JP2024510898A - Ｒｏｒ１を標的とするキメラ抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、ＲＯＲ１結合タンパク質、及び切断型ＥＧＦ受容体を含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。また、ＲＯＲ１結合タンパク質を含むＣＡＲを発現し、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）が提供される。ＣＡＲ Ｔ細胞におけるｃ－Ｊｕｎの過剰発現は、改善された特性、例えば、疲弊の低減または防止をもたらす。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０２１年２月２５日に出願された米国仮出願第６３／１５３，８７８号、２０２１年１０月２８日に出願された同第６３／２６３，２２９号、及び２０２２年２月１１日に出願された同第６３／３０９，３９３号の優先権の利益を主張し、その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表に対する言及
本出願にて提出された、電子的に提出された配列表（名称：４３８５＿０４２ＰＣ０４＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：８０，７１６バイト、作成日：２０２２年２月２３日）の内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を使用する養子免疫療法は、有望ながん処置であり、その理由は、これらの細胞が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）非依存的様式で抗原発現腫瘍細胞を直接的に認識し、殺傷し得るからである。しかしながら、Ｔ細胞の疲弊は、ＣＡＲ Ｔ細胞治療の有効性を制限する主要な要因である。
したがって、最大の有効性を可能とするために、耐疲弊性ＣＡＲ Ｔ細胞を提供する方法論が必要とされている。
いくつかの態様では、本開示は、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド（ｃ－ｊｕｎ）、ＲＯＲ１結合タンパク質、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、キメラポリペプチドが細胞内で発現された場合に、細胞の疲弊を防止または低減することが可能である。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は、ＲＯＲ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＲ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの態様では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号４５を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号４６を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号４７を含む。いくつかの態様では、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号４９を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号５０を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号５１を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合部分のＶＨは、配列番号４４を含み、ＲＯＲ１結合部分のＶＬは、配列番号４８を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合部分は、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲはさらに、膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む。いくつかの態様では、ＴＭドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ１５２、またはそれらの任意の組み合わせに由来する。いくつかの態様では、ＴＭドメインは、ＣＤ２８に由来する。いくつかの態様では、ＴＭドメインは、配列番号５４に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドはさらに、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分とＴＭドメインとの間にスペーサーを含む。いくつかの態様では、スペーサーは、免疫グロブリンヒンジ領域またはＣＤ８に由来する。いくつかの態様では、スペーサーは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、スペーサーはさらに、リンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、ＧＧＧＳＧ（配列番号１６）を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲはさらに、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメイン、ＣＤ３δ活性化ドメイン、ＣＤ３ε活性化ドメイン、ＣＤ３η活性化ドメイン、ＣＤ７９Ａ活性化ドメイン、ＤＡＰ１２活性化ドメイン、ＦＣＥＲ１Ｇ活性化ドメイン、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８活性化ドメイン、ＺＡＰ７０活性化ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。いくつかの態様では、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号５５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、細胞内共刺激シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様では、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、Ｂ７－Ｈ３、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣＡ）、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ－１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせの共刺激ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの態様では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号５３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質、（ｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むスペーサー、（ｉｉｉ）ＣＤ２８膜貫通タンパク質、（ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激領域、及び（ｖ）ＣＤ３ζ活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの態様では、本明細書に提供するのは、（ｉ）Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＲ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＲＯＲ１結合タンパク質、（ｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むスペーサー、及び（ｉｉｉ）切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするヌクレオチド配列を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合部分のＶＨは、配列番号４４を含み、ＲＯＲ１結合部分のＶＬは、配列番号４８を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドはさらに、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－ｊｕｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、同じベクター上にある。いくつかの態様では、ｃ－ｊｕｎポリペプチドとＣＡＲは、リンカーによって連結される。いくつかの態様では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ｃ－ｊｕｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、異なるベクター上にある。
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはさらに、切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするヌクレオチド配列とＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、同じベクター上にある。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔとＣＡＲは、リンカーによって連結される。いくつかの態様では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲはさらに、シグナルペプチドを含む。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、ｈＩｇＫに由来する。いくつかの態様では、ｈＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドはさらに、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、及び／またはユビキチンプロモーターを含む。いくつかの態様では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号６４に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号５８に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号５７に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされるポリペプチドを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分、（ｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むスペーサー、（ｉｉｉ）ＣＤ２８膜貫通タンパク質、（ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激領域、及び（ｖ）ＣＤ３ζ活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分は、Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＲ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの態様では、ＶＨ ＣＤＲ１は、配列番号４５を含み、ＶＨ ＣＤＲ２は、配列番号４６を含み、ＶＨ ＣＤＲ３は、配列番号４７を含む。いくつかの態様では、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号４９を含み、ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号５０を含み、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号５１を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分のＶＨは、配列番号４４を含み、ＲＯＲ１結合部分のＶＬは、配列番号４８を含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分は、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、ポリペプチドはさらに、膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む。いくつかの態様では、ＣＤ２８のＴＭドメインは、配列番号５４に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号５５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号５３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド（ｃ－ｊｕｎ）、ＣＡＲポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含むキメラポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、ＣＡＲポリペプチドは、本明細書に開示されるいずれかである。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、キメラポリペプチドが細胞内で発現された場合に、細胞の疲弊を防止または低減することが可能である。いくつかの態様では、ｃ－ｊｕｎポリペプチドとＣＡＲポリペプチドは、同じベクター上にある。いくつかの態様では、ｃ－ｊｕｎポリペプチドとＣＡＲポリペプチドは、リンカーによって連結される。いくつかの態様では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ｃ－ｊｕｎポリペプチドとＣＡＲポリペプチドは、異なるベクター上にある。いくつかの態様では、切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）とＣＡＲは、同じベクター上にある。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔとＣＡＲは、リンカーによって連結される。いくつかの態様では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、キメラポリペプチドは、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、配列番号５２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、ＣＡＲポリペプチドはさらに、シグナルペプチドを含む。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、ｈＩｇＫに由来する。いくつかの態様では、ｈＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、キメラポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む修飾された細胞を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ｃ－ｊｕｎポリペプチド、キメラ抗原受容体ポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む修飾された細胞を提供する。いくつかの態様では、修飾された細胞は、本明細書に開示されるポリペプチドを含む。いくつかの態様では、修飾された細胞は、ＣＡＲポリペプチドを含み、ＥＧＦＲｔは、細胞表面で発現される。いくつかの態様では、細胞は、免疫細胞である。いくつかの態様では、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、及びそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで操作される。いくつかの態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養される。
上記の修飾された細胞のいずれにおいても、いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現は、本開示のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、及び／またはキメラポリペプチドのいずれかを含むように修飾されていない対応する細胞と比較して増加する。いくつかの態様では、対応する細胞と比較して、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。
同様に本明細書に提供するのは、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞の集団であり、ここで、集団は、抗原刺激後に、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含まない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞を含む。
いくつかの態様では、抗原刺激後の集団に存在するＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞の数は、参照集団と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％減少する。いくつかの態様では、免疫細胞の集団は、抗原刺激後に、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、または約５％未満のＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞を含む。
いくつかの態様では、本開示はさらに、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞の集団を提供し、ここで、集団は、抗原刺激後に、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含まない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞を含む。
いくつかの態様では、抗原刺激後の集団に存在するＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞の数は、参照集団と比較して、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％減少する。いくつかの態様では、免疫細胞の集団は、抗原刺激後に、約５％未満、約４．５％未満、約４％未満、約３．５％未満、または約２％未満のＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞を含む。
同様に本明細書に提供するのは、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞の集団であり、集団は、抗原刺激後に、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含まない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＧＺＭＡ陽性免疫細胞を含む。
いくつかの態様では、抗原刺激後の集団に存在するＧＺＭＡ陽性免疫細胞の数は、参照集団と比較して、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約２０％減少する。いくつかの態様では、免疫細胞の集団は、抗原刺激後に、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、または約１０％未満のＧＺＭＡ陽性免疫細胞を含む。
上記の免疫細胞の集団のいずれにおいても、いくつかの態様では、ＣＡＲポリペプチドは、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれかを含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
上記に提供する免疫細胞の集団のいずれにおいても、いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはその両方）である。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、キメラポリペプチドまたは修飾された細胞及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはベクターを細胞にトランスフェクションすることを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を調製する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはキメラポリペプチドを細胞内で発現させることを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を調製する方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養される。
いくつかの態様では、本開示は、適切な条件下で、本明細書に開示されるポリヌクレオチドもしくはベクターを含む、またはポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを発現する細胞を培養することを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を増殖させる方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、腫瘍の処置を必要とする対象におけるその処置方法を提供し、これは、対象に対して、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞を投与することを含み、ここで、ＣＡＲは、腫瘍で発現される抗原に対して特異的である。いくつかの態様では、免疫細胞は、本明細書に開示される修飾された細胞のいずれかを含む。
いくつかの態様では、腫瘍は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）癌、胃腸癌、卵巣癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する。いくつかの態様では、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの態様では、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの治療、サイトカイン、外科手術、放射線治療、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
上記に提供する処置方法（例えば、腫瘍の処置方法）のいずれにおいても、いくつかの態様では、投与後、腫瘍のサイズ（腫瘍サイズ）は、参照腫瘍サイズと比較して減少する。いくつかの態様では、参照腫瘍サイズは、（ｉ）投与前の腫瘍サイズ、（ｉｉ）投与を受けなかった（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象における腫瘍サイズ、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。いくつかの態様では、参照腫瘍サイズと比較して、腫瘍サイズは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少する。
上記に提供する処置方法（例えば、腫瘍の処置方法）のいずれにおいても、いくつかの態様では、投与後、対象の生存期間は、参照生存期間と比較して延長される。いくつかの態様では、参照生存期間は、投与を受けなかった（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象の生存期間を含む。いくつかの態様では、参照生存期間と比較して、生存期間は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、少なくとも約３か月、少なくとも約４か月、少なくとも約５か月、少なくとも約６か月、少なくとも約７か月、少なくとも約８か月、少なくとも約９か月、少なくとも約１０か月、少なくとも約１１か月、または少なくとも約１年延長される。
上記に提供する処置方法（例えば、腫瘍の処置方法）のいずれにおいても、いくつかの態様では、投与後、免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞と比較して、対象内でより長く存続することが可能である。
いくつかの態様では、投与後、免疫細胞は、対応する免疫細胞よりも対象内で少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、少なくとも約３か月、少なくとも約４か月、少なくとも約５か月、または少なくとも約６か月長く存続することが可能である。いくつかの態様では、対応する免疫細胞の投与を受けた参照対象に存在する対応する免疫細胞と比較して、投与後約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約７か月、または約８か月で、対象には、約１倍～約１０倍多くの投与された免疫細胞が存在する。
本開示はさらに、腫瘍細胞の殺傷方法を提供し、これは、腫瘍細胞を、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞と接触させることを含み、ここで、ＣＡＲは、腫瘍細胞で発現される抗原に対して特異的である。いくつかの態様では、免疫細胞は、本明細書で提供される修飾された細胞のいずれかを含む。
いくつかの態様では、腫瘍細胞の殺傷は、腫瘍細胞をｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞と接触させる参照方法と比較して増加する。いくつかの態様では、参照方法、腫瘍細胞の殺傷は、少なくとも約０．５倍、１倍、少なくとも約２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加する。
同様に本明細書に提供するのは、抗原刺激に応答した免疫細胞によるサイトカインの産生を増加させる方法であり、これは、免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含み、ここで、ＲＯＲ－１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。
いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、またはその両方を含む。いくつかの態様では、修飾後、抗原刺激に応答したサイトカインの産生は、対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍増加する。いくつかの態様では、サイトカインの産生の増加は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘアッセイを使用して測定される。
いくつかの態様では、本開示はさらに、抗原刺激に応答した免疫細胞の増殖を増加させる方法を提供し、これは、免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含み、ここで、ＲＯＲ－１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。
いくつかの態様では、修飾後、抗原刺激に応答した免疫細胞の増殖は、対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍増加する。いくつかの態様では、増殖の増加により、免疫細胞の数が増加する。
本明細書に提供するのは、持続抗原刺激に応答した免疫細胞のエフェクター機能を増加させる方法であり、これは、免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含み、ここで、ＲＯＲ－１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。
いくつかの態様では、免疫細胞は、対応する免疫細胞と比較して、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回のさらなる抗原刺激アッセイに対してエフェクター機能を保持する。いくつかの態様では、エフェクター機能は、（ｉ）腫瘍細胞を殺傷する能力、（ｉｉ）さらなる抗原刺激後にサイトカインを産生する能力、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方の能力を含む。いくつかの態様では、免疫細胞のエフェクター機能は、対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍増加する。
本明細書に提供するのは、持続抗原刺激に応答した免疫細胞の疲弊を低減または防止する方法であり、これは、免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含み、ここで、ＲＯＲ－１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様では、修飾後、持続抗原刺激に応答して、免疫細胞は、対応する免疫細胞と比較して、（ｉ）疲弊に関連する遺伝子のレベルの低下、（ｉｉ）活性化に関連する遺伝子のレベルの増加、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を発現する。
いくつかの態様では、上記の方法に有用な免疫細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含むように修飾される。
Ａ及びＢは、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）が、ＲＯＲ１発現ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を選択的に溶解することを示す。Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞、対照Ｒ１２（例えば、ｃ－Ｊｕｎを発現しない）ＣＡＲ Ｔ細胞、またはｃ－Ｊｕｎ－Ｒ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ、核に限定されたｍＫａｔｅ２）を発現する、ＲＯＲ１を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍細胞（「Ｈ１９７５」）（Ａ）またはＲＯＲ１発現を欠くＮＳＣＬＣ腫瘍細胞（「Ｈ１９７５－ＲＯＲ１ＫＯ」）（Ｂ）のいずれかと共に、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：１で１２０時間インキュベートした。ＮＬＲ陽性細胞の総数を経時的にカウントし（ｘ軸）、時点０時間でのカウントに対して正規化し、正規化された標的の殺傷（ｙ軸）を算出した。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＲＯＲ１依存性サイトカイン分泌が高まるが、持続性シグナル伝達は増加しないことを示す。Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）、またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＲＯＲ１を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍細胞と共に、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：１で２４時間インキュベートし、その時点で共培養ウェルからサイトカイン定量用の上清を回収した。ＩＬ－２の濃度は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘを使用して測定した。図に示す結果は、異なる３ドナー（すなわち、ドナー１、ドナー２、及びドナー３）からのものである。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＲＯＲ１依存性サイトカイン分泌が高まるが、持続性シグナル伝達は増加しないことを示す。Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）、またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＲＯＲ１発現を欠くＮＳＣＬＣ腫瘍細胞と共に、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：１で２４時間インキュベートし、その時点で共培養ウェルからサイトカイン定量用の上清を回収した。ＩＬ－２の濃度は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘを使用して測定した。図に示す結果は、異なる３ドナー（すなわち、ドナー１、ドナー２、及びドナー３）からのものである。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＲＯＲ１依存性サイトカイン分泌が高まるが、持続性シグナル伝達は増加しないことを示す。Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）、またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＲＯＲ１を発現するＮＳＣＬＣ腫瘍細胞と共に、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：１で２４時間インキュベートし、その時点で共培養ウェルからサイトカイン定量用の上清を回収した。ＩＦＮ－γの濃度は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘを使用して測定した。図に示す結果は、異なる３ドナー（すなわち、ドナー１、ドナー２、及びドナー３）からのものである。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＲＯＲ１依存性サイトカイン分泌が高まるが、持続性シグナル伝達は増加しないことを示す。Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）、またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＲＯＲ１発現を欠くＮＳＣＬＣ腫瘍細胞と共に、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：１で２４時間インキュベートし、その時点で共培養ウェルからサイトカイン定量用の上清を回収した。ＩＦＮ－γの濃度は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘを使用して測定した。図に示す結果は、異なる３ドナー（すなわち、ドナー１、ドナー２、及びドナー３）からのものである。 Ａ、Ｂ、及びＣは、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン依存性増殖能力が高まることを示す。Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）、またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、別々に、Ｇｒｅｘ２４ウェルプレートにて、基礎Ｔ細胞培地（Ａ）、Ｔ細胞培地＋２００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｂ）、またはＴ細胞培地＋１２００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－７＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－１５（Ｃ）のいずれかと共に培養した。０日目に、各条件で１００万個の細胞を播種し、７日ごとに細胞をカウントし、１００万個の細胞で再播種した。総細胞数（ｙ軸）は、各増殖の終了時の実際のＴ細胞数を示す。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、ＲＯＲ１発現ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株への慢性曝露後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞による細胞溶解活性及びＩＦＮ－γ分泌が延長されることを示す。対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＲＯＲ１＋Ａ５４９ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞への曝露によって慢性的に７日間刺激した。ＣＡＲ Ｔ細胞を新鮮な標的細胞と共に１：１のＥ：Ｔ比で２日ごとに再播種することにより、慢性抗原曝露を確実にした。慢性刺激後７日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞を回収し、Ａ５４９－ＮＬＲ（Ｅ：Ｔ細胞比１：１）またはＨ１９７５－ＮＬＲ（Ｅ：Ｔ１：５）のいずれかと共にインキュベートした。標的細胞の溶解を、アッセイのセットアップの時点０時間に対して正規化した総ＮＬＲ強度を追跡することによって評価した。ｎ＝３ドナー（Ｄ１３８１４、Ｄ１５１９５、及びＤ１５８４２）。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、ＲＯＲ１発現ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株への慢性曝露後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞による細胞溶解活性及びＩＦＮ－γ分泌が延長されることを示す。対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＲＯＲ１＋Ａ５４９ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞への曝露によって慢性的に７日間刺激した。ＣＡＲ Ｔ細胞を新鮮な標的細胞と共に１：１のＥ：Ｔ比で２日ごとに再播種することにより、慢性抗原曝露を確実にした。慢性刺激後７日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞を回収し、Ａ５４９－ＮＬＲ（Ｅ：Ｔ細胞比１：１）またはＨ１９７５－ＮＬＲ（Ｅ：Ｔ１：５）のいずれかと共にインキュベートした。ＭＳＤによるＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αの定量化用に、２４時間の上清を回収した。ｎ＝３ドナー（Ｄ１３８１４、Ｄ１５１９５、及びＤ１５８４２）。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、慢性抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞における疲弊関連の転写プロファイルが減少することを示す。示されている結果は、２ドナーにおけるシングルセルＣＩＴＥ－ｓｅｑ（Ｓｅｕｒａｔを使用）によるものである。慢性刺激後７日でのｃ－Ｊｕｎの過剰発現を有する及び有さないＣＡＲ＋Ｔ細胞間の差次的遺伝子発現における遺伝子セット濃縮（ｆｇｓｅａ）を示す。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、慢性抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞における疲弊関連の転写プロファイルが減少することを示す。示されている結果は、２ドナーにおけるシングルセルＣＩＴＥ－ｓｅｑ（Ｓｅｕｒａｔを使用）によるものである。単一の細胞からのｃ－Ｊｕｎの過剰発現を有する及び有さないＣＡＲ＋Ｔ細胞の一様多様体近似と投影（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を示す。各ドットは、２次元空間に投影された細胞を表す。ｃ－Ｊｕｎを添加した場合に頻度が減少するクラスター（クラスター０、３、及び５）のマーカーならびに対応する頻度が示されている（矢印参照）。クラスター３は、主に文献に基づく疲弊マーカーが濃縮された細胞で構成されていた。クラスター０及び５は、主に文献に基づくＴ細胞の分化／活性化マーカー（例えば、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＲＳＦ９、グランザイムＡ）が濃縮された細胞で構成されていた。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、慢性抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞における疲弊関連の転写プロファイルが減少することを示す。示されている結果は、２ドナーにおけるシングルセルＣＩＴＥ－ｓｅｑ（Ｓｅｕｒａｔを使用）によるものである。２次元空間での図５Ｂからのｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴ（第１のグラフ）、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、第２のグラフ）及びグランザイムＡ（ＧＺＭＡ、第３のグラフ）の発現を示す。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現により、慢性抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞における疲弊関連の転写プロファイルが減少することを示す。示されている結果は、２ドナーにおけるシングルセルＣＩＴＥ－ｓｅｑ（Ｓｅｕｒａｔを使用）によるものである。疲弊マーカー（クラスター３）及び分化／活性化マーカー（０、５）が濃縮されたクラスター０、３、及び５が、ｃ－Ｊｕｎの添加により頻度が低下する（細胞のパーセンテージが減少する）ことを示す。 操作されたＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ１９７５におけるＲＯＲ１発現レベルの変化を示す。様々な強度を有する変異脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位要素のセットを使用して、広範囲にわたるヒトＲＯＲ１の相対発現を制御し、ＲＯＲ１発現を欠くＨ１９７５細胞株に導入した。細胞株（ｘ軸）によるＲＯＲ１の発現レベルは幾何ＭＦＩ（ｙ軸）として表される。 ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、低レベルのＲＯＲ１を発現するＮＳＣＬＣ細胞株に対する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性に必要な抗原密度閾値を変化させないことを示す。Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）、またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＮＬＲ及び様々なレベルのＲＯＲ１を発現するＮＳＣＬＣ細胞株（Ｈ１９７５）（図６に記載）と共に１４８時間インキュベートし、その間、ＮＬＲ陽性細胞の総数をカウントし、時点０時間でのカウントに対して正規化し、正規化された標的の殺傷を算出した（４ドナー、エフェクター対標的［Ｅ：Ｔ］比＝１：１６）。ＲＯＲ１ノックアウト細胞及びＲＯＲ１低発現細胞をそれぞれ、左上のパネル及び右上のパネルに示す。ＲＯＲ１低中発現細胞及びＲＯＲ１中発現細胞をそれぞれ、左中央のパネル及び右中央のパネルに示す。ＲＯＲ１中高発現細胞及びＲＯＲ１高発現細胞をそれぞれ、左下のパネル及び右下のパネルに示す。 Ａ及びＢは、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、低レベルのＲＯＲ１を発現するＨ１９７５ ＮＳＣＬＣ細胞株に応答した抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカイン分泌に必要な抗原密度閾値を実質的に変化させないことを示す。Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞（丸）、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）（四角）、またはｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（三角）を、様々なレベルのＲＯＲ１を発現するＨ１９７５細胞（図６に記載）を含むウェルにて２４時間インキュベートし、その時点でそれらのウェルからＩＬ－２（Ａ）及びＩＦＮ－γ（Ｂ）の定量用の上清を回収した。濃度は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘを使用して測定した（４ドナー、エフェクター対標的［Ｅ：Ｔ］比＝１：１）。 Ａ、Ｂ、及びＣは、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）の抗腫瘍効果の比較を示す。ヒトＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ ＮＳＣＬＣ細胞を皮下移植した動物を、以下のうちの１つの静脈内単回投与（４×１０６細胞）により処置した：（ｉ）高用量ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞、（ｉｉ）対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）、及び（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞。次に、動物の腫瘍サイズ（Ａ）、体重（Ｂ）、及び生存（Ｃ）を、ＣＡＲ Ｔ細胞投与後の様々な時点で評価した。 Ｈ１７９５担腫瘍ＮＳＧマウスにおける抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の存続を示す。示されるように、動物は以下のうちの１つの単回静脈内投与を受けた：（ｉ）ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞（丸）、（ｉｉ）対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）（三角）、及び（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ひし形）。次に、投与後の様々な時点で末梢血を採取し、フローサイトメトリーを使用して血液１ｍＬあたりのＣＡＲ Ｔ細胞の数を定量した。
