JP2022512922A - キメラ抗原受容体記憶様（ｃａｒｍｌ）ｎｋ細胞ならびにその産生および使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明の種々の態様の一つは、キメラ抗原受容体記憶様(ＣＡＲＭＬ)ＮＫ細胞ならびにその産生および使用方法の提供である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月６日出願の米国仮出願６２／７５６,２９４および２０１９年１月４日出願の米国仮出願６２／７８８,４４０に基づく優先権を主張し、これらは、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
連邦政府の資金による研究または開発についての記載
適用なし。
参照により取り込まれる資料
本開示の一部である配列表は、本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含むコンピュータ読み取り可能形式を含む。配列表の主題は、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
発明の分野
本発明は、一般に修飾ＮＫ細胞に関する。
発明の概要
本発明の種々の態様の一つは、記憶様キメラ抗原受容体(ＣＡＲＭＬ)ＮＫ細胞およびその使用方法の提供である。
本発明のある態様は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)構築物を提供する。ある実施態様において、構築物は、疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメント；膜貫通ドメイン；または少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＡＲ構築物は、記憶様ナチュラルキラー(ＭＬ ＮＫ)細胞で発現されるかまたは機能することができる。
ある実施態様において、疾患関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ４ ＢＡＦＦ－Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ｇｐ１２０またはｇｐ４１からなる群から選択される。
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲIIIａ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８αまたはＩＬ１５Ｒｂからなる群から選択される。
ある実施態様において、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７／４１ＢＢ、ＤＮＡＭ－１、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＮＴＢＡ、ＣＲＡＣＣ、ＣＤ２、ＣＤ２７、１種以上のインテグリン類、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＲＥ１ａまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、膜貫通アダプターである。
ある実施態様において、ＣＡＲ構築物は、膜貫通アダプターまたはヒンジをさらに含む。
ある実施態様において、膜貫通アダプターは、ＦｃｅＲ１γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、１種以上のインテグリン類は、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントは、(ｉ)配列番号１のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ；(ii)配列番号２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ；または(iii)配列番号３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖからなる群から選択されるｓｃＦｖを含む。
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｄ；配列番号７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲIIIａ；配列番号９のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＫｐ３０；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６；配列番号１５のアミノ酸配列を含むａｃｔＫＩＲ；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｃ；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ８α；または配列番号２１のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Ｒｂからなる群から選択される。
ある実施態様において、ヒンジは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｄ；配列番号６のアミノ酸配列を含むＦｃγＲIIIａ；配列番号８のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＮＫｐ３０；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６；配列番号１４のアミノ酸配列を含むａｃｔＫＩＲ；配列番号１６のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｃ；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤ８α；または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Ｒｂからなる群から選択される。
ある実施態様において、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７／４１ＢＢ；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＤＮＡＭ－１；配列番号２４のアミノ酸配列を含むＮＫｐ８０；配列番号２５のアミノ酸配列を含む２Ｂ４；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＮＴＢＡ；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＲＡＣＣ；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤ２７；インテグリン類、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ２または配列番号３２のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＩＬ１５ＲＢ；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＩＬ１８Ｒ；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＩＬ１２ＲＢ１または配列番号３６のアミノ酸配列を含むＩＬ１２ＲＢ２であるＩＬ１２Ｒ；配列番号３７のアミノ酸配列を含むＩＬ２１Ｒ；配列番号３８のアミノ酸配列を含むＩＲＥ１ａ；またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の他の態様は、ここに記載するＣＡＲ構築物を含む記憶様ナチュラルキラー(ＭＬ ＮＫ)細胞を提供する。
本発明の他の態様は、キメラ抗原受容体記憶様ナチュラルキラー(ＣＡＲＭＬ ＮＫ)細胞を産生する方法を提供する。ある実施態様において、方法は、ＮＫ細胞、ＩＬ－１２／１５／１８またはＩＬ－１５を含む活性化サイトカインを準備し；サイトカイン活性化記憶様(ＭＬ)ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間、ＮＫ細胞または活性化サイトカインを接触させ；キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を、ウイルスベクターを介して、サイトカイン活性化ＭＬ ＮＫ細胞に、ＣＡＲ形質導入ＭＬ ＮＫ細胞をもたらすよう、ＣＡＲをサイトカイン活性化ＭＬ ＮＫ細胞にウイルスにより形質導入するのに十分な時間、ＩＬ－１５存在下で形質導入し；またはＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ(ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞)を形成するのに十分な時間、ＣＡＲ形質導入ＭＬ ＮＫ細胞をＩＬ－１５存在下でインキュベートすることを含む。
ある実施態様において、ＮＫ細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から単離された。
ある実施態様において、サイトカイン活性化ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間は、約８～約２４時間、約１２時間または約１６時間である。
ある実施態様において、ＣＡＲをＭＬ ＮＫ細胞にウイルスにより形質導入するのに十分な時間は、約１２時間～約２４時間である。
ある実施態様において、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞(ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞)を形成させるのに十分な時間は、少なくとも約３日間～約８日間または約７日間である。
ある実施態様において、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を含むウイルスベクターは、ＣＡＲレンチウイルスである。
ある実施態様において、ウイルスベクターは、ｐＭＮＤ－Ｇ、ｐＭＮＤ－Ｌｇ、ｐＭＤＮ－ＲＥＶまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるレンチウイルスベクターである。
ある実施態様において、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)の、ウイルスベクターを介するサイトカイン活性化ＭＬ ＮＫ細胞への形質導入は、ポリブレンの非存在下で実施される。
本発明の他の態様は、ここに記載するＣＡＲ構築物を含む、ここに記載する方法により産生したキメラ抗原受容体記憶様ナチュラルキラー(ＣＡＲＭＬ ＮＫ)細胞を提供する。
本発明の他の態様は、処置を必要とする対象における疾患に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。ある実施態様において、方法は、対象にキメラ抗原受容体記憶様(ＣＡＲＭＬ)ＮＫ細胞を投与することを含み、ここで、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメント；膜貫通ドメイン；または少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を含む。
ある実施態様において、疾患関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ４ ＢＡＦＦ－Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ｇｐ１２０またはｇｐ４１からなる群から選択される。
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲIIIａ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８αまたはＩＬ１５Ｒｂからなる群から選択される。
ある実施態様において、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７／４１ＢＢ、ＤＮＡＭ－１、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＮＴＢＡ、ＣＲＡＣＣ、ＣＤ２、ＣＤ２７、１種以上のインテグリン類、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＲＥ１ａまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、膜貫通アダプターである。
ある実施態様において、方法は、膜貫通アダプターをさらに含む。
ある実施態様において、膜貫通アダプターは、ＦｃｅＲ１γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、１種以上のインテグリン類は、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントは、(ｉ)配列番号１のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ；(ii)配列番号２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ；または(iii)配列番号３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖからなる群から選択されるｓｃＦｖを含む。
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｄ；配列番号７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲIIIａ；配列番号９のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＫｐ３０；配列番号１３のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６；配列番号１５のアミノ酸配列を含むａｃｔＫＩＲ；配列番号１７のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｃ；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ８α；または配列番号２１のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Ｒｂからなる群から選択される。
ある実施態様において、方法は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｄ；配列番号６のアミノ酸配列を含むＦｃγＲIIIａ；配列番号８のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＫｐ３０；配列番号１２のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６；配列番号１４のアミノ酸配列を含むａｃｔＫＩＲ；配列番号１６のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｃ；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤ８α；または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Ｒｂからなる群から選択されるヒンジをさらに含む。
ある実施態様において、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７／４１ＢＢ；配列番号２３のアミノ酸配列を含むＤＮＡＭ－１；配列番号２４のアミノ酸配列を含むＮＫｐ８０；配列番号２５のアミノ酸配列を含む２Ｂ４；配列番号２６のアミノ酸配列を含むＮＴＢＡ；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＲＡＣＣ；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤ２；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤ２７；インテグリン類；配列番号３０のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ２または配列番号３２のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＩＬ１５ＲＢ；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＩＬ１８Ｒ；配列番号３５のアミノ酸配列を含むＩＬ１２ＲＢ１または配列番号３６のアミノ酸配列を含むＩＬ１２ＲＢ２であるＩＬ１２Ｒ；配列番号３７のアミノ酸配列を含むＩＬ２１Ｒ；配列番号３８のアミノ酸配列を含むＩＲＥ１ａ；またはこれらの組み合わせから選択される。
ある実施態様において、ＣＡＲ構築物は、記憶様ナチュラルキラー(ＭＬ ＮＫ)細胞で発現または機能できる。
ある実施態様において、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、抗原特異的標的に対する免疫応答を誘導する。
ある実施態様において、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、腫瘍負荷を軽減する。
ある実施態様において、疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントは、疾患関連抗原に対する一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含む。
ある実施態様において、対象は、疾患関連抗原がある疾患を有する。
ある実施態様において、抗原はＢ細胞抗原であるまたは疾患は血液癌、自己免疫疾患または免疫系障害からなる群から選択される。
ある実施態様において、抗原は腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)であるまたは疾患は癌である。
ある実施態様において、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、対照と比較して、抗原標的またはエピトープに対する機能的応答が増強している。
ある実施態様において、対照は、ＣＡＲを伴わないＭＬ ＮＫ細胞、ＳｃＦｖを伴わないＭＬＮＫ細胞、ＣＡＲを伴うＮＫ細胞、ＣＡＲ ｓｃＦｖを伴うＮＫ細胞、標的と関連しないｓｃＦｖを含むＭＬ ＮＫまたは標的と関連しないｓｃＦｖを含むＮＫである。
ある実施態様において、対象は、癌、自己免疫状態または感染性疾患(例えば、細菌、ウイルス)を有する。
本発明の他の態様は、処置を必要とする対象に、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を投与することを含む、方法を提供する。ある実施態様において、方法は、対象またはドナーからＮＫ細胞を単離し；ここに記載する方法によりＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を産生し；または対象にＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の治療有効量を投与することを含む。
ある実施態様において、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の治療有効量は、約１０７細胞／kgである。
ある実施態様において、ｒｈＩＬ－２またはＩＬ－１５が対象に投与される。
本発明の他の態様は、(ｉ)配列番号１を含む抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、配列番号２を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖまたは配列番号３を含む抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ；(ii)配列番号１９を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号１１を含むＮＫｐ３０膜貫通ドメインまたは配列番号５を含むＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン；および(iii)配列番号２２を含むＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン、配列番号３３を含むＩＬ－１５Ｒ細胞内シグナル伝達ドメインまたは配列番号２５を含む２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)構築物を提供し、ここで、該ＣＡＲ構築物は、記憶様ナチュラルキラー(ＭＬ ＮＫ)細胞で発現されるかまたは機能することができる。
他の目的および性質は、一部、以下から明らかであるかまたは示される。
当業者は、下記図面が説明の目的のみであることを理解する。図面は、如何なる方法でも本発明が教示する範囲を限定することを意図しない。
