CN107875376A - 包含ny‑eso‑1的微泡、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包含NY‑ESO‑1的微泡、其制备方法及用途，本发明中以微泡形式呈递NY‑ESO‑1的方式可以降低副作用，延长抗原蛋白的半衰期，向细胞运送目标货物的效率高，靶向性较好，可有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。

Description

包含NY-ESO-1的微泡、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种包含NY-ESO-1的微泡、其制备方法及用途。
背景技术
近年来，肿瘤免疫治疗不断取得新的突破，寻找和鉴定新的肿瘤特异性或相关性抗原是肿瘤免疫学研究的关键之一[1,2]。癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)在多种组织来源的肿瘤细胞中表达，但在正常组织中的表达仅限于睾丸和胎盘组织，因此被认为是肿瘤免疫疗法中较理想和最具应用前景的一类靶点[3]。目前发现的CTA大约有100个[4]。NY-ESO-1(纽约食管鳞癌蛋白，New York esophageal squamous cell carcinoma-1)，又名CTAG1，是由Chen等使用重组cDNA文库血清学分析技术(serological analysis ofrecombinant cDNA expression libraries，SEREX)从食管癌cDNA表达文库中筛选出来的一种肿瘤共享抗原[5]。其编码基因位于X染色体Xq28区，含有180个氨基酸，分子量为18KD，N-端富含甘氨酸，C-端结构极其疏水[6]。CTA中命名为LAGE-1的蛋白与NY-ESO-1高度同源(84％)[7]。NY-ESO-1基因家族第3个成员ESO-3 mRNA除去polyA尾全长942bp，编码的蛋白质由143个氨基酸组成，与NY-ESO-1和LAGE-1的氨基酸序列具有中等相似性，尤其是其C端的63个氨基酸，与前二者有着高度一致性[8]。这类CTA的表达被组蛋白修饰和启动子区的去甲基化所调控，如图1所示[9]。近期研究表明，低甲基化试剂5-Aza-2'-deoxycytidine(5AZA)和组蛋白去乙酰化抑制剂LBH589可以诱导前列腺癌细胞株中CTA的表达，包括NY-ESO-1、MAGE和SSX家族的成员[10,11]。
NY-ESO-1的抗体首次在喉管滑膜瘤病人体内发现。此后相继有文献报道，NY-ESO-1在多种肿瘤组织中高表达，包括神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌等，然而在结肠癌、胰腺癌、肾癌、淋巴癌中，NY-ESO-1的表达水平则较低。NY-ESO-1的表达谱如图2所示[12]。NY-ESO-1被认定为特定种类肿瘤的标志物。较有趣的是，NY-ESO-1在肿瘤中的表达情况也与地域有相关性，比如在美国，约20-25％的非小细胞肺癌患者组织中NY-ESO-1表达阳性，然而在日本非小细胞肺癌患者很少发现NY-ESO-1表达阳性的情况。
尽管NY-ESO-1是一个理想的免疫疗法的靶点，然而其功能却所知甚少。迄今为止，NY-ESO-1没有明显的功能结构域或相互作用蛋白为研究其功能提供线索。在正常细胞中，只有少数几种CTA的功能被报道，他们在减数分裂和顶体装配中起到作用，侧面反映了染色体异常与肿瘤发生的关系[13,14]。MAGE-1和GAGE可以分别通过TNF-α和Fas起作用，抑制细胞凋亡[15]。NY-ESO-1的功能没有被充分研究的一个关键因素是在老鼠内没有同源基因，导致没有基因敲除鼠可以利用。在老鼠中，唯一发现的一个相关基因，ESO-3，是一个广泛表达的基因，而不是CTA[8]。
NY-ESO-1唯一一个保守的特性是其C-端的Pcc-1结构域，它是酵母内一个转录因子的同源物，这个转录因子在细胞周期进程和极化生长中起作用[16]。有研究报道，NY-ESO-1可以与CTA中的另外一员MAGE-C1相互作用，MAGE-C1主要在细胞周期进程、凋亡及神经遗传疾病中起作用[17]。由于NY-ESO-1在精原细胞和初级精母细胞中表达，而在精细胞分化过程中表达消失，提示其可能在精细胞自身更新和分化中起作用。
