CN105017428A - 双靶向融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞表面分子DEC205的双靶向融合蛋白CFmDEC，以及利用多靶点抗肾癌复合抗原基因片段sig-tG250-Fc-IRES-GM-CSF-B7.1(25)，以5型复制缺陷性腺病毒为载体构建了抗肾细胞癌腺病毒疫苗—Ad5-tG250FcGB。该双靶向融合蛋白CFmDEC可增强肾细胞癌腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB的抗肿瘤效应，有效结合腺病毒并提高腺病毒疫苗靶向DCs的能力，在体内能够诱导更高的特异性抗肿瘤免疫反应，抑制肾细胞癌的生长。

Description

双靶向融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种融合蛋白，特别涉及一种可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(DCs)表面分子DEC205的双靶向融合蛋白(CFmDEC)及其编码基因与其在增强腺病毒疫苗免疫活性中的应用。

背景技术

一、肿瘤基因疫苗的研究进展

肿瘤免疫治疗概念的提出是建立在人体免疫系统能够将肿瘤细胞从正常细胞中识别，从而影响肿瘤细胞的生长。有证据显示免疫系统对肿瘤细胞的耐受是不完全的，对肿瘤细胞自发免疫反应的强度和范围与肿瘤预后及生存时间存在相关性。然而，抗肿瘤免疫反应通常会被肿瘤微环境中的免疫抑制反应影响，这两种反应相互制约，如何使抗肿瘤免疫反应压倒免疫抑制反应是利用肿瘤免疫治疗发挥作用的关键。

尽管在过去十几年做了大量工作，但多项临床试验效果并不理想，肿瘤疫苗一直无法转化至有效的临床产品。近来情况好转，一些研究在人体试验上取得了一定的临床效果，并且有部分产品已经注册。在众多肿瘤疫苗中，基因疫苗近年来发展迅速，相关技术平台比较完善，在肿瘤和感染性疾病等免疫治疗领域中显示出一定的地位。

基因疫苗是利用病毒或质粒为载体，将编码抗原片段基因克隆至载体，在体内表达目的抗原，诱导机体产生免疫应答。基因疫苗由体细胞吸收后，可以内源性表达目的抗原。基因疫苗有以下几项优点：1)能够诱导细胞因子高水平表达，进而募集并激活DCs；2)通过表达专职APCs抗原(是指抗原递呈细胞)，可以通过MHC I类途径(是指I类抗原递呈途径)诱导CD8阳性T细胞反应(是指特异性细胞杀伤反应)，从而特异性杀伤肿瘤细胞；3)可以将靶抗原的多个表位同时作为靶点，而无需MHC I类限制；4)可以将抗原设计至更具免疫原性，或共递送多种抗原；5)很容易形成融合基因，形成Th记忆反应(是指辅助性T细胞反应)，从而产生免疫记忆。综合各种优势，相信基因疫苗将在抗肿瘤免疫治疗中发挥有效而强大的作用。

1DNA疫苗

将编码目的抗原的质粒DNA通过皮内或肌肉注射，是一种简单而有效的诱导免疫反应的治疗方法。DNA质粒载体含有一个基因读码框，读码框通常由载体内的启动子控制(如巨细胞病毒增强启动子CMV)。DNA注入体内后必须由细胞摄取，进入细胞核并以转录激活形式存在；最终基因表达量与转染的细胞数量成正比。诱导靶抗原相关免疫反应的前提包括以下几点：1)摄入质粒的细胞能够产生目的抗原，以分泌形式或膜表达形式输出；2)抗原在引流淋巴结由宿主专职APCs处理并交叉递呈。但是也有一些条件限制质粒DNA发挥作用：1)能够进入细胞并定位于细胞核的质粒DNA很少；2)组织内APC周围缺乏炎症反应条件，以及缺乏激活T细胞活化等共刺激分子的表达。因此，单纯裸质粒DNA注射通常效果不佳，尤其是在从小物种(小鼠、大鼠)到灵长类、人的试验中得到证实。单纯的DNA疫苗在人体实验中虽然剂量加大，但仍不能诱导有效的免疫反应，其中原因仍不明了，不排除大物种和小物种骨骼肌结构差异的影响。总而言之，可以这样认为，低效的DNA质粒递送方式和低水平的抗原表达量，以及缺乏内生免疫系统刺激，一同导致了DNA疫苗效果不佳。因此，有必要进一步优化DNA疫苗策略。为了能更好的发挥DNA疫苗作用，剂量、时间、佐剂、递送方式以及给药途径等各种因素都必须综合考虑。

其中一种有效的方法是将质粒与脂质体混合，直接瘤内注射以提高DNA摄入量。Vical公司利用该方法设计出肿瘤疫苗Allovectin-7，将编码HLA-B7和β2微球蛋白的DNA序列装载成为一个功能性MHC I类分子复合物。瘤内注射后，MHC I复合物展示在肿瘤细胞表面，并通过下列方式增加抗肿瘤免疫反应：1)DNA-脂质体诱导炎症反应；2)MHCI增强肿瘤抗原呈递；3)宿主识别新生的MHC I为外源分子，产生异源反应。在针对III/IV期黑色素瘤病人的Allovectin-7Ⅲ期临床试验中已经证明，与当前一线化疗相比其临床效果具有明显优势。另外一种方法是直接将编码肿瘤抗原片段的质粒DNA注射进淋巴结，以提高DNA的暴露率，增加专职抗原递呈细胞对其的摄取，其机制可能是淋巴结内注射质粒有利于局部炎症反应、产生适当的细胞因子环境以及上调免疫应答所需的共刺激分子。

2DNA电脉冲(DNA-EGT)

质粒DNA体内电脉冲是一种安全的递送方式，可以提高细胞对DNA的摄取，增加蛋白表达量并延长免疫反应时间。电脉冲的原理是利用短暂的电脉冲使细胞膜瞬时通透性增加，大分子物质如DNA或RNA可以进入胞质内^[17]。此外，组织内的电势梯度允许细胞核内转导DNA分子的输送。随后电脉冲停止，细胞膜上裂隙封闭，而不会导致细胞死亡。电转化的脉冲时间一般是毫秒或微秒级的。电脉冲不仅可以增加目的基因表达，同时还可在注射位点提高炎性化学因子和细胞因子的分泌，营造炎性环境并募集APCs，最终输送至引流淋巴结，因而可以增强免疫反应。所以，电脉冲介导的质粒DNA递送比普通肌肉内注射能诱发更强的抗原特异性体液及细胞免疫反应。

DNA-EGT技术在一项治疗前列腺癌的I期临床试验中显示出可喜的结果，病人不仅安全耐受，同时可以诱导出比单纯注射DNA疫苗组高的免疫学反应。VGX-3100^TM同样是利用EGT技术的DNA疫苗，目前其针对宫颈癌患者的II期临床研究正在进行。该疫苗质粒编码HPV病毒E6和E7抗原，在其I期临床试验中受者是CIN2/3期术后患者，在用VGX-3100^TM治疗的18人中，13人出现了明显的T细胞反应，阳性反应中百万细胞里出现100至5000斑点。亚组分析显示83％(5/6)出现强烈的T细胞反应，另外15/18中发展了至少一个抗体反应。另一个正在进行的I/II期临床试验药物是V934/V935，该疫苗是由默克和Inovio/Geron公司共同开发，针对靶点是人端粒酶(hTERT)，同时该疫苗策略利用Prime/boost(初免/增强)技术。

3RNA疫苗

用编码肿瘤抗原的质粒DNA直接注射DNA转录产物mRNA，即RNA疫苗。Cure-Vac公司应用该方法使mRNA疫苗与精蛋白混合后皮内注射。该mRNA疫苗技术是通过与质粒DNA一样的作用机制来诱导抗原表达和免疫刺激。动物模型中，仅仅两次皮内注射RNA疫苗就可以观察到抗原特异性CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞等全身免疫反应。同时，还在肿瘤内检测到多种与疫苗相关的T/NK细胞激活以及瘤内免疫细胞浸润。基于该平台，Cure-Vac公司研制了分别针对前列腺癌和肺癌的两种RNA疫苗CV9103和CV9201(www.curevac.com)。I/IIa期临床试验证实疫苗安全，病人可以耐受，而且在大部分病人体内可以检测到至少一种抗原特异性T细胞反应。

4病毒载体

病毒载体是通过将抗原编码片段插入到病毒基因组中，进而表达相应目的抗原。病毒载体制备需要转染质粒提供反向缺失病毒基因，或者专门利用一种包装细胞，该细胞株基因组已经被稳定插入可以复制和包装病毒的基因。重组病毒纯化定量后可以感染宿主细胞，表达靶抗原并呈递至免疫系统。理想的病毒载体应该能有效的将表达的目的抗原呈递至免疫系统，而病毒本身的免疫原性较低。同时，在致病潜能、病毒繁殖、传染性及病毒残留方面还要有安全保证。

4.1痘病毒载体疫苗

将肿瘤抗原基因序列插入到在哺乳动物体内无复制能力的灭活痘病毒可以构建痘病毒载体疫苗。该载体在数个研究中证明是安全的，并可以有效诱导细胞及体液免疫反应。痘病毒载体是第一个被用于肿瘤疫苗临床研究的基因载体。早期在病人体内可以诱导免疫反应，但是经过几年随访观察发现无明确临床效果。

Bavarian Nordic公司开发了前列腺癌疫苗PROSTVAC-VF，是由两个不同的病毒载体构成，先用复制性牛痘病毒载体初免，再用复制缺陷性禽痘病毒增强。该疫苗以PSA为抗原靶点，同时编码三联共刺激分子B7.1(CD80)、ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)，三联分子命名为TRICOM。两种载体疫苗分别命名为vaccinia-PSA-TRICOM和fowlpox-PSA-TRICOM。在随后针对激素抵抗性前列腺癌病人的II期随机空载体对照双盲临床研究中，没有达到预期的研究目的—无进展生存。但是在随后3年的跟踪随访发现，治疗组总体生存率有一定的提高，PROSTVAC-VF组30％病人生存，对照组17％病人生存，而且治疗组中位生存率提高了8.5个月。基于这样的结果，其Ⅲ期临床试验已于2011年启动，名为PROSPECT，计划招募1200名无症状或轻微症状的激素抵抗性前列腺癌患者。另一个备受关注的痘病毒载体疫苗是牛津大学开发的Trovax，灭活的MVA(修饰的Ankara病毒)载体，靶向肿瘤标记物5T4。经过前期I/II临床试验，目前已经进入Ⅲ期临床研究(目标是进展期或转移性肾细胞癌患者)。研究共募集733位病人，分为两组：1)Trovax+IL-2或IFNα或sunitinib；2)安慰剂+IL-2或IFNα或sunitinib。虽然生存率没有达到预设终点，但是特定亚组分析显示总体生存率有一定的提高，与疫苗的作用有确定性的联系，尤其5T4抗体反应(体液免疫)与生存率提高具有相关性^[29]。但同时也发现血小板水平升高与抗体反应和治疗效果呈负相关，具体原因尚待解释。另有两项已完成II期临床试验是用Trovax分别治疗激素抵抗性前列腺癌和肾细胞癌，结果部分产生反应。

另外一个MVA疫苗是TG4010，融合了MUC1抗原(是指特异性抗原)和免疫刺激因子IL-2。其II期临床研究在乳腺癌、肾癌、前列腺癌和肺癌中显示了令人鼓舞的效果。其中一项临床效果最好的IIb临床试验是将治疗性疫苗TG4010作为NSCLC(是指非小细胞肺癌)标准化学治疗的辅助治疗，实验组6月无病生存率至少40％。亚组分析显示TG4010联合化疗效果优于单独化疗组，中位生存时间显著增加(17.1vs11.3月)。最主要的是，该亚组病人激活的NK细胞(是指自然杀伤细胞)在基线水平以上。因此，在用TG4010辅助化疗NSCLC试验中，通过反应率、进展时间和无进展生存数据分析，可以得出这样的结论：激活的NK细胞数量可以作为临床效果的一个预测指标。接下来用TG4010治疗(IV)NSCLC的IIb/III临床试验即将开始，总共需要招募1200名MUC-1阳性NSCLC患者，结果令人期待。

4.2甲病毒载体

甲病毒属于单股正链RNA病毒，通过基因工程设计后甲病毒载体可以在多种细胞中高水平表达外源基因。甲病毒载体更多的是被当作病毒样复制子颗粒(VRPs)使用，该VRPs包含包装载体RNA；同样也可直接作为复制性RNA或DNA核酸疫苗使用。甲病毒因为可以诱导凋亡，其介导的外源基因表达通常是瞬时的；但是中和抗体并不影响加强免疫剂(boost)的作用。甲病毒载体因为可以诱导凋亡、高表达外源基因以及激活I型IFN反应，已经成为一个有吸引力的载体疫苗。

已有多项研究利用甲病毒载体构建肿瘤相关抗原疫苗，诱导了保护性及治疗性免疫反应。基于复制子技术，两项甲病毒肿瘤疫苗正在研究，一是直肠癌，二是前列腺癌。I期临床数据已经出版，转移性肿瘤患者注射了靶向CEA(是指癌胚抗原)的VRPs后，产生了临床相关CEA特异性抗体和T细胞反应，同时存在高滴度病毒中和抗体(是指能够中和病毒的抗体)。

4.3腺病毒载体

腺病毒载体系统是一个高效的疫苗载体系统。重组腺病毒载体生产依靠特有的包装细胞株，因为细胞株含有腺病毒基因产品中缺失的复制性区域。腺病毒是高效的基因递送工具，广泛适应用于各种基因治疗。早在1999年，一名遗传性酶缺陷患者通过肝动脉给予高剂量腺病毒载体进行体细胞基因治疗，因急性中毒死亡。因而对腺病毒载体的临床应用关注度随之升高，更多工作转向如何破解腺病毒毒性的分子机制。如今，已经认识到E1(病毒复制区域)是导致腺病毒高免疫原性的原因，将E1删除很大程度上增加了腺病毒载体基因治疗成功应用的可能，促进了腺病毒疫苗载体的发展应用。

基于腺病毒疫苗已经在动物实验中证明可以诱导针对各种免疫原，包括感染性因子(病毒、寄生虫或细菌病原体)和肿瘤细胞的CD8+特异性T细胞反应。目前研究最多的病毒骨架是源于人C组2和5血清型(病毒不同型别)腺病毒，因为它们具有良好的免疫原性以及在生产体系中的高稳定性和高产量。但是，C组腺病毒在多数人群中广泛流行，大部分人体内已经形成了对Ad5(5型腺病毒)的预存体液和细胞免疫反应，可能严重阻碍Ad5载体体内感染效率，影响其作为疫苗载体的使用。但是，在一项名为STEP(临床试验名称)的IIb临床研究中，利用表达HIV-1融合抗原的Ad5载体疫苗免疫病人发现，接种疫苗之前体内有循环Ad5中和抗体的病人，不仅抑制了HIV感染，甚至显示出捕获HIV病毒的趋势增加。在多个鼠及猴模型动物实验中，证实了腺病毒载体肿瘤疫苗可以有效打破免疫耐受，诱导针对靶抗原的T细胞免疫反应及B细胞免疫反应。另有研究是基于Ad6载体(6型腺病毒)设计的靶向人端粒酶(hTERT)蛋白的疫苗V934/V935，利用prime/boost策略，已经进入I/II临床试验。

当人感染Ad(腺病毒)时，机体会诱导产生中和腺病毒六邻体蛋白的抗体。六邻体蛋白由7个短的高变区域(HVRs)构成，每个HVRs都能引发一个血清型特异性免疫反应。因此，针对多数人缺乏的相关六邻体蛋白的预存免疫反应，进而选择相应腺病毒血清型，可以产生新的腺病毒载体。例如，人B组腺病毒(包括hAd3,7,11,35)和D组腺病毒(hAd26、hAd48和hAd49)在人群中相对不流行，抗hAd5抗体并不能抑制B组腺病毒载体的感染。尤其是hAd35已经被认为可以替代hAd5成为新的疫苗递送工具，因为其较低的血清阳性率，类似的还有Ad49。但是，在鼠或非人灵长类试验研究中比较B组和D组血清型腺病毒载体的免疫原性，发现均不如C组(C组腺病毒)载体，可能是因为不同的感染趋向性。

4.4溶瘤性载体

溶瘤病毒可以在肿瘤细胞内选择性复制并裂解细胞，而并不感染正常细胞。Onyx-015是第一个被设计并使用于人体的复制选择性病毒。该病毒是用Ad2/Ad5杂交并删除E1B和E3B区，并只在inactive p53(野生型P53抗原)、activated p14ARF(ARF肿瘤抑制基因，GPT结合蛋白)和late viral mRNA transport(晚期病毒mRNA转运)细胞中复制。多项临床试验用Onyx-015直接瘤内注射(5×10⁹vp，vp是指滴度)，但抗肿瘤效果十分有限，不过没有发现病毒全身蔓延。临床效果不佳的原因可能是病毒通过CAR受体(科萨奇和腺病毒受体)感染靶细胞，而多数肿瘤细胞CAR表达下调，导致腺病毒不易感染。尽管如此，2005年在中国还是批准了溶瘤腺病毒H101上市，用于联合化学治疗晚期顽固性鼻咽癌患者。由于溶瘤腺病毒的局限性，接下来应该研究基于疱疹病毒或痘病毒的溶瘤病毒。

Amgen/Biovex公司正在开发一种源于单纯疱疹病毒的溶瘤病毒OncoVEXGM-CSF，它可以选择性感染肿瘤细胞并产生GM-CSF，增加对肿瘤抗原的呈递。由于其II期临床效果较好，目前已经进入到针对黑色素瘤的Ⅲ期临床研究。另一个有前途的溶瘤疱疹病毒载体是JX-594，它是将具有复制能力的Wyeth株痘病毒通过基因工程改造后沉默其内源性胸苷激酶基因，并表达人GM-CSF和LacZ基因。2011年11月，Jennerex通过一项随机剂量变化II期临床试验得出最终数据，进展期肝癌患者应用高剂量JX-594比低剂量组总体生存率提高，具有统计学意义。高剂量组中位生存率13.8月，低剂量组6.7个月，同时中位生存率分别为66％和23％。另一项IIb期多中心试验已完成，应用JX-594治疗非sorafenib干预进展期肝癌。

4.5Prime/Boost初免/增强

研究证实利用不同方式递送同一抗原可以获得高效免疫保护反应(基因载体/蛋白，病毒载体/质粒载体)。将携带同一抗原的两种不同病毒载体序列递送，可以避免中和抗体对病毒载体疫苗的限制。该策略目前正广泛应用于针对感染性疾病的预防性疫苗研究。Barouch等^[67]利用恒河猴模型研究以SIV(猴免疫缺陷病毒)为靶点的腺病毒初免-痘病毒增强，或两种不同亚型腺病毒prime/boost策略，结果超过80％对象避免了重复感染。在肿瘤治疗性疫苗中，基于prime/boost策略最有前途的是前列腺癌疫苗PROSTVAC-VF。

