TW202246504A

TW202246504A - 靶向嵌合抗原受體之ｒｏｒ１

Info

Publication number: TW202246504A
Application number: TW111107188A
Authority: TW
Inventors: 俊勇朴; 沛雅黃; 布萊斯颯特; 秉昱柳; 馬克拉潔; 赫威爾墨菲特; 布萊恩威赤奈爾; 韞宋; 史考特布威肯; 尼拉潔沙馬; 舒巴波特魯裡; 比讓波爾達吉普爾
Original assignee: 美商萊爾免疫藥物股份有限公司
Priority date: 2021-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2022-12-01
Also published as: AU2022227686A1; JP2024510898A; KR20230148837A; WO2022182891A1; CA3172530A1; US20230022654A1; IL304355A; EP4298120A1

Abstract

本揭示案係關於編碼包含c-Jun多肽、ROR1結合蛋白及截短EGF受體之嵌合多肽的多核苷酸。亦提供表現CAR的細胞(例如，T細胞)，該等CAR包含ROR1結合蛋白並且過度表現c-Jun多肽。CAR T細胞中之c-Jun之過度表現賦予經改良之性質，例如，減少或防止耗竭。

Description

靶向嵌合抗原受體之ROR1

使用表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞之接受性免疫療法係有希望的癌症治療，因為此等細胞可以不依賴於人類白血球抗原(HLA)之方式直接識別及殺滅表現抗原之腫瘤細胞。然而，T細胞耗竭係限制CAR T細胞治療劑之功效的主要因數。

因此，需要提供耗竭抗性CAR T細胞以便允許最大功效的方法。

在一些態樣中，本發明提供編碼包含c-Jun多肽(c-jun)、ROR1結合蛋白及截短EGF受體(EGFRt)之嵌合多肽的多核苷酸。在一些態樣中，c-Jun多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，當嵌合多肽在細胞中表現時，c-Jun多肽能夠防止或減少細胞之耗竭。在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含特異性結合至ROR1之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。在一些態樣中，CAR包含特異性結合至ROR1之抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，ROR1結合蛋白特異性結合至與R12抗體相同的抗原決定基。在一些態樣中，ROR1結合蛋白包含有包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的輕鏈可變區(VL)。在一些態樣中，VH CDR1包含SEQ ID NO：45，VH CDR2包含SEQ ID NO：46，並且VH CDR3包含SEQ ID NO：47。在一些態樣中，VL CDR1包含SEQ ID NO：49，VL CDR2包含SEQ ID NO：50，並且VL CDR3包含SEQ ID NO：51。在一些態樣中，ROR1結合部分之VH包含SEQ ID NO：44並且ROR1結合部分之VL包含SEQ ID NO：48。在一些態樣中，ROR1結合部分包含與SEQ ID NO：52具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，CAR進一步包含跨膜(TM)域。在一些態樣中，TM域衍生自CD8a、CD2、CD4、CD28、CD45、PD1、CD152，或其任何組合。在一些態樣中，TM域衍生自CD28。在一些態樣中，TM域包含與SEQ ID NO：54具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，編碼本揭示案之CAR的多核苷酸進一步包含特異性結合至ROR1之抗體或其抗原結合部分與TM域之間的間隔基。在一些態樣中，間隔基衍生自免疫球蛋白鉸鏈區或CD8。在一些態樣中，間隔基包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列。在一些態樣中，間隔基進一步包含連接子。在一些態樣中，連接子包含GGGSG (SEQ ID NO：16)。在一些態樣中，CAR進一步包含細胞內信號轉導域。在一些態樣中，其中細胞內信號轉導域包含CD3 ζ活化域、CD3δ活化域、CD3ε活化域、CD3η活化域、CD79A活化域、DAP 12活化域、FCER1G活化域、DAP10/CD28活化域、ZAP70活化域，或其任何組合。在一些態樣中，細胞內信號轉導域包含CD3 ζ活化域。在一些態樣中，CD3 ζ活化域包含與SEQ ID NO：55具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或至少約100%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，CAR包含細胞內共刺激信號轉導區域。在一些態樣中，細胞內共刺激信號轉導域包含以下各者之共刺激域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、Lck結合缺失CD28(ICA)、OX40、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、Fc受體γ鏈、Fc受體ε鏈、與CD83特異性結合之配位體，或其任何組合。在一些態樣中，細胞內信號轉導域包含4-1BB共刺激域。在一些態樣中，4-1BB共刺激域包含與SEQ ID NO：53具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或至少約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，本發明提供包含編碼嵌合抗原受體之核苷酸序列的多核苷酸，該嵌合抗原受體包含(i)ROR1結合蛋白、(ii)包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的間隔基、(iii)CD28跨膜蛋白質、(iv)4-1BB共刺激區域，及(v)CD3 ζ活化域。

在一些態樣中，本文提供包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列的多核苷酸，該嵌合抗原受體包含(i)包含有包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的輕鏈可變區(VL)的ROR1結合蛋白；(ii)包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列之間隔基；及(iii)編碼截短EGF受體(EGFRt)之核苷酸序列。在一些態樣中，ROR1結合部分之VH包含SEQ ID NO：44並且ROR1結合部分之VL包含SEQ ID NO：48。在一些態樣中，EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，本文所述多核苷酸進一步包含編碼c-Jun多肽之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼c-jun多肽之核苷酸序列及編碼CAR之核苷酸序列在同一載體上。在一些態樣中，c-jun多肽及CAR藉由連接子來連接。在一些態樣中，連接子為可裂解連接子。在一些態樣中，連接子包含P2A連接子、T2A連接子，或其任何組合。在一些態樣中，編碼c-jun多肽之核苷酸序列及編碼CAR之核苷酸序列在不同載體上。

在一些態樣中，多核苷酸進一步包含編碼截短EGF受體(EGFRt)之核苷酸序列。在一些態樣中，編碼截短EGF受體(EGFRt)之核苷酸序列及編碼CAR之核苷酸序列在同一載體上。在一些態樣中，EGFRt及CAR藉由連接子來連接。在一些態樣中，連接子為可裂解連接子。在一些態樣中，連接子包含P2A連接子、T2A連接子，或其任何組合。在一些態樣中，CAR進一步包含信號肽。在一些態樣中，信號肽衍生自hIgK。在一些態樣中，hIgK信號肽包含如SEQ ID NO：17闡述之胺基酸序列。在一些態樣中，EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，本文揭示之多核苷酸進一步包含骨髓增生性肉瘤病毒增強子、負控制區域缺失，dl587rev引子結合位點取代(MND)啟動子、EF1a啟動子，及/或泛素啟動子。在一些態樣中，MND啟動子包含與SEQ ID NO：64具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO：58具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列的核苷酸序列。

在一些態樣中，本發明提供編碼CAR之多核苷酸，其包含編碼與SEQ ID NO：57具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列的核苷酸序列。

在一些態樣中，本發明提供包含本文揭示之多核苷酸的載體。在一些態樣中，本發明提供由本文揭示之多核苷酸或載體編碼之多肽。

在一些態樣中，本發明提供嵌合抗原受體(CAR)多肽，其包含(i)ROR1結合抗體或其抗原結合部分、(ii)包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的間隔基、(iii)CD28跨膜蛋白質、(iv)4-1BB共刺激區域，及(v)CD3 ζ活化域。在一些態樣中，ROR1結合抗體或其抗原結合部分特異性結合至與R12抗體相同的抗原決定基。在一些態樣中，ROR1結合抗體或其抗原結合部分包含有包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的輕鏈可變區(VL)。在一些態樣中，VH CDR1包含SEQ ID NO：45，VH CDR2包含SEQ ID NO：46，並且VH CDR3包含SEQ ID NO：47。在一些態樣中，VL CDR1包含SEQ ID NO：49，VL CDR2包含SEQ ID NO：50，並且VL CDR3包含SEQ ID NO：51。在一些態樣中，ROR1結合抗體或其抗原結合部分之VH包含SEQ ID NO：44並且ROR1結合部分之VL包含SEQ ID NO：48。在一些態樣中，ROR1結合抗體或其抗原結合部分包含與SEQ ID NO：52具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，多肽進一步包含跨膜(TM)域。在一些態樣中，CD28 TM域包含與SEQ ID NO：54具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，CD3 ζ活化域包含與SEQ ID NO：55具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或至少約100%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，4-1BB共刺激域包含與SEQ ID NO：53具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或至少約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，本發明提供包含c-Jun多肽(c-jun)、CAR多肽及截短EGF受體(EGFRt)的嵌合多肽。在一些態樣中，CAR多肽為本文揭示之任何CAR多肽。在一些態樣中，c-Jun多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，當嵌合多肽在細胞中表現時，c-Jun多肽能夠防止或減少細胞之耗竭。在一些態樣中，其中c-jun多肽及CAR多肽在同一載體上。在一些態樣中，c-jun多肽及CAR多肽藉由連接子來連接。在一些態樣中，連接子為可裂解連接子。在一些態樣中，連接子包含P2A連接子、T2A連接子，或其任何組合。在一些態樣中，c-jun多肽及CAR多肽在不同載體上。在一些態樣中，截短EGF受體(EGFRt)及CAR在同一載體上。在一些態樣中，EGFRt及CAR藉由連接子來連接。在一些態樣中，連接子為可裂解連接子。在一些態樣中，連接子包含P2A連接子、T2A連接子，或其任何組合。在一些態樣中，EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，嵌合多肽包含與SEQ ID NO：52具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，本發明提供包含與SEQ ID NO：52具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性之胺基酸序列的嵌合多肽。在一些態樣中，CAR多肽進一步包含信號肽。在一些態樣中，信號肽衍生自hIgK。在一些態樣中，hIgK信號肽包含如SEQ ID NO：17闡述之胺基酸序列。

