CN113121699A - Pttrap1双特异性融合蛋白及其应用 - Google Patents

Pttrap1双特异性融合蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113121699A
CN113121699A CN201911388119.XA CN201911388119A CN113121699A CN 113121699 A CN113121699 A CN 113121699A CN 201911388119 A CN201911388119 A CN 201911388119A CN 113121699 A CN113121699 A CN 113121699A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
fusion protein
pttrap1
bispecific fusion
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911388119.XA
Other languages
English (en)
Inventor
张建民
王玥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guodian Beijing Medicine Technology Co ltd
Original Assignee
Guodian Beijing Medicine Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guodian Beijing Medicine Technology Co ltd filed Critical Guodian Beijing Medicine Technology Co ltd
Priority to CN201911388119.XA priority Critical patent/CN113121699A/zh
Priority to PCT/CN2020/078562 priority patent/WO2021134915A1/zh
Publication of CN113121699A publication Critical patent/CN113121699A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

本发明公开了一种PTTRAP1双特异性融合蛋白及其应用，具体公开一种能够同时靶向PD‑L1和/或PD‑L2以及TGF‑β的PTTRAP1双特异性融合蛋白及其在促进抗肿瘤免疫功能中的应用，尤其是在用于打破肿瘤免疫耐受、改善肿瘤微环境、增强免疫应答和治疗肿瘤中的应用，能够促进免疫疗法的抗肿瘤免疫功能和治疗效果。

Description

PTTRAP1双特异性融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及用于癌症治疗中促进抗肿瘤免疫功能的融合蛋白，具体涉及一种能同时靶向PD-L1和/或PD-L2以及TGF-β的PTTRAP1双特异性融合蛋白及其应用。
背景技术
恶性肿瘤一直是严重威胁人类健康的问题。随着环境破坏、食品不安全问题的凸显，我国肿瘤的发病率和死亡率持续上升。根据最新发布的流行病学统计数据显示，肺癌的发病率和死亡率位居恶性肿瘤的前列，给患者的健康和经济带来巨大的伤害。
肿瘤的治疗方法，除了传统的手术疗法、放射疗法和化学疗法外，免疫疗法近年来的发展也有望成为一种新的策略，但由于肿瘤微环境内抑制因素的存在，使得该类免疫疗法在增强免疫应答和杀伤肿瘤细胞中的作用效果受到极大的限制。
程序性死亡受体1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)或配体2(PD-L2)是肿瘤微环境中免疫抑制网络的关键组分，其抑制正常生理学中的表达PD-1的免疫细胞(例如T细胞)的活性，可被肿瘤利用以抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。研究发现，PD-1及PD-L1(或PD-L2)广泛表达于多种肿瘤细胞，两者结合可抑制下游NF-κB的转录并促使干扰素-δ分泌的下调，最终抑制T细胞免疫，导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤。因此，可以通过阻断PD-1/PD-L1(或PD-L2)信号通路来逆转肿瘤免疫微环境，恢复T细胞的抗肿瘤活性，从而增强内源性抗肿瘤免疫效应。临床证据也表明针对PD-1和PD-L1/PD-L2的抗体对黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、Merkel细胞癌、尿路上皮癌、头颈癌等患者的存活率有显著和持久的改善作用。然而，尽管抗PD-1/PD-L1(或PD-L2)疗法有良好的临床活性，但只对少数患者有反应，因此还需要进一步改进。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种PTTRAP1双特异性融合蛋白，所述PTTRAP1双特异性融合蛋白能够靶向程序性死亡配体1(PD-L1)和/或配体2(PD-L2)，且同时靶向人转化生长因子-β(TGF-β)。
上述PTTRAP1双特异性融合蛋白包含：程序性死亡受体1的细胞外结构域，命名为PD1；和人转化生长因子β受体II的细胞外结构域，命名为TGFBRII。
上述PTTRAP1双特异性融合蛋白还包含抗人免疫球蛋白G1(IgG4)的Fc段，命名为Fc；优选地，所述Fc位于所述PD1和TGFBRII的中间(TGFBRII-Fc-PD1)，或所述Fc位于PD1的尾端(TGFBRII-PD1-Fc)。
上述PD1与TGFBRII之间、或所述Fc与TGFBRII之间、或所述Fc与PD1之间均通过柔性接头相连接；所述柔性接头包括但不限于序列表中SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27所示的柔性接头。
上述PTTRAP1双特异性融合蛋白的氨基酸序列具体为但不限于序列表中SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11所示。
本发明另一方面提供上述的PTTRAP1双特异性融合蛋白的表达序列；
具体的，所述表达序列的核苷酸序列包括但不限于序列表中SEQ ID NO：8或SEQID NO：10所示；
任选地，所述表达序列的头端还包含有引导序列，所述引导序列的核苷酸序列可为但不限于序列表中SEQ ID NO：14所示。
本发明又一方面还提供一种重组质粒，由上述的表达序列插入AbVec2.0-IGHG1载体中获得，用于表达获得上述的PTTRAP1双特异性融合蛋白。
上述的PTTRAP1双特异性融合蛋白、PTTRAP1双特异性融合蛋白的表达序列、或重组质粒在制备治疗癌症的药物中的应用也属于本发明的内容。
本发明又一方面还提供一种癌症治疗药物，包含上述的PTTRAP1双特异性融合蛋白；
可选地，所述药物还包含具有肿瘤杀伤性的细胞，其中所述具有肿瘤杀伤性的细胞包括但不限于以下中的一种或多种：γδT细胞、αβT细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞。
上述癌症包括但不限于肺癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、肝癌、胃癌、胶质瘤。
本发明提供的PTTRAP1双特异性融合蛋白可以有效并特异性地同时结合PD-L1和/或PD-L2以及TGF-β，因此是一种同时靶向并有效阻断两种免疫抑制途径的双功能分子，能够打破肿瘤微环境中由这两种免疫抑制途径造成的肿瘤免疫耐受，从而促进免疫疗法的抗肿瘤免疫功能和治疗效果。本发明的实验结果还证明该PTTRAP1双特异性融合蛋白能够减少肿瘤浸润性Treg细胞数量，改善肿瘤微环境，提高抗肿瘤免疫治疗效果，因此可以提供更有效的针对当前免疫检查点抑制剂具有抗性的癌症的免疫治疗药物和治疗策略。
