RO119344B1 - Compoziţie farmaceutică pe bază de peptide şi adjuvanţi cu efect imunomodulator - Google Patents
Compoziţie farmaceutică pe bază de peptide şi adjuvanţi cu efect imunomodulator Download PDFInfo
- Publication number
- RO119344B1 RO119344B1 RO98-01305A RO9801305A RO119344B1 RO 119344 B1 RO119344 B1 RO 119344B1 RO 9801305 A RO9801305 A RO 9801305A RO 119344 B1 RO119344 B1 RO 119344B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- peptide
- pharmaceutical composition
- composition according
- cells
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 389
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title claims abstract description 86
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 131
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 31
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 112
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 81
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 81
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 81
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 76
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 76
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 75
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 67
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 claims description 28
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 claims description 27
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 23
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 claims description 17
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 9
- -1 IFN-befa Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 6
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 claims description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims 1
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 153
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 54
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 35
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 34
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 28
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 16
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 15
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 15
- 230000009471 action Effects 0.000 description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 12
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 11
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 10
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 9
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 9
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 9
- KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N (4s)-5-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-1-[[2-[[2-[[(1s)-3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]a Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CC1=CC=C(O)C=C1 KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 7
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- NEPLKJAINOWIJL-DHNNRRLOSA-N dnc014884 Chemical class C1C2=CC3=CC=CC=C3N2[C@@]2(C)[C@@H]1[C@@]1(C)CCC(=O)C(C)(C)[C@@H]1CC2 NEPLKJAINOWIJL-DHNNRRLOSA-N 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 3
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 3
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XMGQYMWWDOXHJM-JTQLQIEISA-N (+)-α-limonene Chemical compound CC(=C)[C@@H]1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- NZJXADCEESMBPW-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfinyldecane Chemical compound CCCCCCCCCCS(C)=O NZJXADCEESMBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 2
- SNPLKNRPJHDVJA-ZETCQYMHSA-N D-panthenol Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCCO SNPLKNRPJHDVJA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- WEEGYLXZBRQIMU-UHFFFAOYSA-N Eucalyptol Chemical compound C1CC2CCC1(C)OC2(C)C WEEGYLXZBRQIMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150003479 Parg gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- XXJWXESWEXIICW-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol monoethyl ether Chemical compound CCOCCOCCO XXJWXESWEXIICW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000006450 immune cell response Effects 0.000 description 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- WDQFELCEOPFLCZ-UHFFFAOYSA-N 1-(2-hydroxyethyl)pyrrolidin-2-one Chemical compound OCCN1CCCC1=O WDQFELCEOPFLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 5-oxoproline Chemical compound OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000531123 GB virus C Species 0.000 description 1
- 206010056740 Genital discharge Diseases 0.000 description 1
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000997835 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N Leu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101100088246 Mus musculus Rpl13a gene Proteins 0.000 description 1
- 101000608782 Mus musculus Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- OZJHCMYAXLCFKU-UHFFFAOYSA-N Polyavolensinone Natural products CC1(C)C2CCC3n4c(CC3(C)C2(C)CCC1=O)cc5ccccc45 OZJHCMYAXLCFKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102220519838 Putative neutrophil cytosol factor 1B_P91A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940075557 diethylene glycol monoethyl ether Drugs 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N famotidine Chemical compound NC(N)=NC1=NC(CSCCC(N)=NS(N)(=O)=O)=CS1 XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000013546 insoluble monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003893 lactate salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000034701 macropinocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229930188544 polylisin Natural products 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004040 pyrrolidinones Chemical class 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000037072 sun protection Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940070527 tourmaline Drugs 0.000 description 1
- 229910052613 tourmaline Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011032 tourmaline Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 229940030325 tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
Invenţia se referă la o compoziţie farmaceutică, care conţine cel puţin o peptidă, proteină sau fragment de proteină cu efect imunomodulator, împreună cu un adjuvant, ce constă în aceea că adjuvantul prezintă capacitatea de a întări legătura peptidei, respectiv, a proteinei sau a fragmentului de proteină, la celule ce prezintă antigen, respectiv, să întărească preluarea acestuia în aceste celule, şi prin aceasta să producă o intensificare a acţiunii imunomodulatoare a peptidei, respectiv, a proteinei sau a fragmentului de proteină. ŕ
Description
Invenția se referă la o compoziție farmaceutică, pe bază de peptide și adjuvanți, cu efect imunomodulator.
Invenția este o dezvoltare, în continuare, a unui vaccin terapeutic, pe baza celulelor tumorale, care se bazează, în esență, pe următoarele premise: există deosebiri calitative și cantitative, între celule tumorale și celule normale; sistemul imunitar are, în principiu, capacitatea de recunoaștere a acestor deosebiri; sistemul imunitar poate - prin imunizarea specifică cu vaccinuri - să fie stimulat, pentru recunoașterea celulelor tumorale, pe baza acestor deosebiri și să ducă la respingerea lor.
Pentru a cauza un răspuns antitumoral, trebuie să fie îndeplinite cel puțin două premise: în primul rând trebuie ca celulele tumorale să exprime antigeni, care nu apar sau apar atât de limitat la celule normale, încât este posibilă o deosebire calitativă între țesutul normal și țesutul tumoral, prin sistemul imunitar. în al doilea rând, trebuie ca sistemul imunitar să fie activat în mod corespunzător, pentru a reacționa asupra acestor antigeni. O piedică esențială în terapia imunitară la tumori este imunogenitatea lor redusă, mai ales la om.
în trecut, s-au descoperit antigeni asociați cu tumori și specifici tumorilor, care reprezintă astfel de neo-epitopi și ar putea fi astfel ținte potențiale pentru un atac al sistemului imunitar. Faptul că nu se reușește de către sistemul imunitar să elimine tumorile care exprimă acești neo-epitopi, ar trebui, după această teorie, să nu fie cauzat, în mod evident de lipsa de neo-epitopi, ci faptul că răspunsul imunologic asupra acestor neo-antigeni este insuficient.
Pentru imunoterapia cancerului pe bază celulară s-au dezvoltat două ștrategii generale: pe de-o parte imunoterapia adoptivă, care se folosește de expansiunea in vitro a unor T-limfocite reactive și reintroducerea lor în pacient; pe de altă parte imunoterapia activă, care utilizează celule tumorale, în speranța, ca odată cu acestea, să fie produse răspunsuri imunogene fie noi, fie intensificate împotriva antigenilor tumorali, care duc la un răspuns sistemic la tumori. Vaccinurile pentru tumori pe baza imunoterapiei active s-au obținut în diferite feluri; un exemplu pentru aceasta îl reprezintă celule tumorale iradiate, care sunt tratate cu adjuvanți imuno stimulativi cum ar fi Corynebacterium parvum sau Bacillus Calmette Guerin (BCG), pentru a produce imunoreacții împotriva antigenilor de tumori (Oettgen și Old, 1991).
în ultimii ani s-au utilizat, mai ales, celule tumorale modificate genetic pentru o imunoterapie activă împotriva cancerului. O vedere de ansamblu asupra acestor studii diferite, prin care celulele tumorale se îndepărtează printr-o imunogenitate intensificată, datorită introducerii diferitelor gene, este dată de Zatloukal et al., 1993. Una din strategiile utilizate până acum utilizează celule tumorale, care se modifică genetic, pentru a produce citocine.
Identificarea și izolarea de antigeni de tumori și antigeni asociați tumorilor (TAs) respectiv a peptideler derivate din aceștia (descrise, de exemplu, de Wolfel et al., 1994 a) și 1994 b); Carrel et al., 1993, Lehmann et al., 1989, Tibbets et al.,1993, sau în cererile de brevet internațienale publicate WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159), a fost premisa pentru o altă strategie, în care antigenii de tumori se utilizează ca imunogeni pentru vaccinuri de tumori, și anume atât sub formă de proteine, cât și de peptide. Prin lucrările lui Boon et al., 1992; Boon et al.; 1994; Boon et al., 1995; van Peel et al., 1995; Van der Eynde, 1995; s-a făcut cunoscut că melanomii maligni prezintă peptide derivate din antigeni tumorali în contextul MHC-1. Cu un vaccin tumoral sub formă de antigen tumoral, ca atare, nu s-a ajuns însă până acum la o imunogenitate suficientă, pentru a declanșa un răspuns imunitar celular, așa cum ar fi necesar pentru eliminarea de celule tumorale purtătoare de antigeni de tumori (Marchand et al., 1995). Pentru a ajunge ca celulele care prezintă antigen (Antigen-presenting cells, “APCs”) să prezinte pe suprafața lor antigene de peptide definite, s-a propus, să se “pulseze peptidele, ceea ce a dus însă la o încărcare ineficientă a celulelor cu peptide (Tykocinski et al, 1996); s-a mai demonstrat că coaplicarea de adjuvanți a intensificat răspunsul imun numai în anumite condiții (Oettgen și Old, 1991).
RO 119344 Β1
O a treia strategie a imunoterapiei active pentru mărirea eficacității vaccinurilor de tumori se bazează pe celule xenogenizante (înstrăinate) autologe de tumori. La baza acestei concepții stă presupunerea că sistemul imunitar reacționează la celule tumorale, care exprimă o proteină străină și că în cursul acestei reacții se produce și un răspuns imun împotriva acelor antigeni de tumori, care sunt prezentați de celulele tumorale ale vaccinurilor. 55
Un rol central la reglarea răspunsului imun îl joacă un complex trimolecular, constând din componentele receptor antigen de celulă T, molecula MHC (Major Histocompatibility Complet) și liganzii acesteia, care sunt un fragment derivat dintr-o proteină.
Moleculele MHG (respectiv moleculele umane corespunzătoare, HLAs) sunt receptori de peptidă, care permit, la o specificitate stringentă a legăturii, nenumărați liganzi diferiți. 60 Premiza pentru acest fapt o reprezintă toate motivele specifice de peptide, care prezintă umătoarele criterii de specificitate: peptidele au, în funcție de tipul MHC-Haplo, o lungime definită, la tipul MHC-1 Haplo, de regulă, opt până la zece radicali de aminoacizi.
în mod tipic, două dintre pozițiile de aminoacizi reprezintă așanumite “ancore”, care pot fi ocupate numai printr-un singur aminoacid sau prin radicali de aminoacizi cu lanțuri late- 65 rale strâns înrudite. Poziția exactă a aminoacizilor de ancorare în peptidă și cerințele pentru proprietățile lor variază cu tipurile MHC-Haplo. Terminalul C al ligandului de peptidă este cel mai adesea un radical alifatic sau încărcat. Astfel de motive de liganzi de peptide MHC-1 sunt cunoscuți până acum între altele pentru Haplo-tipurile H-2Kd, Kb, Kk, Kkml, Db, HLaA*0201, ΑΌ205 și Bx2705. 70 în cadrul reacției proteinei în interiorul celulei, se descompun produse de gene regulate, modificate și străine, de exemplu, proteine virale sau antigeni de tumori, în peptide mici; unele din acestea reprezintă liganzi potențiali pentru molecule MHC. Cu aceasta se dă premisa pentru prezentarea lor prin molecule MHC și ca urmare a acestora, declanșarea unui răspuns imun, nefiind încă clarificat în amănunt, cum se produc peptidele ca liganzi MHC 75 în celulă.
Proteine străine sau înstrăinate și bucăți rezultate din ruperea lor, pot fi de asemenea recunoscute, legate și înlăturate prin imunoglobuline, care reprezintă răspunsul umoral imun. Acest lucru este valabil și pentru toți antigenii de tumori: la exemplul antigenilor asociați cu tumori, MUC1, CEA și HER2/nou s-a dovedit, că imunoglobuline, care prezintă o specificitate 80 pentru aceste proteine, pot să recunoască și să omoare celulele care poartă preteină. Pentru a declanșa un răspuns imun umoral specific pentru antigenii de tumori, s-au încercat de aceea diferite forme de MUC1 și CEA ca imunogeni ( de exemplu în vectorii recombinați Pox; Bronte et al., J.lmmunol. 154\ 5282 1995) la modele pe animale și testări preclinice.
în cadrul invenției de față, s-au continuat cercetările care au fost folosite la dezvolta- 85 rea unui vaccin celular antitumoral; celule normale ale corpului, ne-maligne, sunt tolerate de sistemul imunitar, când corpul reacționează la o celulă normală, dacă ea, de exemplu, din cauza unei infecții cu un virus, sintetizează proteine străine de corp, cu o apărare imună. Cauza acestui fapt este că moleculele MHC prezintă peptide străine, care provin din proteine străine de corp. Ca urmare a acestui fapt, sistemul imunitar înregistrază că s-a întâmplat 90 ceva nedorit, străin, cu această celulă. Se activează APCs (din acestea fac parte macrofage, celule dendritice, celule Langerhans, celule B, precum și posibil celulele bifenotipice descoperite de curând, care prezintă atât proprietăți ale celulelor B, cât și ale macrofagelor; Tykocinski et al. 1996), care generează o nouă imunitate specifică și celula se elimină.
Deși celulele tumorale conțin antigenii tumorali respectivi, specifici tumorii, sunt însă 95 insuficiente ca atare, ca vaccinuri, deoarece, pe baza imunogenității lor reduse, sunt ignorate de sistemul imunitar. Acum dacă se încarcă o celulă tumorală nu cu o proteină străină, ci cu o peptidă străină, atunci se percep în plus la peptidele străine și antigenii tumorali specifici acestei celule, ca fiind străine. Prin înstrăinarea cu o peptidă se poate ajunge, ca răspunsul imun celular să se declanșeze prin peptidele străine împotriva antigenilor tumorali.
100
RO 119344 Β1
Cauza pentru o imunogenicitate redusă a celulelor tumorale poate să fie nu numai o problemă calitativă, ci o problemă cantitativă. Pentru o peptidă derivată de la un antigen de tumoră acest lucru poate însemna, că deși se prezintă de către molecule MHC, este totuși într-o concentrație, care este prea redusă pentru a declanșa un răspuns imun celular specific tumorii. Deci, o mărire a numărului de peptide specifice tumorii pe celula tumorală, ar trebui astfel să aibă ca efect de asemenea, o înstrăinare a celulelor tumorale, care duce la declanșarea unui răspuns celular imun. S-a propus ca antigenul tumoral, respectiv peptidă derivată din acesta să fie prezentat pe suprafața celulei în așa fel, încât ea împreună cu un un ADN codificat pentru proteina respectivă, respectiv pentru peptidă respectivă, să fie transferat așa cum s-a descris în publicațiile de brevet WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 și WO 95/00159.
în cererea de brevet germană P195 43 649.0, se descrie un vaccin celular, care conține drept componentă activă, celule tumorale, care sunt astfel încărcate cu una sau cu mai multe peptide, încât celulele tumorale în context cu peptidele sunt recunoscute drept străine de către sistemul imunitar al pacientului și declanșează un răspuns celular imun. O caracteristică esențială a peptidelor este că ele constituie liganzi pentru Haplotipul MHC al pacientului. Peptidele sunt recunoscute, de aceea, de către sistemul imunitar al pacientului ca fiind străine, deoarece ele, pe de-o parte, pot fi “peptide străine sau “xenopeptide”, adică ele sunt diferite de peptidele care sunt derivate din proteine, care sunt exprimate de celulele tumorale ale pacientului. O altă categorie de peptide este derivată din antigenii turnorali, care sunt exprimați de celulele pacientului. Acestea, au drept efect o mărire a imunogenității prin aceea că ele există pe celulele tumorale ale vaccinului într-o concentrație, care este mai ridicată decât concentrația acelorași peptide pe celulele tumorale ale pacientului.
Scopul invenției de față a fost să ofere o compoziție farmaceutică nouă cu acțiune imunomodulatoare, mai ales un vaccin.
în completarea concepției din cererea de brevet germană P 195 43 649 0 față de vaccinurile celulare descrise acolo, s-a dezvolatat în cadrul invenției de față o compoziție farmaceutică, ce conține peptidele cu acțiune imunomodulatorie nu în context cu celule, ci împreună cu un adjuvant, pentru a declanșa un răspuns imun împotriva excitanților patogeni, respectiv un răspuns antitumoral, celular și/sau umoral, de preferință un răspuns sistemic imun, respectiv să intensifice sau să producă o toleranță față de proteinele cu acțiune autoimună.
