CN102172397B - 树突细胞的体内靶向 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过抗原体内靶向于树突细胞调节免疫的组合物。组合物包含：在其上具有多个金属螯合基团的含抗原膜囊泡或含抗原脂质体的制备物；以及树突细胞上受体的配体，经由配体上金属亲和标记连接于金属螯合基团的配体。组合物进一步包含免疫调节因子。也提供制备组合物的方法。本发明进一步提供了调节免疫紊乱的方法和治疗肿瘤和感染的方法。
Description
本申请是申请日为2004年8月23日、申请号为200480028055.8、发明名称为“树突细胞的体内靶向”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
此处描述的本发明一般涉及为了疾病预防或为了治疗目的调节免疫反应而将膜相关抗原(Ag)靶向于树突细胞(DC)的制备物的组合物。更加特别地，本发明涉及修饰含Ag膜的方法，以实现了靶向分子和免疫调节因子的嫁接(engraftment)和/或掺入，允许经修饰的膜体内靶向子DC，并且有效地诱导或抑制免疫反应。甚至更加特别地，本发明涉及能够用于修饰含Ag膜结构的组合物，例如脂质体或质膜囊泡(PMV)，以实现所述膜体内有效地靶向DC，因而调节免疫性，并且使它们在免疫治疗中能够用作疫苗或疫苗样试剂以预防或治疗人类和动物疾病。
背景领域
树突细胞(DC)是一个罕见的抗原递呈细胞(APC)群，能够独特地刺激原发免疫反应，它们在癌症免疫治疗中的用途引发了很强的兴趣。1迄今，利用DC刺激有效免疫反应的尝试主要集中在涉及离体(exvivo)DC操作的过程。这个方法通常要求从患者分离DC，数量扩增，荷载抗原(Ag)(参考文献2-5)，然后重新引入患者。虽然这个过程在原理上很简单，但是有与分离和培养这类罕见细胞群相关的种种困难。6，7显然，体内将Ag直接递送到DC并且引发适当免疫反应的策略具有巨大的临床潜能。
DC源自骨髓中的祖细胞，作为未成熟细胞迁移到外周组织，在那里它们内吞Ag并进行复杂的成熟过程。Ag经由很多表面分子被内吞，包括补体受体(例如，CD11c/CD18)和内吞受体(例如，DEC-205、DC-SIGN和Toll样受体)。在Ag获得过程中，未成熟DC也接受例如细菌细胞壁脂多糖(LPS)的病原体相关分子形式的“危险信号”，或者经由例如IFN-γ的细胞因子的炎性刺激。然后DC迁移到次级淋巴器官，成熟成为感受态APC8。受体例如CD11c/CD18、DEC-205、DC-SIGN和Toll样受体在Ag捕获和递呈过程中扮演关键角色，并且主要表达在DC上。因此可以想象这些受体也能够用于体内Ag直接靶向DC。与这个观念一致，已经显示由C，当与炎性刺激剂(例如抗CD40抗体)共同给予时诱导T细胞激活9，10。相反，在没有这样的炎性刺激剂存在下，经由ScFv靶向DC的抗原诱导了T细胞的无应答性。
合成脂质体具有递送大量Ag至DC的潜能(参考文献11)，但是至今在实践中很难完成它们靶向特异性DC表面分子12，13。显然，体内联合脂质体Ag运输能力和分子识别直接靶向DC有或没有“危险信号”的多重Ag的特异性之有效策略将在简化DC免疫治疗特别是对于癌症、感染和自身免疫疾病具有巨大的潜能。
国际申请号PCT/AU00/00397(公开号WO 00/64471)中描述了当体内给予修饰的生物或合成膜或脂质体时，为了改变免疫的目的或者为了将药物和其它试剂靶向特异细胞类型或组织而修饰生物或合成膜或脂质体的方法。通过金属螯合基团的掺入或附着完成了所述膜或脂质体的修饰，因而允许拥有金属亲和标记的一个或多个靶向分子的嫁接。然而，通过将Ag靶向DC诱导的免疫反应的性质关键性地依赖于特异性免疫调节因子，例如细胞因子或“危险”信号，的存在，在PCT/AU00/00397中没有公开或提示体内引发合适的免疫反应要求膜的修饰或需要免疫调节因子。
发明概要
本发明的目的，这个申请的主题，是通过修饰所述膜提供将含有Ag的脂质体和PMV体内靶向DC的组合物，其中所述膜的修饰是经由适当免疫调节因子或“危险信号”的掺入以及能够将修饰膜靶向DC表面受体从而引发适当免疫反应的配体的嫁接。为了增强免疫以预防或治疗例如各种癌症和感染的疾病，或者为了以能够用于治疗或预防移植排斥的方式抑制对特定自体Ag的免疫，或抑制自身免疫疾病例如I型糖尿病、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症的影响，所述组合物能够用作疫苗或用于免疫治疗。
进一步地本发明的目的是提供制备合适的组合物的方法以及利用所述组合物治疗的方法。
根据本发明的第一个实施方案，提供了通过将抗原体内靶向于树突细胞调节免疫的组合物，所述组合物包含：
其表面具有多个金属螯合基团的含抗原膜囊泡或含抗原脂质体的制备物；以及
所述树突细胞上受体的配体，所述配体经由所述配体上金属亲和标记连接于所述金属螯合基团；其中，
所述含抗原囊泡或脂质体包括免疫调节因子。
根据本发明的第二个实施方案，提供了通过将抗原体内靶向于树突细胞制备调节免疫反应的组合物的方法，所述方法包括如下步骤：
i)制备含抗原膜囊泡或含抗原脂质体；
ii)通过至少一种免疫调节因子的掺入修饰所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体；
iii)通过两性分子的掺入进一步修饰所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体，其中所述两性分子当掺入于其中时包含处于所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体表面的螯合基团；以及
iv)将步骤(iii)的产物与所述树突细胞上受体的配体接触，其中所述配体包括结合于所述螯合基团的金属亲和标记。
根据本发明的第三个实施方案，提供了调节受试者免疫反应的方法，所述方法包括给予所述受试者根据第一个实施方案的组合物。
根据本发明的第四个实施方案，提供了预防或治疗受试者肿瘤的方法，所述方法包括给予受试者根据第一个实施方案的组合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体内的所述抗原是肿瘤抗原。
根据本发明的第五个实施方案，提供了预防或治疗受试者感染的方法，所述方法包括给予受试者根据第一个实施方案的组合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体内的所述抗原是来自引起感染的物质(agent)的抗原。
根据本发明的第六个实施方案，提供了根据第一个实施方案的组合物制备调节受试者免疫反应的药剂的用途。
根据本发明的第七个实施方案，提供了根据第一个实施方案的组合物制备预防或治疗受试者肿瘤的药剂的用途。
根据本发明的第八个实施方案，提供了根据第一个实施方案的组合物制备预防或治疗受试者感染的药剂的用途。
通过阅读下面本发明的详述，本发明其它的实施方案将显而易见，其中那里的描述将是之后简要描述的附随图例的参考。
附图说明