附图说明
图1为本发明的一个实施例提供的融合蛋白的结构示意图；
图2为本发明的一个实施例的双特异性融合蛋白TGFBRII-Fc-PD1的分子结构示意图；
图3为融合蛋白的真核表达载体AbVec2.0-IGHG1载体质粒构建酶切图；
图4为本发明的一个实施例提供的目的重组质粒的图谱结构示意图；
图5为融合蛋白表达纯化-Western Blotting及考马斯亮蓝染色蛋白验证结果；
图6为融合蛋白结合实验结果；
图7为双特异性融合蛋白TGFBRII-Fc-PD1分别结合TGF-β和PD-L1的Fortebio结果；
图8为Western Blotting实验验证PTTRAP1双特异性融合蛋白特异结合PD-L1以及TGF-β的结果；
图9为流式细胞术检测体外分离培养的人外周血γδT细胞PD-1表达时相变化及统计结果；
图10为γδT细胞与HepG2肿瘤细胞共孵育不同时间后其表面PD-1表达水平变化检测结果；
图11为流式检测肿瘤细胞表面PD-L1表达水平，及其所分泌的TGF-β1量对比及与纯化蛋白孵育前后肿瘤细胞表面PD-L1表达对比结果；
图12为共聚焦检测双特异性融合蛋白TGFBRII-Fc-PD1对肿瘤细胞表面PD-L1的封闭情况；
图13为LDH法检测γδT细胞联合PTTRAP1双特异性融合蛋白对不同肿瘤细胞的杀伤作用；
图14为γδT细胞联合PTTRAP1双特异性融合蛋白的体内抗肿瘤作用。
具体实施方式
针对临床应用中抗PD-1/PD-L1疗法只对少数患者有反应的客观状况，发明人进行了深入的分析研究，认为要提高客观响应率，应以普遍逆转肿瘤微环境，恢复相关免疫细胞的抗肿瘤活性为突破口。
发明人考虑到：肿瘤微环境中的另一主要免疫抑制机制是免疫抑制细胞因子(例如，转化生长因子-β(TGF-β)调节性T细胞等)的存在，其通过诱导调节性T细胞(Tregs)和抑制CD8+和TH1细胞来驱动肿瘤微环境中的免疫功能障碍，因此，癌细胞能够通过该类细胞因子的特异性免疫抑制机制逃避机体免疫系统的消除。在正常生理学中，调节细胞因子转化生长因子-β(TGFβ)起到维持免疫自身耐受的作用，然而，TGF-β可通过其对先天和适应性免疫系统的影响促进肿瘤进展并促进肿瘤免疫逃避。研究表明，三种TGF-β异构体TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3在许多肿瘤类型中均高表达，TGF-β在肿瘤微环境内起自分泌或旁分泌信号的作用，它通过基质修饰，血管生成和上皮-间质转化(EMT)的诱导促进肿瘤进展。此外，TGF-β1可以直接抑制T细胞和自然杀伤(NK)的细胞分裂和效应功能。因此，在癌症的情况下，TGF-β的免疫抑制会阻止免疫疗法发挥作用，应消除免疫抑制因素TGF-β，而在免疫疗法中如何消除免疫抑制因素TGF-β是关键。
本发明为了解决这一挑战，获得一种PTTRAP1双特异性融合蛋白，其可以同时阻断肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1(和/或PD-L2)信号通路以及自分泌/旁分泌TGF-β，从而改善肿瘤微环境，恢复免疫细胞的抗肿瘤活性，进而增强内源性抗肿瘤免疫效应，使得本发明提供的PTTRAP1双特异性融合蛋白能够显著提高例如γδT细胞的免疫细胞的免疫治疗效果。
另外，本发明还提供上述PTTRAP1双特异性融合蛋白的制备方法，其是将程序性死亡受体1(PD-1)的细胞外结构域(PD1)与人转化生长因子(TGF-β)受体II的细胞外结构域(TGFBRII)相融合，共同起到“陷阱”的作用。该双特异性融合蛋白中间由柔性接头(例如(Gly4Ser)4Gly)相连接，而与抗人免疫球蛋白G1(IgG4)的Fc段(例如已上市的派姆单抗keytruda-(pembrolizumab)内CH2-CH3序列)分别在中间及末尾处构成异四聚体结构的融合蛋白的整体，旨在靶向肿瘤微环境中免疫抑制的两种主要机制。
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
以下以具体实施例详述本发明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的公开内容不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
本发明实施例中使用的细胞系：
NCI-H520肺癌细胞、OVCAR8卵巢癌细胞，PANC-1胰腺癌细胞、MDA-MB231乳腺癌细胞，T淋巴瘤-huT78细胞、CASK-1宫颈癌细胞、HepG2肝癌细胞系，均以含10％FCS的RPMI-1640培养基进行贴壁培养；293T：SV40转化的人胚肾上皮细胞系，以含10％胎牛血清的DMEM培养基进行贴壁培养，用于Luciferase慢病毒的包装；上述细胞系均购自中国医学科学院细胞中心。
本发明实施例中使用的NSG(NOD-SCID小鼠)小鼠，鼠龄4～6周，体重15～20g，雌性，购于生物制品检定所动物中心，于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心无特定病原体(specific pathogen free，SPF)条件下的层流架中饲养。
本发明实施例中使用的菌株和质粒载体：
大肠杆菌DH5α，购自宝生物工程有限公司。基因型为：supE44ΔlacU169(
Figure BSA0000198811670000041
)hsdR17 recA1 end1 gyr96 thi-1 relA1，用于质粒的扩增与转化。
AbVec2.0-IGHG1载体，用于在哺乳动物细胞中专门对分泌型免疫球蛋白重链进行真核表达，购自宝生物工程有限公司。
PHIV-Luciferase(Plasmid#21375)；表达Luciferase的慢病毒载体，用于将Luciferase的编码基因插入肿瘤宿主细胞表达体系内随机实现对肿瘤细胞的改造，购自宝生物工程有限公司。
psPAX2和pMD2.G：分别为慢病毒包装系统中的包装质粒和包膜质粒，购自宝生物工程有限公司。
实施例1、目的重组载体的构建
该实施例利用已有的AbVec2.0-IGHG1载体(addgene，#80795，Tiller等，JImmunol Methods.2008 Jan 1；329(1-2)：1；其在哺乳动物细胞中专门对分泌型免疫球蛋白重链进行表达，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示)、程序性死亡受体1(PD-1)的细胞外结构域序列(命名为PD1，Pubmed，Gene ID：817329(程序性死亡受体1)，PDCD1programmed cell death 1[Homo sapiens(human)Gene ID：5133，updated on 20-Jan-2019，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，对应的氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO：3所示)、人转化生长因子(TGF-β)受体II的细胞外结构域序列(命名为TGFBRII，Pubmed，Gene ID：100329004(人转化生长因子(TGF-β)受体II)，其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：4所示，对应的氨基酸为序列表中SEQ ID NO：5所示)以及抗人免疫球蛋白G1(IgG4)的Fc片段序列(命名为Fc，来自于已上市的派姆单抗keytruda-(pembrolizumab)内CH2-CH3序列，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：6所示，对应的氨基酸为序列表中SEQ ID NO：7所示)构建获得4种不同的目的质粒，其构成分别为：