S-a constatat, în mod surprinzător, că anumiți adjuvanți, de exemplu, policationii, despre care s-a arătat pentru prima oară abia în 1965, că ei pot să producă o creștere a transportului de proteine în celule (Byser et al., 1965; Ryser et al., 1978; Shen et al., 1981) măresc imunogenitatea peptidelor.
Invenția se referă la o compoziție farmaceutică, ce conține cel puțin o peptidă, proteină sau fragment de proteină cu efect imunomodulator, împreună cu un adjuvant, ce constă în aceea că adjuvantul prezintă capacitatea de a întări legătura peptidei, respectiv a proteinei sau fragmentului de proteină la celule ce prezintă antigen, respectiv să întărească preluarea acestuia în aceste celule și prin aceasta să producă o intensificare a acțiunii imunomodulatoare a peptidei, respectiv a proteinei sau fragmentului de proteină.
Compoziția farmaceutică, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:
- adjuvantul conținut în compoziție are proprietatea de a înlesni pătrunderea peptidei în celule, respectiv legarea peptidei la celulele pacientului și de a intensifica imunogenitatea peptidei;
- activitatea adjuvantului mărește concentrația critică a peptidejJa_suprafața celulei (datorită apropierii spațiale), prin acțiunea de schimb electrostatic între peptidă electronegativă și adjuvantul policationic.
RO 119344 Β1 în cele ce urmează, se denumesc, în general, pentru simplificare, reprezentanții pep- 150 tidelor, proteinelor sau fragmentelor de proteină cu acțiune imunomodulatoare, ca “peptide”.
Noțiunea “peptidă” reprezintă, dacă nu se referă în mod expres asupra ligandului, și fragmente mai mari de proteină din care derivă peptidă respectivă, un produs de descompunere celular.
Sub denumirea de “acțiune imunomodulatoare” se înțelege, pe de-o parte, declan- 155 șarea sau intensificarea unei reacții imune celulare și/sau umorale, de preferință sistemice. în această formă de realizare, compoziția farmaceutică, conform invenției, acționează ca un vaccin.
într-o formă de realizare preferată, peptidele sunt liganzi pentru cel puțin o moleculă MHC, care este exprimată de către individul care trebuie tratat. 160
Moleculele MHC umane se denumesc conform expresiei internaționale, în cele ce j urmează și ca”HLA”(“Human Leucocyte Antigen”).
Sub denumirea “răspuns celular imun” se înțelege înainte de toate imunitatea celulară citotoxică T, care, ca urmare, a generării de celule T citotoxice CD8-pozitive și celulelor T ajutătoare CD4 are drept efect distrugerea celulelor tumorale sau a celulelor invadate de 165 excitantul patogen.
Sub denumirea de “răspuns umoral imun” se înțelege producția de imunoglobuline, care recunosc selectiv celulele tumorale sau structurile derivate de excitanții patogeni și ca urmare, împreună cu alte sisteme, ca de exemplu Komplement, ADCC (Antibody dependent Cytotoxicity) sau fagocitoză, au drept efect distrugerea acestor celule tumorale, respectiv 170 a excitanților patogeni sau a celulelor invadate de aceștia.
Peptidă conținută în vaccin este derivată dintr-un antigen, respectiv reprezintă un antigen în cazul proteinelor, împotriva căruia trebuie să se declanșeze un răspuns imun celular și/sau umoral. Cu aceasta se realizează că celule T respectiv alte celule citotoxice efectorice recunosc excitantul de boală respectiv celulele tumorale, care prezintă antigenul 175 și se generează anticorpi.
Pentru imunizarea împotriva excitanților de boală, cum ar fi bacterii, virusuri, paraziți, se utilizează proteine respectiv peptide, care reprezintă o proteină a respectivului excitant, respectiv sunt derivate din acestea. Se pretează, în acest caz, mai ales, proteine care rămân neatacate de rata de mutație generală ridicată, a acestor excitanți. Exemple publicate sunt 180 HPV16/T7 (Human Papilloma Virus; Feltkamp et al. 1995), Hepatitis B Virus Core Antigen (Vitiello et al., 1995), Plasmodium Bergheii (Widmann et al., 1992), InfluenzavirusNukleoprotein, Hepatitis G Virus.
într-o formă de realizare a invenției, este proteina, în privința declanșării unui răspuns antitumoral, un antigen tumoral, respectiv peptidă derivată dintr-un antigen de tumoră; în 185 acest caz, se utilizează compoziția farmaceutică drept vaccin de tumoră. în acest caz, la aplicarea terapeutică a vaccinului, peptidă este derivată dintr-un antigen de tumoră, care este exprimată de celulele tumorale ale pacientului. Acești antigeni de tumori sunt, de exemplu, astfel de antigeni de tumoră care se exprimă de către pacient într-o concentrație, care este prea mică, astfel încât celulele tumorale să nu fie recunoscute drept străine. 190
Antigenii tumorali ai pacientului pot fi stabiliți în cursul punerii diagnozei și a stabilirii planului de terapie cu metode standardizate: antigenii tumorali pot fi dovediți pe cale simplă, în mod imunohistochimic, cu ajutorul anticorpilor. Dacă antigenii de tumori sunt enzime, de exemplu, Tyrosinase, ei pot fi dovediți cu Enzymassays. La antigenii tumorali cu secvență cunoscută poate fi aplicată metoda RT- PCR (Boon, T., et al., 1994, Coulie, P.G. et al., 195
1994; Weynants, P., et al., 1994). Alte metode de demonstrare sunt testările pe bază de
CTLs cu specificitate pentru anigenul tumoral care trebuie stabilit. Astfel de testări au fost descrise între altele de Herin et al., 1987; Coulie et al., 1993, Cox et al., 1994; Rivoltini et al.,
RO 119344 Β1
1994; Kawakami et al., 1995; precum și în WO 94/14459; din aceste referințe, se pot lua și diferiți antigeni de tumori, respectiv peptidepitopi derivați din aceștia, care sunt adecvați în cadrul invenției de față; exemple de antigeni de tumori adecvați sunt indicați și în articolele de ansamblu apărute de curând ale lui Rosenberg, 1996, Henderson și Finn, 1996.
Cu privire la antigenii de tumori, care se pot folosi, invenția de față este nelimitată; câteva exemple pentru antigeni de tumori cunoscuți se pot utiliza în cadrul invenției de față, respectiv, peptide derivate din aceștia sunt indicate în tabel.
Un vaccin de tumoare, care conține un antigen de tumoare, respectiv, o peptidă derivată dintr-un antigen de tumoare, poate fi administrat atât terapeutic, cât și profilactic. La aplicarea profilactică, se folosește, în mod adecvat, un amestec de peptide care sunt derivate din reprezentanți ai antigenilor de tumori care apar des. La aplicarea terapeutică a vaccinurilor de tumori, conform invenției, se utilizează una sau mai multe peptide, de la care este de așteptat, că ei se găsesc în antigenul (sau antigenii) tumorali ai pacientului.
Vaccinul tumoral, conform invenției, are față de vaccinurile celulare pe bază de celule tumorale autologice, avantajul că el este folositor și pentru pacienți într-un stadiu relativ timpuriu (stadiul I și II) al îmbolnăvirii, de la care nu sunt la dispoziție celule tumorale suficiente pentru obținerea unui vaccin celular.
într-o formă de realizare preferată, a invenției, peptidă se stabilește, în privința declanșării unui răspuns imun celular, pe subtipul MHC-I sau MHC-II al individului care trebuie vaccinat; peptidă prezintă deci o secvență, respectiv conține o secvență,-care garantează legarea ei la o meleculă MHC.
într-o altă formă de realizare a invenției, compoziția farmaceutică folosește pentru a produce o toleranță față de proteine, respectiv a fragmentelor lor, care declanșează o autoimunitate față de bolile induse, deci folosește la terapia bolilor autoimunității. Peptidele folosite în această formă de realizare a invenției sunt derivate din proteine care produc boli ale autoimunitătii.
Spre deosebire de aplicarea invenției ca vaccinuri împotriva tumorilor sau ca vaccinuri împotriva excitanților patogeni, la care peptidele corespund cu un fragment al proteinei de origine (antigen tumoral sau respectiv proteină a patogenului), în esență în așa fel, încât peptidă se recunoaște ca “antigen original”, la aplicarea invenției la tratamentul bolilor autoimunitare, se folosesc între altele, peptide care prezintă deosebiri critice față de secvența de aminoacizi a proteinei de origine. Deși aceste peptide se leagă pe baza poziției lor de ancorare, la molecula MHC, ele prezintă însă în secvența lor mutații, care au drept efect ca aceste peptide să funcționeze ca antagoniști, care desfac din nou celulele T activate, specifice (Kersh și Allen, 1996).
Ca antagoniști de peptidă se pretează atât antagoniști “naturali, care au fost descoperiți în viruși (Bertoletti et al., 1994), cât și antogeniști care au fost descoperiți prin cercetare sistematică, de exemplu, prin sitarea de”Peptid-Libraries”. Un exemplu de antagoniști de peptidă sunt peptide, care pot să declanșeze celule T, care sunt specifice pentru Myelin Basic Protein, acestea s-au încercat în experimentări pe animale asupra eficienței lor (Brocke et al. 1996).
O peptidă care trebuie să declanșeze un răspuns imunitar celular trebuie să se poată lega la o moleculă MHC. Pentru a fi declanșat un răspuns imun la pacient, trebuie deci ca individul care se tratează să prezinte o meleculă HLA corespunzătoare în repertoriul său. Deci stabilirea subtipului HLA al pacientului constitue una din premisele esențiale pentru o aplicare eficientă a peptidei la acest pacient.
Subtipul HLA al pacientului se poate determina cu metode standard cum ar fi testul microlimfotoxicitații (Practicai Immunology, 1989).
RO 119344 Β1
Acest test se bazează pe principiul să se trateze limfocite izolate din sângele pacientului mai întâi cu antiser sau cu anticorpi monoclonali, față de o moleculă anumită HLA în prezența unui complement de iepure de casă (C). Celulele pozitive sunt lizate (omorâte) și preiau un colorant al unui indicator, pe când celulele nedeteriorate rămân necolorate.
Pentru stabilirea haplotipului HLA-1 sau HLA-II al unui pacient se poate utiliza și metoda RT-PCR. (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) (Curr. Prot. Mol. Biol. cap. 2 și 15). Pentru aceasta se ia sânge de la un pacient și se izolează din aceasta RNA. Acest RNA se supune, mai întâi, unei transcripții reverse, prin care se formează cADN al pacientului. Acest cADN folosește ca matrice pentru reacția în lanț a polimerazei cu perechi primere, care au, drept efect specific, amplificarea unui fragment de ADN, care este pentru un anumit haplotip HI_A. Dacă, după o gel-electroforeză în agar, apare o bandă ADN, atunci pacientul exprimă molecula HLA corespunzătoare. Dacă banda nu apare, atunci pacientul este negativ pentru aceasta.
Definirea unei peptide utilizate conform invenției, printr-o moleculă HLA o definește cu privire la aminoacizii ei de ancorare și a lungimii ei; poziția definită de ancorare și lungimea, garantează că o peptidă se potrivește în furca de legătură a peptidei moleculei HLA respective a pacientului. Acest lucru are drept urmare, că sistemul imunitar este stimulat și se produce o imunoreacție celulară, care se îndreaptă, în cazul utilizării unei peptide derivate dintr-un antigen tumoral, împotriva celulelor tumorale ale pacientului.
Peptidele care sunt adecvate în cadrul invenției de față, sunt disponibile într-un spectru larg. Secvența lor poate fi derivată de la proteine imunogene care apar în mod natural, respectiv de la produsele lor de descompunere, de exemplu de la peptide virale sau bacteriene, de la antigenii tumorali, sau ele pot fi antagoniste la peptide, care derivă din proteine induse din îmbolnăviri autoimune.
Peptidele adecvate se pot alege, de exemplu, pe baza secvențelor de peptide cunoscute din literatură.
în ceea ce privește declanșarea unui răspuns imun celular, peptidele pot fi definite, de exemplu, pe baza studiilor efectuate de Rammensee et al., 1993, Rammensee et al., 1995, Falk et al., prin caracteristicile HLA, ale peptidelor derivate din proteine imunogene de diferite origini, care se potrivesc în furcile de legare ale moleculei subtipului HLA respective.
Pentru peptidele care prezintă o secvență parțială a unei proteine cu acțiune imunogenă, se poate stabili, cu ajutorul secvențelor de polipeptide sau eventual încă de stabilit, prin comparația secvențelor ținând seama de cerințele specifice HLA, peptide care reprezintă candidați adecvați. Exemple pentru peptide adecvate se găsesc, de exemplu, în studiile efectuate de Rammensee et al., 1993, Falk et al., 1991, și Rammensee, 1995; precum și în WO 91/09869 (peptide HIV); peptide derivate din antigeni de tumoare s-au descris, de exemplu, în cererile de brevet internaționale WO 95/00159, WO 94/05304. Se iau în considerație dezvăluirile acestor referințe din literatură și articolele citate, în legătură cu peptidele ca exemple. Dintre candidații preferați fac parte peptide a căror imunogenitate a fost arătată deja, deci peptide care derivă din imunogeni cunoscuți, de exemplu, proteine virale sau bacteriene.
în loc să se folosească peptide originale, care se potrivesc în furca de legare a moleculelor MHC-I sau MHC-II, deci peptide care sunt derivate, în mod neschimbat, din proteine naturale, se pot lua variațiuni, pe baza secvenței peptidei originale, cu cerințe minime date cu privire la poziția de ancorare și lungime, în măsura în care, prin aceste variațiuni, 4mttnogenitatea efectivă a peptidei, care se compune din afinitatea ei de legare la molecula MHC și a capacității ei de a stimula receptorii celulei T, nu mumai că nu este prejudiciată, ci de preferință, este intensificată. în acest caz, se utilizează deci conform invenției, peptide
250
255
260
265
270
275
280
285
290
295
RO 119344 Β1 artificiale, care sunt concepute corespunzător cerințelor capacității de legare la o moleculă MHC. Astfel de exemplu pornind de la liganzii H2-Kd Leu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe lle (LEFEAIEGFI) se pot modifica aminoacizii, care nu reprezintă aminoacizi de ancorare, pentru a obține peptidă cu secvența PhePhe lle Gly Ala Leu Glu Glu lle (FFIGALEEI); în afară de aceasta aminoacidul de ancorare lle poate fi înlocuit în poziția 9 prin Leu. Stabilirea de epitopi de MHC-I respectiv MHC-II a liganzilor respectivi, adică a variației lor poate fi efectuată de exemplu după principiul descris de Rammensee et al., 1995. Lungimea, peptidei corespunde în cazul adaptării ei la molecula MHC-I de preferință unei secvențe minimale de 8 până la 10 aminoacizi, cu aminoacizii de ancorare necesari. Modelul de legare la MHC-II care se întinde asupra unor noi aminoacizi, prezintă un grad mai înalt de degenerare în pozițiile de ancorare. S-au dezvoltat de curând, pornind de la analiza de structură Rontgen a moleculelor MHC-II, metode, care permit o analiză exactă a modelelor de legare a moleculelor MHC-II, și pornind de la acestea, variațiuni ale secvenței de peptide (Rammensee et al., 1995, și literatura originală citată acolo).
Eventual peptidă poate fi prelungită și la terminalul C și/sau N, în măsura în care această prelungire nu prejudiciază capacitatea de legare la molecula MHC, respectiv peptidă prelungită poate fi procesată celular pe secvența minimală.
