CN108280324A

CN108280324A - 塞来昔布抑制血管新生靶点的筛选方法

Info

Publication number: CN108280324A
Application number: CN201810172132.0A
Authority: CN
Inventors: 谌谐婉; 孙建国; 牛凯; 廖荣霞
Original assignee: Army Medical University
Current assignee: Army Medical University
Priority date: 2018-03-01
Filing date: 2018-03-01
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明属于治疗肿瘤疾病领域，具体涉及塞来昔布抑制血管新生靶点的筛选方法。本发明通过选取血管形成聚合酶链式反应芯片上的84个基因表达的蛋白作为潜在受体蛋白数据库，使用PDB数据库和UniProt数据库筛选54个受体蛋白结构，使用MGLTools处理受体蛋白结构，构建分子对接盒子后使用Autodock_vina作为分子对接工具计算塞来昔布与每个蛋白质受体的结合位点自由能，选取结合位点自由能小于‑9.0kcal/mol的蛋白质受体作为潜在靶点。

Description

塞来昔布抑制血管新生靶点的筛选方法

技术领域

本发明属于治疗肿瘤疾病领域，具体涉及塞来昔布抑制血管新生靶点的筛选方法。

背景技术

塞来昔布已被报道具有促进细胞凋亡、抑制血管新生等作用，从而抑制肿瘤生长。其抑制血管新生作用通常认为与抑制环氧化酶-2(COX-2)活性有关。但我们的前期研究发现，不同浓度塞来昔布并不能阻断放疗后COX-2活性的升高，因此，塞来昔布抑制血管新生可能通过COX-2非依赖途径即脱靶效应(Off-target)来实现。近年研究支持了我们的发现，即塞来昔布抗肿瘤效应存在COX-2非依赖途径。通常认为塞来昔布通过抑制COX-2活性抑制前列腺素PGE2的合成，从而阻断肿瘤生长；然而，加入PGE2后却并不能逆转塞来昔布的抑癌效应，而塞来昔布衍生物Rofecoxib，抑制COX-2的能力更强，但抑制肿瘤的能力却较弱。同时，给塞来昔布增加一个甲基的2,5-dimethyl-celecoxib(DMC)，失去了抑制COX-2的能力，却几乎能完全模拟塞来昔布的抑癌功能。此外，肺癌Celecoxib同步放疗的随机对照研究，因未能完成预计入组量而致阴性结果，其重要原因在于缺乏COX-2非依赖性生物标记物和选择性纳入受试者。

因此，塞来昔布对血管新生的抑制作用可通过COX-2依赖与COX-2非依赖(即off-target效应)两种途径实现。根据药物重定位思路，运用生物信息学方法，进行广泛的基因组筛查将获得最可信、最大亲和力的药物靶点。这对筛选具有这些靶点的病人从而实现更有效的个性化治疗具有重要临床价值。

在已知受体分子结构的情况下，根据几何互补、能量互补、化学环境互补的原则将配体放置在受体的合适部位，并搜索其合理构象，使之形成最佳匹配的配体-受体复合物，这一过程即称为分子对接。随着X-射线晶体衍射和多维核磁共振(NMR)技术的发展，越来越多的蛋白质3D结构被测定出来，小分子数据库也在不断更新，同时计算机运算能力也大幅提高，越来越多的生物医学研究开始采用分子对接方法。由于预测小分子配体和蛋白受体可避免繁琐的化学实验，分子对接已成为药物设计和药物重定位的重要手段。

分子对接最初源于Fisher于1894年提出的“锁钥模型”，锁(lock)和钥匙(key)互相识别的首要条件是空间形状互相匹配。但lock和key是刚性匹配，而受体和配体是柔性匹配。受体和配体在对接过程中为了互相适应对方，结构需要不断变化以实现最优匹配。分子对接的原则为：几何形状互补、静电相互作用互补、氢键相互作用互补、疏水相互作用匹配。满足这些原则后，受体与配体能否结合以及结合强度就取决于形成复合物过程的结合自由能变化。分子对接主要解决两个问题：一是搜索最佳结合位置，二是评价对接分子间的结合强度。寻找低能构象运用搜索算法，评价结合强度使用打分函数解决。