图1显示了新型螯合脂质(NTA)3-DTDA的结构。图1B是掺入进由棕榈酰-油酰-磷酸卵磷脂(POPC)和磷脂酰-乙醇胺-聚乙二醇2000(PE-PEG2000)组成的含抗原(Ag)隐形脂质体(SL)的(NTA)3-DTDA脂质图示。相似地，图1C是与图1B的那些组成相似但是没有能与荷抗原的肿瘤细胞来源的质膜囊泡(PMV)融合的PE-PEG2000的脂质体图示。SL(B)和修饰的PMV(C)两个例子中，也能包括脂质示踪物PC-BODIPY(未显示)以促进脂质体或修饰的PMV的追踪。(NTA)3-DTDA允许组氨酸标记的抗DEC-205和CD11c的ScFv Ab嫁接在脂质体上或修饰的PMV表面，从而，将这些分子靶向DC的表面分子例如DEC-205和CD11c。
图2显示了嫁接了CD11c-ScFv和DEC-205-ScFv的PMV和SL结合于DC。至于图2A，源于B16-OVA细胞的PMV与由POPC、(NTA)3-DTDA和PC-BODIPY组成的脂质体融合。然后PMV在与LTC-DC孵育和流式细胞仪定量分析细胞结合的BODIPY荧光之前，嫁接对照肽(PMV-L2)、CD11c-ScFv(PMV-CD11c)或DEC-205-ScFv(PMV-DEC-205)。图2B显示了结合于相似嫁接的由POPC、(NTA)3-DTDA、PE-PEG2000和PC-BODIPY组成的SL之LTC-DC。每个图谱是三次独立试验得到的代表性图谱。
图3显示了引流淋巴结中嫁接了ScFv的PMV靶向DC。小鼠后足垫注射已经嫁接对照蛋白质(PMV-L2)或抗CD11c(PMV-CD11c)和抗DEC-205(PMV-DEC-205)的ScFv的荧光素标记之PMV。A.注射后取出引流腘淋巴结，用生物素标记的抗CD11c mAb和PE-抗生物素蛋白链菌素染色分离的淋巴结细胞。流式细胞仪点状图显示双染色，描述了如指出的淋巴细胞的PE荧光(图i、iii和v)以及相应的FITC荧光(图ii、iv和vi)。B.用生物素标记的抗CD11c mAb和抗生物素蛋白链菌素-罗丹明染色的淋巴切片相似的试验结果，鉴别出有描述了罗丹明荧光(图像i、ii和v)和PMV荧光素荧光(图像ii、iv和vi)相应区域的荧光图像的DC。
图4显示了将嫁接的PMV和SL靶向DC刺激T细胞增生。A.同系C57BL6脾T细胞与未刺激的DC或与已经用嫁接了L2、CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv的B16-OVA PMV(左图)、嫁接了L2、CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv荷SL的SIINFEKL-6H(中图)、以及嫁接了L2、CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv含OVA的SL(右图)刺激的DC孵育。评价[3H]胸苷掺入之前培养细胞4天；结果是cpm±SEM。B.CD4+和CD8+细胞增生的刺激。CFSE标记的同系C57BL6脾T细胞与用嫁接了DEC-205-ScFv的PMV(PMV)、嫁接了DEC-205-ScFv和SIINFEKL-6H的SL(SIINFEKL-SL)以及嫁接了DEC-205-ScFv含OVA的SL(OVA-SL)刺激的DC孵育。细胞培养4天，基于CFSE稀释流式细胞仪评价增生的CD4+和CD8+T细胞的相对比例。
图5包含了用PMV和SL免疫接种小鼠的结果并显示了CTL抗肿瘤细胞活性的刺激。A.用γ-照射的B16-OVA细胞刺激4天并且源自仅仅静脉注射了PBS(PBS)、嫁接了L2肽(PMV-L2)的B16-OVA PMV、仅仅嫁接了DEC-205-ScFv的PMV(PMV-DEC-205)或与嫁接与LPS(PMV-LPS-DEC-205)、IFN-γ(PMV-IFN-γ-DEC-205)或GM-CSF(PMV-GM-CSF-DEC-205)联合的DEC-205-ScFv之PMV的小鼠脾细胞之CTL活性。B.来自如下用PMV、含SIINFEKL的SL和含OVA的SL免疫的小鼠的脾细胞(25∶1 E∶T比率)之CTL活性，如所示每个都嫁接了L2，CD11cScFv或DEC-205-ScFv。也显示了如所示与嫁接了的PMV和SL掺入的LPS、IFN-γ和GM-CSF条件下的结果。星号指出了CTL活性显著高于(n＝6..，P＜0.05；..，P＜0.01以及..，P＜0.001)用相应的嫁接了L2肽的Ag制备物免疫的小鼠。图A和B中标准51Cr释放试验评价了在指出E∶T的比率的特异性裂解。结果表示为比裂解百分比±SEM。
图6显示了用修饰的PMV和SL的免疫接种引发了肿瘤免疫。不同组的同系C57BL6小鼠用嫁接了L2、CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv的PMV；嫁接了SIINFEKL-6H和L2、CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv的SL以及嫁接了L2、CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv的含OVA的SL免疫(共三次每周一次)，如所示每个疫苗制备物单独或者与LPS或IFN-γ联合注射。用B16-OVA细胞静脉攻击小鼠，16天后取出肺并检查肺转移。结果显示了每组小鼠肿瘤灶的平均数±SEM。点状线指的是注射了PBS的对照鼠中肿瘤转移数。
图7说明了嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)敲除小鼠的抗肿瘤反应。A.如所示同系C 57BL6小鼠(嗜酸细胞活化趋化因子+/+)或C57BL6背景之上的嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠(嗜酸细胞活化趋化因子-/-)用PBS或用嫁接了L2(PMV-L2)或DEC-205-ScFV(PMV-DEC-205)的含IFN-γPMV免疫。从小鼠分离脾细胞，与γ照射的天然B16-OVA细胞共培养。标准51Cr释放试验评价在所指的E∶T比率的比裂解。结果表示为比裂解百分比±SEM。B.如上免疫小鼠，然后用B16-OVA细胞静脉攻击，16天后取出肺，检查肿瘤转移。结果显示了每组小鼠肿瘤灶平均数±SEM。
图8显示了嫁接了CD11c-ScFv和DEC-205-ScFv的BCG分支杆菌膜囊泡结合于DC。Ni-(NTA)3-DTDA与源自BCG分支杆菌的PMV联合，并用6-(荧光素-5(和6-)羧氨基)己酸琥珀酸酯标记。然后在与JAWS-II DC孵育前用对照肽(BCG-Lipo+L2)、CD11c-ScFv(BCG-Lipo+CD11c)或DEC-205-ScFv(BCG-Lipo+DEC205)嫁接PMV，之后流式细胞仪定量分析细胞结合的荧光。上图显示了BCG-Lipo+CD11c的结果而下图包含了BCG-Lipo+DEC205的结果。每个图中，左手痕迹线是JAWS-II细胞单独，中间痕迹线是BCG-Lipo+L2对照，而右手痕迹线是BCG-Lipo+CD11c或BCG-Lipo+DEC205。