在一些態樣中，本發明提供包含多核苷酸、載體、多肽、嵌合多肽，或其任何組合的經修飾之細胞。

在一些態樣中，本發明提供包含c-jun多肽、嵌合抗原受體多肽及截短EGF受體(EGFRt)的經修飾之細胞。在一些態樣中，經修飾之細胞包含本文揭示之多肽。在一些態樣中，經修飾之細胞包含CAR多肽並且EGFRt在細胞表面上表現。在一些態樣中，細胞為免疫細胞。在一些態樣中，細胞為T細胞、B細胞、調控T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、幹細胞、誘導多能幹細胞，及其任何組合。在一些態樣中，細胞在活體外或離體工程化。在一些態樣中，細胞在活體外或離體培養。

在如上所述經修飾之細胞中之任一者中，在一些態樣中，與未修飾以便包含本揭示案之多核苷酸、載體、多肽，及/或嵌合多肽中之任一者的對應細胞相比，c-Jun多肽之表現增加。在一些態樣中，與對應細胞相比，c-Jun多肽之表現增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。

本文亦提供包含c-Jun多肽、嵌合抗原受體(CAR)多肽及截短EGF受體(EGFRt)的免疫細胞之群體，其中如與不包含c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，該群體包含減少數目之TIGIT陽性免疫細胞。

在一些態樣中，與參照群體相比，抗原刺激之後存在於群體中之TIGIT陽性免疫細胞之數目減少至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%，或至少約60%。在一些態樣中，在抗原刺激之後，免疫細胞之群體包含少於約15%、少於約14%、少於約13%、少於約12%、少於約11%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%，或少於約5%之TIGIT陽性免疫細胞。

在一些態樣中，本發明進一步提供包含c-Jun多肽、嵌合抗原受體(CAR)多肽及截短EGF受體(EGFRt)的免疫細胞之群體，其中如與不包含c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，該群體包含減少數目之TNFRSF9陽性免疫細胞。

在一些態樣中，與參照群體相比，抗原刺激之後，存在於群體中之TNFRSF9陽性免疫細胞之數目減少至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%，或至少約70%。在一些態樣中，抗原刺激之後，免疫細胞之群體包含少於約5%、少於約4.5%、少於約4%、少於約3.5%，或少於約2%之TNFRSF9陽性免疫細胞。

本文亦提供包含c-Jun多肽、嵌合抗原受體(CAR)多肽及截短EGF受體(EGFRt)的免疫細胞之群體，其中如與不包含c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，該群體包含減少數目之GZMA陽性免疫細胞。

在一些態樣中，與參照群體相比，抗原刺激之後，存在於群體中之GZMA陽性免疫細胞之數目減少至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%，或至少約20%。在一些態樣中，抗原刺激之後，免疫細胞之群體包含少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%，或少於約10%之GZMA陽性免疫細胞。

在如上所述免疫細胞之群體中之任一者中，在一些態樣中，CAR多肽包含本文所述CAR多肽中之任一者。在一些態樣中，c-Jun多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。

在以上提供之免疫細胞之群體中之任一者中，在一些態樣中，免疫細胞包含T細胞、B細胞、調控T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、幹細胞、誘導多能幹細胞，或其組合。在一些態樣中，免疫細胞為T細胞( 例如，CD4+T細胞、CD8+T細胞，或兩者)。

在一些態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本文揭示之多核苷酸、載體、多肽、嵌合多肽或經修飾之細胞及醫藥學上可接受之載劑。

在一些態樣中，本發明提供製備表現嵌合抗原受體之細胞的方法，其包括用本文揭示之多核苷酸或載體來轉染細胞。在一些態樣中，本發明提供製備表現嵌合抗原受體之細胞的方法，其包括在細胞中表現本文揭示之多肽或嵌合多肽。在一些態樣中，細胞包括T細胞、B細胞、調控T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、幹細胞、誘導多能幹細胞，及其任何組合。在一些態樣中，細胞在活體外或離體培養。

在一些態樣中，本發明提供擴增表現嵌合抗原受體之細胞的方法，其包括培養包含多核苷酸或載體的細胞或在合適條件下表現本文揭示之多肽或嵌合多肽。

在一些態樣中，本發明提供治療有需要之受試者之腫瘤的方法，其包括向受試者投與免疫細胞，其過度表現c-Jun多肽並且包含嵌合抗原受體(CAR)及截短EGF受體(EGFRt)，其中CAR對於在腫瘤中表現之抗原具有特異性。在一些態樣中，免疫細胞包括本文揭示之經修飾之細胞中之任一者。

在一些態樣中，腫瘤衍生自癌症，包括乳癌、頭頸癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、甲狀腺癌、食管癌、眼癌、胃癌、胃腸癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，或其組合。在一些態樣中，腫瘤為實體腫瘤。在一些態樣中，該方法進一步包括向受試者投與至少一種額外治療劑。在一些態樣中，至少一種額外治療劑包括化療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子之活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法，或其任何組合。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑包括抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗GITR抗體、抗TIM3抗體，或其任何組合。

在以上提供之治療方法中之任一者( 例如，治療腫瘤之方法)中，在一些態樣中，與參照腫瘤大小相比，在投與之後，腫瘤之大小(腫瘤大小)降低。在一些態樣中，參照腫瘤大小包括：(i)投與之前的腫瘤大小，(ii)未接受投與( 例如，接受不過度表現c-Jun多肽之對應免疫細胞之投與)的對應受試者中之腫瘤大小，或(iii)同時(i)及(ii)。在一些態樣中，與參照腫瘤大小相比，腫瘤大小降低至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。

在以上提供之治療方法中之任一者( 例如，治療腫瘤之方法)中，在一些態樣中，與參照存活持續時間相比，投與之後，受試者之存活持續時間增加。在一些態樣中，參照存活持續時間包括未接受投與( 例如，接受不過度表現c-Jun多肽之對應免疫細胞之投與)之對應受試者的存活持續時間。在一些態樣中，與參照存活持續時間相比，存活持續時間增加至少約一週、至少約兩週、至少約三週、至少約一個月、至少約兩個月、至少約三個月、至少約四個月、至少約五個月、至少約六個月、至少約七個月、至少約八個月、至少約九個月、至少約10個月、至少約11個月，或至少約一年。

在以上提供之治療方法中之任一者( 例如，治療腫瘤之方法)中，在一些態樣中，與不過度表現c-Jun多肽之對應免疫細胞相比，投與之後，免疫細胞能夠在受試者中持續更長時間。

在一些態樣中，投與之後，免疫細胞能夠在受試者中持續比對應免疫細胞長至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月，或至少約6個月。在一些態樣中，在投與之後約一個月、約兩個月、約三個月、約四個月、約五個月、約六個月、約七個月，或約八個月，如與存在於接受對應免疫細胞之投與的參照受試者中之對應免疫細胞相比，存在於受試者中之所投與免疫細胞為約1倍與約10倍之間。

本發明進一步提供殺滅腫瘤細胞之方法，其包括使腫瘤細胞與過度表現c-Jun多肽並且包含嵌合抗原受體(CAR)及截短EGF受體(EGFRt)之免疫細胞接觸，其中CAR對於在腫瘤細胞中表現之抗原具有特異性。在一些態樣中，免疫細胞包括本文提供之經修飾之細胞中之任一者。

在一些態樣中，與腫瘤細胞與不過度表現c-Jun多肽之對應免疫細胞接觸的參照方法相比，腫瘤細胞之殺滅增加。在一些態樣中，參照方法，腫瘤細胞之殺滅增加至少約0.5倍、1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。

本文亦提供增加響應於抗原刺激之藉由免疫細胞來產生細胞介素的方法，其包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準，其中ROR-1結合蛋白特異性結合至與R12抗體相同之抗原決定基。