研究以不同方式组合的质粒DNA和腺病毒载体prime/boost策略后，结果表明prime/boost可以介导协同免疫激活和高效的抗肿瘤免疫保护作用。事实上，在鼠类和灵长类模型的临床前研究中，已经发现prime/boost策略可以诱导比单独裸DNA或单独重组病毒载体高10-100倍的T细胞反应。利用腺病毒prime/质粒DNA boost最大的优点是腺病毒初免可以激发有力的免疫反应来打破免疫耐受，而因为缺少对质粒载体的免疫记忆反应，质粒DNA随后可以进一步增强免疫反应。在大动物模型，PeruzziD等以狗端粒酶(dTERT)为靶点利用腺病毒prime/DNA-EGT boost方法证实可以诱导有力的细胞免疫反应，同时可以延长狗恶性淋巴瘤生存率。

5、展望

肿瘤免疫治疗相关研究已经持续二十几年，虽然多数临床研究效果不佳，但最近一些列相关研究似乎获得了突破性成果。目前，多项肿瘤基因疫苗临床试验正在进行中，并有望成为上市产品。为增加治疗性肿瘤基因疫苗成功的可能，设计疫苗时可以考虑以下原则：首先是发展高效的疫苗免疫策略，如prime/boost；其次，联合基因疫苗和化疗/或免疫刺激药物；最后是选择合适的肿瘤相关抗原。总之，努力推动并建立研企合作，联合不同的基因载体平台，可以加速肿瘤疫苗向临床产品的转化。

二、靶向树突状细胞的肿瘤免疫基因治疗

靶向树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)的免疫基因治疗方式是当前肿瘤免疫治疗研究中的热点。其作用机制是将表达目的抗原的基因片段原位递送至专职抗原呈递细胞—DCs，由DCs摄取目的基因并表达相应抗原，激活抗肿瘤免疫应答。但选择什么样的载体及如何将目的基因靶向递送至DCs值得深入细致的探讨。本发明旨在试验并设计可以介导腺病毒疫苗体内特异性靶向DCs的融合蛋白。

1、肾细胞癌是免疫治疗研究的理想选择对象

肾细胞癌是成年人肾肿瘤的主要类型，约占成年人肾肿瘤的80％。局限性肾细胞癌预后相对较好，5年生存率可达70-80％，根治性肾切除术和肾部分切除术目前局限性肾癌的主要治疗方式。但是当肾细胞癌有局部浸润或者远处转移，生存时间会显著下降。传统治疗方式如放疗或化疗对转移性肾癌或复发的肾癌几乎不起作用，细胞因子如IFNα和IL-2的虽然对部分病人有效，但强烈的毒副作用限制了其进一步发展应用。因此，进展期肾细胞癌的治疗仍然充满严峻挑战，加强对肾细胞癌的预防和治疗研究工作具有重大意义。

应用免疫制剂IL-2或IFNα是当前肾细胞癌唯一的免疫治疗方法，也是晚期肾细胞癌的主要治疗方式。有报道称进展期肾细胞癌肿块有自发回缩现象，同时观察到癌组织内有肿瘤特异性免疫细胞浸润，由此可见，免疫机制在肾细胞癌自然病程起着关键作用。此外，部分病人在应用高剂量IL-2经验性治疗，可持续长达2年时间的完全免疫应答；但因为毒性问题，高剂量IL-2只适合年轻可耐受的患者人群。因此，开发与研制针对进展期肾细胞癌的新型免疫治疗药物迫在眉睫。

2、基于树突状细胞疫苗在肿瘤免疫治疗中的研究及应用

树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)是机体内功能最强的免疫提呈细胞，其高表达主要组织相容性复合体MHCⅠ类和Ⅱ类分子，可特异性激活CD8+细胞毒性T细胞反应和CD4+辅助T细胞反应，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用，是针对肿瘤抗原免疫反应的理想靶点之一。

DCs的主要功能是调节T细胞介导的免疫反应，从而激发并维持免疫应答。但肿瘤患者体内往往存在一定程度的DCs功能缺陷，不能有效递呈肿瘤抗原、诱导特异性抗肿瘤免疫反应，导致免疫耐受和肿瘤免疫逃逸，进而出现肿瘤细胞的浸润、转移及复发等。将特定的免疫基因递送至DCs，使其表达肿瘤相关抗原或免疫刺激因子，是提高DCs抗肿瘤免疫功能的有效手段之一，也是当前肿瘤免疫治疗研究的热点。目前为止，大多数的DCs疫苗都是通过体外分离病人DCs(个体化治疗)，基因转染修饰或负载肿瘤相关抗原后，再重新输入患者体内来激发抗肿瘤免疫反应。其原理是DCs从注射位点迁移至引流淋巴结，来启动免疫程序并保持免疫记忆，进而起到肿瘤细胞特异性免疫杀伤作用。

尽管体外DCs修饰性疫苗已转化至临床，并在一些传统治疗方法失败的部分患者体内诱导出特异性T细胞免疫反应。但研究也发现经体外培养并修饰后的DCs免疫活性不足，进入体内后迁移能力差，因而严重影响了疫苗的抗肿瘤效率。总之，体外DCs疫苗修饰方法耗时、费力、需要个体化以及成本高等缺点影响其规模化生产，同时体外操作的安全性、细胞制品质量控制、基因转染效率等诸多方面因素也严重制约了其进一步开展应用。而利用特定载体将免疫基因体内原位递送并修饰DCs，由DCs摄取目的基因并表达相关抗原，理论上可以激发DCs的免疫功能而不影响其天然活性，发挥DCs的抗原递呈功能，从而诱导特异性抗肿瘤免疫反应。

3、腺病毒载体在靶向DCs免疫基因治疗中的优势及不足

腺病毒载体在以DCs为靶点的基因递送上有两方面优势，首先与其它载体比较腺病毒感染DCs效率高；其次，腺病毒载体可以直接激活DCs，为接下来的T细胞活化提供必要条件。其中，重组5型复制缺陷性腺病毒因敲除了E1区基因而在体内无自主复制能力，同时可以携带长达6000bp的外源基因，因而广泛应用于肿瘤的免疫基因治疗研究中，并已经在多项临床试验中显示出强大的免疫效率。利用5型腺病毒载体内介导基因原位递送至DCs，可以避免DCs体内迁移能力差的缺点，达到与体外基因修饰DCs相同的目的。5型腺病毒载体是通过受体(coxsackievirus and adenovirusreceptor，CAR)介导途径感染宿主细胞，但由于DCs表面低表达腺病毒受体CAR，要获得足够的感染效率就必须增加病毒的滴度；同时大多数类型宿主细胞表面都表达CAR，因此应用腺病毒疫苗靶向感染DCs的同时腺病毒也会感染其它宿主细胞，可能会导致一些预想不到的毒副反应。此外，将目的基因感染至大量的非专职抗原呈递细胞和未被激活的DCs后，甚至会诱导特异性免疫耐受。因此，如何提高腺病毒特异性细胞靶向能力，是腺病毒载体靶向DCs免疫基因治疗目前存在的主要困难之一。

4、靶向DEC205分子可增强腺病毒载体修饰DCs能力

通过改变CAR介导感染细胞途径，使腺病毒载体直接靶向DCs表面特异性受体分子是腺病毒靶向DCs免疫基因治疗研究的新方向。DCs表达一系列特异性识别受体，包括DEC205、CD40、Fc、DC-sign及TLR等，可以用于提高肿瘤免疫治疗的效果。有研究利用DCs表面特异性分子Fc受体、DC-sign和CD40等构建双特异性分子，使腺病毒颗粒表面的纤维蛋白头节与之结合后再重新选择性的靶向DCs，可以在体内达到免疫基因特异性修饰DCs的目的。

其中，DEC205分子属于CLRs(凝集素受体家族)，高度并特异性表达于CD8+DCs细胞，是目前肿瘤疫苗研究发展的主要焦点。用DEC205特异性抗体递送肿瘤相关抗原可以刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞反应，抑制并延迟肿瘤的生长，并且抗肿瘤效果明显优于体外装载的DCs。抗DEC205抗体目前正用于评估表达肿瘤相关抗原NY-ESO-1的I/II期临床研究。在人体内，MoDC、CD141+DC、CD11+DC和pDC等DCs亚型都表达DEC205分子，并且体外实验中发现DEC205特异性抗体介导的抗原递送都可以激发CD4+和CD8+的T细胞反应。由此可知，靶向DEC205分子在腺病毒疫苗体内修饰DCs的肿瘤免疫基因治疗中具有重要研究意义。

发明内容

本发明的目的是提供一个可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)表面分子DEC205的双靶向融合蛋白。

本发明所提供的双靶向融合蛋白，命名为CFmDEC，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的序列9；

2)将序列表中序列9的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(DCs)表面分子DEC205作用的蛋白质，新蛋白质与序列9同源性达到80％或更高。

序列表中的序列9由520个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-236位为腺病毒受体CAR胞外段，自氨基端第237-241位为连接肽(linker)，自氨基端第242-247位为6个组氨酸序列，自氨基端第248-284位为噬菌体T4纤链蛋白，自氨基端第285-520位为抗小鼠DEC205单链抗体。

编码上述双靶向融合蛋白的基因(CFmDEC)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列8的DNA序列；

2)编码序列表中序列9的DNA序列；

3)所编码的序列80％或以上同源于序列表中序列8且具有可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(DCs)表面分子DEC205作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中序列8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的序列8由1560个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1560位碱基，编码具有序列表中序列9所示氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-708位碱基编码腺病毒受体CAR胞外段，自5’端第709-723位碱基编码连接肽(linker)，自5’端第724-741位碱基编码6个组氨酸序列，自5’端第742-825位碱基编码噬菌体T4纤链蛋白，自5’端第826-1560位碱基编码抗小鼠DEC205单链抗体。

含有本发明双靶向融合基因CFmDEC的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增双靶向融合基因CFmDEC中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述双靶向融合蛋白CFmDEC的方法。

本发明所提供的表达双靶向融合蛋白CFmDEC的方法，可包括以下步骤：

1)构建重组表达载体：将双靶向融合基因CFmDEC连接入载体pGEX-6P-1中，得到重组表达载体pGEX-CFmDEC，其核苷酸序列如序列表中序列10所示；

2)表达双靶向融合蛋白CFmDEC：将含有双靶向融合基因CFmDEC的重组表达载体pGEX-CFmDEC转化或转导宿主细胞及其后代细胞，发酵重组宿主细胞，使双靶向融合基因CFmDEC获得表达，得到双靶向融合蛋白CFmDEC。

在上述双靶向融合蛋白CFmDEC的表达方法中，所述步骤2)中的宿主为任一可表达外源基因的原核细胞；所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli BL21、E.coliRosetta、E.coli Origami、E.coli M15、E.coli JM109、或E.coli LG90等，优选为E.coli BL21(DE3)。

培养含有本发明双靶向融合基因CFmDEC的重组宿主细胞的培养基为低糖高氮适于大肠杆菌生长的培养基，如LB培养基、SOC培养基或肉汤培养基等，优选为LB培养基。

含有本发明核糖醇脱氢酶基因(RDH)的重组宿主细胞的培养条件为培养出发宿主的培养条件，优选为25℃诱导表达4-6小时。

当所述宿主为大肠肝菌时，需加入IPTG进行诱导表达，其中，所加入IPTG的浓度0.2-0.25mmol/L，优选为0.25mmol/L。

本发明还提供双靶向融合蛋白CFmDEC或双靶向融合基因CFmDEC在制备提高腺病毒疫苗抗肿瘤活性药物中的应用。

所述药物为双靶向融合蛋白CFmDEC和腺病毒疫苗按1μg CFmDEC蛋白：

1×10⁶-1×10⁸PFU(优选1×10⁷PFU)腺病毒疫苗或其等比的混合物。

利用本发明可提高腺病毒疫苗抗肿瘤活性，是将双靶向融合蛋白CFmDEC和腺病毒疫苗共混后进行免疫，比例为1μg CFmDEC蛋白：1-1.5PFU(优选1×10⁷)PFU腺病毒疫苗。

所述腺病毒疫苗可为任意的具有抗恶性肿瘤活性的腺病毒疫苗，优选为肾癌腺病毒疫苗，是将复合抗原基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1克隆至载体pDC316中得到腺病毒穿梭载体pDC316-tG250FcGB，再将腺病毒穿梭载体pDC316-tG250FcGB与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共同转染含有Cre/loxP重组酶的HEK293细胞，利用Cre/loxP在细胞内同源重组，得到重组5型复制缺陷型腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB。

所述复合抗原基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1的核苷酸序列如序列表中序列11所示，其自5’端第1-1131位碱基为异种化肾癌相关抗原G250(CAIX)基因，自5’端第1138-2520位碱基为Fc-GPI，自5’端第2568-3161位碱基为IRES序列，自5’端第3184-3597位碱基为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor,GM-CSF)基因，自5’端第3640-4428位碱基为共刺激分子B7.1基因；所述腺病毒穿梭载体pDC316-tG250FcGB的核苷酸序列如序列表中序列12所示。

本发明提供了一个可以增强5型腺病毒载体疫苗体内靶向小鼠DCs能力的双靶向融合蛋白(CFmDEC)。该融合蛋白主要由两个功能部分组成：5型腺病毒受体CAR胞外段和抗小鼠DEC205单链抗体(sFv-DEC205)。胞外段是CAR受体发挥生物学功能的主要部分，可以与5型腺病毒纤维头节蛋白结合；抗小鼠DEC205单链抗体由抗体重链和轻链部分通过linker连接在一起，可以与小鼠DCs表面DEC205分子特异性结合。CAR胞外段和sFv-DEC205再通过噬菌体T4纤链蛋白连接在一起形成双靶向融合蛋白，其中T4纤链蛋白的主要功能是可以将双靶向融合蛋白折叠成三聚体形式，使其两端的蛋白更好的发挥各自的生物学功能。同时，本发明还利用多靶点抗肾癌复合抗原基因片段sig-tG250-Fc-IRES-GM-CSF-B7.1(25)，以5型复制缺陷性腺病毒为载体构建了抗肾细胞癌腺病毒疫苗—Ad5-tG250FcGB。最后，在小鼠肾细胞癌荷瘤模型中验证了本发明的双靶向融合蛋白CFmDEC可增强肾细胞癌腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB的抗肿瘤效应：体外实验证实双靶向融合蛋白CFmDEC可以有效结合腺病毒，并提高腺病毒疫苗靶向DCs的能力；在小鼠体内能够诱导更高的特异性抗肿瘤免疫反应，抑制肾细胞癌的生长。本发明的双靶向融合蛋白CFmDEC为腺病毒疫苗靶向DCs的肿瘤免疫基因治疗的研究提供了一个新的思路，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为载体pGEX-6P-1的物理图谱

图2为不同菌液克隆的CFmDEC PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为不同阳性克隆菌液提取的质粒pGEX-CFmDEC的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图4为能够表达融合蛋白CFmDEC的原核表达载体pGEX-CFmDEC的结构示意图

图5为不同阳性克隆菌诱导表达的GST-CFmDEC融合蛋白的12％SDS-PAGE检测结果(箭头所指为目的蛋白)

图6为不同IPTG浓度下诱导表达的GST-CFmDEC融合蛋白的12％SDS-PAGE检测结果(箭头所指为目的蛋白)

图7A为不同诱导温度下诱导表达的GST-CFmDEC融合蛋白的12％SDS-PAGE检测结果

图7B为在25℃诱导温度下裂解菌液上清和沉淀中诱导表达的GST-CFmDEC融合蛋白的12％SDS-PAGE检测结果

图8为在最佳诱导条件下表达的CFmDEC融合蛋白及其纯化产物的12％SDS-PAGE检测结果

图9为标准品蛋白和待测样品(CFmDEC)与考马斯亮蓝G-250结合后的显色结果(考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕红色，结合后呈青蓝色)

图10为以校正后吸光度值A595为横坐标、以标准蛋白浓度(mg/mL)为纵坐标绘制的用于检测CFmDEC蛋白浓度的标准曲线

图11为CFmDEC融合蛋白的Western blot鉴定结果

图12为PCR扩增及回收、纯化的5型腺病毒纤维头节蛋白Ad5-knob基因的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图13为携带Ad5-knob基因的重组载体pMD18-knob的双酶切鉴定结果

图14为Ad5-knob重组表达载体pGEX-knob的双酶切鉴定结果

图15为诱导表达的全菌、破菌后上清及纯化Ad5-knob/GST蛋白的12％SDS-PAGE检测结果

图16为表达、纯化产物Ad5-knob/GST的Western blot鉴定结果

图17为共聚焦显微镜观察小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDC)的成熟情况

图18A为OD450nm随包被蛋白mBMDC膜蛋白浓度变化的曲线

图18B为OD450nm随包被蛋白Ad5-knob/GST浓度变化的曲线

图19为CFmDEC融合蛋白与小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDC)结合能力的流式细胞分析结果

图20A为共聚焦显微镜下观察CFmDEC融合蛋白增加腺病毒对mBMDC的感染情况

图20B为不同剂量CFmDEC融合蛋白与Ad5-EGFP混合后感染mBMDC 48小时后流式细胞术分析各组平均免疫荧光强度(n＝3)

图21为pVAX-tG250FcGB载体的结构示意图

图22为pDC316-GAPDH质粒图谱

图23为pBHGlox(delta)E1,3Cre质粒图谱

图24为pVAX-tG250FcGB质粒和pDC316-GAPDH质粒双酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图25A为重组穿梭质粒pDC316-tG250FcGB及其PCR鉴定结果的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图25B为重组穿梭质粒pDC316-tG250FcGB的物理图谱

图26为重组复制缺陷性腺病毒载体Ad5-tG250FcGB构建方法的流程图

图27为倒置显微镜下观察转染pDC316-tG250FcGB和pBHGlox(delta)E1,3Cre双质粒的HEK293细胞形态

图28为提取腺病毒基因组PCR鉴定融合抗原基因tG250FcGB(腺病毒载体Ad5-tG250FcGB的鉴定)

图29为Western Blot检测腺病毒感染HEK293细胞后抗原蛋白tG250FcGB表达情况(腺病毒载体Ad5-tG250FcGB的鉴定)

图30为Q Sepharose XL纯化腺病毒Ad5-tG250FcGB的洗脱记录图

图31为纯化腺病毒Ad5-tG250FcGB中的目的抗原基因及E1区基因的PCR检测结果

图32为免疫方案

图33为各组免疫小鼠皮下移植瘤成瘤时间

图34为各组免疫小鼠体内移植瘤的生长曲线

图35A为各组免疫小鼠皮下移植瘤攻击60天后各组小鼠的平均瘤重

图35B为各组免疫小鼠皮下移植瘤的肿瘤生长抑制率

图36为小鼠背部接种肿瘤(皮下移植瘤攻击)后观察各免疫组小鼠的存活情况(生存曲线)