图9描述了来自已经静脉免疫接种嫁接了的BCG制备物的C57/BL6小鼠脾细胞Elispot分析的结果。这些嫁接物是：L2肽作为对照(BCG超声处理物+L2)；CD11c-ScFv(BCG超声处理物+CD11c)或DEC-205-ScFv(BCG超声处理物+DEC205)。用用作制备物载体的PBS免疫接种对照小鼠。
发明详述
此处使用了下列缩写：
Ag抗原
APC抗原递呈细胞
CTL细胞毒性T淋巴细胞
DC树突细胞
IFN-γ干扰素-γ
LPS脂多糖
(NTA)3-DTDA三(次氮基三乙酸)双十四胺
OVA卵白蛋白
PMV质膜囊泡
ScFv单链抗体片段
SL隐形脂质体
此处使用术语“抗原”表示为了递呈给免疫系统而能够被DC吸收、内化和处理的任何分子。
此处使用术语“配体”表示体内能特异性结合于DC表面标记物/受体的任何分子。术语包括完全抗体和抗体片段例如ScFvs和结构域抗体。
此处使用术语“免疫调节因子”表示能调节免疫反应过程或结果的任何“危险信号”、细胞因子或分子。
此处使用术语“受体”表示DC表面上的受体分子并且是能与嫁接了脂质体或膜囊泡的配体相互作用的DC表面上的实体。
此处使用术语“肿瘤”表示良性和恶性实体肿瘤以及实体和非实体癌症。
关于上面定义的第一个实施方案，含抗原的膜囊泡一般是PMV，但是能从任何生物膜或生物结构形成。有利地PMV是肿瘤来源的PMV。PMV也能是淋巴细胞来源的PMV或白细胞来源的PMV。PMV还能是细菌、原生动物、病毒或真菌的膜制备物。关于含抗原的脂质体，这些包括能从脂质不同混合物产生的隐形脂质体(SL)。能如参考文献14、16、17和28所述地制备这样的囊泡和脂质体，此处通过交叉引用引入全部内容作为交叉参考。
组合物的抗原能够是期望的免疫反应所抵抗的任何抗原或编码抗原的DNA。组合物包含相同或不同来源的多个不同抗体。就是说包含肿瘤抗原的组合物可以包括来自不同肿瘤的抗原。
囊泡和脂质体表面上的金属螯合基团作为组成囊泡和脂质体的磷脂和/或脂质内存在的两性分子首基存在。两性分子有利地是次氮基三乙酸双十四胺(NTA-DTDA)或次氮基三乙酸磷脂酰乙醇胺(PE-NTA)，但是组合物包括含有能掺入脂质膜的任何金属结合或螯合基团的任何分子。组合物还能进一步包含两性分子的混合物。
如将在下面更详细解释地，优选的两性分子是(NTA)3-DTDA(三(次氮基三乙酸)双十四胺)。国际申请号PCT/AU00/00397(公开号WO00/64471)中更详细地描述了相关分子NTA-DTDA以及其它两性分子和含有相同分子的囊泡和脂质体，此处通过交叉引用引入全部内容作为参考。
连接于膜囊泡和脂质体上金属螯合基团的配体是能够特异性结合于任何DC表面标记物的任何金属亲和标记的分子。优选的金属亲和标记是六组氨酸。下面的实施例中，使用了抗DC表面分子CD11c和DEC-205(CD205)的六组氨酸标记形式的ScFv。其它的实施例包括任何组氨酸标记的配体，例如能结合于DC表面标记物例如DC-SIGN(CD209)、CD206和CD207的抗体或抗体片段。
组合物能够包括DC上不同标记物/受体的多个配体。例如，组合物能够包含作为配体的抗DEC-205的ScFv联合抗DC-SIGN的ScFv。
如上所示，配体的金属亲和标记一般是共价连接在配体上方便位点的六组氨酸基团。例如，六组氨酸能连接于蛋白质抗原N或C末端。其它金属亲和标记包括能螯合金属并能共价附着于配体上方便位点的任何基团或氨基酸序列。
根据第一个实施方案的组合物的免疫调节因子包括能增强或修饰DC对抗原的反应的化合物或分子。这样的化合物包括“危险信号”(例如，细菌脂多糖)、细胞因子(例如，干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-10、白细胞介素-12和转化生长因子-β)，以及化学因子、激素和生长因子样分子或编码这样分子的DNA。组合物能包括多于一个的免疫调节因子。
关于本发明的第二个实施方案，在上面参考的国际申请(No.PCT/AU00/00397)中描述了制备有配体捕获在其上的膜囊泡或脂质体的合适方法。
关于第二个实施方案方法的步骤(i)，膜囊泡一般是PMV但是能从任何生物膜或生物结构形成。脂质体包括SL。膜囊泡和脂质体的Ag能是将要递送到DC的蛋白质、糖蛋白、肽或多糖或编码抗原的DNA或它们的联合。
第二个实施方案方法的步骤(ii)中，与第一个实施方案组合物一起，免疫调节因子能是“危险信号”(例如，细菌脂多糖)、细胞因子(例如，干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-10、白细胞介素-12和转化生长因子-β)或编码这样因子的DNA。
根据第三个实施方案的方法的免疫反应调节在包括移植排斥或自体免疫疾病例如I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症的病变的预防或治疗中有应用。在移植患者的情况下，这个涉及来自靶向移植受者的供者白细胞的PMV的给予。这个例子中免疫调节因子能够是例如细胞因子例如白细胞介素-10和转化生长因子-β。然而，免疫调节因子能够是具有能力产生耐受原性DC的任何分子。
第四个实施方案的方法能够用于任何肿瘤的治疗，包括但不限于黑素瘤以及前列腺、肠、乳腺和肺的癌症。所述方法也能用于白血病和淋巴瘤的治疗。所述方法能用于治疗任何哺乳动物的肿瘤，但是特别适合治疗人类肿瘤。
鉴于接受治疗的肿瘤，临床医生在对受试者评价后能够确立递送给受试者修饰的含Ag膜囊泡或脂质体的量以及给予方案。
本领域的那些技术人员将立即认识到根据第四个实施方案的方法提供了体外操纵DC有效的替代以用于癌症免疫治疗。
关于第五个实施方案，为了增强对造成感染的物质的免疫和/或用于感染的治疗所述方法能用于预防或治疗任何感染，包括细菌、分枝杆菌、病毒和真菌造成的感染。以与上面给出的移植排斥预防的实施例相似的方法，提供有效的方法所要求的就是制备包括来自传染物至少一个抗原的PMV或脂质体。那个抗原是例如病毒(例如HIV、B和C型肝炎)的包膜蛋白或细菌(例如分支杆菌)的细胞壁成分、真菌(念珠菌)和原生动物(例如疟疾)。
与本发明第三至第五个实施方案一致地能够通过本领域技术人员已知的任何方法将组合物给予受试者。一般静脉或皮下给予组合物。
第三至第五个实施方案的方法的受试者一般是哺乳动物。所述方法特别适合用于人。
本领域技术人员将理解根据本发明第六至第八个实施方案的药剂也将包括组合物的至少一个载体。所述载体是与PMV和脂质体相容的任何溶液。一般的载体是生理盐水和缓冲盐水例如PBS。
药剂还包括与药剂预期用途相符的活性剂。例如，根据第七个实施方案的药剂包括其它抗肿瘤试剂，而根据第八个实施方案的药剂包括以抗细菌、抗原生动物、抗病毒或抗真菌活性作为适当靶感染的其它试剂。这样额外的试剂对于本领域技术人员将是已知的。
原型研究
原型研究中，本发明者发现为了靶向DC，螯合剂-脂质(NTA)3-DTDA能够用于将His标记的ScFv锚定在肿瘤来源的质膜囊泡(PMV)或在含肿瘤抗原的隐形脂质体上。以这种方式将Ag直接靶向DC引发了很强的抗肿瘤反应。
