段中Q279R/R574P突变、FLT1基因中Y1213Y突变、TNFAIP6基因中X278X突变时，则认为个体更有可能在今后患上脉管性疾病。再例如，当个体的基因组中TEK基因中Q346P突变、MMP9基因段中Q279R/R574P突变、FLT1基因中Y1213Y突变、TNFAIP6基因中X278X突变至少一个未出现时，则认为个体在今后患上脉管性疾病的可能性更低。通过早期筛选，可以发现哪些个体更有可能患上脉管性疾病，从而采取合适的预防措施。

本发明所提供的用途中，所述物质具体为用于检测外周或瘤内血液、新鲜组织、石蜡切片、粗针穿刺样本等样品中基因或其活性片段中突变的物质。本领域技术人员可采用合适的方法，检测上述样品中所存在的基因突变，例如，具体可采用的方法可以是Sanger测序、全基因组测序、全外显子测序、靶向测序等方法。用于检测基因或其活性片段中突变的物质通常与检测方法是相对应的，例如，所述用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质包括用于检测TEK基因或其活性片段中346位点的特异性探针，再例如，所述用于检测MMP9基因中Q279R/R574P突变的物质包括用于检测MMP9基因或其活性片段中279位点和574位点的特异性探针，再例如，所述用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质包括用于检测FLT1基因或其活性片段中1213位点的特异性探针，再例如，所述用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质包括用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中278位点的特异性探针；再例如，所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸，从而可以与靶标序列杂交，实现对靶标上是否存在特定突变的检测。用于检测基因或其活性片段中突变的物质还可以包括其他各种相关的检测试剂。

在本发明一优选实施例中，所述用于检测TEK基因或其活性片段中346位点(HG19，27183463)的特异性探针的序列包括如下所示的多核苷酸序列位点为：HG19，27183456>27183608。

在本发明另一优选实施例中，所述用于检测MMP9基因或其活性片段中279位点(HG19，44640225)和574位点(HG19，44642406)的特异性探针的序列包括如下所示的多核苷酸序列位点为：HG19，44640212>44640386，44642295>44642435。

在本发明另一优选实施例中，所述用于检测FLT1基因或其活性片段中1213位点(HG19，28883061)的特异性探针的序列包括如下所示的多核苷酸序列位点为：HG19，28882979>28883064。

在本发明另一优选实施例中，所述用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中278位点(HG19，152236046)的特异性探针的序列包括如下所示的多核苷酸序列位点为：HG19，152235877>152236047。

本发明第二方面提供一种检测试剂盒，包括：用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质、用于检测MMP9基因或其活性片段中Q279R/R574P突变的物质、用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质、和用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质的组合。

本发明所提供的检测试剂盒中，用于检测基因或其活性片段中突变的物质与试剂盒的种类通常是相对应的，例如，所述用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质包括用于检测TEK基因或其活性片段中346位点的特异性探针，再例如，所述用于检测MMP9基因中Q279R/R574P突变的物质包括用于检测MMP9基因或其活性片段中279位点和574位点的特异性探针，再例如，所述用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质包括用于检测FLT1基因或其活性片段中1213位点的特异性探针，再例如，所述用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质包括用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中278位点的特异性探针；再例如，所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸。用于检测基因或其活性片段中突变的物质还可以包括其他相关的检测试剂。

本发明第三方面提供一组生物标志物，包括TEK基因、MMP9基因、FLT1基因、和TNFAIP6基因的组合，更具体可以包括TEK基因中Q346P突变、MMP9基因中Q279R/R574P突变、FLT1基因中Y1213Y突变、和TNFAIP6基因中X278X突变的组合。通过对所述生物标志物的筛查，可以低成本、高深度、更加准确地诊断脉管性疾病和/或评估个体是否易发脉管性疾病。

本发明第四方面提供本发明第三方面所述的生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断脉管性疾病和/或评估脉管性疾病风险。所述脉管性疾病通常为脉管畸形，更具体可以为静脉畸形，所述脉管性疾病的部位通常为头部脉管性疾病和/或颈部脉管性疾病。