într-o formă de realizare a invenției, peptidă este încărcată negativ. în această formă de realizare, peptidă poate fi prelungită cu aminoacizi încărcați negativ, sau se pot introduce aminoacizi încărcați negativ în peptidă, de preferință, în poziții care nu sunt necesare pentru recunoaștere prin CTLs specifice sau ca aminoacizi de ancorare, pentru a realiza o legare electrostatică a peptidei la un adjuvant policationic, cum ar fi polilizină.
într-o formă de realizare a invenției, antigenul nu se introduce sub forma unei peptide, ci ca proteină sau fragment de proteină respectiv ca amestec de proteine sau fragmente de proteină. în cadrul invenției de față sunt adecvate fragmente mai mari de proteină respectiv proteine întregi, despre care se garantează, că ele, după aplicare, sunt procesate de către APCs ale pacientului la peptide, care se potrivesc la molecula MHC.
Proteina reprezintă un antigen, respectiv un antigen de tumoare, din care derivă bucățile obținute după procesare. în această formă de realizare adjuvantul folosește pentru a da posibilitatea încărcării celulelor (“Transloading), mai ales APCs cum ar fi celule dendritice sau macrofage, cu antigenul de tumoare, respectiv cu fragmentele acestuia sau să intensifice această încărcare. Proteine astfel preluate, respectiv fragmente de proteine, sunt procesate de celule și pot apoi să fie prezentate în contextul MHC celulelor de imunoefector și cu aceasta să declanșeze un răspuns imun, respectiv să-l intensifice (Braciale și Braciale, 1991; Kovacservics Bankowski și Rock, 1995, York și Rock, 1996).
Forma de realizare a invenției, în care se folosesc proteine respectiv fragmente mai mari de proteine ca antigeni, are avantajul că există o dependență mai redusă față de tipul de HLA a pacientului, deoarece proteina este procesată în mai multe fragmente și astfel este dată o variabilitate mai mare cu privire la “forma de potrivire” a peptidelor.
în cazul administrării de proteine sau fragmente de proteine se poate dovedi identitatea produselor finale procesate cu ajutorul analizei chimice (descompunerea Edman sau spectrometrie de masă a fragmentelor procesate, a se vedea articolul de prezentare în ansamblu al lui Rammensee et al., 1995 precum și literatura originală citată în acesta) sau cu ajutorul încercărilor biologice (capacitatea APCs de stimulare a celulelor T, care sunt specifice pentru fragmentele procesate).
Alegerea candidaților de peptidă, care se pretează pentru a declanșa un răspuns imun celular, are loc, în principiu, în mai multe trepte: în general candidații, se testează în mod adecvat în încercări în serie, mai întâi într-un test de legare a peptidei asupra capacității lor de legare la o moleculă MHC.
RO 119344 Β1
O metodă de cercetare adecvată pentru aceasta se bazează pe capacitatea peptide- 345 lor de a putea să stabilizeze molecule MHC goale, ca de exemplu în studiile prezentate de Stuber et al., 1994, și Mclntyre et al., 1996. în acest caz, peptida se aduce pe celule, care sunt în stare să exprime molecula MHC respectivă, dar din cauza unui defect genetic nu sunt în situația, de a lega nici o peptidă endogenă în molecula MHC. Linii de celule adecvate din acest tip sunt liniile RMA-S (șoarece) și T2 (uman) respectiv variantele lor transferate. Apoi 350 se pot demonstra, numai moleculele MHC stabilizate de peptida respectivă, de preferință cu ajutorul analizei FACS (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage TM User’s Guide, 1994; Cell Quest TM User’s Guide, 1994) adică citometriei de curgere. Moleculele stabile MHC se dovedesc cu un anti-MHC-anticorp adecvat și cu un colorant de fluorescentă, de exemplu FITC (izotiocianat de fluoresceină) care marchează un al doilea anticorp (de exemplu poli- 355 donai). în scurgere se excită apoi celule individuale de către un laser cu o anumită lungime de undă; se măsoară fluorescența emisă, ea depinde de cantitatea de peptidă legată de celulă.
O altă metodă pentru determinarea cantității legate de peptidă este Scatchard-Plot, așa cum este descris de Sette et al., 1994. Se utilizează pentru aceasta, peptida care este 360 marcată, de exemplu, cu I125 și se incubează peste noapte cu molecule izolate și obținute recembinant MHC la 4°C cu diferite concentrații definite de peptidă.
Pentru determinarea acțiunii de schimb nespecifice a peptidei, se adaugă la câteva probe un exces de peptidă nemarcată, care împiedică interacțiunea nespecifică a peptidei marcate. Apoi se îndepărtează peptida nelegată specific, de exemplu, cu ajutorul cromato- 365 grafiei pe gel. Cantitatea de peptidă legată se determină apoi cu ajutorul radioactivității emise într-un contor de scintilații. Evaluarea datelor astfel obținute are loc prin metode standardizate.
O vedere de ansamblu asupra metodelor pentru caracterizarea acțiunii de schimb MHC/peptidă, a analizei liganzilor și încercărilor de legare a peptidelor, care pot fi utilizate 370 în cadrul invenției de fată, a fost dată de Hammensee et al, 1985.
în următoarea treaptă se examinează candidații de peptidă cu calități bune de legare asupra imunogenității lor.
Declanșarea unui răspuns imunocelular poate fi confirmată prin demonstrarea, CTLS specifice peptidelor, de exemplu, cu ajutorul metodei descrise în Current Protocols in 375 Immunology, cap. 3 sau descrise de Blomberg et al., 1993. O altă demonstrare a prezenței unui răspuns imun celular este realizat atunci când în absența de celule T la un animal de cercetare (care se obține prin tratarea animalului cu anticorpi, care depletează celule CD4 sau CD8) nu apare nici un răspuns imun (Current Protocols in Immunology, cap. 3).
Un răspuns imun celular poate fi arătat și prin demonstrarea unei “delayed type 380 hypersensibility”, reacția DTH la animale imunizate. Pentru aceasta, se pot injecta peptide în laba piciorului de șoarece, după care se măsoară umflătura locului injectat (Grohman et al., 1995; Puccetti et al., 1994).
Inducerea unui răspuns imun umoral prin peptide, care sunt antigeni străini pentru organism, respectiv antigeni care sunt exprimați de organismul de tratat în concentrație re- 385 dusă, se poate determina prin demonstrarea de anticorpi specifici în ser. O metodă potrivită pentru determinarea titrului de anticorpi în ser este Enzyme Linked Immuno-assay (ELISA). în acest caz anticorpii specifici se demonstrează după legare la peptida utilizată pentru imunizare în reacție cu un colorant. O metodă alternativă este Western Blot. în acest caz anticorpii specifici din ser se leagă la peptida imobilizată pe o membrană. Anticorpii legați se 390 demonstrează în final din nou în reacție cu un colorant. (Referință pentru ambele metode:
Current Protocols in Immunology. Editors: Coligan et al., 1991).
RO 119344 Β1 înainte de toate, după vaccinarea cu antigeni străini, de exemplu de origine virală, este de așteptat o formare de anticorpi. Dar nu se poate exclude și că anticorpii specifici se formează și împotriva unor peptide mutate sau supraexprimate, care sunt deviate de antigenii tumorali celulari. O distrugere a tumoarei prin astfel de anticorpi ar putea avea loc după legarea anticorpilor la celulele tumorale prin alte componente ale sistemului imunitar, ca de exemplu complement, anticorpi de care depinde citotoxicitatea (ADCC) sau fagocitoză prin macrofagi (Reitt I.M. Brostoff J. Male D.K. Immunology, Churchill Livingstone).
Declanșarea unui răspuns imun celular prin peptide, care derivă din proteine, a căror acțiune imunogenă nu este cunoscută, poate fi testată de exemplu așa cum este descris de Rivoltini et al., 1995, sau Kawakami et al., 1994. Pentru aceasta sunt necesare celule T, care pot să recunoască peptidă dorită, dacă este prezentată de molecule MHC. în cazul peptidelor care provin din celule tumorale, se obțin celulele T corespunzătoare din limfocite infiltrate în tumoare (TILs), așa cum este descris de Kawakami et al. 1994; în cazul peptidelor străine se obțin astfel de celule T în mod analog din sângele periferic. Celulele T se incubează cu linii celulare cum ar fi T2 (Alexander et al., 1989) sau RMA-S (Kărre et al., 1986), care au fost tratate cu peptidă respectivă și lizate, aceasta, în cazul în care este vorba despre o peptidă imunogenă.
O altă posibilitate pentru testarea candidaților de peptidă care se leagă MHG asupra imunogenității lor, constă în aceea că, se cercetează legarea peptidelor la celule T2. Un astfel de test se bazează pe particularitatea celulelor T2 (Alexander et al,, 1989) sau a celulelor RMA-S (Kărre et al., 1986) să fie defecte în mecanismul de transport al peptidei TAP și abia atunci să prezinte în mod stabil molecule MHC, când se introduc pe ele peptide, care sunt prezentate în contextul MHC. Pentru test se utilizează de exemplu celule T2 sau celule RMA-S, care sunt transferate în mod stabil cu o genă HLA, de exemplu cu HLA-A1 și/sau HLA-A2. Dacă celulele se tratează cu peptide, care sunt liganzi buni HLA, ele sunt prezentate în contextul HLA în așa fel, încât ele pot fi recunoscute de sistemul imunitar drept străine, atunci astfel de peptide au drept efect că molecule HLA apar într-o cantitate semnificativă pe suprafața celulei. Dovedirea HLAs pe suprafața celulelor de exemplu cu ajutorul anticorpilor monoclonari, permite identificarea peptidelor adecvate (Malnati et al., 1995; Sykulev et al., 1994) și aici se utilizează în mod adecvat o peptidă standard cu o capacitate bună de legare în mod cunoscut la HLA.
în privința unei posibilități cât mai largi posibile de aplicare a compoziției farmaceutice conform invenției, se utilizează un amestec din mai multe peptide, din care fiecare se poate lega la altă moleculă MHC, de preferință la unul din doi sau trei, din subtipurile MHC cele mai des reprezentate. Cu un vaccin pe baza unui amestec de peptide care se pot lega la aceste haplotipuri, se poate cuprinde o populație largă de pacienți.
într-o formă de realizare a invenției, vaccinul poate prezenta mai multe secvențe de peptide. Peptidele folosite se pot deosebi în acest caz pe de-o parte prin aceea că ele se leagă de diferite subtipuri HLA. Prin aceasta, se poate ajunge că se pot cuprinde mai multe, respectiv toate subtipurile HLA ale unui pacient sau a unei grupe mai mari de pacienți.
O altă variabilitate, eventual suplimentară cu privire la peptidele utilizate, poate consta din aceea că peptide care se leagă la un anumit subtip HLA, se deosebesc în ceea ce privește secvența care nu este hotărâtoare pentru legătura HLA, prin aceea că derivă, de exemplu, de la diferite proteine ale aceluiași excitant patogen sau de la diferiți excitanți. Datorită unei astfel de variabilități se poate atinge o intensificare a stimulării răspunsului imun, respectiv o imunizare față de diferiți excitanți.
— Cantitatea de peptidă activă din compoziția conform invențieipoate varia într-un interval larg. Cantitatea de peptidă depinde între altele de modul de administrare și de formularea respectivă. Cantitatea de peptidă administrată poate fi de circa 1,0 pg până la cea 5000 pg
I
RO 119344 Β1 pe doză, în general 1,0 pg până la circa 1000 pg, mai ales de circa 10 pg până la circa 500 pg. Administrarea, poate avea loc o dată sau de mai multe ori, la o administrare de mai multe ori în mod corespunzător scopului de cel puțin trei ori. Mai ales la aplicarea terapeutică, aplicarea se face la anumite intervale (de exemplu 1 x pe săptămână până la 1 x lună) într-un timp de lungime dorită, care depinde de situația specifică de imunitate a pacientului, respectiv de desfășurare a bolii.
Compoziția farmaceutică, conform invenției, poate fi aplicată și ex vivo: principiul unei aplicări posibile ex vivo constă din aceea că, se cultivă APCs, de exemplu celule dendritice ex vivo, cultura de celule se incubează cu compoziția conform invenției și APCs, care acum prezintă peptidă în contextul MHC ce se administrează individului care trebuie tratat. Pentru această posibilitate de aplicare se pot utiliza metode cunoscute din literatură, ca de exemplu ale lui Porgador și Gilboa, 1995; Young și Inabe, 1996; descrise în studiile respective.
Adjuvantul conținut în compoziția conform invenției are proprietatea de a înlesni intrarea peptidei în celule, respectiv legarea peptidei la celulele pacientului și de a intensifica imunogenitatea peptidei. Adjuvantul are drept scop să facă, de exemplu, ca membranele celulelor în care peptidă trebuie să pătrundă, să fie cel puțin permeabile pe termen scurt, pentru ca astfel să transporte peptidă în celulă. Pentru aceasta ar fi avantajos, dar nu neapărat necesar, ca peptidă să fie legată de adjuvant, de exemplu prin acțiune de schimb electrostatic, între peptidă electronegativă și adjuvantul policationic. Se poate ajunge la un transport al peptidei în celulă și prin aceea că peptidă pe baza apropierii spațiale la membrana celulei poate ajunge prin ea, imediat ce adjuvantul a realizat permeabilitatea ei. Acțiunea adjuvantului se poate baza și pe aceea că mărește concentrația critică a peptidei la suprafața celulei, pentru primirea, în celulă sau că realizează fagocitoza sau transportul de lichid (pinocitoza) de peptid în celulă.
în mod surprinzător, prezența adjuvantului nu intensifică numai preluarea peptidei în celulă, ci intensifică și acțiunea imunomodulatoare a peptidei, care se poate explica printro prezentare corectă a peptidei prin molecula MHC.
într-o formă de realizare, adjuvanții pot fi (între alții) în principiu toate substanțele care au acțiunea de permeabilizare a membranei, care se utilizează pentru transportul acizilor nucleici în celulă; în legătură cu aceasta se face referire de exemplu la dezvăluirea din WO 93/19768, unde sunt menționate asemenea substanțe.
într-o formă preferată de realizare a invenției, adjuvantul este un acid poliamino sau un amestec de poliaminoacizi bazici.
Gradul de polimerizare a poliaminoacizilor poate varia într-un interval larg. El este de circa 5 până la circa 1000, dar mai ales circa 15 până la circa 500.
Preferabil, se utilizează în cadrul invenției de față, drept adjuvant poliarginina.
Un alt adjuvant preferat în cadrul invenției de față este polilizina.
Exemple pentru alți compuși organici mai ales policationici (poliaminoacizi bazici) sunt polimitina, histona, protamina, polietileniminele, sau amestecuri din aceștia.
Adjuvantul este, eventual, conjugat cu un ligand celular, de exemplu, cu transferină, gp120, LDL (Lew Density Lipoprotein), a//a-fetuin, EGF (Epidermal Growth Factor) -peptide sau cu un reprezentant din alți liganzi celulari, care sunt descriși în WO 93/07283 pentru transportul de ADN prin endocitoză mijlocită de receptori, esteri de hidrați de carbon, cum ar fi manoza sau fructoza (liganzi pentru macrofagi) sau anticorpi (fragmente) împotriva proteinelor de pe suprafața celulelor.
Eventual, există adjuvanți policationici, cum ar fi poliarginină sau polilizină, care sunt eventual conjugați cu un ligand celular, ca parte componentă a unui complex cu ADN, de exemplu sub formă do plasmid ADN.
ADN poate fi lipsit de secvențe care codifică proteina funcțională, în acest caz ADN este o plasmidă goală.
445
450
455
460
465
470
475
480
485
490
RO 119344 Β1 într-o formă de realizare a invenției, ADN conține secvențe care codifică pentru proteine imunomodulatoare, mai ales citocine cum ar fi IL-2, interferoni, GM-CSF.
Pentru a cerceta mecanismul transportului de peptidă, înlesnit prin poliaminoacizi bazici, s-a măsurat în cadrul invenției de față punerea în libertate a lactatuui de hidrogenază (LDH). Pe când în probele tratate cu poliarginină concentrațiile de LDH pusă în libertate nu au fost detectabile, după incubația cu polilizină s-au detectat în celule concentrații, ridicate de LDH. în aceste rezultate, acțiunea polilizinei se poate explica printr-o permeabilizare a membranei celulei.