在一些態樣中，細胞介素包括IFN-γ、IL-2，或兩者。在一些態樣中，與對應免疫細胞相比，修飾之後，響應於抗原刺激的細胞介素之產生增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。在一些態樣中，細胞介素之產生之增加使用Meso Scale Discovery (MSD) U-Plex檢定來量測。

在一些態樣中，本發明進一步提供增加響應於抗原刺激的免疫細胞之增殖的方法，其包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準，其中ROR-1結合蛋白特異性結合至與R12抗體相同之抗原決定基。

在一些態樣中，與對應免疫細胞相比，修飾之後，響應於抗原刺激的免疫細胞之增殖增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。在一些態樣中，增殖增加導致更大數目之免疫細胞。

本文提供增加響應於持續抗原刺激的免疫細胞之效應物功能的方法，其包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準，其中ROR-1結合蛋白特異性結合至與R12抗體相同之抗原決定基。

在一些態樣中，如與對應免疫細胞相比，免疫細胞保持效應物功能達抗原刺激檢定之至少一個、至少兩個，或至少三個額外循環。在一些態樣中，效應物功能包括以下能力：(i)殺滅腫瘤細胞(ii)在進一步抗原刺激後產生細胞介素，或(iii)同時(i)及(ii)。在一些態樣中，如與對應免疫細胞相比，免疫細胞之效應物功能增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。

本文提供減少或防止響應於持續抗原刺激的免疫細胞之耗竭的方法，其包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準，其中ROR-1結合蛋白特異性結合至與R12抗體相同之抗原決定基。在一些態樣中，如與對應免疫細胞相比，修飾之後，響應於持續抗原刺激，免疫細胞表現：(i)與耗竭相關之基因之降低水準，(ii)與活化相關之基因之增加水準，或(iii)同時(i)及(ii)。

在一些態樣中，適用於以上方法之免疫細胞經修飾以便包含本文所述多核苷酸中之任一者。

相關申請案之交叉引用

本PCT申請案要求2021年2月25日提交之美國臨時申請案第63/153,878號；2021年10月28日提交之第63/263,229號；及2022年2月11日提交之第63/309,393號的優先權益處；該等申請案各自以全文引用方式併入本文。經由EFS-WEB以電子方式提交的序列表之引用

在本申請案中提交的以電子方式提交的序列表(名稱：4385_042PC04_Seqlisting_ST25.txt，大小：80,716個位元組；及建置日期：2022年2月23日)之內容以全文引用方式併入本文。

本發明針對編碼嵌合結合蛋白( 例如，CAR)之多核苷酸( 例如，分離多核苷酸)。在一些態樣中，多核苷酸包含編碼c-Jun蛋白及/或截短EGFR的一或多個額外核苷酸序列。如本文所描述，在一些態樣中，此等額外組分( 亦即，c-Jun蛋白及/或截短EGFR)之表現可改良經修飾以便表現嵌合結合蛋白的細胞之一或多個性質。本發明提供表現本文所述多核苷酸的工程化細胞，諸如T細胞。工程化T細胞，例如，ROR特異性CAR T細胞，過度表現c-Jun。T細胞中之c-Jun之過度表現藉由例如減輕或防止T細胞功能不良(例如，T細胞耗竭)來有助於保持細胞之活化狀態。本發明工程化T細胞展現針對帶有ROR1之腫瘤細胞的持續、有效細胞毒性。如與不過度表現c-Jun之T細胞相比，本發明工程化T細胞顯示T細胞耗竭之較少跡象及持續效應細胞之增加跡象。

在更詳細地描述本發明之前，應瞭解本揭示案不限於所描述特定組合物或方法步驟，因為其當然可變化。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案後所顯而易知，本文中描述及說明的每個個別態樣具有可輕易地與任何其他幾個態樣之功能件分離或組合的分立組件及功能件，而不背離本揭示案之範圍或精神。所敘述之任何方法可以所敘述事件順序或在邏輯上可能之任何其他順序來執行。

本文提供之標題不限制本揭示案之各種態樣，該等態樣可參照整個說明書來定義。亦應理解本文中使用之術語僅用於描述特定態樣之目的，並且無意具有限制性，因為本揭示案之範圍僅受隨附請求項限制。

因此，以下直接定義之術語參照整個說明書來更完全定義。術語

為使本說明書可更容易理解，首先定義某些術語。除了如本文另外明確提供以外，以下術語之各者應具有以下闡述之含義。額外定義在整個實施方式中闡述。

應注意術語「一(個)」實體係指彼實體之一或多者；例如，「核苷酸序列」應理解為表示一或多個核苷酸序列。因此，術語「一(個)」、「一或多個」及「至少一個」可在本文中可互換使用。進一步應注意，請求項可撰寫成排除了任何視情況選用之要素。因此，對於與敘述請求項要素有關所使用之象「單獨」、「只」等此類排他性術語或所使用之否定性限制，此說明書僅欲充當一個先行基礎。

此外，本文使用之「及/或」應理解為具體揭示兩個指定特徵或組分中之各者，具有或不具有另一者。因此，如本文中之片語諸如「A及/或B」中所使用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)，及「B」(單獨)。同樣地，如片語諸如「A、B，及/或C」中所使用之術語「及/或」意欲包涵以下態樣中之各者：A、B，及C；A、B，或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。

應理解，當在本文中用語言「包含」描述各態樣時，亦提供以「由...組成」及/或「基本上由...組成」之術語描述之其他相似態樣。

除非另外定義，否則本文所用之全部技術及科學術語皆具有本揭示案相關領域之熟習此項技藝者通常理解的相同含義。舉例而言，以下出版物為熟習此項技術者提供本揭示案中所用的許多術語之綜合詞典：Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, 修訂版, 2000, Oxford University Press。

單位、前綴及符號皆以其國際單位制(Système International de Unites，(SI))公認形式表示。數值範圍包括限定該範圍的數值。當列舉值之範圍時，應瞭解彼範圍之所述上下限之間的各間插整數值，及其各分數亦，以及此等值之間之各子範圍得以具體地揭示。任何範圍之上下限可獨立地包含在該範圍中或自該範圍排除，並且其中包含任一極值、不包含任何極值或包含兩個極限的各範圍亦涵蓋在本揭示案內。因此，本文列舉之範圍應理解為該範圍內之全部值之簡略表達方式，包含所述端點。例如，1至10之範圍應理解為包括來自由1、2、3、4、5、6、7、8、9，及10組成之群的任何數字、數字之組合，或子範圍。

當明確敘述某個值時，應了解約為與所述值相同數量或量的值亦在本揭示案之範圍內。當揭示某個組合時，彼組合之要素之各子組合亦得以具體揭示並且在本揭示案之範圍內。相反地，當個別地揭示不同要素或要素之群組時，其組合亦得以揭示。當本揭示案之任何要素被揭示為具有複數個替代物時，各替代物單獨或在與其他替代物之任何組合形式下得以排除的本揭示案之實例亦由此得以揭示；本揭示案之一個以上要素可具有此類排除，並且具有此類排除的要素之所有組合由此得以揭示。

核苷酸係由其通常接受之單字母碼表示。除非另外指示，否則核苷酸序列在5'至3'方向上自左至右書寫。核苷酸在本文中係由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的其通常已知之一字母符號表示。因此，「a」表示腺嘌呤，「c」表示胞嘧啶，「g」表示鳥嘌呤，「t」表示胸腺嘧啶，並且「u」表示尿嘧啶。

胺基酸序列在胺基至羧基方向上自左至右書寫。胺基酸在本文中由其通常已知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學委員會推薦的單字母符號表示。

術語「約」在本文中用於意謂近似、大概、大約，或接近。當術語「約」與數值範圍結合使用時，其藉由將邊界擴展至所述數值以上及以下來修飾該範圍。一般而言，術語「約」可藉由例如向上或向下(增大或降低) 10%之變化來修飾高於或低於所述值之數值。

術語「投與(administration/administering)」及其語法變異體係指經由醫藥學上可接受之途徑，將本揭示案之組合物( 例如，編碼CAR之多核苷酸或表現CAR之細胞)引入受試者中。將本揭示案之組合物( 例如，編碼CAR之多核苷酸或表現CAR之細胞)引入受試者中係藉由任何合適途徑，包括腫瘤內、經口、經肺、鼻內、非經腸(靜脈內、動脈內、肌肉內、腹膜內，或皮下)、直腸、淋巴內、鞘內、眼周或局部。