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)記憶様(ＭＬ)ＮＫ細胞産生。(Ａ)標的細胞上に発現されるＣＤ１９抗原を標的とするＣＡＲ構築物。(Ｂ)レトロウイルス形質導入プロトコールの図式。(Ｃ)ＣＤ１９－ＣＡＲが形質導入されたＮＫ細胞を５日間休息させ、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより評価した。データは、８名の正常ドナーの代表である。挿入された数値は、示されるゲート内の細胞の頻度を表す。
ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、抗原特異的標的により強固(robust)な応答を示す。ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を、図１に記載するように産生した。細胞をＲａｊｉ(ＣＤ１９＋腫瘍細胞株)で６時間刺激し、フローサイトメトリーにより評価した。(Ａ)対照ＧＦＰのみまたはＧＦＰ－ＣＡＲレンチウイルスの図式。(Ｂ)対照(ＧＦＰのみ)またはＧＦＰ－ＣＡＲレンチウイルスを形質導入したＮＫ細胞の代表的フロー染色。形質導入細胞はＧＦＰ＋である。(Ｃ)代表的ＩＦＮ－γおよびＣＤ１０７ａ(ＧＦＰ－ＣＡＲ ＧＦＰ－およびＧＦＰ－ＣＡＲ ＧＦＰ＋ ＭＬ ＮＫ細胞からの脱顆粒染色)。(Ｄ)Ｃからの概要。データは、２正常ドナーから集める。
ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、抗原特異的標的により強固な応答を示す。ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を、図１に記載するように産生した。細胞をＲａｊｉ(ＣＤ１９＋腫瘍細胞株)で６時間刺激し、フローサイトメトリーにより評価した。ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞がＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ標的に強固にかつ特異的に応答することを示す、概要ＩＦＮ－γ(Ａ)および脱顆粒(ＣＤ１０７ａ、Ｂ)データ。データは、４名の正常ドナーからである。
抗腫瘍応答、サイトカイン産生、細胞毒性、増殖、持続を最適化するための記憶様ＮＫ細胞特異的遺伝子修飾の戦略。
ＭＬ ＮＫ細胞生物学を組み込む、種々の機能にＣＡＲＭＬ ＮＫを適合させる戦略。(Ａ)２つの十分に研究されたシグナル伝達ドメインを介するトリガーを用いる、図１～図３および図６～図８で利用した中間活性化ＣＡＲ。(Ｂ)複数シグナル伝達機構を介する高レベル活性化。(Ｃ)中程度の活性化およびＮＫ持続増強のために操作したＭＬ ＮＫ細胞ＣＡＲ。
Ｒａｊｉ標的に対する機能的応答が増強されたＣＤ１９－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞。精製ＮＫ細胞をＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８または対照(ＩＬ－１５)で１６時間活性化し、洗浄し、ＣＤ１９－ＣＡＲレンチウイルスで形質導入し、次いでＣＡＲＭＬ分化をさせるため、低濃度のＩＬ－１５中で静置させた。(Ａ)ＣＤ１９－ＣＡＲをコードするレンチウイルスカセットの略図。膜貫通：ＣＤ８ａ、共刺激ドメイン：４－１ＢＢおよび刺激ドメイン：Ｐ２Ａスキップサイトを介して緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)マーカーにコンジュゲートしたＣＤ３ζ。(Ｂ)記憶様(ＭＬ)ＮＫ細胞インビトロ実験の図式。(Ｃ)本構築物は、ＧＦＰ共発現および可溶性ＣＤ１９抗原への結合により決定して、ＣＤ１９－ＣＡＲの表面発現をもたらす。(Ｄ)７日目にＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ標的に対するＩＦＮγ産生および脱顆粒(ＣＤ１０７ａ発現)を示す、記憶様ＣＤ１９－ＣＡＲが形質導入されたＮＫ細胞レンチウイルスからの代表的二変数フロープロット(生存ＣＡＲ(ＧＦＰ)－またはＣＡＲ (ＧＦＰ)＋ ＮＫ細胞集団でゲーティング)。(Ｅ)対照ＭＬ ＮＫ細胞およびＣＤ１９－ＣＡＲ ＮＫ細胞両者と比較して、ＣＤ１９－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生およびＣＤ１０７ａ発現増強を示す、概要データ(ｎ＝６；３つの独立した実験)。統計的分析を両側対応ありｔ検定により実施した；＊ｐ＜.０５、＊＊ｐ＜.０１、＊＊＊ｐ＜.００１。
ＣＤ１９－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、腫瘍細胞株および原発濾胞性リンパ腫標的に対し増強された抗原(ＣＤ１９)特異的応答を示す。(Ａ)Ｒａｊｉ標的細胞に対する増強された脱顆粒およびＩＦＮ－γ産生とは対照的に、ＣＤ１９－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、ＣＤ１９陰性Ｋａｓｕｍｉ－３細胞株に対する応答の増強は示さない。(Ｂ)ＣＤ３３－ＣＤ８ａ－４１ＢＢ－ＣＤ３ｚ－ＧＦＰ ＣＡＲを形質導入し、Ｒａｊｉ標的で刺激したＭＬ ＮＫ細胞は、対照(ＧＦＰ－)と比較してエフェクター機能は増加しなかった。(Ｃ)各濾胞性リンパ腫リンパ節について、ＣＤ３３／ＣＤ１９陽性染色を示す代表的フローサイトメトリーデータ。(Ｄ～Ｆ)ＣＤ１９－ＣＡＲＭＬは、ＭＬ ＮＫ細胞対照およびＣＤ３３ ＣＡＲＭＬと比較して、原発ＣＤ１９＋濾胞性リンパ腫標的に対する(Ｄ)ＩＦＮ－γ、(Ｅ)脱顆粒および(Ｆ)致死の有意な増加を示した。(Ｇ)リンパ腫患者ＮＫ細胞から産生した自己ＣＤ１９－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、対照ＭＬ ＮＫ細胞(ＧＦＰ－)と比較して、自己の各ＣＤ１９＋濾胞性リンパ腫標的に対するＩＦＮ－γの有意な増加を示した。データは２～３の独立した実験を表し、対応ありＴ検定を使用して比較した。
試験は、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ担持マウスにおいてインビボでＣＤ１９特異的ＭＬ ＮＫ細胞が拡大し、腫瘍負荷を制御することを示す。(Ａ)(Ｂ)～(Ｅ)の実験計画。ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ(ＮＳＧ)マウスに、１×１０６ ｌｕｃ－Ｒａｊｉ細胞を負荷した。４日目、マウスに、ヒト１９－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞またはヒト３３－ＣＡＲＭＬ－ＮＫ細胞を示すとおりＩＶ注射した。ｒｈＩＬ－１５、組み換えヒトＩＬ－１５；ＱＯＤ、隔日。(Ｂ)導入１８日後の代表的フローサイトメトリーは、脾臓においてＣＤ３３－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞と比較して１９－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の拡大を示す。各産物について、ＣＡＲ発現は、注入前は約２０％であった。(Ｃ)別の実験で、マウスを、生物発光造影(ＢＬＩ)を使用する腫瘍負荷および生存(右)についてモニターした。
ＣＤ３３－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、腫瘍細胞株に対する抗原(ＣＤ３３)特異的に増強された応答を示す。(Ａ)ＣＤ３３－ＣＡＲＭＬ構築物図式。ここで、ＣＤ３３特異的ｓｃＦｖはクローン化された。(Ｂ)ＣＤ３３＋ ＭＯＬＭ－１３に対する増強された脱顆粒(ＣＤ１０７ａ)およびＩＦＮ－γ産生とは対照的に、ＣＤ３３－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、ＣＤ３３陰性Ｒａｊｉ細胞株に対して応答増強を示さない。データは２～３の独立した実験を表し、対応ありＴ検定を使用して比較した。
ＣＤ１２３－ＣＡＲは、ＭＬ ＮＫ細胞で発現され得る。ＣＤ１２３－ＣＡＲ構築物はＭＬ ＮＫ細胞で発現される。
ＣＤ１９－ＣＡＲ (ＩＬ２Ｒｂ)－ＭＬ ＮＫ細胞は、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ標的存在下で、ｐＳＴＡＴ－５シグナル伝達増強を示す。(Ａ)ＣＤ１９－ＣＡＲ(ＩＬ２Ｒｂ)－ＭＬ構築物図式。ここで、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖはクローン化されたが、ＩＬ２Ｒｂ細胞内シグナル伝達ドメインを利用する。(Ｂ)ＣＤ１９(ＩＬ２Ｒｂ)ＣＡＲ構築物はＭＬ ＮＫ細胞で発現され得る。(Ｃ)１９－ＣＡＲ(４１ＢＢ／ＣＤ３ｚ)発現ＮＫ細胞と比較して、ＣＤ１９－ＣＡＲ(ＩＬ２Ｒｂ)発現ＭＬ ＮＫ細胞(両者とも抗原特異的ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ標的で２時間トリガーされた)でｐＳＴＡＴ－５シグナル伝達増強が特異的であることを示すデータ。ＭＦＩ － 中央蛍光強度。
産生された構築物。
(Ａ)ハプロ／同種ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞または(Ｂ)自己ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞で患者を処置するための臨床的調製。アフェレーシスを実施し、ＮＫ細胞を精製し、ＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＬ－１８で約１２時間活性化させる。次いで、ＮＫ細胞を洗浄し、約２日間にわたり２回ＣＡＲレンチウイルスでスピンフェクションさせる。細胞を洗浄し、患者に約１０７細胞／kgで注入する。ハプロ／アロ設定で細胞はｒｈＩＬ－２により支持され得て、自己設定で細胞はＩＬ－１５により支持され得る。
発明の詳細な記載
本発明は、少なくとも部分的に、合成生物学またはゲノム編集を介する、ＭＬ ＮＫ細胞における使用に適するＣＡＲを取り込む記憶様(ＭＬ)ＮＫ細胞の修飾が、広範囲の標的(例えば、腫瘍、自己抗体)を認識させその機能、生存または持続を増強させ得るとの発見に基づく。本発明は、ＮＫ細胞、より具体的に、ＭＬ ＮＫ細胞に取り込まれることができる、これらのＣＡＲ構築物の設計を初めて公開するものであると考える。これらのＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞構築物は、癌(例えば、癌免疫療法)または免疫関連または自己免疫疾患の処置に使用され得る。
ここに記載されるのは、ＭＬ ＮＫ細胞で機能または発現できるキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)構築物である。ＭＬ ＮＫ細胞は、他のＮＫ細胞に存在しないシグナル伝達分子を有する。ここに記載するのは、ＣＡＲ修飾ＭＬ ＮＫ細胞を使用するＮＫ細胞活性化および標的に対する応答である。これらのＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、あらゆる抗原、例えば感染性疾患、細菌感染、ウイルス、癌、自己免疫疾患または免疫障害または機能不全と関連する抗原を標的できる。
ここに記載する、設計されたＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞構築物は、ＣＡＲ構築物がないＮＫ細胞またはＭＬ ＮＫ細胞として性能を増強させる。
記憶様ＮＫ細胞
ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、感染および癌に対して最前線で働く細胞毒性先天性リンパ系細胞である。炎症性微小環境で、複数の可溶性および接触依存的シグナルがＮＫ細胞反応性を調節する。その先天的細胞毒性および免疫刺激性活性に加えて、最近、ＮＫ細胞が異種および万能細胞サブセットを構成することが発見された。強固なリコール応答を搭載する永続性記憶様ＮＫ集団がウイルス感染、接触過敏症反応中および炎症性促進性サイトカインまたは活性化受容体経路での刺激後に報告されている。
ここに記載するのは、記憶様ＮＫ細胞の産生、機能性および臨床応用ならびに新規ＮＫ細胞ベースの免疫療法の設計である。
ここに記載するとおり、記憶様ＮＫ細胞プロセスは、統合生物学を使用して改善されている。ここに開示する例は、ＭＬ ＮＫ細胞における使用に特異的なキメラ抗体受容体(ＣＡＲ)を含む。
記憶様ＮＫ細胞は、強力な抗白血病エフェクターである。組み合わせサイトカイン受容体活性化後、記憶様分化するＮＫ細胞抗腫瘍応答を増強するプロセスは先に発見された(サイトカイン誘導記憶様ＮＫ細胞、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞)。これは前臨床、次いで、白血病免疫療法の目的で、臨床へと進んだ。ＭＬ ＮＫ細胞の主要阻害性チェックポイントであるＮＫＧ２Ａも発見された(例えば、関連米国特許出願１５／９８３,２７５参照)。方法および組成物は、関連米国特許出願１５／９８３,２７５に記載されるとおりであり得て、引用により全体として本明細書に包含させる。
本発明は、ＮＫ細胞活性化および阻害性受容体の確立された生物学を超えて、ＭＬ ＮＫ細胞を、例えば、種々の腫瘍タイプ上の多くの抗原を認識するよう応答させる新規方法を提供することにより、独自の改善を提供する。具体的には、本発明は、合成人工受容体を介して、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に応答できる、ＭＬ ＮＫ細胞の遺伝子修飾を提供する。ここに記載するのは、関連Ｂ細胞抗原を有する通常抵抗性のＢ細胞癌に対する、ＭＬ ＮＫ細胞有する、ＣＤ１９、ＣＤ３３およびＣＤ１２３認識受容体の直接的使用である。この新規プラットフォームは、ＭＬ ＮＫ細胞の多くの修飾を実施するため、抗原および腫瘍の新規な認識を提供し、阻害に打ち勝ちながら、ＭＬ ＮＫ細胞機能、生存および持続を増強する新規戦略を提供するために使用できる。これらのＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の設計は、ＭＬ ＮＫ細胞の生物学に基づいて、新たな可能性をもたらす(例えば、図４、図５、図１２参照)。
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)構築物
本発明は、ＣＡＲで修飾されたＭＬ ＮＫ細胞を提供する。本発明は、ＮＫ細胞、より具体的に、ＭＬ ＮＫ細胞に取り込まれることができるこれらのＣＡＲ構築物を初めて設計設計したと考える。
ＣＡＲの設計は、一般に各細胞型に適合させる。本発明はＭＬ ＮＫ細胞について記載しているが、他の免疫細胞型でも有用である。ここに開示されるのは、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたＭＬ ＮＫ細胞である。
ＣＡＲは、細胞外標的結合ドメイン、ヒンジ領域、ＣＡＲを細胞膜に固定する膜貫通ドメインおよび活性化シグナルを伝達する１以上の細胞内ドメインを含むモジュール形式で設計される。共刺激ドメインの数によって、ＣＡＲは、第一(ＣＤ３ｚのみ)、第二(１共刺激ドメイン＋ＣＤ３ｚ)または第三世代ＣＡＲ(１を超える共刺激ドメイン＋ＣＤ３ｚ)に分類される。ＭＬ ＮＫ細胞へのＣＡＲ分子導入は、ＭＬ ＮＫ細胞をさらなる抗原特異性を有するよう再指示し、完全ＭＬ ＮＫ細胞活性化の駆動に必要なシグナルを提供することができる。
ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞による抗原認識が、標的結合一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)のインタクト表面抗原への結合に基づくため、腫瘍細胞のターゲティングはＭＨＣ制限的、共受容体依存的または標的エピトープのプロセシングおよび有効な提示に依存的ではない。
さらに、ＣＡＲ構築物部分はリンカーと操作可能に結合され得る。リンカーは、ここに記載する部分を結合できるあらゆるヌクレオチド配列であり得る。例えば、リンカーは、この目的に適するあらゆるアミノ酸配列であり得る(例えば、９アミノ酸長のもの)。
疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメント(例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ))
疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントは、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含み得る。ここに記載するとおり、ｓｃＦｖは標的抗原または標的抗原エピトープに結合できるあらゆるｓｃＦｖであり得る。例えば、ｓｃＦｖは、感染性疾患、細菌感染、ウイルスまたは癌と関連する抗原を標的できる。ｓｃＦｖは、米国出願１５／１７９,４７２に記載され、引用により全体として本明細書に包含させるもののような、当分野で知られるあらゆる抗原に対してであり得る。
ここに記載するとおり、ターゲティング抗体フラグメントまたはｓｃＦｖは、あらゆる腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)に対してであり得る。ＴＡＡは、当分野で腫瘍と関連することが知られるあらゆる抗原であり得る。
ここに記載するとおり、ｓｃＦｖの例である、ＣＤ１９、ＣＤ３３およびＣＤ１２３ ＣＡＲは、ＭＬ ＮＫ細胞で発現された。例えば、ＣＤ１９は、癌を標的できまたは自己抗体を除去するために自己免疫疾患に対するＢ細胞を枯渇させ得る。ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ４ ＢＡＦＦ－Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＩＶ：ｇｐ１２０またはｇｐ４１を認識するｓｃＦｖなどの他のｓｃＦｖも、ＣＡＲ構築物に組み込み得る。
ＣＡＲの抗原結合能は、標的抗原ではなく、細胞外ｓｃＦｖにより規定される。ｓｃＦｖの形式は、一般にＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ何れかの配向で、可動性ペプチド配列により結合された２個の可変ドメインである。ｓｃＦｖ内の可変ドメインの配向は、ｓｃＦｖの構造により、ＣＡＲがＭＬ ＮＫ細胞表面上に発現されるかまたはＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が抗原を標的とし、シグナル伝達するかに寄与し得る。さらに、可変ドメインリンカーの長さおよび／または組成は、ｓｃＦｖの安定性または親和性に寄与し得る。
ｓｃＦｖは、種々の構築物における結合部分として使用されることが当分野で周知である(例えば、Sentman 2014 Cancer J. 20 156-159; Guedan 2019 Mol Ther Methods Clin Dev. 12 145-156参照)。当分野で知られるまたは当分野で知られる手段により抗原に対して産生されるあらゆるｓｃＦｖが、結合部分として使用され得る。
ＣＡＲ ｓｃＦｖ親和性は、エピトープを一定に保ちながら相補性決定領域の変異誘発によりまたは同じ標的であるが、同じエピトープに対してではない治療抗体に由来するｓｃＦｖを用いるＣＡＲ開発を介して修飾され、ＭＬ ＮＫ細胞シグナルの強度を変化させ得て、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が過発現抗原を正常に発現される抗原と区別することを可能とする。ＣＡＲ分子の必須要素であるｓｃＦｖは、特異性および腫瘍に対する正常組織の差次的ターゲティングに影響するよう、注意深く設計され、操作され得る。これらの差異がＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞でのみ測定可能であり得ることを仮定して(可溶性抗体とは対照的に)、標的の発現および標的上毒性の感受性についての正常組織の前臨床試験は、固定組織での免疫組織化学ではなく、生存細胞アッセイを必須とする。
ここに記載するｓｃＦｖは、ＡＭＬ、ＡＬＬまたはリンパ腫などの血液系腫瘍に使用できるが、ｓｃＦｖが標的抗原または抗原エピトープに対して産生され得るあらゆる悪性腫瘍、自己免疫性または感染性疾患における使用まで拡大され得る。例えば、ここに記載する構築物は、自己抗体に関連する自己免疫の処置または予防に使用され得る(自己免疫についてリツキシマブに類似する適応症)。他の例として、開示される構築物は、ウイルス抗原、例えばＨＩＶ感染細胞上のｇｐ１２０およびｇｐ４１を認できるｓｃＦｖを使用して、ウイルス感染細胞にも適用され得る。
ｓｃＦｖ配列および特異性：
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ(配列番号１)