脂质体因为具有很高的治疗潜能而很受欢迎，但是缺乏靶向分子附着的简单方法阻碍了它们的用途。13新型螯合剂-脂质(NTA)3-DTDA(图1A)当掺入入SL或肿瘤细胞来源PMV(B16-OVA)时，实现了靶向DC上表面分子的六组氨酸标记的ScFv之稳定嫁接(图1B和图1C)。嫁接了特异于DC标记物CD11c和DEC-205的ScFv的PMV和SLs体外特异性结合于DC，并且基于流式细胞仪和共聚焦显微镜研究，体内相关Ags能直接靶向DC(图2和3)。
最初，检查了DC引发的Ag递呈试验中嫁接的PMV和SL刺激功能性反应的能力。我们的研究显示嫁接了ScFv的PMV和含Ag的SL比对照PMV和SLs更加显著有效地诱导DC刺激T细胞增生(图4A)。PMV刺激了CD4+和CD8+T细胞的增生。PMV具有刺激对肿瘤细胞囊泡中存在的抗原决定簇有反应性的所有可能T细胞克隆介导的反应之潜能。相似地，嫁接了ScFv的含OVA蛋白质的SL可以刺激OVA特异性CD4+和CD8+T细胞；但是期待含有OVA中优势免疫CTL抗原决定簇SIINFEKL的SL只产生CD8+T细胞反应。与这个相符合，我们的数据显示了嫁接的PMV靶向的DC产生了大约相等比例的CD4+和CD8+T细胞，而含SIINFEKL的SL靶向的DC比含OVA的那些更小程度地主要产生了CD8+T细胞(图4B)。
证据显示“危险”信号在Ag暴露后对于DC的成熟和迁移很重要，并且能够避免诱导对递呈的Ag的耐受性。9，10，18值得注意地，“危险”信号在体内Ag递呈试验中不是必需的(图4)，推测是因为在分离过程中DC被“干扰”或激活。已知LPS和象GM-CSF和IFN-γ的细胞因子影响DC吸附Ag和成熟的能力。8，19-21所以对于动物研究，我们在PMV和SL之内掺入了LPS、IFN-γ或GM-CSF，因而提供了同时递送Ag和危险信号至DC的方法。
对嫁接了ScFv的PMV和含Ag的SL诱导DC以引发CTL反应的能力的检查揭示，与对照细胞相比，来自用嫁接了ScFv的PMV或荷SL的抗原免疫的动物之T细胞在体外再刺激之后，体外展现了增加的裂解B16-OVA靶细胞的能力(图5)。重要地，结果显示了体内启动细胞裂解活性依赖于“危险”信号的存在，LPS和IFN-γ刺激了最大的反应(图5)。异种OVA蛋白质和六组氨酸标记形式的SIINFEKL为了经由嫁接的ScFv靶向而与SL相连。因Ag递呈和CTL试验证明以这个方法将嫁接了ScFv的PMV和荷SL的Ag靶向DC能够有效刺激抗肿瘤反应，并且强调了“危险”信号诱导免疫反应的重要性(图4&5)。而且，嫁接了ScFv的含SINFEKL-6H的SL能够诱导显著细胞毒性反应的发现，证明了使用含(NTA)3-DTDA的SL的方法是体内将任何His标记的肽Ag靶向DC的有效策略。
这个工作中最最重要的发现是我们观察到用嫁接了CD11c-ScFv和DEC-205-ScFv的PMV免疫的同种动物在用B16-OVA黑色素瘤攻击后与对照相比具有显著低数量的肺肿瘤转移。相似地，用嫁接了SvFv含OVA的SL和LPS或IFN-γ免疫的同种动物具有更低数量的转移(图6)。结果进一步地显示肿瘤免疫完全依赖于”危险信号”、LPS和IFN-γ(图5和6)。所以用嫁接了CD11c-ScFv-和DEC-205-ScFv的PMV和荷SL的Ag免疫小鼠将相关Ag靶向DC，然后DC处理和递呈Ags至T细胞诱导Ag特异性T细胞激活，并且在体内引发很强的B16-OVA肿瘤生长和转移的抑制。进一步有意义的发现是如下的事实：不像所有都发展了严重肺转移的对照小鼠，已经接种嫁接了DEC-205-ScFv的含IFN-γPMV的小鼠在用B16-OVA肿瘤细胞攻击之后随后不显示任何迹象的肿瘤发展，指出DC靶向疫苗具有治疗活性。
这个研究特别引人的方面是抗B16-OVA黑素瘤的CTL活性的显著产生与肿瘤保护无关。这点在期待只产生抗B16-OVA肿瘤细胞产生的OVA的CD8+CTL反应之SIINFEKL-SL疫苗特别明显。尽管所述疫苗诱导很强的体外抗B16-OVA肿瘤细胞的回忆CTL反应，免疫并没有提供抗肿瘤的体内保护。已知B16-OVA黑色素瘤系表达非常低水平的I型MHC，因此对CTL裂解有抗性，除非使用高活性CTL。14用DC靶向的PMV或SL制备物免疫的小鼠脾细胞在体外用肿瘤细胞刺激后能够裂解B16-OVA肿瘤细胞的事实暗示能够产生抗这个肿瘤细胞系的高亲合力的CTLs。推测，不能产生这样的CTL，或者这样的CTLs体内无效。事实上，前面的研究指出CD4+而不是CD8+T细胞抗B16-OVA转移有效，有T辅助2(Th2)细胞的细胞因子谱的CD4+细胞特别有效。14而且，要观察到肿瘤退化将嗜酸性细胞嗜酸细胞活化趋化因子依赖性地招募到肿瘤是必须的。14为了探查CD4+T细胞介导的嗜酸性细胞的招募在本研究中观察到的抗肿瘤效果中可能的作用，用嫁接了ScFv的PMV免疫嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠。我们的结果显示与对照相比，嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠展现了显著降低的抑制B16-OVA肿瘤生长和转移的能力(图7A)。嗜酸细胞活化趋化因子是很强的嗜酸细胞趋化因子，所以，这些发现与将嗜酸细胞招募至肿瘤组成抗肿瘤反应重要部分相符合。
与使用DC进行肿瘤免疫治疗的现行策略比，此处描述的修饰的PMV和SL系统提供了许多优点。首先，所述系统能体内直接递送Ags至DC，因而取消了从患者分离DC和为了用于免疫治疗体外操纵细胞的需要。其次，靶向或活性脂质体介导的Ag递送到DC具有同时递送更多Ag和/或一些不同Ags的潜能，很可能刺激更加有效的免疫反应。相同的方法很可能能递送任何Ag或免疫调节剂至DC，例如“危险”信号、RNA、DNA和细胞因子或它们的联合，这个通过使用融合于DC靶向蛋白质的Ags不能很容易地完成。9，10第三，所述方法是多用途的，将很方便地用于临床因为为了增强患者肿瘤免疫很可能拥有组氨酸标记的任何DC靶向蛋白质能被嫁接到修饰的PMV或SL以递送特异性肿瘤Ags或其它物质。
在前面原型研究中已经广泛地描述了本发明及其特别应用，现在在此处使用的材料和方法之后将给出具体实施例。本领域技术人员将理解这些实施例只用于举例目的，在任何方面都不限制本发明的范围。
材料和方法
试剂
[3H]-胸苷和51Cr(Na51CrO4)得自Amersham(Buckinghamshire，英国)。棕榈酰-油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、OVA(II级，FPLC纯化的)、LPS(来自大肠杆菌血清型0111：B4)、Isopaque、Ficoll和β-巯基乙醇由Sigma-Aldrich(Castle Hill，New South Wales，澳大利亚)供应。磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000(PE-PEG2000)得自Avanti PolarLipids公司(Alabaster)。2-(4，4-二氟-5-辛酰基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-戊酰基)-1-十六酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱(PC-BODIPY)和5-(和-6)-二乙酸羧基荧光素、琥珀酸酯、混合异构体(CFSE)购自分子探针(Eugene，Oregon)。基本上如所述27合成由共价连接于两个双十四胺(DTDA)的三个次氮基三乙酸(NTA)首基组成的螯合-脂质(NTA)3-DTDA，但是有额外的步骤将NTA基团共价偶联于NTA-DTDA的每个羧基基团以产生(NTA)3-DTDA。对于缓冲液中所有Ni2+的加入使用NiSO4。