投與包含自身投與及藉由另一者來投與。合適投與途徑允許組合物或藥劑執行其規定功能。例如，若合適途徑為靜脈內，組合物藉由將組合物或藥劑引入受試者之靜脈中來投與。

術語「胺基酸取代」係指將存在於母體或參照序列( 例如，野生型序列)中之胺基酸殘基用另一個胺基酸殘基來置換。胺基酸可在母體或參照序列 ( 例如，野生型多肽序列)中，例如，經由化學肽合成或經由在此項技術中已知之重組方法來取代。因此，提及「位置X處之取代」係指存在於位置X處之胺基酸用替代胺基酸殘基來取代。在一些態樣中，取代方式可根據模式AnY來描述，其中A為對應於天然地或最初存在於位置n處之胺基酸的單一字母代碼，並且Y為取代胺基酸殘基。在一些態樣中，取代方式可根據模式An(YZ)來描述，其中A為對應於取代天然地或最初存在於位置n處之胺基酸的胺基酸殘基的單一字母代碼，並且Y及Z為可置換A之替代取代胺基酸殘基。

如本文所用，術語「近似」在應用於所感興趣的一個或多個值時係指與規定參照值相似之值。在某些態樣中，術語「近似」係指在任一方向(大於或小於)上落於規定參照值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小範圍內的一系列值，除非另外規定或另外自上下文中顯而易見(除此類數字超過可能值之100%的情形以外)。

如本文所用，術語「保守」係指在進行比較的兩個或兩個以上序列之相同位置中無改變地出現的相應多核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基。相對保守的核苷酸或胺基酸係在更相關序列之中保守的核苷酸或胺基酸，而非在序列中之其他位置中出現的核苷酸或胺基酸。

在一些態樣中，兩個或兩個以上序列若其彼此100%一致，則被認為「完全保守」或「一致」。在一些態樣中，兩個或兩個以上序列若其彼此至少約70%一致、至少約75%一致、至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致，或至少約95%一致，則被認為「高度保守」。在一些態樣中，兩個或兩個以上序列若其彼此約70%一致、約75%一致、約80%一致、約85%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致，或約99%一致，則被認為「高度保守」。在一些態樣中，兩個或兩個以上序列若其彼此至少約30%一致、至少約35%一致、至少約40%一致、至少約45%一致、至少約50%一致、至少約55%、至少約60%一致、至少約65%一致、至少約70%一致、至少約75%一致、至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致，或至少約95%一致，則被認為「保守」。在一些態樣中，兩個或兩個以上序列若其彼此約30%一致、約35%一致、約40%一致、約45%一致、約50%一致、約55%一致、約60%一致、約65%一致、約70%一致、約75%一致、約80%一致、約85%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致，或約99%一致，則被認為「保守」。序列之保守可應用於多核苷酸或多肽之整個長度或可應用於其一部分、區域或特徵。

如本文所用之術語「衍生自」指示第一與第二分子之間的關係( 例如，結構相似性)。例如，在本揭示案之CAR間隔基包含衍生自人類免疫球蛋白序列(例如，鉸鏈及/或恆定區序列)之胺基酸序列的情況下，衍生自人類免疫球蛋白序列(例如，鉸鏈及/或恆定區序列)之序列可包含或由以下組成：完整鉸鏈、鉸鏈片段、完整鉸鏈或鉸鏈片段加上與野生型免疫球蛋白中之鉸鏈相鄰之額外殘基( 例如，來自恆定域諸如CH1或CH2域之一或多個胺基酸)，或可包含或由以下組成：環區域之完整序列、環區域片段，或環區域片段加上與野生型免疫球蛋白中之環相鄰之額外殘基(例如，來自與CH1、CH2或CH3域中之環區域相鄰之二級結構元件例如b褶板的一或多個胺基酸)。在一些態樣中，衍生自恆定域之間隔基可衍生自輕鏈恆定域(CL)。

如本文所用之術語「環區域」係指胺基酸殘基之一級序列，其在環區域之一級結構之緊鄰N端及C端方向上，連接包含二級結構諸如α-螺旋或β-褶板的兩個區域。環區域之實例包括但不限於CH2或CH3環區域。免疫球蛋白折疊包括藉由希臘鑰匙拓撲結構，在兩個β-褶板中配置的7至9個反平行β-鏈之2層分層結構。因此，本揭示案之恆定域衍生CAR間隔基可包含環序列(或其片段)、由該環序列組成，或基本上由該環序列組成，該環序列在免疫球蛋白域，例如，恆定免疫球蛋白域(例如，CH1、CH2、CH3，或CL)中連接b-褶板A及b-褶板B，b-褶板B及b-褶板C，b-褶板C及b-褶板C’，b-褶板C’及b-褶板C’’，b-褶板C’’及b-褶板D，b-褶板D及b-褶板E，b-褶板E及b-褶板F，或b-褶板F及b-褶板G。

本文揭示之衍生自人類Ig免疫球蛋白(例如，鉸鏈及/或恆定區序列)之CAR間隔基亦涵蓋經由肽鍵來共價連接如上所述之鉸鏈區衍生序列而產生之序列， 亦即，間隔基可為包含完整鉸鏈、其片段，或其組合的多個重複序列的聚合物。

在一些態樣中，「衍生自」第二核酸序列(例如，衍生自CD8a TM序列之目前揭示CAR的TM域序列)的核酸序列可包括與第二核酸序列之核苷酸序列一致或實質上類似的核苷酸序列。在一些態樣中，核酸序列可藉由例如天然發生之誘變、人工定向誘變或人工隨機誘變來獲得。用於衍生核苷酸之誘變可為有意地定向的或有意地隨機的，或各者之混合物。誘變核苷酸以便產生衍生自第一者之不同核苷酸可為隨機事件( 例如，藉由聚合酶失真來引起)並且衍生核苷酸之鑑別可藉由例如如本文論述之合適篩檢方法來進行。

在一些態樣中，衍生自第二核苷酸序列之核苷酸或胺基酸與相應地第二核苷酸序列具有至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約56%、至少約57%、至少約58%、至少約59%、至少約60%、至少約61%、至少約62%、至少約63%、至少約64%、至少約65%、至少約66%、至少約67%、至少約68%、至少約69%、至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%之序列一致性，其中第一核苷酸序列保持第二核苷酸序列之生物活性。

術語「互補」及「互補性」係指藉由Watson-Crick鹼基配對規則來彼此相關的兩個或兩個以上寡聚物( 亦即，各自包含核鹼基序列)，或在寡聚物與標靶基因之間。例如，核鹼基序列「T-G-A(5’à3’)」與核鹼基序列「A-C-T(3’à5’)」互補。互補性可為「部分的」，其中根據鹼基配對規則，給定核鹼基序列之少於全部核鹼基與另一核鹼基序列匹配。例如，在一些態樣中，給定核鹼基序列與其他核鹼基序列之間之互補性可為約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。或者，給定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間可存在「完全」或「完美」(100%)互補性以便繼續該實例。核鹼基序列之間之互補性程度對於序列之間之雜交之效率及強度具有顯著效應。

術語「下游」係指位於參照核苷酸序列3’之核苷酸序列。在某些態樣中，下游核苷酸序列涉及在轉錄開始點之後的序列。例如，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄開始位點下游。術語「上游」係指位於參照核苷酸序列5’之核苷酸序列。

如本文所用，術語「抗原結合域」及「抗體」涵蓋天然或部分或全部合成產生之免疫球蛋白，及其抗原結合部分。該術語亦包括具有與免疫球蛋白結合域同源之結合域的任何蛋白。「抗原結合域」及「抗體」進一步包括包含框架區之多肽，該框架區來自特異性結合並且識別抗原，並且包含至少一個CDR的免疫球蛋白或其一部分。所使用之術語「抗原結合域」及「抗體」意欲包括完整抗體、多株、單株及重組抗體、其部分，並且進一步包括單鏈抗體、人源化抗體、鼠科抗體、嵌合、小鼠-人類、小鼠-靈長類動物、靈長類動物-人類單株抗體、抗獨特型抗體、抗體構築體，諸如，例如，scFv、(scFv) ₂、Fab、Fab'，及F(ab') ₂、F(ab1) ₂、Fv、dAb，及Fd、二硫化物連接之Fvs(dsFcs)，及抗體相關多肽。

在一些態樣中，「抗原結合部分」係指與抗原接觸之多肽序列，包括但不限於衍生自抗體之CDR。

抗原結合部分亦可併入單域抗體、最大抗體、微小抗體、奈米抗體、胞內抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及雙-scFv中( 參見，例如，Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology23:1126-1136, 2005)。抗原結合部分亦可接枝在基於多肽諸如纖連蛋白III型(Fn3)之支架上( 參見美國專利第6,703,199號，其描述纖連蛋白多肽微小抗體)。因此，術語「抗原結合域」及「抗體」亦包括基於纖連蛋白III型域(單價抗體)之支架、其中接枝有一或多個CDR的其他支架系統( 例如，腱生蛋白)、適體等的抗體模擬物。