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCTCTCCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTCCTCCATGCTGCCAGACCCGACATCCAGATGACACAGACAACCAGCAGCCTGTCCGCTTCCCTCGGAGACAGGGTGACAATTTCCTGCAGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTCAAGCTCCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGAGTGCCTTCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTACTCCCTGACCATTAGCAACTTAGAACAGGAGGACATTGCCACCTACTTTTGTCAGCAGGGCAACACCCTCCCCTACACCTTTGGAGGCGGAACCAAGTTAGAAATCACCGGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGAGGCAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAGGTGAAACTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTGGTCGCCCCTAGCCAATCCCTCTCCGTCACCTGCACCGTGAGCGGAGTGAGCCTGCCTGACTACGGAGTGAGCTGGATCAGACAGCCCCCTAGGAAAGGACTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCAGCGAGACCACCTATTACAACAGCGCCCTGAAGTCCAGACTGACAATCATCAAGGACAATAGCAAAAGCCAAGTGTTTCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGATGACACCGCCATCTATTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGAGGAAGCTACGCTATGGATTATTGGGGCCAAGGCACAAGCGTGACCGTCAGCAGCGCGGCCGCC
抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ(配列番号２)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGATGGAAAAGGATACACTGTTGTTGTGGGTTCTGCTCCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGAGATATTGTGCTGACGCAGTCTCCTGCATCACTCGCCGTGTCTCTGGGCCAGCGCGCTACCATCAGCTGCAGAGCCTCTGAAAGTGTTGACAATTATGGAATTTCTTTCATGAATTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCGAAACTCCTCATATATGCCGCGTCTAATCAGGGCTCTGGGGTCCCTGCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCAGTCTGAATATACATCCCATGGAAGAAGACGATACCGCCATGTACTTTTGCCAACAATCTAAGGAGGTGCCTTGGACGTTCGGCGGCGGTACGAAGCTGGAAATTAAGGGCGGCGGGGGAAGCGGCGGGGGGGGATCAGGCGGGGGTGGCTCCGGAGGCGGTGGAAGTATGGGCTGGAGTTGGATCTTCCTTTTCCTTCTTTCTGGTACCGCGGGAGTGCACTCTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCCGGCCCCGAGCTCGTCAAGCCTGGGGCCAGTGTCAAGATTTCCTGTAAGGCATCTGGATATACCTTTACAGATTACAATATGCATTGGGTGAAACAGTCACATGGAAAGTCACTCGAGTGGATCGGATACATTTACCCTTACAATGGAGGAACCGGATATAATCAGAAGTTTAAGAGCAAGGCCACACTCACGGTGGACAATTCTTCATCTACAGCCTACATGGATGTTCGGTCTCTGACTTCCGAGGATAGTGCGGTGTATTACTGCGCCAGGGGACGCCCCGCTATGGATTACTGGGGGCAGGGAACCTCTGTAACAGTTAGCTCA
抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ(配列番号３)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACTTCGTGATGACTCAGTCTCCTAGCTCCCTGACCGTGACAGCCGGCGAGAAGGTGACCATGTCCTGCAAATCTAGTCAGAGTCTGCTGAACTCAGGCAATCAGAAGAACTATCTGACATGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGCCCCCTAAACTGCTGATCTATTGGGCCAGCACCAGGGAATCCGGCGTGCCCGACAGATTCACCGGCTCCGGGTCTGGAACAGATTTTACTCTGACCATTTCAAGCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCTGTGTACTATTGTCAGAATGATTACAGCTATCCCTACACATTTGGCGGGGGAACTAAGCTGGAAATCAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGTGGACCCGAACTGGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAAATGTCTTGCAAGGCTAGTGGGTACACCTTCACAGACTACTATATGAAATGGGTGAAGCAGTCACACGGGAAGAGCCTGGAGTGGATCGGAGATATCATTCCCTCTAACGGCGCCACTTTCTACAATCAGAAGTTTAAAGGCAAGGCTACTCTGACCGTGGACCGGAGCTCCTCTACCGCCTATATGCACCTGAACAGTCTGACATCAGAAGATAGCGCTGTGTACTATTGTACACGGTCCCATCTGCTGAGAGCCTCTTGGTTTGCTTATTGGGGCCAGGGGACACTGGTGACTGTGAGCTCCGCTAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
膜貫通(ＴＭ)ドメインおよびアダプター
ここに記載する構築物は、細胞膜にまたがる疎水性α螺旋からなる膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインの主機能はＭＬ ＮＫ細胞膜にＣＡＲを固定することであるが、以前の証拠は、膜貫通ドメインがＣＡＲ細胞機能に関連し得ることも示唆する。
他のものは、以前、ＣＡＲにおいて使用するための膜貫通(ＴＭ)ドメインを検討していたが、既知ＮＫ細胞では働かなかった。本発明者らは、予期しないことに、他のＮＫ細胞ＣＡＲ構築物で働かない膜貫通ドメインが、ここに記載するとおり、ＭＬ ＮＫ細胞で働くことを発見した。
ここで、ＣＤ８ ＴＭ部分は、ＭＬ ＮＫ細胞がより成熟しており、他のＮＫ細胞と異なる特徴を有するため、ＭＬ ＮＫ細胞に適用できたことが示された。このＴＭドメインは他のＮＫ細胞で働かない(例えば、Li et al. 2018 Cell Stem Cell 23181-192参照)。
ＴＭドメインは、ＮＫ細胞またはＭＬ ＮＫ細胞での使用に適する、あらゆるＴＭドメインであり得る。例えば、ＴＭドメインは、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲIIIａ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２ＣまたはＣＤ８αと関連する配列であり得る。
ＮＫ細胞は、活性化受容体の結合により誘導される、活性化をシグナル伝達する多数の膜貫通(ＴＭ)アダプターを発現する。これは、活性化受容体からのＴＭドメインを操作し、それにより、内因性アダプターを利用する、ＮＫ細胞特異的シグナル増強を提供する。ＴＭアダプターは、シグナル伝達活性化が可能なあらゆる内因性ＴＭアダプターであり得る。例えば、ＴＭアダプターは、ＦｃｅＲ１γ(ＩＴＡＭｘ１)、ＣＤ３ζ(ＩＴＡＭｘ３)、ＤＡＰ１２(ＩＴＡＭｘ１)またはＤＡＰ１０(ＹｘｘＭ／ＹＩＮＭ)であり得る。
ＭＬ ＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４発現を増加させ、ＭＬ ＮＫ細胞におけるそれらの使用の論理的根拠を提供していることが発見された。図４に示すとおり、ＮＫ細胞は、活性化受容体の結合により誘導される、活性化をシグナル伝達する多数の膜貫通(ＴＭ)アダプターを発現する。これは、活性化受容体からのＴＭドメインを操作し、それにより、内因性アダプターを利用する、ＮＫ細胞特異的シグナル増強を提供する。
ヒンジ(スペーサー)
スペーサーとも称するヒンジは、結合単位を膜貫通ドメインと離す、ＣＡＲの細胞外構造領域である。ヒンジは、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の標的への近接を確実にし得るあらゆる部分であり得る(例えば、ＮＫＧ２ベースのヒンジ、ＴＭαベースのヒンジ、ＣＤ８ベースのヒンジ)。ＮＫＧ２Ｄなどの受容体の細胞外部分全体に基づくいくつかのＣＡＲを例外として、ここに記載するとおり、ＣＡＲ(例えばＣＡＲ Ｔ)細胞の大部分は、免疫グロブリン(Ｉｇ)様ドメインヒンジを用いて設計される。
ヒンジは、一般に効率的ＣＡＲ発現および活性のために安定性を提供する。ここに記載するＮＫＧ２ヒンジ(また膜貫通ドメインと組み合わせて)も、標的への適切な近接を確実とし得る。
ヒンジは、標的抗原への接近に柔軟性も提供する。あるＣＡＲの最適スペーサー長は、標的エピトープの位置に依存し得る。長いスペーサーは、ＣＡＲに追加の柔軟性を提供でき、膜近位エピトープまたは複雑なグリコシル化抗原への良好な接近を可能とする。短ヒンジを担持するＣＡＲは、膜遠位エピトープへの結合により有効であり得る。スペーサーの長さは、免疫学的シナプス形成のための適切な細胞間距離を提供するために重要であり得る。そのようなものとして、ヒンジは、適宜個々のエピトープについて最適化され得る。
ここで、ヒンジは、膜貫通ドメインに操作可能に結合する。
ヒンジ／膜貫通(ＴＭ)ドメイン配列
ＮＫＧ２Ｄ(ヒンジ(配列番号４)／ＴＭ(配列番号５))
TCCACAAGAATCAAGATCTTCCCTCTCTGAGCAGGAATCCTTTGTGCATTGAAGACTTTAGATTCCTCTCTGCGGTAGACGTGCACTTATAAGTATTTGATGGGGTGGATTCGTGGTCGGAGGTCTCGACACAGCTGGGAGATGAGTGAATTTCATAATTATAACTTGGATCTGAAGAAGAGTGATTTTTCAACACGATGGCAAAAGCAAAGATGTCCAGTAGTCAAAAGCAAATGTAGAGAAAATGCATCT/CCATTTTTTTTCTGCTGCTTCATCGCTGTAGCCATGGGAATCCGTTTCATTATTATGGTAACAATATGGAGT
ＦｃγＲIIIａ(ヒンジ(配列番号６)／ＴＭ(配列番号７))
CACCTGAGGTGTCACAGCTGGAAGAACACTGCTCTGCATAAGGTCACATATTTACAGAATGGCAAAGGCAGGAAGTATTTTCATCATAATTCTGACTTCTACATTCCAAAAGCCACACTCAAAGACAGCGGCTCCTACTTCTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTGTCTTCAGAGACTGTGAACATCACCATCACTCAAGGTTTGGCAGTGTCAACCATCTCATCATTCTTTCCACCTGGGTACCAA/GTCTCTTTCTGCTTGGTGATGGTACTCCTTTTTGCAGTGGACACAGGACTATATTTCTCTGTGAAGACAAACA
ＮＫｐ４４(ヒンジ(配列番号８)／ＴＭ(配列番号９))
TGTAGAATCTACCGCCCTTCTGACAACTCTGTCTCTAAGTCCGTCAGATTCTATCTGGTGGTATCTCCAGCCTCTGCCTCCACACAGACCTCCTGGACTCCCCGCGACCTGGTCTCTTCACAGACCCAGACCCAGAGCTGTGTGCCTCCCACTGCAGGAGCCAGACAAGCCCCTGAGTCTCCATCTACCATCCCTGTCCCTTCACAGCCACAGAACTCCACGCTCCGCCCTGGCCCTGCAGCCCCCATTGCC/CTGGTGCCTGTGTTCTGTGGACTCCTCGTAGCCAAGAGCCTGGTGCTGTCAGCCCTGCTCGTCTGGTGGGGG
ＮＫｐ３０(ヒンジ(配列番号１０)／ＴＭ(配列番号１１))
TCCGTCACGTGGTTCCGAGATGAGGTGGTTCCAGGGAAGGAGGTGAGGAATGGAACCCCAGAGTTCAGGGGCCGCCTGGCCCCACTTGCTTCTTCCCGTTTCCTCCATGACCACCAGGCTGAGCTGCACATCCGGGACGTGCGAGGCCATGACGCCAGCATCTACGTGTGCAGAGTGGAGGTGCTGGGCCTTGGTGTCGGGACAGGGAATGGGACTCGGCTGGTGGTGGAGAAAGAACATCCTCAGCTAGGG/GCTGGTACAGTCCTCCTCCTTCGGGCTGGATTCTATGCTGTCAGCTTTCTCTCTGTGGCCGTGGGCAGCACC
ＮＫｐ４６(ヒンジ(配列番号１２)／ＴＭ(配列番号１３))
TTCCCCCTGGGCCCTGTGACCACAGCCCACAGAGGGACATACCGATGTTTTGGCTCCTATAACAACCATGCCTGGTCTTTCCCCAGTGAGCCAGTGAAGCTCCTGGTCACAGGCGACATTGAGAACACCAGCCTTGCACCTGAAGACCCCACCTTTCCTGCAGACACTTGGGGCACCTACCTTTTAACCACAGAGACGGGACTCCAGAAAGACCATGCCCTCTGGGATCACACTGCCCAGAATCTCCTTCGG/ATGGGCCTGGCCTTTCTAGTCCTGGTGGCTCTAGTGTGGTTCCTGGTTGAAGACTGGCTCAGCAGGAAGAGG
活性化ＫＩＲ(ＫＩＲ２ＤＳ４)(ヒンジ(配列番号１４)／ＴＭ(配列番号１５))
AGGGAAGGGGAGGCCCATGAACGTAGGCTCCCTGCAGTGCGCAGCATCAACGGAACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGCCCTGCCACCCACGGAGGGACCTACAGATGCTTCGGCTCTTTCCGTGACGCTCCCTACGAGTGGTCAAACTCGAGTGATCCACTGCTTGTTTCCGTCACAGGAAACCCTTCAAATAGTTGGCCTTCACCCACTGAACCAAGCTCCAAAACCGGTAACCCCAGACACCTACAT/GTTCTGATTGGGACCTCAGTGGTCAAAATCCCTTTCACCATCCTCCTCTTCTTTCTCCTTCATCGCTGG
ＮＫＧ２Ｃ(ヒンジ(配列番号１６)／ＴＭ(配列番号１７))
ATGAATAAACAAAGAGGAACCTTCTCAGAAGTGAGTCTGGCCCAGGACCCAAAGCGGCAGCAAAGGAAACCTAAAGGCAATAAAAGCTCCATTTCAGGAACCGAACAGGAAATATTCCAAGTAGAATTAAATCTTCAAAATCCTTCCCTGAATCATCAAGGGATTGATAAAATATATGACTGCCAAGGTTTACTGCCACCTCCAGAGAAG/CTCACTGCCGAGGTCCTAGGAATCATTTGCATTGTCCTGATGGCCACTGTGTTAAAAACAATAGTTCTTATTCCTTTC
ＣＤ８ａ(ヒンジ(配列番号１８)／ＴＭ(配列番号１９))
GTCCTCACCCTGAGCGACTTCCGCCGAGAGAACGAGGGCTACTATTTCTGCTCGGCCCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT/ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
ＩＬ１５Ｒｂ(ヒンジ(配列番号２０)／ＴＭ(配列番号２１))
GCCTCCCACTACTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAGCCCTTGGGAAGGACACC/ATTCCGTGGCTCGGCCACCTCCTCGTGGGCCTCAGCGGGGCTTTTGGCTTCATCATCTTAGTGTACTTGCTGATCAACTGCAGG
細胞内シグナル伝達ドメイン(共刺激ドメイン)
本発明は、ＭＬ ＮＫ細胞で有用な細胞内シグナル伝達ドメインを提供する。例えば、ＮＫ細胞を使用した他のものは、ＮＫ細胞でＣＤ１３７(４－１ＢＢ)を使用できなかったが、驚くべきことに、これらおよび他のものは、ＭＬ ＮＫ細胞で働き得る。ＣＡＲ構築物は、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
ＮＫ細胞は、活性化シグナルを増幅するために、共活性化受容体も利用し得る。ＭＬ ＮＫ細胞で選択的に発現するシグナル伝達ドメイン／モチーフ(ＳＤ)を、利用し得る(例えば、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ１３７、ＣＤ２)。重要なことに、ＮＫ細胞はサイトカイン受容体、最も顕著なことにＩＬ－２／１５Ｒからホメオスタシス、増殖および持続のシグナルを受ける。ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、サイトカイン産生、細胞毒性および長期持続を含むある結果をもたらすために、さらに適合させ得る。
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞(例えば、ＭＬ ＮＫ細胞)で機能できるあらゆる共活性化受容体であり得る。例えば、共活性化受容体は、ＣＤ１３７／４１ＢＢ(ＴＲＡＦ、ＮＦｋＢ)、ＤＮＡＭ－１(Ｙ－モチーフ)、ＮＫｐ８０(Ｙ－モチーフ)、２Ｂ４(ＳＬＡＭＦ)：：ＩＴＳＭ、ＣＲＡＣＣ(ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７)：：ＩＴＳＭ、ＣＤ２(Ｙ－モチーフ、ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ)、ＣＤ２７(ＴＲＡＦ、ＮＦｋＢ)またはインテグリン類(例えば、複数インテグリン類)であり得る。
ある実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞(例えば、ＭＬ ＮＫ細胞)で機能できるあらゆるサイトカイン受容体であり得る。例えば、サイトカイン受容体は、ＩＬ－２／１５Ｒｂｙｃ：：Ｊａｋ１／３、ＳＴＡＴ３／５、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫなどの、持続、生存または代謝と関連するサイトカイン受容体であり得る。他の例として、サイトカイン受容体は、ＩＬ－１８Ｒ：：ＮＦｋＢなどの活性化と関連するサイトカイン受容体であり得る。他の例として、サイトカイン受容体は、ＩＬ－１２Ｒ：：ＳＴＡＴ４などのＩＦＮ－γ産生と関連するサイトカイン受容体であり得る。他の例として、サイトカイン受容体は、ＩＬ－２１Ｒ：：Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２またはＳＴＡＴ３などの細胞毒性または持続と関連するサイトカイン受容体であり得る。
他の例として、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃｅＲ１γ(ＩＴＡＭｘ１)、ＣＤ３ζ(ＩＴＡＭｘ３)、ＤＡＰ１２(ＩＴＡＭｘ１)またはＤＡＰ１０(ＹｘｘＭ／ＹＩＮＭ)などのＴＭアダプターであり得る。
他の例として、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメイン(エンドドメインとしても知られる)は、ＣＤ２８ファミリー(例えばＣＤ２８およびＩＣＯＳ)または腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)ファミリーの遺伝子(例えば４－１ＢＢ、ＯＸ４０またはＣＤ２７)からの共刺激分子に由来し得る。ＴＮＦＲファミリーメンバーは、ＴＲＡＦタンパク質の動員を介してシグナル伝達し、細胞活性化、分化および生存と関連する。
他の例として、ＣＤ２８および４－１ＢＢは、Ｔ細胞におけるＣＡＲで広く使用されている共刺激エンドドメインであるが、これらのエンドドメインがＮＫ細胞で働くことが示されたのは初めてであると考える。ＣＤ２８または４－１ＢＢ細胞内ドメインを含むＣＡＲでの臨床治験は、血液系腫瘍を有する患者でＴ細胞について類似の応答が示されているが、現在までＮＫ細胞ではまだ示されていない。