本開示は、キメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）を対象とする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／または切断型ＥＧＦＲをコードする１つ以上の追加のヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載のとおり、いくつかの態様では、これらの追加の構成要素（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質及び／または切断型ＥＧＦＲ）の発現により、キメラ結合タンパク質を発現するように修飾された細胞の１つ以上の特性が改善され得る。本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを発現する、操作された細胞、例えば、Ｔ細胞を提供する。操作されたＴ細胞、例えば、ＲＯＲ特異的ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する。Ｔ細胞におけるｃ－Ｊｕｎの過剰発現は、例えば、Ｔ細胞機能不全（例えば、Ｔ細胞の疲弊）を緩和または防止することによって、細胞の活性状態を維持するのに役立つ。本操作されたＴ細胞は、ＲＯＲ１を担持する腫瘍細胞に対して持続的で強力な細胞傷害性を示す。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しないＴ細胞と比較して、本操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の疲弊の兆候が少なく、持続性エフェクター細胞の兆候が増加している。
本開示がより詳細に記載される前に、本開示は、記載される特定の組成物またはプロセス工程に限定されないが、そのようなものは当然ながら変わり得ることが理解されるべきである。本開示を読むことで当業者に明らかになるように、本明細書において記載及び例示される個々の態様の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に分離されまたはそれと組み合わされ得る個別の構成要素及び特徴を有する。任意の記述された方法は、記述された事象の順序でまたは論理的に可能性のある任意の他の順序で行われ得る。
本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様を限定するものではなく、本開示の態様は、本明細書の全体を参照することによって定義され得る。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を記載する目的のためのものにすぎず、限定することは意図されていないことも理解されたい。
したがって、以下で直ちに定義される用語は、その全体が本明細書への参照によってより十分に定義される。
用語
本明細書がより容易に理解され得るために、所定の用語が最初に定義される。本明細書で別途明示的に提供される場合を除き、以下の用語の各々は、以下に示される意味を有する。さらなる定義は、詳細な説明を通して示される。
用語「ａ」または「ａｎ」実体は、その実体の１つ以上を指す、例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すことが理解されることが留意されるべきである。このように、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用され得る。特許請求の範囲は、いかなる任意の要素も除外するように作成され得ることがさらに留意される。このように、この記述は、特許請求の範囲の要素の記述に関連して「単独で」、「のみ」等としてのそのような排他的な用語の使用、または否定的な限定の使用のための先行的基礎として機能することが意図されている。
さらに、「及び／または」は、本明細書で使用される場合、他方を伴うまたは伴わない２つの特定された特徴または構成要素の各々の特定の開示として解釈されるべきである。よって、用語「及び／または」は、語句で使用される場合、例えば、本明細書における「Ａ及び／またはＢ」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「及び／または」は、語句で使用される場合、例えば、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」は、以下の態様の各々：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、またはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、及びＣ（単独）を包含することが意図される。
態様が「含む」という言葉を用いて本明細書に記載されている場合はいつでも、「からなる」及び／または「本質的になる」の観点から記載される別の類似する態様も提供されることが理解される。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が関係する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示において使用される用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で認められた形態で示される。数値範囲は、範囲を定義する数を包含する。値の範囲が記述される場合、その範囲の記述された上限及び下限の間の各々の介在整数値、及びその各々の分数も、そのような値の間の各副次範囲と共に、具体的に開示されることが理解されるべきである。任意の範囲の上限及び下限は、独立して、その範囲に含まれ、またはそれから除外され得、限度のいずれかまたは両方が含まれるまたはいずれも含まれない各範囲も本開示に包含される。よって、本明細書で記述される範囲は、記述された端点を含めて、範囲内の値のすべてについて簡略化されていることが理解される。例えば、１～１０の範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または副次範囲が含まれることが理解される。
値が明示的に記述される場合、記述された値とおおよそ同じ量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）または量（ａｍｏｕｎｔ）も、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各々の副次的組み合わせも具体的に開示され、本開示の範囲内である。逆に、異なる要素または要素の群が個々に開示される場合、それらの組み合わせも開示される。開示の任意の要素が複数の代替手段を有するものとして開示される場合、各代替手段が単独でまたは他の代替手段との任意の組み合わせで除外されるその開示の例も本明細書により開示される、開示の複数の要素がそのような除外を有し得、そのような除外を有する要素のすべての組み合わせが本明細書により開示される。
ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている１文字のコードによって表される。別途示されない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’配向で左から右に記述される。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されるそれらの一般的に知られている１文字の記号によって本明細書で表される。したがって、「ａ」は、アデニンを表し、「ｃ」は、シトシンを表し、「ｇ」は、グアニンを表し、「ｔ」は、チミンを表し、「ｕ」は、ウラシルを表す。
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ配向で左から右に記述される。アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字の記号によってまたはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字の記号によって本明細書で表される。
用語「約」は、およそ、大体、ほぼ、またはその領域内を意味するために本明細書で使用される。用語「約」が、数値範囲と併せて使用される場合、それは、示された数値の上下に境界を広げることによってその範囲を修飾する。通常、用語「約」は、上または下（より高いまたはより低い）に例えば、１０パーセントの変動によって、記述された値の上及び下へ数値を修飾し得る。
用語「投与」、「投与すること」、及びその文法的変化形は、本開示の組成物（例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはＣＡＲを発現する細胞）を薬学的に許容可能な経路を介して対象に導入することを指す。対象への本開示の組成物（例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはＣＡＲを発現する細胞）の導入は、腫瘍内、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸、リンパ管内、髄腔内、眼周囲または局所を含む、任意の好適な経路による。
投与には、自己投与及び他人による投与が含まれる。好適な投与経路により、組成物または薬剤は、その意図された機能を発揮することが可能となる。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。
用語「アミノ酸置換」は、親または参照配列（例えば、野生型配列）に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成によりまたは当該技術分野で知られている組換え方法を介して親または参照配列（例えば、野生型ポリペプチド配列）において置換され得る。したがって、「位置Ｘでの置換」に対する言及は、位置Ｘに存在するアミノ酸の代替的アミノ酸残基での置換を指す。いくつかの態様では、置換パターンは、スキーマＡｎＹに従って説明され得、Ａは、ｎ位に天然に、または元々存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。いくつかの態様では、置換パターンは、スキーマＡｎ（ＹＺ）に従って記載され得、Ａは、位置ｎに天然にまたは元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字コードであり、Ｙ及びＺは、Ａを置き換え得る代替的な置換アミノ酸残基である。
本明細書で使用される場合、用語「およそ」は、対象となる１つ以上の値に適用される場合、記述された参照値と同様の値を指す。所定の態様では、用語「およそ」は、別途記述されない限り、または別途文脈から明らかでない限り、記述された参照値のいずれかの方向に（より上またはより下に）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を指す（そのような数が可能性のある値の１００％を超えるであろう場合を除く）。
本明細書で使用される場合、用語「保存された」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基であって、比較されている２つ以上の配列の同じ位置において改変なく存在するものをそれぞれ指す。比較的保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列において他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連した配列間で保存されているものである。
いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存された」または「同一」と称される。いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、または少なくとも約９５％同一である場合、「高度に保存された」と称される。いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「高度に保存された」と称される。いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも約３０％同一、少なくとも約３５％同一、少なくとも約４０％同一、少なくとも約４５％同一、少なくとも約５０％同一、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、または少なくとも約９５％同一である場合、「保存された」と称される。いくつかの態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約３５％同一、約４０％同一、約４５％同一、約５０％同一、約５５％同一、約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存された」と称される。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの長さ全体に適用され得、またはその一部、領域または特徴に適用され得る。
「に由来する」は、その用語が本明細書で使用される場合、第１の分子と第２の分子との間の関係性（例えば、構造的類似性）を示す。例えば、ヒト免疫グロブリン配列（例えば、ヒンジ及び／または定常領域配列）に由来するアミノ酸配列を含む本開示のＣＡＲスペーサーの場合、ヒト免疫グロブリン配列（例えば、ヒンジ及び／または定常領域配列）に由来する配列は、全ヒンジ、ヒンジ断片、全ヒンジまたはヒンジの断片及び野生型免疫グロブリンにおいてヒンジに隣接する追加の残基（例えば、ＣＨ１またはＣＨ２ドメイン等の定常ドメインからの１つ以上のアミノ酸）を含み、またはそれからなり得、またはループ領域の全配列、ループ領域断片、またはループ領域断片及び野生型免疫グロブリンにおいてループに隣接する追加の残基（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインにおけるループ領域に隣接する二次構造要素、例えば、β－シートからの１つ以上のアミノ酸）を含み、またはそれからなり得る。いくつかの態様では、定常ドメインに由来するスペーサーは、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に由来し得る。
用語「ループ領域」は、本明細書で使用される場合、ループ領域から一次構造の直近のＮ末端及びＣ末端の方向で、α－ヘリックスまたはβ－シート等の二次構造を含む２つの領域を接続させるアミノ酸残基の一次配列を指す。ループ領域の例には、ＣＨ２またはＣＨ３ループ領域が含まれるがこれらに限定されない。免疫グロブリンの折り畳みは、グリークキートポロジーで２つのβ－シートに配置された７～９個の逆平行β鎖の２層サンドイッチを含む。したがって、本開示の定常ドメイン由来ＣＡＲスペーサーは、免疫グロブリンドメイン、例えば、定常免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＬ）におけるβ－シートＡ及びβ－シートＢ、β－シートＢ及びβ－シートＣ、β－シートＣ及びβ－シートＣ’、β－シートＣ’及びβ－シートＣ’’、β－シートＣ’’及びβ－シートＤ、β－シートＤ及びβ－シートＥ、β－シートＥ及びβ－シートＦ、またはβ－シートＦ及びβ－シートＧを接続させるループ配列（またはその断片）を含み、それからなり、またはそれから本質的になり得る。
本明細書に開示されるヒトＩｇ免疫グロブリン（例えば、ヒンジ及び／または定常領域配列）に由来するＣＡＲスペーサーはまた、上述したヒンジ領域由来配列にペプチド結合を介して共有結合によって生成される配列を包含し、すなわち、スペーサーは、全ヒンジ、その断片、またはそれらの組み合わせの複数のリピートを含むポリマーであり得る。
いくつかの態様では、第２の核酸配列に「由来する」核酸配列（例えば、ＣＤ８ａのＴＭ配列に由来する本開示のＣＡＲのＴＭドメイン配列）は、第２の核酸配列のヌクレオチド配列と同一のまたは実質的に類似するヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの態様では、核酸配列は、例えば、自然に生じる変異誘発、人工特異的変異誘発、または人工ランダム変異誘発によって得られ得る。ヌクレオチドを誘導するために使用される変異誘発は、意図的に仕向けられ、または意図的にランダムであり、または各々の混合であり得る。第１に由来する異なるヌクレオチドを生成するためのヌクレオチドの変異誘発は、ランダム事象（例えば、ポリメラーゼ背信によって引き起こされる）であり得、誘導されたヌクレオチドの同定は、例えば、本明細書で論述される適切なスクリーニング方法によって行われ得る。
いくつかの態様では、第２のヌクレオチド配列に由来するヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドと少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性をそれぞれ有し、第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の生物学的活性を保持する。
用語「相補的」及び「相補性」は、ワトソン・クリック塩基対合規則によって互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、核酸塩基配列を含む各々）、またはオリゴマーと標的遺伝子との間を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ－Ｇ－Ａ（５’→３’）」は、核酸塩基配列「Ａ－Ｃ－Ｔ（３’→５’）」と相補的である。相補性は、「部分的」であり得、その場合、所与の核酸塩基配列の核酸塩基のすべて未満が、塩基対合規則に従って他の核酸塩基配列に一致する。例えば、いくつかの態様では、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％であり得る。あるいは、例を続けると、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間の「完全な」または「完璧な」（１００％）相補性が存在し得る。核酸塩基配列間の相補性の程度は、配列間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対して有意な効果を有する。
用語「下流」は、参照ヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を指す。所定の態様では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合ドメイン」及び「抗体」は、天然であるかまたは部分的もしくは全体的に合成的に生成されたかどうかにかかわらす免疫グロブリン、及びその抗原結合部分を包含する。その用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。「抗原結合ドメイン」及び「抗体」は、抗原に特異的に結合し、それを認識し、少なくとも１つのＣＤＲを含む免疫グロブリンタンパク質またはその一部からのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。用語「抗原結合ドメイン」及び「抗体」の使用は、完全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、その部分を含むことを意味し、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ネズミ抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体コンストラクト、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｃ）、ならびに抗体関連ポリペプチドをさらに含む。
いくつかの態様では、「抗原結合部分」は、抗体に由来するＣＤＲを含むがこれらに限定されない、抗原と接触するポリペプチド配列を指す。
抗原結合部分はまた、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ及びｂｉｓ－ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合部分はまた、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）等のポリペプチドに基づく骨格にグラフトされ得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載している米国特許番号６，７０３，１９９号を参照されたい）。よって、用語「抗原結合ドメイン」及び「抗体」にはまた、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの骨格に基づく抗体模倣体（モノボディ）、１つ以上のＣＤＲがグラフトされた他の骨格システム（例えば、テネイシン）、アプタマー等が含まれる。
用語「抗原結合ドメイン」及び「抗体」にはまた、本開示に従って使用され得る他の好適な抗原結合ドメイン、例えば、ナノボディ、ＶＨＨ抗体、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、アフィボディ、モノボディ、アドネクチン、アルファボディ、アルブミン結合ドメイン、アドヒロン（Ａｄｈｉｒｏｎ）、アフィリン及び他のガンマ－Ｂ結晶由来人工タンパク質、アフィマー、アフィチン（ＮＡＮＯＦＩＴＩＮ（商標））、アンチカリン、アルマジロリピートタンパク質（ＡＲＭ－リピートタンパク質、例えば、β－カテニン、ａ－インポーティング（ａ－ｉｍｐｏｒｔｉｎｇ）、プラコグロビン、大腸腺腫性ポリポーシス、ＡＲＭＣ４、ＡＲＭＣＸ３等）、アトリマー（Ａｔｒｉｍｅｒ）（例えば、テトラネクチン及び由来タンパク質）、アビマー／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、センチリン、フィノマー及び他のＦｙｎ ＳＨ３ドメイン由来タンパク質、クーニッツドメイン、Ｏｂｏｄｙ／ＯＢ－フォールド、プロネクチン、レペボディ（Ｒｅｐｅｂｏｄｙ）、または任意の合成及び／またはコンピューター的に設計された結合タンパク質または骨格が含まれる。
抗体のモジュール型構造は、６０種を超える異なる二重特異的または多重特異的抗体形式を生成するために利用されてきた。したがって、いくつかの態様では、抗体は、例えば、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（二重作用Ｆａｂ）（ツーインワン）、ＤＡＦ（フォーインワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ノブインホール共通ＬＣ、ノブインホールアセンブリ、チャージペア、Ｆａｂ－アーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ－Ｙ（２つのＨＣのヘテロ二量体化を誘導するロイシンジッパーを有する二重特異的抗体）、Ｆｃａｂ、Ｋλ体、直交Ｆａｂ、ＤＶＤ－ＩｇＧ（二重可変ドメインＩｇＧ）、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ－ＩｇＧ（フォーインワン）、ナノボディ、ナノボディ－ＨＳＡ、ＢｉＴＥ（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー）、ダイアボディ、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）、ＴａｎｄＡｂ（タンデム抗体）、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２－ＳｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣ Ａｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、イントラボディ、Ｄｏｃｋ及びＬｏｃｃｋ、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－ＨＳＡ、タンデムｓｃＦｖ－毒素、ＩｇＧ－ＩｇＧ、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ、及びｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦＶ２から選択される形式であり得る。
「抗原結合ドメイン」及び「抗体」にはまた、所望の生物学的活性または機能を示す限り、二重特異的抗体及び多重特異的抗体が含まれる。いくつかの態様では、本開示のキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含む。
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体部分及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体部分を含む融合タンパク質であって、軽鎖及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短いフレキシブルポリペプチドリンカーを介して隣接して連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現することが可能である、融合タンパク質を指し、ｓｃＦｖは、その由来となったインタクト抗体の特異性を保持する。別途特定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関していずれかの順序でＶＬ及びＶＨ可変領域を有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得、または、ＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。
用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。例えば、通常、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）及び各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）が存在する。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番スキーム）、またはそれらの組み合わせによって記載されるものを含む、多数のよく知られているスキームのいずれかを使用して決定され得る。Ｋａｂａｔ付番スキーム下では、いくつかの態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるＣＤＲアミノ酸残基は、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）におけるＣＤＲアミノ酸残基は、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｃｈｏｔｈｉａ付番スキーム下では、いくつかの態様では、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸残基は、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基は、２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ付番の組み合わされたスキームでは、いくつかの態様では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、またはその両方の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、いくつかの態様では、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば、哺乳動物ＶＨ、例えば、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）、及びＶＬ、例えば、哺乳動物ＶＬ、例えば、ヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）に対応する。
本明細書で使用される場合、「細胞操作」または「細胞修飾」（その誘導体を含む）は、細胞、例えば、本明細書に開示される免疫細胞の標的修飾を指す。いくつかの態様では、細胞操作は、ウイルス遺伝子操作、非ウイルス遺伝子操作、腫瘍特異的標的化を可能にする受容体（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）の導入、Ｔ細胞機能を改善する１つ以上の内因性遺伝子の導入、Ｔ細胞機能を改善する１つ以上の合成遺伝子の導入、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の機能を改善する１つ以上の合成遺伝子（例えば、修飾されていない対応する細胞と比較して、免疫細胞がｃ－Ｊｕｎの発現の増加を示すような、ｃ－Ｊｕｎをコードするポリヌクレオチド）の導入、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本開示の他の場所でさらに説明されるように、いくつかの態様では、細胞は、転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムベースの転写活性化因子）を用いて操作または修飾され得、転写活性化因子は、目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の内因性発現を誘導及び／または増大することが可能である。
用語「抗原」は、免疫反応を引き起こす分子を指す。この免疫反応は、抗体生成、もしくは特定の免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方を伴い得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が、抗原として機能し得ることを理解する。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体分子と特異的に相互作用する抗原の部位を指す。本明細書でエピトープ決定基と称されるそのような部位は、典型的には、アミノ酸側鎖または糖側鎖等の要素を含み、またはその一部である。エピトープ決定基は、例えば、当該技術分野で知られている方法によって、例えば、結晶学によってまたは水素－重水素交換によって定義され得る。エピトープ決定基と特異的に相互作用する抗体分子上の部位の少なくとも１つまたはいくつかは、典型的には、ＣＤＲ（複数可）に位置する。典型的にはエピトープは、特定の三次元構造的特徴を有する。典型的にはエピトープは、特定の電荷的特徴を有する。いくつかのエピトープは、線状エピトープである一方で、他のものは、コンフォメーショナルエピトープである。
用語「自己」は、後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指す。
用語「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞にある場合に、その細胞に、標的細胞、典型的にはがん細胞に対する特異性、及び細胞内シグナル生成を提供するポリペプチドのセット、典型的には最も単純な形態では２つを指す。いくつかの態様では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び以下に定義される刺激分子及び／または共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは、同じポリペプチド鎖にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは、互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットには、二量化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに結合させ得、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させ得る二量化スイッチが含まれる。いくつかの態様では、ＣＡＲの刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）である。いくつかの態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能性シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの態様では、共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／またはＣＤ２８から選択される。
いくつかの態様では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質であって、抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ＣＡＲスペーサーによって連結されている、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲスペーサーを介して膜貫通ドメインに連結された抗原結合ドメインならびに共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲスペーサーを介して膜貫通ドメインに連結された抗原結合ドメインならびに１つ以上の共刺激分子（複数可）に由来する２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲスペーサーを介して膜貫通ドメインに連結された抗原結合ドメインならびに１つ以上の共刺激分子（複数可）に由来する少なくとも２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲのアミノ末端（Ｎ末端）における任意のリーダー配列を含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインのＮ末端でリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、細胞プロセシング及び細胞膜へのＣＡＲの局在化中に抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意に切断される。
本出願は、本開示の主題の異なる態様を説明するためにしばしばＣＡＲを使用しているが、当業者には、本明細書で提供される関連開示が、他のキメラ結合タンパク質にも同様に適用できることが明らかであろう。本明細書で使用される場合、用語「キメラ結合タンパク質」は、１つ以上の抗原（例えば、抗原結合部分を含む）に結合することが可能であり、天然に存在しない方向で接続された本来は別々のタンパク質またはタンパク質の断片または同じタンパク質の複数の断片をコードする２つ以上の異種ポリヌクレオチドの接合を介して創出されるタンパク質を指す。他のキメラ結合タンパク質の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、操作されたＴＣＲ）、キメラ抗体－Ｔ細胞受容体（ｃａＴＣＲ）、キメラシグナル伝達受容体（ＣＳＲ）、Ｔ細胞受容体模倣体（ＴＣＲ模倣体）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。したがって、別段の指示がない限り、用語ＣＡＲは、いくつかの態様では、当該技術分野で知られている他のタイプのキメラ結合タンパク質、例えば、本明細書に記載のものを包含し得る。
用語「がん」は、異常な細胞の制御不能な成長を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的にまたは身体の他の部分に血流及びリンパ系を介して広がり得る。様々ながんの例が本明細書に記載されており、それには乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌等が含まれるがこれらに限定されない。用語「腫瘍」及び「がん」は、本明細書で互換的に使用され、例えば、両方の用語は、固体及び液体、例えば、びまん性または循環性の腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、用語「がん」または「腫瘍」には、前がん、及び悪性のがん及び腫瘍が含まれる。
用語「がん関連抗原」または「腫瘍抗原」またはその変化形は、正常な細胞と比較して、全体的にまたは断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）としてのいずれかでがん細胞の表面に優先的に発現し、薬理学的薬剤をがん細胞に優先的に標的化するために有用である分子（典型的にはタンパク質、炭水化物または脂質）を互換的に指す。いくつかの態様では、腫瘍抗原は、正常な細胞及びがん細胞の両方によって発現したマーカー、例えば、系統マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。所定の態様では、腫瘍抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌及び腺癌、例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌等を含むがこれらに限定されないがんに由来する。
いくつかの態様では、腫瘍抗原は、特定の増殖性障害に共通する抗原である。いくつかの態様では、がん関連抗原は、がん細胞において、正常な細胞と比較して過剰発現（例えば、正常な細胞と比較して約１倍の過剰発現、約２倍の過剰発現、約３倍の過剰発現またはそれ以上）した細胞表面分子である。いくつかの態様では、がん関連抗原は、がん細胞において不適切に合成された細胞表面分子、例えば、正常な細胞に発現した分子と比較して欠失、付加または変異を含有する分子である。いくつかの態様では、がん関連抗原は、全体的にまたは断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として、がん細胞の細胞表面にのみ発現し、正常な細胞の表面で合成または発現しない。
用語「抗がん効果」は、例えば、腫瘍体積の減少、がん細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、がん細胞増殖の減少、がん細胞生存の減少、またはがん性病態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むがこれらに限定されない、様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指す。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。よって、ポリペプチドにおけるアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換えられた場合、置換は、保存的とみなされる。いくつかの態様では、一続きのアミノ酸は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に同様の一続きで保存的に置き換えられ得る。
非保存的アミノ酸置換には、（ｉ）陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）が陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）の代わりになったものまたはそれによって置換されたもの、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）の代わりになったものまたはそれによって置換されたもの、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが任意の他の残基の代わりになったものまたはそれによって置換されたもの、または（ｉｖ）嵩高い疎水性または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＴｒｐ）がより小さな側鎖を有するもの（例えば、ＡｌａまたはＳｅｒ）または側鎖を有しないもの（例えば、Ｇｌｙ）の代わりになったものまたはそれによって置換されたものが含まれる。
他のアミノ酸置換も使用され得る。例えば、アミノ酸アラニンの場合、置換は、Ｄ－アラニン、グリシン、ベータ－アラニン、Ｌ－システイン及びＤ－システインのいずれか１つから選ばれ得る。リジンの場合、置き換えは、Ｄ－リジン、アルギニン、Ｄ－アルギニン、ホモ－アルギニン、メチオニン、Ｄ－メチオニン、オルニチン、またはＤ－オルニチンのうちのいずれか１つであり得る。通常、単離されたポリペプチドの特性の変化を誘導することが予期され得る機能的に重要な領域における置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリンまたはトレオニンが疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、またはアラニンの代わりになったもの（またはそれによって置換されたもの）、（ｉｉ）システイン残基が任意の他の残基の代わりになったもの（またはそれによって置換されたもの）、（ｉｉｉ）陽性側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジンが陰性側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の代わりになったもの（またはそれによって置換されたもの）、または（ｉｖ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンがそのような側鎖を有しないもの、例えば、グリシンの代わりになったもの（またはそれによって置換されたもの）である。前述の非保存的置換のうちの１つがタンパク質の機能的特性を改変し得る可能性はまた、タンパク質の機能的に重要な領域に関する置換の位置に相関する：したがって、いくつかの非保存的置換は、生物学的特性に対する効果をほとんど有さず、または有しない場合がある。
本開示の文脈では、用語「変異」及び「アミノ酸置換」は、上で定義されるように（時に単に「置換」と称される）、互換可能と考えられる。
本開示の文脈では、置換は（それらがアミノ酸置換と称される場合であっても）、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基を代替的アミノ酸残基で置換することは、第１のアミノ酸をコードするコドンを第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。
本明細書で使用される場合、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。通常、用語「相同性」は、２つの分子間の進化的関係性を意味する。よって、相同である２つの分子は、共通の進化的祖先を有する。本開示の文脈では、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を包含する。
いくつかの態様では、ポリマー分子は、分子におけるモノマーの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が同一（正確に同じモノマー）または同様（保存的置換）である場合、互いに「相同」であるとみなされる。用語「相同」は必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。
本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間の全体的な単量体保存を指す。任意の追加の限定詞を伴わない用語「同一」、例えば、タンパク質Ａがタンパク質Ｂと同一であることは、配列が１００％同一（１００％の配列同一性）であることを意味する。例えば、「７０％同一」として２つの配列を記載することは、例えば、「７０％の配列同一性」を有するものとしてそれらを記載することと同等である。
２つのポリペプチド配列の同一率の計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列をアライメントすることによって実施され得る（例えば、最適なアライメントのために第１及び第２のポリペプチド配列の一方または両方にギャップが導入され得、非同一配列は比較目的のために無視され得る）。所定の態様では、比較目的のためにアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。次いで対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸が比較される。
第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸によって占められている場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一率は、ギャップの数、及び各ギャップ（２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要がある）の長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較及び同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