術語「抗原結合域」及「抗體」亦包括可根據本揭示案來使用之其他合適抗原結合域，例如，奈米抗體、VHH抗體、DARPin(經設計錨蛋白重複蛋白)、親和體、單價抗體、阿德耐汀、阿爾法體、白蛋白結合域、Adhiron、人泛蛋白及其他γ-B晶體蛋白衍生人工蛋白、Affimer、Affitin(NANOFITIN™)、抗運載蛋白、犰狳重複蛋白(ARM-重複蛋白諸如，例如b-連環蛋白、a-輸入、斑珠蛋白、腺瘤性結腸息肉病、ARMC4、ARMCX3等)、Atrimer( 例如，四連接素及衍生蛋白)、Avimer/Maxibody、Centyrin、Fynomer及其他FynSH3域衍生蛋白、Kunitz域、Obody/OB-fold、Pronectin、Repebody，或任何合成及/或計算設計之結合蛋白或支架。

利用抗體之模組化架構來產生超過60種不同雙特異性或多特異性抗體格式。因此，在一些態樣中，抗體可呈選自例如以下之形式：crossMab、DAF (雙重作用Fab) (二合一)、DAF (四合一)、DutaMab、DT-IgG、孔中結共同LC、孔中結組件、Charge對、Fab-臂交換、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y (白胺酸拉鍊誘導兩個HC之異二聚化的雙特異性抗體)、Fcab、Kl-抗體、正交Fab、DVD-IgG (雙重可變域IgG)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG (四合一)、奈米抗體、奈米抗體-HSA、BiTE (雙特異性T細胞銜接體)、雙價抗體、DART (雙重親和力重新定位)、TandAb (串聯抗體)、scDiabody、scDiabody-CH3、Triple Body、微型抗體、微小抗體、TriBi微小抗體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-ScFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HC Ab、scDiabody-Fc、雙價抗體-Fc、串聯scFv-Fc、胞內抗體、Dock and Locck、ImmTAC、HSAbody、scDiabody-HSA、串聯scFv-毒素、IgG-IgG、Cov-X-主體，及scFv1-PEG-scFV2。

「抗原結合域」及「抗體」亦包括雙特異性抗體及多特異性抗體，只要其展現所需生物活性或功能。在一些態樣中，本揭示案之嵌合結合蛋白( 例如，CAR)包含細胞外抗原結合域， 例如，scFv。

術語「scFv」係指包含有至少一個包含輕鏈可變區之抗體部分及至少一個包含重鏈可變區之抗體部分的融合蛋白，其中輕及重鏈可變區， 例如，經由合成連接子， 例如，短可撓性多肽連接子來相鄰連接，並且能夠表現為單鏈多肽，並且其中scFv保留產生其之完整抗體的特異性。除非指定，如本文所用，scFv可具有任一順序之VL及VH可變區， 例如，相對於多肽之N端及C端，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。

如本文所用之術語「互補決定區」或「CDR」係指賦予抗原特異性及結合親和力的抗體可變區內之胺基酸序列。例如，通常，存在各重鏈可變區中之三個CDR( 例如，HCDR1、HCDR2，及HCDR3)及各輕鏈可變區中之三個CDR(LCDR1、LCDR2，及LCDR3)。給定CDR之確切胺基酸序列邊界可使用許多熟知方案中之任一者來測定，包括藉由Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(「Kabat」編號方案)，Al-Lazikani等人，(1997) JMB 273,927-948 (「Chothia」編號方案)所描述之方案，或其組合。在Kabat編號方案下，在一些態樣中，重鏈可變域(VH)中之CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)，及95-102(HCDR3)；並且輕鏈可變域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)，及89-97(LCDR3)。在Chothia編號方案下，在一些態樣中，VH中之CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)，及95-102(HCDR3)；並且VL中之CDR胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)，及91-96(LCDR3)。在組合Kabat及Chothia編號方案中，在一些態樣中，CDR對應於作為Kabat CDR、Chothia CDR，或兩者之一部分的胺基酸殘基。例如，在一些態樣中，CDR對應於VH， 例如，哺乳動物VH， 例如，人類VH中之胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)，及95-102(HCDR3)；及VL， 例如，哺乳動物VL， 例如，人類VL中之胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)，及89-97(LCDR3)。

如本文所用，「細胞工程」或「細胞修飾」(包括其衍生詞)係指細胞，例如，本文揭示之免疫細胞之靶向修飾。在一些態樣中，細胞工程包括病毒基因工程改造、非病毒基因工程改造、引入受體以便允許腫瘤特異性靶向( 例如，抗ROR1 CAR)引入一或多個改良T細胞功能之內源性基因，引入一或多個改良免疫細胞，例如，T細胞，功能之合成基因( 例如，編碼c-Jun多肽之多核苷酸，以使得與未修飾之對應細胞相比，免疫細胞展現增加之c-Jun表現)，或其任何組合。如在本揭示案中別處進一步描述，在一些態樣中，細胞可用轉錄活化劑( 例如，基於CRISPR/Cas系統之轉錄活化劑)來工程化或修飾，其中轉錄活化劑能夠誘導及/或增加所關注蛋白質( 例如，c-Jun)之內源性表現。

術語「抗原」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生，或特異性免疫感受態細胞之活化，或兩者。熟習此項技術者理解任何巨分子，包括實際上所有蛋白或肽，可充當抗原。此外，抗原可衍生自重組或基因組DNA。

如本文所用，術語「抗原決定基」係指與抗體分子特異性地相互作用的抗原之部分。此等部分，在本文中稱為抗原決定性決定簇，通常包含諸如胺基酸側鏈或糖側鏈之要素或作為該等要素之一部分。抗原決定性決定簇可例如藉由在此項技術中已知之方法， 例如，藉由晶體學或藉由氫-氘交換來定義。與抗原決定性決定簇特異性地相互作用的抗體分子上之至少一個或一些部分通常位於CDR中。通常抗原決定基具有特異性三維結構特徵。通常抗原決定基具有特異性電荷特徵。一些抗原決定基為線性抗原決定基，而其他者為構形抗原決定基。

術語「自體」意指來源於同一個體之任何物質，之後將該物質再引入該個體中。

術語「嵌合抗原受體」或替代地「CAR」係指一組多肽，通常呈最簡單形式之兩個多肽，當處於免疫效應細胞中時，該等多肽向細胞提供針對靶細胞，通常癌細胞之特異性，以及細胞內信號產生。在一些態樣中，CAR至少包含細胞外抗原結合域、跨膜域及細胞質信號轉導域(在本文中亦稱為「細胞內信號轉導域」)，包含衍生自如以下定義之刺激分子及/或共刺激分子的功能性信號轉導域。在一些態樣中，該組多肽在同一多肽鏈中， 例如，包含嵌合融合蛋白。在一些態樣中，該組多肽不彼此相鄰， 例如，在不同多肽鏈中。在一些態樣中，該組多肽包括二聚化開關，在存在二聚化分子時，該開關可使多肽彼此偶合， 例如，可使抗原結合域偶合至細胞內信號轉導域。在一些態樣中，CAR之刺激分子為與T細胞受體複合物相關之ζ鏈( 例如，CD3 ζ)。在一些態樣中，細胞質信號轉導域包含一級信號轉導域( 例如，CD3-ζ之一級信號轉導域)。在一些態樣中，細胞質信號轉導域進一步包含衍生自至少一個如以下定義之共刺激分子的一或多個功能性信號轉導域。在一些態樣中，共刺激分子選自本文所述共刺激分子， 例如，4-1BB( 亦即，CD137)、CD27，及/或CD28。

在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含抗原結合域、跨膜域，及包含衍生自刺激分子之功能性信號轉導域的細胞內信號轉導域，其中抗原結合域及跨膜域藉由CAR間隔基來連接。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔基來連接至跨膜域之抗原結合域及包含衍生自共刺激分子之功能性信號轉導域及衍生自刺激分子之功能性信號轉導域的細胞內信號轉導域。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔基來連接至跨膜域之抗原結合域及包含衍生自一或多個共刺激分子之兩個功能性信號轉導域及衍生自刺激分子之功能性信號轉導域的細胞內信號轉導域。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔基來連接至跨膜域之抗原結合域及包含衍生自一或多個共刺激分子之至少兩個功能性信號轉導域及衍生自刺激分子之功能性信號轉導域的細胞內信號轉導域。在一些態樣中，CAR包含CAR之胺基末端(N端)處之視情況選用之前導序列。在一些態樣中，CAR進一步包含抗原結合域之N端處之前導序列，其中在CAR之細胞處理及定位至細胞膜期間，前導序列視情況自抗原結合域( 例如，scFv)上裂解。