ＣＤ２８ベースのＣＡＲの高エフェクター機能および自己限定的拡大は、ＭＬ ＮＫ細胞におけるＣＡＲの迅速な腫瘍排除および短期持続を伴う疾患の一過性処置(すなわち、同種造血幹細胞移植のための橋渡し療法として)に理想的であり得る。さらに、４－１ＢＢベースのＣＡＲを、完全応答のために持続性ＮＫ細胞の維持が必要であり得る疾患の処置に使用し得る。
ＩＣＯＳの取り込みなどの他のドメインが、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞に取り込まれ得る。最近のデータは、種々のリンパ球サブセットが最適機能および持続のために別個の共刺激シグナルを必要とすることを示唆する。ＩＣＯＳ細胞内ドメインは、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の持続を増強でき、４－１ＢＢ細胞内ドメインは、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞で最適持続を提供できる。
ある実施態様において、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、ＣＡＲに２以上の細胞内ドメインを合わせることにより、単一のＭＬ ＮＫ細胞において種々の細胞内ドメインの性質を合わせることができる。例えば、このような組み合わせは、種々のシグナル伝達経路の同時の活性化をもたらす、ＣＤ２８ファミリーからの１個の細胞内ドメインおよびＴＮＦＲファミリーからの１個の細胞内ドメインを含み得る。
各共刺激ドメインは、特有の性質を有し得る。ｓｃＦｖの親和性、抗原発現の強度、腫瘍外毒性(off-tumor toxicity)の確率または処置すべき疾患の差異は、細胞内ドメインの選択に影響し得る。
細胞内シグナル伝達ドメイン配列
ＣＤ１３７／４１ＢＢ(配列番号２２)
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
ＤＮＡＭ－１(配列番号２３)
aaggagaaggagagagagaagagatctatttacagagtcctgggatacacagaaggcacccaataactatagaagtcccatctctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgatacaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccaaagactagagtttaag
ＮＫｐ８０(配列番号２４)
tttctcagggagtattgctaaaatgccaaaaaggaagttgttcaaatgccactcagtatgaggacactggagatctaaaagtgaataatggcacaagaagaaatataagtaataaggacctttgtgcttcgagatctgcagaccagacagtactatgccaatcagaatggctcaaataccaagggaagtgttattggttctctaatgagatgaaaagctggagtgacagttatgtgtattgtttggaaagaaaatctcatctactaatcatacatgaccaacttgaaatggcttttatacagaaaaacctaagacaattaaactacgtatggattgggcttaactttacctccttgaaaatgacatggacttgggtggatggttctccaatagattcaaagatattcttcataaagggaccagctaaagaaaacagctgtgctgccattaaggaaagcaaaattttctctgaaacctgcagcagtgttttcaaatggatttgtcagtattag
２Ｂ４(配列番号２５)
agaccagtcccaaggaatttttgacaatttacgaagatgtcaaggatctgaaaaccaggagaaatcacgagcaggagcagacttttcctggaggggggagcaccatctactctatgatccagtcccagtcttctgctcccacgtcacaagaacctgcatatacattatattcattaattcagccttccaggaagtctggatccaggaagaggaaccacagcccttccttcaatagcactatctatgaagtg
ＮＴＢＡ(配列番号２６)
attccctatctttgtctactcagcgaacacagggccccgcagagtccgcaaggaacctagagtatgtttcagtgtctccaacgaacaacactgtgtatgcttcagtcactcattcaaacagggaaacagaaatctggacacctagagaaaatgatactatcacaatttactccacaattaatcattccaaagagagtaaacccactttttccagggcaactgcccttgacaatgtcgtgtaa
ＣＲＡＣＣ(配列番号２７)
agtacattgaagagaagaagagagtggacatttgtcgggaaactcctaacatatgcccccattctggagagaacacagagtacgacacaatccctcacactaatagaacaatcctaaaggaagatccagcaaatacggtttactccactgtggaaataccgaaaaag
ＣＤ２(配列番号２８)
aaaaggaaaaaacagaggagtcggagaaatgatgaggagctggagacaagagcccacagagtagctactgaagaaaggggccggaagccccaccaaattccagcttcaacccctcagaatccagcaacttcccaacatcctcctccaccacctggtcatcgttcccaggcacctagtcatcgtcccccgcctcctggacaccgtgttcagcaccagcctcagaagaggcctcctgctccgtcgggcacacaagttcaccagcagaaaggcccgcccctccccagacctcgagttcagccaaaacctccccatggggcagcagaaaactcattgtccccttcctctaattaa
ＣＤ２７(配列番号２９)
atccttgtgatcttctctggaatgttccttgttttcaccctggccggggccctgttcctccatcaacgaaggaaatatagatcaaacaaaggagaaagtcctgtggagcctgcagagccttgtcgttacagctgccccagggaggaggagggcagcaccatccccatccaggaggattaccgaaaaccggagcctgcctgctccccctga
インテグリン類
Ａ. ＩＴＧＢ１(配列番号３０)
aagcttttaatgataattcatgacagaagggagtttgctaaatttgaaaaggagaaaatgaatgccaaatgggacacgggtgaaaatcctatttataagagtgccgtaacaactgtggtcaatccgaagtatgagggaaaatga
Ｂ. ＩＴＧＢ２(配列番号３１)
aaggctctgatccacctgagcgacctccgggagtacaggcgctttgagaaggagaagctcaagtcccagtggaacaatgataatccccttttcaagagcgccaccacgacggtcatgaaccccaagtttgctgagagttag
Ｃ. ＩＴＧＢ３(配列番号３２)
aaactcctcatcaccatccacgaccgaaaagaattcgctaaatttgaggaagaacgcgccagagcaaaatgggacacagccaacaacccactgtataaagaggccacgtctaccttcaccaatatcacgtaccggggcacttaa
ＩＬ１５ＲＢ(配列番号３３)
aactgcaggaacaccgggccatggctgaagaaggtcctgaagtgtaacaccccagacccctcgaagttcttttcccagctgagctcagagcatggaggagacgtccagaagtggctctcttcgcccttcccctcatcgtccttcagccctggcggcctggcacctgagatctcgccactagaagtgctggagagggacaaggtgacgcagctgctcctgcagcaggacaaggtgcctgagcccgcatccttaagcagcaaccactcgctgaccagctgcttcaccaaccagggttacttcttcttccacctcccggatgccttggagatagaggcctgccaggtgtactttacttacgacccctactcagaggaagaccctgatgagggtgtggccggggcacccacagggtcttccccccaacccctgcagcctctgtcaggggaggacgacgcctactgcaccttcccctccagggatgacctgctgctcttctcccccagtctcctcggtggccccagccccccaagcactgcccctgggggcagtggggccggtgaagagaggatgcccccttctttgcaagaaagagtccccagagactgggacccccagcccctggggcctcccaccccaggagtcccagacctggtggattttcagccaccccctgagctggtgctgcgagaggctggggaggaggtccctgacgctggccccagggagggagtcagtttcccctggtccaggcctcctgggcagggggagttcagggcccttaatgctcgcctgcccctgaacactgatgcctacttgtccctccaagaactccagggtcaggacccaactcacttggtgtag
ＩＬ１８Ｒ(配列番号３４)
tataaagttgacttggttctgttctataggcgcatagcggaaagagacgagacactaacagatggtaaaacatatgatgcctttgtgtcttacctgaaagagtgtcatcctgagaataaagaagagtatacttttgctgtggagacgttacccagggtcctggagaaacagtttgggtataagttatgcatatttgaaagagatgtggtgcctggcggagctgttgtcgaggagatccattcactgatagagaaaagccggaggctaatcatcgttctcagccagagttacctgactaacggagccaggcgtgagctcgagagtggactccacgaagcactggtagagaggaagattaagatcatcttaattgagtttactccagccagcaacatcacctttctccccccgtcgctgaaactcctgaagtcctacagagttctaaaatggagggctgacagtccctccatgaactcaaggttctggaagaatcttgtttacctgatgcccgcaaaagccgtcaagccatggagagaggagtcggaggcgcggtctgttctctcagcaccttga
ＩＬ１２Ｒ
ＩＬ１２ＲＢ１(配列番号３５)
aacagggccgcacggcacctgtgcccgccgctgcccacaccctgtgccagctccgccattgagttccctggagggaaggagacttggcagtggatcaacccagtggacttccaggaagaggcatccctgcaggaggccctggtggtagagatgtcctgggacaaaggcgagaggactgagcctctcgagaagacagagctacctgagggtgcccctgagctggccctggatacagagttgtccttggaggatggagacaggtgcaaggccaagatgtga
ＩＬ１２ＲＢ２(配列番号３６)
cattacttccagcaaaaggtgtttgttctcctagcagccctcagacctcagtggtgtagcagagaaattccagatccagcaaatagcacttgcgctaagaaatatcccattgcagaggagaagacacagctgcccttggacaggctcctgatagactggcccacgcctgaagatcctgaaccgctggtcatcagtgaagtccttcatcaagtgaccccagttttcagacatcccccctgctccaactggccacaaagggaaaaaggaatccaaggtcatcaggcctctgagaaagacatgatgcacagtgcctcaagcccaccacctccaagagctctccaagctgagagcagacaactggtggatctgtacaaggtgctggagagcaggggctccgacccaaagcccgaaaacccagcctgtccctggacggtgctcccagcaggtgaccttcccacccatgatggctacttaccctccaacatagatgacctcccctcacatgaggcacctctcgctgactctctggaagaactggagcctcagcacatctccctttctgttttcccctcaagttctcttcacccactcaccttctcctgtggtgataagctgactctggatcagttaaagatgaggtgtgactccctcatgctctga
ＩＬ２１Ｒ(配列番号３７)
agcctgaagacccatccattgtggaggctatggaagaagatatgggccgtccccagccctgagcggttcttcatgcccctgtacaagggctgcagcggagacttcaagaaatgggtgggtgcacccttcactggctccagcctggagctgggaccctggagcccagaggtgccctccaccctggaggtgtacagctgccacccaccacggagcccggccaagaggctgcagctcacggagctacaagaaccagcagagctggtggagtctgacggtgtgcccaagcccagcttctggccgacagcccagaactcggggggctcagcttacagtgaggagagggatcggccatacggcctggtgtccattgacacagtgactgtgctagatgcagaggggccatgcacctggccctgcagctgtgaggatgacggctacccagccctggacctggatgctggcctggagcccagcccaggcctagaggacccactcttggatgcagggaccacagtcctgtcctgtggctgtgtctcagctggcagccctgggctaggagggcccctgggaagcctcctggacagactaaagccaccccttgcagatggggaggactgggctgggggactgccctggggtggccggtcacctggaggggtctcagagagtgaggcgggctcacccctggccggcctggatatggacacgtttgacagtggctttgtgggctctgactgcagcagccctgtggagtgtgacttcaccagccccggggacgaaggacccccccggagctacctccgccagtgggtggtcattcctccgccactttcgagccctggaccccaggccagctaa
ＩＲＥ１ａ(配列番号３８)
cccctgagcatgcatcagcagcagcagctccagcaccagcagttccagaaggaactggagaagatccagctcctgcagcagcagcagcagcagctgcccttccacccacctggagacacggctcaggacggcgagctcctggacacgtctggcccgtactcagagagctcgggcaccagcagccccagcacgtcccccagggcctccaaccactcgctctgctccggcagctctgcctccaaggctggcagcagcccctccctggaacaagacgatggagatgaggaaaccagcgtggtgatagttgggaaaatttccttctgtcccaaggatgtcctgggccatggagctgagggcacaattgtgtaccggggcatgtttgacaaccgcgacgtggccgtgaagaggatcctccccgagtgttttagcttcgcagaccgtgaggtccagctgttgcgagaatcggatgagcacccgaacgtgatccgctacttctgcacggagaaggaccggcaattccagtacattgccatcgagctgtgtgcagccaccctgcaagagtatgtggagcagaaggactttgcgcatctcggcctggagcccatcaccttgctgcagcagaccacctcgggcctggcccacctccactccctcaacatcgttcacagagacctaaagccacacaacatcctcatatccatgcccaatgcacacggcaagatcaaggccatgatctccgactttggcctctgcaagaagctggcagtgggcagacacagtttcagccgccgatctggggtgcctggcacagaaggctggatcgctccagagatgctgagcgaagactgtaaggagaaccctacctacacggtggacatcttttctgcaggctgcgtcttttactacgtaatctctgagggcagccacccttttggcaagtccctgcagcggcaggccaacatcctcctgggtgcctgcagccttgactgcttgcacccagagaagcacgaagacgtcattgcacgtgaattgatagagaagatgattgcgatggatcctcagaaacgcccctcagcgaagcatgtgctcaaacacccgttcttctggagcctagagaagcagctccagttcttccaggacgtgagcgacagaatagaaaaggaatccctggatggcccgatcgtgaagcagttagagagaggcgggagagccgtggtgaagatggactggcgggagaacatcactgtccccctccagacagacctgcgtaaattcaggacctataaaggtggttctgtcagagatctcctccgagccatgagaaataagaagcaccactaccgggagctgcctgcagaggtgcgggagacgctggggtccctccccgacgacttcgtgtgctacttcacatctcgcttcccccacctcctcgcacacacctaccgggccatggagctgtgcagccacgagagactcttccagccctactacttccacgagcccccagagccccagcccccagtgactccagacgccctctga
細胞外シグナル伝達ドメイン
所望により、シグナル伝達を増幅するために細胞外シグナル伝達ドメインをＣＡＲ構築物に組み込み得る。細胞外シグナル伝達ドメインは、ＣＤ８ヒンジなどのヒンジ領域にクローン化され得るが、標的に基づき、選択され得る。
分子エンジニアリング
次の定義および方法は、本発明をより良好に定義し、本発明の実施に際して当業者への指針となるために提供する。特に断らない限り、用語は、関連分野の当業者による一般的使用に従うと理解される。
ここに記載されるのは、キメラ抗原受容体記憶様ナチュラルキラー(ＣＡＲＭＬ ＮＫ)細胞を産生する方法である。単離ＮＫ細胞を、ＩＬ－１２／１５／１８などのサイトカインを使用して活性化し得る。ＮＫ細胞を、サイトカイン活性化記憶様(ＭＬ)ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間、サイトカイン存在下でインキュベートし得る。例えば、サイトカイン活性化記憶様(ＭＬ)ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間は、約８～約２４時間、約１２時間または約１６時間であり得る。他の例として、サイトカイン活性化記憶様(ＭＬ)ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間は、少なくとも約１時間；約２時間；約３時間；約４時間；約５時間；約６時間；約７時間；約８時間；約９時間；約１０時間；約１１時間；約１２時間；約１３時間；約１４時間；約１５時間；約１６時間；約１７時間；約１８時間；約１９時間；約２０時間；約２１時間；約２２時間；約２３時間；約２４時間；約２５時間；約２６時間；約２７時間；約２８時間；約２９時間；約３０時間；約３１時間；約３２時間；約３３時間；約３４時間；約３５時間；約３６時間；約３７時間；約３８時間；約３９時間；約４０時間；約４１時間；約４２時間；約４３時間；約４４時間；約４５時間；約４６時間；約４７時間；または約４８時間であり得る。
次に、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス)を介して、サイトカイン活性化ＭＬ ＮＫ細胞に、ＣＡＲ形質導入ＭＬ ＮＫ細胞をもたらすよう、ＣＡＲをサイトカイン活性化ＭＬ ＮＫ細胞にウイルスにより形質導入するのに十分な時間、ＩＬ－１５の存在下、形質導入し得る。例えば、ＣＡＲ形質導入ＭＬ ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間は、約１２時間～約２４時間であり得る。他の例として、ＣＡＲをＭＬ ＮＫ細胞にウイルスにより形質導入するのに(ＣＡＲ形質導入ＭＬ ＮＫ細胞の形成)十分な時間は、少なくとも約１時間；約２時間；約３時間；約４時間；約５時間；約６時間；約７時間；約８時間；約９時間；約１０時間；約１１時間；約１２時間；約１３時間；約１４時間；約１５時間；約１６時間；約１７時間；約１８時間；約１９時間；約２０時間；約２１時間；約２２時間；約２３時間；約２４時間；約２５時間；約２６時間；約２７時間；約２８時間；約２９時間；約３０時間；約３１時間；約３２時間；約３３時間；約３４時間；約３５時間；約３６時間；約３７時間；約３８時間；約３９時間；約４０時間；約４１時間；約４２時間；約４３時間；約４４時間；約４５時間；約４６時間；約４７時間；または約４８時間であり得る。