通过这些方法获得的塞来昔布抑制血管新生作用靶点，将为探明塞来昔布“老药新靶”的分子作用机制奠定基础，对于防治肿瘤复发转移具有重要理论意义和应用前景。

发明内容

目前尚未报道运用生物信息学方法，特别是已知药物小分子结构，通过分子对接和结合自由能分析筛选结合能低的受体蛋白的方法。本技术能较为全面地发现塞来昔布抑制血管新生的新靶点，具体方法为：

(1)确定受体蛋白数据库

选取血管形成聚合酶链式反应芯片(PCR芯片)上包括ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、TYMP、FGF1、FGF2(bFGF)、FIGF(VEGFD)、FLT1、JAG1、KDR、NRP1、NRP2、PGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、BAI1、COL4A3、IL8、ANGPTL4、F3、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINE1(PAI-1)、SERPINF1、HIF1A、NOS3、SPHK1、CCL11(Eotaxin)、CCL2(MCP-1)、CXCL1、CXCL10(INP10)、CXCL5(ENA78/LIX)、CXCL6(GCP-2)CXCL9(MIG)、EDN1、IFNA1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、TNF、CTGF、EFNA1、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、S1PR1、TEK(TIE2)、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CDH5、COL18A1、ENG(EVI-1)、ERBB2(HER2)、FN1、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、LECT1、LEP、MMP14、MMP2、MMP9、PLAU(uPA)、PLG、TIMP1、TIMP2、TIMP3、AKT1、PTGS1、PTGS2、MMP1、MMP3在内的84个基因表达的蛋白作为潜在受体蛋白数据库。

(2)受体蛋白结构筛选

根据上述84个蛋白名称，在PDB数据库逐条检索其3D结构，筛除没有实验晶体结构数据或NMR结构分辨率低的蛋白以及只有复合物结构且其中小分子结构也未知的蛋白，并结合UniProt数据库进行筛选。

(3)受体蛋白结构预处理

使用MGLTools处理受体蛋白结构，增加极性氢原子，去掉非极性氢原子，保存为.pdbqt结构。在PubChem数据库中下载塞来昔布的结构数据，使用MGLTools处理为.pdbqt格式。

(4)确定分子对接盒子

以整个蛋白质结构的中心为中心设置对接盒子，使得该盒子包含整个蛋白质分子，所有蛋白的对接盒子Spacing距离设为该距离与默认值的对接结果无显著差异。

(5)对接计算

使用Autodock_vina作为分子对接工具，分别计算塞来昔布与每个蛋白质受体的结合位点自由能，选取每个蛋白质受体自由能最低的结合位点，进行排序。

(6)靶点选择

根据排序，选取结合位点自由能小于-9.0kcal/mol的蛋白质受体作为靶点。

获得的塞来昔布抑制血管新生的靶点，APN(PDB#:4FYR)、AKT1(PDB#:4EJN)、NOS3(PDB#:4D1O)、SPHK1(PDB#:4V24)、TGFA(PDB#:3E50)、EPHB4(PDB#:3ZEW)、ITAV(PDB#:1JV2)。