NY-ESO-1被报道在分化的细胞和肿瘤细胞中定位于细胞浆，而在间充质干细胞中却定位于细胞核[18]。NY-ESO-1的细胞核定位可能提示它的新功能。有研究发现，NY-ESO-1有顶点和腔内定位的趋势。这样的定位模式提示NY-ESO-1可能在微泡运输和胞吐中起作用[19]。一种细胞内分泌的微泡被靶细胞吸收后，可能改变其表观遗传标记，进而引起细胞本身发生变化，另外，微泡也参与蛋白储存和运输，提示NY-ESO-1可能在这些方面起到作用。
CTA因其只在睾丸和肿瘤组织中表达的特性使其成为较合适的肿瘤免疫疗法的靶点。睾丸具有免疫赦免的特性，所以，这些CTA，如NY-ESO-1在睾丸之外的组织表达会引起较强的免疫反应。在已经发现的约100个CTA中，并不是所有的都可以引起免疫反应，而在能够引起免疫反应的CTA中，NY-ESO-1是免疫原性最强、肿瘤疫苗策略的理想靶点。从1997年被发现以来，NY-ESO-1相关的临床试验得到了迅速的发展。
NY-ESO-1阳性的肿瘤病人会产生自发的体液和细胞免疫反应，具有自发免疫反应的病人被认为是可以接受肿瘤疫苗的群体[20]。发生免疫的时间和效率根据肿瘤病人的不同有很大的差异。研究表明，多发性骨髓瘤病人中的抗体可以激活补体反应，同时增加APC等抗原提呈细胞对CTA的吸收，表明初始自发的抗体可以通过影响细胞摄取单价或多价免疫复合体调控抗肿瘤免疫[21]。另外，NY-ESO-1的抗体效价随着肿瘤负荷增大和疾病进展而升高，所以在多种肿瘤如多发性骨髓瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞癌中，可以做为疾病复发和疾病进展的标志[22]。用疫苗处理后的免疫反应比原始自发的免疫反应要集中和高效。
第一类被发现可以引起CD8+T细胞反应的NY-ESO-1肽段：155-163(Q9T)、157-165(S9C)、157-167(S11L)属于HLA-A2限制型。Q9T免疫原性较弱，S9C和S11L具有交叉免疫原性[23,24]。源于NY-ESO-1的其他肽段也被用来研究其相关的免疫功能。比如HLA-classⅡ限制的87-79，HLA-DP4限制的108-119，HLA-DR7限制的121-132，145-156，HLA-DR52b限制的119-143等可以引起较强的CD4+T细胞反应。目前发现有至少5中HLA classⅡ限制的21种不同的肽段能够引起较强的CD4+T细胞反应[21,25]。
研究表明，NY-ESO-1与细胞毒性T细胞反应(CTL)具有一定关系。如NY-ESO-1在NSCLC病人中的阳性率较高，然而这些未被免疫的病人对于NY-ESO-1的CTL反应却很少，提示原始自发的免疫反应不足以对NY-ESO-1的抗原抵抗[26]。在一些肝癌患者中，NY-ESO-1阳性的病人中，肿瘤浸润细胞TIL中FOXP3+调节性T细胞的浸润较多，提示肿瘤微环境中的免疫抑制现象[27]。对于NY-ESO-1如何调节TIL中各种淋巴细胞的数量和功能有待进一步研究。
研究表明，DC与NY-ESO-1抗原：抗体(12D7)复合物共孵育，可以有效刺激NY-ESO-1/HLA-A2特异的CD8+T细胞产生IFN-γ[28]。另外，百分之九十NY-ESO-1抗体阳性的肿瘤病人可以分离到NY-ESO-1特异的CD8+T细胞[29]。最近一项研究表明，在人源化小鼠里，转染NY-ESO-1特异TCR的造血干细胞可以分化成功能性CD8+T细胞。有趣的是，从这种老鼠脾脏分离出的CD8+T细胞可以体外扩增和识别表达NY-ESO-1的靶标，这对于T细胞终端分化和失能是一个极好的解决和补充。针对NY-ESO-1的免疫疗法主要是疫苗或者是体外刺激、体内回输的方式激发体内的细胞免疫。提高NY-ESO-1免疫疗法效率的关键在于优化获得NY-ESO-1特异性杀伤性细胞的实验方案设计[30]。
国外已开展较多关于NY-ESO-1的临床研究。临床研究中主要分为两种方法，一种是疫苗，包括DNA，肽段疫苗[25]，另外一种是携带特异识别NY-ESO-1的TCR-T细胞疗法[31]。在疫苗研究中，疫苗的形式非常重要。在黑色素瘤病人中，NY-ESO-1全长蛋白单独或与佐剂联用，可以有效的减小病灶。CHP-NY-ESO-1蛋白与CHP-HER2蛋白联用能较好的引起患者的体液免疫反应。然而在一些情况下，NY-ESO-1肽段则展现出比全长更有优势的效果[21]。总之，NY-ESO-1抗原疫苗可以有效激发体液免疫和细胞免疫。
另外，基于TCR的TCR-T细胞疗法，在转移性黑色素瘤、滑膜细胞肉瘤和多发性骨髓瘤病人当中展现出喜人的疗效[31-33]。尽管以NY-ESO-1为靶点的肿瘤免疫疗法取得了一些成果和进展，然而在一些治疗有效的病人中，在一定时间内出现了肿瘤复发的现象，这可能是由于肿瘤细胞中MHC表达的缺失引起的免疫逃逸。