图37为各组免疫小鼠在免疫前1周及末次免疫后2周血清中特异抗体的OD450nm值

图38为免疫后小鼠血清中IgG亚型分析中IgG1及IgG2a抗体的OD450nm值

图39为免疫后小鼠血清中IgG亚型分析中IgG1/IgG2a抗体的OD450nm值

图40A为免疫后2周各组免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-2和IFN-γ浓度

图40B为免疫后2周各组免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-4和IL-10浓度

图41为免疫小鼠脾细胞特异性IFN-γ分泌的ELISpot法检测结果示意图

图42为免疫组小鼠IFN-γ分泌的ELISPOT法检测结果

图43为LDH释放法测定免疫小鼠的CTL杀伤活性

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的内容不限于下述的实施例。

实施例1、介导5型腺病毒载体感染树突状细胞的双靶向融合蛋白CFmDEC的表达及鉴定

本实施例的内容包括：

1)获得能够介导5型腺病毒载体感染树突状细胞的双靶向融合蛋白CFmDEC的编码基因；

2)构建能够表达融合蛋白CFmDEC的原核表达载体；

3)在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白CFmDEC；

4)考马斯亮蓝法测定融合蛋白CFmDEC的浓度；

5)对融合蛋白CFmDEC进行Western Blot鉴定。

一、实验材料及主要仪器设备

1、引物、质粒、菌株

引物片段由北京中美泰和生物技术有限责任公司合成；大肠杆菌E.coli DH5α和BL21(DE3)购自中美泰和；CFmDEC基因序列由金唯智公司合成并克隆至pUC57载体。

2、工具酶

Ex聚合酶、pMD-18T和SolutionⅠ连接酶、DNA聚合酶Ⅰ(Klenow)购自TaKaRa公司；DNA限制性内切酶Nco I、BamH I和EcoR I，小牛肠碱性磷酸酶(CIP)购自New England Biolabs公司。

3、试剂及试剂盒

胰化蛋白胨及酵母提取物购自Oxoid公司；DNA电泳用琼脂糖购自Promega公司；DNA相对分子质量标准DL 2000购自TaKaRa公司；PCR试剂盒购自Takara生物技术有限公司；PCR产物纯化试剂盒、小片段胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物有限责任公司；异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)购自Promega公司；鼠抗6×His单克隆抗体购自中杉金桥有限公司，HRP标记山羊抗鼠IgG抗体购自中杉金桥公司；Western blot超敏发光液购自普利莱公司；标准相对分子质量蛋白Marker购自Thermo公司；GST亲和层析凝胶Glutathione Sepharose 4B、蛋白酶PreScission Protease购自GE Healthcare公司。

4、主要仪器设备

GeneAmp PCR System2400PCR扩增仪	Perkin Elmer公司
		THZ-95型台式恒温振荡培养箱	江苏太仓市实验设备厂
高速台式离心机	北京六一仪器厂
		labofuge 400R恒温低速水平离心机	Kendro公司
3K18高速冷冻离心机	SIGMA公司
		洁净工作台	北京半导体设备厂
电热三用水浴箱	北京长风仪器仪表厂
		EPC3000恒流恒压电泳仪	北京六一仪器厂

Scienta-ⅡD超生细胞粉碎机	成都生科仪器有限公司
		紫外分光光度计	Unioco公司
蛋白凝胶电泳槽	Bio-Rad公司
		自动凝胶成像系统Gel-Pro Analyzer	Kodak公司
FACSCalibur流式细胞仪	BD公司
		倒置显微镜	重庆光化学仪器厂

二、获得能够介导5型腺病毒载体感染树突状细胞的双靶向融合蛋白CFmDEC的编码基因

调阅文献，查找腺病毒受体CAR胞外段序列(序列表中序列1)、连接肽(linker)序列(序列表中序列2)、噬菌体T4纤链蛋白(T4Fibritin)序列(序列表中序列3)及抗小鼠DEC205单链抗体序列(其蛋白编码序列见序列表中序列7)，并在GenBank中查找其对应的碱基序列。在腺病毒受体CAR胞外段编码序列(序列表中序列4)的3’端通过15个碱基的连接肽(linker)编码序列(序列表中序列5)连上6个组氨酸(6×His，His-tag)编码序列(目的是作为检测标签)，再与噬菌体T4纤链蛋白编码序列(序列表中序列6)连接，最后在噬菌体T4纤链蛋白编码序列的下游(3’端)连上抗小鼠DEC205单链抗体编码序列(序列表中序列7)，再对该融合基因核苷酸序列进行原核表达密码子优化，得到融合基因CFmDEC。融合基因CFmDEC核苷酸序列如序列表中序列8所示，自5’端第1-708位碱基编码腺病毒受体CAR胞外段，自5’端第709-723位碱基编码连接肽(linker)，自5’端第724-741位碱基编码6个组氨酸序列，自5’端第742-825位碱基编码噬菌体T4纤链蛋白，自5’端第826-1560位碱基编码抗小鼠DEC205单链抗体。融合基因CFmDEC编码的融合蛋白CFmDEC的氨基酸残基序列如序列表中序列9所示。

合成融合基因CFmDEC后，分别在融合基因CFmDEC的上、下游引入Nco Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点，然后将该融合基因克隆至pUC57载体(购自Takara公司)中，即连接入pUC57载体多克隆位点的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点之间，得到携带融合基因CFmDEC的重组载体，命名为pUC57-CFmDEC。

三、构建能够表达融合蛋白CFmDEC的原核表达载体

1、构建载体pGEX-6P-1

用已知方法构建载体pGEX-6P-1(参考文献田仁礼，朱静潆，于继云等，小鼠CD40胞外段基因的克隆、原核表达及活性鉴定，细胞与分子免疫学杂志，2013年第11期)。其物理图谱如图1所示。

2、获得能够表达融合蛋白CFmDEC的原核表达载体(pGEX-CFmDEC)

2.1新鲜E.coli DH5α化学感受态细胞的制备(CaCl₂法)

a取-70℃保存的E.coli DH5α菌种平均接种至3管5mL LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜(10-12小时)；

b活化的菌种接种于3瓶150mL LB液体培养基中，37℃振荡培养约2-4h，使细菌生长达到对数生长期，OD_600nm＝0.3-0.6为宜；

c无菌条件下将菌液转移至无菌、预冷的聚丙烯管中，冰浴10min后4℃、8000rpm离心10min，使菌体完全沉淀；

d弃上清，用50mL预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀(轻轻晃动重悬忌吹打)，冰浴20min后4℃、8000rpm离心10min；

e弃上清，用25mL预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀，冰浴12h，加入甘油2.5mL，每只100μL分装，贮于-70℃备用。

2.2pGEX-6P-1、pUC57-CFmDEC载体转化E.coli DH5α感受态细胞

将载体pGEX-6P-1和pUC57-CFmDEC分别转化入大肠杆菌E.coli DH5α化学感受态细胞，具体操作步骤如下：

a从-80℃冰箱取两支E.coli DH5α感受态细胞，至于冰盒上，然后用移液器吸取上述两质粒各1μL，轻柔混匀；

b冰水浴30min后，将E.coli DH5α感受态细胞转移至42℃水浴锅中热休克60s；

c热休克过程结束后，将E.coli DH5α感受态细胞重新置于冰水浴中静置2min；

d移液器吸取转化后的E.coli DH5α感受态细胞50μL，均匀涂于含50μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h；

e挑取单克隆菌落，分别接种于含50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中振荡培养12h。

2.3pGEX-6P-1和pUC57-CFmDEC质粒的提取

收集转化菌液，用碱裂解法试剂盒(康为世纪公司)小量提取质粒，具体步骤如下：

a收集3mL菌液，离心，得到菌体沉淀，加入250μL Buffer P1，振荡至彻底悬浮；

b加入250μL Buffer P2，温和上下颠倒混匀4-6次，使菌体充分裂解变清亮；

c加入350μL溶液Buffer N3，立即轻轻上下颠倒混匀4-6次，直至出现白色絮状物，再12,000rpm离心10min；

d将上清液转移到已装入收集管的吸附柱，室温12,000rpm离心1min；

e倒掉废液，加入750μL Buffer PW漂洗液，12,000rpm离心1min，重复一次；

f将吸附柱重新放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量去除漂洗液；

g将吸附柱放入一个新的干净离心管中，向吸附膜的中间部位加入50μL无菌水，室温静置2-5min，12,000rpm离心1min，收集洗脱液，-20℃贮存备用。

2.4pGEX-6P-1、pUC57-CFmDEC质粒的酶切、胶回收及纯化

将质粒pUC57-CFmDEC用NcoⅠ进行酶切，将质粒pGEX-6P-1用BamH Ⅰ进行酶切，酶切体系如下：

10×Buffer	2μL
		BSA	0.5μL
pUC57-CFmDEC	10μL
		Nco Ⅰ	0.5μL
灭菌双蒸水	7μL
		总体积	20μl

10×Buffer	2μL
		BSA	0.5μL
pGEX-6P-1	10μL
		BamHⅠ	0.5μL
灭菌双蒸水	7μL
		总体积	20μl

酶切条件：37℃水浴4h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶回收试剂盒(北京康为世纪生物公司)对酶切产物进行回收及纯化，具体步骤如下：

a酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳15min，紫外灯下切下目的条带所在的胶块，按100μg/300μL溶胶液比例加入溶胶液750μL，55℃水浴溶胶，边溶边振荡；

b溶解的胶液分次移入吸附柱，12000rpm离心1min；

c弃去回收管中废液，加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，再重复漂洗一次；

d弃去回收管中废液，12000rpm离心2min；

e将吸附柱放入一干净的Ep管中，在吸附膜的中央加入50μL洗脱液，室温静置5min，12000rpm、离心1min，收集洗脱液，得到目的基因片段，-20℃保存备用。

2.5pGEX-6P-1、pUC57-CFmDEC质粒酶切回收产物的粘性末端补平、再酶切及连接

2.5.1将经回收、纯化的pGEX-6P-1、pUC57-CFmDEC质粒酶切产物用Klenow Ⅰ补平，补平体系如下：

纯化的酶切产物	15.0μL
		Klenow Ⅰ	1.0μL
10×Klenow buffer	2.5μL
		dNTP	2.0μL
双蒸水	4.5μL
		总体积	25μl

Klenow Ⅰ补平条件为：37℃恒温60mins，65℃灭活15mins。

2.5.2回收粘性末端补平的pGEX-6P-1载体片段，回收产物用EcoR Ⅰ进行酶切，酶切体系如下：

纯化补平产物	15μL
		EcoR Ⅰ	1.0μL
10×buffer 4	2.0μL
		BSA	0.2μL
双蒸水	2.8μL
		总体积	20μl

2.5.3回收、纯化经EcoRⅠ酶切的pGEX-6P-1载体片段和CFmDEC基因，将两者进行连接，10μL连接反应体系为：5μL Solution I，pGEX-6P-1载体片段1μL，CFmDEC基因4μL，连接条件为：16℃连接仪中连接30min。

2.6连接产物的转化

取新鲜制备的化学感受态细胞E.coli DH5α100μL，置于冰浴中，加入连接产物10μL，轻轻混匀后冰浴30min，立即转移到42℃水浴中热激60s，冰浴静置2min，均匀涂布于含有氨苄霉素(50μg/mL)的LB固体平板培养基上，在超净工作台吹干约10min，37℃倒置培养10-12h。从平板中挑取单一菌落约6个，分别接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中(5mL/管)，37℃、180rpm振荡培养12h。

2.7菌液PCR快速鉴定

取0.5μL过夜培养菌液，稀释10倍作为模板，用设计的上游引物F1：5’-CCATGGCCCTGCTGCTGTGCTTCGT-3’和下游引物R1：5’-GAATTCTGCGGCACGCTTGAT-3’及康为世纪公司的EsTaq Mix试剂盒进行PCR鉴定。配制50μL PCR反应体系：模板1μl，引物(50pM)F、R各1μl，Estaq Mix液25μL，去离子水22μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，扩增30个循环；72℃继续延伸7min。对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2(泳道M：DNA Marker(DL 5000)；泳道1-6：不同菌液克隆的CFmDEC基因的PCR扩增产物)所示，获得一条大小约为1560bp的条带，与预期结果相符。

2.8提取质粒并测序

提取经PCR初步鉴定片段大小正确的阳性克隆的质粒，对质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3(泳道M：DNA Marker(DL 10000)；泳道1-6：用不同阳性克隆菌液提取的质粒)所示，获得一条大小约为1560bp的条带，与预期结果相符。将阳性克隆质粒送中美泰和生物技术有限责任公司进行测序，结果阳性克隆质粒的核苷酸序列如序列表中序列10所示，与预期结果相符，将测序正确的阳性克隆质粒命名为pGEX-CFmDEC，其结构示意图如图4所示。

四、在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白CFmDEC

1、重组质粒pGEX-CFmDEC转化大肠杆菌

将鉴定正确的重组质粒pGEX-CFmDEC转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于含有氨苄霉素(150μg/mL)的LB平板上，在37℃下培养过夜(10-12小时)。

2、筛选GST-CFmDEC蛋白表达水平最高的阳性克隆菌

挑取7个不同的阳性克隆菌，在相同条件下诱导GST-CFmDEC蛋白的表达(使用GST谷胱甘肽巯基转移酶标签)，选择蛋白诱导表达较好的菌作为下一步的工作菌，并保存相应菌的菌种，具体方法如下：

a在LB平板上挑取7个阳性单克隆菌落，接种于含有氨苄霉素(150μg/mL)的5mL液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜(10-12小时)。

b按照1：100的比例取过夜培养的菌液加入到另外的含有氨苄霉素(150μg/mL)的5mL液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD600≈0.6时向各管菌液中加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，37℃、180rpm振荡培养过夜(10-12小时)。

c取诱导过夜的菌液1mL，4℃、12000rpm离心1min收集菌液，用3×Loadingbuffer处理后进行12％SDS-PAGE电泳。

d取下凝胶转入含有考马斯亮蓝染色液的容器中，在摇床中缓慢摇动染色3h后，取出凝胶，放入干净的容器中加入脱色液，缓慢摇动脱色12h，凝胶脱色后立即观察，选择诱导的目的蛋白条带最深的菌液作为GST-CFmDEC蛋白诱导表达的诱导菌。

结果如图5(泳道M：蛋白预染Marker；泳道1-7：不同阳性克隆菌表达的GST-CFmDEC)所示，4号菌表达出了大小约81kDa的目的蛋白，较其它阳性克隆菌表达浓度相对较高，因而选择4号菌作为诱导表达GST-CFmDEC蛋白的工作菌，将该菌株命名为pGEX-CFmDEC(+)BL21(DE3)。

3、GST-CFmDEC蛋白表达中IPTG诱导浓度的优化

a根据上一步实验结果选择目的蛋白GST-CFmDEC诱导表达水度较高的4号克隆作为实验的诱导菌，按照1：100的比例，将未诱导的4号菌液分别接种到5管含有5mL液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD600≈0.6时，向其中4管中加入IPTG使其终浓度分别为：0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L、1.0mmol/L，37℃、180rpm振荡培养过夜(10-12小时)，另外一管作为未诱导前的对照。

b取诱导过夜的菌液1mL，4℃、12000rpm离心1min收集菌液，用5×Loadingbuffer处理后进行12％SDS-PAGE电泳。

c染色并脱色后分析电泳结果，选择最佳的IPTG诱导浓度。

不同的IPTG诱导浓度诱导GST-CFmDEC蛋白的表达情况如图6(泳道M：蛋白预染Marker；泳道1-4：不同IPTG浓度下GST-CFmDEC的表达水平)所示，可见其它诱导条件相同时，IPTG浓度为0.25mmol/L时诱导的GST-CFmDEC蛋白表达水平较高，因此选择0.25mmol/L作为诱导表达GST-CFmDEC蛋白的最佳IPTG诱导浓度。

4、GST-CFmDEC蛋白表达中诱导温度的优化

根据以上实验结果，选择4号菌液和IPTG浓度为0.25mmol/L进行后续实验，菌液诱导前的步骤与以上步骤相同，其它步骤如下：

a加入IPTG后，选择18℃、22℃、25℃、30℃四个温度进行诱导表达，180rpm振荡培养4h。

b收集菌液，进行12％SDS-PAGE电泳。

c分析电泳结果，确定最佳诱导温度，然后确定该温度下的蛋白可溶性表达情况。

d收集所选温度诱导的菌液1mL，离心收集菌液，用PBS洗2遍后，用1mL的PBS重悬，超声破碎菌体使菌液变澄清。

e 4℃、12000rpm离心1min，收集上清及菌体沉淀，菌体沉淀用1mL PBS重悬，上清及菌体沉淀用5×Loading buffer处理后进行12％SDS-PAGE电泳。

f分析电泳结果，确定最适的诱导温度下可溶性蛋白的表达情况。

不同诱导温度下GST-mPSCA蛋白的表达情况如图7A(泳道M：蛋白预染Marker；泳道1-4：在温度分别为18℃、22℃、25℃、30℃下诱导的全菌液GST-CFmDEC表达情况)所示，IPTG诱导浓度相同(0.25mmol/L)的情况下，改变诱导温度，根据图7A可见其它诱导条件相同时，在25℃下诱导的GST-mPSCA蛋白表达水平较好，因此选择25℃作为诱导表达GST-CFmDEC蛋白的最佳诱导温度。

25℃诱导时菌液超声后分别取沉淀、上清进行12％SDS-PAGE电泳分析，验证该诱导温度下GST-mPSCA可溶性表达的情况。结果如图7B(泳道M：蛋白预染Marker；泳道1：超声后上清中的GST-mPSCA蛋白；泳道2：超声后沉淀中的GST-mPSCA蛋白)所示，在诱导温度25℃时上清中含有大量的融合蛋白GST-mPSCA。

5、纯化诱导表达的GST-CFmDEC融合蛋白

a取过夜培养的4号阳性克隆菌液5mL转接入500mL氨苄霉素抗性(150μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养，至菌液在600nm波长处的吸光值OD600≈0.6时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L，25℃诱导表达4.5h。

b将菌液分成两部分倒入离心管中，4℃、8000rpm离心5min收集菌液，用PBS洗涤2次后，用50mL PBS重悬菌液。

c将重悬的菌体置入冰浴中，超声裂解菌体至菌液清亮。

d 4℃、8000rpm离心5min，收集菌液上清至新的离心管中，弃沉淀，将收集的菌液上清用0.45μm滤膜过滤。

e Glutathione Sepharose^TM4B凝胶的预处理：取400μL凝胶，4000rpm离心2min，用枪尖吸出凝胶上层的保护液，用等体积冰浴PBS重悬，4000rpm离心2min，弃上清，重复洗一次。

f用50％体积的冰浴的PBS重悬凝胶，并将其与过滤后的菌液上清充分混匀，4℃在混匀仪上混匀4h。

g 4000rpm离心5min，收集凝胶，轻柔去除上清，用10倍体积的冰PBS洗涤凝胶3-5次左右，可以适当增加洗涤次数。

h去除上清后向沉淀混合物中加入10mmol/L还原性谷胱甘肽洗脱缓冲液200μL洗脱目的蛋白GST-CFmDEC，重复洗脱6-8次，通过12％SDS-PAGE电泳检测洗脱蛋白情况。