Fără a dori să ne fixăm asupra teoriei, se pare că acțiunea compoziției farmaceutice conform invenției constă din aceea că peptidă pătrunde cu ajutorul adjuvantului în celulele respective sau se leagă la celule, care apar în zona endodermică a pielii. Celulele de atac sunt între altele celule care prezintă antigen, din care peptidă, eventual după procesare, este prezentată de celulele B și/sau celulele T. Exemple pentru celulele de atac sunt: macrofagele, fibroblastele, cheratinocitele, celulele Langerhans, celulele dendritice sau celulele B.
în cadrul invenției de față s-a cercetat dacă peptidele mici sunt preluate în prezența poliaminoacizilor bazici sau a formelor glicozilate ale unui polication, într-o cantitate intensificată de către celule care prezintă antigen de tipul macrofagilor (APCs). Din resturile de zahăr utilizat se cunoaște că ele sunt preluate de macrofage prin endocitoză, mijlocită de receptor. (Despre APCs se consideră că ele reprezintă in vivo tipul de celulă, care preia peptidele și le prezintă altor celule imune. Rezultate ale unor cercetări in vitro, care arată că APCs în prezența adjuvanților testați endocitează cantități mărite de antigeni de peptidă, sunt o dovadă, că acești adjuvanți sunt adecvați și in vivo, de a intensifica prezentarea peptidelor față de celulele efector, precum și de a le activa în mod intensificat, ceea ce duce în final la un răspuns imun intensificat față de “target” conținută în vaccin).
Ca adjuvanți se pot folosi și componente sub formă de particule, eventual în plus față de adjuvanții menționați mai sus. Pentru particule se pretează în principiu materiale, care se utilizează și pentru material de coloane în sinteza de peptide, de exemplu gel de silice și rășini sintetice, în măsura în care sunt acceptabile din punct de vedere fiziologic și se pot obține din ele particule, care sunt destul de mici, pentru a ajunge în celule. Cu ajutorul adjuvanților sub formă de particule, se poate ajunge la concentrații ridicate locale pe peptidă, ceea ce înlesnește preluarea lor în celule.
Felul adjuvantului utilizat, oportunitatea modificării lui cu un ligand celular, respectiv adausul de ADN, precum și cantitatea necesară de adjuvant în raport cu peptidă, se pot determina în mod individual și empiric, de exemplu raportul individual ales al peptidei față de adjuvant, care în principiu poate oscila într-un domeniu larg, se poate determina cu ajutorul titrării.
Testarea adjuvanților se poate face în principiu după aceleași metode ca testarea peptidei, eventual în mai multe trepte.
Capacitatea unui adjuvant să mărească legătura și/sau internalizarea unei peptide la APCs se poate măsura de exemplu în prima treaptă, prin aceea că APCs se incubează cu peptide și adjuvanți marcați prin fluorescență. O legare respectiv preluare mărită datorită adjuvantului se poate determina prin comparație cu celule care au fost tratate numai cu peptidă, prin citometria de curgere.
într-o a doua treaptă se pot cerceta adjuvanții de testare in vitro dacă și în ce măsură prezența lor într-o prezentare a unei peptide pe APCs rezultă în mod favorabil, putând să se măsoare conform metodelor descrise mai sus pentru testarea peptidei, prin concentrația MHC de pe celule.
O altă posibilitate de testare a eficienței unui adjuvant este utilizarea unui sistem de model in vitro. în acest caz se incubează APCs împreună cu adjuvanți și peptidă, și se măsoară activarea relativă a unui ion de celulă, care recunoaște în mod specific peptidă utilizată (Coligan et al., 1991; Lopez et al., 1993).
RO 119344 Β1
Eficiența formulării se poate indică și printr-un răspuns imun, prin demonstrarea unei reacții DTH “delayed-type hypersensitivity” la animale imunizate.
în cele din urmă, acțiunea imunomodulatorie a formulării a fost măsurată în cerce- 545 tarea pe animale. Pentru aceasta, se pot folosi, între altele, modele de tumori stabilite, la care sunt cunoscute secvențe de peptidă de către celulele imune. Vaccinul se aplică, în rapoarte variate de peptidă și adjavant conținut față de peptidă și adjuvant și de cantitatea totală. Protecția față de creșterea tumoarei este o măsură care arată eficacitatea vaccinului contra tumorilor. 550
Compoziția fammaceutică poate fi administrată parenteral topic, oral sau local. De preferință ea se aplică parenteral, de exemplu subcutan, intradermal sau intramuscular, de preferință subcutanat sau intradermal, pentru ajunge mai ales la celulele pielii (cheratinocite, fibroblaste), celule dendritice, celule Langerhans sau macrofage, ca celule-țintă. în cadrul unei terapii a tumorii, vaccinul împotriva tumorilor se poate administra șiintratumoral. 555
Compoziția conform invenției, pentru administrarea parenterală, se află,în general,ca soluție sau suspensie a peptidei și a adjuvantului într-un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic, de preferință,într-un purtător lichid, apos. Ca purtători apoși se pot folosi de exemplu apa, apă tamponată, soluție de sare (0,4 %), soluție de glicină (0,3%), acid hialuronic și alți purtători similari cunoscuți. în afară de purtătorii apoși se pot folosi și solvenți 560 cum ar fi dimetilsulfoxid, propilen-glicol, dimetilformamidă și amestecuri din aceștia. Compoziția mai poate conține în afară de aceștia, substanțe auxiliare acceptabile din punct de vedere farmaceutic, cum ar fi substanțe tampon, precum și săruri anorganice, pentru a ajunge la o presiune osmotică normală și/sau la o liofilizare activă. Exemple pentru astfel de adausuri sunt: săruri de sodiu și de potasiu, de exemplu cloruri și fosfați, zaharoză, glucoză, 565 hidrolizate de proteină, dextran, polivinilpirolidonă sau polietilenglicol. Compozițiile pot fi sterilizate prin tehnici obișnuite, de exemplu prin filtrarea sterilă. Compoziția poate fi direct umplută sau liofilizată sub această formă și poate fi amestecată înainte de utilizare cu o soluție sterilă.
într-o formă de realizare a invenției, compoziția farmaceutică se află sub formă de 570 formulare topică, de exemplu, pentru aplicare dermală respectiv transdermală. Compoziția farmaceutică poate, de exemplu, să se afle ca hidrogel pe bază de acid poliacrilic sau poliacrilamidă (ca Dolobene*, Merckle), ca unguent, de exemplu cu polietilenglicol (PEG) ca vehicol, cum ar fi unguentul standardizat DAB 8 (50% PEG, 50% PEG 1500), sau ca emulsie, mai ales ca microemulsie de apă-în-ulei, eventual și cu adaus de lipozomi. Ca accele- 575 rator de permeabilitate (“remorcher”) se pretează, între alții, derivații de sulfoxid cum ar fi dimetilsulfexid (DMSO) sau decilmetilsulfoxid (decil-MSO) precum și transcutol (dietilen-glicolmonoetileter) sau ciclodextrine, apoi pirolidone, de exemplu 2-pirolidonă, N-metil-2-pirolidonă, acidul 2-pirolidon-5-carboxilic sau substanța de descompunere biologică N-(2-hidroxietil)-2-pirolidonă și esterii ei de acid gras, derivați de uree, cum ar fi dodeciluree, 1,3-dido- 580 deciluree și 1,3-difeniluree, terpene, de exemplu D-limonen, menton, a-terpinol, caevol, limonenoxid sau 1,8-cineol.
Alte forme de aplicare sunt aerosolii, de exemplu, pentru administrare ca spray pentru nas sau pentru inhalare.
Compoziția conform invenției poate fi administrată și cu ajutorul lipozomilor, care pot 585 fi prezenți sub formă de emulsii, spume, micelii, monostraturi insolubile, dispersii de fosfolipid, straturi lamelare și altele asemănătoare. Acestea se folosesc drept vehicul, pentru a transporta lipidele în direcția unui țesut anumit, de exemplu la un țesut limfoid sau la un țesut de tumoare, respectiv să prelungească durata de acțiune a peptidei.
în cazul prezentei compoziției conform invenției, ca formulare topică, aceasta poate 590 conține și absorbanți UV, pentru a acționa de exemplu la aplicarea profilactică împotriva melanomului, în același timp ca agent de protecție împotriva, soarelui.
RO 119344 Β1
Specialistul în materie poate să preia, substanțe ajutătoare și formulări adecvate din manuale standard cum ar fi Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990.
- fig.1, vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva mastocitomului P815 cu peptida KYQAVTTTL;
- fig.2, vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva mastocitomului P815 cu peptida SYFPEITHI;
- fig.3, vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva mastocistomului P815 cu peptida SYFPEITHI;
- fig.4, vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva melanomului M-3 cu un amestec de peptide;
- fig.5, vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva melanomului M-3 cu ajutorul unei aplicații topice; ;
- fig.6, vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva metastazelor melanomului M-3;
- fig.7, vindecarea șoarecilor purtători de micrometastaze M-3, după vaccinarea cu un amestec de peptide;
- fig.8, încărcarea mijlocită de polilizină a celulelor cu tirozinază;
- fig. 9, activarea celulei T după vaccinarea în modelul terapeutic (punerea în libertate a IFN-gama a celulelor de splină a animalelor vaccinate ca reacție asupra celulelor M-3);
- fig. 10, inducerea imunității antivirale cu ajutorul nucleocapsid-peptidei ASNENMETM de influență și a polilizinei fucosilate drept adjuvant (activare CTL);
- fig.11, intensificarea legării de peptide la APC prin poliaminoacizi bazici;
- fig. 12, permeabilizarea membranei celulei prin poliaminoacizi bazici (punerea în libertate de LDH după tratarea celulelor cu polilizină sau poliarginină);
- fig.13, internalizarea peptidelor prin poliarginină;
- fig.14, transport de peptide în celule care prezintă antigen din măduva osoasă;
- fig. 15, mărirea transportlui de peptide în celule care prezintă antigen cu ajutorul poliaminoacizilor policationici și a histonelor;
- fig. 16, eficiența transportului în dependență de gradul de polimerizare a aminoacizilor bazici;
- fig. 17, transport de peptide cu poliarginine cu greutate moleculară redusă;
- fig. 18, influențarea eficienței transportului în funcție de încărcarea peptidei.
în exemplele care urmează s-au utilizat, dacă nu se indică altfel, următoarele materiale și metode:
A) Celule
a) Linii de celule
Linia de celule de melanom al șoarecelui Cloudman S91 (Klon M-3; ATCC No. CCL 53.1), linia de mastocitom P815 (ATCC Nr. TIB 64) și linia de monicite macrofage P388D1 (ATCC TIB 63) au fost dobândite de la ATCC. Celulele au fost completate în mediu DMEM cu conținut ridicat de glucoză (High Glucose DMEM, LifeTechnologies) și s-au cultivat cu 10% FCS, 2 mM L-glutamină și 20 pg/ml gentamicină. Celulele au fost testate conform rutinei, pentru lipsa de contaminare cu micoplasme (PCR-Mycoplasma Detection Kit, Stratagene).
Linia de celule murine RMA/S (limfom de șoarece) s-a descris de către Kărre et al., 1986 și de Ljunggren et al., 1990.
b) Celule prezentând antigen din măduva osoasă
Mai întâi, s-au spălat oase din femurul șoarecilor DBA/2. Celulele de măduvă osoasă au fost cultivate în modiu DMEM cu conținut ridicat de glucoză, conținând 10% FCS, 5% ser de cal, 2 mM L-glutamină și 20 pg/ml gentamicină în prezența a 200 unități, de GM-CSF de șoarece (Li et al., 1989; Genzyme, Cambridge, MA, USA). în timpul primelor cinci zile s-au
RO 119344 Β1 schimbat la fiecare 24 h doua treimi de mediu, pentru a îndepărta granulocite ne-aderente și celule B (Inaba et al., 1992). S-au recoltat atât celule aderente cât și lipite între zilele 8 și 10, prin incubație cu PBS/5 mM EDTA și s-au însămânțat la o densitate a celulelor de 3 x 104 celule pe Well pe un purtător de obiect al microscopului 8-Well (Nune, Roskilde, Danemarca). Mai mult decât 90% din celule au arătat o reacție pozitivă cu anticorpul F4/80 (Endogen, Cambridge, MA, USA).
B) Sinteza peptidelor
Peptidele au fost sintetizate pe un Peptid-Synthesizer (model 433 A cu Feedbackmonitor, Applied Biosystems.Foster City, Canada) cu utilizarea de TentaGEL S PHB (Rapp, TObingen ca fază solidă după metoda Fmoc (activarea HBTU, Fastmoc™ scara 0,25 mmol). Peptidele au fost dizolvate în 1M TEAA, pH 7,3 și au fost purificate prin cromatografie reversă pe o coloană Vydac C 18. Secvențele au fost confirmate cu ajutorul spectrometriei de masă în timp de zbor pe un Lasermat MAT (Finnigan, San Jose, Canada).
645
650
655
C) Lista peptidelor utilizate
Denumirea peptidei | Secvența | Antigenul aferent | Aminoacid numerotare în proteină | Haplotip MHC |
kpep117 | SYFPEITHI | tirozinkinaza JAK1 | 355-363 | H2-Kd |
kpep118 | KYQAVTTTL | Tum-P198 | 14-22 | H2-Kd |
kpep162 | GPPHSNNFGY | Tum-P35B | 4-13 | H2-Kd |
kpep163 | ISTQNHRAL | P91A | 12-20 | H2-Kd |
kpep164 | LPYLGWLVF | P815 | 35-43 | H2-Kd |
kpep143 | RYAEDYEEL | trp-1 | H2-Kd | |
kpep145 | PYLEQASRI | tirozinaza | H2-Kd | |
kpep146 | YYVSRDTLL | tirozinaza | H2-Kd | |
kpep150 | YYSVKKTFL | trp-1 | H2-Kd | |
ASNENMETM | peptidă nucleokapsi d-influenza | H2-Kb |
660
665
670
Amestecuri de peptide
Amestec de peptide I pentru vaccinuri de melanom M-3: kpep 143, kpep 145, kpep 146, kpep 150.
Amestec de peptide III pentru vaccin de mastocitom P815: kpep 117, kpep 118, kpep 675 182, kpep 163, kpep 164.
D) Obținerea vaccinurilor
D1) Vaccinuri de peptide individuale
a) Vaccinurile de peptide individuale fără adjuvant s-au obținut prin preluarea peptidei într-o concentrație de 1 mg/ml în PBS. Timpul de incubare până la injecție a fost de 4 h la 680 temperatura ambiantă.
b) Vaccinuri de peptidă individuală cu polilizină (dacă nu se indică altfel, în continuare polilizina utilizată având o lungime a lanțului de 200) ca adjuvant, s-au ohfinnt prin aceea că peptidă și polilizina s-au amestecat în cantitățile indicate în HBS. Timpul de inhibare până la injecție a fost de 4 h, la temperatura ambiantă.
685
RO 119344 Β1
i) Pentru a obține un vaccin cu un conținut de 16 pg de peptidă activă s-au amestecat 11,8 pg de polilizină cu 160 pg peptidă kpep 117 într-un volum total de 1 ml HBS.
ii) Pentru a obține un vaccin cu un conținut de 100 pg peptidă activă s-au amestecat 74 pg polilizină cu 1 mg peptidă kpep 117 într-un volum total de 1 ml HBS.
c) S-au obținut vaccinuri de control cu peptide individuale cu Incomplete Freund's Adjuvans (IFA) prin aceea că peptidă și IFA s-au emulsionat în cantitățile indicate. Timpul de incubare până la injecție a fost de 30 min la temperatura ambiantă.
i) Pentru un vaccin de control, conținând 16 pg peptidă activă, s-au emulsionat 192 pg peptidă kpep 117 în 600 pl HBS cu 600 pl IFA.
ii) Pentru un vaccin de control, conținândIOO pl peptidă activă, s-au emulsionat 1,2 mg peptidă kpep 117 în 600 pl HBS cu 600 pl IFA.