本发明所提供的生物标志物，是通过针对大量与静脉畸形相关基因的液相捕获探针，应用目标基因高通量平行靶向测序方法测定受试者的序列后筛选获得的，这些与静脉畸形相关基因包括：TEK(Gene ID：7010)、ENG(Gene ID：2022)、FLT1(Gene ID：2321)、ACVRL1(Gene ID：94)、KDR(Gene ID：3791)、RASA1(Gene ID：5921)、MMP9(Gene ID：4318)、PIK3CA(Gene ID：5290)、GLMN(Gene ID：11146)、TNFAIP6(Gene ID：7130)等。液相捕获探针的设计和制备方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，在本发明一具体实施例中，制备基因RNA液相探针的方法包括：(1)根据各基因编码序列的正链设计探针序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，酌情在目标区域的两端适当延伸，设计长度为55-120nt的，整体的平均长度为100nt左右，通过3X叠瓦式设计，使每个碱基都有三根序列不同的探针可以覆盖，保证碱基的捕获效率，对于GC含量极高或极低、重复性高的区域增加探针层数及浓度、掺入核苷酸类似物、优化杂交体系；(2)采用高通量电化学合成技术合成上述探针序列的单链DNA(oligo)模板，形成寡核苷酸混合物；(3)通过PCR的方法，以步骤(2)中的oligo模板为基础，使用生物素标记的寡核苷酸及核苷酸类似物作为原料，合成出的探针带有生物素标记，从而在后续实验中与链霉亲和素磁珠结合。利用液相探针试剂盒筛查受试者基因突变的方法方法对于本领域技术人员来说也应该是已知的，在本发明一具体实施例中，利用液相探针试剂盒筛查受试者基因突变的方法包括：(1)提取所述受试者的基因组DNA，经Bioruptor Pico超声随机打断至150-200bp；(2)将上述打碎的基因组DNA进行末端修复、3’端加“A”，连接接头及纯化；(3)通过PCR扩增的方法进行样本标记和富集DNA；(4)带有特异index的文库与本发明第二方面、第三方面中生物素标记的RNA探针文库进行液相杂交，利用生物素-亲和素间的结合具有迅速、专一、稳定的特性，使用链霉亲和素标记的磁珠获取目标基因外显子；(5)洗脱未结合探针与非特异性结合不稳定文库；(6)PCR扩增文库，进一步富集DNA，完成目标区域文库的捕获；(7)将扩增后的文库使用Illumina X10平台进行PE150测序；(8)将测序原始数据与人类参考基因组(HG19，2009)比对，评估文库及测序质量，采用samtools、GATK、Varscan软件检测SNP及InDel，使用Cnkit、ADTEx软件检测CNV，使用Lumpy软件检测SV。

本发明发明人通过大量实验研究，设计并构建针对待筛选基因所有外显子及侧翼序列的文库，通过对目标基因进行捕获，利用高通量的深度测序技术结合生物信息学分析，通过一种针对静脉畸形的高通量平行靶向测序基因筛选方法，提供了一组包括TEK基因、MMP9基因、FLT1基因、和TNFAIP6基因的生物标志物。

而本发明所提供的生物标志物可以避免全基因组测序，大大节约了需要的测序数据量，并可以以东亚人群(East Asia)为目标群体，通过一次性检测静脉畸形相关的主要致病基因的突变，具有优良的检测敏感性和特异性，且成本低、深度高、对相关突变的检测更加准确。基于所述生物标志物，可以进一步开发相应的检测试剂盒，用于静脉畸形的临床分子诊断，并为遗传性皮肤黏膜静脉畸形的早期发现、早期预防、早期诊断、早期治疗提供理论依据，还可通过生物信息学等技术手段进一步探究静脉畸形突变基因的功能及内在机制，为未来相关的靶向治疗提供理论依据，进而开展试验性治疗研究。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

1.静脉畸形相关致病基因的试剂盒制备

所述试剂盒包括如下方法制备的静脉畸形相关致病基因DNA探针文库：

(1)根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取以下静脉畸形相关致病基因的编码序列：TEK、ENG、FLT1、ACVRL1、KDR、RASA1、MMP9、PIK3CA、GLMN、TNFAIP6；

(2)针对各基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，酌情在目标区域的两端适当延伸，设计长度为55-120nt的，整体的平均长度为100nt左右，通过3X叠瓦式设计，使每个碱基都有三根序列不同的探针可以覆盖，保证碱基的捕获效率，对于GC含量极高或极低、重复性高的区域增加探针层数及浓度、掺入核苷酸类似物、优化杂交体系，根据人类参考基因组HG19，探针设计如下：

表1

(2)采用高通量电化学合成技术合成上述探针序列的单链DNA(oligo)模板，形成寡核苷酸混合物；

(3)以步骤(2)中的oligo模板为基础，使用生物素标记的寡核苷酸及核苷酸类似物作为原料，合成出的探针带有生物素标记，从而在后续实验中与链霉亲和素磁珠结合；

2.静脉畸形相关致病基因的试剂盒筛查突变

(1)提取所述受试者的基因组DNA 1μg，经Bioruptor Pico超声随机打断至150-200bp；

(2)将上述打碎的基因组DNA进行末端修复、3’端加“A”，反应体系如下：

表2

试剂名称	体积
		DNA fragment	35μl
10X ERA Buffer	5μl
		5X ERA-Tailing Enzyme Mix	10μl
Total volume	50μl

反应条件如下，热盖设置为85℃：

表3

(3)连接接头，反应体系如下：

表4

试剂名称	体积
		步骤(2)液体	50μl
Adapter for Illumin	5μl
		Nuclease-free water	15μl
5X Ligation Buffer	20μl
		Ligase	10μl
Total volume	100μl

反应条件如下，无热盖：

表5

温度	时间	循环数
			20℃	15min	1
4℃	维持	1

(4)连接后纯化，纯化使用磁珠为Agencourt AMPure XP，磁珠纯化体系如下：

表6

试剂名称	体积
		步骤(3)液体	100μl
Agencourt AMPure XP beads	80μl
		Total volume	180μl

(5)Pre-PCR反应，反应体系如下：

表7

试剂名称	体积
		步骤(4)液体	20μl
PCR Master Mix	25μl
		TPE1.0(10μM)	2.5μl
TPE2.0Index-8(10μM)	2.5μl
		Total volume	50μl