6、GST标签切除及纯化CFmDEC融合蛋白

通过PreScission Protease切除GST-CFmDEC融合蛋白中的GST标签，得到CFmDEC融合蛋白，具体步骤如下：

a配制PreScission cleavage buffer：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM dithiothreitol(DTT)，pH7.5。

b步骤5f后，用10倍体积PreScission cleavage buffer洗涤GlutathioneSepharose^TM4B凝胶3次。

c准备PreScission Protease混合物：按照1mL Glutathione Sepharose^TM4B凝胶加入80μL(10units)PreScission Protease，用PreScission cleavage buffer将其稀释至1mL(1mL Glutathione Sepharose^TM4B可以结合8mg蛋白)。

d将PreScission Protease混合物与Glutathione Sepharose凝胶混合后，于4℃混匀仪上混合12h。

e混匀后，4℃、500rpm离心5mins，回收上清，目的蛋白CFmDEC包含于上清中，而GST部分和PreScission Protease仍结合在凝胶上。

结果如图8(泳道M：蛋白预染Marker；泳道1：pGEX-CFmDEC(+)BL21(DE3)诱导表达后的全菌液；泳道2：pGEX-CFmDEC(+)BL21(DE3)诱导表达后的破菌上清；泳道3-4：纯化后的GST-CFmDEC蛋白；泳道5：经PreScission Protease切割后的CFmDEC蛋白；泳道6：浓缩后的CFmDEC蛋白)所示，在最佳诱导条件(pGEX-CFmDEC(+)BL21(DE3)菌株，IPTG终浓度为0.25mmol/L，25℃诱导4h)下，GST-CFmDEC融合蛋白的可溶性表达情况最好，诱导菌液上清经Glutathione Sepharose凝胶纯化并利用PreScission Protease切割后，获得的目的蛋白经SDS-PAGE分析，可见一条清晰的相对分子质量大小约为60kDa的条带(箭头所指)，与预期的CFmDEC蛋白大小相符。

7、考马斯亮蓝法测定CFmDEC蛋白浓度

a考马斯亮蓝G-250(0.01％)染液配制：称取0.01g考马斯亮蓝G-250，溶于5mL90％乙醇中，加入85％(m/v)的磷酸10mL，最后用蒸馏水定容至100mL，将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。

b标准品蛋白配制：取1μg/μL的牛血清白蛋白(BSA)，用蒸馏水稀释至0.1-0.5μg/μL不同梯度的浓度。

c取96孔板，每孔加入200μL考马斯亮蓝染色液，分别取10μL的0、0.1-0.5μg/μL不同浓度的标准品蛋白以及纯化后的CFmDEC，加入到含有200μL考马斯亮蓝染色液的孔内，轻微振荡混匀，静置10mins。

d打开酶联仪，将波长调至595nm，放入待测96孔板，读取吸光度值。

e用标准品蛋白对应的A595值减去空白对照对应的A595值，得出校正后的吸光度值A595；再以校正后吸光度值A595为横坐标、标准蛋白浓度(μg/μL)为纵坐标作散点图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线得出公式，根据测出的待测样品的A595值，计算出纯化的CFmDEC浓度。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕红色，当标准品蛋白和待测样品与其结合后会呈青蓝色(见图9)。将标准品蛋白加入到染色液中，静置10mins后用酶联仪读取各孔所对应的A595值，用其减去空白对照所对应的A595值，得到了不同浓度标准品蛋白的校正A595值，如表1所示。

表1不同浓度标准品蛋白的校正A595值

标准品蛋白浓度(μg/μL)	A595	校正后A595
			0	0.378	0
0.1	0.515	0.137
			0.2	0.573	0.195
0.3	0.774	0.396
			0.4	0.901	0.523
0.5	0.954	0.576

以校正后吸光度值A595为横座标，标准蛋白浓度(mg/mL)为纵坐标，作散点图，即得到一条标准曲线(见图10)，由此标准曲线得出公式：y＝0.8071x+0.0042。

所得样品校正OD值为0.424，将其带入公式y＝0.8071x+0.0042，得出经纯化浓缩的CFmDEC融合蛋白浓度为0.35μg/μL。

五、Western Blot鉴定纯化的CFmDEC融合蛋白

取20μl纯化后的CFmDEC蛋白进行Western Blot检测，同时以GAPDH蛋白作为检测的阳性对照，具体步骤如下：

a取CFmDEC蛋白样品进行12％SDS-PAGE电泳：制备分离胶(10％)，积层胶(10％)，每个电泳孔道中加入20μl样品，同时加入预染蛋白Marker，80V恒压至样品到达积层胶与分离胶交界时，提高电压至120V，至溴酚蓝条带到达胶的底部时停止电泳。

b电泳结束后，切取分离胶进行恒流转印：将滤纸，PVDF膜剪成与胶同样大小；PVDF膜浸入甲醇30s后，与滤纸浸入转移Buffer中平衡15min；将滤纸和凝胶逐层铺平，勿有气泡和皱褶；恒流180mA，冰浴下转移2h。

c转印结束后，将PVDF膜置于含有5％脱脂奶粉的TBST溶液封闭液中，室温封闭2h。

d用封闭液按照1：1000稀释小鼠抗6×His单克隆抗体，4℃孵育过夜。

e TBST洗膜3次，每次10min。

f加入用封闭液1：5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小时。

g TBST洗膜3次，每次10min。

h暗室中ECL显影：在暗室中红色灯光的照明下，在曝光盒内置一保鲜膜，将PVDF膜有蛋白的一面向上；取ECL发光试剂盒内适量的A液和B液，按1：1比例混匀后均匀滴到PVDF膜上；将PVDF膜包在两层保鲜膜之间，发光反应1min后在上层保鲜膜上放感光胶片曝光约30s；将曝光后的胶片浸于显影液中显影约3min；看到条带后将胶片浸于定影液中定影约5min；将定影后的胶片自来水冲洗晾干，保存实验结果。

Western blot鉴定结果如图11(泳道1：CFmDEC融合蛋白；泳道2：阴性对照(未诱导的菌液蛋白))所示，CFmDEC融合蛋白内部含有His标签，因此，用特异性的小鼠抗6×His抗体可以检测到分子量与预期片段大小一致的特异性条带，可见纯化后的CFmDEC融合蛋白具有与特异性抗体结合的能力。

腺病毒在感染细胞的过程中，首先也是最关键的程序即受体识别。腺病毒感染宿主细胞时，首先通过三聚纤维蛋白球形区域与宿主细胞初级受体结合，然后病毒五临体基质与整合素α相互作用，并通过受体介导内吞作用摄入病毒粒子。腺病毒A、C、D、E、F纤维受体已经被确认为CAR。CAR属于跨膜蛋白，包括胞外区的D1、D2两个结构域，一个跨膜区和C末端的胞内区，其中CAR胞外段区域足以满足病毒的粘附和感染需求。对腺病毒纤维突与CAR D1区的结构分析证实，负责与CAR结合的氨基酸残基定位于两个相邻扭结单体连接所形成的侧面，由此可以得出腺病毒纤维突与CAR亲和的机制，即三个CAR分子能够同时结合一个纤维头节三体。

在众多腺病毒载体靶向DCs免疫基因治疗研究中，运用较多的是5型复制缺陷型腺病毒载体，因其具有载量大、感染效率高以及可以激发非特异性免疫反应等优点。在体外实验中，利用5型腺病毒载体感染树突状细胞可以获得较高的目的抗原表达效率，然而单纯腺病毒体内研究发现，腺病毒往往不能达到理想的DCs靶向性。究其原因，首先腺病毒载体具有体内多种宿主细胞广泛趋向性，能够同时感染体内多种类型细胞；另外腺病毒是通过受体介导途径感染细胞，因此低表达或无表达腺病毒受体的细胞类型(如抗原呈递细胞DCs)就难以被腺病毒感染。因此如何使腺病毒特异性靶向此类细胞，是腺病毒载体靶向DCs治疗研究中存在的主要难题之一。

DCs细胞表面腺病毒受体表达量低，单纯体内腺病毒递送治疗往往不能使腺病毒有效滴度集中趋向于DCs，达不到预期的靶向DCs目的。然而多项研究证明，利用过渡分子介导可以改变腺病毒的自然趋向性，即将腺病毒靶向于DCs细胞上特异性表达的受体分子，通过特异性受体来介导腺病毒靶向DCs。CD40及Fc受体等虽然可以靶向DCs，但同时也会靶向巨噬细胞、B细胞等其他细胞，缺乏对DCs的绝对特异性；DCs上众多表面分子中，DEC205分子已经被证实为甘露糖受体家族成员之一，是一种胞饮受体并且只限制表达于DCs表面，非常适合于靶向DCs的研究。虽然目前还没有发现DEC205的自然配体，但针对人和小鼠DEC205分子的单链抗体序列已经被确认，并在一些实验研究中证实，与DEC205单克隆抗体相同，DEC205单链抗体连接抗原后与DEC205分子同样可以特异性结合。本实施例的目的即通过构建一种双靶向融合蛋白分子来改变5型腺病毒的趋向性，使腺病毒载体特异性靶向DCs细胞。为了能够介导腺病毒特异性感染DCs，双靶向融合蛋白必须具备以下三点特征：1)双靶向融合蛋白具备稳定的生物学结构；2)可以与5型腺病毒颗粒特异性结合；3)能够与DCs表面特异性受体结合。具备以上三点就可以使病毒产生新的靶向性趋势。在本发明的双靶向融合蛋白分子CFmDEC中，由5型腺病毒受体CAR胞外段、噬菌体T4纤链蛋白和抗DEC205单链抗体组成。在双靶向融合蛋白中引入噬菌体T4纤链蛋白可以使其两端的功能域形成三聚体形式，使其中的受体CAR与5型腺病毒表面的纤维头节蛋白能更加有效的进行三价结合。腺病毒受体CAR表达于宿主细胞表面，可以介导细胞对5型腺病毒的内吞作用，其胞外段是发挥生物学功能的主要部分，因此选择CAR胞外段部分来构建双靶向融合蛋白。在体外，双靶向融合蛋白中的CAR胞外段功能域与5型腺病毒纤维头节蛋白结合后，可以阻断腺病毒的自然靶向趋势；将5型腺病毒与双靶向融合蛋白CFmDEC结合后，利用双靶向融合蛋白中的抗小鼠DEC205单链抗体部分与DCs表面受体分子DEC205特异性结合，从而介导5型腺病毒特异性靶向DCs细胞。最终，将具有各自生物学功能的三段区域通过linker拼接在一起，构成可以介导5型腺病毒特异性靶向DCs的双靶向融合蛋白，通过双靶向融合蛋白作为“桥梁分子”来介导5型腺病毒载体特异性集中靶向DCs细胞，进而增加腺病毒感染DCs细胞的效率，使DCs细胞能够高效表达并递呈目的抗原。

本发明选择的pGEX-6P-1原核载体表达效率高，适合量产，同时携带GST标签，易于分离纯化，而且可以增加可溶性蛋白的表达。在确定好双靶向融合蛋白各部分组成后，将其拼接的基因序列按原核表达系统密码子要求进行序列优化，并克隆至原核表达载体中，IPTG诱导蛋白表达，并利用PreScission Protease切割GST蛋白标签并纯化双靶向融合蛋白CFmDEC。纯化后的重组双靶向融合蛋白CFmDEC经Western Blot检测可以与特异性抗体发生反应。综上所述，本实施例成功构建、表达及纯化了双靶向融合蛋白CFmDEC，为下一步的功能验证实验奠定了坚实的基础。

实施例2、介导腺病毒感染DC的双靶向融合蛋白CFmDEC的体外功能验证

本实施例的目的是鉴定双靶向融合蛋白CFmDEC的生物学活性和验证体外功能，具体内容包括：

1)构建表达5型腺病毒纤维头节蛋白(Ad5-knob)的原核表达载体pGEX-knob，在大肠杆菌BL21(De3)中表达并利用GST琼脂糖凝胶纯化，得到5型腺病毒纤维头节蛋白Ad5-knob；

2)通过酶联免疫吸附试验(ELISA)验证双靶向融合蛋白CFmDEC与5型腺病毒纤维头节蛋白Ad5-knob的特异性结合能力；

3)分离及培养小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDC)，提取细胞膜蛋白，ELISA验证双靶向融合蛋白CFmDEC与mBMDC膜蛋白的结合能力；

4)用流式细胞术分析双靶向融合蛋白CFmDEC与小鼠骨髓来源DCs细胞的结合能力，以及双靶向融合蛋白CFmDEC介导腺病毒感染小鼠树突状细胞的能力，为下一步双靶向融合蛋白CFmDEC介导5型腺病毒靶向DCs的体内功能评价奠定基础。

一、实验材料及主要仪器设备

1、引物、菌株及实验动物

引物片段由中美泰和生物技术有限责任公司合成；大肠杆菌E.coli DH5α、原核表达菌株E.coli BL21(DE3)购自Takara公司；6-8周龄雄性Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。

2、工具酶和其它试剂

Solution Ⅰ连接酶购自TaKaRa公司；DNA限制性内切酶Xho Ⅰ、BamH Ⅰ购自NewEngland Biolabs公司；DNA片段纯化试剂盒、DNA片段凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京康为世纪生物技术有限公司；DNA电泳用琼脂糖购自Promega公司；高保真DNA聚合酶(Ex)试剂盒、DNA相对分子质量标准DL 2000Marker购自TakaRa公司；注射用氨苄青霉素钠粉针剂购自华北制药有限公司；小鼠抗GST单克隆抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体购自中杉金桥公司；HRP标记小鼠抗6×His单克隆抗体购自康为世纪公司；FITC标记小鼠抗6×His单克隆抗体购自博胜经纬公司；FITC标记山羊抗小鼠CD11c、PE标记山羊抗小鼠CD80抗体、PE标记山羊抗小鼠MHCⅡ抗体购自ebioscience公司；Western Blot超敏发光液购自普利莱公司；标准相对分子质量蛋白Marker购自Thermo公司；细胞膜蛋白提取试剂盒购自生工生物工程技术有限公司；GST亲和层析凝胶购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司。

3、仪器设备

GeneAmp PCR System2400PCR扩增仪	Perkin Elmer公司
		THZ-95型台式恒温振荡培养箱	江苏太仓市实验设备厂
高速台式离心机	北京六一仪器厂
		labofuge 400R恒温低速水平离心机	Kendro公司
3K18高速冷冻离心机	SIGMA公司
		洁净工作台	北京半导体设备厂
电热三用水浴箱	北京长风仪器仪表厂
		EPC3000恒流恒压电泳仪	北京六一仪器厂
SL-3数控层析冷柜	北京四环科学仪器长

紫外分光光度计	Unioco公司
		自动凝胶成像系统Gel-Pro Analyzer	Kodak公司
倒置显微镜	重庆光化学仪器厂

二、5型腺病毒纤维头节蛋白Ad5-knob的原核表达

1、5型腺病毒纤维头节蛋白Ad5-knob基因序列的获得

1.1设计引物

根据Gene Bank中公布的5型腺病毒纤维头节蛋白Ad5-knob基因序列(GenBank号：AC_000008.1)设计上、下游引物，分别引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点(划线部分)以及保护性碱基，引物序列如下：

上游引物F2：5’-CCCGGATCCGGTGCCATTACAGTAGGAAACAAAA-3’；

下游引物R2：5’-CGCCTCGAGTTATTCTTGGGCAATGTATGAAAAAGTG-3’。

1.2PCR扩增5型腺病毒纤维头节蛋白Ad5-knob基因序列

以pAdeasy(购自Promega)为模板，在引物F2、R2的引导下进行PCR扩增，反应体系如下：

ExTaq	0.5μL
		ExTaq	Buffer
dNTP	Mixture
		引物F	1μL
引物R	1μL
		pAdeasy	1μL
灭菌去离子水	33.5μL
		总体系	50μL

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环；72℃继续延伸7min。反应结束后，取PCR扩增产物50μL再切胶回收、纯化PCR扩增产物，对其进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图12(泳道M：DNAMarker(DL2000)；泳道2：经回收、纯化的Ad5-knob基因)所示，与预期结果相符。将回收、纯化的Ad5-knob基因连入pMD18-T载体(购自Takara)将连接产物转化E.coli.DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提质粒，对其进行双酶切鉴定，结果如图13(M:DNAMarker(DL5000)；1:pMD18-knob重组质粒；2:BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切重组质粒pMD18-knob(箭头所指为酶切下的Ad5-knob基因片段))所示，表明获得了连接位置正确的重组载体。送中美泰和公司测序，测序结果表明获得了序列正确(与GenBank公布的5型腺病毒knob基因序列完全相同)的携带Ad5-knob基因的重组载体，命名为pMD18-knob。

2、构建表达5型腺病毒纤维头节蛋白Ad5-knob的原核表达载体pGEX-knob

用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ对重组载体pMD18-knob进行双酶切，回收、纯化酶切产物Ad5-knob基因，再用同样的限制性内切酶酶切载体pGEX-6P-1，将Ad5-knob基因和pGEX-6P-1酶切产物分别用1％琼脂糖电泳分离、纯化回收后进行连接，连接体系为：1μL载体pGEX-6P-1片段，4μL Ad5-knob基因，5μL Solution Ⅰ连接酶，连接条件为：用16℃连接30min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于含氨苄霉素的LB固体培养基中，12小时后筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，先进行PCR鉴定，结果经PCR扩增可以获得大小约为588bp的DNA片段，再用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切鉴定，结果如图14(M1:DNA Marker(DL15000)；M2:DNA Marker(DL2000)；1:pGEX-knob质粒；2:pGEX-knob的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切产物)所示，表明获得了序列及连接位置均正确的Ad5-knob的原核表达载体，命名为pGEX-knob。

3、重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

3.1重组蛋白在E.coli.BL21(DE3)宿主菌的诱导表达

将鉴定正确的重组表达载体pGEX-knob转化至感受态细胞E.coli.BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，37℃培养过夜。将50μL菌液接种于5mL氨苄霉素抗性LB培养基中，37℃振荡培养至OD600≈0.6。取出1mL未诱导的菌液作为对照，其余菌液加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，分别在30℃、25℃、22℃下继续诱导培养4h。培养结束后取1mL菌液12000rpm离心1min，加入SDS上样缓冲液后100℃加热10min，行12％SDS-PAGE鉴定双靶向融合蛋白的表达情况，以pGEX-6p-1空载体转化菌并经诱导表达的菌液作为对照。

在诱导温度分别为30℃、25℃、22℃下诱导的全菌及破菌后的上清液进行SDS-PAGE检测，结果如图15(M:蛋白预染marker；1:pGEX42a诱导后全菌；2-4:pGEX-knob在温度分别为30℃、25℃、22℃下诱导的全菌；5:破菌后上清液)所示，经过优化诱导条件(诱导温度优选为25℃)实现了重组蛋白在上清中的可溶性表达。