好適なソフトウエアプログラムは、様々な供給源から、ならびにタンパク質及びヌクレオチド配列両方のアライメントのために利用可能である。配列同一率を決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴのウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能なプログラムのＢＬＡＳＴ群の一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用されるのに対し、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスのＥＭＢＯＳＳ群の一部であり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａでＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から利用可能でもあるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。
配列アライメントは、当該技術分野で知られている方法、例えば、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ ＸまたはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥ等を使用して行われ得る。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアライメントされる単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それら自体の配列同一率をそれぞれ有し得る。配列同一率値は、最も近い１０分の１に丸められることが留意される。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に下方に丸められるのに対し、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に上方に丸められる。長さの値は、常に整数であることも留意される。
所定の態様では、第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の同一百分率（ＩＤ％）は、ＩＤ％＝１００ｘ（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアライメント（視覚検査または特定の配列アライメントプログラムによってアライメントされる）において同一一致としてスコア化されたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である）として計算される。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一率は、第１の配列に対する第２の配列の同一率よりも高い。
当業者は、配列同一率の計算のための配列アライメントの生成が、一次配列データによって専らもたらされる２元配列－配列比較に限定されないことを理解する。配列アライメントは、配列データを、異種源からのデータ、例えば、構造的データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、変異の位置）、または系統発生学的データを統合することによって生成され得ることも理解される。異種データを統合して多重配列アライメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで利用可能であり、また、例えば、ＥＢＩから代替的に利用可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一率を計算するために使用される最終アライメントは、自動または手動のいずれかでキュレートされ得ることも理解される。
本明細書で使用される場合、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。ポリマー分子の互いの類似率の計算は、類似率の計算が当該技術分野において理解されるように保存的置換を考慮することを除き、同一率の計算と同じ手法で実施され得る。類似性の百分率は、使用される比較スケール、すなわち、アミノ酸が、例えば、それらの進化的近似性、電荷、体積、柔軟性、極性、疎水性、芳香族性、等電点、抗原性、またはそれらの組み合わせに従って比較されるかどうかに依存することが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「単離された」、「精製された」、「抽出された」、及びその文法的変化形は、互換的に使用され、精製の１つ以上のプロセスを受けた本開示の所望の組成物、例えば、本開示のＣＡＲの調製の状態を指す。いくつかの態様では、単離することまたは精製することは、本明細書で使用される場合、混入物質を含有する試料から本開示の組成物、例えば、本開示のＣＡＲの（例えば、画分）を除去する、部分的に除去するプロセスである。
いくつかの態様では、単離された組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さず、または、代替的に、望ましくない活性のレベルまたは量は、許容可能なレベルまたは量以下である。いくつかの態様では、単離された組成物は、本開示の所望の組成物の量及び／または濃度を許容可能な量及び／または濃度及び／または活性以上で有する。いくつかの態様では、単離された組成物は、組成物が得られる出発物質と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発物質と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％、または９９．９９９９％超である場合がある。
いくつかの態様では、単離された調製物は、残留する生物学的生成物を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離された調製物は、任意の混入した生物学的物質を１００％、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、または少なくとも約９０％含まない。残留する生物学的生成物は、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、または代謝生成物を含み得る。
「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、及びその文法的変化形は、互換的に使用され、一本鎖形態、または二本鎖ヘリックスのいずれかのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン、「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ、例えば、ホスホロチオエート及びチオエステルを指す。一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ及びＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、及び特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、それを任意の特定の三次形態に限定しない。よって、この用語には、とりわけ、線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、超らせんＤＮＡ及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論述する際、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを付与する通常の規則に従って本明細書で記載され得る。
「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡが含まれるがこれらに限定されない。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載される１つ以上の核酸を含む。
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、またはそれらの混合物を含む任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。よって、その用語には、三本鎖、二本鎖及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。それにはまた、ポリヌクレオチドの、例えば、アルキル化、及び／またはキャッピングによって修飾された、及び修飾されていない形態が含まれる。より具体的には、用語「ポリヌクレオチド」には、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）及びｍＲＮＡを含むポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）（スプライシングされているかスプライシングされていないかにかかわらない）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、及び非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、ならびにポリマーがＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対合または塩基積層を可能とする構成の核酸塩基を含有する他の合成配列特異的核酸ポリマーが含まれる。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ベクターに挿入されたＤＮＡを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。いくつかの態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様では、所定のクラスのすべての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドにおけるすべてのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンで置き換えられ得る）。
用語「コードする」は、ヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）の定義された配列またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及びマクロ分子の合成のための鋳型として機能するための、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの特定の配列の内在する特性及びそれに起因する生物学的特性を指す。よって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を生成する場合、タンパク質をコードする。コード鎖（そのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供される）、及び遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖はいずれとも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の生成物をコードすると称され得る。
別途特定されない限り、アミノ酸配列を「コードする」ヌクレオチド配列、例えば、本開示のＣＡＲを「コードする」ポリヌクレオチドには、互いの変性バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。
用語「発現」は、プロモーターによって促進される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、修飾アミノ酸を含み得る。その用語はまた、自然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。その定義にはまた、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチンを含む）を含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で知られている他の修飾が含まれる。
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子生成物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片ならびに前述のものの他の均等物、バリアント、及びアナログが含まれる。ポリペプチドは、単一ポリペプチドであり得、または多分子複合体、例えば、二量体、三量体または四量体であり得る。それらはまた、一本鎖または複数鎖のポリペプチドを含み得る。最も一般的なジスルフィド結合は、複数鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに適用され得る。いくつかの態様では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を介して生成されたポリペプチドまたはタンパク質を指す。操作された宿主細胞において発現した組換え的に生成されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離された、分画された、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドと同様に、本開示の目的のために単離されたとみなされる。本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）は、当該技術分野で知られている方法を使用して組換え的に生成され得る。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）は、本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードするベクターでのトランスフェクション後に、細胞、例えば、Ｔ細胞によって生成される。
本明細書で使用される場合、ポリペプチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド）の「断片」という用語は、Ｎ及び／またはＣ末端で欠失した天然に存在する配列よりも短いポリペプチドのアミノ酸配列、または天然に存在するポリペプチドと比較して欠失したポリペプチドの任意の部分を指す。よって、断片は、Ｎ及び／またはＣ末端のみが欠失したことを必ずしも必要とするわけではない。天然に存在する配列に対して内部アミノ酸が欠失したポリペプチドも断片とみなされる。
本明細書で使用される場合、用語「機能的断片」は、ポリペプチド機能を保持するポリペプチド断片を指す。したがって、いくつかの態様では、Ｉｇヒンジの機能的断片は、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が標的エピトープ（例えば、腫瘍抗原）と有効に相互作用し得るように、標的エピトープ（例えば、腫瘍抗原）から少し離れてＣＡＲにおける抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を配置する能力を保持する。同様に、いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎ機能的断片は、ＣＡＲ Ｔ細胞で発現された場合、例えば対応する全長ｃ－Ｊｕｎを発現する参照ＣＡＲ Ｔ細胞の活性の少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を有するＣＡＲ Ｔ細胞をもたらす断片である。そのような活性の非限定的な例は、本開示の他の箇所でさらに説明される。
本明細書で使用される場合、用語「参照ＣＡＲ Ｔ細胞」は、同じ構造的ＣＡＲ構成要素を含むが、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない対応するＣＡＲ Ｔ細胞を指す。
本開示の他の場所でさらに記載されるように、本明細書に記載のＣＡＲ（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドは、ｃ－Ｊｕｎタンパク質またはその機能的断片をコードする追加のヌクレオチド配列を含むことができる。ｃ－Ｊｕｎ断片が機能的断片であるかどうかは、ｃ－Ｊｕｎの活性化を特定するための任意の既知の方法（例えば、ａｂｃａｍ（商標）の比色ｃ－Ｊｕｎ転写因子アッセイキット（比色））等によって評価することができる。本明細書に記載のＴ細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるｃ－Ｊｕｎの過剰発現は、Ｔ細胞の機能不全（例えば、Ｔ細胞の疲弊）を緩和または防止することによって細胞の活性部位を維持するのに役立つ。したがって、ｃ－Ｊｕｎの機能的断片は、本明細書に記載の操作された免疫細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞にこの活性を与える能力に基づいて評価され得る。そのような活性としては、標的を担持する腫瘍細胞（例えば、ＲＯＲ１＋腫瘍細胞）に対する持続的で強力な細胞傷害性（例えば、腫瘍細胞を溶解または殺傷する能力）、またはＴ細胞の疲弊の兆候の減少（例えば、ＰＤ－１等の抑制性受容体の発現の減少）、及び持続性エフェクター細胞の兆候の増加が挙げられるがこれらに限定されない。Ｔ細胞の疲弊を評価し、それによってｃ－Ｊｕｎの機能的断片を評価する方法としては、例えば、当該技術分野で知られている疲弊、細胞表現型、持続性、細胞傷害性及び／または殺傷、増殖、サイトカイン放出、及び遺伝子発現プロファイルを測定するために有用なアッセイ、例えば、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＩｎｃｕＣｙｔｅ免疫細胞殺傷分析、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）または同様のアッセイ、持続抗原刺激アッセイ、順次抗原刺激アッセイ（持続抗原刺激アッセイと同様であるが、各再刺激回でＥ：Ｔ細胞比をリセットしない）、バルク及びシングルセルＲＮＡｓｅｑ（例えば、Ｆｒｏｎ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１１：２２０、２０１９ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３５：ｉ４３６－４４５、２０１９ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｄａｔａ Ｓｃｉ．２：１３９－１７３を参照されたい）、細胞傷害性／殺傷アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットならびに他の標準的な分子及び細胞生物学方法、例えば、本明細書に記載のものまたは例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙもしくはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９－２０２１）もしくはその他に記載のものが挙げられる。
タンパク質操作及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、ポリペプチドの特徴を改善または改変するためにバリアントが生成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的喪失を伴わずに分泌タンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失させられ得る。Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、３、８、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失させた後であってもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０アミノ酸残基を欠失させた後に最大で１０倍高い活性を示した。（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
その上、豊富な証拠は、バリアントがしばしば、天然に存在するタンパク質のものと同様の生物学的活性を保持することを実証している。例えば、Ｇａｙｌｅ及び同僚（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範な変異分析を行った。彼らは、ランダム変異誘発を使用して、分子の長さ全体にわたってバリアント当たり２．５個のアミノ酸変化を平均とする３，５００種を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成した。複数の変異がすべてのあり得るアミノ酸位置について試験された。調査者は、「分子のほとんどが［結合または生物学的活性］のいずれにもほとんど影響を与えずに改変され得ること」を見出した。（要約を参照されたい）。実際、試験した３，５００種を超えるヌクレオチド配列のうち、２３種の独自のアミノ酸配列のみが、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を生成した。
上記のとおり、バリアントまたは誘導体には、例えば、修飾されたポリペプチドが含まれる。いくつかの態様では、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖タンパク質のバリアントまたは誘導体は、化学的修飾及び／または内因性修飾の結果である。いくつかの態様では、バリアントまたは誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏ修飾の結果である。いくつかの態様では、バリアントまたは誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾の結果である。いくつかの態様では、バリアントまたは誘導体は、プロデューサー細胞、例えば、Ｔ細胞における細胞内修飾の結果である。
バリアント及び誘導体に存在する修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部位の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノ化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファー－ＲＮＡ媒介付加、例えば、アルギニル化、及びユビキチン化が含まれる。
用語「シグナル伝達ドメイン」は、第２のメッセンジャーを生成することによってまたはそのようなメッセンジャーに反応することによってエフェクターとして機能することによって定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を制御するために細胞内で情報を伝達することによって作用するタンパク質の機能的部分を指す。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、その用語が本明細書で使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲ含有細胞、例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成し得る。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の非限定的な例には、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性及びヘルパー活性が含まれる。いくつかの態様では、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を発揮するように細胞を指示するタンパク質の一部である。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分が使用される範囲内で、そのような切断された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用され得る。よって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断された部分を含むことを意味する。
いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、または抗原依存的刺激の原因となる分子に由来するものが含まれる。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル、または抗原非依存的刺激の原因となる分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含み得る。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれるがこれらに限定されない。
用語「共有結合した」、「融合した」、及びその文法的変化形は、互換的に使用され、第２の部位、例えば、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に共有結合的にまたは非共有結合的にそれぞれ接続された第１の部位、例えば、第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第１の部位は、第２の部位に直接的に結合または並置され得、または代替的に介在部位は、第１の部位を第２の部位に共有結合させ得る。用語「連結した」は、第２の部位へのＣ末端またはＮ末端での第１の部位の融合を意味するだけでなく、第２の部位（または第１の部位、それぞれ）における任意の２つの箇所、例えば、アミノ酸への第１の部位（または第２の部位）全体の挿入が含まれる。いくつかの態様では、第１の部位は、ペプチド結合またはリンカーによって第２の部位に連結される。第１の部位は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２の部位に連結され得る。リンカーは、ペプチドまたはポリペプチド（ポリペプチド鎖の場合）またはヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖の場合）または任意の化学的部位（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド鎖または任意の化学的分子の場合）であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的組成物」は、１つ以上の他の化学的成分、例えば、薬学的に許容可能な担体及び賦形剤と混合もしくは混和された、または懸濁された本明細書に記載の化合物の１つ以上、例えば、本開示のＣＡＲもしくはＣＡＲを発現する細胞、または本開示のＣＡＲを発現しかつｃ－Ｊｕｎを過剰発現する細胞を指す。薬学的組成物の１つの目的は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを発現しかつｃ－Ｊｕｎを過剰発現する細胞の調製物の対象への投与を容易化することである。
用語「賦形剤」及び「担体」は、互換的に使用され、化合物、例えば、本開示のＣＡＲまたはＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及び所定の態様では、切断型ＥＧＦＲを発現するように操作された細胞の投与をさらに容易化するために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。
用語「薬学的に許容可能な担体」、「薬学的に許容可能な賦形剤」、及びその文法的変化形は、ヒトを含む動物において使用するための米国連邦政府の規制機関によって承認されたまたは米国薬局方に列挙された薬剤のいずれか、ならびに対象への組成物の投与を禁止する程度まで望ましくない生理学的作用の生成を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性及び特性を無効化しない任意の担体または希釈剤を包含する。薬学的組成物の調製において有用であり、通常は安全であり、非毒性であり、所望である賦形剤及び担体が含まれる。
用語「対象」、「患者」、「個体」、及び「宿主」、ならびにその変化形は、本明細書で互換的に使用され、限定されないが、ヒト、診断、処置、または療法が所望である飼い慣らされた動物（例えば、イヌ、ネコ等）、牧場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）、特にヒトを含む任意の哺乳動物対象を指す。本明細書に記載の方法は、ヒト療法及び獣医学的用途の両方に適用可能である。
本明細書で使用される場合、語句「それを必要とする対象」には、例えば、本明細書に記載の疾患または障害（例えば、がん）と関連する１つ以上の症状を改善するために、本明細書に記載の組成物（例えば、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）の投与から利益を受けるであろう哺乳動物対象等の対象が含まれる。
用語「処置する」、「処置」、または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、例えば、疾患または病態の重症度の減少、疾患経過の継続期間の減少、疾患または病態に関連する１つ以上の症状の改善または排除、疾患または病態を有する対象への有益な効果の提供（必ずしも疾患または病態の治癒を伴わない）を指す。その用語にはまた、疾患もしくは病態またはその症状の予防または防止が含まれる。いくつかの態様では、用語「処置すること」または「処置」は、抗原に対する対象における免疫反応を誘導することを意味する。
用語「防止する」、「防止すること」、及びその変化形は、本明細書で使用される場合、疾患、障害及び／または病態の開始を部分的または完全に遅延させること、特定の疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状、特徴、または臨床的兆候の開始を部分的または完全に遅延させること、特定の疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状、特徴、または兆候の開始を部分的または完全に遅延させること、特定の疾患、障害及び／または病態から進行を部分的または完全に遅延させること、及び／または疾患、障害、及び／または病態に関連する病理を発達させるリスクを低下させることを指す。いくつかの態様では、アウトカムを防止することは、予防処置を介して達成される。
本明細書で使用される場合、用語「治療的有効量」は、所望の治療効果、薬理学的及び／または生理学的効果を必要とする対象に対して、それをもたらすのに十分な本開示の組成物（例えば、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む試薬または薬学的化合物の量である。
治療的有効量は、予防が療法としてみなされ得る場合、「予防的有効量」であり得る。本明細書で使用される場合、「予防」は、疾患または病態の開始を防止するために、または疾患または病態に関連する症状を防止または遅延させるために使用される処置または作用の過程を指す。本明細書で使用される場合、「予防」は、健康を維持するために及び疾患または病態の開始を防止するために、または疾患または病態に関連する症状を防止または遅延させるために取られる手段を指す。
ＲＯＲ１
本開示から明らかなように、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＲＯＲ１に特異的に結合するキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者の約５７％及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌患者の４２％で過剰発現されており（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ２０１７）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞にとって非常に魅力的な標的を意味する。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１陽性（ＲＯＲ１＋）固形腫瘍は、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で安全に標的化され得る（Ｓｐｅｃｈｔ ２０２０）が、固形腫瘍の悪性腫瘍患者では、ＣＡＲ Ｔ細胞が注入後に疲弊または機能不全を示すため、有効性は一部制限されている。さらに、固形腫瘍は、ＣＡＲ Ｔ細胞等の免疫療法の抗腫瘍活性を制限する免疫抑制バリアを有する（Ｎｅｗｉｃｋ ２０１６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ２０１８、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ２０１９）。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質を発現する細胞は、転写因子ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように修飾されており、当該技術分野で利用可能な他の抗ＲＯＲ１細胞と比較して、疲弊に対してより耐性があり、改善されたエフェクター機能を示す。
いくつかの態様では、本開示のＣＡＲ、すなわち、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、腫瘍抗原、例えば、チロシンプロテインキナーゼ等のプロテインキナーゼ上のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＳｃＦｖ）を含む抗原結合ドメインを含む。
いくつかの態様では、腫瘍抗原は、神経栄養チロシナーゼキナーゼ受容体関連１（ＮＴＲＫＲ１）としても知られているチロシン－プロテインキナーゼ膜貫通受容体「ＲＯＲ１」である。ヒトアミノ酸及び核酸配列は、公共データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔで見ることができる。例えば、ヒトＲＯＲ１のアイソフォーム１及び２前駆体のアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００５００３．２及びＮＰ＿００１０７７０６１．１でそれぞれ見ることができ、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００５０１２．３及びＮＭ＿００１０８３５９２．１でそれぞれ見ることができる。本明細書で使用される場合、「ＲＯＲ１」には、全長野生型ＲＯＲ１の変異、例えば、点変異、断片、挿入、欠失及びスプライスバリアントを含むタンパク質が含まれる。いくつかの態様では、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。いくつかの態様では、ＲＯＲ１タンパク質は、がん細胞に発現する。
ＲＯＲ１は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）ファミリーのメンバーである。ヒトにおいて、ＲＯＲ１は、ＲＯＲ１遺伝子によってコードされる。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、中枢神経系における成長を調節する受容体チロシンキナーゼであり、がん細胞の転移において役割を有する。ＲＯＲ１は、有意な触媒活性を欠く偽キナーゼと考えられ、非標準的Ｗｎｔシグナル伝達経路と相互作用する。ＲＯＲ１の発現の増加は、がん、例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病と関連する。ＲＯＲ１は、循環腫瘍細胞において高度に発現し、膵臓癌細胞の浸潤を促進する（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｒｅｐ．１８：５０８７－５０９４）。ＲＯＲ１はまた、卵巣癌におけるその役割と同様に、子宮内膜癌において腫瘍進行を促進するために現れる（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１４８：５７６－５８４）。ＲＯＲ１は、上皮腫瘍において発現し（例えば、複数の上皮癌の組織構造で高度に発現し）、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌、及び肺癌のサブセットで均一に発現する（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｌｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３：３０６１－３０７１）。ＲＯＲ１発現はまた、結腸直腸癌患者におけるリンパ節転移に正に関連する（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８：３２８６４－３２８７２）。以前のＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ及びＡＤＣの試験からの臨床データでは、非ヒト霊長類におけるｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙも重大な毒性も報告されていない。さらに、本明細書で実証されるように、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で抗腫瘍効果を示す。具体的には、慢性刺激（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）後に、サイトカイン産生の改善、細胞傷害性の延長、及び疲弊関連遺伝子発現プロファイルの減少が観察され、ＮＳＣＬＣマウス異種移植モデルにおいては、抗腫瘍効果の改善が示された。
ｃ－Ｊｕｎ
本明細書に記載のとおり、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、キメラ結合タンパク質、例えば、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む）は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする追加のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ポリシストロン性ポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドは、ｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲならびにいくつかの態様では、１つ以上の追加のタンパク質（例えば、ＥＧＦＲｔ等の安全スイッチタンパク質）を含む複数のタンパク質をコードする。所定の態様では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及びＲＯＲ１結合タンパク質を含むキメラポリペプチド（例えば、キメラ結合タンパク質）をコードする。いくつかの態様では、そのようなキメラポリペプチドは、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及びＲＯＲ１結合タンパク質が翻訳後に別個の機能タンパク質へと切断されるように、切断可能なリンカーを含み得る。
ヒトでは、ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、１番染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００１．１１のヌクレオチド５８，７８０，７９１～５８，７８４，０４７、マイナス鎖方向）に位置するＪＵＮ遺伝子によってコードされる。ＪＵＮ遺伝子及びそのコードされたタンパク質の同義語は既知であり、「Ｊｕｎがん原遺伝子、ＡＰ－１転写因子サブユニット」、「ｖ－Ｊｕｎ鳥肉腫ウイルス１７がん遺伝子ホモログ」、「転写因子ＡＰ－１」、「Ｊｕｎがん遺伝子」、「ＡＰ－１」、「Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質」、「ｐ３９」、及び「エンハンサー結合タンパク質ＡＰ１」を含む。野生型ヒトｃ－Ｊｕｎタンパク質配列は、３３１アミノ酸長である。野生型ヒトｃ－Ｊｕｎのアミノ酸配列及び核酸配列を、それぞれ表１及び表２に示す。
野生型ヒトｃ－Ｊｕｎ（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｐ０５４１２－１）タンパク質配列は、３３１アミノ酸長（配列番号１）である。アミノ酸配列及び核酸配列を、それぞれ表１及び表２に示す。
Figure 2024510898000001
Figure 2024510898000002
Figure 2024510898000003
代替的に、本開示に有用なｃ－Ｊｕｎは、変異ｃ－Ｊｕｎが機能不全の（疲弊した）Ｔ細胞をレスキューする能力に影響を与えない限り、変異ヒトｃ－Ｊｕｎであり得る。いくつかの態様では、変異ｃ－Ｊｕｎは、野生型ｃ－ＪｕｎのＣ末端のアミノ酸残基（例えば、Ｃ末端の５０、７５、１００、１５０、２００、もしくは２５０個以上の残基）、Ｃ末端部分（例えば、４分の１、３分の１、もしくは半分）またはＣ末端ドメイン（例えば、イプシロン、ｂＺＩＰ、及びそのアミノ酸のＣ末端）と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含む。いくつかの態様では、野生型ｃ－ＪｕｎのＮ末端のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端の５０、７５、１００、もしくは１５０個以上）、Ｎ末端部分（例えば、４分の１、３分の１、もしくは半分）、またはＮ末端ドメイン（例えば、デルタ、トランス活性化ドメイン、及びそのアミノ酸のＮ末端）が欠失、突然変異、またはその他の方法で不活性化される。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎは、そのトランス活性化ドメイン及び／またはそのデルタドメインに不活性化変異（例えば、置換、欠失、または挿入）を含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎは、Ｓ６３Ａ及びＳ７３Ａ変異の一方または両方を含む（これらの位置は上記では二重下線が引かれている）。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎは、野生型ヒトｃ－Ｊｕｎと比較して、残基２と１０２の間、または残基３０と５０の間に欠失を有する。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれるＷＯ２０１９／１１８９０２に開示されている切断型ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、配列番号１に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。所定の態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列は、当該技術分野で知られている任意の方法を使用してコドン最適化され得る。例えば、その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国公開第２０１１／００８１７０８Ａ１号、第２０１４／０２４４２２８Ａ１号、及び第２０１９／０３２５９８９Ａ１号を参照されたい。例えば、所定の態様では、本明細書に開示されるｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列のコドンは、野生型ヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２）と比較して、以下のパラメータのうちの１つ以上を修飾（例えば、増大または低減）するように最適化されている：（ｉ）コドン適応指数（すなわち、コドン使用バイアス）、（ｉｉ）グアニン－シトシン（ＧＣ）ヌクレオチド含量、及び（ｉｉｉ）それらの組み合わせ。
いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの態様では、そのようなコドン最適化は、ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現を増加させることができる。したがって、いくつかの態様では、本開示のコドン最適化されたｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列は、細胞にトランスフェクションされた場合、野生型ヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２）でトランスフェクションされた細胞における対応する発現と比較して、コードされたｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を増加させることが可能である。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）内で過剰発現され場合、細胞の疲弊を防止及び／または低減することが可能である。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する細胞は、耐疲弊性であり、それによって養子細胞療法（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法）の進歩に対する大きな障壁に対処する。所定の態様では、耐疲弊性は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない対応する細胞）と比較して、少なくとも約０．０１倍、少なくとも約０．０２倍、少なくとも約０．０３倍、少なくとも約０．０４倍、少なくとも約０．０５倍、少なくとも約０．０６倍、少なくとも約０．０７倍、少なくとも約０．０８倍、少なくとも約０．０９倍、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．２倍、少なくとも約０．３倍、少なくとも約０．４倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。いくつかの態様では、疲弊した細胞（例えば、免疫細胞）におけるｃ－Ｊｕｎポリペプチドの過剰発現により、疲弊は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現が増加するように修飾されなかった対応する疲弊細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下し得る。