雖然本申請案經常使用CAR來例示所揭示標的之不同態樣，但是熟習此項技術者顯而易知本文提供之相關揭示內容可同樣適用於其他嵌合結合蛋白。如本文所用，術語「嵌合結合蛋白」係指如下蛋白，該等蛋白能夠結合至一或多個抗原( 例如，包含抗原結合部分)並且經由以非天然存在之取向來連接最初編碼獨立蛋白或蛋白片段或同一蛋白之多個片段的兩個或兩個以上異源多核苷酸來產生。其他嵌合結合蛋白之非限制性實例包括T細胞受體(TCR)( 例如，工程化TCR)、嵌合抗體-T細胞受體(caTCR)、嵌合信號轉導受體(CSR)、T細胞受體模擬物(TCR模擬物)，及其組合。因此，除非另外指示，否則術語CAR，在一些態樣中，可涵蓋在此項技術中已知之其他類型之嵌合結合蛋白，例如，本文描述之嵌合結合蛋白。

術語「癌症」係指藉由異常細胞之不受控制的生長來表徵之疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統至身體之其他部分。各種癌症之實例在本文中描述並且包括但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及其類似癌症。術語「腫瘤」及「癌症」在本文中可互換使用， 例如，兩個術語涵蓋固體及液體， 例如，彌散或循環，腫瘤。如本文所用，術語「癌症」或「腫瘤」包含癌前期以及惡性癌症及腫瘤。

術語「癌症相關抗原」或「腫瘤抗原」或其變異體可互換地係指與正常細胞相比，完整地或作為片段(例如，MHC/肽)在癌細胞之表面上優先表現，並且適用於將藥劑優先靶向輸送至癌細胞的分子(通常蛋白、碳水化合物或脂質)。在一些態樣中，腫瘤抗原為由正常細胞及癌細胞表現之標誌物，例如，譜系標誌物，例如，B細胞上之CD19。在某些態樣中，腫瘤抗原衍生自癌症包括但不限於原發性或轉移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌諸如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌，及其類似癌症。

在一些態樣中，腫瘤抗原為特定增殖病症常見的抗原。在一些態樣中，癌症相關抗原為與正常細胞相比，在癌細胞中過度表現之細胞表面分子，例如，與正常細胞相比，約1倍過度表現、約2倍過度表現、約3倍過度表現或更大。在一些態樣中，癌症相關抗原為在癌細胞中不適當地合成之細胞表面分子，例如，與在正常細胞上表現之分子相比，含有缺失、添加或突變之分子。在一些態樣中，癌症相關抗原完整地或作為片段(例如，MHC/肽)僅在癌細胞之細胞表面上表現，並且不在正常細胞之表面上合成或表現。

術語「抗癌效應」係指可藉由各種方式來表明之生物效應，包括但不限於，例如，腫瘤體積減少、癌細胞數目減少、轉移數目減少、預期壽命增加、癌細胞增殖減少、癌細胞存活減少，或與癌性病狀相關之各種生理症狀改善。

「保守胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基置換的情況。具有相似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電之極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸經來自相同側鏈家族之另一個胺基酸置換，則取代被視為保守的。在一些態樣中，一串胺基酸可用在側鏈家族成員之順序及/或組成上有所不同的在結構上類似之串來進行保守置換。

非保守胺基酸取代包括(i)具有正電性側鏈之殘基( 例如，Arg、His或Lys)取代或經負電性殘基( 例如，Glu或Asp)取代，(ii)親水性殘基( 例如，Ser或Thr)取代或經疏水性殘基( 例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)取代，(iii)半胱胺酸或脯胺酸取代或經任何其他殘基取代，或(iv)具有龐大疏水性或芳族側鏈之殘基( 例如，Val、His、Ile或Trp)取代或經具有較小側鏈( 例如，Ala或Ser)或無側鏈( 例如，Gly)之殘基取代。

亦可使用其他胺基酸取代。例如，對於胺基酸丙胺酸，取代可來自D-丙胺酸、甘胺酸、β-丙胺酸、L-半胱胺酸及D-半胱胺酸中任一者。對於離胺酸，置換可為D-離胺酸、精胺酸、D-精胺酸、高精胺酸、甲硫胺酸、D-甲硫胺酸、鳥胺酸，或D-鳥胺酸中任一者。總體上，可預期誘導分離多肽之性質變化的在功能上重要區域之取代為如下取代：(i)極性殘基， 例如，絲胺酸或蘇胺酸，與疏水性殘基， 例如，白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸，或丙胺酸發生的取代；(ii)半胱胺酸殘基與任何其他殘基發生的取代；(iii)具有正電性側鏈之殘基， 例如，離胺酸、精胺酸或組胺酸與具有負電性側鏈之殘基， 例如，麩胺酸或天冬胺酸發生的取代；或(iv)具有龐大側鏈之殘基， 例如，苯丙胺酸，與不具有此側鏈之殘基， 例如，甘胺酸發生的取代。前述非保守取代中之一者可改變蛋白之功能性質的可能性亦與相對於蛋白之在功能上重要區域之取代位置相關：一些非保守取代可相應地對於生物性質幾乎沒有效應。

在本揭示案之內容中，如上文定義之術語「突變」及「胺基酸取代」(有時簡稱為「取代」)被視為可互換的。

在本揭示案之情形中，取代(甚至當其被稱為胺基酸取代時)在核酸水準下進行， 亦即，胺基酸殘基經替代胺基酸殘基取代藉由編碼第一胺基酸之密碼子經編碼第二胺基酸之密碼子取代來進行。

如本文所用，術語「同源性」係指聚合物分子之間，例如核酸分子( 例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。總體上，術語「同源性」意味著兩個分子之間之進化關係。因此，同源的兩個分子具有共同進化祖先。在本揭示案之情形中，術語同源性涵蓋一致性及相似性。

在一些態樣中，若分子中之單體之至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或至少約99%為一致的(恰好相同單體)或類似的(保守取代)，則聚合物分子被視為彼此「同源的」。術語「同源」一定涉及至少兩個序列(多核苷酸或多肽序列)之間的比較。

如本文所用，術語「一致性」係指聚合物分子之間，例如，多肽分子或多核苷酸分子( 例如DNA分子及/或RNA分子)之間的總體單體保守。沒有任何額外限定詞之術語「一致」， 例如，蛋白A與蛋白B一致，意味著序列為100%一致的(100%序列一致性)。將兩個序列描述為， 例如，「70%一致」相當於將其描述為具有， 例如，「70%序列一致性」。

兩個多肽序列之一致性百分比之計算，例如，可藉由出於最佳比較目的而比對兩個序列來執行( 例如，為了最佳比對，可將間隙引入第一及第二多肽序列中之一或兩者中並且為了便於比較，可忽略不一致序列)。在某些態樣中，為了便於比較而比對之序列長度為參照序列長度之至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%，或約100%。然後比較相應胺基酸位置處之胺基酸。

當第一序列中之位置由與第二序列中相應位置相同的胺基酸佔據時，則分子在彼位置處為一致的。兩個序列之間的一致性百分比隨序列共有的一致位置之數目而變化，考慮到了空隙之數目及各空隙之長度，需要引入該等空隙以達成兩個序列之最佳比對。序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比之判定可使用數學演算法來完成。

可獲得來自各種來源，並且用於比對蛋白及核苷酸序列的合適軟體程式。測定序列一致性百分比的一種合適程式為bl2seq，其為可自美國政府之國家生物技術資訊中心BLAST網站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得的BLAST程式套件之一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP演算法來執行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他合適程式， 例如，Needle、Stretcher、Water，或Matcher，其為EMBOSS生物資訊學程式套件之一部分並且亦可自European Bioinformatics Institute (EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa處獲得。

序列比對可使用在此項技術中已知之方法諸如MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等進行。

單一多核苷酸或多肽標靶序列內的與多核苷酸或多肽參照序列比對之不同區域可各自具有其自己的序列一致性百分比。注意將序列一致性百分比值舍入至小數點後一位。例如，將80.11、80.12、80.13，及80.14向下舍入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18，及80.19向上舍入至80.2。亦應注意長度值始終為整數。

在某些態樣中，相對於第二胺基酸序列(或核酸序列)之第一胺基酸序列(或核酸序列)之一致性百分比(%ID)計算為%ID=100 x (Y/Z)，其中Y為在第一及第二序列之比對(如藉由目視檢查或特定序列比對程式來比對)中算作一致匹配的胺基酸殘基(或核鹼基)之數目並且Z為第二序列中之殘基之總數。若第一序列之長度比第二序列更長，則相對於第二序列之第一序列之一致性百分比高於相對於第一序列之第二序列之一致性百分比。