单克隆单体和蛋白质
小鼠CD56(克隆42.18，大鼠IgG2a)mAb来自第六届人NK细胞工场，鼠CD3mAb(克隆145-2C11，亚美尼亚仓鼠IgG)购自PharMingen(San Diego，California)。重组鼠IFN-γ和GM-CSF由PeproTech公司(Rockey Hill，New Jersey)提供。使用杆状病毒蛋白质表达系统产生重组ScFv抗体N418(抗CD11c)和NLDC145(抗-DEC-205)，每个在羧基末端有六组氨酸(6H)标记并分别表示为CD11c-ScFv和DEC-205-ScFv，并且如所述进行纯化。16，28肽由John Curtin医学研究学校(JCSMR)，ANU，Canberra生物分子资源实验室合成。常规地使用在血浆蛋白质富含组氨酸的糖蛋白质中发现的10个氨基酸序列L2肽(GHHPHGHHPH)嫁接对照PMV和SL，因为它结合于有高亲合力的Ni-(NTA)3-DTDA并能阻断其非特异性结合于细胞。使用代表H-2b小鼠OVA优势免疫CTL抗原决定簇(OVA残基257-264)的有六组氨酸标记附着的肽SIINFEKL-6H而将肽Ag递送至DC。
小鼠和细胞系
6-8周龄的雌性或雄性C57BL6小鼠(H-2b)由动物培育公司(JCSMR，ANU)提供，C57BL6嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠(H-2b)(嗜酸细胞活化趋化因子-/-)是生化和分子生物系(JCSMR)Paul Foster博士的礼物，并用于获得用于体外试验和肿瘤生长体内研究的淋巴细胞。分泌OVA的肿瘤细胞系高转移鼠B16-OVA黑色素瘤[C57BL6(H-2b)]培养在含有10％胎牛血清(FCS，Trace生物科学，诺贝尔公园，Victoria，澳大利亚)和0.5mg/mL遗传霉素(Invitrogen)的RPMI1640培养基(Gibco-BRL，Invitrogen，墨尔本，澳大利亚)中在37℃ 5％CO2大气环境下。鼠胚胎皮肤树突细胞(FSDC)[C57BL6-DBA/2JF1(H-2b/d)]培养在相同的培养基中但是没有遗传霉素。如所述29分离和培养的鼠长期培养的树突细胞(LTC-DC)[B10.A(2R)(H-2k/b)]是H.O’Neill博士(生化和分子生物学学院，ANU)的礼物。
树突细胞和T细胞的分离
从C57BL/6小鼠脾分离鼠DC和T细胞。简而言之，用胶原酶IV(Boerhringer Mannheim)消化分离脾细胞，接着使用Isopaque-Ficoll梯度的密度梯度离心分离低密度脾细胞。如所述31通过可塑性粘附分离DC，然后悬浮在含10％FCS、5×10-5M β-巯基乙醇、100IU/ml青霉素、100μg/ml新霉素和10mM HEPES的完全RPMI1640生长培养基。为了T细胞的分离，脾脏分裂为单个细胞悬浮液，低张裂解去除红细胞后，使用尼龙绒毛柱分离T细胞。32
质膜囊泡和隐形脂质体
蔗糖梯度离心制备培养细胞的PMV，30并且基本如总结地进行修饰。16，17如下制备用于修饰PMV的脂质体：混合POPC、(NTA)3-DTDA、LPS和PC-BODIPY(摩尔比例94∶2∶2∶2)的乙醇溶液或POPC、(NTA)3-DTDA和PC-BODIPY(摩尔比例96∶2∶2)的乙醇溶液，N2气流下干燥，然后在含有60μM Ni2+的100μl PBS中再水化。在有指出的的地方，作为LPS的替代，再水化缓冲液中包括IFN-γ或GM-CSF(50ng)。使用TOSCO 100W超声粉碎机(测量和科学有限公司，伦敦，英国)在最大振幅对含水混合物进行超声处理(三次，15秒)。加入15％PEG400和用PBS稀释10倍之前，脂质体(100μl)与100μl B16-OVA细胞来源的PMV(1×108个细胞等同物)混合。用合适的ScFv嫁接之前，通过容量排除色谱纯化含(NTA)3-DTDA和细胞因子的PMV。17
如下制备隐形脂质体(SL)：溶于乙醇的POPC、(NTA)3-DTDA、PE-PEG2000LPS和PC-BODIPY(摩尔比例96∶1∶1∶1∶1)或POPC、(NTA)3-DTDA、PE-PEG2000和PC-BODIPY(摩尔比例97∶1∶1∶1)在N2气流下干燥，然后在含有30μM Ni2+的100μl PBS中再水化(总脂质1mM)。对于缺乏LPS的混合物，IFN-γ或GM-CSF(50ng)包括在PBS中。超声脂质混合物并纯化SL(如上)。对于功能性研究，所有脂质混合物中省略PC-BODIPY。
试图将OVA蛋白质的优势免疫抗原决定簇SIINFEKL封装在SL内，但是很困难，因为这个肽在用于生产SL并嫁接组氨酸标记的ScFv的pH(pH 7.4)有很低的溶解度。然而，所述肽的六组氨酸标记形式SIINFEKL-6H允许有效的封装和/或所述肽嫁接到含(NTA)3-DTDA的SL上。使用FACS分析的结合研究显示嫁接了CD11c-ScFv-或DEC-205-ScFv的含SIINFEKL-6H的SL体外能够有效地靶向DC上的受体(未显示)。因而，在有指出的地方，包括SIINFEKL-6H(2μM)同时与ScFv嫁接。将干燥的脂质混合物在含0.1mg OVA(1mg/ml)的PBS中再水化接着短暂超声将OVA有效地封装在含POPC、(NTA)3-DTDA和PE-PEG2000的SL中。室温下与合适的ScFv(200μg/ml)孵育1小时嫁接含(NTA)3-DTDA的PMV和SL。如前所述地通过流式细胞仪评价嫁接的PMV和SL与DC的结合。17
DC的体内靶向
为了获得用于跟踪研究的高度荧光的PMV，PMV与异硫腈酸荧光素(FITC，分子探针)反应，与L2或ScFv嫁接，然后注射到小鼠后足垫。16小时后，收集每个动物的引流腘淋巴结并用于淋巴结细胞分离以在用生物素化CD11c mAb和抗生物素蛋白链菌素-藻红蛋白(抗生物素蛋白链菌素-PE)染色后进行双色流式细胞仪分析或者用于共聚焦荧光成像。为了成像，淋巴结在10％福尔马林中固定，然后石蜡包埋，切成切片；然后切片粘附到载玻片上并去除石蜡。载玻片与PBS加20％羊血清(PBS-羊血清)中的抗CD11c的mAb N418室温下孵育1小时之前，与PBS-羊血清室温孵育30分钟以阻断。然后水中彻底清洗切片，用抗生物素蛋白链菌素-罗丹明在PBS-羊血清中染色。进一步清洗之后，使用Radiance 2000荧光共聚焦显微镜(Bio-Rad，Richmond，加利福尼亚)分析载玻片的荧光素和罗丹明荧光。用Kalman平均30个连续激光扫描获得图像，并使用Bio-Rad图像软件进行处理。