3.2Ad5-knob/GST重组蛋白的纯化

将Ad5-knob E.coli.BL21(DE3)表达菌以1:200转接800mL LB培养液(含200mg/L氨苄青霉素)，37℃振荡培养至OD600≈0.6；按预实验摸索条件，确定加入IPTG至终浓度0.25mmol/L，25℃诱导表达4h。4℃、8000rpm离心5min收集细菌，采用韦氏博慧GST亲和层析凝胶纯化目的蛋白，具体步骤如下：

a.缓冲液配制：缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH8.3；缓冲液Ⅱ：50mM Tris-HCl，20mM还原型谷胱甘肽，pH8.3。

b.20mL预冷的缓冲液Ⅰ重悬菌体，超声裂菌30min，使表达的可溶性蛋白完全释放。

c.4℃、12000r/min离心30min，收集超声上清液并保存于冰盒上。

d.取GST亲和层析凝胶1mL装柱，用10倍柱体积去离子水在位清洗，流速1mL/min；

e.接着用10倍柱体积缓冲液Ⅰ平衡亲和柱，再将超声所获上清液上样，流速1mL/min；

f.10倍体积缓冲液Ⅰ冲洗杂蛋白，流速1mL/min；最后用缓冲液Ⅱ洗脱GST标签目的蛋白。

g.取20洗脱样品，行10％SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，检测洗脱效果。

对纯化洗脱后的目的蛋白Ad5-knob/GST也进行12％SDS-PAGE分析，结果如图15(M:蛋白预染marker；6:洗脱的重组蛋白)所示，可见一清晰的相对分子质量大小约为47KD的蛋白带，与预期的重组Ad5-knob/GST蛋白大小相符。

3.3表达、纯化产物Ad5-knob/GST的Western blot分析

将纯化的重组蛋白Ad5-knob/GST经12％SDS-PAGE分离后点转移至PVDF膜，以5％脱脂奶粉/TBST室温封闭2h，用1:200稀释小鼠抗GST单克隆抗体孵育过夜，TBST洗膜3次，10min/次，最后加入1:5000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体室温孵育1h，TBST洗膜3次，10min/次，之后暗室显影。未诱导的转化pGEX-knob的菌液总蛋白按相同步骤操作，作为对照。

Western blot鉴定结果如图16(1:pGEX-knob质粒未诱导；2:诱导后纯化的Ad5-knob)所示，纯化的重组Ad5-knob蛋白与小鼠抗GST单克隆抗体有很高的特异性反应，Western Blot显影后可以检测到相对分子质量与预期片段大小一致的特异性条带，将洗脱的目的蛋白命名为Ad5-knob/GST，-20℃保存备用。

三、小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDC)分离与培养

a取6-8周龄雌性Balb/c小鼠，颈椎脱臼法处死，浸入75％乙醇中5-10min；

b超净台内无菌手术取出小鼠完整股骨、胫骨，剔净周围组织，用70％酒精浸泡消毒2-5min，用PBS冲洗干净；

c离断股骨及胫骨干骺端，用1mL注射器抽吸RPMI-1640培养基冲洗冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白；

d收集骨髓细胞，过200目筛网过滤细胞悬液，去除组织碎片，于1700rpm转速，离心10min；

e弃上清，加入2mL红细胞裂解液Tris-NH₄Cl重悬，室温下静置2min，充分溶解红细胞；

f 2min后加入PBS终止裂解，再次离心，1700rpm，10min，弃上清；

g PBS洗涤后重悬于含10％胎牛血清、500U青霉素/链霉素的RPMI-1640完全培养基，并将细胞分至六孔细胞培养板，37℃、5％CO₂培养4小时；

h 4小时后吸出上层液体及悬浮淋巴细胞，保留贴壁细胞，每孔加入3mL含10％胎牛血清、500U青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基，同时加入小鼠重组GM-CSF和小鼠重组IL-4至终浓度分别为20ng/mL；

i隔日用含上述细胞因子的RMPI-1640完全培养基半量换液，至第7日加入小鼠重组TNF-α至终浓度为500ng/mL，继续培养1天；

j培养至第8天，用吸管轻轻吹打并收集所有悬浮细胞，即为小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDC)。备用于后续实验。

k取部分细胞，利用FITC标记山羊抗小鼠CD11c单克隆抗体、PE标记山羊抗小鼠CD80单克隆抗体和PE标记山羊抗小鼠MHCⅡ单克隆抗体，分别与细胞孵育30min，PBS洗涤3次后，流式细胞术鉴定细胞亚型。

共聚焦显微镜观察mBMDC成熟情况：收集培养至第8天后的小鼠骨髓来源DC细胞，用FITC标记的山羊抗小鼠CD11c单抗、PE标记的山羊抗小鼠CD80单抗和山羊抗小鼠MHCⅡ单抗染色，共聚焦显微镜下观察细胞染色，分析小鼠DC细胞亚型。结果如图17(A:PE标记抗mCD80抗体(40×)；B:FITC标记抗体mCD11c抗体(40×)；C:PE标记抗体mMHCⅡ抗体(40×))所示，证明分离与培养的小鼠骨髓来源DC细胞处于成熟状态。

四、提取小鼠骨髓来源树突状细胞(mBMDC)的膜蛋白

根据生工生物工程公司的《细胞膜蛋白提取试剂盒》提取小鼠骨髓来源DC细胞膜蛋白，具体步骤如下：

a.取步骤2.3收集的小鼠DC细胞约1×10⁶个，1000rpm离心5min，弃去培养液，细胞再用预冷的PBS洗涤两遍；

b.向上一步收集的细胞中加入1000μL预冷的溶液A(使用前每1mL溶液A加入1μL DTT，10μL PMSF，1μL蛋白酶抑制剂和5μL磷酸酶抑制剂)，超声破碎细胞，每次30s，3-4次，每次间隔1min，置于冰上冷却。超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％。

c.将匀浆液转移至冷的离心管中，4℃、3000rpm离心10min，弃上清。

d.向沉淀中加入500ul预冷的溶液B(使用前每1mL溶液B加入1μL DTT，10μLPMSF，1μL蛋白酶抑制剂和5μL磷酸酶抑制剂),涡旋震荡10s，在冰上放置30分钟,期间取出震荡5-6次

e.4℃、16000rpm离心10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得膜蛋白；考马斯亮蓝法蛋白定量后分装，保存于-80℃备用。

五、酶联免疫吸附实验(ELISA)验证CFmDEC与靶蛋白的结合

用Ad5-knob/GST蛋白和mBMDC膜蛋白分别包被ELISA板，检测双靶向融合蛋白CFmDEC与Ad5-knob/GST蛋白和mBMDC细胞膜蛋白中DEC205分子的结合能力，具体方法如下：

a.包被：纯化的Ad5-knob和mBMDC细胞膜蛋白用包被液倍比稀释后，100μL/孔包被ELISA板，同时用同样倍比稀释的BSA作为阴性对照包被酶联板，4℃静置包被过夜；

b.洗涤：将ELISA板孔中包被液扣出，每孔用200μL PBST洗涤，放到脱色摇床中轻微震荡2min，在吸水纸上扣干，重复5次；

c.封闭：每孔加入含5％BSA的PBS 100μL，37℃封闭2h后弃去封闭液，扣干酶联板，PBST洗涤5次；

d.双靶向融合蛋白CFmDEC孵育：纯化的双靶向融合蛋白CFmDEC用PBS稀释至1μg/mL加入酶联板，100ul/孔，37℃孵育1h

e.抗体标记：PBST洗板5次后吸水纸上扣干，加入1：5000稀释的HRP标记的小鼠抗6×His单克隆抗体，37℃孵育1h；。

f.显色：PBST洗涤酶联板5次，吸水纸上扣干，加入TMB显色液100μl，37℃显色15min；

g.终止显色：加入2M H₂SO₄，50μl/孔，终止反应；

h.测OD值：Biorad酶联仪检测450nm的OD值，根据读数结果绘制反应曲线。

以纯化的Ad5-knob蛋白和提取的膜蛋白(含mDEC205)包被酶标板，用双靶向融合蛋白CFmDEC作为一抗结合mDEC205，再以HRP标记鼠抗6×His对包被蛋白进行ELISA检测，同时以不加CFmDEC作为空白对照，每个稀释度做3个副孔。终止显色后，空白对照呈阴性反应，CFmDEC重组蛋白均呈阳性反应。将Elisa检测结果以包被蛋白浓度为横坐标、以OD_450nm为纵坐标绘制曲线(见图18A和18B)，得出线性回归方程分别为：y＝0.0039x+0.3392，R²＝0.9458和y＝0.0107x+0.4423，R²＝0.9697，故y与x之间呈较高的相关性。因此，可以表明本发明的介导腺病毒感染DC细胞的CFmDEC双靶向融合蛋白可以与其靶蛋白特异性结合。

六、流式细胞分析双靶向融合蛋白CFmDEC与mBMDC结合能力

为检测CFmDEC与小鼠骨髓来源成熟DC的结合能力，将纯化的重组蛋白CFmDEC与mBMDC共孵育，CFmDEC可以通过抗mDEC205单链抗体部分与小鼠DC上DEC205受体分子结合；然后用FITC标记小鼠抗6×His单克隆抗体染色，利用重组蛋白CFmDEC上的His标签，通过FITC标记抗His单克隆抗体及流式细胞仪来检测双靶向融合蛋白CFmDEC与小鼠骨髓来源DC细胞的结合能力，具体步骤如下：

a.收集的小鼠骨髓来源树突状细胞，1000rpm离心5min，弃上清培养液；

b.5mLPBS重悬洗涤细胞，1000rpm离心5min，重复3次，尽量去除培养基中的残余血清；

c.将1ug纯化的重组蛋白CFmDEC用PBS稀释至200ul，4℃下与mBMDC共孵育30min，同时以1ug BSA用200ul PBS稀释后孵育细胞作为阴性对照；

d.将孵育后的小鼠BMDC细胞用PBS重悬洗涤，1000rpm，离心5min，重复3次；

e.收集细胞并用FITC标记的小鼠抗6×His单克隆抗体100ul，终浓度为2μg/mL，4℃孵育30min；

f.5mL PBS洗涤细胞两次，最后用200μl PBS重悬细胞，流式细胞术检测细胞膜染色情况。

经流式细胞仪分析，结果如图19(A：空白对照(BSA)；B：双靶向融合蛋白CFmDEC)所示，实验组阳性率为15.45％，证明CFmDEC可以通过抗DEC205单链抗体与mBMDC表面DEC205分子有效结合。

七、检测重组蛋白的腺病毒递送能力

将双靶向融合蛋白CFmDEC与携带绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒载体(Ad5-EGFP，购自Clotech公司)以不同的比例共孵育，感染小鼠骨髓来源DC细胞，检测双靶向融合蛋白介导腺病毒感染小鼠DC的效率，具体步骤如下：

a.将收集的小鼠骨髓来源DC细胞分至24孔细胞培养板，调整至每孔细胞浓度为1×10⁵个；

b.感染滴度为10⁶PFU的腺病毒Ad5-EGFP与剂量分别为0，10ng，50ng，100ng，150ng的CFmDEC双靶向融合蛋白室温下混合共孵育30min；

c.将腺病毒Ad5-knob和双靶向融合蛋白CFmDEC的混合物，加入含有小鼠BMDC细胞的24孔培养板中，5％CO₂、37℃培养4小时；

d.更换小鼠BMDC细胞完全培养基，于5％CO₂、37℃继续培养48小时；

e.流式细胞术及共聚焦显微镜检测小鼠BMDC细胞中绿色荧光蛋白表达情况。

f.统计学分析：采用SPSS15.0进行统计学分析，对计量资料采用t检验，且以P<0.05为差异具有统计学意义。

将不同质量的CFmDEC融合蛋白与感染滴度为10MOI的Ad5-EGFP室温下混合，放置30min后，感染小鼠骨髓来源DC细胞，48小时后流式细胞术及共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果如图20A(A：Ad-EGFP与100ng CFmDEC蛋白感染mBMDC；B：单独Ad-EGFP感染mBMDC)和图20B所示，加入融合蛋白CFmDEC后的Ad5-EGFP感染小鼠DCs效率明显增高，表达绿色荧光蛋白的细胞数量及荧光强度均高于对照组(P＜0.05)，表明重组蛋白CFmDEC可增加5型腺病毒感染mBMDC的能力。

腺病毒感染过程中，外壳蛋白尤其是纤维蛋白参与介导与细胞受体的结合。其中位于纤维蛋白C末端，由180个氨基酸残基构成的头节蛋白，已经被证实为腺病毒受体结合区域纤维头节区外形似球状，从腺病毒壳蛋白向外突出，与细胞表面腺病毒受体结合，是病毒与细胞作用过程中的关键环节。与5型腺病毒knob区结合的受体为一个46kd的糖蛋白-CAR。CAR广泛表达于人体细胞，在5型腺病毒与宿主细胞结合的过程中起关键作用，缺少CAR或knob，腺病毒与宿主细胞之间的亲和力会显著降低，目前已经证实5型腺病毒感染宿主细胞首先是通过腺病毒外壳蛋白纤维头节knob与受体CAR特异性结合，从而触发后续的病毒脱壳程序，病毒基因进入胞内表达目的蛋白。

本实施例从5型腺病毒pAdeasy载体上扩增出5型腺病毒纤维knob序列，并将其克隆至pGEX载体，构建了含knob的重组原核表达载体，经IPTG诱导表达后通过GST融合标签纯化knob蛋白。经酶联免疫吸附试验来验证双靶向融合蛋白CFmDEC与纯化后的Ad5-knob蛋白的特异性结合能力，根据所测OD450值所绘制的反应曲线及得到的线性回归方程，间接证明双靶向融合蛋白CFmDEC可以通过其CAR功能域与腺病毒纤维头节蛋白有效结合，说明本发明制备的双靶向融合蛋白CFmDEC中的CAR部分具有其天然空间构象，具有较高的生物学活性。

DEC205受体分子的特点是在DCs表面高度特异性表达，因此在本实施例中，选择抗DEC205单链抗体作为双靶向融合蛋白的一部分来结合DEC205受体从而靶向DCs。为验证双靶向融合蛋白CFmDEC中单链抗体sFvDEC205的体外生物学活性，最好能获得DEC205蛋白，但由于其分子量大，利用原核蛋白表达系统得到完整的DEC205蛋白具有一定的难度。因此，先提取小鼠骨髓来源DCs的膜蛋白，由于DEC205受体属于细胞膜表达并包含在提取的DCs膜蛋白中，所以可以用具有活性的膜蛋白来检测双靶向融合蛋白中sFvDEC205与DEC205受体的结合能力。从ELISA结果分析，双靶向融合蛋白CFmDEC可以与小鼠DCs膜蛋白特异性结合，而且我们认为其结合是通过膜蛋白中的DEC205来实现的，因此，证明了双靶向融合蛋白CFmDEC中的单链抗体sFvDEC205具有结合并靶向DEC205的作用。

通过蛋白水平已经验证了双靶向融合蛋白CFmDEC可以与其特异性靶蛋白结合，为了进一步在细胞水平验证双靶向融合蛋白与靶细胞的结合能力，本实施例从Balb/c小鼠体内分离并培养了小鼠骨髓来源DCs(mBMDC)，将其与双靶向融合蛋白CFmDEC共孵育来验证CFmDEC是否可以通过sFvDEC205功能域结合到mBMDC表面。因双靶向融合蛋白CFmDEC中包含6×His标签，所以本实施例利用FITC标记的小鼠抗His单克隆抗体作为二抗来检测双靶向融合蛋白与细胞的结合情况。从流式细胞术结果可以看出，实验组双靶向融合蛋白CFmDEC与mBMDC的结合率为15.45％，由此可以证明CFmDEC在体外可以有效的结合并靶向小鼠骨髓来源树突状细胞。

5型腺病毒感染DCs是通过腺病毒受体CAR介导实现的，而本发明设计双靶向融合蛋白CFmDEC的目的，是将腺病毒在体外与CFmDEC结合，使腺病毒可以不经过DCs表面的CAR介导，直接由CFmDEC介导感染DCs。为验证这一过程，我们首先分离培养小鼠骨髓来源DCs，并在培养第7天加入TNF-α刺激DCs的成熟，流式细胞术分析mBMDC表面标志物证明了mBMDC处于成熟状态。取不同质量的双靶向融合蛋白CFmDEC与编码绿色荧光蛋白的5型腺病毒载体混合并放置30分钟，目的是确保腺病毒与蛋白可以充分结合。腺病毒载体-蛋白混悬液感染mBMDC 48小时后，免疫荧光结果发现，与单独腺病毒组比较，混合CFmDEC后的腺病毒感染mBMDC的能力明显提高(P＜0.05)；与其他各组比较，双靶向融合蛋白蛋质量为100ng时mBMDC的平均免疫荧光强度最强(P＜0.05)，即病毒感染效率最高。由此可见，双靶向融合蛋白CFmDEC在可以在体外协助腺病毒载体特异性靶向小鼠树突状细胞，从而提高目绿色荧光蛋白的表达量。

综上所述，本实施例通过一系列实验验证了双靶向融合蛋白在体外具有良好的生物学活性，并证明双靶向融合蛋白可以在体外介导5型腺病毒靶向DCs，为下一步双靶向融合蛋白的体内功能验证打下了坚实的基础。

实施例3、靶向肾癌相关抗原G250的重组腺病毒疫苗的构建及鉴定

本实施例中利用双酶切反应从真核表达质粒pVAX-tG250FcGB中获得sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1复合抗原(简称tG250FcGB或G250)基因片段(其核苷酸序列如序列表中序列11所示，自5’端第1-1131位碱基为异种化肾癌相关抗原G250(CAIX)基因，自5’端第1138-2520位碱基为Fc-GPI，自5’端第2568-3161位碱基为IRES序列，自5’端第3184-3597位碱基为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)基因，自5’端第3640-4428位碱基为共刺激分子B7.1基因)，并将其克隆至腺病毒穿梭载体pDC316中，构建穿梭质粒pDC316-tG250FcGB(序列12)；根据AdMax腺病毒制备方法，将pDC316-tG250FcGB和pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞中，包装5型复制缺陷型腺病毒Ad5-tG250FcGB；扩增并纯化腺病毒后，在真核细胞内验证融合抗原的表达，为下一步的双靶向融合蛋白CFmDEC介导腺病毒抑瘤活性研究提供重要的实验材料。

一、实验材料

1、引物、菌株、细胞

所用引物均由中美泰和生物技术公司合成；大肠杆菌E.coli DH5α购自Taka公司；人胚肾HEK293细胞购自协和细胞库。

2、酶和试剂

2×Es Taq MasterMix、质粒小量提取试剂盒、柱离心型DNA凝胶回收与纯化试剂盒、无内毒素质粒大量提取试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司；病毒基因组提取试剂盒购自三博远志公司；胎牛血清购自德国PAA公司；DMSO、胰蛋白酶购自Sigma公司；琼脂粉购自美国Amresco公司；酵母提取物、胰蛋白胨为英国Oxoid公司产品；脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen生命技术公司；连接混合物Solution I、Cryonase^TMCold-active Nuclease核酸酶均购自TaKaRa；DNA限制性内切酶Nhe I、Sma I、Pme I购自New EngLand BioLabs公司；DNA电泳用琼脂糖购自Promega公司；MEM液体培养基购自Gibco BRL公司；HRP标记山羊抗人IgGFc段抗体购自Sigma公司；六孔细胞培养板购自Costar公司；Q Sepharose XL阴离子层析交换介质购自GE公司。