D2) Amestecuri de peptide ca vaccin
a) Amestecul de peptide I drept vaccin de control fără adjuvant a conținut 250 pg din fiecare peptidă kpep 143, kpep 145, kpep 146, kpep 150 într-un volum total de 1 ml PBS.
b) Amestecul de peptide III drept vaccin de control fără adjuvant a conținut 250 pg din fiecare peptidă kpep 117, kpep 118, kpep 162, kpep 16 kpep 164 într-un volum total de 1 ml PBS.
c) Amestecul de peptide I ca vaccin cu polilizină ca adjuvant s-a obținut, prin aceea că s-a amestecat 1 mg amestec de peptidă (conținând 250 pg din fiecare peptidă) cu 74 pg polilizină în HBS. Timpul de incubare până la injecție a fost de 4 h, la temperatura camerei.
d) Amestecul de peptide III ca vaccin cu polilizină ca adjuvant s-a obținut, prin aceea că s-a amestecat 1,25 mg amestec de peptide III (conținând 250 pg din fiecare peptidă) cu 93 pg polilizină în HBS. Timpul de incubare până la injecție a fost de 4 h, la temperatura camerei.
e) Amestecul de peptide I ca vaccin de control cu adjuvant Freund incomplet s-a obținut, prin aceea că s-au emulgat 1,2 mg amestec de peptidă I în 600 pl HBS (conținând 300 pg din fiecare peptidă) cu 600 pl IFA. Timpul de incubare până la injecție a fost de 30 min, la temperatura camerei.
f) Amestecul de peptide III ca vaccin de control cu Incomplete Freund’d Adjuvans a fost obținut prin aceea că s-au emulsionat 1,5 g amestec de peptide III în 600 pl HBS (conținând 300 pg din fiecare peptidă) cu 600 pl IFA. Timpul de incubare până la injecție a fost de 30 min, la temperatura camerei.
g) Pentru administrarea topică cu polilizină ca adjuvant, s-a incubat 1 mg amestec de peptide I (conținând 250 pg din fiecare peptidă) cu 74 pg polilizină timp de 4 h, într-un volum total de 400 pl HBS. Amestecul obținut s-a amestecat prin agitare în 1,6 g din hidrogelul DOLOBENE (Merckle).
h) Pentru administrarea topică a unui vaccin de control fără adjuvant s-a amestecat prin agitare 1 mg amestec de peptide (conținând 250 pg din fiecare peptidă) într-un volum total de 200 pl HBS în 1,8 g din hidrogelul DOLOBENE (Merckle).
i) Obținerea de polilizină cuplată cu fucoză (lungimea lanțului: 240 respectiv 200) s-a efectuat prin metoda descrisă de MacBroom et al., 1992, obținându-se o substituire de circa 40% (materialele inițiale: befa-L-fucopiranosilfenil-izotiocianat și polilizină au fost obținute de la Sigma).
j) Dacă s-au utilizat conjugate de transferină/polilizină (obținute, așa cum se descrie în WO 93/07283, cantitatea a fost reglată în așa fel încât cantitatea absolută de polilizină a fost de 75 pg pe mg peptidă. Dacă s-a integrat plasmida-ADN (plasmida PSP65, liberă de LPS, Boehringer Mannheim) în complecși, raportul a fost de 37,5 pg ADN/ 75 pg polilizină/ 1 mg de peptidă. în cazul utilizării de 160 pg în loc de 1 mg de peptidă, cantitățile pentru celelalte componente s-au redus cu acelaș factor (6,25).
RO 119344 Β1
E) Injecția vaccinurilor 735 înainte de injecția subcutană, șoarecii au fost anesteziați în grupe de până la opt animale într-o cameră aerisită, izolată. După tratamentul timp de 3,5 min cu Halothan (4% în
O2, rata de curgere 4) șoarecii au fost anesteziați circa 1 min; în acest timp s-a injectat vaccinul subcutan.
Injecția intraperitoneală a avut loc fără anestezie prealabilă. Volumul de injecție a fost 740 pentru fiecare vaccin de100 pl pe animal; aceasta corespunde la 100 pg peptidă individuală sau amestec de peptide I pe fiecare animal. în cazul amestecului de peptide III s-au aplicat 125 pg de cantitate totală de peptide pe fiecare șoarece.
F) Aplicarea topică a vaccinurilor
Pentru fiecare șoarece s-au aplicat pe animalele epilate 200 mg de unguent, care 745 conținea 100 pg peptidă sau amestec de peptide I respectiv 125 pm amestec de peptide I, prin frecare pe piele, și anume în zona spatelui și la urechi. Cantitatea exactă a fost controlată cu un cântar.
G) Aplicarea vaccinurilor împotriva creșterii tumorii la modelul șoarece
Protocolul testării eficienței vaccinurilor contra cancerului, la modelul șoarece, a 750 corespuns profilactic sau terapeutic, dacă nu s-a indicat altfel principiului descris în WO 94/21808, utilizându-se ca model de șoarece modelul DBA/2.
Se prezintă, în continuare, câteva exemple de realizare
Exemplul 1. Vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva mastocitomului P815
160 pg din peptidă secvenței KYQAVTTTL (kpep 118) derivată din antigenul de tu- 755 moare P815, descris de Lethe et al., 1992, dintr-un ligand de H2-Kd, s-au amestecat cu 11,8 pg polilizină 300 în 500 pl HBS și s-au incubat 4 h, la temperatura ambiantă. Apoi s-au adăugat 500 pl EBSS (soluție de sare tamponată Earl). S-au administrat 100 pl din amestecul obținut la fiecare din cei 8 șoareci la, un interval de o săptămână. După această preimunizare s-au provocat, după încă o săptămână, tumori, prin aceea că s-au injectat fiecărui 760 șoarece contralateral 5 x10 celule din linia de celule de mastocitoză P815 (ATCC Nr. TIB64; aceste celule exprimă artigenul de tumoare din care este derivată peptidă P815) în 100 pl EBSS. Rezultatul acestor încercări este reprezentat în fig.1 (pătratele pline).
într-o cercetare paralelă, s-au amestecat 200 pg din peptidă cu 500 pl HBS și apoi s-au emulsionat cu 500 pl adjuvant Freund. Cu câtelOO pl din emulsia obținută s-au preimu- 765 nizat 8 șoareci și apoi s-au provocat tumori cu celule P815, așa cum s-a menționat mai sus (fig.1: cercuri pline).
Pentru încă o încercare paralelă s-au obținut vaccinuri celulare împotriva tumorilor după cum urmează:
160 pg peptidă kpep 118 s-au amestecat cu 3 pg transferin-polilizină (RfpL), 10 pg 770 pL și 6 pg plasmidă psp65 (liberă de LPS) în 500 pl tampon HBS. După 30 min la temperatura ambiantă, soluția de mai sus a fost introdusă într-o butelie de cultură celulară T 75 cu 1,5 x 10 celule din linia de celule fibroblaste alogene NIH3T3. (ATCC Nr. CRL 1658) în 20 ml mediu DMEM (10% FCS, 20 mM glucoză) și s-a incubat la 37°C. După 3 h, celulele au fost tratate cu 15 ml mediu proaspăt și s-au incubat la 37°C și 5% CO2. 4 h înainte de aplicare 775 celulele au fost iradiate cu 20 Gy. Prelucrarea vaccinurilor a avut loc așa cum s-a descris în WO 94/21808. Preimunizarea cu acest vaccin a fost efectuată la un interval de o săptămână cu 10 celule; după încă o săptămână s-a realizat așezarea tumorii, așa cum s-a descris mai sus (fig.1: triunghiuri pline). S-a demonstrat, că vaccinurile, care au conținut peptidă unificată cu polilizină, au protejat cel mai bine șoarecii de formarea tumorilor.
780
RO 119344 Β1
Exemplul 2. Vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva mastocitomului P815 cu un ΐ vaccin cu o singură peptidă
a) S-au testat trei vaccinuri cu o singură peptidă, conținând fie peptidă kpep 117 singură în PBS (fig.2a), peptidă kpep 117, emulsionată în IFA (fig.2b), sau peptidă kpep 117 cu polilizină (lungimea lanțului: 240) ca adjuvant (fig.2c), asupra acțiunii de protecție împotriva unei tumori P815.
Vaccinurile au fost obținute, așa cum s-a descris mai sus în paragraful D. Volumul de injecție a fost de fiecare dată de 100 pl; injecția a fost efectuată subcutan (s.c.) sau intraperitoneal (i.p.). Șoareci simplii au folosit drept control negativ, un vaccin de celulă întreagă, constând din celule P815 care secretă GM-CSF drept control pozitiv (P815-GM-CSF; 10 celule în 100 μΙ au fost injectate subcutan la fiecare animal). Fiecare grupă de încercare a constat din opt animale, s-au efectuat trei vaccinări (sc) la intervale de șapte zile. La o săptămână după ultima vaccinare, animalele au obținut o provocare de tumoare contralaterală cu 5 x10 celule P815. Animalele au fost inspectate zilnic, iar apariția de tumori a fost controlată săptămânal.
Peptidă kpep 117 cu polilizină ca adjuvant a atins cea mai bună acțiune antitumorală, dacă s-au injectat 100 pg pe animal subcutan (trei din opt animale au fost protejate). Acest efect a fost aproape la fel de bun ca cel cu vaccin cu celule întregi (patru animale din opt au fost protejate). 16 pg peptidă împreună cu polilizină pe animal a fost mai puțin eficientă (două animale au fost protejate), dar în mod clar fiind mai eficientă decât 100 pg peptidă în PBS (fig.2a, nici un efect de protecție). Nici dacă a fost emulsionată în IFA, peptidă nu a obținut efectul pe care l-a produs împreună cu polilizină (fig.2c).
b) într-o altă experimentare în modelul mastocitom P815, s-au comparat între ele două polilizine nemodificate cu lungimea diferită a lanțului, una scurtă cu numai 16 radicali de lizină (pL 16) și una lungă cu 240 radicali (pL240). Li s-a injectat animalelor din grupele de control, 100 pm peptidă kpep 117 fie dizolvată în PBS, fie emulsionată în IFA. S-au folosit drept control pozitiv două vaccinuri celulare secretând GM-CSF (vezi a)), un vaccin fiind obținut din celule stabile transferate P815 și cel de al doilea vaccin fiind obținut prin transfecție tranzientă cu utilizarea metodei descrise de Wagner et al., 1992 (AVET). Ambele vaccinuri de celule întregi au conferit protecție la patru respectiv cinci, dintr-un total de opt animale. Vaccinurile pe bază de peptide, care erau formate numai din peptidă sau peptidă emulsionată în IPA, au arătat o lipsă totală a efectului de protecție; toate animalele au dezvoltat tumori, după introducerea tumorilor. Dacă totuși peptidă a fost administrată împreună cu polilizină, vaccinul de peptidă a protejat animalele împotriva instalării de tumori; două din opt animale au fost protejate dacă s-a utilizat polilizină lungă (pL240), și patru din opt animale în cazul polilizinei scurte. Aceste rezultate care sunt reprezentate în fig.3 arată că o singură peptidă, dacă este administrată cu polilizină ca adjuvant, are ca efect o protecție eficientă antitumorală; care este comparabilă cu unul din vaccinurile de celulă întreagă, cel mai eficient, care este remarcat în literatură ca standard pentru vaccinarea antitumorală (Dranoff et al., 1993; Schmidt et al. 1995).
Exemplul 3. Vaccinarea șoarecilor DBA/2 împotriva mastocitomului P815 cu un vaccin antitumoral conținând o singură peptidă P815 sau amestecuri de peptide P815
Pentru obținerea vaccinurilor, s-au utilizat următoarele peptide: kpep118 (100 pg pe injecție).
Amestec de peptide III (kpep 117, kpep 118, kpep 162, kpep 163, kpep 164) acest amestec de peptide conținea toate peptidele P815 cunoscute până acum; pentru fiecare injecție s-au administrat 25 pg din fiecare peptidă).
Drept control pozitiv s-au utilizat celule P815 care secretă GM-CSF.
în încercările preliminare s-a dovedit kpep 117 ca fiind peptidă cu efectul de protecție-------- t cel mai bun împotriva unei instalări de tumoare P815, dacă s-a utilizat 100 pg peptidă împreună cu polilizină (7,5 pg polilizină/100 pg peptidă, corespunzând raportului standard
RO 119344 Β1 polilizină: cu lungimea lanțului = 200). O cantitate mai mică (16 pg) kpep 117 a fost mai puțin eficientă. în acest exemplu s-au injectat 100 pg kpep pe animal și anume o dată numai cu polilizină (grupa B), o dată cu transferină-polilizină (grupa C) și o dată cu transferină-polilizină/ADN (grupa D). Drept control s-a utilizat kpep 118 cu IFA. în această experimentare 835 kpep 118 singur, nu a arătat nici o acțiune de protecție împotriva instalării de tumoare.
în încercările efectuate în exemplul 4 s-a arătat că un vaccin conținând un amestec de peptide din peptide de melanon, prezintă o acțiune de protecție față de melanom. De aceea s-a testat în acest exemplu, dacă concepția amestecului de peptide se pretează și pentru P815. Amestecul de peptidă III s-a administrat o dată numai cu polilizină (grupa E), 840 o dată cu transferină-polilizină (grupa P) și o dată cu transferină-polilizină/ADN (grupa G). Drept control s-a utilizat amestecul de peptide III în IFA. Drept control negativ s-au utilizat șoareci simpli; drept control pozitiv s-au utilizat celule P815 transferate GM-CSF (10s celule pe șoarece).
Cercetările realizate în acest exemplu s-au dezvoltat, în comparație cu alte cercetări, 845 într-un mod mai mult atipic în grupa de control pozitivă (celule care secretă GM-CSF); toate animalele au căpătat, imediat după introducerea tumorilor, tumori, din care majoritatea au dispărut la fel de repede cum au apărut. O explicație posibilă pentru aceasta este că tumoarea a crescut o vreme, înainte de a fi distrusă. O altă explicație posibilă ar fi, că umflătura diagnosticată drept tumoare nu a provenit din creșterea de tumoare, ci de la un infiltrat 850 puternic de celulă imună (granulom). Dat fiind că animalele nu au fost supuse disecției, nu s-a putut stabili definitiv cauza; în orice caz, tumorile instalate au fost în cele din urmă distruse. Un alt rezultat interesant a fost obținut în grupa G, în care animalele au fost tratate cu o combinație din amestec de peptidă III și polilizină. Toate animalele au dezvoltat tumori, dar la două din animale, mărimea umflăturii tumorii (respectiv a infiltratului de celulă imună) a 855 fost relativ mică, nu a crescut și șoarecii nu arătau ca nefiind sănătoși. Aceste două animale nu au fost omorâte, ci ținute mai departe sub observație. în mod surprinzător, tumorile, la nouă săptămâni după introducerea de tumori, nu au mai fost detectabile, un rezultat neobservat până acum. Două din opt animale au distrus în cele din urmă tumorile lor. Distrugerea tumorilor se pare că se explică prin conținutul de kpep 117 în amestecul de peptide, ceea 860 ce este în analogie cu exemplul 2, unde două din opt animale cu 16 pg kpep 117 și trei din opt animale cu 100 pg kpep 117 au fost protejate. Efectul de protejare ar putea fi provocat și prin mai mult decât o peptidă a amestecului.
Exemplul 4. Protecția șoarecilor DBA/2 împotriva, melanomului M-3 prin preimunizare cu un vaccin împotriva tumorilor, care conține un amestec de peptide 865
S-a utilizat un vaccin profilactic, care a conținut un amestec de peptide de melanom (amestec de peptide I, paragraful D2).