次に、ＣＡＲ形質導入ＭＬ ＮＫ細胞を、ベクターを発現させ、ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ(ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞)を形成させるのに十分な時間、ＩＬ－１５の存在下でインキュベートし得る。例えば、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間は、約３日～約８日であり得る。例として、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間は、少なくとも約１日；約２日；約３日；約４日；約５日；約６日；約７日；約８日；約９日；約１０日；約１１日；約１２日；約１３日；または約１４日であり得る。
ここで使用する用語「異種ＤＮＡ配列」、「外来性ＤＮＡセグメント」または「異種核酸」は、各々、特定の宿主細胞に対して外来である起源由来の、または、同じ起源であれば、その元々の形から修飾された配列をいう。故に、宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞に内因性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用により、修飾されている遺伝子を含む。本用語はまた、天然に存在しない複数コピーの、天然に存在するＤＮＡ配列を含む。故に、本用語は、細胞に外来または異種かまたは細胞に同種であるが、宿主細胞核酸内の該要素が通常みられない位置にある、ＤＮＡセグメントも含む。外来性ＤＮＡセグメントを発現させて、外来性ポリペプチドを産生する。「同種」ＤＮＡ配列は、導入される宿主細胞と天然で関連するＤＮＡ配列である。
発現ベクター、発現構築物、プラスミドまたは組み換えＤＮＡ構築物は、一般に、例えば、宿主細胞で、特定の核酸の転写または翻訳を可能とする一連の特定の核酸要素を伴う、組み換え手段または直接化学合成によるものを含む、ヒト介入により、産生されている、核酸をいうと理解される。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であり得る。一般に、発現ベクターは、プロモーターに操作可能に結合した、転写される核酸を含み得る。
「プロモーター」は、一般に核酸の転写を指示する核酸制御配列として理解される。誘導型プロモーターは、一般に特定の刺激に応答して、操作可能に結合した遺伝子の転写に介在するプロモーターとして理解される。プロモーターは、ポリメラーゼタイプIIプロモーターの場合、ＴＡＴＡ要素のような、転写開始部位近位に必要な核酸配列を含み得る。プロモーターは、所望により遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を含んでよく、これらは、転写開始部位から数千塩基対遠いところに位置し得る。
ここで使用する「転写可能核酸分子」は、ＲＮＡ分子に転写され得るあらゆる核酸分子をいう。転写可能核酸分子が、翻訳され、故にタンパク質産物として発現される機能的ｍＲＮＡ分子に転写されるような方法で、構築物を細胞に導入する方法は知られる。構築物はまた、目的の特定のＲＮＡ分子の翻訳を阻止するために、アンチセンスＲＮＡ分子を発現できるよう構築され得る。本発明の実施に際し、構築物および宿主細胞の調製および使用のための慣用の組成物および方法は、当業者に周知である(例えば、Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754参照)。
「転写開始部位」または「開始部位」は、＋１位とも定義される転写配列の一部である最初のヌクレオチド周囲の位置である。この位置に対して、遺伝子の他の全配列およびその制御領域が番号付けされ得る。下流配列(すなわち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列)は正で呼ばれ、上流配列(５’方向の制御領域の大部分)は負で呼ばれる。
「操作可能に結合」または「機能的に結合」は、好ましくは一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸フラグメント上の核酸配列の結合をいう。例えば、制御ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、これら２配列が制御ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響するように位置づけられる(すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある)ならば、「操作可能に結合する」または「関連する」と言える。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で制御配列に操作可能に結合し得る。２つの核酸分子は、単一連続核酸分子の一部であってよく、隣接していてよい。例えば、プロモーターは、該プロモーターが細胞における目的の遺伝子の転写を制御するかまたは介在するならば、該目的の遺伝子に操作可能に結合している。
「構築物」は、一般に１以上の核酸分子が操作可能に結合している核酸分子を含む、ゲノム統合または自律複製が可能なあらゆる源由来の、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製核酸分子、ファージまたは直線状もしくは環状一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸分子などの、あらゆる組み換え核酸分子として理解される。
本発明の構築物は、３’転写終結核酸分子に操作可能に結合した転写可能核酸分子に操作可能に結合したプロモーターを含む。さらに、構築物は、例えば、３’非翻訳領域(３’ ＵＴＲ)からのさらなる制御核酸分子を含み得るが、これに限定されない。構築物は、翻訳開始に重要な役割を有し得て、発現構築物の遺伝子成分でもあり得るｍＲＮＡ核酸分子の５’非翻訳領域(５’ ＵＴＲ)を含み得るが、これに限定されない。これらのさらなる上流および下流制御核酸分子は、プロモーター構築物に存在する他の要素に対して天然または異種である源に由来し得る。
用語「形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、核酸フラグメントの宿主細胞ゲノムへの導入をいう。形質転換核酸フラグメントを含む宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と称され、トランスジェニック細胞を含む生物は、「トランスジェニック生物」と称される。
「形質転換」、「トランスジェニック」および「組み換え」は、異種核酸分子が導入されている、細菌、ラン藻、動物または植物などの宿主細胞または生物をいう。核酸分子は、一般に当分野で知られ、開示されるとおり、ゲノムに安定的に統合され得る(Sambrook 1989; Innis 1995; Gelfand 1995; Innis & Gelfand 1999)。ＰＣＲの既知方法は、対でのプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法を含むが、これらに限定されない。用語「非形質転換」は、形質転換プロセスを経ていない正常細胞をいう。
「野生型」は、何ら既知変異がない、天然でみられるウイルスまたは生物をいう。
上記の必要なパーセント同一性を有し、発現されるタンパク質の必要な活性を保持するバリアントヌクレオチドおよびそのコードポリペプチドの設計、産生および試験は、当分野の技術範囲内である。例えば、指向性進化法および変異体の迅速な単離は、Link et al. (2007) Nature Reviews 5(9), 680-688; Sanger et al. (1991) Gene 97(1), 119-123; Ghadessy et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8) 4552-4557を含むが、これらに限定されない参考文献に記載の方法に従い得る。故に、当業者は、当分野で日常的な方法により、例えば、ここに記載する参照配列と少なくとも９５～９９％同一性を有する、多数のヌクレオチドおよび／またはポリペプチドバリアントを産生し、所望の表現型についてこれらをスクリーニングできる。
ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性パーセント(％)は、２つの配列をアラインしたとき、参照配列と比較して、候補配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基において同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージとして理解される。パーセント同一性を決定するために、配列をアラインし、必要であるならば、最大パーセント配列同一性を達成するために、ギャップを挿入する。パーセント同一性を決定するための配列アラインメント方法は当業者に周知である。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２またはＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウェアなどの、公開された利用可能なコンピュータソフトウェアが、配列のアラインにしばしば使用される。当業者は、比較する配列の完全長にわたり最大アラインメントを達成するのに必要な何らかのアルゴリズムを含む、アラインメントの測定のための適切なパラメータを決定できる。配列がアラインされたとき、ある配列Ｂに対する、それとのまたはそれに対比したある配列Ａのパーセント配列同一性(これは代替的にある配列Ｂに対して、それとまたはそれに対比して特定パーセント配列同一性を有するまたは含むある配列Ａと表現される)は、パーセント配列同一性＝Ｘ／Ｙ１００(式中、ＸはＡおよびＢで配列アラインメントプログラムまたはアルゴリズムアラインメントにより同一マッチとしてスコア化された残基数であり、ＹはＢの総残基数である)により計算される。配列Ａの長さが配列Ｂの長さと等しくないならば、ＡのＢに対するパーセント配列同一性は、ＢのＡに対するパーセント配列同一性と等しくない。
一般に、必要な活性が保持される限り、保存的置換をどの場所でもなし得る。置き換えられたアミノ酸が元のアミノ酸に類似する性質を有する、いわゆる保存的交換、例えばＧｌｕのＡｓｐ、ＧｌｎのＡｓｎ、ＶａｌのＩｌｅ、ＬｅｕのＩｌｅおよびＳｅｒのＴｈｒでの交換が実施できる。例えば、類似する性質を有するアミノ酸は、脂肪族アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン)；ヒドロキシルまたは硫黄／セレニウム含有アミノ酸(例えば、セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン)；環状アミノ酸(例えば、プロリン)；芳香族アミノ酸(例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン)；塩基性アミノ酸(例えば、ヒスチジン、リシン、アルギニン)；または酸性およびそのアミド(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン)であり得る。欠失は、アミノ酸の直接結合への置換である。欠失位置は、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメイン間の結合を含む。挿入は、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の導入であり、以前の直接結合が１以上のアミノ酸により置換される。アミノ酸配列は、当分野で知られるコンピュータシミュレーションプログラムの助けを借りて調節でき、例えば、活性が改善されたまたは制御が変えられた、ポリペプチドが産生され得る。この人工的に産生されたポリペプチド配列に基づき、このような調節されたポリペプチドに対応する核酸分子コードを、所望の宿主細胞の特定のコドン使用頻度を使用して、インビトロで合成できる。
「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、６×ＳＳＣ緩衝液(すなわち、０.９Ｍ塩化ナトリウムおよび０.０９Ｍクエン酸ナトリウム)中、６５℃でのハイブリダイゼーションとして定義される。これらの条件を考慮して、２配列間のＤＮＡ二本鎖の融解温度(Ｔｍ)を計算することにより、ある一組の配列がハイブリダイズするかについて決定し得る。特定の二本鎖が、６×ＳＳＣの塩条件で６５℃未満の融解温度を有するならば、２配列はハイブリダイズしない。他方で、同じ塩条件で融解温度が６５℃を超えるならば、配列はハイブリダイズする。一般に、あらゆるハイブリダイズしたＤＮＡ：ＤＮＡ配列の融解温度は、下式を使用して、計算できる。Ｔｍ＝８１.５℃＋１６.６(ｌｏｇ１０[Ｎａ＋])＋０.４１(Ｇ／Ｃ含量割合)－０.６３(％ホルムアミド)－(６００／ｌ)。さらに、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＴｍは、ヌクレオチド同一性が１％減少する毎に１～１.５℃低下する(例えば、Sambrook and Russel, 2006参照)。
宿主細胞は、当分野で知られる種々の標準技術を使用して、形質転換され得る(例えば、Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754参照)。このような技術は、ウイルス感染、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム介在トランスフェクション、微粒子銃介在送達、受容体介在取り込み、細胞融合、エレクトロポレーションなどを含むが、これらに限定されない。トランスフェクト細胞を選択し、増殖させて、宿主細胞ゲノムに安定に統合された発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を提供し得る。
Figure 2022512922000002
Figure 2022512922000003
Figure 2022512922000004
宿主細胞に導入し得る核酸の例は、例えば、他の種からのＤＮＡ配列もしくは遺伝子または同じ種に端を発するまたは同じ種に存在するが、遺伝子工学の方法によりレシピエント細胞に組み込まれた遺伝子もしくは配列である。用語「外来性」はまた形質転換される細胞に通常存在しないまたは恐らく単に形質転換ＤＮＡセグメントまたは遺伝子でみられる形態、構造などで存在しない遺伝子または通常存在し、天然発現パターンと異なる方法での発現、例えば、過発現が望まれる遺伝子もいうことが意図される。故に、用語「外来性」遺伝子またはＤＮＡは、レシピエント細胞に、類似遺伝子がこのような細胞に既に存在し得るかにかかわらず、導入されたあらゆる遺伝子またはＤＮＡセグメントをいうことが意図される。外来性ＤＮＡに含まれるＤＮＡのタイプは、細胞に既に存在するＤＮＡ、同じタイプの生物の他の個体からのＤＮＡ、異なる生物からのＤＮＡまたは外的に産生されたＤＮＡ、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ配列または合成もしくは修飾バージョンの遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含み得る。
ここに記載するアプローチにより開発された宿主株は、当分野で知られる多数の手段により評価され得る(例えば、Studier (2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234; Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363; Baneyx (2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253参照)。
遺伝子を下方制御またはサイレンシングする方法は、当分野で知られる。例えば、発現されたタンパク質活性を、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質アプタマー、ヌクレオチドアプタマーおよびＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)(例えば、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、小ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)およびマイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)を使用して、下方制御または排除できる(例えば、ハンマーヘッド型リボザイムおよび小ヘアピンＲＮＡを記載するFanning and Symonds (2006) Handb Exp Pharmacol. 173, 289-303G；ターゲティングデオキシリボヌクレオチド配列を記載するHelene, C., et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; Maher (1992) Bioassays 14(12): 807-15；アプタマーを記載するLee et al. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8；ＲＮＡｉを記載するReynolds et al. (2004) Nature Biotechnology 22(3), 326-330；ＲＮＡｉを記載するPushparaj and Melendez (2006) Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6), 504-510；ＲＮＡｉを記載するDillon et al. (2005) Annual Review of Physiology 67, 147-173；ＲＮＡｉを記載するDykxhoorn and Lieberman (2005) Annual Review of Medicine 56, 401-423参照)。ＲＮＡｉ分子は、種々の供給源から市販されている(例えば、Ambion, TX; Sigma Aldrich, MO; Invitrogen)。種々のアルゴリズムを使用する、いくつかのｓｉＲＮＡ分子設計プログラムが当分野で知られる(例えば、Cenix algorithm, Ambion; BLOCK-iTTM RNAi Designer, Invitrogen; siRNA Whitehead Institute Design Tools, Bioinofrmatics & Research Computing参照)。最適ｓｉＲＮＡ配列の規定に影響する特性は、ｓｉＲＮＡ末端のＧ／Ｃ含量、ｓｉＲＮＡの特定の内部ドメインのＴｍ、ｓｉＲＮＡ長、ＣＤＳ(コード領域)内の標的配列位置および３’オーバーハングのヌクレオチド含量を含む。
製剤
ここに記載する薬剤および組成物は、例えば、引用により全体として本明細書に包含させるRemington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)に記載のとおり、１以上の薬学的に許容される担体または添加物を使用して、何らかの慣用の方法により製剤化され得る。このような製剤は、対象への適切な投与のための形態を提供するよう、適当な量の担体と共に、精製された形態であり得るここに記載する生物学的活性剤を治療有効量で含む。
用語「製剤」は、ヒトなどの対象への投与に適する形態に薬物を調製することをいう。故に、「製剤」は、希釈剤または担体を含む薬学的に許容される添加物を含み得る。
ここで使用する用語「薬学的に許容される」は、薬理学的活性の許容されない喪失または許容されない有害副作用を引き起こさない、物質または成分をいい得る。薬学的に許容される成分の例は、United States Pharmacopeia (USP 29)およびNational Formulary (NF 24), United States Pharmacopeial Convention, Inc, Rockville, Maryland, 2005 ("USP/NF")またはより新しい版にモノグラフがあり、ＦＤＡの継続してアップデートされるInactive Ingredient Searchオンラインサーチデータベースに挙げられている成分であり得る。ＵＳＰ／ＮＦなどに記載されていない他の有用な成分も使用され得る。
ここで使用する用語「薬学的に許容される添加物」は、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張または吸収遅延剤を含み得る。薬理学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である(一般にRemington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)参照)。何らかの慣用の媒体または薬剤が活性成分と不適合でない限り、治療組成物におけるその使用は意図される。補助的活性成分も、組成物に取り込ませ得る。