免疫細胞、例えば、Ｔ細胞におけるｃ－Ｊｕｎの過剰発現は、例えば、Ｔ細胞機能不全（例えば、Ｔ細胞の疲弊）を緩和または防止することによって、細胞の活性状態を維持するのに役立つ。本操作された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、ＲＯＲ１を担持する腫瘍細胞に対して持続的で強力な細胞傷害性を示す。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しないＴ細胞と比較して、本操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の疲弊の兆候が少なく、持続すること及びより長く機能することができるエフェクター細胞の兆候が増加している。
本明細書で使用される場合、用語「過剰発現」もしくは「過剰発現する」（またはその文法的変形）は、参照細胞と比較して増加した発現（遺伝子レベル及び／またはタンパク質レベルで）を指す。本開示から明らかなように、いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように修飾されていない対応する細胞（例えば、自然界に存在する対応するＴ細胞）と比較して、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように修飾されている。いくつかの態様では、対応する細胞と比較して、本開示の細胞では、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現が増加する。いくつかの態様では、対応する細胞と比較して、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように細胞を修飾する例示的な方法は、本開示の他の箇所に提供されている。
所定の態様では、本明細書に記載の操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＴＮＦＲＳＦ９、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）、及びＣＤ３９が挙げられるがこれらに限定されない１つ以上の疲弊マーカーの発現が低下している。そのようなマーカー（例えば、疲弊マーカー）の発現は、バルク集団において、フローサイトメトリーによって、バルクＲＮＡｓｅｑトランスクリプトーム分析を使用して測定することができるか、または所定の態様では、個別細胞トランスクリプトーム分析が、シングルセルＲＮＡｓｅｑを使用して行われ得る。所定の態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞における１つ以上のマーカー（例えば、疲弊マーカー）の発現は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように操作されていない対応する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、または少なくとも約１００倍以上低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）における１つ以上のマーカー（例えば、疲弊マーカー）の発現は、参照細胞の対応する発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。
所定の態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、本明細書に記載のもの）におけるＴＩＧＩＴの発現は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように操作されていない対応する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、または少なくとも約１００倍以上低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）におけるＴＩＧＩＴの発現は、参照細胞の対応する発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。
所定の態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、本明細書に記載のもの）におけるＰＤ－１の発現は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように操作されていない対応する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、または少なくとも約１００倍以上低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）におけるＰＤ－１の発現は、参照細胞の対応する発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。
所定の態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、本明細書に記載のもの）におけるＣＤ３９の発現は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように操作されていない対応する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、または少なくとも約１００倍以上低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）におけるＣＤ３９の発現は、参照細胞の対応する発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。
いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）におけるＴＮＦＲＳＦ９の発現は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように操作されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、または少なくとも約１００倍以上低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）におけるＴＮＦＲＳＦ９の発現は、参照細胞の対応する発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。
いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）におけるＧＺＭＡの発現は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように操作されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、または少なくとも約１００倍以上低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）におけるＧＺＭＡの発現は、参照細胞の対応する発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。
いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞の集団（例えば、ＣＡＲ、切断型ＥＧＦＲｔ、及びｃ－Ｊｕｎポリペプチドの過剰発現を含むように修飾されたもの）は、抗原刺激後に、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞を含む。いくつかの態様では、抗原刺激後の集団に存在するＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞の数は、参照集団と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％減少する。いくつかの態様では、免疫細胞の集団は、抗原刺激後に、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、または約５％未満のＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞を含む。所定の態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、１４日間の持続抗原刺激後に、わずか約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％のＴＩＧＩＴ陽性細胞を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、１４日間の持続抗原刺激後に、わずか約５％～１０％、約５％～１５％、約８％～１２％、または約８％～１５％のＴＩＧＩＴ陽性細胞を有する。これに関して、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞等の操作されたＴ細胞の集団内のＴＩＧＩＴ陽性細胞％は、フローサイトメトリーを使用して測定され得る。
所定の態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、約１４日間の持続刺激後に、わずか約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％のＰＤ１陽性細胞を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、１４日間の持続抗原刺激後に、わずか約２％～５％のＰＤ１陽性細胞を有する。これに関して、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＣＡＲ＋ｃ－Ｊｕｎ＋Ｔ細胞の集団内のＰＤ１陽性細胞％は、フローサイトメトリー等の当該技術分野で知られている方法を使用して測定され得る。
所定の態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、１４日間の持続刺激後に、わずか約２０％～６０％のＣＤ３９陽性細胞を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、１４日間の持続刺激後に、わずか約２０％～４０％または２５％～４５％または３０％～４０％のＣＤ３９陽性細胞を有する。ＣＡＲ＋ｃ－Ｊｕｎ＋Ｔ細胞の集団内のＣＤ３９陽性細胞パーセントは、フローサイトメトリー等の当該技術分野で知られている方法を使用して測定され得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞の集団（例えば、ＣＡＲ、切断型ＥＧＦＲｔ、及びｃ－Ｊｕｎポリペプチドの過剰発現を含むように修飾されたもの）は、抗原刺激後に、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞を含む。いくつかの態様では、抗原刺激後の集団に存在するＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞の数は、参照集団と比較して、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％減少する。いくつかの態様では、免疫細胞の集団は、抗原刺激後に、約５％未満、約４．５％未満、約４％未満、約３．５％未満、または約２％未満のＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞の集団（例えば、ＣＡＲ、切断型ＥＧＦＲｔ、及びｃ－Ｊｕｎポリペプチドの過剰発現を含むように修飾されたもの）は、抗原刺激後に、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＧＺＭＡ陽性免疫細胞を含む。いくつかの態様では、抗原刺激後の集団に存在するＧＺＭＡ陽性免疫細胞の数は、参照集団と比較して、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約２０％減少する。いくつかの態様では、免疫細胞の集団は、抗原刺激後に、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、または約１０％未満のＧＺＭＡ陽性免疫細胞を含む。
所定の態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しないＴ細胞の対照集団と比較して、ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、及び／またはＴＮＦαを、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１２５倍、または少なくとも約１５０倍分泌する。所定の態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない操作されたＴ細胞の対照集団と比較して、Ｅ：Ｔ比１：１、１：５、１：１０及び／または１：２０での持続抗原刺激の０日目及び／または１４日目に、ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、及び／またはＴＮＦαを、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍発現する。サイトカイン分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＭＳＤ分析等の当該技術分野で知られている方法を使用して測定され得る。
所定の態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない操作されたＴ細胞の対照集団と比較して、例えば、曲線下面積（ＡＵＣ）によって定量化して、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、または少なくとも約２５０倍以上の殺傷効率を示す。
所定の態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない操作されたＴ細胞の対照集団と比較して、抗原に応答して、少なくとも１．５倍もしくは少なくとも約１．５倍、少なくとも２倍もしくは少なくとも約２倍、少なくとも２．５倍もしくは少なくとも約２．５倍、少なくとも３倍もしくは少なくとも約３倍、少なくとも３．５倍もしくは少なくとも約３．５倍、少なくとも４倍もしくは少なくとも約４倍、少なくとも５倍もしくは少なくとも約５倍、少なくとも８倍もしくは少なくとも約８倍、少なくとも１０倍もしくは少なくとも約１０倍、少なくとも１５倍もしくは少なくとも約１５倍、少なくとも２０倍もしくは少なくとも約２０倍、少なくとも２５倍もしくは少なくとも約２５倍、少なくとも３０倍もしくは少なくとも約３０倍、少なくとも５０倍もしくは少なくとも約５０倍、７５倍もしくは少なくとも約７５倍、少なくとも１００倍もしくは少なくとも約１００倍、少なくとも１２５倍もしくは少なくとも約１２５倍、少なくとも１５０倍もしくは少なくとも約１５０倍、少なくとも２００倍もしくは少なくとも約２００倍、少なくとも２２５倍もしくは少なくとも約２２５倍、少なくとも２５０倍もしくは少なくとも約２５０倍、少なくとも３００倍もしくは少なくとも約３００倍、少なくとも４００倍もしくは少なくとも約４００倍、または少なくとも５００倍もしくは少なくとも約５００倍以上の増殖を示す。抗原誘導性の増殖は、本明細書に記載のもの等、当該技術分野で知られている増殖アッセイを使用して調べることができる。
本明細書に記載の細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）の１つ以上の特性、例えば、疲弊、細胞表現型、持続性、細胞傷害性及び／または殺傷、増殖、サイトカイン放出、及び遺伝子発現プロファイルを測定するために有用なアッセイは、当該技術分野で知られており、これらとしては、例えば、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＩｎｃｕＣｙｔｅ免疫細胞殺傷分析、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）または同様のアッセイ、持続抗原刺激アッセイ、順次抗原刺激アッセイ（持続抗原刺激アッセイと同様であるが、各再刺激回でＥ：Ｔ細胞比をリセットしない）、バルク及びシングルセルＲＮＡｓｅｑ（例えば、Ｆｒｏｎ Ｇｅｎｅｔ．２０２０；１１：２２０、２０１９ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３５：ｉ４３６－４４５、２０１９ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｄａｔａ Ｓｃｉ．２：１３９－１７３を参照されたい）、細胞傷害性／殺傷アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットならびに他の標準的な分子及び細胞生物学方法、例えば、本明細書に記載のものまたは例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙもしくはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９－２０２１）もしくはその他に記載のものが挙げられる。
ＥＧＦＲｔ
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、キメラ結合タンパク質、例えば、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む）はさらに、切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、所定の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、（ｉｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）、及び（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｔを含むキメラポリペプチド（例えば、キメラ結合タンパク質）をコードする。
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥＧＦファミリーのリガンドに結合する受容体チロシンキナーゼであり、いくつかのシグナル伝達カスケードを活性化して細胞外のキュー（ｃｕｅ）を適切な細胞応答に変換する。本明細書で使用される場合、「切断型上皮成長因子受容体」または「ＥＧＦＲｔ」は、全長ＥＧＦＲタンパク質の部分配列のみを含む（例えば、配列番号３）。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩ及びＩＶならびにＥＧＦＲの膜貫通ドメインを含むが、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩ及びＩＩならびにＥＧＦＲの細胞内配列を欠いている。
いくつかの態様では、本明細書に記載のＥＧＦＲｔは、膜近傍ドメインをさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「膜近傍ドメイン」は、膜貫通ドメインのすぐＣ末端にある細胞表面タンパク質（例えば、ＥＧＦＲ）の細胞内部分を指す。いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの態様では、膜近傍ドメインの追加により、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現が増加し得る。したがって、いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインの最初の３つのアミノ酸を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ、ＥＧＦＲドメインＩ、膜貫通ドメイン、及びアミノ酸Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇを含む（配列番号３、表３を参照されたい）。
Figure 2024510898000004
本開示から明らかなように、ＥＧＦＲｔをコードするヌクレオチド配列を含めることは、本開示のポリヌクレオチド（例えば、キメラ結合タンパク質、例えば、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む）に所定の利益を提供する。
いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、キルスイッチとして機能し得る。いくつかの態様では、操作された細胞（例えば、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）が体内で不要になった場合、薬学的グレードの抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、またはネシツムマブを患者に投与することにより、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、及び／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を通じて、操作された細胞を除去することができる。
いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、配列番号３に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。所定の態様では、ＥＧＦＲｔは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。
スペーサー
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、キメラ結合タンパク質、例えば、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む）は、スペーサーをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。用語「スペーサー」は、本明細書で使用される場合、間隔が空けられた２つの部位：例えば、キメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）の抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインを共に共有結合させることが可能なポリペプチド配列を指す。いくつかの態様では、本明細書に開示されるキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分と膜貫通ドメインとの間にスペーサーを含む。
いくつかの態様では、スペーサーは、免疫グロブリンに由来する（例えば、ヒンジ領域またはループ領域に由来する）。所定の態様では、これらのスペーサーは、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのヒンジ領域、その断片（単独もしくは追加の配列、例えば、ＣＨ１もしくはＣＨ２領域配列によってキャップされている）、またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのヒンジ領域からの断片の組み合わせを含む。いくつかの態様では、スペーサーは、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭの定常ドメインループ領域、その断片（単独もしくは例えば、隣接するβ鎖からの追加の配列によってキャップされている）、またはＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのループ領域からの断片の組み合わせを含む。いくつかの態様では、本開示のスペーサーは、ヒンジ領域由来配列、ループ領域由来配列、またはそれらの組み合わせを含む。
したがって、いくつかの態様では、本開示は、キメラポリペプチド（例えば、キメラ結合タンパク質、例えば、ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを提供し、ＣＡＲは、（ｉ）抗原結合ドメイン（例えば、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ）、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）細胞内ドメインを含む。所定の態様では、本明細書のポリヌクレオチドはさらに、（ｉｖ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及び（ｖ）ＥＧＦＲｔペプチドをコードする。所定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドはまた、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域及び／またはループ領域に由来するアミノ酸配列、及び任意にリンカー（例えば、ｇｌｙ－ｓｅｒリッチリンカー）を含む１つ以上のスペーサーをコードし、スペーサーは抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。いくつかの態様では、本開示は、本開示のＣＡＲをコードする導入遺伝子を含む組換え核酸コンストラクトを提供する。本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列またはベクターのうちの１つ以上によってコードされるＣＡＲを提供する。いくつかの態様では、本開示のＣＡＲは、標準的ＣＡＲ、スプリットＣＡＲ、オフスイッチＣＡＲ、オンスイッチＣＡＲ、第一世代ＣＡＲ、第二世代ＣＡＲ、第三世代ＣＡＲ、第四世代ＣＡＲ、または第五世代ＣＡＲとして設計される。
用語「本開示のスペーサー」及び「Ｉｇ由来スペーサー」は、（ｉ）「ヒンジ領域由来スペーサー」、すなわち、ヒト免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＣＨ１及びＣＨ２定常ドメインの間に位置するヒンジ領域に由来するアミノ酸配列、及び任意に隣接するＣＨ１及び／またはＣＨ２ドメインからの１つ以上のアミノ酸、またはそれらの組み合わせ（例えば、いくつかの連結されたヒンジ領域由来スペーサー）を含むスペーサー、（ｉｉ）「ループ領域由来スペーサー」、すなわち、ヒト免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの定常ドメインのループ領域に由来するアミノ酸配列、及び任意に隣接するβ鎖からの１つ以上のアミノ酸、またはそれらの組み合わせ（例えば、いくつかの連結されたループ領域由来スペーサー）を含むスペーサー、または、
（ｉｉｉ）それらの組み合わせ（例えば、２つ以上の連結されたヒンジ領域由来スペーサー及びループ領域由来スペーサー）を指すために互換的に使用される。
いくつかの態様では、本開示のスペーサーという用語は、ヒトＩｇＡ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６、ＩＧＨＡ１＿ヒト、免疫グロブリン重定常アルファ１、配列番号５）、ヒトＩｇＡ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８７７、ＩＧＨＡ２＿ヒト、免疫グロブリン重定常アルファ２、配列番号６）、ネズミＩｇＧ２Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１６６５、ＧＣＡＭ＿マウス、免疫グロブリンガンマ２Ａ鎖Ｃ領域、配列番号７）、ヒトＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７、ＩＧＨＧ１＿ヒト、免疫グロブリン重定常ガンマ１、配列番号８）、ヒトＩｇＧ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９、ＩＧＨＧ２＿ヒト、免疫グロブリン重定常ガンマ２、配列番号９）、ヒトＩｇＧ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０、ＩＧＨＧ３＿ヒト、免疫グロブリン重定常ガンマ３、配列番号１０）、ヒトＩｇＧ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６１、ＩＧＨＧ４、免疫グロブリン重定常ガンマ４、配列番号１１）、ヒトＩｇＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８８０、ＩＧＨＤ＿ヒト、免疫グロブリン重定常デルタ、配列番号１２）、ヒトＩｇＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５４、ＩＧＨＥ＿ヒト、免疫グロブリン重定常鎖イプシロン、配列番号１３）、またはＩｇＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８７１、ＩＧＨＭ＿ヒト、免疫グロブリン重定常ミュー、配列番号１４）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖のサブ配列であって、サブ配列は、ＣＨ１－ＣＨ２ヒンジ領域またはその一部を含む、サブ配列を指す。いくつかの態様では、サブ配列は、ＣＨ１及び／またはＣＨ２定常ドメインの隣接部分をさらに含む。
いくつかの態様では、本開示のスペーサーという用語は、ヒトＩｇＡ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６、ＩＧＨＡ１＿ヒト、免疫グロブリン重定常アルファ１、配列番号５）、ヒトＩｇＡ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８７７、ＩＧＨＡ２＿ヒト、免疫グロブリン重定常アルファ２、配列番号６）、ネズミＩｇＧ２Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１６６５、ＧＣＡＭ＿マウス、免疫グロブリンガンマ２Ａ鎖Ｃ領域、配列番号７）、ヒトＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７、ＩＧＨＧ１＿ヒト、免疫グロブリン重定常ガンマ１、配列番号８）、ヒトＩｇＧ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９、ＩＧＨＧ２＿ヒト、免疫グロブリン重定常ガンマ２、配列番号９）、ヒトＩｇＧ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０、ＩＧＨＧ３＿ヒト、免疫グロブリン重定常ガンマ３、配列番号１０）、ヒトＩｇＧ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６１、ＩＧＨＧ４、免疫グロブリン重定常ガンマ４、配列番号１１）、ヒトＩｇＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８８０、ＩＧＨＤ＿ヒト、免疫グロブリン重定常デルタ、配列番号１２）、ヒトＩｇＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５４、ＩＧＨＥ＿ヒト、免疫グロブリン重定常鎖イプシロン、配列番号１３）、またはＩｇＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８７１、ＩＧＨＭ＿ヒト、免疫グロブリン重定常ミュー、配列番号１４）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖のサブ配列を指し、サブ配列は、定常ドメインまたはその一部からのループ領域を含む。いくつかの態様では、サブ配列は、β鎖の隣接部分をさらに含む。
いくつかの態様では、本開示のＣＡＲスペーサーは、ＩｇＧ２のヒンジ、例えば、マウスＩｇＧ２Ａのヒンジ由来ＣＡＲスペーサー、例えば、スペーサー１、例えば、ＫＰＣＰＰＣＫＣＰ（配列番号１５）の配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
いくつかの態様では、本開示のスペーサーは、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、本開示のＣＡＲスペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を除き、配列番号１５に記載の配列のうちのいずれか１つと同一の配列を含む。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を含む。
いくつかの態様では、本開示のスペーサーは配列番号１５に記載の配列を含み、スペーサー配列は、任意のフレキシブルリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧ（配列番号１６）のリンカー）をさらに含む。よって、いくつかの態様では、本開示のスペーサーは、スペーサー配列（例えば、配列番号１５）及び任意のＣ末端またはＮ末端フレキシブルリンカーを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される任意のフレキシブルリンカー（例えば、ｇｌｙ／ｓｅｒリッチリンカー）は、スペーサーのＣ末端及び／またはＮ末端に付加され得る。
したがって、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、（ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質、（ｉｉ）スペーサー、及び（ｉｉｉ）ＥＧＦＲｔをコードするヌクレオチドを含む、キメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、（ｉ）Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびにＲ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＲＯＲ１結合タンパク質、（ｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むスペーサー、及び（ｉｉｉ）切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするヌクレオチド配列を含むＣＡＲを含む。本開示の他の箇所にさらに記載のとおり、いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合部分のＶＨは、配列番号４４を含み、ＲＯＲ１結合部分のＶＬは、配列番号４８を含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｔは、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
シグナルペプチド
本明細書に記載のとおり、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、キメラ結合タンパク質、例えば、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む）は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列も含む。シグナルペプチドは、コードされたタンパク質の細胞表面発現を促進し、その後、成熟タンパク質から切断され得る。
当該技術分野で知られている任意の適切なシグナルペプチドが本開示で使用され得る。シグナルペプチドの非限定的な例を表４（下記）に示す。所定の態様では、シグナルペプチドは、ヒトＩｇカッパに由来する。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、配列番号１７（ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ）に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。所定の態様では、シグナルペプチドは、配列番号１７（ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ）に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦに由来する。所定の態様では、そのようなシグナルペプチドは、配列番号１８（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ）に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、シグナルペプチドは、配列番号１８（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ）に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、単一のシグナルペプチド（例えば、配列番号１７または１８）を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、複数のシグナルペプチド（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）を含む。所定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、キメラポリペプチド（例えば、キメラ結合タンパク質、例えば、ＣＡＲ）をコードし、ＣＡＲは、（ｉ）抗原結合ドメイン（例えば、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ）、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）細胞内ドメインを含む。所定の態様では、本明細書のポリヌクレオチドはさらに、（ｉｖ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及び（ｖ）ＥＧＦＲｔポリペプチドをコードする。所定の態様では、本明細書のポリヌクレオチドは、１つ以上のシグナルペプチド（例えば、表４に記載のもの）もコードする。






















Figure 2024510898000005
リンカー
いくつかの態様では、本開示のいずれかのＣＡＲスペーサーは、任意のＮ末端リンカー及び／または任意のＣ末端リンカーを含み得る。いくつかの態様では、リンカーは、本明細書に記載のＣＡＲの任意の構成要素を連結することができる。当該技術分野で知られているフレキシブルリンカー配列が任意のリンカーとして使用され得る。いくつかの態様では、任意のリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍ（配列番号２１）（式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００の任意の整数である）に従うグリシン／セリンリンカーである。いくつかの態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－（Ｓｅｒ）ｙ］ｚ（配列番号２２）（式中、ｘは、１～４の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、１～５０の整数である）に従う。いくつかの態様では、任意のリンカーは、配列（Ｇ）ｎ（配列番号２３）（式中、ｎは、１～１００の整数であり得る）を含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎ（配列番号２４）（式中、ｎは、１～１００の整数である）を含み得る。
いくつかの態様では、任意のリンカーの配列は、ＧＧＧＧ（配列番号２５）である。いくつかの態様では、任意のリンカーの配列は、ＧＧＧＳＧ（配列番号２６）である。
いくつかの態様では、任意のリンカーは、配列（ＧＧＧＳＧ）ｎ（配列番号２７）を含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２８）を含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは、配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２９）を含み得る。いくつかの態様では、任意のリンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎ（配列番号３０）を含み得る。これらの例では、ｎは、１～１００の整数であり得る。他の例では、ｎは、１～２０、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の整数であり得る。いくつかの態様では、ｎは、１～１００の整数である。
任意のリンカーの例としては、例えば、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３２）、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号３４）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号６３）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３６）が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの態様では、任意のリンカーは、配列ＰＧＧを含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは、グリシン及びセリンに加えて追加のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、任意のリンカーは、１、２、３、４、または５個の非ｇｌｙ／非ｓｅｒアミノ酸を含む。いくつかの態様では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－リンカーは、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも９５％のグリシンまたはセリンアミノ酸を含む。
いくつかの特定の態様では、任意のリンカーは、長さが１～１０のアミノ酸である。いくつかの態様では、任意のリンカーは、長さが約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、または約９０～約１００のアミノ酸である。
いくつかの態様では、リンカーは、切断可能ではないリンカーであるため、リンカーと本明細書で提供されるポリヌクレオチドの異なる成分（例えば、ｃ－Ｊｕｎ及びキメラ結合タンパク質）は、単一のポリペプチドとして発現される。所定の態様では、リンカーは、切断可能なリンカーである。本明細書で使用される場合、用語「切断可能なリンカー」は、発現時に選択的に切断されて２つ以上の生成物を生成し得るような、切断部位を含むリンカーを指す。いくつかの態様では、リンカーは、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、フーリン切断部位、またはそれらの任意の組み合わせから選択される（下記の表５を参照されたい）。いくつかの態様では、リンカーはさらに、ＧＳＧリンカー配列を含む。いくつかの態様では、本開示に有用なリンカーは、第１及び第２の遺伝子によってコードされる別個のポリペプチドが翻訳中に生成されるように、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。本開示で使用され得るリンカーの追加の説明は、例えば、ＷＯ２０２０／２２３６２５Ａ１及びＵＳ２０１９／０２７６８０１Ａ１に提供されており、その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる。
Figure 2024510898000006
いくつかの態様では、リンカーは、Ｐ２Ａリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号３７に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、Ｔ２Ａリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、Ｅ２Ａリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、リンカーは、フーリン切断部位を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む。
抗原結合ドメイン
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）の抗原結合ドメインは、ｌｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆ（ａｂ）’３、Ｆｖ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、イントラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、ユニボディ、またはナノボディを含む。所定の態様では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、当該技術分野で知られている方法に従って調製され得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。ＳｃＦｖ分子は、フレキシブルポリペプチドリンカーを使用してＶＨ及びＶＬ領域を共に連結することによって生成され得る。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／またはアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカー長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折り畳まれ、相互作用するかに大きく影響を及ぼし得る。実際、短いポリペプチドリンカーが用いられる場合（例えば、５～１０アミノ酸）、鎖内の折り畳みが防止される。鎖間折り畳みはまた、２つの可変領域を合わせて機能性エピトープ結合部位を形成するために必要とされる。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、米国特許出願公開番号２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４、及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ｓｃＦｖは、そのＶＬ及びＶＨ領域の間に、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの態様では、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。いくつかの態様では、リンカー配列は、グリシン及びセリンリピートのセット、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎは、１以上の正の整数である）（配列番号４２）を含む。いくつかの態様では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号４３）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３６）、または上で開示される任意のｇｌｙ－ｓｅｒリッチリンカーであり得る。