3、腺病毒纯化相关试剂：

平衡缓冲液：(50mM Tris-HCL，pH 8.0)；

洗脱缓冲液：(50mM Tris-HCL，1M NaCl，pH 8.0)；

病毒保存液：(50mM Tris-HCL，pH 8.0，150mM NaCl，2mM MgCl2，5％蔗糖)

4、质粒

真核表达载体pVAX-tG250FcGB(结构示意图见图21，构建方法见文献田仁礼，于继云等，异种化人肾细胞癌特异性抗原G250真核表达载体的构建及表达，生物技术通讯，2009年第2期)；腺病毒穿梭质粒pDC316-GAPDH(物理图谱见图22，构建方法见文献肖毅，以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗的研究，中国人民解放军医学院，博士学位论文)，它是在pDC316载体的基础上通过插入GAPDH片段，从而在多克隆酶切位点的上游引入Nhe I位点；腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre(物理图谱见图23)购自Microbix Biosystems公司，由本元正阳基因股份有限公司提供。

二、构建穿梭质粒pDC316-tG250FcGB

利用分子克隆技术将pVAX-tG250FcGB载体中融合抗原基因片段tG250FcGB插入到pDC316载体中，构建穿梭质粒pDC316-tG250FcGB，具体方法如下：

1、pVAX-tG250FcGB质粒和pDC316-GAPDH质粒的双酶切

pVAX-tG250FcGB质粒用Nhe Ⅰ和Pme Ⅰ进行双酶切；pDC316-GAPDH质粒用Nhe Ⅰ和Sma Ⅰ进行双酶切；酶切体系分别如下：

酶切反应条件：37℃水浴锅温浴2小时。

酶切反应条件：25℃水浴4小时。

2、胶回收

将pVAX-tG250FcGB质粒和pDC316-GAPDH质粒利用限制性内切酶Nhe Ⅰ和Pme Ⅰ/Sma Ⅰ分别双酶切，将pVAX-tG250FcGB质粒和pDC316-GAPDH质粒双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图24(M1,M2：DNA Marker(DL15000)；M3:DNA Marker(DL5000)；1：pDC316-GAPDH质粒；2：pDC316-GAPDH经Nhe Ⅰ和Sma Ⅰ酶切；3：pVAX-tG250FcGB质粒；4：pVAX-tG250FcGB经Nhe Ⅰ和Sma酶切)所示，切胶回收获得tG250FcGB融合抗原片段和pDC316载体片段。

3、连接反应

得到的tG250FcGB融合基因片段和pDC316载体片段通过一端的Nhe Ⅰ酶切位点和另一平末端连接，获得质粒产物，10μL连接反应体系：5μL Solution Ⅰ，酶切产物tG250FcGB 4μL，酶切产物pDC3161μL，反应条件：16℃连接仪中连接30mins。连接产物的转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板固体培养基上。从平板中挑取单一菌落约5个，分别接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中(5mL/管)，37℃、180rpm震荡培养过夜，经1％琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒与预期大小一致。

4、菌液PCR快速鉴定

选取阳性单克隆菌液，提取质粒后进行PCR初步鉴定，方法为：取0.5μL过夜培养菌稀释10倍作为模板，用PCR法进行初步鉴定，选用设计的上游引物F3：CTCGAGCAGAGGCTGCCCCGGATG和下游引物R3：GAATTCGTCACCAGCAGTGAAGCA，目的片段大小约为1100bp。按照康为世纪公司的Es Taq MasterMix说明书配制PCR扩增体系，具体如下：

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增30个循环；72℃继续延伸7min。取反应产物3μL，用于1％琼脂糖DNA凝胶电泳分析PCR产物。

PCR初步鉴定结果如图25A(M1:DNA Marker(DL15000)；M2:DNA Marker(DL5000)；1:质粒pDC316-tG250FcGB；2:PCR扩增出的特异性片段)所示，PCR扩增出一条大小约为1100bp的tG250FcGB融合基因片段，与预期结果相符。

5、DNA序列测定

挑取经PCR初步鉴定正确的阳性克隆菌，提取质粒，送中美泰和生物技术公司测序，测序结果表明阳性重组质粒的核苷酸序列如序列表中序列12所示，获得了序列及连接位置均正确的重组穿梭质粒，命名为pDC316-tG250FcGB，其物理图谱如图25B所示。

三、重组腺病毒载体pAd5-tG250FcGB的制备

1、大量提取重组穿梭质粒pDC316-tG250FcGB

a取200mL含pDC316-tG250FcGB质粒的过夜培养的E.coli DH5α菌液，加入离心管中，12000rpm离心3min收集细菌，尽量弃去全部上清；

b向留有菌体沉淀的离心管中加入12mL含有RNase A的Buffer P1，使用吸管充分混匀，悬浮细菌沉淀；

c向离心管中加入12mL Buffer P2，温和地上下颠倒混匀6-8次，噬菌体充分裂解，室温放置3-5min；

d向离心管中加入12mL Buffer E3，立即上下颠倒6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5min后，12000rpm离心10min，将上清全部倒入除内毒素过滤器中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL离心管中；

e向滤液中加入11mL的异丙醇，上下颠倒混匀；

f将混合溶液转移至PS平衡好的吸附柱中，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附管重新放回收集管中；

g加入10mL Buffer PW至吸附柱中，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液；

h重复一遍步骤g，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；

i将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入1mL去离子灭菌水，室温放置2-5min，12000rpm离心5min，得到无内毒素质粒pDC316-tG250FcGB；

j取4μL质粒溶液稀释于196μL去离子水中，紫外分光光度计中测得质粒DNA浓度，余下质粒置于-20℃保存，备转染用。

2、大量提取腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre

大量提取腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre，测浓度后备转染用，具体步骤参照步骤1。

3、重组腺病毒包装细胞HEK293细胞的复苏与培养

a.从液氮罐中取出一支原代HEK293细胞，迅速放入42℃水浴锅中温育2-3mins，待冻存管内细胞完全溶解后，将细胞转移至15mL离心管中；

b.室温下1000rpm离心5min收集细胞，倒掉上清液，PBS洗涤细胞一遍，再次离心并收集细胞；

c.用含100U/mL青霉素和链霉素、10％胎牛血清的MEM完全培养基重悬细胞，并将细胞转移至25cm²细胞培养瓶中，于5％CO₂、37℃孵箱中培养；

d.待HEK293细胞长至密度为90％以上时，将细胞用0.2％胰酶消化下来，并接种至六孔细胞培养板中，每孔细胞数为3×10⁵个。

3、双质粒共转染HEK293细胞

利用Invitrogen公司的转染试剂脂质体Lipofectamine 2000，将穿梭质粒pDC316-tG250FcGB和腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，在HEK293细胞内同源重组产生重组复制缺陷型腺病毒载体pAd5-tG250FcGB，构建方法如图26所示，具体步骤如下：

a.取出前一天培养于六孔板中的HEK293细胞，倒置显微镜先观察细胞状态，待细胞生长至80％会合度时，更换OPTI-MEM^TM无血清培养基；

b.转染试剂的配制：取1μg的穿梭质粒pDC316-tG250FcGB和4μg的骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共同稀释于250μL的OPTI-MEM^TM培养基中，同时取10μL的Lipofectamine 2000转染试剂稀释于250μLOPTI-MEM^TM培养基中，室温放置5分钟后，将两液体混合，移液器轻微吹打混匀，室温静置20分钟，形成DNA转染复合物；

c.转染细胞：取出更换培养基2小时后的六孔板，用OPTI-MEM^TM洗涤六孔板中的HEK293细胞，尽量去除抗生素和血清，将配置好的转染复合物轻柔加入到培养板中，补充OPTI-MEM^TM培养基至2mL，于5％CO₂、37℃培养箱中培养4-6h；

d.细胞换液：转染后4-6h，轻柔吸去细胞上层培养液，换成含10％胎牛血清的MEM培养基，2mL/孔，继续于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

4、镜下观察HEK293细胞病变(CPE)并收集病毒

转染后第二天观察细胞状态，同时每隔2-3天半量更换培养基。由于HEK293细胞内含有腺病毒重组酶，穿梭质粒和骨架质粒会在HEK293细胞中重组并包装成5型腺病毒，腺病毒在HEK293细胞中不断复制导致细胞发生病变并释放病毒。细胞病变特点是胞体变圆变大，表现为葡萄状，并可见到明显的噬斑。当大部分HEK293细胞发生病变并从细胞培养板底部脱落时，开始收集病毒，方法如下：

a将六孔板中的悬浮及贴壁细胞用移液器轻微吹打重悬，并全部移至15mL塑料离心管中；

b将上一步收集至离心管的细胞先置于-70℃冰箱1h，取出后在放于37℃水浴锅中充分融解，反复冻融3次使细胞内病毒完全释放；

c将装有冻融后细胞的离心管置于低温离心机，4℃、8000rpm离心10分钟，收集含有病毒的上清液，即为原代病毒；

d用0.22μm孔径的滤器过滤原代病毒上清液，贮存于-70℃冰箱中备用。

将穿梭质粒pDC316-tG250FcGB和腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，在Cre/loxP重组酶作用下实现重组，包装成腺病毒载体，命名为pAd5-tG250FcGB。转染后7天左右已观察到局部细胞变圆、变大，部分细胞脱落形成噬斑(图27A：未转染双质粒的HEK293细胞B：双质粒转染HEK293细胞后的第7天)；转染后10天左右，大部分细胞发生病变(CPE)并细胞培养板底部脱落，悬浮于培养基中，此时收集细胞获得原代腺病毒，命名为Ad5-tG250FcGB。

5、重组腺病毒载体pAd5-tG250FcGB的鉴定

通过转染HEK293细胞后获得重组腺病毒载体pAd5-tG250FcGB，通过基因水平和蛋白水平分别鉴定重组腺病毒载体pAd5-tG250FcGB。

5.1提取病毒基因组PCR鉴定融合抗原基因tG250FcGB

根据博大泰克病毒基因组提取试剂盒提取病毒基因组，具体步骤如下：

a.取50μL原代病毒上清液移至EP管中，加入等体积预冷的溶液P，反复颠倒数次室温放置30min，12000rpm、离心5min，尽量弃除上清；

b.向病毒颗粒沉淀中加入200μL缓冲液SL，立即震荡混匀；

c.加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，58℃放置1小时；

d.加入220μL结合液SB，立即上下快速颠倒充分混匀，58℃放置10min；

e.冷却后，加入220μL无水乙醇，充分颠倒混匀；

f.将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

g.加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；

h.重复步骤g，再加吸附柱放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；

i.取出吸附柱，放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL去离子水，58℃温浴5分钟，12000rpm离心1min，获得病毒基因组。

以病毒基因组为模板，特异性扩增融合抗原tG250FcGB基因片段，PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增30个循环；72℃继续延伸7min。取反应产物3μL，进行1％琼脂糖DNA凝胶电泳检测，结果如图28(M：DNA Marker(DL5000)；1：tG250FcGB基因片段；2：空白对照)所示，显示扩增出大小约为1100bp的片段，与预期一致。

5.2Western Blot检测腺病毒感染HEK293细胞后抗原蛋白tG250FcGB的表达情况

取原代腺病毒Ad5-tG250FcGB 10μl，加入到六孔板内呈对数生长的HEK293细胞中，24小时后收集感染后的细胞，进行Western Blot检测目的抗原tG250FcGB的表达情况，同时以未感染病毒的HEK293细胞为阴性对照，以β-actin蛋白作为检测的阳性对照，具体步骤如下：

a.病毒感染细胞24h后，收集细胞并PBS轻柔洗细胞2次，离心后弃上清，然后加入50μL细胞裂解液，混匀后煮沸5min；

b.取相关样品进行12％SDS-PAGE电泳步骤如下：制备分离胶(12％)，积层胶(6％)，每个泳道中加入20μl样品，同时加入预染蛋白Marker标记，80V恒压至样品到达积层胶与分离胶交界时，提高电压至120V，至溴酚蓝条带到达胶的底部时停止电泳。

c.电泳结束后，切取分离胶进行恒流转印：将滤纸，PVDF膜剪成与胶同样大小；PVDF膜浸入甲醇30s后，与滤纸浸入转移Buffer中平衡15min；将滤纸和凝胶逐层铺平，勿有气泡和皱褶；恒流180mA，冰浴下转膜2h。

d.膜转印结束后，将PVDF膜置于含有5％脱脂奶粉的TBST溶液封闭液中，室温封闭2h；

e.加入用封闭液1：5000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG Fc抗体，37℃孵育1小时；

f.TBST洗膜3次，每次10min；

g.暗室中ECL显影：在暗室中红色灯光的照明下，在曝光盒内置一保鲜膜，将PVDF膜有蛋白的一面向上；取ECL发光试剂盒内适量的A液和B液1：1混匀后均匀涂到PVDF膜上；将PVDF膜包在两层保鲜膜之间，发光反应1min后在上层保鲜膜上放感光胶片曝光约30s；将曝光后的胶片浸于显影液中显影约3min；看到条带后将胶片浸于定影液中定影约5min；将定影后的胶片自来水冲洗晾干，保存实验结果。

在重组腺病毒载体pAd5-tG250FcGB中，异种化抗原下游连接人免疫球蛋白Fc段，在细胞中表达并通过GPI锚定于细胞膜，我们通过检测下游Fc受体从而验证融合抗原的表达。将原代腺病毒Ad5-tG250FcGB感染HEK293细胞后，Western Blot鉴定结果如图29(A：原代病毒感染HEK293细胞48小时后细胞裂解物；B：未经处理的HEK293细胞裂解物)所示，显示腺病毒感染组可以见到特异性条带，而对照组没有特异性条带出现，证明包装的重组腺病毒具有感染能力，并可以表达目的抗原蛋白。

四、重组腺病毒Ad5-tG250FcGB的扩增、纯化及滴度测定

利用原代重组腺病毒Ad5-tG250FcGB感染HEK293细胞，获得第1代重组腺病毒，再利用第1代腺病毒感染HEK293细胞得到第2代腺病毒，如此逐级扩增至可以感染大量HEK293细胞；将大量扩增得到的腺病毒经GE公司的阴离子交换层析介质Q SepharoseXL^TM纯化，并测定滴度。

1、重组腺病毒Ad5-tG250FcGB的扩增

a.取Ad5-tG250FcGB原代腺病毒500μL直接感染25cm²培养瓶内的HEK293细胞，36-48h内可见细胞明显病变，收集第1代重组腺病毒；

b.取1代腺病毒继续感染HEK293细胞，收集病毒后继续感染至第3代；

c.大量培养HEK293细胞并接种与10个175cm²的细胞培养瓶，待细胞生长至会合度达80-90％时，加入适量3代病毒液，于培养箱内5％CO²、37℃条件下培养，48小时后当细胞完全病变时，收集细胞；

d.将细胞重悬于平衡缓冲液中，于-70℃/37℃间反复冻融3次，4℃、8000rpm离心20min，收集病毒上清液；

e.用0.22μm孔径的滤器过滤病毒上清液，收集滤过液用于病毒纯化。

2、重组腺病毒Ad5-tG250FcGB的纯化

a.取10ul Cryonase^TMCold-active Nuclease核酸酶，加入到步骤2.4.1收获的腺病毒溶液中，混匀并4℃放置30min；

b.用20mL阴离子层析介质Q Sepharose XL^TM装柱，再用平衡缓冲液平衡4-6个柱床体积，流速为2mL/min；

c.将含有重组腺病毒Ad5-tG250FcGB的20mL病毒缓冲液缓慢上样，降低流速至1mL/min；

d.再用病毒缓冲液洗柱4-6个柱床体积，洗掉未结合成分；

e.用洗脱缓冲液与平衡缓冲液以不同的比例混合，进行梯度洗脱；根据预实验结果，先以含0.3M NaCl洗脱缓冲液洗脱，再以50mM Tris-HCL，0.45M NaCl，pH 8.0缓冲液洗脱腺病毒；

f.收集重组腺病毒Ad5-tG250FcGB洗脱液，利用病毒保存缓冲液透析去盐，100kD孔径的超滤离心管浓缩病毒，-70℃冰箱保存备用。

用原代重组腺病毒感染HEK293细胞，并逐级扩增，最终获得10瓶175cm²培养瓶量的含腺病毒HEK293细胞；细胞裂解后将病毒液结合到Q Sepharose XL阴离子交换层析柱，以0-1M NaCl滴度浓度的洗脱缓冲液依次洗脱，Q Sepharose XL纯化Ad5-tG250FcGB洗脱记录图如图30所示，收集不同峰值的洗脱液，最终在含0.45MNaCl的洗脱液中获得需要的重组腺病毒Ad5-tG250FcGB。

3、纯化腺病毒Ad5-tG250FcGB中的目的抗原基因及E1区基因的PCR检测

将纯化后的腺病毒Ad5-tG250FcGB提取基因组，PCR扩增复合基因中tG250FcGB基因片段和野生型5型腺病毒E1区基因。凝胶电泳结果如图31(M：DNA Marker(DL2000)；1：tG250FcGB基因片段；2：E1区基因(无))所示，显示成功扩增出大小约为1100bp左右的tG250FcGB抗原基因，说明纯化的腺病毒Ad5-tG250FcGB内包含目的抗原基因；而扩增E1区基因的泳道无任何条带出现，说明构建的腺病毒缺失E1区，重组腺病毒载体pAd5-tG250FcGB为非复制型(是指删除了E1区，具有无法自主复制的优点)。

4、重组腺病毒Ad5-tG250FcGB的滴度测定

确定目的抗原基因存在及重组腺病毒载体为非复制型后测定重组腺病毒Ad5-tG250FcGB的滴度，方法如下：

a.提前一天接种HEK293细胞至六孔细胞培养板，每孔接种量约为1×10⁶个细胞；

b.病毒感染液配制：取10μL纯化的腺病毒，加入到990μL的MEM培养基中，混匀后再吸取100μL稀释于900μLMEM培养基，依次倍比稀释至病毒液浓度为原液的10^-6倍；

c.细胞铺板后24小时细胞密度达90-95％，倒掉细胞培养液，每孔分别加入不同浓度稀释的病毒液，继续培养2小时；

d.从细胞培养板中吸出病毒液，每孔加入2.5mL含10％胎牛血清的MEM完全培养基，继续培养48小时；

e.观察细胞病变情况，以全部发生细胞病变培养孔所对应的最高稀释倍数为准，根据下述公式计算出病毒的感染滴度。

将纯化腺病毒用病毒保存液透析，再通过超滤离心管浓缩获得病毒浓缩液；利用快速CPE法测定腺病毒的感染滴度(PFU/mL)，根据公式计算出腺病毒的滴度为2.5×10⁹PFU/mL。