「安定な」製剤または組成物は、約０℃～約６０℃などの適切な温度で、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約１か月、少なくとも約３か月、少なくとも約６か月、少なくとも約１年または少なくとも約２年などの商業的に妥当な期間、保存が可能である十分な安定性を有する組成物をいい得る。
製剤は、投与方法に合わせるべきである。本発明で使用する薬剤は、非経腸、肺、経口、局所、皮内、腫瘍内、鼻腔内、吸入(例えば、エアロゾルで)、インプラント、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼、経皮、バッカルおよび直腸を含むが、これらに限定されないいくつかの経路を使用して、対象に投与するために、既知方法で製剤化され得る。個々の薬剤はまた、１以上のさらなる薬剤と組み合わせてまたは他の生物学的に活性なもしくは生物学的に不活性な薬剤と共に投与され得る。このような生物学的に活性なまたは不活性な薬剤は、薬剤と流動的にまたは機械的に連通(communication)しているか、またはイオン、共有結合、ファンデルワールス、疎水性、親水性もしくは他の物理的力により薬剤に結合していてよい。
制御放出(または徐放性)製剤を、薬剤の活性を延長し、投与頻度を低減するために製剤化し得る。制御放出製剤は、作用開始時間または薬剤血中濃度などの他の特徴に作用し、結果として副作用発生に影響するようにも使用できる。制御放出製剤は、所望の治療効果を生ずる薬剤の量を最初に放出し、徐々にかつ継続的に長期間にわたり治療効果を超えるレベルの量である薬剤の残量を放出するように設計され得る。体内で薬剤をほぼ一定のレベルに維持するために、薬物は、代謝されまたは体から排出された薬剤量を置き換える速度で剤型から放出され得る。薬剤の制御放出の種々のインデューサー、例えば、ｐＨの変化、温度の変化、酵素、水または他の生理的条件または分子により刺激され得る。
ここに記載する薬剤または組成物は、下記の他の治療モダリティと組み合わせても使用され得る。故に、ここに記載する治療に加えて、疾患、障害または状態の処置に効果的であることが知られる他の治療も対象に提供し得る。
治療方法
また提供されるのは、ＮＫ細胞ベースの治療(例えば、遺伝子修飾ＮＫ細胞を使用)の治療有効量の投与が必要である対象における、増殖性疾患、障害または状態、感染性疾患または免疫障害を処置する方法である。開示されるＮＫ細胞ベースの治療を、癌(例えば、免疫療法薬物として)、自己免疫疾患(例えば、Ｂ細胞枯渇のための処置)または感染性疾患の処置剤として使用し得る。
ここに記載するｓｃＦｖはＡＭＬ、ＡＬＬまたはリンパ腫などの血液系腫瘍に使用できるが、ｓｃＦｖが標的に対して産生され得るあらゆる悪性腫瘍、自己免疫または感染疾患における使用にまで拡大され得る。例えば、ここに記載する構築物は、自己抗体に関連する自己免疫の処置または予防に使用され得る(自己免疫についてリツキシマブに類似する適応症)。他の例として、開示される構築物は、ウイルス抗原、例えばＨＩＶ感染細胞上のｇｐ１２０およびｇｐ４１を認識できるｓｃＦｖを使用して、ウイルス感染細胞にも適用され得る。
ここに記載される方法は、一般にそれが必要である対象で実施する。ここに記載する治療方法が必要である対象は、増殖性疾患、障害または状態；免疫障害；または感染性疾患を有する、有すると診断された、疑われるまたは発症するリスクのある対象であり得る。処置の必要性の決定は、一般に問題の疾患または状態に対応する病歴および身体検査により評価され得る。ここに記載する方法で処置可能な種々の状態の診断は、当分野の技術範囲内である。対象は、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、サル、ハムスター、モルモットおよびヒトなどの哺乳動物を含む動物対象であり得る。例えば、対象はヒト対象であり得る。
一般に、ＮＫ細胞ベースの処置の安全かつ有効な量は、例えば、望まない副作用が最小でありながら、対象において所望の治療効果をもたらす量である。種々の実施態様において、ここに記載するＮＫ細胞ベースの処置の有効量は、実質的に疾患、障害または状態を阻止する、疾患、障害または状態の進行を減速させるまたは疾患、障害または状態の発症を限定することができる。
実質的には、全体までの何らかの大きな比率であり得る。故に、「実質的に遮断または阻止」または「実質的に除去」は、ほぼまたはほぼ完全な遮断、阻止または除去であり得る。
ここに記載する方法により、投与は非経腸、肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼、バッカルまたは直腸投与であり得る。好ましくは、ＮＫ細胞は静脈内点滴として投与され得る。
ここに記載する処置を使用するとき、治療有効量のＮＫ細胞ベースの処置を精製された形態で、または、存在するならば、薬学的に許容される形態で、および薬学的に許容される添加物の存在下または非存在下で用い得る。例えば、本発明の化合物は、何らかの医学的処置に適用される合理的な利益／リスク比で、疾患、障害または状態の阻止、疾患、障害または状態の進行の減速または疾患、障害または状態発症の限定に十分な量で投与され得る。
単一剤型を得るための薬学的に許容される担体と組み合わせ得るここに記載するＮＫ細胞(例えば、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞)ベースの処置の量は、処置する宿主および特定の投与方法により変わる。各剤型の個々の用量に含まれる薬物の単位含量は、必要な治療有効量が、多数の独立した用量の投与により達成されるため、それ自体必ずしも治療有効量を構成する必要はないことは当業者により認識される。
ここに記載する組成物の毒性および治療有効性は、ＬＤ５０(集団の５０％に致死の用量)およびＥＤ５０(集団の５０％に治療有効である用量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的医薬的手法により決定され得る。毒性と治療効果の間の用量比は、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表し得る治療指数であり、治療指数が大きいほど、一般に当分野において最適であると理解される。
何らかの特定の対象のための特定の治療有効用量レベルは、処置する障害および障害の重症度；用いる特定の化合物の活性；用いる特定の組成物；対象の年齢、体重、一般的健康、性別および食習慣；投与時間；投与経路；用いる組成物の排泄速度；処置期間；用いる特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医薬分野で周知の類似因子を含む、種々の因子による(例えば、Koda-Kimble et al. (2004) Applied Therapeutics: The Clinical Use of Drugs, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781748453; Winter (2003) Basic Clinical Pharmacokinetics, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781741475; Sharqel (2004) Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton & Lange, ISBN 0071375503参照)。例えば、組成物を所望の治療効果を達成するのに必要であるよりも低いレベルの用量で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させるのは十分に当分野の技術範囲内である。所望により、有効１日用量を、投与の目的で複数用量に分けてよい。結果として、単一用量組成物は、１日用量を構成する量またはその約数を含み得る。しかしながら、本発明の化合物および組成物の総１日使用は、合理的な医学的判断の範囲内で、処置医により決定されることは理解される。
同様に、ここに記載する容態、疾患、障害および状態の各々ならびにその他は、ここに記載する組成物および方法から利益が得られ得る。一般に、容態、疾患、障害または状態は、容態、疾患、障害または状態に罹患し得るまたは素因があるが、その臨床または亜臨床症状をまた経験していないまたは示していない、哺乳動物における臨床症状の出現の予防または遅延を含む。処置はまた、容態、疾患、障害または状態の阻止、例えば、疾患または少なくとも１つのその臨床もしくは亜臨床症状の発症の停止または軽減も含み得る。さらに、処置は、疾患の軽減、容態、疾患、障害または状態または少なくとも１つのその臨床もしくは亜臨床症状の退行を含み得る。処置される対象の利益は、統計学的に有意であるかまたは少なくとも対象もしくは医師が覚知できるものであり得る。
ＮＫ細胞ベースの処置の投与は、単回事象としてまたは処置の期間中に行い得る。例えば、ＮＫ細胞ベースの処置を毎日、毎週、隔週または毎月投与し得る。急性状態の処置のために、処置のタイムコースは、通常少なくとも数日である。ある状態は、処置を数日から数週に伸ばし得る。例えば、処置は、１週間、２週間または３週間に及び得る。より慢性的な状態について、処置は、数週間から数カ月または１年以上まで延長される。
ここに記載する方法による処置は、化学療法、免疫療法またはチェックポイント遮断治療などの疾患、障害または状態のための慣用の処置モダリティ前に、同時にまたは後に実施し得る。例えば、対象は、インターフェロン；チェックポイント阻害剤抗体；抗体－薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)；抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体；または抗ＣＤ７４抗体から選択される少なくとも１つの治療剤を投与され得る。他の例は、第二抗体またはその抗原結合フラグメント、薬物、毒素、酵素、細胞毒性剤、抗血管形成剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、免疫調節剤、サイトカイン、ケモカイン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、ホウ素化合物または放射性同位体から選択される治療剤を含む。
ＮＫ細胞ベースの処置は、抗生物質、抗炎症剤または他の薬剤などの他の薬剤と同時にまたは逐次的に投与され得る。例えば、ＮＫ細胞ベースの処置は、抗生物質または抗炎症性などの他の薬剤と同時に投与され得る。同時投与は、各々ＮＫ細胞ベースの処置、抗生物質、抗炎症剤または他の薬剤の１以上を含む別々の組成物の投与により行い得る。同時投与は、ＮＫ細胞ベースの処置、抗生物質、抗炎症剤または他の薬剤の２以上を含む、１組成物の投与により行い得る。ＮＫ細胞ベースの処置を、抗生物質、抗炎症剤または他の薬剤と逐次的に投与し得る。例えば、ＮＫ細胞ベースの処置を、抗生物質、抗炎症剤または他の薬剤の投与の前または後に投与し得る。
ここに記載する方法および組成物を、癌、自己抗体と関連する自己免疫状態、免疫障害または感染症(例えば、細菌、ウイルス)の予防、処置または進行遅延に使用できる。開示されるＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞構築物は、癌または感染性疾患を標的とするｓｃＦｖなどの疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントを含むように設計され得る。ここに記載するとおり、疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントは周知である。
例えば、癌は血液癌または固形腫瘍を伴う癌であり得る。例えば、癌は、急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)；副腎皮質癌腫；ＡＩＤＳ関連癌；カポジ肉腫(軟組織肉腫)；ＡＩＤＳ関連リンパ腫(リンパ腫)；原発ＣＮＳリンパ腫(リンパ腫)；肛門癌；虫垂癌；消化器カルチノイド腫瘍；星状細胞腫；非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、小児癌、中枢神経系腫瘍(脳癌)；皮膚基底細胞癌；胆管癌；膀胱癌；骨癌(ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む)；脳腫瘍；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍(消化器)；小児カルチノイド腫瘍；心臓(心臓)腫瘍；中枢神経系癌；非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、小児(脳癌)；胚芽腫、小児(脳癌)；胚細胞腫瘍、小児(脳癌)；原発ＣＮＳリンパ腫；子宮頸癌；胆管癌腫；胆管癌脊索腫；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)；慢性骨髄増殖性新生物；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫(脳癌)；皮膚Ｔ細胞；非浸潤性乳管癌(ＤＣＩＳ)；胚芽腫、中枢神経系、小児(脳癌)；子宮内膜癌(子宮癌)；上衣腫、小児(脳癌)；食道癌；感覚神経芽腫；ユーイング肉腫(骨癌)；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；眼癌；眼内黒色腫；眼内黒色腫；網膜芽細胞腫；卵管癌；骨線維性組織球腫、悪性または骨肉腫；胆嚢癌；胃(胃)癌；消化器カルチノイド腫瘍；消化器間質腫瘍(ＧＩＳＴ)(軟組織肉腫)；胚細胞腫瘍；中枢神経系胚細胞腫瘍(脳癌)；小児頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；精巣癌；妊娠性絨毛性疾患；ヘアリー細胞白血病；頭頸部癌；心臓腫瘍；肝細胞(肝臓)癌；組織球増殖症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；島細胞腫瘍；膵臓神経内分泌腫瘍；カポジ肉腫(軟組織肉腫)；腎臓(腎臓細胞)癌；ランゲルハンス細胞組織球増殖症；喉頭癌；白血病；口唇および口腔癌；肝臓癌；肺癌(非小細胞および小細胞)；リンパ腫；男性乳癌；悪性骨線維性組織球腫または骨肉腫；黒色腫；黒色腫、眼内(眼)；メルケル細胞癌腫(皮膚癌)；中皮腫、悪性；転移癌；原発不明転移扁平上皮頸部癌；ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線神経束癌；口内癌；複数内分泌新生物症候群；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉(リンパ腫)；骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物；骨髄性白血病、慢性(ＣＭＬ)；骨髄性白血病、急性(ＡＭＬ)；骨髄増殖性新生物；鼻腔および副鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；口腔癌、口唇または口腔癌；中咽頭癌；骨肉腫および悪性骨線維性組織球腫；卵巣癌膵臓癌；膵臓神経内分泌腫瘍(島細胞腫瘍)；乳頭腫；傍神経節腫；副鼻腔および鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽細胞腫；妊娠関連乳癌；原発中枢神経系(ＣＮＳ)リンパ腫；原発腹膜癌；前立腺癌；直腸癌；再発癌腎臓細胞(腎臓)癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児(軟組織肉腫)；唾液腺癌；肉腫；小児横紋筋肉腫(軟組織肉腫)；小児血管腫瘍(軟組織肉腫)；ユーイング肉腫(骨癌)；カポジ肉腫(軟組織肉腫)；骨肉腫(骨癌)；子宮肉腫；セザリー症候群(リンパ腫)；皮膚癌；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉腫；皮膚扁平上皮細胞癌；原発不明扁平上皮頸部癌、転移；胃(胃)癌；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚；リンパ腫；菌状息肉およびセザリー症候群；精巣癌；咽頭癌；鼻咽頭癌；中咽頭癌；下咽頭癌；胸腺腫および胸腺癌腫；甲状腺癌；甲状腺腫瘍；腎盂および輸尿管移行細胞癌(腎臓(腎臓細胞)癌)；輸尿管および腎盂；移行細胞癌(腎臓(腎臓細胞)癌；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；血管腫瘍(軟組織肉腫)；外陰癌；またはウィルムス腫瘍であり得る。
他の例として、自己免疫状態または免疫障害は、アカラシア；アジソン病；成人スティル病；無ガンマグロブリン血症；円形脱毛症；アミロイド症；強直性脊椎炎；抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎；抗リン脂質抗体症候群；自己免疫性血管浮腫；自己免疫性自律神経障害；自己免疫性脳脊髄炎；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患(ＡＩＥＤ)；自己免疫性心筋炎；自己免疫性卵巣炎；自己免疫性精巣炎；自己免疫性膵炎；自己免疫性網膜症；自己免疫性蕁麻疹；軸索および神経細胞型ニューロパチー(ＡＭＡＮ)；バロー病；ベーチェット病；良性粘膜類天疱瘡；類天疱瘡；キャッスルマン病(ＣＤ)；セリアック病；シャーガス病；慢性炎症性脱髄性多発神経炎(ＣＩＤＰ)；慢性再発多発性骨髄炎(ＣＲＭＯ)；チャーグ・ストラウス症候群(ＣＳＳ)または好酸球性肉芽腫(ＥＧＰＡ)；瘢痕性類天疱瘡；コーガン症候群；寒冷凝集素疾患；先天性心ブロック；コクサッキー心筋炎；クレスト症候群；クローン病；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；デビック病(視神経脊髄炎)；円板状ループス；ドレスラー症候群；子宮内膜症；好酸球性食道炎(ＥｏＥ)；好酸球性筋膜炎；結節性紅斑；本態性混合型クリオグロブリン血症；エバンス症候群；線維筋痛症；線維化肺胞炎；巨細胞性動脈炎(側頭動脈炎)；巨細胞心筋炎；糸球体腎炎；グッドパスチャー症候群；多発性血管炎を伴う肉芽腫；グレーブス病；ギランバレー症候群；橋本甲状腺炎；溶血性貧血；ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(ＨＳＰ)；妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡(ＰＧ)；化膿性汗腺炎(ＨＳ)(反対型ざ瘡)；低ガンマグロブリン血症；ＩｇＡ腎症；ＩｇＧ４関連硬化性疾患；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)；封入体筋炎(ＩＢＭ)；間質性膀胱炎(ＩＣ)；若年性関節炎；若年性糖尿病(１型糖尿病)；若年性筋炎(ＪＭ)；川崎病；ランバート－イートン症候群；白血球破壊性脈管炎；扁平苔癬；硬化性苔癬；木質結膜炎；線状ＩｇＡ病(ＬＡＤ)；ループス；ライム病慢性；メニエール病；顕微鏡的多発血管炎(ＭＰＡ)；混合性結合組織病(ＭＣＴＤ)；モーレン潰瘍；ムッハ・ハーベルマン病；多巣性運動神経障害(ＭＭＮ)またはＭＭＮＣＢ；多発性硬化症；重症筋無力症；筋炎；ナルコレプシー；新生児ループス；視神経脊髄炎；好中球減少症；眼瘢痕性類天疱瘡；視神経炎；回帰性リウマチ(ＰＲ)；ＰＡＮＤＡＳ；傍腫瘍性小脳変性症(ＰＣＤ)；発作性夜間血色素尿症(ＰＮＨ)；パリー・ロンベルグ症候群；扁平部炎(周辺部ブドウ膜炎)；パーソネイジ・ターナー症候群；天疱瘡；末梢ニューロパチー；静脈周囲脳脊髄炎；悪性貧血(ＰＡ)；ＰＯＥＭＳ症候群；結節性多発性動脈炎；多腺性症候群Ｉ型、II型、III型；リウマチ性多発筋痛症；多発性筋炎；心筋梗塞後症候群；心膜切開後症候群；原発性胆汁性肝硬変；原発硬化性胆管炎；プロゲステロン皮膚炎；乾癬；乾癬性関節炎；赤芽球癆(ＰＲＣＡ)；壊疽性膿皮症；レイノー現象；反応性関節炎；反射性交感神経性ジストロフィー；再発性多発性軟骨炎；下肢静止不能症候群(ＲＬＳ)；レトロ腹膜線維症；リウマチ熱；関節リウマチ；サルコイドーシス；シュミット症候群；強膜炎；強皮症；シェーグレン症候群；精子＆精巣自己免疫；スティッフパーソン症候群(ＳＰＳ)；亜急性細菌心内膜炎(ＳＢＥ)；スザック症候群；交感性眼炎(ＳＯ)；高安動脈炎；側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎；血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)；トロサ・ハント症候群(ＴＨＳ)；横断性脊髄炎；１型糖尿病；潰瘍性大腸炎(ＵＣ)；未分化結合組織疾患(ＵＣＴＤ)；ブドウ膜炎；脈管炎；白斑症；またはフォークト・小柳・原田病であり得る。
他の例として、自己免疫状態または免疫障害は自己炎症性疾患であり得る。自己炎症性は、家族性地中海熱(ＦＭＦ)、新生児期発症多臓器性炎症性疾患(ＮＯＭＩＤ)、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群(ＴＲＡＰＳ)、インターロイキン－１受容体拮抗分子欠損症(ＤＩＲＡ)、ベーチェット病または脂肪異栄養症および発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚疾患症候群(ＣＡＮＤＬＥ)であり得る。