a.AbVec2.0-IGHG1-TGFBRII-PD1-Fc；
b.AbVec2.0-IGHG1-TGFBRII-Fc-PD1；
c.AbVec2.0-IGHG1-TGFBRII-Fc；
d.AbVec2.0-IGHG1-PD1-Fc；
其中如图1所示，a质粒中双特异性融合蛋白的表达序列表示为TGFBRII-PD1-Fc(其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：8所示，对应的氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO：9所示)，b质粒中的双特异性融合蛋白的表达序列表示为TGFBRII-Fc-PD1(其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：10所示，对应的氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO：11所示，其表达获得的双特异性融合蛋白的结构示意图如图2所示)，两质粒包含PD1序列、TGFBRII序列、表达柔性(Gly4Ser)4接头的序列(命名为linker，公开号：US 2003/0095977 A1，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：12所示，对应的氨基酸为序列表中SEQ ID NO：13所示)和Fc序列，并且在TGFBRII序列前端还均包含TGF-βII细胞外结构域自身引导DNA序列(命名为TGFBRII-signal，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：14所示，对应的氨基酸为序列表中SEQ ID NO：15所示)。在双特异性融合蛋白的表达序列TGFBRII-PD1-Fc中，两条linker序列分别位于PD1序列和TGFBRII序列之间，以及PD1序列和Fc序列。在双特异性融合蛋白的表达序列TGFBRII-Fc-PD1中，两条linker序列分别位于PD1序列和Fc序列之间，以及Fc序列和TGFBRII序列之间。
如图1所示，c质粒中的融合蛋白表达序列表示为TGFBRII-Fc(其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：16所示，对应的氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO：17所示)包含TGFBRII序列、linker序列和Fc序列，并且在TGFBRII序列前端还包含TGFBRII-signal序列，其中linker序列用于连接TGFBRII序列和Fc序列。d质粒中的融合蛋白表达序列表示为PD1-Fc(其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：18所示，对应的氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO：19所示)包含PD1序列、linker序列和Fc序列，并且在PD1序列的前端还包含PD-1细胞外结构域自身引导DNA序列(命名为PD-1-signal，核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：20所示，对应的氨基酸为序列表中SEQ ID NO：21所示)，其中linker序列用于连接PD1序列和Fc序列。
当然，上述融合蛋白中所使用的柔性接头并不限于US 2003/0095977 A1中公开的柔性(Gly4Ser)4接头，还可以使用包括但不限于US2003/0095977 A1中公开的其他柔性接头，例如15 mer G4 S：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：22)、18 mer G4 S：GGGGSGGGGSGGGGSGGS(SEQ ID NO：23)、25 mer G4 S：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：24)、35 mer G4 S：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：25)、18 merPKOD：GLEGSPEAGLSPDAGSGS(SEQ ID NO：26)、18 mer PKOD2：GLEGSPEAGLSPDAGSDS(SEQ IDNO：27)。
具体构建方法包括以下步骤：
1.1、设计双特异性融合蛋白的表达序列TGFBRII-PD1-Fc、TGFBRII-Fc-PD1以及融合蛋白的表达序列TGFBRII-Fc、PD1-Fc，并在各融合蛋白的表达序列两端分别引入与后续所用载体(AbVec2.0-IGHG1)连接对应的酶切位点的粘性末端，其中序列的合成由生工生物工程有限公司完成；
1.2、构建目的质粒
该步骤利用上述步骤1.1构建获得的蛋白表达序列TGFBRII-PD1-Fc、TGFBRII-Fc-PD1、TGFBRII-Fc、PD1-Fc(两端引入酶切位点)分别构建获得4种目的质粒，其构建方法包括以下步骤：
1)按照按照EcoRI和HindIII(购自NEW ENGLAND BioLabs)两种限制性内切酶说明书中提供的方法按照下表1所列的双酶切体系，对AbVec2.0-IGHG1载体以及各蛋白表达序列(作为底物)进行双酶切；
表1：酶切体系
Figure BSA0000198811670000061
Figure BSA0000198811670000071
时间：5-10min；条件：37℃恒温。
2)双酶切后的产物采用柱式DNA回收试剂盒(购自生工生物工程有限公司)进行回收，随后将回收的双酶切产物(载体和目的片段的双酶切产物)通过T4 DNA连接酶(购自NEWENGLAND BioLabs)按照下表2所示连接体系在16℃连接过夜：
表2：连接体系
Figure BSA0000198811670000072
3)转化：取上述步骤3)的连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min，置冰上5min，加入1ml LB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min，最后均匀涂布在含有100ng/ml抗生素的LB平板上(100-150μl)。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。
4)阳性菌落抽提质粒、酶切鉴定及测序分析
挑取转划后长出的阳性克隆菌落，使用质粒小量提取试剂盒(购自生工生物工程有限公司)按照说明书要求小量抽提质粒，对抽提的质粒进行酶切鉴定，并根据酶切鉴定结果对含有目的片段插入的重组质粒进行DNA序列测定(由上海生物工程股份有限公司完成)。用DNAMAN软件分析测序结果，获得测序正确的目的重组质粒，分别命名为AbVec2.0-IGHG1-TGFBRII-PD1-Fc、AbVec2.0-IGHG1-TGFBRII-Fc-PD1、AbVec2.0-IGHG1-TGFBRII-Fc和AbVec2.0-IGHG1-PD1-Fc。
如图3所示，为目的重组质粒经过双酶切之后获得的片段，证明提取的质粒中含有目的DNA片段。
如图4所示，示出了目的重组质粒AbVec2.0-IGHG1-TGFBRII-Fc-PD1的图谱结构示意图。
通过本实施例，获得了分别用于表达融合蛋白TGFBRII-PD1-Fc、TGFBRII-Fc-PD1、TGFBRII-Fc和PD1-Fc的目的重组质粒，将用于以下实施例进行体内外试验。
按照本实施例介绍内容，改变柔性接头的种类能得到仅linker不同的用于表达融合蛋白TGFBRII-PD1-Fc、TGFBRII-Fc-PD1的重组质粒，在此不一一罗列。
实施例2、目的质粒表达、纯化和验证