リンカー長さの変動は、活性を保持または向上させ、活性研究において優れた有効性を発揮し得る。
いくつかの態様では、抗原結合ドメインまたは他の部分またはＣＡＲ全体のアミノ酸配列は、修飾され得、例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列は、例えば、保存的置換によって修飾され得る。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。
例示的な抗ＲＯＲ１ ＣＡＲは、Ｈｕｄｅｃｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９．１２（２０１３）：３１５３－６４（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの態様では、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含む本開示のＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．に記載されているように生成され（例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．３１５５頁、第１段落全体（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されているように）、Ｈｕｄｅｃｅｋに開示されるスペーサーが本開示のＣＡＲスペーサーによって置き換えられる。いくつかの態様では、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲには、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（３１５４－５５にわたって記載の段落）、Ｂａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ４（２０１２）：３４９－６１、及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（２０１１）：ｅ２１０１８（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載の２Ａ２、Ｒ１１、及びＲ１２抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体のＶＨ及び／またはＶＬ配列を含む抗体またはその断片が含まれる。
いくつかの態様では、本開示の抗原結合ドメインは、抗ＲＯＲ１抗体、例えば、Ｒ１２抗体と交差競合することが可能である。Ｒ１２抗体配列が表６に示されている。いくつかの態様では、本開示のために有用な抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体の同じエピトープに結合する。当業者には明らかなように、当該技術分野で知られている任意の抗ＲＯＲ１抗体を本開示で使用することができる。そのような抗体の非限定的な例としては、Ｈｕｄｅｃｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９．１２（２０１３）：３１５３－６４、Ｂａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ４（２０１２）：３４９－６１、及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（２０１１）：ｅ２１０１８、ＵＳ９，３１６，６４６Ｂ２、及びＵＳ９，７５８，５８６Ｂ２（その各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載の２Ａ２及びＲ１１抗体が挙げられる。
Figure 2024510898000007
いくつかの態様では、本開示の抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体のＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗原結合ドメイン、例えば、Ｒ１２ ｓｃＦｖは、Ｒ１２抗体のＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの態様では、Ｒ１２ ｓｃＦｖは、ＩｇＧ２リンカー、例えば、スペーサー１（配列番号１５）、及び任意に配列番号１６のリンカーによって膜貫通ドメインに連結される。
いくつかの態様では、ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分は、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、ＲＯＲ１を標的とする本開示のＣＡＲには、２０１７年９月１２日に発行された米国特許番号ＵＳ９３１６６４６Ｂ２、または２０１６年４月１９日に発行されたＵＳ９７５８５８６Ｂ２（その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されているものを含む、ＲＯＲ１を標的とする抗体またはその断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））が含まれる。
いくつかの態様では、本開示のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ＫＰＣＰＰＣＫＣＰ（配列番号１５）を及び任意に配列番号１６のリンカーを含むＣＡＲスペーサーによって連結されており、抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３、例えば、Ｒ１２抗体のＶＨ及びＶＬを含む。
いくつかの態様では、抗ＲＯＲ１抗原結合抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、生物学的に活性な分子にコンジュゲートまたは融合されて、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞がＲＯＲ１を発現する細胞に反応するように仕向ける本開示のＣＡＲが形成される。
いくつかの態様では、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）には、ＵＣ－９６１（サームツズマブ（Ｃｉｒｍｔｕｚｕｍａｂ））と呼ばれる抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が含まれる。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２２２２６８８を参照されたい。サームツズマブは、がん、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、卵巣癌、及び黒色腫を処置するために使用され得る。例えば、Ｈｏｊｊａｔ－Ｆａｒｓａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．８（４）：ｅ６１１６７及びＮＣＴ０２２２２６８８を参照されたい。
シグナル伝達、膜貫通、共刺激ドメイン
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）の細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するものを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば、２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＢ７－Ｈ３に由来するものをさらに含む。いくつかの態様では、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの態様では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号５３に記載の配列を含む。
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、及びＣＤ１５４からなる群から選択されるものを含む。膜貫通ドメインは、天然または組換え源のいずれかに由来し得る。源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、本開示のＣＡＲが標的に結合したときはいつでも、細胞内ドメイン（複数可）にシグナル伝達することが可能である。
いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＣＤ１９の少なくとも膜貫通領域（複数可）を含み得る。
いくつかの態様では、ＴＭドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ１５２、またはそれらの任意の組み合わせに由来する。いくつかの態様では、ＴＭドメインは、ＣＤ２８に由来する。いくつかの態様では、ＴＭドメインは、配列番号５４に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。所定の態様では、ＴＭドメインは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、共刺激ドメイン、例えば、本明細書に記載の共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。いくつかの態様では、共刺激ドメインは、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、Ｂ７－Ｈ３、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣＡ）、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ－１、ＴＩＬＲ２、ＴＩＬＲ４、ＴＩＬＲ７、ＴＩＬＲ９、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせの共刺激ドメインを含む。
いくつかの態様では、本開示のキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）は、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメイン、ＣＤ３δ活性化ドメイン、ＣＤ３ε活性化ドメイン、ＣＤ３η活性化ドメイン、ＣＤ７９Ａ活性化ドメイン、ＤＡＰ１２活性化ドメイン、ＦＣＥＲ１Ｇ活性化ドメイン、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８活性化ドメイン、ＺＡＰ７０活性化ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む。いくつかの態様では、ＣＤ３ζ活性化ドメインは、配列番号５５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。所定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５５に記載の配列を含む。
いくつかの態様では、本開示のキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）（例えば、ＲＯＲ１を標的とするＣＡＲ）の膜貫通ドメインは、リンカーによってキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）の細胞内ドメインに連結された膜貫通ドメインを含む。
いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの態様では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号５３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。所定の態様では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号５３に記載の配列を含む。
上記の開示から明らかなように、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（５’から３’へ）（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）第１のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）をコードする第２のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第１のシグナルペプチド（例えば、ｈＩｇκ）をコードする第３のヌクレオチド配列、（ｉｖ）抗原結合ドメイン（例えば、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ）をコードする第４のヌクレオチド配列、（ｖ）第２のリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧ、配列番号１６）をコードする第５のヌクレオチド配列、（ｖｉ）スペーサー（例えば、ＩｇＧ２のヒンジ由来スペーサー）をコードする第６のヌクレオチド配列、（ｖｉｉ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８）をコードする第７のヌクレオチド配列、（ｖｉｉｉ）共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）をコードする第８のヌクレオチド配列、（ｉｘ）細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）をコードする第９のヌクレオチド配列、（ｘ）第３のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）をコードする第１０のヌクレオチド配列、（ｘｉ）第２のシグナルペプチド（例えば、ＧＭＣＳＦＲαＳＰ）をコードする第１１のヌクレオチド配列、及び（ｘｉｉ）ＥＧＦＲｔをコードする第１２のヌクレオチド配列を含む。
二重特異的ＣＡＲ
いくつかの態様では、本開示のＣＡＲは、二重特異的ＣＡＲである。したがって、いくつかの態様では、本開示のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも二重特異的ＣＡＲ（例えば、第１の抗原及び第２の抗原を標的とするＣＡＲ）のポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、本開示のＣＡＲの抗原結合ドメインは、二重特異的抗体分子である。二重特異的抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。いくつかの態様では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）にある。いくつかの態様では、第１及び第２のエピトープは、重複する。いくつかの態様では、第１及び第２のエピトープは、重複しない。いくつかの態様では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）にある。
いくつかの態様では、二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列ならびに第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。いくつかの態様では、二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体を含む。いくつかの態様では、二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体、またはその断片及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体、またはその断片を含む。いくつかの態様では、二重特異的抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはその断片及び第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはその断片を含む。
所定の態様では、抗体分子は、多重特異的（例えば、二重特異的または三重特異的）抗体分子である。二重特異的またはヘテロ二量体抗体分子を生成するためのプロトコルは、当該技術分野で知られている。
二重特異的抗体分子の各抗体または抗原結合抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）内で、ＶＨは、ＶＬの上流または下流にあり得る。いくつかの態様では、上流抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流に配置され、下流抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流に配置され、これにより二重特異的抗体分子全体は、配置ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２を有する。いくつかの態様では、上流抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流に配置され、下流抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流に配置され、これにより二重特異的抗体分子全体は、配置ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２を有する。任意に、リンカーは、２つの抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）の間に、例えば、コンストラクトがＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２として配置された場合はＶＬ１とＶＬ２との間に、またはコンストラクトがＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２として配置された場合はＶＨ１とＶＨ２との間に配置される。リンカーは、本明細書に記載されるリンカー、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６、例えば、４（配列番号４３）である）であり得る。通常、２つのｓｃＦｖの間のリンカーは、２つのｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を避けるのに十分な長さとすべきである。任意に、リンカーは、第１のｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨの間に配置される。任意に、リンカーは、第２のｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨの間に配置される。複数のリンカーを有するコンストラクトでは、リンカーの任意の２つ以上は、同じまたは異なり得る。したがって、いくつかの態様では、二重特異的ＣＡＲは、本明細書に記載される配置でＶＬ、ＶＨ、及び任意に１つ以上のリンカーを含む。
いくつかの態様では、抗体分子は、第１の腫瘍抗原（例えば、ＲＯＲ１）上に位置する第１のエピトープ及び第２の抗原、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、またはＣＤ７９ａ上に位置する第２のエピトープを有する二重特異的抗体分子である。いくつかの態様では、二重特異的抗体は、第１のエピトープであって、第１のエピトープは、ＣＤ１９上に位置する、第１のエピトープ、及び第２のエピトープであって、第２のエピトープは、ＣＤ２０上に位置する、第２のエピトープに結合する。いくつかの態様では、二重特異的抗体は、第１のエピトープであって、第１のエピトープは、ＣＤ１９上に位置する、第１のエピトープ、及び第２のエピトープであって、第２のエピトープは、ＣＤ２２上に位置する、第２のエピトープに結合する。いくつかの態様では、二重特異的抗体は、第１のエピトープであって、第１のエピトープは、ＣＤ２０上に位置する、第１のエピトープ、及び第２のエピトープであって、第２のエピトープは、ＣＤ２２上に位置する、第２のエピトープに結合する。所定の態様では、抗体分子は、第１のＢ細胞エピトープに対する第１の結合特異性及び別のＢ細胞抗原に対する第２の結合特異性を有する二重特異的抗体分子である。例えば、いくつかの態様では、二重特異的抗体分子は、第１のＢ細胞エピトープ、例えば、ＲＯＲ１に対する第１の結合特異性、及びＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、またはＣＤ７９ａ Ｂ細胞エピトープのうちの１つ以上に対する第２の結合特異性を有する。
いくつかの態様では、第２の抗原は、ＲＯＲ１、ＨＥＲ２、ＡＦＰ、ＣＤ１９、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ１７１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ２、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１ １Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
誘導性発現コンストラクト
いくつかの態様では、本明細書に記載のＣＡＲ（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔをコードする本明細書におけるポリシストロン性ポリヌクレオチドの発現は、構成的プロモーター、例えば、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターによって制御される。しかしながら、本開示のポリヌクレオチド（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）によってコードされるポリペプチドの発現の制御は、構成的プロモーターの使用に限定されない。
よって、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、ＥＧＦＲｔタンパク質、シグナルペプチド、及び／またはスペーサー）によってコードされるタンパク質の発現は、誘導性である。用語「誘導性」は、「誘導性プロモーター」、すなわち、遺伝子生成物、例えば、本開示のＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、ＥＧＦＲｔをコードするまたは特定するポリヌクレオチドに機能可能に連結された場合に、実質的にプロモーターに対応する誘導因子が細胞に存在する場合にのみ細胞において遺伝子生成物を生成させるヌクレオチド配列の存在を指す。誘導性プロモーターの使用は、機能可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をそのような発現が所望である場合に開始させ、または発現が所望ではない場合に発現を停止させることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの態様では、本開示のＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドは、「組織特異的」プロモーター、すなわち、遺伝子生成物、例えば、本開示のＣＡＲをコードするまたは特定するポリヌクレオチドに機能可能に連結された場合に、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ細胞において遺伝子生成物（複数可）を生成させるヌクレオチド配列を含む。
ベクター
本開示はまた、制御エレメントに機能可能に連結された本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及びＥＧＦＲｔタンパク質をコードするポリヌクレオチド（すなわち、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）を含むベクターを提供する。いくつかの態様では、本開示のＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、ＥＧＦＲｔをコードするポリシストロン性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子である。
いくつかの態様では、ベクターは、トランスファーベクターである。用語「トランスファーベクター」は、単離された核酸（例えば、本開示のポリヌクレオチド）を含み、細胞の内部に単離された核酸を送達するために使用され得る物質の組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当該技術分野で知られている。よって、用語「トランスファーベクター」には、自己複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。その用語はまた、細胞への核酸の移行を容易化する非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えば、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等をさらに含むように解釈されるべきである。ウイルストランスファーベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの態様では、ベクターは、発現ベクターである。用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に機能可能に連結された発現コントロール配列を含む組換えポリヌクレオチド（例えば、本開示のポリペプチド）を含むベクターを指す。いくつかの態様では、発現ベクターは、ポリシストロン発現ベクターである。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、むき出しまたはリポソームに含有される）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野で知られているすべてのものが含まれる。
いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクター、哺乳動物ベクター、または細菌ベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、センダイウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ハイブリッドベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群から選択される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、第三世代アデノウイルスベクターである。ＡＤＥＡＳＹ（商標）は、アデノウイルスベクターコンストラクトを生成するための群を抜いて人気のある方法である。そのシステムは、２つのタイプのプラスミド：シャトル（またはトランスファー）ベクター及びアデノウイルスベクターからなる。対象となる導入遺伝子は、シャトルベクターにクローニングされ、検証され、制限酵素ＰｍｅＩで線状化される。次いでこのコンストラクトは、ＰＡＤＥＡＳＹ（商標）を含有するＢＪ５１８３ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞であるＡＤＥＡＳＩＥＲ－１細胞に形質転換される。ＰＡＤＥＡＳＹ（商標）は、ウイルス生成に必要なアデノウイルス遺伝子を含有する約３３Ｋｂのアデノウイルスプラスミドである。シャトルベクター及びアデノウイルスプラスミドは、アデノウイルスプラスミドへの導入遺伝子の相同組換えを容易化する整合する左及び右の相同アームを有する。標準的なＢＪ５１８３を超らせんＰＡＤＥＡＳＹ（商標）及びシャトルベクターで共形質転換し得るが、この方法は、非組換えアデノウイルスプラスミドのより高いバックグラウンドをもたらす。次いで組換えアデノウイルスプラスミドは、導入遺伝子がアデノウイルスプラスミドに導入されたこと、及び他のパターンの組換えが生じていないことを決定するために、サイズ及び適切な制限消化パターンについて検証される。検証されると、組換えプラスミドは、ＩＴＲによって隣接された線状ｄｓＤＮＡコンストラクトを生成するためにＰａｃＩで線状化される。２９３または９１１細胞は、線状化コンストラクトでトランスフェクションされ、ウイルスは、約７～１０日後に採取され得る。この方法に加えて、本出願が出願されたときに当該技術分野で知られているアデノウイルスベクターコンストラクトを生成するための他の方法は、本明細書に開示される方法を実施するために使用され得る。
いくつかの態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター（例えば、第三または第四世代レンチウイルスベクター）である。用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点でレトロウイルスの中でも独特であり、有意な量の遺伝子情報を宿主細胞のＤＮＡに送達し得るので、遺伝子送達ベクターのうちで最も効率的な方法のうちの１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶはすべて、レンチウイルスの例である。用語「レンチウイルスベクター」は、特にＭｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）で提供される自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。臨床において使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステム等が含まれるがこれらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られているであろう。
レンチウイルスベクターは通常、細胞株が３つの別のプラスミド発現システムでトランスフェクションされる一過性トランスフェクションシステムにおいて生成される。これらには、トランスファーベクタープラスミド（ＨＩＶプロウイルスの一部）、パッケージングプラスミドまたはコンストラクト、及び異なるウイルスの異種エンベロープ遺伝子（ｅｎｖ）を有するプラスミドが含まれる。ベクターの３つのプラスミド成分は、パッケージング細胞に入れられ、これは次いでＨＩＶシェルに挿入される。ベクターのウイルス部分は、ウイルスが細胞システム内で複製することができないように挿入配列を含有する。現在の第三世代レンチウイルスベクターは、９つのＨＩＶ－１タンパク質のうちの３つ（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ）のみをコードし、これらは、複製可能なウイルスの組換え媒介生成を避けるために別のプラスミドから発現する。第四世代レンチウイルスベクターでは、レトロウイルスゲノムは、さらに減少されている（例えば、ＴＡＫＡＲＡ（登録商標）ＬＥＮＴＩ－Ｘ（商標）第四世代パッケージングシステムを参照されたい）。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）配列番号５２を含むＲ１２のｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、（ｉｉｉ）切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするポリヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを含む。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）配列番号５２を含むＲ１２のｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、（ｉｉｉ）切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）、（ｉｖ）膜貫通ドメイン、（ｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン、（ｖｉ）細胞内共刺激シグナル伝達領域をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を含む。いくつかの態様では、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分とＴＭドメインとの間にスペーサーを含む。いくつかの態様では、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、リンカーをさらに含むスペーサーを含む。いくつかの態様では、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ｃ－ＪｕｎポリペプチドとＣＡＲペプチドとの間にリンカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ＣＡＲペプチドとＥＧＦＲｔペプチドとの間にリンカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む。したがって、所定の態様では、本明細書に記載のベクターは、ポリヌクレオチドを含み、これは、（５’から３’へ）（ｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）第１のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）をコードする第２のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）シグナルペプチド（例えば、ｈＩｇκ）をコードする第３のヌクレオチド配列、（ｉｖ）抗原結合ドメイン（例えば、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ）をコードする第４のヌクレオチド配列、（ｖ）第２のリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧ、配列番号１６）をコードする第５のヌクレオチド配列、（ｖｉ）スペーサー（例えば、ＩｇＧ２のヒンジ由来スペーサー）をコードする第６のヌクレオチド配列、（ｖｉｉ）膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８）をコードする第７のヌクレオチド配列、（ｖｉｉｉ）共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）をコードする第８のヌクレオチド配列、（ｉｘ）細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）をコードする第９のヌクレオチド配列、（ｘ）第３のリンカー（例えば、Ｐ２Ａリンカー）をコードする第１０のヌクレオチド配列、（ｘｉ）シグナルペプチド（例えば、ＧＭＣＳＦＲαＳＰ）をコードする第１１のヌクレオチド配列、及び（ｘｉｉ）ＥＧＦＲｔをコードする第１２のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、非ウイルス的方法は、対象の細胞または組織に本開示のＣＡＲ及び他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を送達するために使用され得る。いくつかの態様では、非ウイルス的方法には、トランスポゾンの使用が含まれる。いくつかの態様では、非ウイルス的送達方法の使用は、細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞の再プログラム化、及び対象への細胞の直接的注入を可能とする。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドを含む核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びゲノム編集代替手段、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼ（ＭＮ）を使用することによって標的細胞（例えば、Ｔ細胞）または宿主細胞（例えば、ＣＡＲポリペプチドの組換え発現のための細胞）のゲノムに挿入され得る。
いくつかの態様では、本開示のコンストラクト（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）は、バイシストロンまたはマルチシストロン発現ベクターを使用して細胞において発現され得る。いくつかの態様では、バイシストロンまたはマルチシストロンベクターには、限定されないが、（１）複数のオープンリーディングフレームに融合された複数のプロモーター、（２）オープンリーディングフレーム間のスプライシングシグナルの挿入、発現が単一のプロモーターによって促進されるタンパク質の融合、（３）コンストラクトによって発現されるタンパク質間のタンパク質分解切断部位（自己切断ペプチド、例えば、Ｐ２Ａ）の挿入、及び（ｉｖ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の挿入が含まれる。
いくつかの態様では、本明細書のコンストラクトの複数のタンパク質単位は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で発現され、それにより複数のタンパク質単位を有する単一のポリペプチドを生成し、その少なくとも１つはＣＡＲであり、１つは、本開示のｃ－Ｊｕｎポリペプチドである。いくつかの態様では、高い効率の切断部位を含有するアミノ酸配列またはリンカーが、本明細書に記載の発現コンストラクトによって発現される各タンパク質間に配置される。本明細書で使用される場合、高い切断効率は、翻訳されたタンパク質の５０％超、７０％超、８０％超、または９０％超が切断されるものとして定義される。切断効率は、ウェスタンブロット分析によって測定され得る。
高い効率の切断部位の非限定的な例には、ブタテシオウイルス－１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、ＦＭＤＶ ２Ａ（本明細書でＦ２Ａと略される）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、及びＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）及び軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様では、高い効率の切断部位は、Ｐ２Ａである。高い効率の切断部位は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｉｇｈ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａ ２Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ，Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ａｎｄ Ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（４）：ｅｌ８５５６（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの態様では、Ｐ２Ａは、ブタテシオウイルス－１に由来する自己切断ペプチド配列（アクセッション番号ＱＫＶ２７５４７．１、アミノ酸番号１～２２（配列番号５６））を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、Ｐ２Ａ配列は、組換えを防ぐためにコドン最適化され、コドン分岐される。いくつかの態様では、Ｐ２Ａ配列は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのｃ－Ｊｕｎ及び抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ部分の後に（例えば、Ｃ末端に）配置される。いくつかの態様では、Ｐ２Ａは、ポリペプチドレベルで切断される。
いくつかの態様では、複数のタンパク質が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において発現し、発現は、強力なプロモーターのコントロール下にある。いくつかの態様では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ユビキチンプロモーターを含む。
いくつかの態様では、本開示のベクターは、アクセサリー遺伝子をさらに含む。いくつかの態様では、アクセサリー遺伝子は、非免疫原性選択ツール、追跡マーカー、または自殺遺伝子である。いくつかの態様では、アクセサリー遺伝子は、切断型ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｔ）である。本明細書に記載の態様に従って使用され得る切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）遺伝子の例は、配列番号３を含む。
ポリヌクレオチド修飾
いくつかの態様では、本開示のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。よって、本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの態様では、本開示のＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及び／またはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。いくつかの態様では、ＩＶＴ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写）または化学的合成を使用することによって導入される少なくとも１つのヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ－ＲＮＡ）モノマー、２’－フルオロ－ＤＮＡモノマー、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡモノマー、２’－アミノ－ＤＮＡモノマー、ロック核酸（ＬＮＡ）モノマー、ｃＥｔモノマー、ｃＭＯＥモノマー、５’－Ｍｅ－ＬＮＡモノマー、２’－（３－ヒドロキシ）プロピル－ＲＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’－フルオロ－ＡＮＡモノマー、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）モノマー、インターカレート核酸（ＩＮＡ）モノマー、及び当該ヌクレオチドアナログの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、最適化された核酸分子は、少なくとも１つの骨格修飾、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの態様では、本開示のタンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードするポリヌクレオチドは、末端位置で、例えば、５’及び／または３’末端に対して位置１、２、３でＭ（２’－Ｏ－メチル）、ＭＳ（２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート）、またはＭＳＰ（２’－Ｏ－メチ３’チオＰＡＣＥ、ホスホノアセテート）修飾、またはそれらの組み合わせを導入することによって化学的に修飾され得る。
本開示のｃ－Ｊｕｎ、ＣＡＲ及び／またはＥＧＦＲｔタンパク質をコードする修飾されたポリヌクレオチド（すなわち、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）は、分子の長さ全体にわたって均一に修飾される必要はない。異なるヌクレオチド修飾及び／または骨格構造は、核酸における様々な位置に存在し得る。当業者は、ヌクレオチドアナログまたは他の修飾（複数可）が、核酸の機能が実質的に低下しないように、核酸の任意の位置（複数可）に位置し得ることを理解する。修飾はまた、５’または３’末端修飾であり得る。核酸は、最小で１％及び最大で１００％修飾されたヌクレオチド、または任意の介在パーセンテージ、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％修飾されたヌクレオチドを含有し得る。
いくつかの態様では、本開示のＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及び／またはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）は、エンド及びエキソヌクレアーゼによる急速分解を防止するための修飾を含み得る。修飾には、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、反転結合等）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合等）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または広範なパートナーのレパートリーと塩基対合する塩基、またはコンジュゲーション塩基での置き換え、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位におけるもの）または糖の置き換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置き換えを含む、ヌクレオシド間結合修飾が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書に記載の方法で有用な本開示の修飾された合成ポリヌクレオチド（すなわち、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）の具体的な例には、修飾または非天然ヌクレオシド間結合を含有するポリヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。修飾されたヌクレオシド間結合を有する修飾された合成ポリヌクレオチドには、とりわけ、ヌクレオシド間結合においてリン原子を有しないものが含まれる。いくつかの態様では、修飾された合成ポリヌクレオチドは、そのヌクレオシド間結合（複数可）においてリン原子を有する。