传统NY-ESO-1在免疫疗法中的应用主要包括肽段和蛋白的使用，此方法存在易被人体快速清除、生物相容性差、体内分布不理想和向细胞渗透能力低等缺陷，这些问题一定程度上限制了他们的临床应用。
发明内容
本发明提供一种包含NY-ESO-1的微泡、其制备方法及用途，本发明中以微泡形式呈递NY-ESO-1的方式可以降低副作用，延长抗原蛋白的半衰期，向细胞运送目标货物的效率高，靶向性较好，可有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。
根据第一方面，一种实施例中提供一种包含NY-ESO-1肽段、全长蛋白和/或其编码核酸的微泡在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步地，所述编码核酸是DNA和/或RNA。
进一步地，上述微泡包括外泌体。
根据第二方面，一种实施例中提供一种微泡，该微泡内包含NY-ESO-1肽段、全长蛋白和/或其编码核酸，上述微泡具有预防和/或治疗肿瘤的作用。
根据第三方面，一种实施例中提供一种制备如第二方面的微泡的方法，包括：培养表达NY-ESO-1肽段或全长蛋白的细胞株，从培养液上清中分离微泡。
进一步地，上述从培养液上清中分离微泡，包括如下步骤：
(1)通过离心去除上清液中的细胞、死细胞和细胞碎片，然后通过超速离心获得分泌到培养液中的微泡；
(2)任选地，还包括通过蔗糖密度梯度离心或超滤进一步纯化上述微泡，获得密度大小不同的微泡。
进一步地，上述步骤(1)具体包括：
将收取的上清液，以300g的速度离心10分钟去除细胞；以2000g的速度离心30分钟去除死细胞；以10000g的速度离心1小时去除细胞碎片；以100000g的速度超速离心2小时，收集沉淀获得分泌到培养液中的微泡。
进一步地，上述细胞株是内源性包含NY-ESO-1编码核酸的细胞株，或外源转染NY-ESO-1编码核酸的细胞株；
优选地，上述内源性包含NY-ESO-1编码核酸的细胞株是人恶性黑色素瘤细胞A375细胞株，上述外源转染NY-ESO-1编码核酸的细胞株是HeLa或293T细胞株。
根据第四方面，一种实施例中提供一种肿瘤免疫疗法，包括给肿瘤患者施用包含NY-ESO-1肽段、全长蛋白和/或其编码核酸的微泡。
进一步地，上述微泡包括外泌体。
本发明证实，NY-ESO-1存在于分泌到细胞外的微泡(包括外泌体)中。本发明将成功纯化的微泡用于动物实验中，证实以微泡形式呈递NY-ESO-1的方式可以降低副作用，延长抗原蛋白的半衰期，向细胞运送目标货物的效率高，靶向性较好，可有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。
附图说明
图1示出了CTA表达的表观遗传调控示意图；(A)甲基转移酶(DNMT)促进CTA启动子区胞嘧啶甲基化(橙色圆圈)，阻止转录因子TF靠近，或者通过MBP的结合募集共抑制分子(CR)，包括组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和甲基转移酶(HMT)，增加染色体紧密度，抑制基因转录；(B)CTA启动子区的胞嘧啶在去甲基化的情况下，MBP和CR的募集受到抑制，组蛋白乙酰化酶(HAT)和TF募集到染色体上，启动基因转录。
图2示出了NY-ESO-1在不同肿瘤组织中的表达情况。
图3示出了NY-ESO-1过表达的HeLa细胞株；(A)荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白阳性细胞的分选情况；(B)WB检测构建细胞株中NY-ESO-1的表达；GAPDH作为内参蛋白。
图4示出了NY-ESO-1在细胞内形成微泡分泌到细胞外的过程示意图；向HeLa细胞株中瞬时转染SFB标签的NY-ESO-1，用NY-ESO-1的抗体(E978，santa cruz)进行染色，Usp16作为对照蛋白，观察含有NY-ESO-1的微泡从形成到分泌的过程。
图5示出了WB检测NY-ESO-1在细胞裂解液和细胞外微泡中的表达；(A)HeLa细胞株中，NY-ESO-1在细胞外微泡中的表达情况，以TSG101，Actin作为参照；(B)HeLa细胞株中，NY-ESO-1在细胞外微泡中的表达情况，以CD63，CD9，Flotillin-1，GM130作为参照；(C)A375中内源NY-ESO-1在细胞外微泡中的表达情况。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