该实施例利用293T细胞瞬时转染上述实施例1获得的4种目的质粒，并使用AktaAvant 25-ProteinA Column(GE-Instructions 71-7002-00 AR HiTrapTM Protein A HP)纯化转染293T细胞后分泌的上清液。利用Western Blotting及考马斯亮蓝实验验证纯化的四种融合蛋白TGFBRII-PD1-Fc、TGFBRII-Fc-PD1、TGFBRII-Fc、PD1-Fc。具体包括以下步骤：
2.1、目的质粒的转染和纯化
1)目的质粒瞬时转染293T细胞
提前将生长状态良好的293T细胞铺至10cm皿(10皿)，使其培养48h后细胞密度达80％～90％。按照jet PRIME Polyplus转染试剂盒(购自生工生物工程有限公司)的使用说明书对293T细胞进行转染。
2)培养上清液的纯化
利用四种目的质粒转染293T细胞后，继续在37℃、5％CO2条件下培养48h，随后利用AktaAvant25-ProteinAColumn按照说明书要求纯化293T细胞培养上清液，并透析浓缩。分别得到TGFBRII-PD1-Fc、TGFBRII-Fc-PD1、TGFBRII-Fc、PD1-Fc四种纯蛋白，并留取部分上清液作为对照(纯化前的目的蛋白)用于后续试验。
2.2、Western Blotting及考马斯亮蓝实验验证
收集上述四种目的蛋白(纯化前和纯化后)，配制10％SDS-PAGE凝胶，电泳，转膜，用含有5％脱脂奶粉的TBST溶液封闭，蛋白直接作为样本上样后，由于含有Fc段，因此可以直接用HRP标记的相应种属来源二抗(抗人IgG(购自北京三联博悦生物技术有限公司))(1∶2000稀释)进行二抗孵育，室温孵育时间1h，随后放入ECL自显影仪(上海西唐生物科技有限公司)中曝光成像。
收集上述四种目的蛋白(纯化前和纯化后)，配制10％SDS-PAGE凝胶，电泳，然后按照考马斯亮蓝染色试剂盒(生工生物工程有限公司)的使用说明书对纯化前后的四种蛋白进行考马斯亮蓝染色。
如图5所示，其中上图示出了四种目的蛋白表达纯化前后的Western Blotting验证结果，下图示出了马斯亮蓝染色结果，可见纯化前由于表达量高，曝光时呈现空泡状，杂带多而目的条带不明显；利用AktaAvant25-ProteinAColumn进行纯化后目的蛋白条带清晰且位置正确，四种目的蛋白的大小分别为TGFBRII-PD1-Fc(约74kDa)、TGFBRII-Fc-PD1(约74kDa)、TGFBRII-Fc(约50kDa)、PD1-Fc(约50kDa)。以上结果初步证明了所构建的四个目的质粒可以成功在293T内表达。其中融合蛋白TGFBRII-PD1-Fc和TGFBRII-Fc-PD1统称为PTTRAP1双特异性融合蛋白。
实施例3、体外结合功能检测
该实施例分别利用Elisa结合实验、流式封闭、Fortebio检测、以及WesternBlotting实验，验证了PTTRAP1双特异性融合蛋白可以有效并且特异的结合PD-L1以及TGF-β，进而阻断PD-1/PD-L1和TGF-β-Smad经典通路。具体包括以下步骤：
3.1、Elisa结合检测
1)、PD-L1-Fc包被酶标板：将PD-L1-Fc(购自生工生物工程有限公司)用0.05MPH9，碳酸盐包被缓冲液稀释成1～10μg/ml，在酶标板的每孔加0.1ml，4℃下包被过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(pH 7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液)洗3次，每次3分钟。
2)、加样：向酶标板的每孔加0.1ml系列稀释(使用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液稀释)的待检样品(TGFBRII-PD1-Fc或TGFBRII-Fc-PD1)，置37℃孵育3小时。然后用洗涤缓冲液洗涤。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。
3)待步骤2)反应结束后，于各反应孔中，加入生物素化的TGF-β1(购自生工生物工程有限公司)0.1ml，置37℃孵育2小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。
4)加酶标抗体：于各反应孔中，加入HRP缀合的链霉抗生物素蛋白(在PBS中1∶200稀释，购自生工生物工程有限公司)一起温育45分钟，洗涤。反应结束后用PBST洗液洗涤5次，拍干。
5)显色：加入Elisa底物(购自生工生物工程有限公司)各100μL/孔进行显色，37℃温育15min。
6)终止反应与测量：加入终止液(配方为：1000mL双蒸水中含有98％硫酸铵27.8mL)，50μL/孔，测定OD450值。
7)结果判断：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
检测结果如图6所示，示出了两步法ELISA图，可见PTTRAP1双特异性融合蛋白(TGFBRII-PD1-Fc和TGFBRII-Fc-PD1)能够同时结合PD-L1和TGF-β。
3.2、Fortebio检测
该步骤的目的是采用OctetRED(ForteBio)检测分子量为150Da～1000Da的小分子与蛋白间的相互作用，在该步骤中的检测过程中使用SSAsensor(Cat#18-0008and18-0009)传感器。
检测样品制备：使用PBS缓冲液对上述实施例2获得的TGFBRII-Fc-PD1纯化蛋白浓缩液进行稀释，具体为将20mM蛋白样品溶于100％DMSO中，随后使用PBS缓冲液进行稀释，使得DMSO的最终浓度为5％。随后将制备的检测样品按照OctetRED的使用说明书直接上机检测。
检测结果如图7所示，其中A幅示出的是TGFBRII-Fc-PD1与TGF-β1的结合能力及结合速度，B幅示出的是TGFBRII-Fc-PD1与PD-L1的结合能力及结合速度。已知判断亲和力是根据KD(M)值，KD＞10-8M属于结合能力较弱；10-9M＜KD＜10-8M属于结合能力较强；10-11M＜KD＜10-9M属于结合能力强；KD＜10-11M属于结合能力很强。根据图7结果，可见TGFBRII-Fc-PD1分别对TGF-β及PD-L1的结合能力分别为1E-12、1.1E-12，即TGFBRII-Fc-PD1对TGF-β及PD-L1纯蛋白的结合能力均很强，属于快结合快解理方式。
3.3、Western Blotting
收集上述实施例2纯化后的四种目的蛋白，配制10％SDS-PAGE凝胶，电泳，转膜，用含有5％脱脂奶粉的TBST溶液封闭，分别用一抗(PD-L1抗原或TGF-β抗原)进行孵育，4℃过夜，随后用HRP标记的相应种属来源二抗(抗人IgG(购自北京三联博悦生物技术有限公司))(1∶2000稀释)进行二抗孵育，室温孵育时间1h，随后放入ECL自显影仪(上海西唐生物科技有限公司)中曝光成像。
检测结果如图8所示，其中A幅为使用PD-L1抗原进行孵育的检测结果，B幅为使用TGF-β抗原进行孵育的检测结果，可见PTTRAP1双特异性融合蛋白(TGFBRII-PD1-Fc和TGFBRII-Fc-PD1)可以同时有效且特异结合PD-L1和TGF-β，进而阻断PD-1/PD-L1和TGF-β-Smad经典通路。
3.4、流式细胞术检测体外分离培养的人外周血γδT细胞PD-1表达时相变化及统计字体
3.4.1、细胞培养和细胞扩增
PBMC细胞：采集健康志愿者静脉血，通过人外周血淋巴细胞分离液(购自生工生物工程有限公司)按照说明书要求从正常人外周血中分离了外周血单个核细胞(PBMC)。