肾细胞癌是泌尿系肿瘤中恶性程度较高的肿瘤，约占肾脏恶性肿瘤的80-90％，成人恶性肿瘤的3％。目前手术切除，尤其根治性切除是局限性肾细胞癌的一线治疗方法，但是大约有25-30％的肾细胞癌在确诊时就已经处于晚期，同时在行根治性切除术后的肾癌中也有20-30％会发生转移。对于失去手术机会的转移性肾细胞癌，目前还没有令人满意的治疗方法，放疗、化疗及内分泌治疗对肾癌几乎不起作用，而且转移性肾细胞癌的5年生存率甚至不到10％。生物治疗如细胞因子虽然会对一小部分病人起作用，但是强烈的毒副作用限制了其进一步发展。上述传统治疗方法在抑制肾癌复发和转移方面存在很大的局限性，因此，研制出高效抑制肾癌转移和复发的新型药物迫在眉睫。

肾细胞癌目前被认为是最具免疫原性的肿瘤之一，多项研究已经证明肾细胞癌对免疫治疗尤其敏感。而近年来逐步发展的免疫基因治疗手段，因其特异性高、针对性强、毒副作用小，已经成为肾细胞癌生物治疗的主要研究方向。

真核表达质粒pVAX-tG250FcGB是专门针对肾细胞癌免疫治疗而设计的一种DNA疫苗(构建方法参见文献田仁礼，于继云等，异种化人肾细胞癌特异性抗原G250真核表达载体的构建及表达，生物技术通讯，2009年第2期)，同时在小鼠肾细胞癌模型中体内实验中取得了较好的免疫学效果。该质粒中复合基因片段sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1包含了异种化肾癌相关抗原G250(CAIX)基因和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)以及共刺激分子B7.1。其中G250是肾细胞癌特异性抗原，在所有肾细胞癌和大部分其它肾癌中都有表达，是肾细胞癌免疫基因治疗理想靶点；对G250抗原进行异种化处理的目的是设法诱导机体产生针对自身G250抗原的交叉免疫反应，从而识别表达G250抗原的肾癌细胞并打破机体的自身免疫耐受。GM-CSF和B7.1分子是抗肿瘤免疫基因研究设计中的常见佐剂分子，对于活化局部的免疫微环境和提高肿瘤抗原递呈能力具有显著作用。通过核糖体内部进入位点(IRES)将异种化抗原G250基因与佐剂基因连接，可允许两端目的基因同时有效表达，有望产生针对肾细胞癌的协同免疫效应。

在优化设计好复合基因后，关键是应该如何选择合适的载体向体内递送复合基因，质粒载体如pVAX1虽然安全，但转染效率低；而病毒载体感染能力强，是免疫基因递送的理想方式。腺病毒载体具有基因载量大、宿主范围广、感染效率高、不整合到宿主染色体中以及制备简单等诸多优点，尤其是经过改造过的5型复制缺陷性腺病毒载体相对比较安全，是目前免疫基因治疗的首选载体。腺病毒载体的构建主要包括插入外源基因和细胞内病毒包装两个过程。本发明中病毒包装是利用加拿大Microbix的AdMax包装系统，该系统是通过pDC系列穿梭载体与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共同转染含有Cre/loxP重组酶的HEK293细胞，利用Cre/loxP在细胞内同源重组，产生重组5型复制缺陷型腺病毒。与目前传统的AdEasy病毒包装系统相比，AdMax的主要优点是避免了在先细菌中同源重组以及转染前质粒线性化等繁琐程序，同时出毒时间快，病毒滴度高。

本实施例中利用分子克隆技术将含有双顺反子的复合抗原基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1克隆至腺病毒穿梭载体pDC316中，利用AdMax系统成功包装了含有肾癌相关复合抗原的5型复制缺陷性腺病毒载体pAd5-tG250FcGB，在HEK293细胞中扩增并纯化后获得了较高的病毒滴度，经Western Blot鉴定分析证实融合抗原可以得到有效表达，为下一步验证双靶向融合蛋白CFmDEC介导腺病毒感染DCs及抑制肿瘤效应的研究提供了重要的实验材料。

实施例4、介导5型腺病毒感染DCs的双靶向融合蛋白CFmDEC联合腺病毒Ad5-tG250FcGB的抑瘤活性研究

在本实施例中将构建的5型复制缺陷型腺病毒肾癌疫苗Ad5-tG250FcGB和双靶向融合蛋白CFmDEC体外结合后通过足底注射方法免疫小鼠，通过对免疫后小鼠体内免疫学反应和肿瘤形态学的检测以及生存期的观察等，评价双靶向融合蛋白CFmDEC增强Ad5-tG250FcGB抗小鼠肾癌的效果并深入探讨其发挥作用可能的免疫学机制。

一、实验材料及仪器设备

1、质粒、细胞及实验动物

免疫所用双靶向融合蛋白CFmDEC和肾癌腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB为实施例1和实施例3构建；表达人G250抗原的小鼠肾癌细胞Renca/G250细胞(构建方法参见文献李云奇，肖毅，于继云等，稳定表达人G250基因小鼠renca细胞株的建立，解放军医学院学报，2013年第5期)；6-8周龄雌性Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2、抗体和蛋白

HRP标记山羊抗小鼠IgG单克隆抗体购自中山金桥公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG1、IgG2a重链部分单克隆抗体购自Abcam公司；人G250原核表达蛋白构建(构建方法参见文献肖毅，高江平，于继云等，肾癌相关抗原G250的原核表达、纯化及抗原活性检测，细胞与分子免疫学杂志，2013年第3期)、表达及保存。

3、主要试剂及检测用试剂盒

Poly(I:C)购自北京百奥莱博科技有限公司，RPMI 1640培养基为Gibco公司产品；普通胎牛血清为PAA公司产品；青霉素和链霉素为华北制药有限公司产品；磷酸盐缓冲液(PBS)为中山公司产品；小鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司；小鼠IL-10、IL-4、IL-2和INF-γ细胞因子ELISA试剂盒购自欣博胜生物公司。CTL活性检测试剂盒CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay为Promega公司产品；小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自达科为生物技术公司。

4、主要的仪器设备

二氧化碳培养箱购自Thermo Forma公司；MDF-38E(N)超低温冰箱购自SANYO公司；GL-21M冷冻离心机为湘仪离心机仪器有限公司产品；倒置显微镜购自重庆光化学仪器厂；GENESYSTM2分光光度计为SPECTRONIC公司产品；SPECTRAⅢ酶联检测仪为安发玛西亚公司产品；Biosys Bioreader 4000PRO自动读板仪为德国BIOSYS公司产品。

二、免疫方案

1、实验动物分组

6-8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为4组，每组5只。A组为PBS空白对照组；B组为CFmDEC双靶向融合蛋白对照组；C组为单独腺病毒Ad5-tG250FcGB疫苗组；D组为CFmDEC联合Ad5-tG250FcGB疫苗组。

2、Balb/c小鼠的免疫策略

具体免疫方案如图32所示，免疫方法采用Balb/c小鼠后足底注射，隔2周共免疫2次。A组单独注射50μLPBS；B组注射1μg双靶向融合蛋白CFmDEC；C组注射1×10⁷PFU腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB；D组注射1μg双靶向融合蛋白CFmDEC+1×10⁷PFU腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB(混合后一次性注射)；各实验组同时加50μg Poly(I:C)作为佐剂，并调整体积至50μL。在免疫前1周及末次免疫后2周分别取小鼠眼眶静脉血，进行体液免疫检测；同时于末免后两周处死小鼠，取脾脏进行EliSpot及CTL杀伤等相关免疫学检测。

三、构建肿瘤预防模型

分别收获对数生长期的Renca/G250细胞，该细胞系是将Ires-neo-G250质粒转染至小鼠Renca细胞中，并利用G418加压筛选获得的单克隆细胞株，其人G250抗原的表达效率高达95％，制备单细胞悬液，灭菌的PBS缓冲液洗涤两遍，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL。免疫方案如上一步骤所述，于第二次免疫后一周，在Balb/c小鼠背部左侧皮下接种100μL细胞悬液即1×10⁵个/只。

四、CFmDEC联合腺病毒载体疫苗抑瘤活性观察

皮下移植瘤攻击后，观察小鼠体内肿瘤的生长情况。可触及肿瘤结节时，记录各组小鼠的成瘤时间；接着每间隔2天用游标卡尺测量并记录移植瘤的垂直长径和垂直短径，依照公式计算移植瘤体积，绘制小鼠体内移植瘤的生长曲线；待移植瘤生长至10周时，断颈处死小鼠，手术剥取肿瘤组织并称取瘤重，依照公式计算肿瘤的抑制率。计算公式如下：

肿瘤体积(mm³)＝0.5×垂直长径×(垂直短径)²；

肿瘤生长抑制率(％)＝(对照组平均瘤重-免疫组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

皮下移植瘤攻击后，观察小鼠体内肿瘤的生长情况，记录各组荷瘤小鼠的生存时间。

1、小鼠肿瘤形态学观察

1.1免疫小鼠移植瘤形成时间

末次免疫后1周后，对各组Balb/c小鼠进行背部皮下移植瘤攻击，以能明确触及到肿瘤结节为准，记录各组小鼠的移植瘤成瘤时间。

各组免疫小鼠皮下移植瘤成瘤时间如表2和图33所示，发现各组间存在不同程度的差别(表2)，PBS空白组和双靶向融合蛋白CFmDEC组的成瘤时间最早，大约7天左右，两组之间成瘤时间无显著差异(P＞0.05)；腺病毒疫苗联合融合蛋白组与单独腺病毒疫苗组小鼠的成瘤时间最晚，都在肿瘤接种10天以后；但与单纯腺病毒疫苗组相比，腺病毒疫苗联合融合蛋白组的成瘤时间更长，两组之间比较存在显著性差异(P＜0.01)。

表2各组免疫小鼠皮下移植瘤的成瘤时间

分组	平均成瘤时间(天)
		A组PBS空白组	7±0.71
B组CFmDEC蛋白对照组	7.6±0.55
		C组Ad5-tG250FcGB病毒疫苗组	13.8±1.92**
D组CFmDEC/Ad5-tG250FcGB联合疫苗组	17.4±2.07**

注：^**与对照组比成瘤时间差异非常显著(P<0.01)。

1.2免疫小鼠的皮下移植瘤生长

从小鼠皮下移植瘤攻击后开始至颈椎脱臼法处死小鼠的两月内，每三天用游标卡尺测量一次肿瘤的垂直长径和垂直短径，并通过公式计算每组小鼠体内肿瘤的平均体积，绘制其肿瘤生长曲线。对每次测量的结果进行统计学分析。由图34中可以发现，从肿瘤接种第18天以后，腺病毒疫苗组和融合蛋白联合腺病毒疫苗组的小鼠肿瘤体积与PBS组和融合蛋白对照组比较，存在显著性差异(P<0.05)；PBS空白组与融合蛋白对照组小鼠肿瘤体积大小并不存在显著性差异(P>0.05)；而融合蛋白联合腺病毒疫苗组与其它各组之间比较均存在显著性差异(P<0.05)。对肿瘤生长曲线进行线性回归并对其斜率做t检验，可见双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组小鼠的肿瘤生长受到了抑制。

1.3疫苗免疫对荷瘤小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

皮下移植瘤攻击后，颈椎脱臼法处死每组各5只小鼠，轻柔剥取肿瘤组织，拍照并称量各组瘤重。

结果如表3和图35A、图35B所示，双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组、单独腺病毒疫苗组的平均瘤重与融合蛋白对照组和PBS空白对照组之间存在显著性差异(P＜0.01)；双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组瘤重与单纯腺病毒疫苗组之间也存在显著性差异(P＜0.05)。根据公式计算各组疫苗对肿瘤的抑制率，计算公式如下：肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重－免疫组平均瘤重)/对照组平均瘤重。与对照组相比，双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组的平均瘤重最小，肿瘤抑制率高达81.20％，与对照组的差异非常显著(P＜0.01)。

表3各组免疫小鼠对肿瘤的瘤重以及肿瘤抑制率

分组	平均瘤重(g)	肿瘤抑制率(％)
			A组PBS空白组	7.77±1.23	—
B组CFmDEC蛋白对照组	7.57±1.36	2.57**
			C组Ad5-tG250FcGB病毒疫苗组	2.78±0.29	64.22**
D组CFmDEC/Ad5-tG250FcGB联合疫苗组	1.46±0.30	81.20**

注：^*与对照组比成瘤时间差异显著(P<0.05)；^*与对照组比成瘤时间差异非常显著(P<0.01)

1.4免疫接种后小鼠的存活情况

小鼠背部接种肿瘤后观察各免疫组小鼠的存活情况如图36所示，从结果可以看出，A、B组的小鼠在肿瘤攻击后90天内均全部死亡；腺病毒疫苗组小鼠在攻瘤后第84天、88天和90天时分别死亡1只小鼠；双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组在观察终点第100天时只死亡1只小鼠，生存率与其余各对照组相比存在显著性差异(P＜0.05)。

五、CFmDEC联合腺病毒Ad5-tG250FcGB疫苗抗肿瘤效应的免疫学机制研究

通过检测小鼠体内一系列的免疫学指标，对双靶向融合蛋白CFmDEC联合腺病毒Ad5-tG250FcGB疫苗发挥抗肿瘤作用的机制进行初步研究。

1、ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体

免疫前1周及末次免疫后第2周，通过小鼠眼眶静脉取血，室温放置2h后，4℃，3000rpm离心10min，取上层血清分装，-70℃保存备用。用原核表达纯化的G250蛋白包被ELISA板，将小鼠血清用PBS以1：500稀释检测检测免疫小鼠血清中特异抗体IgG滴度，具体操作方法如下：

a.包被：纯化的tG250FcGB蛋白用包被液稀释至终浓度为1.0μg/mL，100μl/孔包被ELISA板，同时用BSA 100ng/孔作为阴性对照包被酶联板，4℃静置包被过液；

b.洗涤：将ELISA板孔中包被液扣出，用PBST洗涤5次，每次放到脱色摇床中轻微震荡1min，在吸水纸上扣干；

c.封闭：用5％BSA-PBS 100μl/孔，37℃封闭2h后弃去封闭液，扣干酶联板，PBST洗板5次；

d.检测：将小鼠血清样品用PBS倍比稀释后依次加入酶联板，100ul/孔，37℃孵育1h；

e.HRP标记二抗孵育：PBST洗板5次后吸水纸上扣干，每孔加入200μl 1：5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG、IgG1和IgG2a，37℃孵育1h；

f.显色：PBST洗5次后吸水纸上扣干，加入TMB显色液100μl，37℃显色15min，每孔加入100μl浓度为1M的H₂SO₄终止显色反应；

g.测OD值：伯乐酶联仪检测450nm的OD值。

结果如图37所示，在末次免疫后2周，腺病毒疫苗组和双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组小鼠血清中均能检测到特异性抗体，其OD450值显著高于其余两组(P<0.01)；而双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组和单独腺病毒疫苗组相比，其OD450值无显著差异。

2、免疫后小鼠血清中IgG亚型分析

用纯化的tG250FcGB蛋白包被ELISA板，取末次免疫后2周的小鼠血清，以1：500稀释后孵板，检测各组小鼠血清IgG抗体亚型IgG1及IgG2a。

由图38可见，双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组(CFmDEC/Ad5-tG250FcGB)和单独腺病毒疫苗组(Ad5-tG250FcGB)与其它两组相比IgG1及IgG2a抗体OD450nm都显著提高，但双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组和单独腺病毒疫苗组之间的IgG1及IgG2a抗体OD450nm值确无明显差异，表明病毒联合疫苗诱导体液免疫反应并无明显优势；由图39可见，与其它两组比较，双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组和单独腺病毒疫苗组的IgG1/IgG2a比明显倒置，其中蛋白联合疫苗组的IgG1/IgG2a值又显著低于单独腺病毒疫苗组，表明蛋白联合疫苗诱导体液免疫反应为主。

3、ELISA检测免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清中细胞因子变化

3.1分离免疫小鼠脾脏淋巴细胞

a.在末次免疫后2周，断颈处死各组免疫小鼠，于75％乙醇中浸泡5min，移入紫外线照射消毒过的超净台；

b.无菌条件下手术取出小鼠脾脏，将脾脏剪成小块后置入200目细胞筛中，接着将细胞筛放入无血清的1640培养基的平皿中，用研磨棒尽量将脾研磨均匀；

c.用无血清的1640培养基将细胞筛中的淋巴细胞冲出，转移至15mL细胞离心管中，800rpm×2min离心沉淀，再用细胞洗涤液洗3次；

d.将2mL小鼠淋巴细胞分离液加入到离心管中，将步骤c所得到的脾细胞悬液沿管壁小心缓慢滴加在淋巴细胞分离液上方(比例为1：1)，室温下1500rpm离心20min；

e.离心后取液体分为三层，取中间层白膜细胞，加入含5mL细胞洗涤液的离心管中，1500rpm/min,离心20min，重复洗涤一遍；将细胞沉淀重悬于无血清1640培养基中并计数。

f.将小鼠脾淋巴细胞培养于24孔细胞培养板，调整细胞数量为每孔5×10⁵个，每孔加入1μg tG250FcGB抗原，48小时后检测培养上清中的细胞因子。

3.2ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清中细胞因子

参照欣博盛生物公司的小鼠IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10检测试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：

a.收获上一步培养48小时的脾淋巴细胞培养上清液，于-20℃保存备用。

b.标准品的配制:加入标准品和标本通用稀释液1.0mL至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000pg/mL)。然后根据说明书进行稀释。(标准曲线使用以下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0pg/mL)。

c.从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。

d.空白孔加标准品和标本通用稀释液，其余加入稀释好的不同浓度标准品(100μl/孔)，并加入已经稀释好的小鼠血清，按照100μl/孔加入到相应孔中。用封板胶纸封住反应孔，36℃孵育90min，提前20分钟准备生物素化抗体工作液。

e.用双蒸水1:20稀释浓缩洗涤液配制洗涤工作液，洗板5次。

f.空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min，提前20分钟准备酶结合物工作液，避光室温(22-25℃)放置。

g.洗板5次，空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱，避光孵育30min。

h.洗板5次，加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15min。

i.加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3min内)，在仪器保存读数结果。根据读数结果及标准品浓度绘制标准曲线计算各组小鼠血清中相应细胞因子的浓度。

末次免疫后2周，取小鼠脾脏并分离培养脾淋巴细胞，培养48小时以后检测培养上清中Th1类相关细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度。结果如图40A所示，与对照组相比，双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组的IL-2和IFN-γ的浓度都显著提高，表明该双靶向融合蛋白能够显著提高疫苗的细胞免疫反应。

末次免疫后2周，检测小鼠脾淋巴细胞培养血清中Th2类相关细胞因子IL-4和IL-10的浓度。结果如图40B所示，各免疫组小鼠之间脾淋巴细胞培养上清中的IL-4和IL-10的浓度明显差别，表明该双靶向融合蛋白能够显著提高疫苗的体液免疫反应。

4、ELISpot法检测免疫小鼠脾细胞特异性IFN-γ的分泌

将原核表达抗原tG250FcGB加入到实验孔，小牛血清白蛋白BSA加入对照孔中，抗原终浓度为10μg/mL。用tG250FcGB抗原作为刺激物对各组免疫小鼠的淋巴细胞进行刺激，特异性抗原肽可以激活T淋巴细胞，分泌细胞因子IFN-γ并被预包被在ELIspot板上的IFN-γ单克隆抗体捕获，通过酶联显色的方式变成红色斑点，而对特异抗原肽无反应的细胞就不会释放特异性细胞因子。参照达科为生物技术公司的小鼠IFN-γELIspot检测试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：

a.免疫后2周处死小鼠，按上一步骤中方法分离免疫小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓度至5×10⁶个/mL；

b.准备ELISpot板：取预包被INF-γ抗体的ELISpot板，每孔加入200μlEZ-Culture^TM无血清培养基，室温静置5-10min后将其抠出；

c.细胞接种并加入刺激物并培养：整个实验设置1组阳性对照(PMA刺激)，同一只实验小鼠的细胞样品，设1组阴性对照(加入BSA浓度1μg/μl)，实验孔加入G250抗原，浓度为1μg/μl，同时设置背景负对照(不含细胞，只加培养基和所有检测试剂)；

①加入细胞悬液量：根据每孔不同细胞量调整细胞浓度，100μl/well

正对照孔：细胞浓度采用1×10⁵cells/well；

负对照孔：细胞浓度采用5×10⁵cells/well；

背景负对照：加入100μl的EZ-Culture^TM无血清培养基；

实验孔：细胞浓度采用5×10⁵cells/well。

②加入刺激物：10μl/well，各孔具体加入量如下：

正对照孔：加入10μl的阳性刺激物PMA；

负对照孔：加入10μl的EZ-Culture^TM无血清培养基；

实验孔：加入1μl原核蛋白tG250FcGB抗原作为刺激物，终浓度为10μg/mL.