Protocolul preimunizării cu vaccin precum și instalarea tumorilor a corespuns cu protocolul descris în exemplul 2, cu deosebirea ca, instalarea tumorii s-a efectuat cu celule M3 (105 celule pe animal). Drept vaccin de control s-a utilizat un vaccin dintr-o celulă întreagă 870 din celule M-3, care secretă o cantitate optimă de IL-2 (1000-2000 unități pentru 105 celule) și care a fost obținut așa cum s-a descris de către Schmidt et al., 1995. în condițiile alese de testare, acest vaccin a obținut o protecție de 100% (fig.4). S-a administrat la patru grupe de animale de testare, vaccinuri cu amestecul de peptide. Două grupe au primit peptidele emulsionate în IFA, fie s.c. fie i.p. Celelalte grupe au primit peptidele împreună cu polilizină 875 (pL240) fie s.c., fie i.p.
Fig.4 ilustrează efectul de protecție al vaccinurilor cu polilizină (pL240) ca adjuvant; 50% din șoarecii tratați au fost protejați împotriva provocării tumorii M-3 în comparație cu animalele netratate, în care s-au dezvoltat repede tumori solide. Acest efect a putut fi obținut, dacă vaccinul peptidă-polilizină a fost injectat subcutan sau a fost aplicat ca hidrogel pe 880
RO 119344 Β1 piele (fig.5). în celelalte grupe de control, care au fost tratate cu vaccinuri peptid/polilizină
i.p. sau cu peptide în IFA, vaccinurile au fost în esență ineficiente. Aici tumorile instalate nu au fost respinse și tumorile au crescut în comparație cu animalele de control netratate, cu o întârziere mică. Aceste rezultate arată că un amestec de peptidă într-un vaccin duce la un efect de protecție antitumoare, dacă conține polilizină. în condițiile alese de testare acest vaccin de peptidă a fost numai pe jumătate atât de eficient ca vaccinul celular IL-2, care, în concordanță cu rapoartele apărute de puțin timp (Zatloukal, 1993, Zatloukal 1995), a protejat până la 100% din animale împotriva instalării tumorilor cu 105 celule vii M3.
Exemplul 5. Protecția șoarecilor DBA/2 împotriva metastazelor M-3
a) S-a utilizat un vaccin terapeutic, care a conținut un amestec de peptide de melanom (amestec de peptide I, descris în paragraful D2). S-au administrat trei vaccinări (s.c.) la un interval de o săptămână. Prima vaccinare a avut loc la cinci zile după instalarea metastazei, s-a vaccinat apoi împotriva unei metastaze de cinci zile. S-au injectat 1,2 x 104 celule M-3 pentru instalarea metastazei, s-a utilizat protocolul descris în WO 94/91808 și în Schmidt et al., 1996.
Ca vaccin, s-a utilizat amestecul de peptide I: fără adjuvant (pepmix 1 PBS) cu IFA drept adjuvant (IFa pepmix 1) sau cu polilizină modificată cu fucoză (fpL pepmix 1). Grupele de control nu au primit vaccin (simple) sau vaccinurile de celule totale menționate în exemplul 4IL-2 care produc M-3. Fig.6 arată, că cea mai bună protecție s-a obținut în grupa, care a fost tratată cu amestecul de peptide I cu polilizină modificată cu fuGoză ca adjuvant (fig.6a). 50% din șoareci au putut să respingă metastaza (4/8). Acest tratament a fost chiar mai eficient decât cel cu vaccinul cu celula întreagă, care a protejat numai 33% din șoareci (3/9). Vaccinul de peptidă cu IFA sau fără adjuvant a dus numai la o întârziere de creștere a metastazei de tumoare (fig.6b).
b) într-un alt experiment s-a cercetat în modelul terapeutic acțiunea de protecție a unui vaccin, care a conținut amestecul de peptide I și a fost administrat subcutan. Grupe de control au obținut amestecul de peptide în PBS (fără adjuvant) sau cu IFA. Ca adjuvant s-a utilizat polilizină 240 nemodificată. în afară de aceasta s-a folosit ca adjuvant polilizină modificată cu fucoză (fpL200). Drept control s-a preluat în acest experiment o grupă de animale cu vaccinul celular care exprimă IL-2. Așa cum se arată în fig.7a, vaccinul peptidă/polilizină a fost eficient la tratarea metastazelor M3. O rată semnificativă de vindecare a fost realizată în această testare numai cu polilizină modificată cu fucoză. Cu acest tratament, 50% din animale au respins metastaza, care în comparație cu vaccinul IL-2, în acest caz a vindecat 70% din animale, a fost o valoare bună.
c) într-un alt experiment, s-a testat în modelul terapeutic, cum acționează modificările și schimbările policationului asupra eficienței antitumorale. în acest caz, s-au testat, în plus, la polilizină nemodificată și la polisina 200 modificată cu fucoză, polizina nemodificată scurtă, pL 16, o polilizină pL 450 și un alt polication, și anume poliarginina (pArg720). Drept control pozitiv s-a utilizat un vaccin M3 celular, într-o cantitate optimă (> 10 ng pe 10 celule) care secretă GM-CSF (Schmidt 1995). Și în această testare grupele de control au conținut amestecul de peptidă în IFA sau fără oricare adjuvant. Ca în exemplul 5b) cel mai bun efect a fost obținut atunci când s-a utilizat drept adjuvant fucoză-polilizină, fig.7b. în aceste grupe, 40% din animale au respins metastaza, în comparație cu 30% în grupa cu polilizină scurtă pL 16. în afara grupei, care a primit peptidele împreună cu poliarginina, animalele celorlaltor grupe, cărora le-a fost administrat un vaccin cu peptidă, au prezentat numai o scurtă întârziere la formarea de tumori. Poliarginina nemodificată a fost în această testare la fel de eficientă ca polilizină modificată cu fucoză; ea a dus la respingerea metastazelor la patru din zece animale.
RO 119344 Β1
Fig.7c arată repetarea acestui efect obținut prin poliarginină într-un experiment independent. Și aici a arătat ca vaccinarea cu amestecul de peptidă în legătură cu poliarginină 930 prezintă o acțiune antitumorală la patru din opt animalele tratate.
Exemplul 6. Transîncărcarea de celule cu tirozinază cu utilizarea de polilizină drept adjuvant
Acest exemplu a servit ca testare care trebuia să arate, că polilizină drept adjuvant este adecvată pentru încărcarea celulelor cu fragmente de proteină mai mari sau proteine 935 întregi, utilizându-se, drept celule, celule M-3.
Pentru încărcarea celulelor, s-au tratat mai întâi 160 pg tirozinază marcată FITC (EG 1.14.18.1; Sigma) cu 3 pg polilizină (pl_240) și s-au incubat 3 h, la temperatura ambiantă. Apoi s-a pus soluția obținută la într-o butelie de cultură de celule T 75 cu 2 x 10® celule M-3 și s-a incubat la 37°C. După aceea, celulele s-au spălat de două ori cu PBS, s-a dizolvat cu 940 PBS/2 ml EDTA și s-a preluat în 1 ml PBS/5% FCS pentu analiza FACS. Fig.8 arată încărcarea celulelor M-3 cu tirozinază (curba din stânga arată controlul, cea din dreapta, încărcarea cu tirozinază).
Exemplul 7. Determinarea activării celulei T după imunizare în modelul terapeutic
După ce vaccinul peptidă/polication în modelul terapeutic de șoarece (vezi exemplul 945 5) a arătat, în mod clar, o eficacitate; s-a cercetat, dacă acest tratament duce și la activarea celulelor T. Pentru aceasta, s-au folosit secrețiile de citochină după coincubația de celule de splină a animalelor vaccinate cu celule M3 parenterale care țineau, loc de marcatori (Kawakami et al., 1994b).
S-au obținut suspensii de celule individuale de splină, din animale vaccinate și ne- 950 tratate, urmate de liza eritrociteor cu tampon hipotonic (0,15 NH4CI, 1 ml KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Celulele aderente au fost îndepărtate, incubând 3 x10 celule de splină pe ml mediu DMM (10% FCS) în cupe Petri timp de 90 min la 37°C. Celulele neaderente au fost co-cultivate prin pipetare cu grijă și co-cultivare cu 1 x 103 celule parenterale, în rapoarte diferite de cantități. Celulele au fost cultivate în 200 μΙ mediu DMEM (10% FCS), 2 mM L-glu- 955 tamină și 20 pg/ml gentamicină în capsule de cultură a țesuturilor cu fundul plat. în ziua 9 s-au recoltat 100 μΙ de supernatant și s-a măsurat conținutul respectiv de IFN-gama cu utilizarea unui Kit ELISA obținut din comerț (Endogen, Cambridge, MA, USA) după prescripția furnizorului. S-a dovedit că după nouă zile de incubație, numai celulele de splină de la animale vaccinate au secretat cantități mai mari de IFN-gama în mediu, pe când în coculturile 960 de celule de splină a animalelor netratate și celule M3, practic nu s-au putut detecta IFNgama. Rezultatul acestor testări este reprezentat în fig .9.
Exemplul 8. Inducerea imunității antivirale cu ajutorul peptidei de nucleocapsidă de influenza ASNENMETM și a polilizinei fucosilate ca adjuvant
S-a folosit un vaccin care, la 1 mg de peptidă ASNENMETM, a conținut 75 pg fpLys. 965 Vaccinul a fost administrat printr-o singură injecție, așa cum este indicat în partea de metodă fiecărui animal injectându-se 100 pg peptidă/7,5 pg fpLys. Pentru control a avut loc injecția a 100 pg peptidă singură (PBS), respectiv nu s-a efectuat nici o injecție (control simplu).
Celulele de limfom-șoarece-RMA-S au fost incubate în mediu lipsit de ser la 26°C, cu 10 pg/ml peptidă ASNEMETM. 970
La 10 zile după vaccinare, s-au izolat celule din splina animalelor vaccinate, s-au amestecat cu celule RMA-S încărcate cu peptidă în proporția 5:1 și s-au cultivat mai departe timp de cinci zile (Stuber et al., 1994). Numărul de celule de splină efector supraviețuitoare în diferitele culturi a fost determinat, apoi celulele s-au amestecat pentru determinarea activității CTL cu ajutorul încercării de punere în libertate de Europium (Blomberg et al., 1993) 975 standardizate, timp de 4 h în diferite rapoarte cu celule RMA-S, care au fost tratate în
RO 119344 Β1 prealabil cu peptidă ASNENMETM și cu Europium-Chelat. Așa cum se arată în fig. 10, imunitatea specifică, în această încercare a fost realizată numai prin vaccinarea cu peptidă și cu fpLys, totuși nu atunci când s-a administrat peptidă singură.
Exemplul 9. Testarea diferiților poliaminoacizi bazici asupra capacității lor de a intensifica internalizarea și/sau legarea de peptide la APCs
Pentru aceste teste s-a utilizat un test de fluorescență: un model de antigen de peptidă cu secvența LEEAIEGFL (MHC restrâns Kd) a fost marcat cu colorantul de fluorescență izotiocianat de fluoresceină (FITG) conform instrucțiunilor furnizorului (Molecular Probes). Preluarea, respectiv legarea, peptidei marcate FITC (“pulsed”) sau împreună cu aminoacizi bazici de diferite concentrații (polilizină cu o lungime a lanțului de 16 până la 490, poliarginină cu o lungime a lanțului de 15 până la 720) prin care linia de celule de macrofage monocite restrânsă Kd MHC P388D1 restrânsă Kd a fost măsurată cu ajutorul citometriei de curgere. Pentru aceasta 1 x 106 celule P388D1 într-un volum final de 1 ml mediu (DMEM/10% FCS) s-au incubat în țevi mici de centrifugă cu peptidă marcată FITC singură sau cu un amestec din peptidă și poliaminoacid, timp de 30 min, la 37°C și apoi s-au spălat în mod intensiv, pentru a îndepărta peptidă liberă. Poliaminoacizii s-au adăugat într-o concentrație de 50, 25, 12, 6 și 3 pg pe ml de mediu, conținând 5 pg de peptidă marcată FITC. Intensitatea relativă a fluorescenței a diferitelor probe s-a comparat, pentru a aprecia eficienta preluării și/sau legării peptidei. Rezultatul acestor testări este reprezentat în fig.11; testările au fost realizate cu câte 25 pg pL 450 respectiv pArg450. în condițiile alese, poliarginina s-a dovedit a fi de cinci ori mai eficientă decât polilizină.
Exemplul 10. Cercetarea mecanismului prin care peptidele sunt preluate de APCs
Peptidele pot fi preluate de APCs prin mecanisme specifice, cum ar fi macropinocitoza sau endocitoză mijlocită de receptor (Lanzavecchia, 1996)
Un mecanism alternativ poate consta din aceea că poliaminoacizii fac ca membrana să fie permeabilă și, în acest mod, se dă posibilitatea difuzării de peptide din mediu în citoplasmă.
a) Dacă are loc o permeabilizare a membranei celulei, s-a testat prin măsurarea punerii în libertate a enzimei citoplasmatice la lactat dehidrogenază (LDH) după incubația celulelor P388D1 cu poliaminoacizi (polilizină sau poliarginina) în condiții izotonice, cu utilizarea chitului obținut din comerț (Cytotox 96, Promega, Madison, Wisconsin, USA). După prescripția furnizorului, pe baza rezultatelor obținute în fig. 12a se presupune, că acțiunea lui pLys constă în aceea că face ca membrana celulei să devină permeabilă, ceea ce reiese din concentrațiile ridicate ale enzimei citoplasmatice puse în libertate în condiții izotonice. Spre deosebire de aceasta, după tratamentul cu pArg (fig. 12b) nu se detectează practic nici un LDH. La comparația de probe, care au fost tratate numai cu poliaminoacizi, nu s-a constatat nici o deosebire față de tratarea cu un amestec de polilizină sau poliarginină cu peptidă, la punerea în libertate a LDH. După incubația cu peptidă singură nu s-a demonstrat nici o activitate LDH măsurabilă.
b) Dacă are loc o internalizare a peptidelor marcate FITG în prezența sau în absența poliaminoacizilor bazici, a fost cercetat pe baza principiului publicat de Midoux et al. 1993:
Particule internalizate de celule au fost transportate în endozomi. în comparație cu citoplasmă sau cu mediul de cultură de celule, care prezintă valori pH neutre, aceste organe sunt acide, cu un pH de circa 5.
Fluorescență emisă de FITC este dependentă în mare măsură de pH. într-un mediu ambiant cu condiții de pH așa cum sunt de găsit în endozomi, fluorescență este înăbușită. De aceea peptide markate de FITC, care sunt preluate de celule în endosomi, arată o fluorescentă micșorată. La adaus de monenzină, valoarea redusă a pH-ului endozomilor este neutralizată, ceea ce duce la o fluorescență intensificată măsurabilă a peptidelor internalizate marcate FITC.
RO 119344 Β1
Celulele au fost incubate cu un amestec de poliarginină (interval de greutate moleculară medie 100.000, lungimea lanțului 490) și peptidă marcată prin fluorescență la 4°C sau 37°C. O cotă alicotă a probelor incubate la 37°C a fost reținută și a fost tratată înainte de analiza citometrică de curgere, la 4°C cu 50 μΜ monenzină.
S-a dovedit, că incubația APCs cu anumiți poliaminoacizi bazici cum ar fi polilizină (pLys) și poliarginină (pArg) intensifică preluarea, respectiv legarea peptidelor la APCs.
Așa cum rezultă din fig. 13, la celule care au fost tratate numai cu peptidă și cu monenzină, s-a observat numai o creștere redusă a fluorescenței. Spre deosebire de acestea, semnalele de fluorescență în probe, care au fost tratate cu monenzină și un amestec de poliarginină și peptidă, au fost mult mai puternice. Nu s-a observat nici o preluare de peptidă, dacă probele au fost incubate la 4°C. O creștere semnificativă a fluorescentei după tratarea cu monenzină arată că încărcarea realizată cu pArg duce la acumularea lor în vezicule, în interiorul celulei (Midoux et al., 1993; fig. 13). Așa cum s-a așteptat, după tratarea cu monenzină a probelor încărcate cu polilizină, s-a observat numai o creștere redusă a fluorescenței. încărcarea cu polilizină la 4°C a avut ca efect o creștere măsurabilă a fluorescenței, care este încă o dovadă, că acțiunea polilizinei se explică în principal printr-o permeabilizare a membranei celulelor (fig. 12b).