γδT细胞扩增：以唑来膦酸盐(正大天晴天晴依泰(唑来膦酸注射液))或ANTI-PAN-TCRγδ(贝克曼库尔特商贸公司IM1349)体外扩增培养PBMC中的γδT细胞，其中采用唑来膦酸盐的扩增方法为：第一天于24孔板内以2×106个细胞/孔铺板PBMC，前四天使用含Zol唑来膦酸盐(0.8mg/ml)。30ml完全培养基内加入50ul Zol唑来膦酸盐及含10％胎牛血清、IL-2(200IU)的RPMI-1640培养基内进行培养，培养条件为37℃，5％CO2，第五天撤去刺激即使用含10％胎牛血清、IL-2的RPMI-1640培养基在相同的条件下培养，每两天更换一次培养基，至第7-9天检测纯度，纯度达90％以上可用于后续感染。
3.4.2、流式细胞术检测
该步骤使用上述步骤3.4.1体外扩增的γδT细胞，采用流式细胞仪(beckman)按照说明书步骤检测体外分离培养的人外周血γδT细胞PD-1表达时相变化。
流式细胞术检测结果如图9所示，其中A幅和C幅表示γδT细胞表面PD-1表达随时间的变化图，B幅表示γδT细胞的纯度检测统计图。可见来源于人外周血的γδT细胞在体外培养的早期活化阶段会出现PD-1表达的一过性上升(第4天)，PD-1增加超过40％(甚至达到60％左右)，随后下降至初始水平并保持稳定；从B幅结果可知来源于人外周血的γδT细胞在体外培养过程中的纯度在一定范围内持续升高，最后保持稳定。该结果表明γδT细胞在活化状态下PD-1表达水平上调，肿瘤细胞可通过调控PD-1/PD-L1信号通路影响γδT细胞的杀伤功能。
3.5、γδT细胞与HepG2肿瘤细胞共孵育0h/2h/4h/6h/12h/24h后其表面PD-1表达水平变化检测
1)按照上述步骤3.4.1的方法对来自健康供体的新鲜分离的PBMC用于体外扩增γδT细胞作为效应细胞，加入RPMI-1640培养基清洗一遍，300×g离心5min，将细胞沉淀重悬于含5％四季青血清的RPMI-1640培养基中，计数备用；
2)靶细胞的制备：收集生长状态良好的HepG2肿瘤细胞，用RPMI-1640培养基清洗一遍，300×g离心5min，弃上清后，将细胞沉淀重悬于含5％四季青血清(购自生工生物工程有限公司)的RPMI-1640培养基中，计数，并调整细胞浓度为2×105个/mL备用；
3)效靶细胞共孵育：在圆底96孔板中各孔加入50μL靶细胞，调整效应细胞浓度，按效靶比10∶1加入效应细胞，同时设置效应细胞自发释放孔，靶细胞自发释放孔，靶细胞最大释放孔，培养基自发孔，体积校正孔，每组均设置4个复孔，平板室温400×g离心4min后置于37℃，5％CO2分别孵育0h/2h/4h/6h/12h/24h；
4)分别在不同时间段收集效应细胞与靶细胞混合悬液，同时染色hPD-1、γδT流式抗体(均购自生工生物工程有限公司)，上流式细胞仪检测。
流式细胞检测结果如图10所示，其中A幅和B幅为γδT细胞与HepG2肿瘤细胞分别共孵育0h、2h、4h、6h、12h和24h时，γδT细胞表面PD-1应激变化图，可见γδT细胞与HepG2肿瘤细胞共孵育后0-6h内，γδT细胞表面PD-1表达上调，随后PD-1表达达到平稳状态，当共孵育24h时，PD-1的表达稍有下降，但与共孵育12h的结果没有显著差异。
以上结果证明了γδT细胞在活化状态下PD-1表达水平有应激性的上调，并且肿瘤细胞可通过调控PD-1/PD-L1信号通路影响γδT细胞杀伤功能。因此，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路来提高γδT细胞的杀伤功能在原理上是可行的。这也可证明人γδT细胞是一类独特的T淋巴细胞亚群，且γδT细胞的抗肿瘤功能也能被PD-1通路所调控。
3.6、流式检测肿瘤细胞表面PD-L1表达水平及Elisa检测其TGF-β1的分泌量
1)该步骤首先使用流式细胞仪按照操作说明书检测不同肿瘤细胞(例如NCI-H520肺癌细胞、PANC-1胰腺癌细胞、T淋巴瘤-huT78细胞、CASK-1宫颈癌细胞、HepG2肝癌细胞系)PD-L1表达水平以及采用Elisa检测试剂盒按照说明书检测不同肿瘤细胞表面TGF-β1的分泌量。
检测结果如下表3所示，可见在检测的几种肿瘤细胞均能表达PD-L1和TGF-β1。其中以HepG2肿瘤细胞表面PD-L1表达最高，且其上清TGF-β1分泌也最高。因此选用HepG2肿瘤细胞系作为对PTTRAP1双特异性融合蛋白敏感的肿瘤细胞系。
表3：
Figure BSA0000198811670000121
2)根据上述步骤3.5所述的方法，区别在于该步骤中使用实施例2获得的纯化后的融合蛋白(TGFBRII-Fc-PD1、TGFBRII-PD1-Fc、PD-1-Fc)以及纯化前的细胞培养上清与HepG2肿瘤细胞分别共孵育2小时，对HepG2肿瘤细胞表面的PD-L1进行流式检测。
检测结果如图11中A幅和B幅所示，可见相对于初始PD-L1表达水平，使用融合蛋白PD-1-Fc和PTTRAP1双特异性融合蛋白与HepG2肿瘤细胞共孵育后，肿瘤细胞表面的PD-L1表达水平显著降低；相对于融合蛋白PD-1-Fc，PTTRAP1双特异性融合蛋白的作用效果更加显著，并且尤其以纯化后的PTTRAP1双特异性融合蛋白对HepG2肿瘤细胞表面的PD-L1表达水平影响最为显著，封闭效果最为明显。
3.7、共聚焦检测PTTRAP1双特异性融合蛋白对肿瘤细胞表面PD-L1的封闭情况
1.爬片的准备
1)根据需要用小砂轮或玻璃刀将盖玻片剪裁成合适的大小；
2)将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，然后置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后高压消毒。高压消毒后取出放入烘箱中烘干，烘干后放入超净台中备用。
3)将爬片用多聚赖氨酸处理，以使细胞与爬片结合更牢固。具体为：1mg/ml的多聚赖氨酸用0.22μm的滤器过滤除菌后分装于经过无菌处理的1ml细胞冻存管内保存在4℃条件下。使用时将高压灭菌过的爬片放到0.1mg/ml的多聚赖氨酸溶液内浸泡5min，无菌晾干即可使用。
2.细胞爬片
1)胰酶消化HepG2肿瘤细胞后重悬细胞于完全培养基(含10％FCS的RPMI-1640培养基)中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。
2)将细胞悬液种入培养板内的爬片上。
3.细胞的固定及免疫荧光
1)在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，一般先使用PBS轻洗细胞2×3min，然后再做固定。
2)固定：加入4％多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。
3)除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3min。
4)通透：0.5％TritonX-100(PBS配制)室温通透20min。
5)除去TritonX-100，使用PBS轻洗细胞3×3min。
6)3％H2O2孵育15min。
7)除去H2O2，使用PBS轻洗细胞3×3min。
8)封闭：用10％的与二抗同源的血清(PBS配制)封闭半小时。
9)一抗：滴加足够量适宜浓度的一抗(市售TGF-β1抗体+纯化的双特异性融合蛋白TGFBRII-Fc-PD1或单独的纯化蛋白TGFBRII-Fc或PD1-Fc)，4℃孵育过夜(或37℃，60min)。
10)除去一抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。
11)二抗：滴加足够量适宜浓度的二抗(抗人IgG)，37℃，30min。
12)除去二抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。
13)二氨基联苯胺(DAB)底物显色：室温下避光孵育5至10分钟，或直至样本出现棕褐色。
14)除去显色工作液，使用PBS冲洗细胞3～4次。
15)复染核：0.5μg/ml DAPI(或200nM Hoechst33342)避光孵育5min。
16)使用PBS轻洗细胞4×5min，洗去多余的DAPI。
17)取爬片。