抗原递呈试验
在37℃完全培养基中DC与修饰的PMV或SL孵育4个小时，然后清洗以去除未结合的PMV或SL，γ-照射(5000拉德)，在生长培养基中分装到96孔平底平板(2×104个细胞/200μl/孔)。加入同种T细胞(2×104个细胞)，通过测量[3H]-胸苷的掺入评价增生14之前细胞共培养4天。通过如所述地33在与DC共培养之前用CFSE(5μM)标记T细胞评价Ag递呈试验中增生的CD4+和CD8+T细胞的比例。4天后，清洗共培养的细胞，用抗小鼠CD4(克隆L3T4)-Cy-Chrome(10μg/ml)和抗小鼠CD8(克隆Ly-2)-PE(10μg/ml)染色，通过流式细胞仪分析CFSE、Cy-Chrome和PE荧光。
细胞毒性试验
如描述的那些相似地进行Ag特异性CTL试验。34同种C57BL6小鼠静脉注射(i.v.)PBS(对照)或嫁接了ScFv的源于B16-OVA细胞的PMV或荷抗原的SL(如指出地)进行免疫。免疫14天后，取出脾脏，如上分离T淋巴细胞(效应T细胞)。然后T细胞悬浮于完全培养基并1×105个细胞/孔的浓度分装到24孔平底平板(ICN生物医学)中与1×105个γ照射(5000拉德)的B16-OVA细胞共培养。共培养5天后，如所述地用标准51Cr释放试验评价T细胞的细胞裂解活性。16
动物免疫和体内肿瘤攻击
每周i.v.尾静脉注射PBS(对照)或者都悬浮在200μl体积PBS中嫁接了ScFv的B16-OVA细胞来源的PMV(2×105细胞等同物)或荷相关抗原(～0.2μg OVA或～0.8ng SIINFEKL-6H)的SL(～0.16μg总脂质)免疫小鼠三次。最后一次注射两周后，静脉注射3×105个B16-OVA细胞攻击小鼠。在第16天，取出肺脏，在解剖显微镜下计数可见的肿瘤灶的数量。或者，在静脉注射1.5×105个B16-OVA细胞3、6和9天后用嫁接了ScFv的B16-OVA PMV免疫小鼠。
实施例1
体外和体内脂质体都能够用于将肿瘤抗原靶向DC
两种类型的脂质体制备物用于将肿瘤Ag靶向DC(见下面图1)。第一个限定了肿瘤细胞来源的通过靶向DC的ScFv的嫁接修饰的PMV粗制备物之用途，第二个是也嫁接了DC靶向的ScFv的含Ag隐形脂质体的制备物。隐形脂质体(SLs)是合成的脂质结构，它们通过包含例如PE-PEG2000的脂质而立体稳定，并且由于它们逃脱网状内皮系统非特异性清除的能力，在它们静脉给予后它们能够保留在血循环中数天。14描述了螯合脂质NTA-DTDA修饰肿瘤细胞和肿瘤细胞来源的PMV以用于T细胞共刺激分子的嫁接的用途。15，16最近我们生产了新型脂质，(NTA)3-DTDA(图1A)，它与NTA-DTDA相关，但是通过获得更高局部密度的NTA首基，允许组氨酸标记的蛋白质更加稳定地锚定到PMV和SL上(未显示)。因而，脂质体经由(NTA)3-DTDA附着于组氨酸标记的抗DC标记物例如CD11c和DEC-205的ScFv允许脂质体有效地靶向DC(图1B)。
为了确定这种方式制备的脂质体是否能用于将肿瘤抗原靶向DC，我们首先探究了这个系统体外将Ag靶向DC的能力。这个研究中，我们使用了高度转移的黑色素细胞系B16-OVA，因为这个细胞系分泌低水平的能用作替代分泌的肿瘤特异性Ag的OVA(参考文献17)，实现了OVA特异性免疫反应的评价。B16-OVA肿瘤系大多对OVA特异性CTLs有抗性，除非使用高亲合力的CTL。17能够修饰(B16-OVA来源的)PMV以通过与由POPC、(NTA)3-DTDA和PC-BODIPY(摩尔比例96∶2∶2)组成的合成脂质的融合而含有掺入的(NTA)3-DTDA。并且，从合适的脂质混合物POPC、PE-PEG2000、(NTA)3-DTDA和PC-BODIPY(摩尔比例96∶2∶1∶1)生产含(NTA)3-DTDA的SL。能够制造含有OVA或OVA CTL抗原决定簇SIINFEKL的SLs制备物。含(NTA)3-DTDA的PMV和SLs与对照含六组氨酸的分子(L2肽)或六组氨酸标记的抗CD11c或DEC-205的ScFv嫁接。因为修饰的膜也含有作为荧光追踪物的PC-BODIPY，通过流式细胞仪能评价它们对DC的靶向。
长时间培养的DC(LTC-DC)与对照修饰的PMV(PMV-L2)的孵育稍微增加了细胞的荧光强度(背景之上～2倍)，但是它们的荧光在与嫁接了CD11c-ScFv(PMV-CD11c)或DEC-205-ScFv(PMV-DEC-205)的PMV孵育后比对照细胞高4-8倍(图2A)。与嫁接了CD11c-ScFv的SL(SL-CD11c)和嫁接了DEC-205-ScFv的SL(SL-DEC-205)孵育的LTC-DC与对照细胞比也展现了显著增加的结合(3-6倍)(图2B)。相似地，与对照细胞相比，表达CD11c的胚胎皮肤DC(FSDC)与嫁接了CD11c-ScFv的PMV或SL孵育基本上导致了荧光的增加(未显示)。使用阻断mAbs能够测试嫁接了的PMV和SL的结合特性。因而，同型匹配的对照mAb与DC的预孵育没有显著降低嫁接了CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv的PMV或SL与DC的结合，但是它们与抗CD11c mAb N418或抗DEC-205mAb NLDC145的预孵育抑制了各自嫁接了ScFv的SL或PMV大约90％的结合(未显示)。这个证实了所述结合是嫁接的ScFv特异性的。
为了确立嫁接了ScFv的PMV能够体内靶向DC，我们皮下注射荧光素标记的嫁接了ScFv的PMV至小鼠后足垫，然后流式细胞仪检查了从引流腘淋巴结分离的细胞的荧光素荧光，或者在每个切片用CD11cmAb作为DC标记物PE染色后共聚焦扫描激光显微镜检查引流淋巴结的切片。通过FACS分析和荧光显微镜(图3A和B，图i、iii和v)结果都显示小鼠注射嫁接了L2、CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv的PMV导致了相对较小的淋巴细胞群(2-2.5％)中高水平的CD11c特异性荧光，因而鉴定它们是DC。重要地，与注射嫁接了L2的PMV的小鼠相比，注射嫁接了ScFv的PMV的小鼠的淋巴结中观察到了CD11c阳性细胞中更大的荧光素标记的细胞群(～1.7％)(图3A和B，图iv和vi)。这些发现显示嫁接了ScFv的PMV能够体内靶向DC。
表1
脂质体和修饰的质膜囊泡制备物
a来源于B16-OVA黑色素瘤细胞系的PMV
b有H-2b单倍体型SIINFEKL优势免疫I型MHC抗原决定簇
c偶联于脂质体的对照含六组氨酸分子
实施例2
脂质体介导的肿瘤抗原靶向树突细胞体外和体内都诱导有效的肿
瘤特异性免疫