本发明以微泡作为NY-ESO-1的药物载体系统，达到增加安全性，提高药效的目的。因此，以微泡形式呈递NY-ESO-1可以有效的将抗原呈递到免疫环境当中，延长抗原在体内的半衰期，相比于传统方法有明显的优势。
本发明实施例的方案包括，培养表达NY-ESO-1(包括肽段及全长蛋白)的细胞，通过超速离心的方法分离细胞培养上清中的微泡，通过密度梯度离心或超滤的方法对微泡进行分类和纯化，最终检测利用微泡各组分作为疫苗防治肿瘤的可行性。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1制备包含NY-ESO-1的微泡
(1)培养表达NY-ESO-1(全长)的细胞株(包括内源A375和外源转染的HeLa、293T等)，每组扩大培养至上清体积达到300ml，收取上清；
(2)利用超速离心的方法获得微泡：将收取的上清，300g离心10分钟，去除细胞；2000g离心30分钟，去除死细胞；1000g离心1小时，去除细胞碎片；100000g超速离心2小时，收沉淀获得分泌到培养基中的微泡；
(3)利用蔗糖密度梯度离心(1.06、1.08、1.10、1.13、1.15、1.17、1.20、1.22g/ml)或超滤的方法进一步纯化微泡，获得密度大小不同的微泡；
(4)构建动物模型，体内验证微泡各组分防治肿瘤的可行性。
实施例2构建稳定表达NY-ESO-1的细胞株HeLa-NY-ESO-1，检测细胞内NY-ESO-1的表达
构建稳定表达NY-ESO-1的细胞株的过程如下：
1.用脂质体方法向293T细胞中转染PLVX-IRES-Zsgreen1-NY-ESO-1(或者PLVX-IRES-Zsgreen1空载体)、pMD2G、psPAX2质粒，48小时收获病毒上清液；
2.将HeLa细胞株种于6孔板培养，铺板24小时后加入病毒上清液进行感染，同时加入polybrene增强感染效率；
3.感染72小时后的HeLa细胞用流式细胞仪分选Zsgreen阳性的细胞，进行培养，即获得表达NY-ESO-1的稳定细胞株。
检测细胞内NY-ESO-1的表达的过程如下：
1.用1％SDS裂解对照与表达NY-EOS-1的细胞株，样品于98℃加热，10分钟后加入5×SDS loading buffer，混匀后继续于98℃加热10分钟；
2.准备12％SDS胶，按照每孔30-40ug进行上样，跑胶，湿法转膜；
3.用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，加入NY-ESO-1特异的抗体(santa cruz,E978)4℃孵育过夜；
4.PBST洗膜10分钟，3次，加入二抗室温孵育1小时，继续洗膜10分钟，3次，加入ECL显色液进行曝光。
图3示出了NY-ESO-1过表达的HeLa细胞株。其中，(A)荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白阳性细胞的分选情况；(B)WB检测构建细胞株中NY-ESO-1的表达；GAPDH作为内参蛋白。结果表明，NY-ESO-1在细胞株HeLa-NY-ESO-1内获得稳定表达。
实施例3通过荧光共聚焦显微镜观测到NY-ESO-1可以分泌到细胞外
1.把灭菌玻璃片放置于六孔板中，再将HeLa细胞以0.5M/孔接种于玻璃片上；
2.细胞接种24小时后，用脂质体方法转染SFB-NY-ESO-1的质粒；
3.转染24小时后，将细胞用4％多聚甲醛室温固定15分钟，用PBS洗涤三次后，加入0.1％ Triton X-100进行通透7分钟，PBS洗涤3次后，加入5％BSA室温封闭30分钟；
4.加入NY-ESO-1和Usp16的特异抗体(1∶50稀释)，4℃孵育18小时；
5.PBS洗涤细胞3次，加入cy5标记的羊抗鼠二抗和FITC标记的羊抗兔抗体，室温孵育1小时；
6.PBS洗涤细胞3次，加入抗淬灭剂封片；
7.于荧光共聚焦显微镜下进行观察，拍照。
图4示出了NY-ESO-1在细胞内形成微泡分泌到细胞外的过程图。向HeLa细胞株中瞬时转染SFB标签的NY-ESO-1，用NY-ESO-1的抗体(E978，santa cruz)进行染色，Usp16作为对照蛋白，观察含有NY-ESO-1的微泡从形成到分泌的过程。
实施例4在外源表达NY-ESO-1的HeLa细胞株和内源表达NY-ESO-1的A375细胞株中，验证NY-ESO-1存在于分离得到的微泡当中
1.将HeLa细胞和A375细胞进行培养至细胞数量达到3×109，培养上清达到300ml后，将上清换成300ml无血清无双抗DMEM，继续培养36小时；
2.收取上清，根据实施例1中的离心方法进行顺序离心，将最后获得的微泡用200ul PBS进行溶解；