18)用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液(购自生工生物工程有限公司)封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。
检测结果如图12所示，其中利用0.25％TritonX-100分别对细胞膜穿透(破膜)及不穿透(不破膜)的处理，A幅表示使用市售TGF-β1抗体+双特异性融合蛋白TGFBRII-Fc-PD1作为一抗(不破膜)，B幅表示使用市售TGF-β1抗体+双特异性融合蛋白TGFBRII-Fc-PD1作为一抗(破膜)，C幅表示使用单独的纯化蛋白PD1-Fc作为一抗(不破膜)，D幅表示使用单独的纯化蛋白PD1-Fc作为一抗(破膜)，可见针对HepG2肝癌细胞系的细胞爬片，使用PTTRAP1双特异性融合蛋白(TGFBRII-Fc-PD1)及单独的纯化蛋白对照作为一抗进行孵育，二抗使用抗人IgG进行分析时，显示了PTTRAP1双特异性融合蛋白可以结合于肿瘤细胞表面，这与封闭实验相吻合。
3.8、LDH法检测γδT细胞联合PTTRAP1双特异性融合蛋白对不同肿瘤细胞的杀伤作用
1)收集上述步骤3.4.1制备得到的人γδT细胞，加入RPMI-1640培养基清洗一遍，300×g离心5min，将细胞沉淀重悬于含5％四季青血清的RPMI-1640培养基中，计数备用；
2)肿瘤细胞的制备：分别收集生长状态良好的肿瘤细胞(HepG2、PANC-1、NCI-H520、T淋巴瘤-huT78、CASK-1)，用RPMI-1640培养基清洗一遍，300×g离心5min，弃上清后，将细胞沉淀重悬于含5％四季青血清的RPMI-1640培养基中，计数，并调整细胞浓度为2×105个/mL备用；
3)蛋白+肿瘤细胞预孵育：将四种纯化蛋白分别直接加入各肿瘤细胞培养体系种孵育2小时，利用PBS清洗细胞2次后，使用完全培养基重悬细胞，获得靶细胞；
4)效靶细胞共孵育：在圆底96孔板中各孔加入50μL靶细胞，调整效应细胞浓度，按效靶比10∶1加入效应细胞，同时设置效应细胞自发释放孔，靶细胞自发释放孔，靶细胞最大释放孔，培养基自发孔，体积校正孔，每组均设置4个复孔，平板室温400×g离心4min后置于37℃，5％CO2共孵育8h；
5)使用
Figure BSA0000198811670000141
非放射性细胞毒性检测试剂盒按照说明书检测各组共孵育的杀伤效率(以百分杀伤率表示)。同时使用扩增的天然γδT细胞为对照，用LDH杀伤检测试剂盒(购自生工生物工程有限公司)按照说明书检测杀伤效果(以杀伤率表示)。
检测结果如图13和上表3所示，可见γδT细胞+双特异性融合蛋白TGFBRII-Fc-PD1的杀伤效率显著高于单独使用γδT细胞的杀伤效率。针对不同的肿瘤细胞，γδT细胞+PTTRAP1双特异性融合蛋白的杀伤效率也显著高于其他组的杀伤效率，证明了本发明提供的PTTRAP1双特异性融合蛋白与γδT细胞共施用杀伤肿瘤细胞时，能够显著提高γδT细胞的杀伤效果。
以上3.1～3.8的实验方法同样适用PD-L2，与PD-L1有同样的效果，表明PTTRAP1双特异性融合蛋白能够同时靶向结合PD-L2和TGF-β。
该实施例中与本发明提供的PTTRAP1双特异性融合蛋白联用的免疫细胞并不限于人γδT细胞，由于本发明提供的PTTRAP1双特异性融合蛋白是一种能够同时靶向结合PD-L1(和/或PD-L2)以及TGF-β的融合蛋白，以同时阻断肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1(和/或PD-L2)信号通路以及自分泌/旁分泌TGF-β，从而改善肿瘤微环境，恢复免疫细胞的抗肿瘤活性，进而增强内源性抗肿瘤免疫效应。因此，受到肿瘤微环境中这两种抑制因素影响的免疫细胞，例如αβT细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞等都可以与本发明提供的PTTRAP1双特异性融合蛋白联用，以提高上述这类免疫细胞的抗肿瘤活性和效果。
实施例4、γδT细胞联合PTTRAP1双特异性融合蛋白的体内抗肿瘤作用
4.1、表达外源Luciferase的HepG2肝癌细胞系(购自购自中国医学科学院细胞中心)细胞构建
1)按照Vigorous质粒大量提取纯化试剂盒(购自生工生物工程有限公司)的说明书，大量提取慢病毒载体pHIV-Luciferase(Plasmid#21375)，病毒包装载体pMD2.G和psPAX2的质粒。
2)按照
Figure BSA0000198811670000151
的说明书，分别共转染慢病毒载体pHIV-Luciferase和病毒包装载体质粒到293T细胞中，收集培养上清，浓缩纯化病毒颗粒。具体方法包括以下步骤：
A、将已长到80％-90％的293T细胞培养瓶(T175)从37℃、5％CO2的细胞培养箱中取出，消化后收集并洗涤细胞，每10cm细胞培养皿中加入4.5×106个细胞和9mL DMEM完全培养基(购于Gibco公司，产品目录号11965-084)，轻轻摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
B、培养第2天，每个培养皿加入如下试剂：
Figure BSA0000198811670000152
(购于PolyplusTransfection公司，产品目录号B161116)、4μg慢病毒载体质粒、3μgpsPAX2质粒和2μg PMD2.G质粒，混合均匀，然后再向体系中加入jetprime(购于PolyplusTransfection公司，产品目录号114-15)，25nL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置10min，得到混合液；
C、将用于包装病毒的293T细胞从37℃、5％CO2的细胞培养箱中取出，将步骤3)的混合液平均加到每个培养皿中，轻轻摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。培养4h后，弃旧培养基，加入5mL已预热的PBS清洗细胞，再加入9mL新鲜的已预热的含10％(体积分数)FBS的DMEM完全培养基，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
D、继续培养48-72h后收取培养上清作为病毒原液，并将收集的病毒原液用0.45ym过滤器过滤到50mL离心管中，4℃、18500g高速离心2h。弃上清液，向沉淀中加入DMEM完全培养基(加入的培养基与病毒原液的体积比为1∶500)重悬病毒颗粒，得到表达Luciferase的慢病毒颗粒，命名为Luciferase-GFP慢病毒；
3)将Luciferase-GFP慢病毒颗粒感染生长良好的HepG2肿瘤细胞。将HepG2细胞培养至密度融合70％左右时，保留少量培养基，在混合培养基(含10％FCS的RPMI-1640完全培养基(购自北京细工生物有限公司))中加入浓缩的慢病毒颗粒，感染对数生长期HepG2肿瘤细胞；然后细胞置于37℃、5％CO2孵箱培养过夜，感染至隔天更换完全培养基(含有5％胎牛血清的DMEM完全培养基)并维持正常培养及传代。
4)空载体对照组与实验组相应的慢病毒感染HepG2肿瘤细胞第3天后，分别收集细胞，用流式细胞技术及荧光显微镜、及体外luciferin发光技术检测其正确表达情况。感染72h后，通过GFP标签流式分选阳性的HepG2肝癌细胞系细胞，获得稳定表达外源Luciferase的HepG2肝癌细胞系(命名为Luciferase-HepG2肝癌细胞)，用于以下实验和体内实验的肿瘤活体成像。
4.2、HepG2肝癌细胞系荷瘤小鼠模型建立及细胞过继免疫治疗
1)该步骤采用上述步骤4.1获得的稳定表达外源Luciferase的HepG2肝癌细胞系以8×106cell/50μl在小鼠右侧背部偏下位置皮下输注接种共70只NSG(购自上海南方模式生物科技股份有限公司，雌性)小鼠，待肿瘤生长至300mm3左右时进行小鼠分组和细胞过继免疫治疗；