熟習此項技術者認識到為了計算序列一致性百分比而產生序列比對不限於僅由原始序列資料推動的二元序列-序列比較。亦應認識到序列比對可藉由將序列資料與來自異類來源之資料諸如結構資料 ( 例如，晶體學蛋白結構)、功能資料 ( 例如，突變之位置)，或系統發生資料整合來產生。整合異類資料以便產生多重序列比對之合適程式為可在www.tcoffee.org處獲得，及替代地可例如自EBI獲得之T-Coffee。亦應認識到用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動或手動進行。

如本文所用，術語「相似性」係指聚合物分子之間，例如多核苷酸分子( 例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。聚合物分子彼此相似性百分比之計算可以與一致性百分比之計算相同的方式來執行，除了相似性百分比之計算考慮到如在此項技術中理解之保守取代以外。應瞭解相似性百分比取決於所使用之比較量表， 亦即，是否對胺基酸進行比較， 例如，根據其進化接近性、電荷、體積、可撓性、極性、疏水性、芳族性、等電點、抗原性，或其組合。

如本文所用，術語「分離」、「純化」、「萃取」，及其語法變異體可互換使用並且係指經歷一或多個純化過程的本揭示案之所需組合物， 例如，本揭示案之CAR的製備狀態。在一些態樣中，如本文所用之分離或純化為將本揭示案之組合物， 例如，本揭示案之CAR自含有污染物之樣品中移除、部分移除( 例如，分率)的過程。

在一些態樣中，分離組合物不具有可偵測非所需活性或，替代地，非所需活性之水準或量等於或低於可接受水準或量。在一些態樣中，分離組合物具有等於或高於可接受量及/或濃度及/或活性的本揭示案之所需組合物之量及/或濃度。在一些態樣中，如與獲得組合物之起始物質相比，分離組合物得以富集。如與起始物質相比，此富集可為至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.9%、至少約99.99%、至少約99.999%、至少約99.9999%，或大於99.9999%。

在一些態樣中，分離製劑實質上不含殘餘生物產品。在一些態樣中，分離製劑100%不含、至少約99%不含、至少約98%不含、至少約97%不含、至少約96%不含、至少約95%不含、至少約94%不含、至少約93%不含、至少約92%不含、至少約91%不含，或至少約90%不含任何污染生物物質。殘餘生物產品可包括非生物材料(包括化學品)或不當核酸、蛋白、脂質，或代謝物。

「核酸」、「核酸分子」、「核苷酸序列」、「多核苷酸」及其語法變異體可互換使用並且係指呈單股形式，或雙鏈螺旋之核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；「RNA分子」)或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷，或去氧胞苷；「DNA分子」)之磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯及硫酯。單股核酸序列係指單股DNA(ssDNA)或單股RNA(ssRNA)。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋為可能的。術語核酸分子，及尤其DNA或RNA分子，僅係指分子之一級及二級結構，並且不將其限於任何特定三級形式。因此，此術語包括尤其在線性或圓形DNA分子( 例如，限制片段)、質體、超螺旋DNA及染色體中發現之雙鏈DNA。在討論特定雙鏈DNA分子之結構中，可在本文中根據僅給出沿著非轉錄DNA鏈( 亦即，具有與mRNA同源之序列的鏈)在5’至3’方向上之序列的通常慣例來描述序列。

「重組DNA分子」為經歷分子生物學調處之DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因組DNA、質體DNA、合成DNA，及半合成DNA。本揭示案之「核酸組合物」包含如本文所描述之一或多種核酸。

如本文所用之術語「多核苷酸」係指任何長度之核苷酸之聚合物，包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其類似物，或其混合物。此術語係指分子之一級結構。因此，該術語包含三、雙及單股去氧核糖核酸(「DNA」)，以及三、雙及單股核糖核酸(「RNA」)。其亦包括例如藉由烷基化，及/或加帽來修飾，及未修飾形式之多核苷酸。更特定言之，術語「多核苷酸」包含不論剪接或未剪接之聚去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)及多核苷酸(含有D-核糖)，包括mRNA，作為嘌呤或嘧啶鹼基之N-或C-糖苷的任何其他類型之多核苷酸，及含有正核苷酸主鏈之其他聚合物，例如，聚醯胺( 例如，肽核酸「PNA」)及多嗎啉聚合物，及其他合成序列特異性核酸聚合物，限制條件為該等聚合物含有允許諸如在DNA及RNA中發現之鹼基配對及鹼基層疊之組態下的核鹼基。

在一些態樣中，本文揭示之多核苷酸包含DNA， 例如，插入載體中之DNA。在一些態樣中，本文揭示之多核苷酸包含mRNA。在一些態樣中，mRNA為合成mRNA。在一些態樣中，合成mRNA包含至少一個非天然核鹼基。在一些態樣中，某種類別之所有核鹼基經非天然核鹼基置換( 例如，本文揭示之多核苷酸中之所有尿苷可經非天然核鹼基， 例如，5-甲氧基尿苷置換)。

術語「編碼」係指諸如基因、cDNA，或mRNA之多核苷酸中之特定核苷酸序列充當模板之固有性質，該等模板用於合成生物過程中的具有核苷酸( 例如，rRNA、tRNA及mRNA)之經定義序列或胺基酸之經定義序列及由此產生之生物性質的其他聚合物及巨分子。因此，若對應於基因之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白，則基因、cDNA，或RNA編碼該蛋白。其核苷酸序列與mRNA序列一致並且通常在序列表中提供的編碼鏈，及用作轉錄基因或cDNA之模板的非編碼鏈，均可被視為編碼該蛋白或該基因或cDNA之其他產物。

除非另外規定，否則「編碼」胺基酸序列」之核苷酸序列例如「編碼」本揭示案之CAR之多核苷酸，包括為彼此簡並型式並且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。

術語「表現」係指由啟動子推動的特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。

術語「多肽」、「肽」，及「蛋白」在本文中可互換使用以便係指任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可包含經修飾之胺基酸。該等術語亦涵蓋天然地或藉由干預來修飾之胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、醣化、脂化、乙醯化、磷酸化，或任何其他調處或修飾，諸如與標記組分偶聯。在該定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括，例如，非天然胺基酸諸如高半胱胺酸、鳥胺酸、對乙醯苯丙胺酸、D-胺基酸，及肌酸)，以及在此項技術中已知之其他修飾的多肽。

如本文所用之術語「多肽」係指任何大小、結構，或功能之蛋白、多肽，及肽。多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、同源物、異種同源物、同種同源物、片段及前述者之其他等效物、變異體，及類似物。多肽可為單一多肽或可為多分子複合物諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽。最通常二硫鍵發現于多鏈多肽中。術語多肽亦可應用於一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物。在一些態樣中，「肽」可為小於或等於50胺基酸長度， 例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45，或50胺基酸長度。

「重組」多肽或蛋白係指經由重組DNA技術產生之多肽或蛋白。與藉由任何合適技術來分離、分開，或部分地或大致上純化之天然或重組多肽一樣，出於本揭示案之目的，重組產生之多肽及在工程化宿主細胞中表現之蛋白被視為分離的。藉由本文揭示之多核苷酸來編碼之多肽( 例如，抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt)可使用在此項技術中已知之方法來重組產生。在一些態樣中，在藉由至少一個編碼本文描述之多肽之多核苷酸或載體來轉染之後，藉由本揭示案之多核苷酸來編碼之多肽( 例如，抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt)藉由細胞， 例如，T細胞產生。

如本文所用，術語多肽( 例如，c-Jun多肽)之「片段」係指與天然存在之多肽相比，N及/或C端缺失或多肽之任何部分缺失的比天然存在之序列短的多肽之胺基酸序列。因此，片段不一定只缺失N及/或C端胺基酸。相對於天然存在之序列，內部胺基酸缺失之多肽亦被視為片段。

如本文所用，術語「功能性片段」係指保留多肽功能之多肽片段。因此，在一些態樣中，Ig鉸鏈之功能性片段保持將CAR中之抗原結合域( 例如，scFv)定位於距標靶抗原決定基( 例如，腫瘤抗原)之一定距離處以使得抗原結合域( 例如，scFv)可與標靶抗原決定基( 例如，腫瘤抗原)有效地相互作用的能力。類似地，在一些態樣中，c-Jun功能性片段為在CAR T細胞中表現時，產生CAR T細胞的片段，該細胞具有表現對應全長c-Jun之參照CAR T細胞之活性的例如至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%，或約100%。此活性之非限制性實例在本揭示案中別處進一步描述。