他の例として、感染性疾患の処置は、ＨＩＶ感染細胞上の抗原などの抗原を認識できるｓｃＦｖを使用して、あらゆる細菌感染またはウイルス感染であり得る。感染性疾患は、急性弛緩性脊髄炎(ＡＦＭ)；アナプラズマ病；炭疽病；バベシア症；ボツリヌス症；ブルセラ症；カンピロバクター症；カルバペネム耐性感染(ＣＲＥ／ＣＲＰＡ)；軟性下疳；チクングニアウイルス感染(チクングニア)；クラミジア；シガテラ(有害有毒藻類ブルーム(ＨＡＢｓ))；クロストリジウム・ディフィシル感染；クロストリジウム・パーフリンジェンス(イプシロン毒素)；コクシジオイデス症真菌感染(バレー熱)；クロイツフェルト・ヤコブ病、伝達性海綿状脳症(ＣＪＤ)；クリプトスポリジウム症(クリプト)；サイクロスポーラ症；デング、１,２,３,４(デング熱)；ジフテリア；大腸菌感染、志賀毒素産生(ＳＴＥＣ)；東部馬脳炎(ＥＥＥ)；エボラ出血性熱(エボラ)；エーリキア症；脳炎、アルボウイルスまたは傍感染性；エンテロウイルス感染、非ポリオ(非ポリオエンテロウイルス)；エンテロウイルス感染、Ｄ６８(ＥＶ－Ｄ６８)；ジアルジア症(ジアルジア)；鼻疽；淋菌感染(淋菌感染症)；鼠径部肉芽腫；ヘモフィルス・インフルエンザ病、Ｂ型(ＨｉｂまたはＨ－ｆｌｕ)；ハンタウイルス肺症候群(ＨＰＳ)；溶血性尿毒症症候群(ＨＵＳ)；Ａ型肝炎(Ｈｅｐ Ａ)；Ｂ型肝炎(Ｈｅｐ Ｂ)；Ｃ型肝炎(Ｈｅｐ Ｃ)；Ｄ型肝炎(Ｈｅｐ Ｄ)；Ｅ型肝炎(Ｈｅｐ Ｅ)；ヘルペス；帯状疱疹、帯状疱疹ＶＺＶ(帯状疱疹)；ヒストプラスマ症感染(ヒストプラスマ症)；ヒト免疫不全ウイルス／ＡＩＤＳ(ＨＩＶ／ＡＩＤＳ)；ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)；インフルエンザ(Ｆｌｕ)；在郷軍人病(レジオネラ症)；らい病(ハンセン病)；レプトスピラ症；リステリア症(リステリア)；ライム病；鼠径リンパ肉芽腫症感染(ＬＧＶ)；マラリア；麻疹；類鼻疽；髄膜炎、ウイルス(髄膜炎、ウイルス)；髄膜炎菌感染症、細菌(髄膜炎、細菌)；中東呼吸器症候群コロナウイルス(ＭＥＲＳ－ＣｏＶ)；流行性耳下腺炎；ノロウイルス；麻痺性貝毒素(麻痺性貝毒素、シガテラ)；シラミ寄生症(シラミ、アタマおよびコロモジラミ)；骨盤内炎症性疾患(ＰＩＤ)；百日咳(百日咳)；ペスト；腺、敗血症性、肺炎性(ペスト)；肺炎球菌疾患(肺炎)；灰白髄炎(ポリオ)；ポーワッサン；オウム病(オウム熱)；ケジラミ症(ケジラミ；シラミ寄生症)；膿疱性皮疹疾患(天然痘、サル痘、牛痘)；Ｑ熱；狂犬病；リシン中毒；リケッチア症(ロッキー山紅斑熱)；風疹、先天性を含む(三日ばしか)；サルモネラ症胃腸炎(サルモネラ)；疥癬寄生(疥癬)；スコンブロイド；敗血症性ショック(敗血症)；重症急性呼吸器症候群(ＳＡＲＳ)；細菌性赤痢胃腸炎(赤痢菌)；天然痘；ブドウ球菌感染、メチシリン耐性(ＭＲＳＡ)；ブドウ球菌食中毒、エンテロトキシンＢ中毒(スタフ食中毒)；ブドウ球菌感染、バンコマイシン低感受性(ＶＩＳＡ)；ブドウ球菌感染、バンコマイシン耐性(ＶＲＳＡ)；レンサ球菌疾患、Ａ群(侵襲性)(Ｓｔｒｅｐ Ａ(侵襲性))；レンサ球菌疾患、Ｂ群(Ｓｔｒｅｐ－Ｂ)；レンサ球菌毒性ショック症候群、ＳＴＳＳ、毒素ショック(ＳＴＳＳ、ＴＳＳ)；梅毒、一次、二次、早期不顕性、晩発性潜在性、先天性；破傷風感染、強縮(開口障害)；トリコモナス症(トリコモナス感染)；旋毛虫症感染(旋毛虫症)；結核(ＴＢ)；結核(不顕性)(ＬＴＢＩ)；野兎病(ウサギ熱)；チフス熱、Ｄ群；チフス；腟疾患、細菌(酵母感染)；ベイピング関連肺傷害(電子タバコ関連肺傷害)；水痘(水疱瘡)；ビブリオ・コレラエ(コレラ)；ビブリオ症(ビブリオ)；ウイルス出血性熱(エボラ、ラッサ、マールブルグ)；西ナイルウイルス；黄色熱；エルシニア属(エルシニア)；またはジカウイルス感染(ジカ)であり得る。
投与
本発明のある態様は、対象に直接投与される、ＮＫ細胞(例えば、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞、修飾ＮＫ細胞、予め活性化されたＮＫ細胞、ＮＫＧ２Ａ遮断ＮＫ細胞、予め活性化されたおよびＮＫＧ２Ａ遮断ＮＫ細胞)を提供する。
ここに記載するとおり(例えば、実施例２)、ハプロ／同種ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞または自己ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞(例えば、図１３参照)を用いる患者の臨床的調製および処置を、ここに記載するとおりＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を使用して実施できる。
アフェレーシス(例えば、採血、血漿および細胞への分離により体から血漿を取り、細胞を再導入)を対象で実施し得る。
ＮＫ細胞を精製し、ＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＬ－１８で約１２時間活性化させ得る。ＮＫ細胞を洗浄し、ＣＡＲレンチウイルスでスピンフェクト(例えば、約２日にわたり２回)し得る。細胞を洗浄し、患者に約１０７細胞／kgで注入し得る。ハプロ／アロ設定で、細胞はｒｈＩＬ－２により支持され得て、自己設定で細胞はＩＬ－１５により支持され得る。
上記のとおり、投与は非経腸、肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼、バッカルまたは直腸投与であり得る。
ここに記載する薬剤および組成物を、当分野で周知の種々の方法により投与し得る。投与は、例えば、経口摂取、直接注射(例えば、全身性または定位的)、目的の因子を分泌するよう操作した細胞の埋め込み、薬物放出生体材料、ポリマーマトリクス、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、埋め込み可能マトリクスデバイス、ミニ浸透圧ポンプ、埋め込み可能ポンプ、注射用ゲルおよびヒドロゲル、リポソーム、ミセル(例えば、最大３０μm)、ナノスフェア(例えば、１μm未満)、マイクロスフェア(例えば、１～１００μm)、リザーバーデバイス、上記の何らかの組み合わせまたは種々の比で所望の放出プロファイルを提供するための他の適当な送達媒体を含む方法を含み得る。薬物または組成物の制御放出送達の他の方法は当業者に知られ、本発明の範囲内である。
送達系は、例えば、特定の臓器または腫瘍へのインスリンまたは化学療法の送達に使用されるのに類似する方法で薬剤または組成物を投与するために使用し得るインフュージョンポンプである。一般に、このような系を使用して、薬剤または組成物を、選択部位で、制御された期間にわたり薬剤を放出する生分解性、生体適合性重合体インプラントと組み合わせて、投与し得る。重合体材料の例は、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレンビニルアセテートおよびコポリマーおよびこれらの組み合わせを含む。さらに、制御放出系は、治療標的は近接に配置でき、故に、全身性投与量の一部しか必要としない。
薬剤をカプセル化し、種々の担体送達系で投与し得る。担体送達系の例は、マイクロスフェア、ヒドロゲル、重合体インプラント、スマートポリマー担体およびリポソームを含む(一般に、Uchegbu and Schatzlein, eds. (2006) Polymers in Drug Delivery, CRC, ISBN-10: 0849325331参照)。分子または生体分子薬剤送達のための担体ベースの系は、細胞内送達を提供する；生体分子／薬剤放出速度に適合される；作用部位に到達する生体分子の割合を増加させる；薬物の作用部位への輸送改善；他の薬剤または添加物との共局在化沈着を可能とする；インビボで薬剤安定性を改善する；クリアランス低減により作用部位での薬剤の作用時間を延長する；薬剤の非標的組織への非特異的送達を減少させる；薬剤による刺激を低減する；薬剤の高初期用量による毒性を低減する；薬剤の免疫原性を変える；投与頻度を低減する、製品の味を改善する；または製品の保存期間を改善する。
ここに記載される定義および方法は、本発明をより良好に定義し、本発明の実施に際して当業者への指針となるために提供する。特に断らない限り、用語は、関連分野の当業者による一般的使用に従うと理解される。
ある実施態様において、本発明のある実施態様を述べかつ請求るために使用される成分量、分子量などの性質、反応条件などを表す数字は、用語「約」により修飾される場合があることは理解される。ある実施態様において、用語「約」は、値が、該値の測定に用いるデバイスまたは方法の平均の標準偏差を含むことを示すために使用される。ある実施態様において、明細書および添付される特許請求の範囲に示される数的パラメータは、特定の実施態様により得ようとしている所望の性質により変わり得る近似である。ある実施態様において、数的パラメータは、記載される有効数字の数値および通常の四捨五入法の適用の観点から解釈されるべきである。本発明のある実施態様の広い範囲を示す数的範囲およびパラメータは近似であるにもかかわらず、具体例で示される数的値は、できるだけ正確に示す。本発明のある実施態様において示される数的値は、各試験測定値でみられる標準偏差に起因する一定の誤差を必ず含み入る。ここでの値の範囲の標記は、単に該範囲内に入る各個々の値を記載する省略法として使用することが意図される。ここで特に断らない限り、各個々の値は、個々にここに記載されるかのように本明細書に包含される。
ある実施態様において、単数表現および特定の実施態様(特に次の特許請求の範囲の文脈で)使用される類似表現は、特に断らない限り、単数および複数両方を網羅すると解釈され得る。ある実施態様において、ここで、特許請求の範囲を含み、使用される用語「または」は、代替のみをいうかまたは代替が相互排他的であることが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するために使用される。
用語「含む」、「有する」および「包含する」は、オープンエンドの連結動詞である。「含み」、「含んで」、「有し」、「有して」、「包含し」および「包含して」などのこれらの動詞のあらゆる形態または時制もオープンエンドである。例えば、１以上の工程を「含む」、「有する」または「包含する」何らかの方法は、これら１以上の工程のみを有することに限定されず、他の挙げていない工程もカバーし得る。同様に、１以上の特性を「含む」、「有する」または「包含する」何らかの組成物またはデバイスは、これら１以上の特性のみを有することに限定されず、他の挙げていない特性もカバーし得る。
ここに記載する全方法は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、あらゆる適当な順番で実施され得る。ある実施態様に関して提供される任意かつ全ての例または例示表現(例えば「など」)は、本発明のより良い理解を容易にすることのみを意図し、他に請求されている本発明の範囲を限定しない。明細書のあらゆる用語は、本発明の実施に必須である請求されていないあらゆる要素を示すと解釈されてはならない。
ここに開示される本発明の代替要素または実施態様のグループ分けは、限定と解釈してはならない。各グループメンバーは、個々にまたは該グループの他のメンバーとまたはここに見られる他の要素と何らかの組み合わせで記載され、請求され得る。グループ中の１以上のメンバーは、便利さまたは特許性により、グループに入れられまたはグループから削除され得る。何らかのこのような包含または削除が実施されたとき、明細書は、ここでは修飾されたグループを含み、故に、添付する特許請求の範囲で使用する全てのマーカッシュグループの記載を満たすとみなされる。
本明細書で引用する全ての刊行物、特許、特許出願および他の引用文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の引用文献が、具体的にかつ個々に引用により全ての目的で全体として本明細書に包含させると示したのと同程度に引用により全ての目的で全体として本明細書に包含させる。ここでの引用文献の引用は、これらが本発明の先行技術であることを認めたと解釈されてはならない。
本発明を詳細に記載してきたが、修飾、バリエーションおよび等価な実施態様が、添付する特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を逸脱することなく可能であることは明らかである。さらに、本発明の全ての例は、非限定的例として提供されることは認識されるべきである。
次の非限定的実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。本発明者らが発見した代表的方法に従う、実施例に記載される技術は本発明の実施に十分に機能し、故に、その実施のためのモードの例を構成すると考えられることは当業者により認識される。しかしながら、当業者は、本発明の観点から、開示される特定の実施態様に多くの変更をなし、なお、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、同様のまたは類似の結果が得られ得ることを認識する。
実施例１：記憶様キメラ抗原受容体(ＣＡＲＭＬ)ＮＫ細胞
次の実施例は、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を産生する方法およびＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の特徴づけを記載する。
標的細胞で発現されるＣＤ１９、ＣＤ２２およびＣＤ１２３抗原を標的とするＣＡＲ構築物を有するＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が産生され得ることが示された(例えば、図１、図１２参照)。
ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞は、抗原特異的標的により強固な免疫応答を示す
ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が、抗原特異的標的により強固な応答を示すことが示された(例えば、図２、図３、図６、図９参照)。ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を、図１、図６および図８に示すとおり産生した。
細胞をＲａｊｉ(ＣＤ１９＋腫瘍細胞株)で６時間刺激し、フローサイトメトリーにより評価した。データは、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞がＣＤ１９＋Ｒａｊｉ標的に強固におよび特異的に応答したことを示した(例えば、図３、図６参照)。
ＣＤ１９－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が腫瘍細胞株および原発濾胞性リンパ腫標的に対し増強された抗原(ＣＤ１９)特異的応答を示すことが示された(例えば、図７参照)。
ＣＤ３３－ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が、腫瘍細胞株に対して抗原(ＣＤ３３)特異的に増強された応答を示すことも示された(例えば、図９参照)。
ＣＤ１９－ＣＡＲ(ＩＬ２Ｒｂ)－ＭＬ ＮＫ細胞がＣＤ１９＋Ｒａｊｉ標的存在下でｐＳＴＡＴ－５シグナル伝達増強を示すことも示された(例えば、図１１参照)。
ＮＫ細胞はインビボで拡大し、腫瘍負荷を制御する
本試験は、ＣＤ１９特異的ＭＬ ＮＫ細胞が、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ担持マウスにおいて、インビボで拡大し、腫瘍負荷を制御することを示した(例えば、図８参照)。
ＣＡＲＭＬ ＮＫを種々の機能に適合させる戦略
抗腫瘍応答、サイトカイン産生、細胞毒性、増殖、持続を最適化するための記憶様ＮＫ細胞特異的遺伝子修飾の戦略を、図４、図５および図１２に記載する。ＣＡＲをＭＬ ＮＫ細胞を特異的に刺激させるための設計の論理的根拠が有効であることが示された。例えば、ＮＫＧ２Ｄ発現はＭＬ ＮＫ細胞で増加し、ＮＫＧ２Ｄ ＴＭドメインの包含は、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞におけるシグナル伝達を増強させる。
ＣＡＲＭＬ構築物
種々のシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９、ＣＤ３３およびＣＤ１２３ ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が、ここに記載するプロトコールを使用して産生された(ｓｅｅ 例えば、図１Ｂ、図６Ｂ、図８、図１２)。
最適化産物産生
ここで、初代ＮＫ細胞を末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から精製した。ＰＢＭＣは、円形の核を有するあらゆる末梢血細胞である。これらの細胞は、リンパ球(Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞)および単球からなり、一方赤血球および血小板に核はなく、顆粒球(好中球、好塩基球および好酸球)は多葉性核を有する。他の産物は幹細胞または細胞株由来であった。
サイトカイン添加の順番がＭＬ ＮＫ細胞産生に重要であることが判明した。－１日に、ＣＩＭＬ活性化サイトカイン、ＩＬ－１２／１５／１８を加えた。０日に、サイトカインを洗い流し、細胞の培養をアッセイの残り期間ＩＬ－１５中で継続した。
ここで、ＣＡＲを、レンチウイルスを使用して導入した。単にあらゆるウイルス構築物が働かないだけでなく、現在Ｔ細胞に使用される他のウイルス粒子を使用して、ＣＡＲはＭＬ ＮＫ細胞に導入できないことが発見された。
他の方法で使用したポリブレンがＮＫ細胞を殺すことも判明した。すなわち、慣用的に使用されるポリブレンは、形質導入中使用しない。
レンチウイルスベクターの構築およびＮＫ細胞の形質導入
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をするカセットを、ＭＮＤレンチウイルス骨格に組み込んで、レンチウイルスベクターを産生した。レンチウイルス上清を産生するために、２９３Ｔ細胞を、カルシウムクロライドトランスフェクション試薬を使用して、レンチウイルスベクター、ｐＭＮＤ－Ｇ、ｐＭＮＤ－ＬｇおよびｐＭＤＮ－ＲＥＶと共トランスフェクトした。レンチウイルスを含む上清を２４～４８時間後に回収し、超遠心分離を使用して濃縮した。形質導入のために、精製サイトカイン活性化(ＩＬ－１２／１５／１８)ＮＫ細胞を、５０ng／mL ＩＬ－１５添加完全培養培に播種した。ウイルス上清を細胞に加え、２０００rpmで９０分間、室温でスピンフェクトした。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２中、インキュベートした。ウイルス形質導入有効性を最大化するために、細胞を１日目および２日目にスピンフェクトした。次いで、細胞を洗浄し、すぐに使用するかまたは１ng／mL ＩＬ－１５添加完全培地で培養した。最大ベクター発現が７日目までに期待される。
図１Ａ、図１Ｂ、図６Ａおよび図６Ｂに記載するとおり、ＮＫ細胞を正常ドナーＰＢＭＣから精製し、ＩＬ－１２／１５／１８中インキュベートした。サイトカインを洗い流し、次いで細胞を高用量ＩＬ－１５中でインキュベートし、ＣＡＲレンチウイルスで２回形質導入した。細胞を休息させ(インビボまたはインビトロ)、エフェクター機能の増強について評価した。
実施例２：ＣＡＲＭＬ ＮＫの臨床的使用
本実施例は、(Ａ)ハプロ／同種ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞または(Ｂ)自己ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞での患者処置のための臨床的調製を記載する(例えば、図１３参照)。
アフェレーシスを実施し、ＮＫ細胞を精製し、ＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＬ－１８で約１２時間活性化させる。ＮＫ細胞を洗浄し、約２日にわたり２回ＣＡＲレンチウイルスとスピンフェクトする。細胞を洗浄し、患者に約１０７細胞／kgで注入する。ハプロ／アロ設定で細胞はｒｈＩＬ－２により支持され、自己設定で細胞はＩＬ－１５により支持される。

Claims (48)

  1. キメラ抗原受容体構築物(ＣＡＲ構築物)であって、
    (ｉ)疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメント；
    (ii)膜貫通ドメイン；および
    (iii)少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン
    を含み、
    記憶様ナチュラルキラー(ＭＬ ＮＫ)細胞で発現されるかまたは機能することができる、ＣＡＲ構築物。
  2. 疾患関連抗原はが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ４ ＢＡＦＦ－Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ｇｐ１２０またはｇｐ４１からなる群から選択される、請求項１のＣＡＲ構築物。