2)如图14中A幅所示，将上述经过输注处理的小鼠共分为7组，其中组1为空白对照组，组2为单独γδT细胞治疗组；组3为γδT细胞联合PD1-Fc纯化蛋白治疗组；组4为γδT细胞联合TGFBRII-Fc纯化蛋白治疗组；组5为γδT细胞联合TGFBRII-Fc-PD1纯化蛋白治疗组；组6为γδT细胞联合TGFBRII-PD1-Fc纯化蛋白治疗组；组7为γδT细胞联合PD-1市售抗体组阳性对照组。组1为空白对照，不进行任何处理；其余组均给予瘤内注射1×107γδT细胞/50μl，并分别联合4组目的质粒。每隔4天治疗一次，共治疗四次。动物同时给予腹腔注射IL-25000U/只。
每隔4天进行小动物活体成像记录肿瘤生长情况。首先利用异氟烷麻醉小鼠，待小鼠麻醉后腹腔注射体内发光底物Luciferin(购自于美国Promega公司、终浓度150μg/ml，按小鼠体重1μl/mg)，15-20分钟后进行图像采集。并记录小鼠的生存情况。
结果如图14所示，其中A幅表示小鼠肿瘤活体成像结果，B幅表示荷瘤小鼠的生存期分析结果，C幅表示肿瘤生长情况统计结果。可见治疗组的小鼠较空白对照生存期显著延长，且显著抑制肿瘤的生长，其中以γδT细胞联合PTTRAP1双特异性融合蛋白(TGFBRII-PD1-Fc和TGFBRII-Fc-PD1)治疗显著优于其他治疗组的治疗效果，证明了本发明提供的PTTRAP1双特异性融合蛋白联合γδT细胞的过继免疫治疗能在体内发挥显著的抑制肿瘤生长的效果。
根据以上实施例的结果，本发明所提供的PTTRAP1双特异性融合蛋白，由于能够同时靶向结合PD-L1(和/或PD-L2)以及TGF-β的融合蛋白，可以同时阻断肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1(和/或PD-L2)信号通路以及自分泌/旁分泌TGF-β，从而可以改善肿瘤微环境，恢复免疫细胞，例如γδT细胞、αβT细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞等的抗肿瘤活性，因此具有广泛的抗肿瘤作用，如肺癌、胰腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、肝癌等，联合γδT细胞(以及其它免疫细胞，例如αβT细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞等)具有较佳的体内外治疗效果，可以应用于制备抗肿瘤细胞制剂，为肿瘤的过继性免疫治疗提供了新的有效工具。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure ISA0000198811690000011
Figure ISA0000198811690000021
Figure ISA0000198811690000031
Figure ISA0000198811690000041
Figure ISA0000198811690000051
Figure ISA0000198811690000061
Figure ISA0000198811690000071
Figure ISA0000198811690000081
Figure ISA0000198811690000091
Figure ISA0000198811690000101
Figure ISA0000198811690000111
Figure ISA0000198811690000121
Figure ISA0000198811690000131
Figure ISA0000198811690000141

Claims (10)

1.一种PTTRAP1双特异性融合蛋白，其特征在于，所述PTTRAP1双特异性融合蛋白能够靶向程序性死亡配体1(PD-L1)和/或配体2(PD-L2)，且同时靶向人转化生长因子-β(TGF-β)。
2.根据权利要求1所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白，其特征在于，所述PTTRAP1双特异性融合蛋白包含：程序性死亡受体1的细胞外结构域，命名为PD1；和人转化生长因子β受体II的细胞外结构域，命名为TGFBRII。
3.根据权利要求2所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白，其特征在于，所述PTTRAP1双特异性融合蛋白还包含抗人免疫球蛋白G1(IgG4)的Fc段，命名为Fc；优选地，所述Fc位于所述PD1和TGFBRII的中间(TGFBRII-Fc-PD1)，或所述Fc位于PD1的尾端(TGFBRII-PD1-Fc)。
4.根据权利要求3所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白，其特征在于，所述PD1与TGFBRII之间、或所述Fc与TGFBRII之间、或所述Fc与PD1之间均通过柔性接头相连接；所述柔性接头包括但不限于序列表中SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27所示的柔性接头。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白，其特征在于，所述PTTRAP1双特异性融合蛋白的氨基酸序列具体为但不限于序列表中SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：11所示。
6.权利要求1-5中任一项所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白的表达序列；
具体的，所述表达序列的核苷酸序列包括但不限于序列表中SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：10所示；
任选地，所述表达序列的头端还包含有引导序列，所述引导序列的核苷酸序列可为但不限于序列表中SEQ ID NO：14所示。
7.一种重组质粒，其特征在于，由权利要求6所述的表达序列插入AbVec2.0-IGHG1载体中获得，用于表达获得权利要求1-5中任一项所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白。
8.权利要求1-5中任一项所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白、权利要求6所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白的表达序列、或权利要求7所述重组质粒在制备治疗癌症的药物中的应用。
9.一种癌症治疗药物，包含权利要求1-5中任一项所述的PTTRAP1双特异性融合蛋白；
可选地，所述药物还包含具有肿瘤杀伤性的细胞，其中所述具有肿瘤杀伤性的细胞包括但不限于以下中的一种或多种：γδT细胞、αβT细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞。
10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的药物，其特征在于，所述癌症包括但不限于肺癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、肝癌、胃癌、胶质瘤。
CN201911388119.XA 2019-12-30 2019-12-30 Pttrap1双特异性融合蛋白及其应用 Pending CN113121699A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911388119.XA CN113121699A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 Pttrap1双特异性融合蛋白及其应用