反应条件如下，热盖设置为105℃：

表8

(6)再次使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化后，进行片段长度测定，文库长度约为270-320bp；

(7)准备DNA文库，配制Block体系如下(记为管B)，而Hyb Buffer记为管A，5μlRNase Block与2μl Probe置于PCR管记为管C：

表9

试剂名称	体积
		步骤(6)液体	750ng
Hyb Human Block	5μl
		Hyb Block-A0	1μl
Hyb Index Block-8	5μl

(8)利用真空浓缩离心机，将步骤(7)的管B液体浓缩后补足至10μl，将A管13μl与C管7μl混合在一起，标记为AC管，B管置于以下反应体系中孵育，热盖105℃：

表10

温度	时间	循环数
			95℃	5min	1
65℃	维持	1

待PCR仪降温至维持温度后，将AC管一同置入孵育，2min后将AC管中液体全部加入至B管中，混匀并继续孵育过夜；

(9)捕获所用磁珠采用的是Cap beads，反复多次，将重悬的捕获磁珠同探针室温孵育30min，反复多次离心混悬，去除上清液后，再加入30μl Nuclease-free water；

(10)利用Post-PCR反应进一步富集DNA，体系如下：

表11

反应条件如下，热盖105℃：

表12

(11)利用Agencourt AMPure XP磁珠再次富集DNA，取1μl文库使用Qubit dsDNAHS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1-10ng/μl，取1μl样品使用Agilent2100Bioanalyzer system(Agilent DNA 1000Kit)进行片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp间，最后使用Illumina X10平台进行PE150测序；

(12)初步过滤初始数据，得到Clean reads，过滤内容如下：

以4bp划窗的方式，剪切掉平均碱基质量值小于20的序列，去除N碱基数＞5的测序序列，去除不合格碱基比例大于40％的测序序列，去除剪切过后剩余长度不足30bp的测序序列，自动检测接头序列并剪切，针对pair end序列对overlap区域进行碱基矫正；

过滤情况统计：

表13

(13)利用BWA MEM软件，将测序原始数据与人类参考基因组(HG19，2009)比对得到Bam文件。

3.液相测序芯片对目标区域靶向捕获效果的评估：

(1)利用BWA MEM软件统计文库平均长度、比对率、覆盖率、捕获率、测序深度、均一性等指标，评价样本文库质量，统计的指标和结果如下：

表14

(2)使用GATK、Varscan软件检测SNP及InDel；

(3)使用Cnkit、ADTEx软件检测CNV，使用Lumpy软件检测SV；

(4)利用Annovar软件对检出的各种类型变异进行注释。

4.选取临床14例样本，样本选择情况如下：

表15

5.前述步骤1-4所使用样本为3号样本，进一步对其他13例样本进行分析，试剂盒制备及引物序列同步骤1，具体分析步骤及基本参数分析同步骤2及步骤3，利用试剂盒分析14例样本的目标基因突变情况如下具体如下：

表16

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质、用于检测MMP9基因或其活性片段中Q279R/R574P突变的物质、用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质、和用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断脉管性疾病和/或评估脉管性疾病风险。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Y1213Y突变为其中G>A的突变，所述X278X突变为其中TA>T的突变。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脉管性疾病选自脉管畸形，优选为静脉畸形；和/或，所述脉管性疾病为头部脉管性疾病和/或颈部脉管性疾病。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述物质具体为用于检测外周或瘤内血液、新鲜组织、石蜡切片、粗针穿刺样本中基因或其活性片段中突变的物质。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质包括用于检测TEK基因或其活性片段中346位点的特异性探针；

所述用于检测MMP9基因中Q279R/R574P突变的物质包括用于检测MMP9基因或其活性片段中279位点和574位点的特异性探针；

所述用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质包括用于检测FLT1基因或其活性片段中1213位点的特异性探针；

所述用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质包括用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中278位点的特异性探针；

所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸。

6.一种检测试剂盒，包括：用于检测TEK基因或其活性片段中Q346P突变的物质、用于检测MMP9基因或其活性片段中Q279R/R574P突变的物质、用于检测FLT1基因或其活性片段中Y1213Y突变的物质、和用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中X278X突变的物质的组合。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：用于检测TEK基因或其活性片段中346位点的特异性探针、用于检测MMP9基因或其活性片段中279位点和574位点的特异性探针、用于检测FLT1基因或其活性片段中1213位点的特异性探针、用于检测TNFAIP6基因或其活性片段中278位点的特异性探针的组合，所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸。

8.一组生物标志物，包括TEK基因、MMP9基因、FLT1基因、和TNFAIP6基因的组合。

9.如权利要求8所述的生物标志物，其特征在于，包括TEK基因中Q346P突变、MMP9基因中Q279R/R574P突变、FLT1基因中Y1213Y突变、和TNFAIP6基因中X278X突变的组合。

10.如权利要求8～9任一权利要求所述的生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断脉管性疾病和/或评估脉管性疾病风险。