修飾されたヌクレオシド間結合の非限定的な例には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートを含む）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらのＴ－５’結合アナログ、ならびに逆転した極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接対が、３’－５’から５’－３’またはＴ－５’から５’－Ｔに連結されている）が含まれる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
修飾されたヌクレオシド間結合であって、それにリン原子が含まれない、修飾されたヌクレオシド間結合は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されるヌクレオシド間結合を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するもの、ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）は、１つ以上の同義コドン変化を導入することによってコドン最適化され得る。本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」、「コドン最適化された」、及びその文法的変化形は、その翻訳効率を増加させるために同義コドンを置き換えることによる核酸の一次配列の修飾を指す。したがって、コドン最適化は、コードするアミノ酸配列を変化させることなくポリヌクレオチドにおいて使用されるコドンを交換することを含み、これは、「稀な」コドンを除去し、それらを存在量が多いコドンで置き換え、または低いｔＲＮＡリチャージ率を有するコドンを高いｔＲＮＡリチャージ率を有するコドンで除去するので、コドン最適化された遺伝子がコードするタンパク質の存在量を典型的に劇的に増加させる。そのようなコドン最適化は、例えば、（ｉ）組換えタンパク質発現におけるタンパク質収率を改善し、または（ｉｉ）本明細書に開示される結合分子をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡ（そのようなｍＲＮＡまたはＤＮＡは、それを必要とする対象に投与される）の安定性、半減期、または他の所望の特性を改善し得る。
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲまたはＥＧＦＲｔ）のコード配列の１つ以上は、本出願が出願されたときに当該技術分野で知られている任意の方法を使用してコドン最適化され得る。
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）は、配列最適化されている。本明細書で使用される場合、用語「配列最適化された」は、その翻訳効率を増加させる特徴を導入し、その翻訳効率を低下させる特徴を除去し、またはｉｎ ｖｉｖｏでの投与後に発現有効性に関する特性を概して改善するための核酸の配列の修飾を指す。そのような特性には、核酸安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）を改善すること、標的組織における翻訳有効性を増加させること、発現した切断型タンパク質の数を減少させること、発現したタンパク質のフォールディングを改善することもしくはミスフォールディングを防止すること、発現した生成物の毒性を減少させること、発現した生成物によって引き起こされる細胞死を減少させること、またはタンパク質凝集を増加及び／または減少させることが含まれるがこれらに限定されない。
本開示は、コンストラクト全体に対する修飾、例えば、機能的に同等な分子を生成するためのＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、ＥＧＦＲｔコンストラクトの様々なドメインの１つ以上のアミノ酸配列における修飾を企図する。コンストラクトは、本明細書に開示される出発発現コンストラクト（例えば、配列番号５８に示すコンストラクト）の少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を保持するように修飾され得る。本開示はまた、例えば、機能的に同等な分子を生成するためのＣＡＲ、またはｃ－ＪｕｎもしくはＥＧＦＲｔのドメインのコンストラクトの１つ以上のＣＤＲの１つ以上のアミノ酸配列における修飾をもたらすコンストラクトの特定の領域の修飾を企図する。
細胞
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドコンストラクト（すなわち、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）を含む遺伝子修飾された細胞を提供する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎ、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、及びＥＧＦＲｔは、コンストラクトを発現するように遺伝子修飾された細胞によって組換え的に発現され、細胞は、本開示のｃ－Ｊｕｎ、ＣＡＲまたはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチド配列またはベクターの１つ以上を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示される遺伝子修飾された細胞は、本開示のタンパク質構成要素（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードするポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクションされている。用語「トランスフェクションされた」（または同等の用語「形質転換された」及び「形質導入された」）は、外因性核酸、例えば、本開示のタンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードするポリヌクレオチドまたはベクターが、宿主細胞、例えば、Ｔ細胞のゲノムに移行または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクションされた」細胞は、外因性核酸、例えば、本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクション、形質転換または形質導入されたものである。細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞は、細胞における目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の内因性発現を誘導及び／または増大することができる転写活性化因子で修飾されている。本明細書で使用される場合、「転写活性化因子」という用語は、遺伝子または遺伝子セットの転写を（例えば、核酸配列のエンハンサーまたはプロモーター近位エレメントに結合し、それによってその転写を誘導することによって）増加させるタンパク質を指す。本開示で使用され得るそのような転写活性化因子の非限定的な例としては、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ベースの転写活性化因子、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ベースの転写活性化因子、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システムベースの転写活性化因子、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＫａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ６９（２）：１８８－１９７（Ｓｅｐ．２０１４）を参照されたい。
いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムベースの転写活性化因子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）で修飾されている。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＮｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５４：１－１３（Ｍａｙ ２０１４）を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲａは、エンドヌクレアーゼ活性を欠くが、そのガイドＲＮＡ及び標的ＤＮＡ核酸配列に結合する能力を保持する修飾されたＣａｓタンパク質の使用を含むＣＲＩＳＰＲツールの一種である。本開示で使用され得るそのような修飾されたＣａｓタンパク質の非限定的な例は、当該技術分野で知られている。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＰａｎｄｅｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０（１）：１－１４（Ｊａｎ．２０２０）を参照されたい。いくつかの態様では、修飾されたＣａｓタンパク質は、修飾されたＣａｓ９タンパク質（当該技術分野では「ｄＣａｓ９」とも称される）を含む。いくつかの態様では、修飾されたＣａｓタンパク質は、修飾されたＣａｓ１２ａタンパク質を含む。いくつかの態様では、本開示に有用な修飾されたＣａｓタンパク質は、ガイドポリヌクレオチド（例えば、低分子ガイドＲＮＡ）に結合し（「修飾されたＣａｓガイド複合体」）、ガイドポリヌクレオチドは、目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）をコードする核酸配列の領域に相補的である認識配列を含む。いくつかの態様では、ガイドポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする内在性核酸配列のプロモーター領域に相補的な認識配列を含む。いくつかの態様では、１つ以上の転写活性化因子は、修飾されたＣａｓガイド複合体（例えば、修飾されたＣａｓタンパク質のＮ及び／またはＣ末端）に結合され、修飾されたＣａｓガイド複合体が細胞に導入された場合に、１つ以上の転写活性化因子が、核酸配列の制御エレメント（例えば、プロモーター領域）に結合することができ、それによって、コードされたタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現が誘導され、及び／または増加する。いくつかの態様では、１つ以上の転写活性化因子は、内因性遺伝子の制御エレメント（例えば、プロモーター領域）に結合することができ、それによって、コードされたタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現を誘導する及び／または増加させることができる。使用され得る一般的な活性化因子の非限定的な例としては、ＲＮＡＰのオメガサブユニット、ＶＰ１６、ＶＰ６４及びｐ６５が挙げられる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＫａｂａｄｉ ａｎｄ Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ６９：１８８－１９７（２０１４）を参照されたい。
いくつかの態様では、１つ以上の転写リプレッサー（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘドメイン（ＫＲＡＢ））は、修飾されたＣａｓガイド複合体（例えば、修飾されたＣａｓタンパク質のＮ及び／またはＣ末端）に結合され、細胞に導入された場合に、１つ以上の転写リプレッサーが、遺伝子、例えば、ｃ－Ｊｕｎの発現を妨害し得る遺伝子（例えば、Ｂａｃｈ２）の転写を抑制または低減し得る。例えば、その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０００３０３７９Ａ１及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １９：４５９（２０２１）を参照されたい。いくつかの態様では、本開示に有用な修飾されたＣａｓタンパク質は、１つ以上の転写活性化因子及び１つ以上の転写リプレッサーの両方に結合し得る。
いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの態様では、そのような修飾されたＣａｓタンパク質の使用により、目的の遺伝子の条件付き転写及び発現が可能になり得る。例えば、いくつかの態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、プロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ））及びｃ－Ｊｕｎのプロモーター領域を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に連結されたリガンド結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）を含むように修飾される。いくつかの態様では、細胞は、転写活性化因子（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ転写活性化因子（ＶＰＲ））にリンカー（例えば、ＴＥＶ切断可能リンカー）を介して結合した修飾されたＣａｓタンパク質と複合体を形成するＴ細胞の活性化用リンカー（ＬＡＴ）をさらに含むように修飾される。リガンド結合タンパク質が活性化されると、修飾されたＣａｓタンパク質が核局在化のために放出され、ｃ－Ｊｕｎの発現を条件付きかつ可逆的に誘導する。参照により全体として本明細書に組み込まれるＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ９（Ｓｕｐｐｌ２）：Ａ１６４（２０２１）。
当業者には明らかなように、いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞は、複数のアプローチの組み合わせを使用して修飾されている。例えば、いくつかの態様では、細胞は、本明細書に記載の外因性ポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質、ＲＯＲ１結合タンパク質、及びＥＧＦＲｔをコードする）で修飾されている。いくつかの態様では、そのような細胞は、内因性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を増加させることができる外因性転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲα）でさらに修飾される。いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの態様では、そのような組み合わせアプローチは、免疫細胞がさらに高いレベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質発現（例えば、外因性ヌクレオチド配列によってコードされるものと免疫細胞によって内因的に発現されるものの両方）を有するようにし得る。
本開示から明らかなように、本明細書に記載の免疫細胞は、参照細胞（例えば、自然界に存在する対応する細胞）と比較して優れた１つ以上の特性を示す。例えば、いくつかの態様では、参照細胞と比較して、本明細書で提供される免疫細胞
別段の指示がない限り、１つ以上の外因性ヌクレオチド配列及び／または転写活性化因子は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して細胞に導入することができる。１つ以上の外因性ヌクレオチド配列を細胞に送達するための適切な方法の非限定的な例としては、トランスフェクション（形質転換及び形質導入としても知られる）、エレクトロポレーション、非ウイルス送達、ウイルス形質導入、脂質ナノ粒子送達、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、本開示のベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターでトランスフェクションされる。いくつかのそのような態様では、細胞は、本開示のタンパク質を安定的に発現し得る。
いくつかの態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、本開示のタンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクションされる。そのような態様では、細胞は、本開示のタンパク質を一時的に発現し得る。例えば、ＲＮＡコンストラクトは、細胞に直接的にトランスフェクションされ得る。トランスフェクションにおいて使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、３’及び５’非翻訳配列（ＵＴＲ）、５’キャップ及び／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現させる核酸、及びポリＡテール（典型的には長さが５０～２０００塩基）を含有するコンストラクトを生成するために、特別に設計されたプライマーでの鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）と、それに続くポリＡ付加を伴う。そのように生成されたＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクションし得る。いくつかの態様では、鋳型には、本開示のＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、ＥＧＦＲｔ、及び他のタンパク質のための配列が含まれる。所定の態様では、ＲＮＡベクターは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入される。
いくつかの態様では、本明細書に記載のタンパク質（例えば、ＣＡＲポリペプチド及びｃ－Ｊｕｎポリペプチド）のコード配列は、別個の発現コンストラクト上に配置され得る。いくつかの態様では、本明細書に記載のタンパク質（例えば、ＣＡＲポリペプチド、ｃ－Ｊｕｎタンパク質、及び存在する場合はＥＧＦＲｔ）のコード配列は、単一の発現コンストラクト上に配置され得る。コード配列は、コンストラクト上の１つ以上の発現カセットに配置することができ、各カセットは、それ自体の転写単位（例えば、それ自体のプロモーター及びポリアデニル化部位ならびに他の転写制御エレメント）である。所定の態様では、３つのコード配列（例えば、それぞれ、ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及びＥＧＦＲｔをコードする）は、共通のプロモーター下で転写される３つのコード配列を有する単一の発現カセット（例えば、トリシストロン発現カセット）に配置され得る。
いくつかの態様では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。本明細書で使用される場合、用語「免疫エフェクター細胞」は、例えば、免疫エフェクター反応の促進において、免疫反応に関与する細胞を指す。「免疫エフェクター機能」または「免疫エフェクター反応」は、例えば、標的細胞の免疫攻撃を向上または促進する免疫エフェクター細胞の機能または反応を指す。例えば、免疫エフェクター機能または反応は、標的細胞の成長または増殖の殺傷または阻害を促進するＴまたはＮＫ細胞の特性を参照する。Ｔ細胞の場合、一次刺激及び共刺激は、免疫エフェクター機能または反応の例である。
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含有する細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成し得る。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞における、免疫エフェクター機能の例には、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性及びヘルパー活性が含まれる。いくつかの態様では、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を発揮するように細胞を仕向けるＣＡＲの一部である。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分が使用される範囲内で、そのような切断された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用され得る。よって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断された部分を含むことを意味する。
いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、または抗原依存的刺激の原因となる分子に由来するものが含まれる。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル、または抗原非依存的刺激の原因となる分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含み得る。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれるがこれらに限定されない。
免疫エフェクター細胞の例には、例えば、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞及びガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、及び骨髄由来食細胞が含まれる。自然リンパ球（ＩＬＣ）は、共通のリンパ前駆細胞（ＣＬＰ）に由来し、リンパ系に属する自然免疫細胞の群である。これらの細胞は、組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）の欠如のため、抗原特異的ＢまたはＴ細胞受容体の非存在によって定義される。ＩＬＣは、骨髄または樹状細胞マーカーを発現しない。ＩＬＣは、様々な生理学的機能を有する、いくつかの機能は、ヘルパーＴ細胞に類似するのに対し、その群にはまた、細胞傷害性ＮＫ細胞が含まれる。したがって、いくつかの態様では、本開示のＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＩＬＣ細胞である。
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症の部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の源から得られ得る。
本開示の操作された免疫細胞の源は、処置を受ける患者（すなわち、自己細胞）でも、処置を受ける患者ではないドナーからのもの（例えば、同種異系細胞）でもよい。いくつかの態様では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞である。本明細書の操作されたＴ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８－（すなわち、ＣＤ４シングルポジティブ）Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８＋（すなわち、ＣＤ８シングルポジティブ）Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ８＋（ダブルポジティブ）Ｔ細胞であり得る。機能的には、これらのＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、またはそれらの混合物であり得る。操作されるＴ細胞は、自己由来のものでも同種異系のものでもよい。
一次Ｔ細胞を含む一次免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症の部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び／または腫瘍組織を含む多数の細胞源から得られ得る。ＰＢＭＣを含む白血球は、周知の技術、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離及び白血球アフェレーシスによって他の血液細胞から単離することができる。白血球アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞を含む）、単球、顆粒球、及び他の有核白血球細胞を含む。Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または対向流遠心溶出法によって、他の白血球からさらに単離される。特定のＴ細胞のサブ集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＧＩＴＲ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞は、陽性または陰性選択技術（例えば、蛍光ベースまたは磁気ベースの細胞選別を使用して）さらに単離され得る。例えば、Ｔ細胞は、様々な市販の抗体結合ビーズのいずれか、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）、ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）またはＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離製品（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と、所望のＴ細胞の陽性選択または不要な細胞の除去のための陰性選択に十分な時間インキュベートすることによって単離され得る。
いくつかの例では、自己Ｔ細胞は、がん処置後にがん患者から直接得られる。所定のがん処置、特に免疫系を損なう処置の後では、処置直後に収集されたＴ細胞の品質が、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖する能力及び／またはｅｘ ｖｉｖｏで操作された後の生着する能力が向上する可能性があることが観察されている。
遺伝子修飾の前後にかかわらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第５，８５８，３５８号、第５，８８３，２２３号、第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、第６，６９２，９６４号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８０号、第６，９０５，６８１号、第６，９０５，８７４号、第７，０６７，３１８号、第７，１４４，５７５号、第７，１７２，８６９号、第７，１７５，８４３号、第７，２３２，５６６号、第７，５７２，６３１号、及び第１０，７８６，５３３号（各々が参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる）に記載の方法を使用して、一般に活性化及び増殖され得る。一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドに結合した表面との接触によってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで増殖され得る。具体的には、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと併せたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用され得る。例えば、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触し得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が使用され得る。
細胞培養条件には、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計されたその他の薬剤のうちの１つ以上が含まれ得る。いくつかの態様では、培養条件には、ＩＬ－２、ＩＬ－７及び／またはＩＬ－１５の添加が含まれる。
いくつかの態様では、操作される細胞は、操作後に成熟Ｔ細胞に分化する多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞であり得る。これらの非Ｔ細胞は、同種異系であることができ、例えば、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、または造血幹細胞もしくは前駆細胞であることができる。説明を容易にするために、本明細書では多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）及び多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を総称して「前駆細胞」と呼ぶ。
同種異系細胞が使用される場合、所定の態様では、移植片対宿主拒絶反応を低減するように細胞が操作される（例えば、内因性Ｂ２Ｍ及び／またはＴＲＡＣ遺伝子をノックアウトすることによって）。
薬学的組成物
本開示はまた、本明細書に開示される組成物、例えば、対象への投与のために好適な、本開示のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔ）をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１コンストラクト）、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及びＥＧＦＲｔタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）を含むベクター、または本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及びＥＧＦＲｔタンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトまたはベクターを含む遺伝子修飾された細胞を含む薬学的組成物を提供する。
薬学的組成物は通常、本開示の抗ＲＯＲ－１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及びＥＧＦＲｔタンパク質をコードするまたは含むポリヌクレオチド、ベクター、または細胞及び薬学的に許容可能な賦形剤または担体を対象への投与に好適な形態で含む。薬学的に許容可能な賦形剤または担体は、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。
本開示は、本明細書に記載の発現コンストラクト（例えば、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）で修飾された操作されたＴ細胞を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、患者に導入する前に細胞の健康を維持するのに適した薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
いくつかの態様では、操作された細胞を培地から回収し、洗浄し、担体中で治療的有効量に濃縮することができる。担体の例としては、食塩水、緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）、生理食塩水、水、ハンクス液、リンガー液、Ｎｏｎｎｏｓｏｌ－Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｒ）（Ｂａｘｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。担体は等張であることが好ましい。いくつかの態様では、担体には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または他のヒト血清成分、５％グルコースまたはデキストロース等の成分を補充することができる。追加の等張化剤としては、三価以上の糖アルコールを含む多価糖アルコールが挙げられ、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、またはマンニトールも挙げることができる。
薬学的Ｔ細胞組成物は、がん患者に対して治療的有効量で全身的（例えば、静脈内または門脈注射を通じて）または局所的（例えば、腫瘍内注射を通じて）に投与することができる。いくつかの態様では、組成物、例えば、ＲＯＲ１を標的とする組成物は、ＲＯＲ１を発現することが知られている腫瘍を有する患者を処置するために使用される。いくつかの態様では、組成物、例えば、ＲＯＲ１を標的とする組成物は、転移性黒色腫、非小細胞肺癌、骨髄腫、食道癌、滑膜肉腫、胃癌、乳癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、及び膀胱癌から選択されるがんを有する患者を処置するために使用される。本明細書で使用される場合、用語「処置」または「処置すること」とは、処置される対象において有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。そのような結果としては、疾患に起因する１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の縮小（例えば、腫瘍体積を減少させること）、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の防止もしくは遅延）、疾患の蔓延（例えば、転移）の防止もしくは遅延、疾患の再発もしくは逆戻りの防止もしくは遅延、病状の改善、疾患の寛解（部分的もしくは完全）の提供、疾患の処置に必要とされる１つ以上の他の薬物の用量の減少、生活の質の改善、体重の回復、及び／または生存（例えば、全生存または無増悪生存）の延長が挙げられるがこれらに限定されない。
組成物の治療的有効量とは、所望の臨床エンドポイントを達成するのに十分な操作されたＴ細胞の数を指す。いくつかの態様では、治療的有効量は、約１０４超、約１０５超、約１０６超、約１０７超、約１０８超、または約１０９超の操作された細胞を含む。
いくつかの態様における薬学的組成物は、疾患または病態を処置または防止するのに有効な量、例えば、治療的有効量または予防的有効量の細胞を含む。いくつかの態様における治療的または予防的有効性は、処置される対象の定期的な評価によって監視される。数日間以上にわたる反復投与の場合、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで処置が反復される。しかしながら、他の投与計画も有用であり得、究明され得る。所望の用量は、組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の連続注入投与によって送達され得る。
本開示のＣＡＲを含む薬学的組成物の多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）を参照されたい）。薬学的組成物は通常、無菌で製剤化され、米国食品医薬品局のすべてのＧｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）の規則を十分に順守する。
所定の態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体において、１つ以上の追加の治療剤と共投与される。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及び／またはＥＧＦＲｔをコードする）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤（複数可）の投与の前に投与される。所定の態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及び／またはＥＧＦＲｔをコードする）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤（複数可）の投与の後に投与される。さらなる態様では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ及び／またはＥＧＦＲｔをコードする）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤（複数可）と同時に投与される。
許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエント（例えば、動物またはヒト）に対して非毒性であり、これには緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
担体または希釈剤の例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれるがこれらに限定されない。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び化合物の使用は、当該技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または化合物が本開示の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞）と非適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。
適応症
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）は、疾患または病態、例えば、増殖性疾患、例えば、がんまたは悪性腫瘍または前がん性病態、例えば、骨髄異形成、骨髄異形成症候群または前白血病を処置するために使用され得る。
「がん」は、体内の異常な細胞の制御不能な成長を特徴とする様々な増殖性疾患の広範な群を指す。制御不能な細胞分裂及び成長は、隣接組織に侵入する悪性腫瘍の形成をもたらし、また、リンパ系または血流を介して身体の遠位部分に転移し得る。本明細書で使用される場合、用語「増殖性」障害または疾患は、多細胞生物に対して損害（すなわち、不快感または減少した平均余命）をもたらす多細胞生物における細胞の１つ以上のサブセットの不要な細胞増殖を指す。例えば、本明細書で使用される場合、増殖性障害または疾患には、新生物障害及び他の増殖性障害が含まれる。「新生物」は、本明細書で使用される場合、悪性または良性にかかわらず、異常な組織成長をもたらす調節不全または調節されない細胞成長の任意の形態を指す。よって、「新生物細胞」には、調節不全または調節されない細胞成長を有する悪性及び良性細胞が含まれる。いくつかの態様では、がんは、腫瘍である。「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、悪性または良性にかかわらずすべての新生物細胞成長及び増殖、ならびにすべての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。
いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を使用して、ＲＯＲ１陽性である再発性または難治性の固形腫瘍の悪性腫瘍を処置することができる。特定の態様では、処置される疾患は、乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌、または非小細胞肺癌である。いくつかの態様では、疾患は、固形または液性腫瘍である。いくつかの態様では、がんは、膵臓癌である。いくつかの態様では、疾患は、血液癌である。いくつかの態様では、血液癌は、白血病である。
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物（例えば、本開示のｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを発現するように操作された細胞、本開示のｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、本開示のｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲ、または本開示のｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）は、腫瘍サイズの減少もしくは縮小、または腫瘍成長の阻害を必要とする対象においてそれを行うために使用される。いくつかの態様では、腫瘍は、癌腫（すなわち、上皮起源のがん）である。いくつかの態様では、腫瘍は、例えば、胃癌、食道・胃接合部癌（ＧＥＪ）、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌（肝細胞癌、ＨＣＣ）、卵巣癌、乳癌、ＮＳＣＬＣ、膀胱癌、肺癌、膵臓癌、頭頸部癌、リンパ腫、子宮癌、腎癌または腎臓癌、胆管癌、前立腺癌、精巣癌、尿道癌、陰茎癌、胸部癌、直腸癌、脳癌（神経膠腫及び膠芽腫）、子宮頸癌、耳下腺癌、喉頭癌、甲状腺癌、腺癌、神経芽細胞腫、黒色腫、及びメルケル細胞癌からなる群から選択される。
「がん」または「がん組織」は、様々な段階における腫瘍を含み得る。所定の態様では、がんまたは腫瘍は、ステージ０、例えば、例えば、がんまたは腫瘍が、発達における極めて早期であり、転移していないようなものである。いくつかの態様では、がんまたは腫瘍は、ステージＩ、例えば、がんまたは腫瘍が、サイズが比較的小さく、近くの組織に広がっておらず、転移していないようなものである。いくつかの態様では、がんまたは腫瘍は、ステージＩＩまたはステージＩＩＩ、例えば、がんまたは腫瘍が、ステージ０またはステージＩよりも大きく、近くの組織に成長しているが、潜在的にリンパ節を除き転移していないようなものである。いくつかの態様では、がんまたは腫瘍は、ステージＩＶ、例えば、がんまたは腫瘍が転移しているようなものである。ステージＩＶはまた、進行または転移癌と称され得る。
いくつかの態様では、がんには、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、脳癌、乳癌、小児期癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫ファミリー、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭部及び下咽頭癌、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織における肉腫、基底及び扁平上皮細胞皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍及びがん処置によって引き起こされる二次癌が含まれ得るがこれらに限定されない。
いくつかの態様では、腫瘍は、固形腫瘍である。「固形腫瘍」には、肉腫、黒色腫、癌腫、または他の固形腫瘍癌が含まれるがこれらに限定されない。「肉腫」は、胚性結合組織結合組織のような物質から構成され、通常は、線維性または同質物質に埋め込まれた密接して包まれた細胞から構成される腫瘍を指す。肉腫には、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫（ｍｅｌａｎｏｓａｒｃｏｍａ）、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫、絨毛腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、ジェンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血球肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性間葉肉腫、傍骨性肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢包性肉腫、滑膜肉腫、または毛細血管拡張性肉腫が含まれるがこれらに限定されない。
用語「黒色腫」は、皮膚及び他の器官のメラノサイト系から生じる腫瘍を指す。黒色腫には、例えば、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング・パッセイ黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、転移性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、または表在拡大型黒色腫が含まれる。
用語「癌腫」は、周囲組織に浸潤する傾向があり転移を引き起こす上皮細胞から構成される悪性の新たな成長物を指す。例示的な癌腫には、例えば、細葉細胞癌、腺房細胞癌、腺嚢胞癌、腺様嚢胞癌、腺腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、底細胞癌、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌、気管支肺胞上皮癌、気管支癌、気管支原性癌、脳状癌、胆管細胞癌、絨毛癌、膠様癌、面皰癌、体癌（ｃｏｒｐｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、篩状癌、よろい状癌、皮膚癌、円筒状癌、円筒状細胞癌、腺管癌、硬性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｕｒｕｍ）、胚性癌、脳様癌、類表皮癌、上皮アデノイド癌、外部寄生癌、潰瘍癌、線維性癌、ゼラチン状癌、膠様癌、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血液癌、肝細胞癌、ヒュルツル細胞癌、ヒアリン癌、副腎様癌（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、幼児期胚性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペチャー癌、クルチッキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌、粘液腺癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌、粘膜表皮癌、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、骨様癌、乳頭癌、門脈周囲癌、浸潤前癌、有棘細胞癌、糊状癌、腎臓の腎細胞癌、補充細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌（ｓｏｌａｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿体癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、糸状癌、血管拡張性癌、毛細血管拡張性癌、移行細胞癌、結節癌、結節状癌、いぼ状癌、または絨毛癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｆｌｏｓｕｍ）が含まれる。
本明細書に開示される組成物（例えば、本開示のｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを発現するように操作された細胞、本開示のｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、本開示のｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲ、または本開示のｃ－Ｊｕｎ及びＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）で処置され得るさらなるがんには、例えば、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前がん性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、甲状腺乳頭癌、神経芽腫、神経内分泌癌、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、前立腺癌、ミュラー管癌、卵巣癌、腹膜癌、卵管癌、または子宮乳頭状漿液性癌が含まれる。
方法
本開示はまた、養子療法のために本明細書に記載の組成物（例えば、ｃ－Ｊｕｎ及び抗ＲＯＲ１ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクター、またはそのベクターで形質導入された細胞、例えば、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）の１つ以上を使用するための方法を提供する。以下に提供される開示は、主に細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）の投与に言及しているが、本記載の方法が、本明細書に記載の他の組成物（例えば、ｃ－Ｊｕｎ及び抗ＲＯＲ１ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含むベクター）のいずれかを対象に投与することによって達成され得ることは当業者には明らかであろう。
いくつかの態様では、本開示は、対象における標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫反応を刺激する方法であって、有効量の本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現し、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現する細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。また、抗腫瘍免疫の提供を、それを必要とする対象において行う方法であって、方法は、有効量の本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現し、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現する細胞を対象に投与することを含む、方法が提供される。
本開示はまた、がんの処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、有効量の本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現し、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現する細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、がんの処置方法は、それを必要とする対象に対して、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞を投与することを含み、ここで、ＣＡＲは、腫瘍で発現される抗原に対して特異的である。そのような免疫細胞の非限定的な例は、本開示全体にわたって記載されている。本開示から明らかなように、そのような方法は、ＲＯＲ１発現に関連するあらゆるがんの処置に有用である可能性がある。そのようながんの非限定的な例は、本開示の他の箇所に提供されている。
本明細書で実証されるように、いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現し、ＣＡＲ（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ）及びＥＧＦＲｔを含む）を対象に投与することにより、１つ以上のがんの症状または形勢を緩和または軽減することができる。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾された免疫細胞を投与することにより、参照腫瘍サイズと比較して腫瘍サイズが減少する可能性がある。いくつかの態様では、参照腫瘍サイズは、（ｉ）投与前の腫瘍サイズ、（ｉｉ）投与を受けなかった（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象における腫瘍サイズ、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供される修飾された免疫細胞を投与することにより、対象における腫瘍サイズを、参照腫瘍サイズと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％減少させることができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾された免疫細胞を投与することにより、対象の生存期間を延長することができる。いくつかの態様では、参照生存期間と比較して、生存期間は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、少なくとも約３か月、少なくとも約４か月、少なくとも約５か月、少なくとも約６か月、少なくとも約７か月、少なくとも約８か月、少なくとも約９か月、少なくとも約１０か月、少なくとも約１１か月、または少なくとも約１年延長される。いくつかの態様では、参照生存期間は、投与を受けなかった（例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象の生存期間を含む。
本開示の他の場所でさらに記載されるように、いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾された免疫細胞は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように修飾されていない対応する細胞）と比較して、腫瘍細胞を殺傷する能力の向上を示す。したがって、いくつかの態様では、本明細書に提供するのは、腫瘍細胞の殺傷方法であり、これは、腫瘍細胞を、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞と接触させることを含み、ここで、ＣＡＲは、腫瘍細胞で発現される抗原に対して特異的である。そのような免疫細胞の非限定的な例は、本開示全体にわたって提供されている。いくつかの態様では、参照細胞（例えば、本明細書に記載のとおりに修飾されなかった対応する細胞）と比較して、腫瘍細胞の殺傷は、少なくとも約０．５倍、１倍、少なくとも約２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加する。
本開示から明らかなように、本開示の修飾された免疫細胞は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように修飾されていない対応する細胞）と比較して、様々な優れた特性を示す。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾された細胞は、抗原で刺激された場合に、増加した量のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、またはその両方）を産生することが可能である。したがって、いくつかの態様では、本明細書に提供するのは、抗原刺激に応答した免疫細胞によるサイトカインの産生を増加させる方法であり、これは、免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ－１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様では、対応する免疫細胞と比較して、抗原刺激に応答したサイトカインの産生は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。いくつかの態様では、サイトカインの産生は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増加する。
いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾された免疫細胞は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように修飾されていない対応する免疫細胞）と比較して、抗原刺激に応答した増殖の増加を示す。したがって、同様に本明細書に提供するのは、抗原刺激に応答した免疫細胞の増殖を増加させる方法であり、これは、免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ－１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様では、修飾後、抗原刺激に応答した免疫細胞の増殖は、対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。いくつかの態様では、増殖は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増加する。
本開示から明らかなように、本明細書で提供される方法はまた、持続抗原刺激に応答した免疫反応の１つ以上のエフェクター機能を増加させるために使用することができる。改善され得るエフェクター機能の非限定的な例は、（ｉ）腫瘍細胞を殺傷する能力、（ｉｉ）さらなる抗原刺激後にサイトカインを産生する能力、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方の能力を含む。いくつかの態様では、そのような方法は、免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ－１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。
いくつかの態様では、修飾後、免疫細胞は、対応する免疫細胞と比較して、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回のさらなる抗原刺激アッセイに対してエフェクター機能を保持する。
いくつかの態様では、修飾後、免疫細胞のエフェクター機能は、対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。いくつかの態様では、エフェクター機能は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％以上増加する。
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法はまた、持続抗原刺激後の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の疲弊を軽減または防止するために使用することができる。いくつかの態様では、そのような方法は、免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含む。いくつかの態様では、ＲＯＲ－１結合タンパク質は、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する。
いくつかの態様では、修飾後、持続抗原刺激に応答して、免疫細胞は、対応する免疫細胞と比較して、（ｉ）疲弊に関連する遺伝子のレベルの低下、（ｉｉ）活性化に関連する遺伝子のレベルの増加、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を発現する。そのような遺伝子の非限定的な例は、本開示の他の箇所で説明されている。
本開示はまた、療法のための細胞、例えば、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、対象から単離された細胞の集団を本開示のポリヌクレオチドまたはベクターで形質導入することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、形質導入は、好適な条件下で細胞を培養することを含む。
本開示はまた、がんと診断された対象において遺伝子操作された細胞の持続集団を生成する方法であって、方法は、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現するように及びｃ－Ｊｕｎポリペプチド過剰発現するように遺伝子操作された細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本開示の他の箇所に記載されているように、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現は、疲弊を軽減または防止するのに役立ち、その結果、本開示の修飾された免疫細胞は、対象に投与された場合、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように修飾されていない対応する細胞）と比較して、対象内でより長く存続することが可能である。いくつかの態様では、対象に投与された場合、本開示の修飾された免疫細胞は、対応する免疫細胞より、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、少なくとも約３か月、少なくとも約４か月、少なくとも約５か月、少なくとも約６か月、少なくとも約７か月、少なくとも約８か月、少なくとも約９か月、少なくとも約１０か月、少なくとも約１１か月、または少なくとも約１年以上長く対象内で存続することが可能である。したがって、いくつかの態様では、参照対象に投与された場合の対応する免疫細胞と比較して、投与後約１か月の時点で対象内に存在する修飾された免疫細胞の数は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。いくつかの態様では、投与後約２か月の時点で、参照対象に存在する対応する免疫細胞と比較して、修飾された免疫細胞の数は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。いくつかの態様では、投与後約３か月の時点で、参照対象に存在する対応する免疫細胞と比較して、修飾された免疫細胞の数は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。いくつかの態様では、投与後約４か月の時点で、参照対象に存在する対応する免疫細胞と比較して、修飾された免疫細胞の数は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。いくつかの態様では、投与後約５か月の時点で、参照対象に存在する対応する免疫細胞と比較して、修飾された免疫細胞の数は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。いくつかの態様では、投与後約６か月の時点で、参照対象に存在する対応する免疫細胞と比較して、修飾された免疫細胞の数は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。いくつかの態様では、投与後約７か月の時点で、参照対象に存在する対応する免疫細胞と比較して、修飾された免疫細胞の数は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。いくつかの態様では、投与後約８か月の時点で、参照対象に存在する対応する免疫細胞と比較して、修飾された免疫細胞の数は、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。
本開示はまた、がんと診断された対象において遺伝子操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を増殖させる方法であって、方法は、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを発現するように及びｃ－Ｊｕｎポリペプチド過剰発現するように遺伝子操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、Ｔ細胞、例えば、自己Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、異種Ｔ細胞である。本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、対象は、ヒト対象である。
いくつかの態様では、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含む組成物（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）の投与により、本開示のＣＡＲの代わりに抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）を含む対応する組成物の投与後に観察されるインターロイキン分泌と比較して、インターロイキン（例えば、インターロイキン－２）の分泌が、少なくとも約０．０１倍、少なくとも約０．０２倍、少なくとも約０．０３倍、少なくとも約０．０４倍、少なくとも約０．０５倍、少なくとも約０．０６倍、少なくとも約０．０７倍、少なくとも約０．０８倍、少なくとも約０．０９倍、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．２倍、少なくとも約０．３倍、少なくとも約０．４倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。
いくつかの態様では、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含む組成物（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）の投与により、本開示のＣＡＲの代わりに抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）を含む対応する組成物の投与後に観察されるインターフェロン（例えば、インターフェロン－ガンマ）分泌と比較して、インターフェロン（例えば、インターフェロン－ガンマ）の分泌が、少なくとも約０．０１倍、少なくとも約０．０２倍、少なくとも約０．０３倍、少なくとも約０．０４倍、少なくとも約０．０５倍、少なくとも約０．０６倍、少なくとも約０．０７倍、少なくとも約０．０８倍、少なくとも約０．０９倍、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．２倍、少なくとも約０．３倍、少なくとも約０．４倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。
いくつかの態様では、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含む組成物（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）の投与により、本開示のＣＡＲの代わりに抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）を含む対応する組成物の投与後に観察されるＴＮＦα分泌と比較して、ＴＮＦαの分泌が、少なくとも約０．０１倍、少なくとも約０．０２倍、少なくとも約０．０３倍、少なくとも約０．０４倍、少なくとも約０．０５倍、少なくとも約０．０６倍、少なくとも約０．０７倍、少なくとも約０．０８倍、少なくとも約０．０９倍、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．２倍、少なくとも約０．３倍、少なくとも約０．４倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する。
いくつかの態様では、本開示は、薬剤として使用するための本開示のポリヌクレオチド、ベクター、ＣＡＲ、組成物、キット、細胞、または薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、がんの処置を、それを必要とする対象において行うための薬剤として使用するための本開示のポリヌクレオチド、ベクター、ＣＡＲ、組成物、キット、細胞、または薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、がんの処置を、それを必要とする対象において行うための本開示のポリヌクレオチド、ベクター、ＣＡＲ、組成物、キット、細胞、または薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、薬剤の製造のための本開示のポリヌクレオチド、ベクター、ＣＡＲ、組成物、キット、細胞、または薬学的組成物の使用を提供する。いくつかの態様では、本開示は、がんの処置を、それを必要とする対象において行うための薬剤の製造のための本開示のポリヌクレオチド、ベクター、ＣＡＲ、組成物、キット、細胞、または薬学的組成物の使用を提供する。
本開示はまた、ＣＡＲ療法を必要とする対象を処置するためのポリヌクレオチドコンストラクト（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）、そのコンストラクトを含むベクター（例えば、ｃ－Ｊｕｎ、ＣＡＲもしくはＥＧＦＲｔをコードする）、またはそのコンストラクトまたはそのベクターを含む遺伝子操作された細胞を含む組成物を提供する。本開示はまた、薬剤として使用するための本開示のポリヌクレオチドコンストラクト（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）、そのポリヌクレオチドコンストラクトを含むベクター、またはｃ－Ｊｕｎ、ＣＡＲ、もしくはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを含む遺伝子修飾された細胞を含む組成物を提供する。また、ＣＡＲ療法を必要とする対象におけるがんのための処置として使用するための本開示のポリヌクレオチドコンストラクト（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）、そのポリヌクレオチドコンストラクトを含むベクター、またはｃ－Ｊｕｎ、ＣＡＲもしくはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドコンストラクトまたはベクターを含む遺伝子修飾された細胞を含む組成物が提供される。また、ＣＡＲ療法を必要とする対象におけるがんのための処置のための薬剤の製造のためのポリヌクレオチドコンストラクト（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）、ｃ－Ｊｕｎ、ＣＡＲもしくはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、またはｃ－Ｊｕｎ、ＣＡＲ、もしくはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドもしくはベクターを含む遺伝子修飾された細胞を含む組成物が提供される。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）を細胞にトランスフェクションすることを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を調製する方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、本開示は、適切な条件下で、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるベクターまたは本明細書に開示されるポリペプチドを含む細胞を培養することを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を増殖させる方法を提供する。
いくつかの態様では、本明細書に開示される処置方法は、少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、追加の治療剤は、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの治療、サイトカイン、外科手術、放射線治療、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
キット
本開示はまた、（ｉ）本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ｃ－Ｊｕｎ－抗ＲＯＲ１ ＣＡＲコンストラクト）、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及び／またはＥＧＦＲｔ）をコードする１つ以上のベクター、またはそのポリヌクレオチド（複数可）もしくはベクター（複数可）を含む組成物、及び任意に（ｉｉ）使用するための指示書、例えば、本明細書に開示される方法に従って使用するための指示書を含むキット、または製造製品を提供する。
本開示はまた、（ｉ）本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及びＥＧＦＲｔタンパク質を発現するように遺伝子修飾された細胞、すなわち、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、及び／またはＥＧＦＲｔタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを含む細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、もしくはＩＬＣ細胞）、またはその細胞を含む薬学的組成物、及び任意に（ｉｉ）使用のための指示書を含むキットを提供する。
いくつかの態様では、キットまたは製造製品は、少なくとも本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、及び／またはＥＧＦＲｔタンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、及び／またはＥＧＦＲｔタンパク質を発現するように遺伝子修飾された細胞、または本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を１つ以上の容器に含む。
いくつかの態様では、キットまたは製造製品は、少なくとも、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、及びＥＧＦＲｔタンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎ、及びＥＧＦＲｔを発現するように遺伝子修飾された細胞、または本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、及び任意に冊子を含む。
当業者は、本開示のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及び組成物、本開示のポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞を含む薬学的組成物、またはそれらの組み合わせが、当該技術分野でよく知られている確立されたキット形式のうちの１つに容易に組み込まれ得ることを容易に認識する。
いくつかの態様では、キットまたは製造製品は、容器（例えば、ガラスバイアル）内に乾燥形態で、例えば、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、及びＥＧＦＲｔタンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、またはポリヌクレオチド、ベクターを含む組成物（例えば、薬学的組成物）、及び任意に溶媒を有するバイアルを含む。
いくつかの態様では、キットまたは製造製品は、少なくとも１つの容器内に、例えば、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、及びＥＧＦＲｔタンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、またはポリヌクレオチド、ベクターを含む組成物（例えば、薬学的組成物）、及びトランスフェクション試薬を有する別のまたはさらなる容器を含む。
＊＊＊
本開示の実施は、別途示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を用いるであろう。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許番号４，６８３，１９５、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）、）、Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）ａｎｄ ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
以下の実施例は、例示として提供され、限定として提供されない。
Figure 2024510898000008
Figure 2024510898000009
Figure 2024510898000010
Figure 2024510898000011
Figure 2024510898000012
 実施例１：ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷する能力の分析
本明細書に記載の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）のＲＯＲ１依存性生物学的活性の特性評価を開始するために、ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷する能力を評価した。簡潔には、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（本明細書では「ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞」と称される）を、ＲＯＲ１＋ＮＳＣＬＣ細胞株（「Ｈ１９７５」）またはクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を介してヒトＲＯＲ１をノックアウトしたＨ１９７５（「Ｈ１９７５－ＲＯＲ１ＫＯ」）のいずれかと共にインキュベートした。比較として、腫瘍細胞を溶解しないものとする非形質導入「ｍｏｃｋ」Ｔ細胞（すなわち、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖを発現しない）、及びｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない「対照」抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞もまた、Ｈ１９７５細胞またはＨ１９７５－ＲＯＲ１ＫＯ細胞のいずれかと共にインキュベートした。Ｈ１９７５細胞とＨ１９７５－ＲＯＲ１ＫＯ細胞は両方とも、ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ、核に限定されたｍＫａｔｅ２）を発現したため、非溶解細胞を定量することができる。これらの異なるＣＡＲ Ｔ細胞を、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：１で１２０時間インキュベートした。
図１Ａに示すように、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と同様、ＲＯＲ１発現依存的に腫瘍細胞の細胞溶解を媒介した。重要なことに、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞による標的陰性Ｈ１９７５－ＲＯＲ１ノックアウト細胞の殺傷は観察されなかった（図１Ｂ）。これらの結果は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が、より伝統的な抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）と比較して、腫瘍細胞の殺傷において同等に有効であることを実証する。
実施例２：ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が選択的サイトカイン分泌を引き起こす能力の分析
本明細書に記載の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能をさらに特性評価するために、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞または対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）を、Ｈ１９７５またはＨ１９７５－ＲＯＲ１ＫＯ腫瘍細胞と共に、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１：１で２４時間インキュベートした。その後、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γの定量化のために、異なるインキュベーション条件から上清を回収した。これらサイトカインの濃度は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘを使用して測定した。
図２Ａ及び２Ｃに示すように、ＲＯＲ１抗原に応答して、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞及びｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方が、かなりの量のＩＬ－２及びＩＦＮ－γの両方を産生した。しかしながら、サイトカイン産生は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞ではるかに多かった。サイトカインは、Ｈ１９７５－ＲＯＲ１ＫＯ細胞の存在下で培養した場合、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によってもｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔによっても分泌されなかった（図２Ｂ及び２Ｄ）。
まとめると、これらのデータは、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍細胞のみを溶解し、抗原依存的にサイトカインを分泌するという点で、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の選択的生物学的活性を実証した。さらに、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞による標的依存性サイトカイン分泌は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して高まった。
実施例３：ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン依存性増殖の分析
ｃ－Ｊｕｎの過剰発現がサイトカインに対する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の感受性に何らかの影響を及ぼしたかどうかを確認するため、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）及びｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を別々に、Ｇｒｅｘ ２４ウェルプレート（１ｘ１０６細胞／ウェル）にて、以下のうちの１つの条件下で培養した：（ｉ）Ｔ細胞培地（ＯｐＴｍｉｚｅｒ基礎培地、ＯｐＴｍｉｚｅｒ細胞サプリメント、免疫細胞血清代替物、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ）単独、（ｉｉ）２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＴ細胞培地、または（ｉｉｉ）１２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－７及び２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－１５を添加したＴ細胞培地。非形質導入（「ｍｏｃｋ」）細胞もこれらの条件下で培養し、対照として使用した。７日目及び１４日目に、各培養条件におけるＴ細胞の総数をカウントした。７日目の細胞を次の培養回のために１ｘ１０６細胞／ウェルで再播種した。アッセイ期間中、各サンプルの培地条件を維持した。
図３Ａに示すように、サイトカインの非存在下では、いずれのＴ細胞も増殖できなかった。サイトカインの添加により限られた数まで一時的に増殖したｍｏｃｋまたは対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、優れた増殖能力を示し、これが試験全体を通じて維持された（図３Ｂ及び３Ｃ）。これらの結果は、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の様々な機能特性（例えば、サイトカイン感受性）を改善することができることをさらに実証している。
実施例４：慢性抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍特性に対するｃ－Ｊｕｎ過剰発現の影響の分析
慢性感染症及びがんでは、持続抗原曝露によりＴ細胞が疲弊すること、ならびにＴ細胞のエフェクター機能、例えば、細胞溶解活性及びサイトカイン分泌の進行性消失に至ることがある。したがって、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が長期間の抗原刺激後の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能に何らかの影響を与えたかどうかを評価するため、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞及び対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）を、ＲＯＲ１＋Ａ５４９ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞への反復曝露により慢性的に刺激した。ＣＡＲ Ｔ細胞を新鮮な標的細胞と共に１：１のＥ：Ｔ比で２日ごとに再播種することにより、慢性抗原曝露を確実にした。慢性刺激後７日目に、これらのＣＡＲ Ｔ細胞を回収し、Ａ５４９－ＮＬＲ（Ｅ：Ｔ細胞比１：１）またはＨ１９７５－ＮＬＲ（Ｅ：Ｔ１：５）のいずれかと共にインキュベートした。標的細胞の溶解を、アッセイのセットアップの時点０時間に対して正規化した総ＮＬＲ強度を追跡することによって評価した。ＭＳＤによるＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αの定量化用に、２４時間の上清を回収した。
図４Ａに示すように、反復抗原刺激後でも、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）と比較して、ＲＯＲ１＋腫瘍細胞を効果的に溶解することが可能であった。同様に、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくともＩＦＮ－γのレベルの増加も引き起こした（図４Ｂ）。これらの結果は、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、慢性抗原刺激の存在下でＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能の維持に役立つことができることを実証する。
実施例５：ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する慢性的に刺激された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞における疲労関連転写プロファイルの分析
Ｔ細胞疲弊に対するｃ－Ｊｕｎ過剰発現の影響をさらに理解するために、７日間の慢性刺激時点のＣＡＲ＋Ｔ細胞（ｎ＝３ドナー、図５Ａに記載）に対してバルクＲＮＡ配列決定を行い、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）とｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞間で差次的に発現される遺伝子を同定した。文献（Ｂｅｌｔｒａ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０２０；５２（５）：８２５－８４１．ｅ８、Ｚｈａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１８；５６４（７７３５）：２６８－２７２）からのＴ細胞疲弊のモデルからの遺伝子セットを使用した、差次的に発現された遺伝子セットに対する遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）により、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞において下方制御された遺伝子は、（Ｔｅｘｔｅｒｍ＿ＵＰ［Ｂｅｌｔｒａ ２０２０からの遺伝子セット］及びＴｅｘ＿ｍｕｌｔｉＴｕｍｏｒｓ［Ｚｈａｎｇ ２０１８からの遺伝子セット］）において上方制御された遺伝子セットに関して有意に濃縮されることが示された。反対に、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞において上方制御された遺伝子は、Ｔ細胞増殖遺伝子を含む遺伝子セット（ＴｅｘＰｒｏｇ２＿ＵＰ［Ｂｅｌｔｒａ ２０２０からの遺伝子セット］）及び末端疲弊表現型において下方制御された遺伝子セット（Ｔｅｘｔｅｒｍ＿ＤＯＷＮ［Ｂｅｌｔｒａ ２０２０からの遺伝子セット］）に関して有意に濃縮された（図５Ａ）。これらのデータを総合すると、疲弊遺伝子発現サインの減少、及びＴ細胞増殖に関連する遺伝子の発現の維持に対するｃ－Ｊｕｎの影響が示される。
ｃ－Ｊｕｎの影響をよりよく理解するために、ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｄｅｘｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ（ＣＩＴＥ）－ｓｅｑもまた、２ドナーにおける７日目のＣＡＲ＋Ｔ細胞に対して実施した（図５Ｂ～図５Ｄ）。転写（及びタンパク質）プロファイルに基づく細胞のクラスタリングは、文献に基づく疲弊マーカーが主に濃縮された細胞を有するクラスター３（図５Ｂ）を同定するのに役立った。クラスター３の頻度は、ｃ－Ｊｕｎの添加により両ドナーにおいて減少し、疲弊に対するｃ－Ｊｕｎの効果が示された（図５Ｄ）。さらに、より分化した／活性化されたマーカー（例えば、４－１ＢＢ、グランザイムＡ［ＧＺＭＡ］（図５Ｃ））が濃縮されたクラスター０及び５（図５Ｂ）もまた、ｃ－Ｊｕｎの添加により頻度が減少した（図５Ｄ）。
実施例６：低レベルのＲＯＲ１を発現するＮＳＣＬＣ細胞株に対するｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の反応性の分析
ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が抗原を認識することに対して影響を与えるかどうかを評価するため、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞及び対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）を、様々なレベルの細胞表面ＲＯＲ１を発現するように操作されたＨ１９７５細胞と共にインキュベートした（図６）。様々な強度を有する変異脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入部位要素のセットを使用して、広範囲にわたるヒトＲＯＲ１の相対発現を制御し、Ｈ１９７５－ＲＯＲ１ＫＯ細胞株に導入した（Ｋｏｈ ２０１３．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８（１２）：ｅ８２１００．ｄｏｉ：１０．１３７１）。細胞株によるＲＯＲ１の発現レベルは、幾何ＭＦＩとして表される（図６）。これらの細胞を１４８時間にわたって共インキュベートし、様々な時点で、ＮＬＲ陽性細胞の総数をカウントし、時点０時間でのカウントに対して正規化し、正規化された標的の殺傷を算出した。最初の抗原刺激から２４時間後に上清を回収し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘを使用してＩＬ－２及びＩＦＮ－γの量も定量した。