表4预包被ELISPOT检测试剂盒实验卡片

阴性对照	阴性对照	阴性对照	阴性对照
				样品D	样品D	样品D阴性对照	样品D阴性对照
样品C	样品C	样品C阴性对照	样品C阴性对照
				样品B	样品B	样品B阴性对照	样品B阴性对照
样品A	样品A	样品A阴性对照	样品A阴性对照
				阳性对照	阳性对照	阳性对照	阳性对照

d.孵育：加完所有的样品之后，将ELISpot板盖好，放入37℃、CO₂培养箱培养48h。

e.裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基，加冰冷的去离子水，200μl/孔，4℃冰箱放置10min，低渗裂解细胞；

f.洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μl/孔，洗涤5-7次。每次停留30-60S，最后一次扣干；

g.检测抗体孵育：将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各试验孔，100μl/孔，37℃孵育1小时；

h.洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μl/孔，洗涤5-7次。每次停留30-60S，最后一次扣干；

i.酶联亲和素孵育：将稀释好的酶联亲和素工作液加入各个试验孔，100μl/孔，37℃孵育1小时；

j.洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μl/孔，洗涤5-7次。每次停留30-60S，最后一次扣干；

k.显色：将AEC显色液加入各实验孔，100μl/孔，室温避光静置20min；

l.终止：倾倒孔内液体，揭开板底座，用自来水洗涤正反面及底座3-5遍，终止显色；将ELISPOT板置于Biosys Bioreader自动读板机内，调节好合适的参数，记录斑点数。

结果如图41(阳：阳性对照(加PMA+Ionomoycin)；阴：阴性对照(不加细胞)A：PBS对照组；B：CFmDEC蛋白对照组；C：Ad5-tG250FcGB病毒疫苗组；D：CFmDEC/Ad5-tG250FcGB联合疫苗组；a,b:实验孔(加入抗原tG250FcGB)c,d:对照空(加入BSA))和表5所示，D组双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组和C组单独腺病毒疫苗组免疫小鼠均能检测到特异性淋巴细胞的IFN-γ分泌，D组免疫小鼠:3397.66±319.97个/10⁶个脾淋巴细胞；C组免疫小鼠:1337.33±110.60个/10⁶个脾淋巴细胞；与其它各组比较D组免疫斑点数显著升高(P<0.01)。各组中加入G250抗原刺激与加入BSA对照的实验孔斑点数之间都具有显著差异。

表5各组ELISPOT斑点计数

5、免疫小鼠脾细胞CTL杀伤活性的检测

通过乳酸脱氢酶(LDH)法检测CTL杀伤活性，LDH是存在于细胞质中的众多的内含酶之一，当效应细胞特异的杀伤靶细胞之后，靶细胞的细胞膜受到破坏，通透性发生改变，胞浆中的乳酸脱氢酶随之释放到胞外。在实验过程中，在效靶细胞共孵育的培养上清中加入酶促反应使底物，使其转化成一种紫红色的甲肷类化合物，读取其490nm的吸收值可以间接反映出效应细胞对靶细胞的杀伤效率。

5.1效应细胞的制备

无菌条件下获取免疫小鼠脾淋巴细胞悬液，在细胞中同时加入tG250FcGB抗原作为刺激物，浓度20μg/mL，于含IL-2(20IU/mL)的培养基刺激培养5d，收获淋巴细胞作为效应细胞。

5.2靶细胞的制备

将表达人tG250FcGB抗原的小鼠肾癌细胞Renca/G250置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中孵箱培养备用。

5.3乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠的CTL杀伤活性

末次免疫后2周，颈椎脱臼法处死免疫小鼠，无菌条件下分离免疫小鼠脾单细胞并制备细胞悬液，同时在细胞中加入了特异性刺激物tG250FcGB抗原，培养基中加入IL-2(终浓度：20IU/mL)，CO₂孵箱中培养5d后作为效应细胞；以表达人tG250FcGB抗原的Renca细胞作为靶细胞。效靶比(E/T)设定为40:1、20:1、10:1三个梯度，在按照实验卡片加入相应细胞及试剂，效应细胞与靶细胞共孵育后，酶标仪读取OD490nm吸收值，根据公式计算各组的CTL杀伤活性，具体方法如下：

5.3.1反应体系的建立

整个反应体系按照Promega公司Non-Radioactive CytotoxicityAssay试剂盒说明书，如表6所示，设置严格的对照孔和实验孔，同时每组设立3个复孔，均为200μl体系。

a.靶细胞和效应淋巴细胞浓度调整：最适靶细胞数为2×10⁵个/mL，实验孔中每孔加入50μl即1×10⁴个靶细胞/孔；将每只小鼠的效应细胞调整至4×10⁶个/mL，再根据不同的效靶比加入不同数量和体积的效应细胞；

b.根据不同的效靶比(分别为10:1、20:1、40:1)参照表1加入不同体积的靶细胞及效应细胞，用含5％胎牛血清的RPMI1640培养基补充至总体积200μl，每组设3个复孔。同时设立对照：靶细胞自发释放、靶细胞最大释放、培养基空白对照、总体积校正对照和效应细胞自发释放(与对应的实验孔相比，不加靶细胞)，各对照也设3个复孔，每孔总体积200μl。分别加入到96孔U形底细胞培养板；

c.培养板于室温1000rpm离心4min，然后置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h；

d.培养结束前45min，于靶细胞最大释放孔及体积校正孔中加入10×裂解液20μl(10μl 10×裂解液/100μl培养基)；

e.培养结束后，室温1000rpm离心4min，小心吸取每孔上清50μl置于96孔平底酶标板上对应的孔中，加入50μl乳酸脱氢酶底物液，室温避光反应30min后，加入50μl终止液。酶标仪上测量波长为490nm时的OD值。

表7 LDH法检测免疫小鼠效应细胞杀伤活性时反应孔中所加液体的量

5.3.2特异性CTL活性的计算：先计算出各组数据所设复孔的平均值，再按如下公式计算免疫小鼠特异的CTL杀伤活性：

实验组释放＝每一效靶比(avg)－培养基背景(avg)

靶细胞自发释放＝靶细胞自发释放(avg)－培养基背景(avg)

效应细胞自发释放＝效应细胞自发释放(avg)－培养基背景(avg)

靶细胞最大释放＝靶细胞最大释放(avg)－体积校正(avg)

应用SPSS17.0软件包进行统计分析，各免疫组小鼠成瘤时间和离体肿瘤体积、瘤重的比较采用完全随机的单因素方差分析(one way ANOVA)，两组样本之间的数据差异进行t检验(Student’s t-test)，生长曲线采用对数秩检验(log-rank test)，生存时间曲线采用Kaplan–Meier法进行统计，以P<0.05作为统计学差异显著性标准，P<0.01作为统计学差异非常显著性标准。

结果见表8和图43，可以看出，随着效靶比的增加，C组和D组小鼠效应细胞特异性的杀伤靶细胞的能力也逐渐提高，而双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组的小鼠体内产生了更强的特异性杀伤反应，在效靶比为40:1和20:1时与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。

表8不同效靶比免疫小鼠脾细胞杀伤活性

注：*与对照组相比，差异显著(P<0.05)。

肾细胞癌被认为是最具免疫原性的恶性肿瘤之一，对传统放疗及化疗不敏感。目前对于术后复发及转移性肾细胞癌的治疗主要是依靠免疫治疗。IL-2和IFN-A是进展期肾细胞癌的标准免疫治疗方法，其中高剂量IL-2治疗在部分病人中证明了有效的抗肿瘤作用，甚至在一小部分病人中长期有效而无耐受。但无论IL-2还是IFN-α都具有很强的毒副作用，会产生高热及全身反应，因而限制了其进一步应用。尽管如此，仍然可以看到免疫治疗在肾细胞癌中的应用前景。近年来，随着肿瘤免疫学理论以及免疫学分子生物学的发展，肿瘤疫苗作为一种新型的主动免疫治疗方式逐步的在实验室中开展起来，甚至部分疫苗已经进入临床试验。肾细胞癌疫苗的形式多种多样，包括：自体肿瘤细胞疫苗、基因修饰的肿瘤细胞疫苗以及DC疫苗、蛋白/抗原肽疫苗、病毒载体疫苗、质粒DNA疫等苗。已有多种肾细胞癌疫苗完成临床I/II期研究，并取得了阶段性成果，正准备进入III期临床。

在多种肾癌疫苗中，靶向DCs的疫苗方式被认为是最具潜力并最具应用价值的疫苗形式之一。在体外培养扩增并经过基因修饰的DCs重新回输体内可以获得一定的临床效果，但体外扩增的DCs往往会损失部分抗原递呈功能，进入机体后不能获得更加理想的预期效果。体内原位修饰DCs可以保持DCs的天然活性，但同时也对基因修饰技术提出一定的要求，传统的基因递送方式因其表达效率低难以获得有效的DCs靶向性。而利用腺病毒载体构建的基因疫苗具有很强的感染能力，体外实验已经证实对多种组织来源的DC细胞均具较强的亲和性，可以高效表达外源蛋白；但体内研究发现，由于腺病毒载体具有广泛的宿主细胞易感性，进入体内后真正作用于DCs的腺病毒有效滴度所剩无几，因而难以实现腺病毒载体靶向DCs的目的。

本发明利用分子克隆技术制备了双靶向融合蛋白CFmDEC，在体外可以与腺病毒载体疫苗Ad-tG250FcGB结合，进入体内后Ad-tG250FcGB/CFmDEC复合体可以通过双靶向融合蛋白上的抗DEC205单链抗体与DCs表面的DEC205分子特异性结合，达到修饰DCs的目的，从而启动内源性抗原递呈途径，杀伤肿瘤细胞。肾癌腺病毒疫苗Ad-tG250FcGB中不仅包括肾癌特异性抗原G250基因片段，同时也融合了多种免疫增效元件，利用IRES双顺反子可以使抗原与免疫佐剂一起表达，能够有效增强抗原诱导的免疫反应。因此，本发明选择利用腺病毒载体pAd-tG250FcGB来验证双靶向融合蛋白CFmDEC对增强腺病毒载体疫苗抗肾细胞癌的效果；同时在动物免疫方式中加入聚肌胞苷酸Poly(I:C)，目的是刺激DCs成熟，获得更好的抗原递呈作用。

本发明的动物实验研究中选用的肿瘤细胞模型为表达人G250抗原的小鼠肾癌细胞系Renca/G250，该细胞系是将Ires-neo-G250质粒转染至小鼠Renca细胞中，并利用G418加压筛选获得的单克隆细胞株，其人G250抗原的表达效率高达95％，非常适合本实验对模型细胞的要求。免疫小鼠后观察肿瘤形态学的变化，发现Ad-tG250FcGB/CFmDEC组小鼠的肿瘤生长缓慢，肿瘤成瘤时间较对照组晚，肿瘤的生长速度受到明显抑制，免疫组小鼠的生存期也显著延长，肿瘤生长抑制率达到81.2％，Ad-tG250FcGB/CFmDEC组疫苗免疫小鼠后能够有效提高生存率。

ELISA法检测免疫小鼠血清中G250抗体IgG水平的结果显示，经过疫苗免疫后的Ad-tG250FcGB/CFmDEC组和单独Ad-tG250FcGB组的小鼠血清中均能检测到G250蛋白的特异性抗体，但两者之间抗体滴度无显著差异，可能原因是腺病毒疫苗是以诱导细胞免疫反应为主，双靶向融合蛋白并不能提高腺病毒疫苗的体液免疫反应。对免疫小鼠血清抗体亚型进行分析发现，与PBS和单纯融合蛋白组相比，Ad-tG250FcGB/CFmDEC组和Ad-tG250FcGB组的IgG1/IgG2a值均小于1，而Ad-tG250FcGB/CFmDEC组的IgG1/IgG2a值小于Ad-tG250FcGB组，两者之间有显著差异(P<0.05)，这说明腺病毒疫苗联合CFmDEC诱导的小鼠免疫反应以Th1型为主，即倾向于细胞免疫反应。检测免疫后两周的小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中细胞因子的改变，结果提示Ad-tG250FcGB/CFmDEC组的IL-2和IFN-γ浓度显著高于其余各组，而IL-4和IL-10浓度在各免疫组间并无显著差异，由此进一步证明双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗可以提高小鼠Th1免疫反应的强度，而Th1免疫反应以介导细胞毒性免疫反应为主，在主动性杀伤肿瘤细胞方面起着关键作用。ELISPOT法检测分析提示，Ad-tG250FcGB/CFmDEC组的IFN-γ分泌斑点数与其他各组相比显著提高，说明疫苗免疫后可以诱导小鼠T淋巴细胞特异性分泌IFN-γ，而IFN-γ正是反应T介导的细胞毒性免疫反应的标志。

应用表达人G250抗原的Renca/G250作为靶细胞，特异性抗原G250刺激免疫小鼠的脾淋巴细胞做为效应细胞来检测小鼠CTL特异性杀伤反应。结果发现在三种不同的效应细胞/靶细胞设定比之下，Ad-tG250FcGB/CFmDEC组和Ad-tG250FcGB组免疫小鼠体内均能检测到特异的CTL杀伤活性。双靶向融合蛋白联合腺病毒疫苗组在效靶比为40:1、20:1及10:1时，其CTL杀伤活性分别为：42.25±4.00，35.36±2.07*，19.48±2.91；在效靶比为40:1和20:1时，Ad-tG250FcGB/CFmDEC组与Ad-tG250FcGB组比，杀伤活性显著提高(P<0.05)，由此可见双靶向融合蛋白可以协助腺病毒疫苗提高对肾癌细胞Renca/G250的杀伤作用。

综上所述，本发明制备了介导5型腺病毒载体特异性感染DCs的双靶向融合蛋白CFmDEC，通过动物实验初步证实该融合蛋白能够介导肾癌腺病毒度疫苗Ad-tG250FcGB增强机体产生特异性细胞免疫反应，抑制肾细胞癌的生长，延长小鼠生存期。

Claims (10)

1.可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)表面分子DEC205的双靶向融合蛋白，命名为CFmDEC，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的序列9；

2)将序列表中序列9的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(DCs)表面分子DEC205作用的蛋白质，新蛋白质与序列9同源性达到80％或更高。

2.编码权利要求1所述双靶向融合蛋白的基因，命名为CFmDEC，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列8的DNA序列；

2)编码序列表中序列9的DNA序列；

3)所编码的序列80％或以上同源于序列表中序列8且具有可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(DCs)表面分子DEC205作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中序列8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述双靶向融合基因CFmDEC的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

4.一种表达权利要求1所述双靶向融合蛋白CFmDEC的方法，包括以下步骤：

1)构建重组表达载体：将双靶向融合基因CFmDEC连接入载体pGEX-6P-1中，得到重组表达载体，命名为pGEX-CFmDEC，其核苷酸序列如序列表中序列10所示；

2)表达双靶向融合蛋白CFmDEC：将重组表达载体pGEX-CFmDEC转化或转导宿主细胞及其后代细胞，发酵重组宿主细胞，使双靶向融合基因CFmDEC获得表达，得到双靶向融合蛋白CFmDEC。

5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述步骤2)中的宿主为任一可表达外源基因的原核细胞；所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli BL21、E.coliRosetta、E.coli Origami、E.coli M15、E.coli JM109、或E.coli LG90等，优选为E.coli BL21(DE3)；所述步骤2)中培养含有本发明双靶向融合基因CFmDEC的重组宿主细胞的培养基为低糖高氮适于大肠杆菌生长的培养基，如LB培养基、SOC培养基或肉汤培养基等，优选为LB培养基。

6.根据权利要求4或5所述的表达方法，其特征在于：所述步骤2)中含有本发明核糖醇脱氢酶基因(RDH)的重组宿主细胞的培养条件为培养出发宿主的培养条件，优选为25℃诱导表达4-6小时；所述步骤2)中当所述宿主为大肠肝菌时，需加入IPTG进行诱导表达，其中，所加入IPTG的浓度0.1-1mmol/L，优选为0.25mmol/L。

7.权利要求1所述双靶向融合蛋白CFmDEC或权利要求2所述双靶向融合基因CFmDEC在制备提高腺病毒疫苗抗肿瘤活性药物中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，所述药物为双靶向融合蛋白CFmDEC和腺病毒疫苗按1μg CFmDEC蛋白：1×10⁶-1×10⁸PFU(优选1×10⁷PFU)腺病毒疫苗或其等比的混合物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述腺病毒疫苗可为任意的具有抗恶性肿瘤活性的腺病毒疫苗，优选为肾癌腺病毒疫苗，是将复合抗原基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1克隆至载体pDC316中得到腺病毒穿梭载体pDC316-tG250FcGB，再将腺病毒穿梭载体pDC316-tG250FcGB与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共同转染含有Cre/loxP重组酶的HEK293细胞，利用Cre/loxP在细胞内同源重组，得到重组5型复制缺陷型腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述复合抗原基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1的核苷酸序列如序列表中序列11所示；所述腺病毒穿梭载体pDC316-tG250FcGB的核苷酸序列如序列表中序列12所示。