为了测定靶向DC的荷Ag的PMV和SL是否能诱导功能性Ag递呈到T细胞，我们最初检查了嫁接了ScFv的PMV和SL Ag递呈试验中刺激T细胞增生的能力。分离自C57BL/6小鼠的脾DC分别用嫁接了对照组氨酸标记肽(L2)或抗CD11c和DEC-205的ScFv的B16-OVA-PMV、荷SL的SIINFEKL-6H或荷OVA的SL刺激。孵育后，细胞与纯化的同种T细胞共培养，然后用[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷刺激以评价T细胞增生的速率。与对照培养物相比，暴露于嫁接了CD11c-ScFv的(荷SIINFEKL-6H或OVA的)PMV或SL的DC基本诱导了更高水平的T细胞增生。当T细胞与暴露于嫁接了DEC-205ScFv的PMV或SL的DC共培养时，甚至观察到了更高速率的增生(图4A)。所以，嫁接了ScFv的荷Ag的PMV和SL能有效地递送Ag至DC并且刺激了T细胞增生。
有趣地，使用标记了CFSE的T细胞的研究揭示了增生CD4+和CD8+T细胞的比率依赖于使用的Ag。因而，T细胞与已经用嫁接了DEC-205的PMV刺激的DC之共培养物由～60％ CD8+T细胞和～40％ CD4+T细胞组成(图4B)。相反，T细胞和用嫁接了DEC-205的荷OVA肽SIINFEKL-6H的SL刺激的DC之共培养物含有～80％ CD8+T细胞和～20％CD4+T细胞，与SIINFEKL是CD8+T细胞抗原决定簇相符合。显著地，与SIINFEKL培养物相比，与用嫁接了DEC-205封装了完整OVA的SL刺激的DC一起培养的T细胞含有较少的增生CD8+T细胞(～70％)和显著更高比例的～30％ CD4+T细胞(图4B)，与OVA含有CD4+和CD8+T细胞抗原决定簇相符合。用靶向CD11c-ScFv的Ags刺激的DC共培养物中增生CD4+和CD8+T细胞的相对比例揭示了相似于用靶向DEC-205-ScFv的Ag刺激的DC的模式(未显示)。
最近的研究证明Ag暴露和DC成熟过程中危险信号9，10在决定DC引发的免疫反应类型中的重要性。尽管研究显示体外脂质体将Ag靶向DC并诱导T细胞反应，以前体内研究提示为了这个方法在体内成功，危险信号与DC共递送是必需的。因而，为了同时递送Ag和炎性刺激物至DC，我们生产了含有掺入的LPS、IFN-γ或GM-CSF的荷Ag的修饰PMV和SL。我们发现了高达1％的LPS能够包括在脂质混合物中，如结合研究中使用流式细胞仪所评价地，PMV和SL能制成掺入高效率的细胞因子GM-CSF和IFN-γ而没有显著地干扰嫁接了ScFv的SL体外靶向DC的能力。而且，因为GM-CSF在无血清的培养基中诱导了FSDC的增生，并且IFN-γ抑制了完全培养基中它们的增生17，使用FSDC增生试验监测到SL中发现有＞85％的GM-CSF和＞75％IFN-γ掺入的细胞因子的捕获(未显示)。
为了测定体内靶向DC的PMV或含Ag的SL是否能够产生CTL反应，我们用缺乏或含有危险信号例如LPS、IFN-γ和GM-CSF的制备物免疫C57BL6小鼠。然后我们分离脾T细胞，体外用γ照射的B16-OVA肿瘤细胞再刺激细胞，标准51Cr释放试验评价它们细胞裂解B16-OVA细胞的活性。图5A中显示了用各种嫁接了DEC-205-ScFv的PMV制备物免疫的动物的代表性裂解曲线。当用嫁接了L2肽或DCE-205-ScFv的PMV在没有危险信号存在下预先免疫小鼠时检测到很小的CTL活性(图5A)。然而，LPS或IFN-γ掺入在嫁接了DEC-205-ScFv的PMV中导致了高水平细胞裂解活性的诱导，50％靶细胞的特异性裂解在1∶1的效应物与靶点比率仍然发生(图5A)。相反，GM-CSF是有效性低很多的CTL活性诱导剂。
为了方便对比，图5B中呈现了在25∶1的效应物与靶点比率的各种PMV和SL免疫条件的细胞裂解活性。用含危险分子IFN-γ或LPS的(荷SIINFEKL或OVA的)PMV或SL免疫的小鼠之脾细胞观察到了最大的CTL活性。嫁接了CD11c-ScFv的PMV和SL多多少少免疫源性较低，通常GM-CSF是比IFN-γ或LPS效率低的危险信号，然而当与PMV和含OVA的SL相联时诱导了显著的CTL活性。有趣地，含有来自注射了嫁接ScFv的PMV或缺乏相关“危险”信号的SL的动物之T细胞的培养物给出了接近背景水平的裂解(图5A和B)。
实施例3
靶向DC的基于脂质体的疫苗诱导了抗肿瘤的保护性免疫
检查用各种B16-OVA制备物免疫的小鼠它们抵抗B16-OVA肿瘤细胞i.v.攻击的能力，在肿瘤细胞注射后16天定量分析肺转移。与对照小鼠相比，用嫁接了ScFv并含LPS或IFN-γ的PMV或荷OVA的SL免疫小鼠观察到了数量低很多的转移(图6)。如果PMV或荷OVA的SL没有嫁接ScFv并且不含有LPS或IFN-γ，检测到了对肿瘤细胞攻击很少的保护。完全相反，含SIINFEKL的SL不能保护小鼠抵抗肿瘤攻击(图6B)，然而一些疫苗构建体诱导了有效的CTL活性(图5)。这些数据与B16-OVA黑色素瘤抵抗CD8+CTLs的清除相符合(参考文献14)。
为了探查接种对以前存在的肿瘤的作用，我们在用1.5×105个B16-OVA肿瘤细胞攻击后3天用嫁接了DEC-205-ScFv的含IFN-γ的PMV注射一组6个小鼠。有趣地，接种的小鼠随后没有显示任何迹象的肿瘤发展，而一组六个对照动物由于肺肿瘤负担的增加，每个含有平均250±37个肿瘤灶，不得不在22天处以安乐死。
Ag递呈试验中观察到高比例的CD4+T细胞(图4B)，提出了这些细胞而不是CD8+T细胞在观察到的抗肿瘤反应中是否有作用的问题。最近发现CD4+T细胞通过涉及嗜酸粒细胞趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子的机制与B16-OVA黑色素瘤肺转移的清除有关14。我们用PMV-DEC-205-ScFv免疫嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠的研究中探查了嗜酸粒细胞参与靶向DC的抗原诱导抗肿瘤反应的可能性。结果显示虽然正常和嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠T细胞的细胞裂解活性基本上相同(图7A)，用PMV-DEC-205免疫的嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠展现了它们抑制肿瘤生长和转移能力的显著缺乏(图7B)。
实施例4
通过将感染物相关抗原靶向树突细胞增强的对感染物的免疫
这个实施例中，我们证明了本发明能够用于将感染物抗原靶向DC。BCG是分支杆菌，含有也存在于造成人类肺结核的病原体结核分支杆菌中的许多抗原。这里描述的实施例中，使用了BCG分支杆菌而不是结核分支杆菌。BCG分支杆菌生长在培养基中，热灭活，在修饰以允许靶向DC前(通过与示踪剂6-(荧光素-5(和-6)-羧氨基)己酸琥珀酸酯反应)进行标记以允许追踪。因而，热灭活的BCG与合适量的Ni-(NTA)3-DTDA混合，短时超声处理以允许螯合脂质掺入到含BCG抗原的BCG膜囊泡中。然后Ni-(NTA)3-DTDA掺入进BCG膜实现了ScFv嫁接到CD11c或DEC-205以允许分别特异性靶向DC上的CD11c和DEC-205标记物。
特异性靶向在包含图8的图示中很明显。荧光谱显示只有靶向鼠DC的嫁接了ScFv的BCG制备物展现了与鼠DC细胞系JAWS-II的结合。嫁接了非靶向对照蛋白质L2的对照BCG制备物没有结合。这个指出了本发明修饰的PMV和脂质体能用于体外BCG相关的抗原靶向DC。