优选靶点为：APN(PDB#:4FYR)、AKT1(PDB#:4EJN)、NOS3(PDB#:4D1O)、ITAV(PDB#:1JV2)。

具体实施方式

1、筛选蛋白

选取血管形成PCR芯片上包括ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、TYMP、FGF1、FGF2(bFGF)、FIGF(VEGFD)、FLT1、JAG1、KDR、NRP1、NRP2、PGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、BAI1、COL4A3、IL8、ANGPTL4、F3、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINE1(PAI-1)、SERPINF1、HIF1A、NOS3、SPHK1、CCL11(Eotaxin)、CCL2(MCP-1)、CXCL1、CXCL10(INP10)、CXCL5(ENA78/LIX)、CXCL6(GCP-2)CXCL9(MIG)、EDN1、IFNA1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、TNF、CTGF、EFNA1、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、S1PR1、TEK(TIE2)、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CDH5、COL18A1、ENG(EVI-1)、ERBB2(HER2)、FN1、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、LECT1、LEP、MMP14、MMP2、MMP9、PLAU(uPA)、PLG、TIMP1、TIMP2、TIMP3、AKT1、PTGS1、PTGS2、MMP1、MMP3在内的84个基因表达的蛋白作为潜在受体蛋白数据库。经过在PDB和UniProt蛋白结构数据库中检索各个蛋白的结构，选取X-ray晶体结构分辨率在NMR结构分辨率片段长度完整的蛋白结构，根据蛋白注释确定这一片段是否包含相关功能位点，选取包含相关功能位点的蛋白结构，最终筛选和处理后，得到54个蛋白(表1)。

表1有确定3D结构的54个血管形成相关蛋白

2、受体蛋白结构预处理

使用MGLTools处理上述筛选的54个受体蛋白结构，增加极性氢原子，去掉非极性氢原子，保存为.pdbqt结构。PubChem数据库中下载塞来昔布的结构数据，使用MGLTools处理为.pdbqt格式。

3、确定分子对接盒子

在未知受体蛋白与配体小分子的功能结合位点情况下，以整个蛋白质结构的中心为中心设置对接盒子，即原子探针的能量网格。例如AKT1蛋白(PDB ID:4EJN)中心为设置边长分别为的长方体盒子，使得该盒子包含整个蛋白质分子。所有蛋白的对接盒子Spacing距离设为

4、对接计算

使用Autodock_vina作为分子对接工具，将所保存的54个受体蛋白结构和塞来昔布结构的.pdbqt结构数据输入Autodock_vina软件，分别计算塞来昔布与每个蛋白质受体的结合位点自由能。分子对接后得到塞来昔布与每个蛋白前20个可能的结合位点亲和力得分，选取每个蛋白质受体自由能最低的结合位点，进行排序，选取结合位点自由能小于-9.0kcal/mol的蛋白质受体作为靶点(表2)。

表2与塞来昔布结合能力最强的前7种蛋白

序号	受体蛋白质	PDBID	最优结合能(-kcal/mol)
				1	APN	4FYR	-10.6
2	AKT1	4EJN	-9.6
				3	NOS3	4D1O	-9.6
4	SPHK1	4V24	-9.4
				5	TGFA	3E50	-9.3
6	EPHB4	3ZEW	-9.3
				7	ITAV	1JV2	-9.2

例如，塞来昔布与AKT1(PDB#:4EJN)的20个结合位点中，最低自由结合能为-9.6kcal/mol，即亲和力最高(表3)。

表3塞来昔布与AKT1前20个可能结合位点亲和力得分

5、功能性结合分析

当结合能不高于-9.0kcal/mol时，视为高亲和力，在7个初筛蛋白(APN、AKT1、NOS3、SPHK1、TGFA、EPHB4、ITAV)中，APN蛋白与塞来昔布亲和力最高。为进一步分析塞来昔布是否作用于这7个蛋白的功能结构域，在PubMed数据库中检索这7个蛋白已经报道的抑制剂，在PubChem中获得抑制剂的3D结构，经过预处理后分别与各自的受体蛋白进行分子对接，比较抑制剂与塞来昔布各自结合能的大小。