Exemplul 11. Cercetarea încărcării APCs cu peptide scurte
APCs provenind din măduva osoasă, obținute cu GM-CSF, s-au cercetat cu o combinație dintr-o peptidă marcată prin fluorescență plus polilizină (pl_200; Sigma) sau cu peptidă singură cu ajutorul microscopiei cu fluorescență. Pentru dovedirea microscopică a preluării peptidei s-au însămânțat APCs pe purtătorul de obiect și s-au incubat cu 40 pg de peptidă LFEAIEGFI marcată cu fluoresceină singură sau cu un amestec de 50 pg/ml polilizină (pl_200) și 40 pg/kl peptidă LFEAIEGFI, 30 min, la 37°C. După spălare în exces, celulele au fost fixate cu 4% para-formaldehidă, s-au acoperit cu anti-Fadent (Dako, Glostrup, Danemarca) și s-au supus microscopiei cu fluorescență (Zeiss). Miezurile au fost colorate cu 4,6diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma). Așa cum se demonstrează în microfotografiile cu fluorescență din fig. 14, celulele, care au fost incubate cu peptidă și polizină (A) au preluat în mod mai intens peptida, decât celulele care au fost tratate numai cu peptidă (B). Pe când fluorescența la celulele care au fost tratate numai cu peptidă (“pulsed”) apare numai pe anumite părți, la celulele tratate cu peptidă în prezența polilizinei apare o fluorescență intensă, nelocalizată și repartizată în general mai uniform pe întreaga celulă.
Exemplul 12. Determinarea cantitativă a încărcării celulelor cu peptidă cu ajutorul citometriei de curgere (“Transloading Assay”)
a) După ce s-a demonstrat prin cercetările realizate în exemplul 11, că APCs sunt celule excepționale pentru încărcarea cu peptide mici, s-au realizat testări FACS in vitro, pentru a identifica adjuvanți adecvați pentru vaccinurile cu peptidă. Această încercare permite o testare cantitativă rapidă a peptidelor marcate cu fluorescență; ca peptidă model, s-a folosit peptida cu secvența LFEAIEGFI. în aceste testări s-au folosit ca APCs linia de celule de șoarece P388D1. 1 χ 106 celule s-au incubat într-un volum final de 1 ml mediu DMEM cu conținut ridicat de glucoză și 10% FCS 30 min la 37°C cu 5 pg peptidă la o concentrație finală de fluorescență de 5 nmol/ml. Celulele au fost tratate fie numai cu peptidă, fie cu o combinație de peptidă și policationi sau de peptidă și histone la concentrații crescânde (3 până la 50 pg/ml), așa cum se arată în fig.15. S-au utilizat următorii compuși: A: poliornitină (greutate moleculară medie la un interval în jurul lui 110.000, lungimea lanțului 580); B: histonă bogată în arginină; C: histonă bogată în lisină; D: poliarginină (greutatea moleculară medie 100.000, lungimea lanțului 490); E: polilizină (greutate moleculară medie 94.000, lungimea lanțului 450).
1030
1035
1040
1045
1050
1055
1060
1065
1070
RO 119344 Β1 în testări preliminare s-a dovedit, că un timp de incubație de 30 min a dat o preluare masivă a peptidei. Un tratament mai îndelungat (4, respectiv 8 ore) nu a dat o mărire semnificativă a semnalului de fluorescență. înainte de analiză celulele au fost spălate de 5 x cu un volum mare de PSS, conținând 0,2% BSA. Celulele au fost preluate din nou în 1 ml PBS/0,2 BSA rece ca gheața și s-au cercetat prin citometrie cu curgere (FACScan; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
Poliarginina și polilizina s-au dovedit a fi adjuvanții cei mai eficienți; poliomitina a arătat în condițiile date un efect citotoxic. Intensificarea preluării de peptide prin poliarginină și polilizină a fost corelată cu concentrația (fig. 15 d, e); preluarea crește cu lungimea lanțului (fig.16).
S-a observat, că poliarginina cu o creștere de 3 zecimi prezintă față de control, un interval mal larg adecvat cu concentrația decât polilizina, care a arătat o creștere maximală de mai puțin decât 2 zecimi, și că poliarginina este mai eficientă la toate lungimile de lanț pentru transportul proteinelor decât polilizina (fig.16); poliarginina dă posibilitatea unui transport eficient la concentrații atât de aici cum ar fi 3 pg/ml, pe când pentru polilizină au fost necesare concentrații de peste 25 pg/ml, pentru a realiza o creștere semnificativă a fluorescenței (fig. 15, d, e).
b) Pentru a stabili dacă pentru transportul de peptide există o limită inferioară a lungimii lanțului, s-au sintetizat poliarginine cu diferite lungimi de lanț (10-30 radicali) și s-a cercetat capacitatea lor de a crește transportul de peptidă la concentrații ridicate ale policationilor (fig. 17). Pentru aceste testări s-a folosit peptidă LFEAISGFI: polimerii de poliarginină a fost testați într-o concentrație de 100 pg/ml.
O creștere, chiar dacă a fost mică, a transportului de peptidă s-a observat deja la poliarginina cea mai scurtă testată.
c) Aminoacizii bazici sunt molecule încărcate pozitiv. De aceea, se poate presupune, că peptide încărcate negativ s-ar putea lega de acești policationi prin acțiuni de schimb electrostatice, ceea ce duce posibil la o preluare mai intensă a peptidelor. Pentru a testa această ipoteză, s-a comparat capacitatea poliaminoacizilor cationici să preia peptide scurte în funcție de încărcarea lor în celule P388D1. în tabelul care urmează sunt menționate peptidele încărcate negativ, utilizate, care îndeplinesc toate condițiile pentru legarea la MHC-I (Rammensee et al., 1995). Peptidă 1 este derivată din TRP-șoarece (“Tyrosinase related protein”), peptidă 2 provine din hemaglutinina de Influenza (Schmidt et al., 1996), peptidă 3 derivă din tirosinaza de șoarece, peptidă 4 din antigenul de tumoare P198, peptidă 5 de la beta-galachtozidază (Gavin et al., 1993), (“Mr” reprezintă intervalul de greutate moleculară, “fluor” reprezintă fluoresceină).
Tabel
Secvența | gr.mol. | gr.m.fluores. | încărcare | încărcare + fluores. |
YAEDYEEL | 1031 | 1389 | 4 x negativ | 6 x negativ |
LFEAIEGFI | 1038 | 1396 | 2 x negativ | 4 x negativ |
IFMNGTMSQV | 1127 | 1485 | neutru | 2 x negativ |
KYQAVTTTL | 1024 | 1382 | 1 x pozitiv | 1 x negativ |
TPHPARIGL | 961 | 1319 | 2 x pozitiv | neutru |
Pe baza metodei utilizate pentru marcarea peptidei cu fluoresceină, se introduc două încărcături negative. S-a dovedit că, după incubare cu poliarginină, peptidele (5 nmol pe
RO 119344 Β1 probă) cu cifra cea mai mare de încărcături negative sunt transportate în modul cel mai eficient în celule P386D1, ceea ce indică faptul că un efect de schimb ionic între peptidă și polication mărește și mai mult transportul de peptidă în celule (fig.18). Totuși în comparație cu celule care au fost tratate numai cu peptide și în cazul peptidelor neutre, s-au preluat cantități mai mari în prezența policationilor. Tratarea numai cu peptide a dat la toate peptidele testate semnale de fluorescentă aproape identice; din motive de prezentare, în fig. 18 se arată semnalul de fluorescentă obținut cu peptidă LFEAIEGFI.
Claims (33)
- Revendicări1. Compoziție farmaceutică, ce conține cel puțin o peptidă, proteină sau fragment de proteină cu efect imunomodulator, împreună cu un adjuvant, caracterizată prin aceea că adjuvantul prezintă capacitatea de a întări legătura peptidei, respectiv a proteinei sau fragmentului de proteină la celule ce prezintă antigen, respectiv să întărească preluarea acestuia în aceste celule și, prin aceasta, să producă o intensificare a acțiunii imunomodulatoare a peptidei, respectiv a proteinei sau fragmentului de proteină.
- 2. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că peptidă, respectiv produsul de descompunere celular al proteinei sau fragmentului de proteină se leagă la cel puțin o moleculă MHC, care este exprmată de individul ce trebuie tratat.
- 3. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că peptidă, respectiv produsul de descompunere celular al proteinei sau fragmentului de proteină, se leagă la o moleculă MHC -I.
- 4. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că peptidă, respectiv produsul de descompunere celular al proteinei sau fragmentului de proteină, se leagă la o moleculă MHC -II.
- 5. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările precedente, caracterizată prin aceea că aceasta conține o peptidă, care derivă dintr-o proteină a unui patogen.
- 6. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că peptidă este derivată dintr-o proteină bacteriană.
- 7. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 6, caracterizată prin aceea că peptidă este derivată dintr-o proteină virală.
- 8. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 1... 4, pentru folosirea, drept vaccin împotriva tumorilor, caracterizată prin aceea că proteina este un antigen de tumoare respectiv fragmentul de proteină sau peptidă respectiv peptidele sunt derivate dintrun antigen sau din antigeni de tumori.
- 9. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 8, pentru folosire terapeutică, caracterizată prin aceea că antigenul de tumoare respectiv antigenii de tumori, este, respectiv, sunt derivați din antigenii de tumori, care sunt exprimați de către individul ce trebuie tratat.
- 10. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 8, pentru aplicare profilactică, caracterizată prin aceea că antigenii de tumori sunt derivați din reprezentanții de antigeni de tumori care apar în mod frecvent.
- 11. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 8...10, caracterizată prin aceea că antigenul de tumoare, respectiv antigenii de tumori sunt antigeni de melanom.
- 12. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 8...11, caracterizată prin aceea că mai conține în afară de aceasta o citochină.
- 13. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 12, caracterizată prin aceea că citochină este aleasă din grupa IL-2, IL-4, IL-12, IFN- alfa, IFN-befa, IFN-gama, IFN-omega, TNF-a//a, GM-CSF, sau amestecuri din aceștia.
- 14. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 2...11, caracterizată prin aceea că aceasta conține mai multe peptide, care se deosebesc prin aceea că ele se leagă la subtipuri MHC diferite ale individului ce trebuie tratat.112511301135114011451150115511601165117θRO 119344 Β1
- 15. Compoziție farmaceutică conform uneia din revendicările 2 până la 14, caracterizată prin aceea că aceasta conține una sau mai multe peptide, care derivă dintr-o proteină imunogenă, care apare, în mod natural, sau dintr-un antigen de tumoare, respectiv sub forma unui produs de descompunere celular din acesta.
- 16. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 2...14, caracterizată prin aceea că aceasta conține una sau mai multe peptide, care sunt diferite de peptidele care sunt derivate din proteine imunogene care apar în mod natural sau din antigeni de tumori, care sunt derivate din aceștia sub forma unor produși de descompunere celulari.
- 17. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că peptidă este un antagonist al unei peptide, care derivă dintr-o proteină, ce provoacă o îmbolnăvire autoimunitară.
- 18. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările precedente, caracterizată prin aceea că adjuvantul este un polication organic sau un amestec de policationi organici.
- 19. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 18, caracterizată prin aceea că peptidă este încărcată negativ.
- 20. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 18 sau 19, caracterizată prin aceea că adjuvantul este un poliaminoacid sau un amestec de poliaminoacizi bazici.
- 21. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 20, caracterizată prin aceea că adjuvantul este poliarginină.
- 22. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 20, caracterizată prin aceea că adjuvantul este polilizină.
- 23. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 18...21, caracterizată prin aceea că adjuvantul este conjugat cu un ligand celular.
- 24. Compoziție farmaceutică conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că ligandul este un radical de hidrat de carbon.
- 25. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 24, caracterizată prin aceea că ligandul este fucoză.
- 26. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că ligandul este transferină.
- 27. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 18...26, caracterizată prin aceea că mai conține și ADN, care este lipsită de secvențe care codifică proteine funcționale.
- 28. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 18...26, caracterizată prin aceea că mai conține și ADN, care codifică o proteină imunomodulatoare.
- 29. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 28, caracterizată prin aceea că proteina imunomodulatoare este o citochină din grupa IL-2, IL-4, IL-12, IFN-a/fe, IFN-beta, IF N-gama, IFN-omega, TNF-a/fe, GM-CSF.
- 30. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 1... 29, pentru administrare parenterală.
- 31. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că este prezentă ca soluție sau suspensie a peptidei sau adjuvantului într-o substanță purtătoare acceptabilă farmaceutic.
- 32. Compoziție farmaceutică, conform uneia din revendicările 1... 29, pentru administrare topică.