図７に示すように、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞及び対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）は、ＲＯＲ１抗原密度にかかわらず、同様の速度でＨ１９７５細胞を溶解した。ＩＬ－２及びＩＦＮ－γレベルを定量した場合にも同様の結果が観察された（図８Ａ及び８Ｂ）。これらの結果は、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞がエフェクター機能を発揮するために必要な抗原密度閾値を実質的に変化させないことを示唆している。
実施例７：ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の分析
ｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、ｉｎ ｖｉｖｏでもＣＡＲ Ｔ細胞の様々な機能特性を改善することができるかどうかを評価するために、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を異種移植動物モデルで調べた。簡潔には、腫瘍細胞（すなわち、ＲＯＲ１陽性Ｈ１９７５ ＮＳＣＬＣ細胞株）を、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの脇腹から皮下移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達した時点で、以下のうちの１つをマウスに静脈内注入した：（ｉ）非形質導入ｍｏｃｋ Ｔ細胞、（ｉｉ）対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）、または（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞。抗腫瘍活性は、ノギスを使用して腫瘍体積を測定することによって評価し、処置関連毒性は、動物の体重を測定することによって評価した。さらに、Ｔ細胞の増殖を、Ｔ細胞注入の２４時間後から毎週採取した末梢血のフローサイトメトリーを使用して、合計６週間評価した。
図９Ａ及び９Ｃに示すように、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）で処置した動物は、最初は腫瘍増殖を制御しているように見えたが、最終的には腫瘍により死亡し、動物の約４０％のみが実験の終了まで生存した。対照的に、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）で処置した動物は、有意に優れた腫瘍制御を示し、実験の全期間を通じて生存した。改善された抗腫瘍データと一致して、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、対照抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）と比較して、はるかに優れた持続性及び増殖も示した。（図１０）。これらの結果は、前のｉｎ ｖｉｔｒｏデータを裏付けると共に、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が、より伝統的な抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）と比較して、はるかに改善された抗腫瘍効果を示すことを実証する。
実施例８：臨床開発
ＲＯＲ１陽性再発性及び／または難治性ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ患者におけるｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の安全性、ＰＫ、及び抗腫瘍活性を評価するために設計された、ＦＩＨ第１相、単群、非盲検、用量漸増及び拡大、多施設共同試験が実施される。この第１相試験の主要目的は、再発性／難治性ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ患者におけるｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の安全性及び忍容性を評価すること、ならびにｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞のＲＰ２Ｄを特定することである。この第１相試験の副次的目的は、ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価すること、ならびにｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の末梢血サンプルにおけるＰＫ（例えば、増殖及び持続性）を評価することである。
第１相設計案
これは、再発性及び／または難治性ＴＮＢＣ及びＮＳＣＬＣ患者におけるｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の安全性、ＰＫ、及び抗腫瘍活性を評価するために設計された、単群、非盲検、用量漸増及び拡大、多施設共同試験である。用量漸増段階では、ＴＮＢＣの参加者のみが登録され、拡大段階では、ＴＮＢＣとＮＳＣＬＣの両試験コホートに登録が行われる。
他の適格基準に加えて、免疫組織化学によるＲＯＲ１陽性で、チェックポイント阻害剤及びアブラキサンを含む２ラインの治療が奏功しなかったＴＮＢＣ、またはＥＧＦＲ＋及びＡＬＫ＋疾患患者に対する標的療法を含む２ラインの治療が奏功しなかったＮＳＣＬＣの参加者は、登録する資格がある。すべての適格基準を満たす参加者が登録され、製品の生成を可能にする白血球アフェレーシスを受ける。製品の製造が成功した後、参加者は投与段階に入り、１サイクルの投与を受ける。投与サイクルは、フルダラビン及びシクロホスファミドによる３日間のリンパ球除去化学療法に続いて、プロトコルで定められた用量レベルの１つで細胞製品を単回ＩＶ投与することを含む。細胞製品は、医療モニターとの協議後に、臨床的または物流上の状況によりこのタイミングを後日変更する必要がない限り、リンパ球除去化学療法の完了から数日後に投与される。
参加者は、細胞製品の投与後最大２年間、安全性、疾患状態、追加の抗がん療法、及び生存について追跡調査される。ｃ－Ｊｕｎ過剰発現抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与されたすべての参加者は、この試験の完了時または中止時に資金援助長期追跡（ＬＴＦＵ）試験への登録を依頼される。

Claims (147)

  1. ｃ－Ｊｕｎポリペプチド（ｃ－ｊｕｎ）、ＲＯＲ１結合タンパク質、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  2. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが、前記キメラポリペプチドが細胞内で発現された場合に、前記細胞の疲弊を防止または低減することが可能である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記ＲＯＲ１結合タンパク質が、ＲＯＲ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記ＣＡＲが、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記ＲＯＲ１結合タンパク質が、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する、請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記ＲＯＲ１結合タンパク質が、前記Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに前記Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号４５を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号４６を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号４７を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号４９を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号５０を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号５１を含む、請求項７または８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記ＲＯＲ１結合部分のＶＨが、配列番号４４を含み、前記ＲＯＲ１結合部分のＶＬが、配列番号４８を含む、請求項６または７に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記ＲＯＲ１結合部分が、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記ＣＡＲがさらに、膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む、請求項４～１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記ＴＭドメインが、ＣＤ８ａ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ１５２、またはそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記ＴＭドメインが、ＣＤ２８に由来する、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記ＴＭドメインが、配列番号５４に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記ＣＡＲがさらに、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分と前記ＴＭドメインとの間にスペーサーを含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記スペーサーが、免疫グロブリンヒンジ領域またはＣＤ８に由来する、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記スペーサーが、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記スペーサーがさらにリンカーを含む、請求項１６～１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記リンカーが、ＧＧＧＳＧ（配列番号１６）を含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記ＣＡＲがさらに、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項４～２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  22. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ活性化ドメイン、ＣＤ３δ活性化ドメイン、ＣＤ３ε活性化ドメイン、ＣＤ３η活性化ドメイン、ＣＤ７９Ａ活性化ドメイン、ＤＡＰ１２活性化ドメイン、ＦＣＥＲ１Ｇ活性化ドメイン、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８活性化ドメイン、ＺＡＰ７０活性化ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
  23. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
  24. 前記ＣＤ３ζ活性化ドメインが、配列番号５５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記ＣＡＲが、細胞内共刺激シグナル伝達領域を含む、請求項４～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインが、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、Ｂ７－Ｈ３、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣＡ）、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ－１、ＴＩＬＲ２、ＴＩＬＲ４、ＴＩＬＲ７、ＴＩＬＲ９、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせの共刺激ドメインを含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  28. 前記４－１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号５３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
  29. （ｉ）ＲＯＲ１結合タンパク質、（ｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むスペーサー、（ｉｉｉ）ＣＤ２８膜貫通タンパク質、（ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激領域、及び（ｖ）ＣＤ３ζ活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  30. （ｉ）Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに前記Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＲＯＲ１結合タンパク質、（ｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むスペーサー、ならびに（ｉｉｉ）切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするヌクレオチド配列を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  31. 前記ＲＯＲ１結合部分のＶＨが、配列番号４４を含み、前記ＲＯＲ１結合部分のＶＬが、配列番号４８を含む、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記ＥＧＦＲｔが、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０または３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. さらに、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２９～３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  34. 前記ｃ－ｊｕｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び前記ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が、同じベクター上にある、請求項１～２８及び３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 前記ｃ－ｊｕｎポリペプチドと前記ＣＡＲが、リンカーによって連結される、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
  36. 前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
  37. 前記リンカーが、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記ｃ－ｊｕｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び前記ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が、異なるベクター上にある、請求項１～２８及び３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  39. さらに、切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～２８及び３３～３８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  40. 前記切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードするヌクレオチド配列及び前記ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が、同じベクター上にある、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
  41. 前記ＥＧＦＲｔと前記ＣＡＲが、リンカーによって連結される、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  42. 前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
  43. 前記リンカーが、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
  44. 前記ＣＡＲがさらにシグナルペプチドを含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  45. 前記シグナルペプチドが、ｈＩｇＫに由来する、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
  46. 前記ｈＩｇＫシグナルペプチドが、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
  47. 前記ＥＧＦＲｔが、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  48. さらに、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、及び／またはユビキチンプロモーターを含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記ＭＮＤプロモーターが、配列番号６４に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
  50. 配列番号５８に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  51. 配列番号５７に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
  52. 請求項１～５１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  53. 請求項１～５１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５２に記載のベクターによってコードされるポリペプチド。
  54. （ｉ）ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分、（ｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むスペーサー、（ｉｉｉ）ＣＤ２８膜貫通タンパク質、（ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激領域、及び（ｖ）ＣＤ３ζ活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
  55. 前記ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分が、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する、請求項５４に記載のポリペプチド。
  56. 前記ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分が、前記Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに前記Ｒ１２抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項５５に記載のポリペプチド。
  57. 前記ＶＨ ＣＤＲ１が、配列番号４５を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が、配列番号４６を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が、配列番号４７を含む、請求項５６に記載のポリペプチド。
  58. 前記ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号４９を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号５０を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号５１を含む、請求項５６または５７に記載のポリペプチド。
  59. 前記ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分のＶＨが、配列番号４４を含み、前記ＲＯＲ１結合部分のＶＬが、配列番号４８を含む、請求項５７または５８に記載のポリペプチド。
  60. 前記ＲＯＲ１結合抗体またはその抗原結合部分が、配列番号５２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５３～５９に記載のポリペプチド。
  61. さらに、膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む、請求項５３～６０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  62. 前記ＣＤ２８ ＴＭドメインが、配列番号５４に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
  63. 前記ＣＤ３ζ活性化ドメインが、配列番号５５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５３～６２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  64. 前記４－１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号５３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５３～６３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  65. ｃ－Ｊｕｎポリペプチド（ｃ－ｊｕｎ）、ＣＡＲポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含むキメラポリペプチド。
  66. 前記ＣＡＲポリペプチドが、請求項５３～６４のいずれか１項を含む、請求項６５に記載のキメラポリペプチド。
  67. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６５または６６に記載のキメラポリペプチド。
  68. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが、前記キメラポリペプチドが細胞内で発現された場合に、前記細胞の疲弊を防止または低減することが可能である、請求項６５～６７のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  69. 前記ｃ－ｊｕｎポリペプチド及び前記ＣＡＲポリペプチドが、同じベクター上にある、請求項６５～６８のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  70. 前記ｃ－ｊｕｎポリペプチドと前記ＣＡＲポリペプチドが、リンカーによって連結される、請求項６９に記載のキメラポリペプチド。
  71. 前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項７０に記載のキメラポリペプチド。
  72. 前記リンカーが、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７１に記載のキメラポリペプチド。
  73. 前記ｃ－ｊｕｎポリペプチド及び前記ＣＡＲポリペプチドが、異なるベクター上にある、請求項６５～６７のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  74. 前記切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）及び前記ＣＡＲが、同じベクター上にある、請求項６５～７３に記載のキメラポリペプチド。
  75. 前記ＥＧＦＲｔと前記ＣＡＲが、リンカーによって連結される、請求項７４に記載のキメラポリペプチド。
  76. 前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項７５に記載のキメラポリペプチド。
  77. 前記リンカーが、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７６に記載のキメラポリペプチド。
  78. 前記ＥＧＦＲｔが、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６５～７７のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  79. 配列番号５２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６５～７８のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  80. 配列番号５２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチド。
  81. 前記ＣＡＲポリペプチドがさらに、シグナルペプチドを含む、請求項６５～８０のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
  82. 前記シグナルペプチドが、ｈＩｇＫに由来する、請求項８１に記載のキメラポリペプチド。
  83. 前記ｈＩｇＫシグナルペプチドが、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８２に記載のキメラポリペプチド。
  84. 請求項１～５１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項５２に記載のベクター、請求項５３～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項６５～８３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む修飾された細胞。
  85. ｃ－ｊｕｎポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む修飾された細胞。
  86. 前記ＣＡＲポリペプチドが、請求項５３～６４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、請求項８５に記載の修飾された細胞。
  87. 前記ＣＡＲポリペプチド及び前記ＥＧＦＲｔが、前記細胞表面で発現される、請求項８５または８６に記載の修飾された細胞。
  88. 前記細胞が、免疫細胞である、請求項８４～８７のいずれか１項に記載の修飾された細胞。
  89. 前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、及びそれらの任意の組み合わせである、請求項８８に記載の修飾された細胞。
  90. 前記細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで操作される、請求項８３～８９のいずれか１項に記載の修飾された細胞。
  91. 前記細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養される、請求項８３～９０のいずれか１項に記載の修飾された細胞。
  92. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現が、請求項１～５１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項５２に記載のベクター、請求項５３～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項６５～８３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドを含むように修飾されていない対応する細胞と比較して増加する、請求項８４～９１のいずれか１項に記載の修飾された細胞。
  93. 前記対応する細胞と比較して、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドの発現が、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１，０００倍以上増加する、請求項９２に記載の修飾された細胞。
  94. ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞の集団であって、抗原刺激後に、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含まない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞を含む、前記集団。
  95. 前記抗原刺激後の集団に存在するＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞の数が、前記参照集団と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％減少する、請求項９４に記載の免疫細胞の集団。
  96. 前記抗原刺激後に、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、または約５％未満のＴＩＧＩＴ陽性免疫細胞を含む、請求項９４または９５に記載の免疫細胞の集団。
  97. ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞の集団であって、抗原刺激後に、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含まない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞を含む、前記集団。
  98. 前記抗原刺激後の集団に存在するＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞の数が、前記参照集団と比較して、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％減少する、請求項９７に記載の免疫細胞の集団。
  99. 前記抗原刺激後に、約５％未満、約４．５％未満、約４％未満、約３．５％未満、または約２％未満のＴＮＦＲＳＦ９陽性免疫細胞を含む、請求項９７または９８に記載の免疫細胞の集団。
  100. ｃ－Ｊｕｎポリペプチド、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞の集団であって、抗原刺激後に、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含まない対応する細胞の参照集団と比較して減少した数のＧＺＭＡ陽性免疫細胞を含む、前記集団。
  101. 前記抗原刺激後の集団に存在するＧＺＭＡ陽性免疫細胞の数が、前記参照集団と比較して、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約２０％減少する、請求項１００に記載の免疫細胞の集団。
  102. 前記抗原刺激後に、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、または約１０％未満のＧＺＭＡ陽性免疫細胞を含む、請求項１００または１０１に記載の免疫細胞の集団。
  103. 前記ＣＡＲポリペプチドが、請求項５４～６４のいずれか１項に記載のＣＡＲポリペプチドを含む、請求項９４～１０２のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団。
  104. 前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９４～１０３のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団。
  105. 前記ＥＧＦＲｔが、配列番号３に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９４～１０４のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団。
  106. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９４～１０５のいずれか１項に記載の免疫細胞の集団。
  107. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１０６に記載の免疫細胞の集団。
  108. 請求項１～５１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項５２に記載のベクター、請求項５３～６４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項６５～８３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド、または請求項８４～９３のいずれか１項に記載の修飾された細胞、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
  109. 請求項１～５１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５２に記載のベクターを細胞にトランスフェクションすることを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を調製する方法。
  110. 請求項５３～６４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項６５～８３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドを細胞内で発現させることを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を調製する方法。
  111. 前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０９または１１０に記載の方法。
  112. 前記細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養される、請求項１０９～１１１のいずれか１項に記載の方法。
  113. 適切な条件下で、請求項１～５１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドもしくは請求項５２に記載のベクターを含む、または請求項５３～６４のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくは請求項６５～８３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドを発現する細胞を培養することを含む、キメラ抗原受容体を発現する細胞を増殖させる方法。
  114. 腫瘍の処置を必要とする対象におけるその処置方法であって、前記対象に対して、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞を投与することを含む前記方法であり、前記ＣＡＲは、前記腫瘍で発現される抗原に対して特異的である、前記方法。
  115. 前記免疫細胞が、請求項８４～９３のいずれか１項に記載の修飾された細胞を含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記腫瘍が、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）癌、胃腸癌、卵巣癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する、請求項１１４または１１５に記載の方法。
  117. 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１１４～１１６のいずれか１項に記載の方法。
  118. さらに、少なくとも１つの追加の治療剤を前記対象に投与することを含む、請求項１１４～１１７のいずれか１項に記載の方法。
  119. 前記少なくとも１つの追加の治療剤が、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの治療、サイトカイン、外科手術、放射線治療、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記投与後、前記腫瘍のサイズ（腫瘍サイズ）が、参照腫瘍サイズと比較して減少する、請求項１１４～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. 前記参照腫瘍サイズが、（ｉ）前記投与前の腫瘍サイズ、（ｉｉ）前記投与を受けなかった（例えば、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象における腫瘍サイズ、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記参照腫瘍サイズと比較して、前記腫瘍サイズが、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％減少する、請求項１２１または１２２に記載の方法。
  124. 前記投与後、前記対象の生存期間が、参照生存期間と比較して延長される、請求項１１４～１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 前記参照生存期間が、前記投与を受けなかった（例えば、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞の投与を受けた）対応する対象の生存期間を含む、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記参照生存期間と比較して、前記生存期間が、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、少なくとも約３か月、少なくとも約４か月、少なくとも約５か月、少なくとも約６か月、少なくとも約７か月、少なくとも約８か月、少なくとも約９か月、少なくとも約１０か月、少なくとも約１１か月、または少なくとも約１年延長される、請求項１２４または１２５に記載の方法。
  127. 前記投与後、前記免疫細胞が、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞と比較して、前記対象内でより長く存続することが可能である、請求項１１４～１２６のいずれか１項に記載の方法。
  128. 前記投与後、前記免疫細胞が、前記対応する免疫細胞よりも前記対象内で少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、少なくとも約３か月、少なくとも約４か月、少なくとも約５か月、または少なくとも約６か月長く存続することが可能である、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記対応する免疫細胞の投与を受けた参照対象に存在する前記対応する免疫細胞と比較して、前記投与後約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約７か月、または約８か月で、前記対象には、約１倍～約１０倍多くの前記免疫細胞が存在する、請求項１２７または１２８に記載の方法。
  130. 腫瘍細胞の殺傷方法であって、前記腫瘍細胞を、ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び切断型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）を含む免疫細胞と接触させることを含む前記方法であり、前記ＣＡＲが、前記腫瘍細胞で発現される抗原に対して特異的である、前記方法。
  131. 前記免疫細胞が、請求項８４～９３のいずれか１項に記載の修飾された細胞を含む、請求項１２９に記載の方法。
  132. 前記腫瘍細胞の殺傷が、前記腫瘍細胞を前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを過剰発現しない対応する免疫細胞と接触させる参照方法と比較して増加する、請求項１２９または１３０に記載の方法。
  133. 前記参照方法と比較して、前記腫瘍細胞の殺傷が、少なくとも約０．５倍、１倍、少なくとも約２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加する、請求項１３１に記載の方法。
  134. 抗原刺激に応答した免疫細胞によるサイトカインの産生を増加させる方法であって、前記免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含む前記方法であり、前記ＲＯＲ－１結合タンパク質が、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する、前記方法。
  135. 前記サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、またはその両方を含む、請求項１３３に記載の方法。
  136. 前記修飾後、前記抗原刺激に応答したサイトカインの産生が、前記対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍増加する、請求項１３４または１３５に記載の方法。
  137. 前記サイトカインの産生の増加が、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘアッセイを使用して測定される、請求項１３４～１３６のいずれか１項に記載の方法。
  138. 抗原刺激に応答した免疫細胞の増殖を増加させる方法であって、前記免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含む前記方法であり、前記ＲＯＲ－１結合タンパク質が、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する、前記方法。
  139. 前記修飾後、前記抗原刺激に応答した免疫細胞の増殖が、前記対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍増加する、請求項１３７に記載の方法。
  140. 前記増殖の増加により、前記免疫細胞の数が増加する、請求項１３７または１３８に記載の方法。
  141. 持続抗原刺激に応答した免疫細胞のエフェクター機能を増加させる方法であって、前記免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含む前記方法であり、前記ＲＯＲ－１結合タンパク質が、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する、前記方法。
  142. 前記免疫細胞が、前記対応する免疫細胞と比較して、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回のさらなる抗原刺激アッセイに対してエフェクター機能を保持する、請求項１４０に記載の方法。
  143. 前記エフェクター機能が、（ｉ）腫瘍細胞を殺傷する能力、（ｉｉ）さらなる抗原刺激後にサイトカインを産生する能力、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方の能力を含む、請求項１４０または１４１に記載の方法。
  144. 前記免疫細胞のエフェクター機能が、前記対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍増加する、請求項１４０～１４２のいずれか１項に記載の方法。
  145. 持続抗原刺激に応答した免疫細胞の疲弊を低減または防止する方法であって、前記免疫細胞を、（ｉ）ＲＯＲ－１結合タンパク質を発現するように、及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルが、前記ｃ－Ｊｕｎポリペプチドのレベルを上昇させるように修飾されていない対応する免疫細胞と比較して上昇するように修飾することを含む前記方法であり、前記ＲＯＲ－１結合タンパク質が、Ｒ１２抗体と同じエピトープに特異的に結合する、前記方法。
  146. 前記修飾後、前記持続抗原刺激に応答して、前記免疫細胞が、前記対応する免疫細胞と比較して、（ｉ）疲弊に関連する遺伝子のレベルの低下、（ｉｉ）活性化に関連する遺伝子のレベルの増加、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を発現する、請求項１４４に記載の方法。
  147. 前記免疫細胞が、請求項６～５１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むように修飾される、請求項１３３～１４５のいずれか１項に記載の方法。
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