分子对接和模拟发现，塞来昔布与4个蛋白受体(APN、AKT1、NOS3、ITAV)存在功能性结合。其中Bestatin为APN蛋白的已知抑制剂，APN与塞来昔布和Bestatin分别对接后的结构进行分子叠合和结构比对时，发现塞来昔布的前20个最可能的结合构象中，有多个结合位置与Bestatin的结合位置重合，表明塞来昔布和Bestatin结合到了APN(PDB#:4FYR)的相同区域，这个区域即APN的活性位点，并且塞来昔布较Bestatin的亲和力更强。

MK-2206和AZD5363为AKT1的已知抑制剂，将AKT1(PDB#:4EJN)与塞来昔布的结合位点，与AKT1与MK-2206及AZD5363的结合位点进行叠合和结构比对，发现三个结合位置也高度重合。这三个分子亲和力最高的一些结合位点都位于AKT1表面最大的“口袋”上，这也是药物小分子的作用靶点。

L-NAME和L-NIO为NOS3的已知抑制剂，将塞来昔布与NOS3(PDB#:4D1O)亲和力最高的结合位点，与NOS3与L-NAME以及L-NIO的结合位点进行比较，发现三个结合位置也高度重合，这三个小分子均结合在NOS3表面最大的口袋上，这也是NOS3表面的活性位点，是药物小分子结合的靶点。

Endostatin和Rapamycin为ITAV已知抑制剂，将ITAV(PDB#:1JV2)与塞来昔布的结合位点，与该蛋白质与Endostatin及Rapamycin的结合位点进行叠合和结构比对，发现塞来昔布的第四个结合位点与另外两个小分子的结合位置高度重合。Endostatin及Rapamycin亲和力最高的结合位点，以及塞来昔布结合能为-9.3kcal/mol的结合位点，均结合在ITAV表面最大的“口袋”上，这也是塞来昔布与ITAV相互结合的活性位点。

综上所述，与塞来昔布有高亲和力的7个蛋白(APN、AKT1、NOS3、SPHK1、TGFA、EPHB4、ITAV)中，有4个蛋白(APN、AKT1、NOS3、ITAV)其活性位点能与塞来昔布相结合。

Claims

1.一种塞来昔布抑制血管新生靶点的筛选方法，其特征在于：

(1)确定受体蛋白数据库

选取血管形成聚合酶链式反应芯片上包括ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、TYMP、FGF1、FGF2(bFGF)、FIGF(VEGFD)、FLT1、JAG1、KDR、NRP1、NRP2、PGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、BAI1、COL4A3、IL8、ANGPTL4、F3、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINE1(PAI-1)、SERPINF1、HIF1A、NOS3、SPHK1、CCL11(Eotaxin)、CCL2(MCP-1)、CXCL1、CXCL10(INP10)、CXCL5(ENA78/LIX)、CXCL6(GCP-2)CXCL9(MIG)、EDN1、IFNA1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、TNF、CTGF、EFNA1、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、S1PR1、TEK(TIE2)、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CDH5、COL18A1、ENG(EVI-1)、ERBB2(HER2)、FN1、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、LECT1、LEP、MMP14、MMP2、MMP9、PLAU(uPA)、PLG、TIMP1、TIMP2、TIMP3、AKT1、PTGS1、PTGS2、MMP1、MMP3在内的84个基因表达的蛋白作为潜在受体蛋白数据库。

(2)受体蛋白结构筛选

(3)受体蛋白结构预处理

(4)确定分子对接盒子

(5)对接计算

(6)靶点选择

2.根据权利要求1所述方法获得的塞来昔布抑制血管新生的靶点，其特征在于，靶点为APN(PDB#:4FYR)、AKT1(PDB#:4EJN)、NOS3(PDB#:4D1O)、SPHK1(PDB#:4V24)、TGFA(PDB#:3E50)、EPHB4(PDB#:3ZEW)、ITAV(PDB#:1JV2)。

3.根据权利要求2所述的优选靶点，其特征在于，进一步优选靶点为APN(PDB#:4FYR)、AKT1(PDB#:4EJN)、NOS3(PDB#:4D1O)、ITAV(PDB#:1JV2)。