- 33. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 32, sub forma unui hidrogel.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19607044A DE19607044A1 (de) | 1996-02-24 | 1996-02-24 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
DE19638313A DE19638313C2 (de) | 1996-09-19 | 1996-09-19 | Pharmazeutische Zusammensetzung für die Immunmodulation |
DE19648687A DE19648687A1 (de) | 1996-11-25 | 1996-11-25 | Pharmazeutische Zusammensetzung für die Immunmodulation |
PCT/EP1997/000828 WO1997030721A1 (de) | 1996-02-24 | 1997-02-21 | Pharmazeutische zusammensetzung für die immunmodulation beruhend auf peptiden und adjuvantien |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RO119344B1 true RO119344B1 (ro) | 2004-08-30 |
Family
ID=27215945
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RO98-01305A RO119344B1 (ro) | 1996-02-24 | 1997-02-21 | Compoziţie farmaceutică pe bază de peptide şi adjuvanţi cu efect imunomodulator |
Country Status (35)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7105162B1 (ro) |
EP (1) | EP0881906B2 (ro) |
JP (1) | JP4184433B2 (ro) |
KR (1) | KR100457647B1 (ro) |
CN (1) | CN1177610C (ro) |
AR (1) | AR005945A1 (ro) |
AT (1) | ATE274350T1 (ro) |
AU (1) | AU722264B2 (ro) |
BG (1) | BG63682B1 (ro) |
BR (1) | BR9707694A (ro) |
CA (1) | CA2243559C (ro) |
CO (1) | CO4600681A1 (ro) |
CZ (1) | CZ295396B6 (ro) |
DE (1) | DE59711873D1 (ro) |
DK (1) | DK0881906T4 (ro) |
EE (1) | EE04481B1 (ro) |
ES (1) | ES2225951T5 (ro) |
HK (1) | HK1017257A1 (ro) |
HR (1) | HRP970100B1 (ro) |
HU (1) | HU224410B1 (ro) |
ID (1) | ID16038A (ro) |
IL (1) | IL125361A (ro) |
MY (1) | MY119276A (ro) |
NO (1) | NO983850L (ro) |
NZ (1) | NZ332020A (ro) |
PE (1) | PE55398A1 (ro) |
PL (1) | PL189413B1 (ro) |
PT (1) | PT881906E (ro) |
RO (1) | RO119344B1 (ro) |
RS (1) | RS50101B (ro) |
SI (1) | SI0881906T2 (ro) |
SK (1) | SK284582B6 (ro) |
TR (1) | TR199801649T2 (ro) |
TW (1) | TW585774B (ro) |
WO (1) | WO1997030721A1 (ro) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2494737C2 (ru) * | 2008-03-27 | 2013-10-10 | Нестек С.А. | Способы увеличения абсорбции пептидов, пептидомиметиков и других субстратов гастроинтестинального транспортного белка |
Families Citing this family (60)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RS50101B (sr) | 1996-02-24 | 2009-01-22 | Boehringer Ingelheim International Gmbh., | Farmaceutski preparati za imunomodulaciju |
DE19803453A1 (de) * | 1998-01-30 | 1999-08-12 | Boehringer Ingelheim Int | Vakzine |
EP2286834A3 (en) * | 1998-02-25 | 2012-01-25 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES, as represented by THE SECRETARY OF THE ARMY | Use of skin penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance transcutaneous immune response |
CA2325818C (en) * | 1998-04-20 | 2008-09-02 | Torrey Pines Institute For Molecular Studies | Topical immunostimulation to induce langerhans cell migration |
CA2362204C (en) * | 1999-02-17 | 2011-11-08 | John Cooper Cox | Immunogenic complexes and methods relating thereto |
DE19909503A1 (de) * | 1999-03-04 | 2000-09-07 | Boehringer Ingelheim Int | Tumorassoziiertes Antigen |
US6809179B1 (en) | 1999-08-04 | 2004-10-26 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Tumor-associated antigen (R11) |
AT408721B (de) * | 1999-10-01 | 2002-02-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend ein antigen |
AT409085B (de) * | 2000-01-28 | 2002-05-27 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Pharmazeutische zusammensetzung zur immunmodulation und herstellung von vakzinen |
US20020009491A1 (en) * | 2000-02-14 | 2002-01-24 | Rothbard Jonathan B. | Compositions and methods for enhancing drug delivery across biological membranes and tissues |
AT409762B (de) * | 2000-04-13 | 2002-11-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Verfahren zur identifizierung von zytokin sekretierenden zellen |
AT410173B (de) | 2000-06-08 | 2003-02-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Antigene zusammensetzung |
KR20020014459A (ko) * | 2000-08-18 | 2002-02-25 | 서진호 | 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법 |
JP2004519453A (ja) * | 2001-01-05 | 2004-07-02 | インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト | ポリカチオン性化合物の用途 |
US7244438B2 (en) | 2001-01-05 | 2007-07-17 | Intercell Ag | Uses for polycationic compounds |
CA2433794A1 (en) * | 2001-01-05 | 2002-07-11 | Intercell Ag | Uses for polycationic compounds as vaccine adjuvants |
AT410798B (de) | 2001-01-26 | 2003-07-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Verfahren zur identifizierung, isolierung und herstellung von antigenen gegen ein spezifisches pathogen |
FR2824326B1 (fr) * | 2001-05-04 | 2004-03-19 | Commissariat Energie Atomique | Melange de peptides issus des proteines e6 et/ou e7 de papillomavirus et leurs applications |
EP1450821A1 (en) * | 2001-12-07 | 2004-09-01 | Intercell AG | Immunostimulatory oligodeoxynucleotides |
US20050221350A1 (en) * | 2002-05-29 | 2005-10-06 | Toni Weinschenk | Method for identifying immunoreactive peptides |
AU2003254585A1 (en) | 2002-07-24 | 2004-02-16 | Intercell Ag | Antigens encoded by alternative reading frame from pathogenic viruses |
JP2006504687A (ja) | 2002-09-13 | 2006-02-09 | インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト | C型肝炎ウイルスペプチドの単離方法 |
JP5116971B2 (ja) | 2002-10-15 | 2013-01-09 | インターセル アーゲー | B群連鎖球菌の接着因子をコードする核酸、b群連鎖球菌の接着因子、およびその使用 |
SI1601770T1 (sl) | 2003-03-04 | 2010-01-29 | Intercell Ag | Streptococcus pyogenes antigeni |
JP4676426B2 (ja) | 2003-03-24 | 2011-04-27 | インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト | 改良型ワクチン |
CA2520868A1 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-14 | Intercell Ag | Staphylococcus epidermidis antigens |
CA2522238A1 (en) | 2003-04-15 | 2004-10-28 | Intercell Ag | S. pneumoniae antigens |
CA2522986A1 (en) | 2003-05-07 | 2004-11-18 | Intercell Ag | Streptococcus agalactiae antigens i + ii |
WO2004106367A2 (en) | 2003-05-30 | 2004-12-09 | Intercell Ag | Enterococcus antigens |
JP4734241B2 (ja) | 2003-07-11 | 2011-07-27 | インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト | Hcvワクチン |
ES2297688T3 (es) | 2004-03-12 | 2008-05-01 | Intercell Ag | Procedimiento para solubizar mezclas de peptidos. |
DE102004038134B4 (de) | 2004-08-05 | 2013-07-25 | Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main | Multivalente Chelatoren zum Modifizieren und Organisieren von Zielmolekülen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung |
ES2344739T3 (es) | 2004-09-24 | 2010-09-06 | Intercell Ag | Proteina capsidial vp1 modificada del parvovirus b19. |
DE602005015605D1 (de) * | 2004-10-29 | 2009-09-03 | Intercell Ag | Hcv impfstoff für chronische hcv patienten |
JP5050144B2 (ja) | 2005-04-20 | 2012-10-17 | 満 明石 | アジュバントとしてのポリアミノ酸 |
EP1887084A1 (en) * | 2006-08-10 | 2008-02-13 | International Investment and Patents SA | Plasmids with immunological action |
CN101516905A (zh) | 2006-09-15 | 2009-08-26 | 英特塞尔股份公司 | 疏螺旋体属抗原 |
JP2008174490A (ja) * | 2007-01-18 | 2008-07-31 | Nitto Denko Corp | 抗原性ペプチドを主成分とする薬剤 |
EP2152731A2 (en) | 2007-05-02 | 2010-02-17 | Intercell AG | Klebsiella antigens |
KR100748265B1 (ko) * | 2007-06-15 | 2007-08-10 | (주)성문엔지니어링 | 공동주택에 배선된 전선의 합선방지구조 |
EP2167530A2 (en) | 2007-06-18 | 2010-03-31 | Intercell AG | Chlamydia antigens |
US8747861B2 (en) | 2007-08-02 | 2014-06-10 | Biondvax Pharmaceuticals Ltd. | Multimeric multiepitope influenza vaccines |
AU2009323682A1 (en) | 2008-12-03 | 2010-06-10 | Protea Vaccine Technologies Ltd. | Glutamyl tRNA synthetase (GtS) fragments |
WO2010092176A2 (en) | 2009-02-13 | 2010-08-19 | Intercell Ag | Nontypable haemophilus influenzae antigens |
BR112012004276A2 (pt) * | 2009-08-27 | 2017-10-24 | Novartis Ag | adjuvante compreendendo alumínio, oligonucleotídeo e policátion |
CN102695501A (zh) | 2009-11-09 | 2012-09-26 | 聚光灯技术合伙有限责任公司 | 碎裂水凝胶 |
JP5864429B2 (ja) | 2009-11-09 | 2016-02-17 | スポットライト テクノロジー パートナーズ エルエルシーSpotlight Technology Partners Llc | 架橋ヒドロゲル組成物、ヒドロゲル組成物の形成方法、及びキット |
WO2011067758A2 (en) | 2009-12-02 | 2011-06-09 | Protea Vaccine Technologies Ltd. | Immunogenic fragments and multimers from streptococcus pneumoniae proteins |
US8765148B2 (en) | 2010-02-19 | 2014-07-01 | Valneva Austria Gmbh | 1C31 nanoparticles |
CA2828068C (en) | 2011-02-22 | 2019-03-19 | Biondvax Pharmaceuticals Ltd. | Multimeric multiepitope polypeptides in improved seasonal and pandemic influenza vaccines |
RU2478399C2 (ru) * | 2011-06-16 | 2013-04-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Способ получения специфического иммуномодулятора |
US20140271723A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Saint Louis University | Adjuvant compositions and methods of using thereof |
CA2984643A1 (en) | 2015-05-13 | 2016-11-17 | Agenus Inc. | Vaccines for treatment and prevention of cancer |
JP6710004B2 (ja) * | 2016-03-15 | 2020-06-17 | Repertoire Genesis株式会社 | 免疫療法のためのモニタリングまたは診断ならびに治療剤の設計 |
MX2018014602A (es) * | 2016-05-27 | 2019-06-10 | Etubics Corp | Composiciones de vacunas neoepitopos y metodos de uso de las mismas. |
EP3527216B1 (en) | 2016-10-11 | 2024-02-14 | NEC Corporation | A medicine comprising a toll-like receptor agonist, lag-3 protein, a hsp70-derived peptide and a gpc3-derived peptide |
CN107469067B (zh) * | 2017-09-05 | 2018-06-19 | 浙江大学 | 一种多肽及其改造体在制备免疫调节药物中的应用 |
EP3784688A2 (en) | 2018-04-26 | 2021-03-03 | Agenus Inc. | Heat shock protein-binding peptide compositions and methods of use thereof |
CN110870913A (zh) * | 2018-08-31 | 2020-03-10 | 成都夸常奥普医疗科技有限公司 | 氨基酸类营养素作为疫苗佐剂的应用以及包含氨基酸营养素作为佐剂的疫苗 |
CN110870912A (zh) * | 2018-08-31 | 2020-03-10 | 成都夸常奥普医疗科技有限公司 | 亚甲蓝类染料作为疫苗佐剂的应用、包含该佐剂的疫苗及其应用 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1290141A (ro) | 1968-05-31 | 1972-09-20 | ||
US4847240A (en) * | 1978-01-16 | 1989-07-11 | The Trustees Of Boston University | Method of effecting cellular uptake of molecules |
US4728639A (en) * | 1982-07-27 | 1988-03-01 | University Of Tennessee Research Corporation | Type-specific opsonic antibodies evoked with a synthetic peptide of streptococcal M protein conjugated to polylysine without adjuvant |
US6022544A (en) * | 1983-01-24 | 2000-02-08 | The John Hopkins University | Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of oligomeric forms of antigen of controlled chemistry |
US4956273A (en) * | 1985-10-24 | 1990-09-11 | Southwest Foundation For Biomedical Research | Synthetic peptides and method of use for diagnosis and vaccination for AIDS and ARC |
BE1000587A4 (fr) | 1986-06-13 | 1989-02-14 | Oncogen | Coordinats et procedes en vue d'augmenter la proliferation des lymphocytes b. |
DE346022T1 (de) * | 1988-06-10 | 1990-05-23 | Medical Research Council, London, Gb | Peptidfragmente von hiv. |
WO1990004412A1 (en) * | 1988-10-27 | 1990-05-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Liposome immunoadjuvants containing il-2 |
WO1991009869A1 (en) | 1990-01-05 | 1991-07-11 | Medical Research Council | Hiv-1 core protein fragments |
US5342774A (en) | 1991-05-23 | 1994-08-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1 |
US6235525B1 (en) | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
AU682308C (en) | 1992-04-03 | 2006-08-17 | Regents Of The University Of California, The | Self-assembling polynucleotide delivery system |
ES2225824T3 (es) | 1992-08-31 | 2005-03-16 | Ludwig Institute For Cancer Research | Nonapeptido aislado derivado del gen mage-3 y presentado por hla-a1, y sus usos. |
US5571711A (en) * | 1993-06-17 | 1996-11-05 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for BAGE tumor rejection antigen precursors |
US5409703A (en) * | 1993-06-24 | 1995-04-25 | Carrington Laboratories, Inc. | Dried hydrogel from hydrophilic-hygroscopic polymer |
CZ5191U1 (cs) | 1993-07-12 | 1996-09-12 | Aliatros Medical, A.S. | Farmaceutický prostředek pro imunomodulační a adjuvantní léčbu |
JP2828391B2 (ja) * | 1993-10-29 | 1998-11-25 | 東燃株式会社 | オリゴ糖を表面に有するリポソーム |
US6660276B1 (en) * | 1994-02-16 | 2003-12-09 | The University Of Virginia Patent Foundation | Peptides recognized by melanoma-specific cytotoxic lymphocytes, and uses therefor |
US6001809A (en) * | 1994-07-11 | 1999-12-14 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of leukocyte adhesion |
UY24367A1 (es) | 1995-11-23 | 2000-10-31 | Boehringer Ingelheim Int | Vacunas contra tumores y procedimiento para su produccion |
RS50101B (sr) | 1996-02-24 | 2009-01-22 | Boehringer Ingelheim International Gmbh., | Farmaceutski preparati za imunomodulaciju |
-
1997
- 1997-02-20 RS YUP-62/97A patent/RS50101B/sr unknown
- 1997-02-20 CO CO97009092A patent/CO4600681A1/es unknown
- 1997-02-21 HR HR970100A patent/HRP970100B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 AU AU18759/97A patent/AU722264B2/en not_active Ceased
- 1997-02-21 TR TR1998/01649T patent/TR199801649T2/xx unknown
- 1997-02-21 CZ CZ19982689A patent/CZ295396B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 EE EE9800255A patent/EE04481B1/xx unknown
- 1997-02-21 AT AT97905068T patent/ATE274350T1/de active
- 1997-02-21 HU HU9901186A patent/HU224410B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 MY MYPI97000683A patent/MY119276A/en unknown
- 1997-02-21 EP EP97905068A patent/EP0881906B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-21 PT PT97905068T patent/PT881906E/pt unknown
- 1997-02-21 IL IL12536197A patent/IL125361A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 DK DK97905068T patent/DK0881906T4/da active
- 1997-02-21 CA CA2243559A patent/CA2243559C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-21 BR BR9707694A patent/BR9707694A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 SK SK1145-98A patent/SK284582B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 JP JP52980697A patent/JP4184433B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-21 US US09/125,672 patent/US7105162B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-21 WO PCT/EP1997/000828 patent/WO1997030721A1/de active IP Right Grant
- 1997-02-21 CN CNB971925186A patent/CN1177610C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-21 ES ES97905068T patent/ES2225951T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-21 NZ NZ332020A patent/NZ332020A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 DE DE59711873T patent/DE59711873D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-21 KR KR10-1998-0706339A patent/KR100457647B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-21 SI SI9730672T patent/SI0881906T2/sl unknown
- 1997-02-21 PL PL97328455A patent/PL189413B1/pl unknown
- 1997-02-21 AR ARP970100701A patent/AR005945A1/es active IP Right Grant
- 1997-02-21 RO RO98-01305A patent/RO119344B1/ro unknown
- 1997-02-24 ID IDP970541A patent/ID16038A/id unknown
- 1997-02-24 PE PE1997000130A patent/PE55398A1/es not_active IP Right Cessation
- 1997-02-24 TW TW086102221A patent/TW585774B/zh not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-08-21 BG BG102714A patent/BG63682B1/bg active Active
- 1998-08-21 NO NO983850A patent/NO983850L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-05-25 HK HK99102360A patent/HK1017257A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2494737C2 (ru) * | 2008-03-27 | 2013-10-10 | Нестек С.А. | Способы увеличения абсорбции пептидов, пептидомиметиков и других субстратов гастроинтестинального транспортного белка |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RO119344B1 (ro) | Compoziţie farmaceutică pe bază de peptide şi adjuvanţi cu efect imunomodulator | |
US20080044484A1 (en) | Use of polymeric nanoparticles for vaccine delivery | |
JP5097400B2 (ja) | 複合ワクチン | |
Rincon-Restrepo et al. | Vaccine nanocarriers: Coupling intracellular pathways and cellular biodistribution to control CD4 vs CD8 T cell responses | |
CN102172397B (zh) | 树突细胞的体内靶向 | |
Faure et al. | Long‐lasting cross‐presentation of tumor antigen in human DC | |
RO115275B1 (ro) | Vaccin tumoral si procedeu de preparare | |
JP2020509067A (ja) | 糖尿病の治療のためのペプチド及び方法 | |
Shi et al. | A vaccination with boosted cross presentation by ER‐targeted antigen delivery for anti‐tumor immunotherapy | |
Otvos et al. | An insect antibacterial peptide-based drug delivery system | |
US10925960B2 (en) | Antigen delivery system | |
Rentzsch et al. | Specific protein antigen delivery to human langerhans cells in intact skin | |
Berti et al. | Reduction-Sensitive Protein Nanogels Enhance Uptake of Model and Tumor Lysate Antigens In Vitro by Mouse-and Human-Derived Dendritic Cells | |
KR101506426B1 (ko) | 화학적 고정화를 통해 안정화된 미세 막상 t 세포 백신 제조방법 | |
Elamanchili | Antigen delivery to dendritic cells using biodegradable poly (D, L-lactic-co-glycolic acid) nanoparticles | |
MXPA98003930A (en) | Vaccines against tumors and procedure for your producc |