3.通过western blot进行目的蛋白的检测：将溶解的微泡进行定量，按照每孔15ug上样于12％的胶当中，跑胶，转膜；室温5％脱脂奶粉封闭1小时；
4.加入针对目标蛋白的特定抗体4℃孵育过夜；
5.PBST洗膜3次，加入相应二抗室温孵育1小时；PBST洗膜3次后加入ECL进行显色曝光。
图5示出了WB检测NY-ESO-1在细胞裂解液和细胞外微泡中的表达。(A)HeLa细胞株中，NY-ESO-1在细胞外微泡中的表达情况，以TSG101，Actin作为参照；(B)HeLa细胞株中，NY-ESO-1在细胞外微泡中的表达情况，以CD63，CD9，Flotillin-1，GM130作为参照；(C)A375中内源NY-ESO-1在细胞外微泡中的表达情况。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
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31.Rapoport AP,Stadtmauer EA,Binder-Scholl GK,Goloubeva O,Vogl DT,Lacey SF,Badros AZ,Garfall A,Weiss B,Finklestein J,Kulikovskaya I,Sinha SK,Kronsberg S,Gupta M,Bond S,Melchiori L,Brewer JE,Bennett AD,Gerry AB,PumphreyNJ,Williams D,Tayton-Martin HK,Ribeiro L,Holdich T,Yanovich S,Hardy N,YaredJ,Kerr N,Philip S,Westphal S,Siegel DL,Levine BL,Jakobsen BK,Kalos M,JuneCH.NY-ESO-1-specific TCR-engineered T cells mediate sustained antigen-specific antitumor effects in myeloma.Nature medicine,2015；21:914-921.
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Claims (10)

1.包含NY-ESO-1肽段、全长蛋白和/或其编码核酸的微泡在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码核酸是DNA和/或RNA。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微泡包括外泌体。
4.一种微泡，其特征在于，所述微泡内包含NY-ESO-1肽段、全长蛋白和/或其编码核酸，所述微泡具有预防和/或治疗肿瘤的作用。
5.一种制备如权利要求4中所述微泡的方法，其特征在于，所述方法包括：培养表达NY-ESO-1肽段或全长蛋白的细胞株，从培养液上清中分离所述微泡。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述从培养液上清中分离所述微泡，包括如下步骤：
（1）通过离心去除上清液中的细胞、死细胞和细胞碎片，然后通过超速离心获得分泌到培养液中的微泡；
（2）任选地，还包括通过蔗糖密度梯度离心或超滤进一步纯化所述微泡，获得密度大小不同的微泡。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体包括：
将收取的上清液，以300g的速度离心10分钟去除细胞；以2000g的速度离心30分钟去除死细胞；以10000g的速度离心1小时去除细胞碎片；以100000g的速度超速离心2小时，收集沉淀获得分泌到培养液中的微泡。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞株是内源性包含NY-ESO-1编码核酸的细胞株，或外源转染NY-ESO-1编码核酸的细胞株；
优选地，所述内源性包含NY-ESO-1编码核酸的细胞株是人恶性黑色素瘤细胞A375细胞株，所述外源转染NY-ESO-1编码核酸的细胞株是HeLa或293T细胞株。
9.一种肿瘤免疫疗法，其特征在于，所述肿瘤免疫疗法包括给肿瘤患者施用包含NY-ESO-1肽段、全长蛋白和/或其编码核酸的微泡。
10.根据权利要求9所述的肿瘤免疫疗法，其特征在于，所述微泡包括外泌体。
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