进行了进一步的实验以验证含嫁接了靶向DC的ScFv的BCG制备物当用作动物疫苗时也增强了对BCG抗原的免疫反应。使用基本上与如实施例1中相同的疫苗接种计划，用嫁接的BCG制备物通过静脉接种C57/BL6小鼠。2-4周后，处死小鼠，取出它们的脾脏分离T细胞并分析BCG特异性干扰素-γ的产生。在分析培养物产干扰素-γ的细胞之前，在热灭活的BCG存在下培养分离自小鼠脾脏的T细胞3天时间获得了产生干扰素-γ的Elispot试验的结果。这些试验的结果呈现在图9中。
能从图9中看出与用已经嫁接了对照蛋白质L2的BCG制备物接种(如指出地)相比，用已经嫁接了两个靶向DC的ScFv任何一个的BCG制备物接种的小鼠脾脏显示了更高数量的产干扰素-γT细胞(即Elispots)。为了引发最合适类型的免疫反应也能包括免疫调节因子(例如干扰素-γ、IL-4、IL-10)和靶向的BCG膜制备物。因而结果显示与(如上面例证地)抗原靶向DC能增强肿瘤免疫一样，本发明修饰的PMV和脂质体也能体内用于将感染物的抗原靶向DC以诱导或增强对感染物的免疫。
本领域的技术人员将理解能够对上面例证的方法和组合物进行许多改变而没有脱离本发明的广泛界限(ambit)和范围。
此处使用了术语“包含”和所述术语的变异例如“包含”或“包含了”，指的是所述整体或所述多个整体但不排除任何单个其它整体或任何多个其它整体的包含，除非上下文或用途中要求所述术语唯一的解释。
这个详述中引用的任何参考发表物并不是承认这些公开构成了澳大利亚普通常识。
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Claims (23)
1.用于通过抗原体内靶向于树突细胞来调节免疫的组合物，所述组合物包含：
在其表面上具有多个金属螯合基团的含抗原膜囊泡或含抗原脂质体的制备物，其中所述金属螯合基团是存在于组成囊泡或脂质体的磷脂和/或脂质内的两性分子的首基；和
选自抗体、抗体片段和结构域抗体的配体，所述配体能够特异性地与所述树突细胞上的受体结合并经由所述配体上的金属亲和标记连接于所述金属螯合基团；
其中，所述含抗原囊泡或脂质体含有免疫调节因子干扰素-γ。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述含抗原膜囊泡选自肿瘤衍生的质膜囊泡、淋巴细胞衍生的质膜囊泡、白细胞衍生的质膜囊泡以及细菌、原生动物、病毒或真菌的膜制备物。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述含抗原脂质体是隐性脂质体。
4.根据权利要求1至3中任一项的组合物，其中所述含抗原膜囊泡和含抗原脂质体的所述抗原选自蛋白质、糖蛋白、肽、多糖和编码前述任何分子的DNA。
5.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述含抗原膜囊泡或脂质体的抗原包含多个不同抗原。
6.根据权利要求1至5中任一项的组合物，其中所述抗体片段是单链抗体片段。
7.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述配体是选自CD11c、DEC-205(CD205)、DC-SIGN(CD209)、CD206和CD207的受体的配体。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述配体是CD11c-ScFv或DEC-205-ScFv。
9.根据权利要求1至8中任一项的组合物，其中在所述配体上的所述金属亲和标记是六组氨酸。
10.根据权利要求1至9中任一项的组合物，其中所述两性分子选自次氮基三乙酸双十四胺、三(次氮基三乙酸)双十四胺或次氮基三乙酸磷脂酰乙醇胺。
11.组合物，其包含：
在其表面上具有多个金属螯合基团的含抗原膜囊泡或含抗原脂质体的制备物，其中所述金属螯合基团是存在于组成囊泡或脂质体的磷脂和/或脂质内的两性分子的首基；和
选自抗体、抗体片段和结构域抗体的配体，所述配体能够特异性地与所述树突细胞上的受体结合并经由所述配体上的金属亲和标记连接于所述金属螯合基团；
其中，所述含抗原囊泡或脂质体含有免疫调节因子干扰素-γ。
12.权利要求11的组合物，其进一步如在权利要求2至10中任一项之中进行定义。
13.权利要求11或12的组合物，其中所述组合物适合于通过抗原体内靶向于树突细胞来调节免疫。
14.制备用于通过抗原体内靶向于树突细胞来调节免疫反应的组合物的方法，所述方法包括下列步骤：
i)制备含抗原膜囊泡或含抗原脂质体；
ii)通过免疫调节因子干扰素-γ的掺入来修饰所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体；
iii)进一步通过两性分子的掺入来修饰所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体，其中所述两性分子包含当掺入在其中时处于所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体的表面上的金属螯合基团作为首基；和
iv)将步骤(iii)的产物与选自抗体、抗体片段和结构域抗体的配体接触，所述配体能够特异性地与所述树突细胞上的受体结合并包含用于结合于所述螯合基团的金属亲和标记。
15.根据权利要求14的方法，其中，在步骤(i)中制备的所述含抗原膜囊泡，在步骤(i)中制备的所述含抗原脂质体，所述含抗原膜囊泡和含抗原脂质体的所述抗原，在步骤(iii)中掺入的所述两性分子，与步骤(iii)的产物接触的所述配体，或者所述配体上的所述金属亲和标记如权利要求2至10中任一项之中所定义。
16.权利要求1至10中任一项之中所定义的组合物，其用于调节受试者免疫反应。
17.根据权利要求16的组合物，其中所述免疫反应的调节是为了移植排斥或自身免疫疾病的预防或治疗。
18.根据权利要求17的组合物，其中所述自身免疫疾病是I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或多发性硬化症。
19.权利要求1至10中任一项之中所定义的组合物，其用于预防或治疗受试者肿瘤，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体中的所述抗原是肿瘤抗原。
20.根据权利要求19的组合物，其中所述肿瘤是黑色素瘤或者前列腺、肠、乳腺或肺的癌症。
21.权利要求1至10中任一项之中所定义的组合物，其用于预防或治疗受试者感染，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体中的所述抗原是来自造成感染的物质的抗原。
22.根据权利要求21的组合物，其中所述感染的致病物质是细菌、分枝杆菌、病毒或真菌。
23.根据权利要求16至22中任一项的组合物，其中所述受试者是人受试者。
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