PCT/CN2020/078562 WO2021134915A1 (zh) 2019-12-30 2020-03-10 Pttrap1双特异性融合蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911388119.XA CN113121699A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 Pttrap1双特异性融合蛋白及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113121699A true CN113121699A (zh) 2021-07-16

Family

ID=76686356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911388119.XA Pending CN113121699A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 Pttrap1双特异性融合蛋白及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113121699A (zh)
WO (1) WO2021134915A1 (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105017428A (zh) * 2014-05-13 2015-11-04 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 双靶向融合蛋白及其编码基因与应用
CN108440673A (zh) * 2018-04-08 2018-08-24 海南医学院 Fc融合蛋白PD1/FGFR1及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2791383C (en) * 2010-03-05 2022-09-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
SG11201606577YA (en) * 2014-02-10 2016-09-29 Merck Patent Gmbh TARGETED TGFβ INHIBITION
BR112019023184A2 (pt) * 2017-05-12 2020-05-19 Jiangsu Hengrui Medicine Co proteína de fusão contendo o receptor de tgf-¿ e o uso farmacêutico da mesma

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105017428A (zh) * 2014-05-13 2015-11-04 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 双靶向融合蛋白及其编码基因与应用
CN108440673A (zh) * 2018-04-08 2018-08-24 海南医学院 Fc融合蛋白PD1/FGFR1及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOFANG XING ET AL.: "Analysis of PD1,PDL1,PDL2 expression and T cells infiltration in 1014 gastric cancer patients", 《ONCOIMMUNOLOGY》 *
YAN LAN ET AL.: "Enhanced preclinical antitumor activity of M7824,a bifunctional fusion protein simultaneously targeting PD-L1 and TGF-β", 《SCI TRANSL MED》 *
张少微: "同时阻断PD-1和CTLA-4增加黑色素瘤中T细胞浸润并减少Treg和骨髓源抑制细胞数量", 《生理科学进展》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021134915A1 (zh) 2021-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108409840B (zh) 抗cd123单链抗体及其组合的嵌合抗原受体和应用
EA016168B1 (ru) Способ получения т-клеточной популяции и ее применение
US20200237822A1 (en) Compositions and methods for stimulating natural killer cells
CN105296431A (zh) 肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用途
WO2018058431A1 (zh) 一种嵌合抗原受体分子及其应用
CN111606999B (zh) 兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒及其应用
US11857572B2 (en) Method for preparing CAR-T cell with TCM as main active component and use thereof
CN106279432B (zh) 一种vc-car分子及在清除hiv-1感染细胞中的应用
JP2022512922A (ja) キメラ抗原受容体記憶様（ｃａｒｍｌ）ｎｋ細胞ならびにその産生および使用方法
CN109836497A (zh) 一种靶向egfr的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN112426526A (zh) 一种nk细胞的制备方法及其在治疗癌症中的应用
CN113621077B (zh) 一种tim-3/cd28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的car-t细胞
WO2020019983A1 (zh) 一种用于治疗肿瘤的基因工程细胞
CN110157686B (zh) 一种免疫检查点激活免疫共刺激的复制型溶瘤腺病毒及其构建方法和应用
CN105367661B (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化her1靶向性的nkt细胞及其应用
CN108699163B (zh) 一种多基因重组嵌合抗原受体分子及其应用
CN107541499B (zh) 一种靶向免疫检测点tnfr2的cik的制备及其应用
CN108753773A (zh) 干扰IFN-gama表达的CD19-CAR-T细胞及其应用
WO2020025039A1 (zh) 表达嵌合抗原受体的t细胞、该嵌合抗原相关表达载体以及它们的应用
CN110699371A (zh) 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
US8142791B2 (en) Multi-modal cancer therapy using viral hitch-hiking
CN113121699A (zh) Pttrap1双特异性融合蛋白及其应用
CN109836500A (zh) 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN112048021A (zh) 一种靶向ror2的嵌合抗原受体、表达基因、表达载体、t细胞及其应用
CN114786696A (zh) 包含免疫调节转基因的溶瘤病毒及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210716