  3. 膜貫通ドメインが、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲIIIａ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８αおよびＩＬ１５Ｒｂからなる群から選択される、請求項１のＣＡＲ構築物。
  4. 少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７／４１ＢＢ、ＤＮＡＭ－１、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＮＴＢＡ、ＣＲＡＣＣ、ＣＤ２、ＣＤ２７、１以上のインテグリン類、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＲＥ１ａおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１のＣＡＲ構築物。
  5. 少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが膜貫通アダプターである、請求項１のＣＡＲ構築物。
  6. 膜貫通アダプターまたはヒンジをさらに含む、請求項１のＣＡＲ構築物。
  7. 膜貫通アダプターが、ＦｃｅＲ１γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５または６のＣＡＲ構築物。
  8. １種以上のインテグリン類が、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４のＣＡＲ構築物。
  9. 疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントが、
    (ｉ)配列番号１のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ；
    (ii)配列番号２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ；および
    (iii)配列番号３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ
    からなる群から選択されるｓｃＦｖを含む、請求項１のＣＡＲ構築物。
  10. 膜貫通ドメインが、
    配列番号５のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｄ；
    配列番号７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲIIIａ；
    配列番号９のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４；
    配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＫｐ３０；
    配列番号１３のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６；
    配列番号１５のアミノ酸配列を含むａｃｔＫＩＲ；
    配列番号１７のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｃ；
    配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ８α；および
    配列番号２１のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Ｒｂ
    からなる群から選択される、請求項３のＣＡＲ構築物。
  11. ヒンジが
    配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｄ；
    配列番号６のアミノ酸配列を含むＦｃγＲIIIａ；
    配列番号８のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４；
    配列番号１０のアミノ酸配列を含むＮＫｐ３０；
    配列番号１２のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６；
    配列番号１４のアミノ酸配列を含むａｃｔＫＩＲ；
    配列番号１６のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｃ；
    配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤ８α；および
    配列番号２０のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Ｒｂ
    からなる群から選択される、請求項６のＣＡＲ構築物。
  12. 少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、
    配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７／４１ＢＢ；
    配列番号２３のアミノ酸配列を含むＤＮＡＭ－１；
    配列番号２４のアミノ酸配列を含むＮＫｐ８０；
    配列番号２５のアミノ酸配列を含む２Ｂ４；
    配列番号２６のアミノ酸配列を含むＮＴＢＡ；
    配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＲＡＣＣ；
    配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤ２；
    配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤ２７；
    インテグリン類；
    配列番号３０のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ１；
    配列番号３１のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ２または配列番号３２のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ３；
    配列番号３３のアミノ酸配列を含むＩＬ１５ＲＢ；
    配列番号３４のアミノ酸配列を含むＩＬ１８Ｒ；
    配列番号３５のアミノ酸配列を含むＩＬ１２ＲＢ１および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＩＬ１２ＲＢ２であるＩＬ１２Ｒ；
    配列番号３７のアミノ酸配列を含むＩＬ２１Ｒ；
    配列番号３８のアミノ酸配列を含むＩＲＥ１ａ；および
    これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１のＣＡＲ構築物。
  13. 請求項１のＣＡＲ構築物を含む、記憶様ナチュラルキラー(ＭＬ ＮＫ)細胞。
  14. キメラ抗原受容体記憶様ナチュラルキラー(ＣＡＲＭＬ ＮＫ)細胞を産生する方法であって、
    ＮＫ細胞、ＩＬ－１２／１５／１８およびＩＬ－１５を含む活性化サイトカインを準備し；
    ＮＫ細胞および活性化サイトカインを、サイトカイン活性化記憶様(ＭＬ)ＮＫ細胞を形成するのに十分な時間接触させ；
    キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を、ウイルスベクターを介して、サイトカイン活性化ＭＬ ＮＫ細胞に、ＣＡＲ形質導入ＭＬ ＮＫ細胞をもたらすよう、ＣＡＲをサイトカイン活性化ＭＬ ＮＫ細胞にウイルスにより形質導入するのに十分な時間、ＩＬ－１５存在下で形質導入し；そして
    ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ(ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞)を形成するのに十分な時間、ＣＡＲ形質導入ＭＬ ＮＫ細胞をＩＬ－１５存在下でインキュベートすること
    を含む、方法。
  15. ＮＫ細胞が末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から単離された、請求項１４の方法。
  16. サイトカイン活性化ＮＫ細胞を形成させるのに十分な時間が約８～約２４時間、約１２時間または約１６時間である、請求項１４の方法。
  17. ＣＡＲをＭＬ ＮＫ細胞にウイルスにより形質導入するのに十分な時間が約１２時間～約２４時間である、請求項１４の方法。
  18. ＣＡＲ発現ＭＬ ＮＫ細胞(ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞)を形成させるのに十分な時間が少なくとも約３日間～約８日間または約７日間である、請求項１４の方法。
  19. キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を含むウイルスベクターがＣＡＲレンチウイルスである、請求項１４の方法。
  20. ウイルスベクターがｐＭＮＤ－Ｇ、ｐＭＮＤ－Ｌｇ、ｐＭＤＮ－ＲＥＶおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるレンチウイルスベクターである、請求項１４の方法。
  21. キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)の、ウイルスベクターを介するサイトカイン活性化ＭＬ ＮＫ細胞への形質導入がポリブレンの非存在下で実施される、請求項１４の方法。
  22. 請求項１～１３の何れかのＣＡＲ構築物を含む、請求項１４～２１の何れかの方法により製造されたキメラ抗原受容体記憶様ナチュラルキラー(ＣＡＲＭＬ ＮＫ)細胞。
  23. 処置を必要とする対象における疾患に対する免疫応答を誘導する方法であって、
    キメラ抗原受容体記憶様(ＣＡＲＭＬ)ＮＫ細胞を対象に投与することを含み、
    ここで、ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が
    (ｉ)疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメント；
    (ii)膜貫通ドメイン；および
    (iii)少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン
    を含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を含むものである、方法。
  24. 疾患関連抗原がＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ４ ＢＡＦＦ－Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ｇｐ１２０またはｇｐ４１からなる群から選択される、請求項２３の方法。
  25. 膜貫通ドメインがＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲIIIａ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８αおよびＩＬ１５Ｒｂからなる群から選択される、請求項２３の方法。
  26. 少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ１３７／４１ＢＢ、ＤＮＡＭ－１、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＮＴＢＡ、ＣＲＡＣＣ、ＣＤ２、ＣＤ２７、１種以上のインテグリン類、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＲＥ１ａおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３の方法。
  27. 少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが膜貫通アダプターである、請求項２３の方法。
  28. 膜貫通アダプターをさらに含む、請求項２３の方法。
  29. 膜貫通アダプターがＦｃｅＲ１γ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７または２８の何れかの方法。
  30. １種以上のインテグリン類がＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６の方法。
  31. 疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントが
    (ｉ)配列番号１のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ；
    (ii)配列番号２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ；および
    (iii)配列番号３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ
    からなる群から選択されるｓｃＦｖを含む、請求項２３の方法。
  32. 膜貫通ドメインが
    配列番号５のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｄ；
    配列番号７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲIIIａ；
    配列番号９のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４；
    配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＫｐ３０；
    配列番号１３のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６；
    配列番号１５のアミノ酸配列を含むａｃｔＫＩＲ；
    配列番号１７のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｃ；
    配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ８α；および
    配列番号２１のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Ｒｂ
    からなる群から選択される、請求項２５の方法。
  33. 配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｄ；
    配列番号６のアミノ酸配列を含むＦｃγＲIIIａ；
    配列番号８のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４４；
    配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＫｐ３０；
    配列番号１２のアミノ酸配列を含むＮＫｐ４６；
    配列番号１４のアミノ酸配列を含むａｃｔＫＩＲ；
    配列番号１６のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２Ｃ；
    配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤ８α；および
    配列番号２０のアミノ酸配列を含むＩＬ１５Ｒｂ
    からなる群から選択されるヒンジをさらに含む、請求項２３の方法。
  34. 少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが
    配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７／４１ＢＢ；
    配列番号２３のアミノ酸配列を含むＤＮＡＭ－１；
    配列番号２４のアミノ酸配列を含むＮＫｐ８０；
    配列番号２５のアミノ酸配列を含む２Ｂ４；
    配列番号２６のアミノ酸配列を含むＮＴＢＡ；
    配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＲＡＣＣ；
    配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤ２)；
    配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤ２７)；
    インテグリン類、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ２および配列番号３２のアミノ酸配列を含むＩＴＧＢ３；
    配列番号３３のアミノ酸配列を含むＩＬ１５ＲＢ；
    配列番号３４のアミノ酸配列を含むＩＬ１８Ｒ；
    配列番号３５のアミノ酸配列を含むＩＬ１２ＲＢ１および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＩＬ１２ＲＢ２であるＩＬ１２Ｒ；
    配列番号３７のアミノ酸配列を含むＩＬ２１Ｒ；
    配列番号３８のアミノ酸配列を含むＩＲＥ１ａ；およびこれらの組み合わせ
    からなる群から選択される、請求項２３の方法。
  35. ＣＡＲ構築物が記憶様ナチュラルキラー(ＭＬ ＮＫ)細胞で発現または機能できる、請求項２３の方法。
  36. ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が抗原特異的標的に対する免疫応答を誘導する、請求項２３の方法。
  37. ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が腫瘍負荷を軽減する、請求項２３の方法。
  38. 疾患関連抗原に対するターゲティング抗体フラグメントが疾患関連抗原に対する一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含む、請求項２３の方法。
  39. 対象が疾患関連抗原がある疾患を有する、請求項２３の方法。
  40. 抗原がＢ細胞抗原であり、疾患が血液癌、自己免疫疾患および免疫系障害からなる群から選択される、請求項２３の方法。
  41. 抗原が腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)であり、疾患が癌である、請求項２３の方法。
  42. ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞が、対照と比較して、抗原標的またはエピトープに対する機能的応答が増強している、請求項２３の方法。
  43. 対照がＣＡＲを伴わないＭＬ ＮＫ細胞、ＳｃＦｖを伴わないＭＬＮＫ細胞、ＣＡＲを伴うＮＫ細胞、ＣＡＲ ｓｃＦｖを伴うＮＫ細胞、標的と関連しないｓｃＦｖを含むＭＬ ＮＫまたは標的と関連しないｓｃＦｖを含むＮＫである、請求項４２の方法。
  44. 対象が癌、自己免疫状態または感染性疾患(例えば、細菌、ウイルス)を有する、請求項２３の方法。
  45. 処置を必要とする対象にＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を投与することを含む、方法であって、
    対象またはドナーからＮＫ細胞を単離し；
    請求項１４のＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞を産生し；そして
    対象にＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の治療有効量を投与する
    ことを含む、方法。
  46. ＣＡＲＭＬ ＮＫ細胞の治療有効量が約１０７細胞／kgである、請求項４５の方法。
  47. ｒｈＩＬ－２またはＩＬ－１５が対象に投与される、請求項４５の方法。
  48. キメラ抗原受容体構築物(ＣＡＲ構築物)であって、
    (ｉ)配列番号１を含む抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、配列番号２を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖまたは配列番号３を含む抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ；
    (ii)配列番号１９を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号１１を含むＮＫｐ３０膜貫通ドメインまたは配列番号５を含むＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメイン；および
    (iii)配列番号２２を含むＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン、配列番号３３を含むＩＬ－１５Ｒ細胞内シグナル伝達ドメインまたは配列番号２５を含む２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメイン
    を含み、
    記憶様ナチュラルキラー(ＭＬ ＮＫ)細胞で発現されるかまたは機能することができる、ＣＡＲ構築物。
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