如本文所用，術語「參照CAR T細胞」係指包含相同結構CAR組分但是不過度表現c-Jun的對應CAR T細胞。

如在本揭示案中別處進一步描述，編碼本文所述CAR( 例如，抗ROR1 CAR)之多核苷酸可包含編碼c-Jun蛋白或其功能片段的額外核苷酸序列。是否c-Jun片段為功能性片段可藉由測定c-Jun活化(例如，來自abcam ^TM之比色c-Jun轉錄因子檢定套組(比色))等的任何已知方法來評定。c-Jun在T細胞，諸如本文所述CAR T細胞中之過度表現藉由減輕或防止T細胞功能不良(例如，T細胞耗竭)而有助於保持細胞之活化狀態。因此，c-Jun之功能性片段可基於其在工程化免疫細胞，諸如本文所述CAR T細胞中賦予此活性之能力來評定。此活性包括但是不限於針對帶有標靶之腫瘤細胞(例如，ROR1+腫瘤細胞)之持續、有效細胞毒性( 例如，裂解或殺滅腫瘤細胞之能力)或T細胞耗竭之減少跡象( 例如，抑制受體，諸如PD-1之降低表現)及持續效應細胞之增加跡象。評估T細胞耗竭及由此評估c-Jun之功能性片段的此類方法包括例如在此項技術中已知的適用於量測耗竭、細胞表型、持久性、細胞毒性及/或殺滅、增殖、細胞介素釋放，及基因表現概況的檢定，諸如，流式細胞術、細胞內細胞介素染色(ICS)、IncuCyte免疫細胞殺滅分析、Meso Scale Discovery (MSD)或類似檢定、持續抗原刺激檢定、連續抗原刺激檢定(類似於持續抗原刺激檢定，但是不隨著每次再刺激循環來重新設定E:T細胞比率)、整體及單一細胞RNAseq(參見 例如，Fron Genet. 2020；11:220；2019 Bioinformatics 35:i436-445；2019 Annual Review of Biomed. Data Sci. 2:139-173)、細胞毒性/殺滅檢定、ELISA、西方墨點法及諸如在本文中描述或如例如在Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., 1999-2021)中或在別處中描述之其他標準分子及細胞生物學方法。

使用蛋白質工程及重組DNA技術之已知方法，可產生變異體以便改良或改變多肽之特徵。例如，分泌蛋白之N端或C端可缺失一或多個胺基酸而不實質性損失生物功能。以全文引用方式併入本文之Ron 等人， J. Biol. Chem.268: 2984-2988 (1993)報道甚至在缺失3、8，或27個胺基末端胺基酸殘基之後仍具有肝素結合活性的變異體KGF蛋白。類似地，干擾素γ在自此蛋白之羧基末端缺失8-10個胺基酸殘基之後展現多達十倍的更高活性。(Dobeli 等人 , J. Biotechnology 7:199-216 (1988)，其以全文引用方式併入本文。)

另外，充分證據證明變異體通常保持與天然存在之蛋白類似的生物活性。例如，Gayle及合作者( J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)，其以全文引用方式併入本文)進行人類細胞介素IL-1a之廣泛突變分析。它們使用隨機誘變來產生超過3,500種個別IL-1a突變體，在分子之整個長度上每個變異體具有平均2.5個胺基酸變化。在每個可能胺基酸位置處檢查多個突變。研究者發現「大多數分子可在對於[結合或生物活性]具有極少影響的情況下加以改變」。(參見摘要。)事實上，在所檢查的超過3,500個核苷酸序列中，僅23個獨特胺基酸序列產生在活性方面與野生型顯著不同的蛋白。

如上所述，變異體或衍生物包括例如經修飾之多肽。在一些態樣中，例如多肽、多核苷酸、脂質、醣蛋白之變異體或衍生物為化學修飾及/或內源性修飾之結果。在一些態樣中，變異體或衍生物為 活體內修飾之結果。在一些態樣中，變異體或衍生物為 活體外修飾之結果。在一些態樣中，變異體或衍生物為生產細胞例如T細胞中之細胞內修飾之結果。

存在於變異體及衍生物中之修飾包括，例如，乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、共價附接核黃素、共價附接血紅素部分、共價附接核苷酸或核苷酸衍生物、共價附接脂質或脂質衍生物、共價附接磷脂醯肌醇、交聯、環合、二硫鍵形成、去甲基化、形成共價交聯、形成半胱胺酸、形成焦麩胺酸鹽、甲醯化、γ-羧化、醣化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、肉豆蔻醯化、氧化、聚乙二醇化(Mei 等人， Blood 116:270-79 (2010)，其以全文引用方式併入本文)、蛋白水解處理、磷酸化、異戊烯化、外消旋、硒化、硫酸化、轉移RNA介導之將胺基酸添加至蛋白諸如精胺醯化，及泛素化。

術語「信號轉導域」係指經由規定信號轉導通道來在細胞內傳輸資訊，以便藉由產生第二信使或藉由對於此等信使作出響應而充當效應物，從而起到調控細胞活性之作用的蛋白之功能性部分。

如本文所用術語之「細胞內信號轉導域」係指分子之細胞內部分。細胞內信號轉導域可產生促進含有CAR之細胞， 例如，本文所述抗ROR1 CAR T細胞之免疫效應物功能的信號。 例如，CAR T細胞中之免疫效應物功能之非限制性實例包括細胞溶解活性及輔助活性，包括分泌細胞介素。在一些態樣中，細胞內信號域為轉導效應物功能信號並且嚮導細胞執行特殊功能的蛋白之部分。雖然可使用整個細胞內信號轉導域，但是在許多情況下，不需要使用整個鏈。就使用細胞內信號轉導域之截短部分而言，此截短部分可代替完整鏈來使用，只要其轉導效應物功能信號。因此，術語細胞內信號轉導域意欲包括足以轉導效應物功能信號的細胞內信號轉導域之任何截短部分。

在一些態樣中，細胞內信號轉導域可包含一級細胞內信號轉導域。示例性一級細胞內信號轉導域包括衍生自導致一級刺激，或抗原依賴性刺激之分子的域。在一些態樣中，細胞內信號轉導域可包含共刺激細胞內域。示例性共刺激細胞內信號轉導域包括衍生自導致共刺激信號，或不依賴於抗原之刺激之分子的域。例如，在CAR T細胞( 例如，本文所述抗ROR1 CAR T細胞)的情況下，一級細胞內信號轉導域可包含T細胞受體之細胞質序列，並且共刺激細胞內信號轉導域可包含來自輔受體或共刺激分子之細胞質序列。

一級細胞內信號轉導域可包含被稱為基於免疫受體酪胺酸之活化模體或ITAM的信號轉導模體。含有ITAM之一級細胞質信號轉導序列之實例包括但不限於衍生自CD3 ζ、FcR γ、共同FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε Rib)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (ICOS)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10，及DAP12之序列。

術語「共價連接」、「融合」，及其語法變異體可互換使用並且係指第一部分， 例如，第一胺基酸序列或核苷酸序列相應地共價或非共價連接至第二部分， 例如，第二胺基酸序列或核苷酸序列。第一部分可直接連接或與第二部分並置或替代地間插部分可將第一部分共價連接至第二部分。術語「連接」不僅意謂第一部分在C端或N端處融合至第二部分，而且包括完整第一部分(或第二部分)插入第二部分(或相應地第一部分)中之任何兩個點例如胺基酸中。在一些態樣中，第一部分藉由肽鍵或連接子來連接至第二部分。第一部分可藉由磷酸二酯鍵或連接子來連接至第二部分。連接子可為肽或多肽(對於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(對於核苷酸鏈)或任何化學部分(對於多肽或多核苷酸鏈或任何化學分子)。

如本文所用，術語「醫藥組合物」係指混合或混雜，或懸浮於一或多種其他化學組分，諸如醫藥學上可接受載劑及賦形劑中之本文描述之化合物，諸如，例如，本揭示案之CAR或本揭示案之表現CAR之細胞，或表現CAR並且過度表現c-Jun之細胞中之一或多者。醫藥組合物之一個用途係促進將如本文所述例如表現CAR並且過度表現c-Jun之細胞製劑投與受試者。

術語「賦形劑」及「載劑」可互換使用並且係指添加至醫藥組合物以便進一步有助於投與化合物， 例如，本揭示案之CAR或經工程化來表現CAR、c-Jun及在某些態樣中截短EGFR之細胞的惰性物質。

術語「醫藥學上可接受之載劑」、「醫藥學上可接受之賦形劑」，及其語法變化形式涵蓋由美國聯邦政府之監管機構批准或在美國藥典中列出供動物，包括人類使用之任何試劑，以及不在妨礙組合物投與受試者之程度上導致產生不當生理效應並且不消除所投與化合物之生物活性及性質的任何載劑或稀釋劑。包含適用於製備醫藥組合物並且通常安全、無毒，及合乎需要的賦形劑及載劑。

術語「受試者」、「患者」、「個體」，及「宿主」及其變異體在本文中可互換使用並且係指需要診斷、治療，或療法的任何哺乳動物受試者，包括但不限於人類、家畜( 例如，犬、貓及其類似動物)、農場動物( 例如，牛、綿羊、豬、馬及其類似動物)，及實驗室動物( 例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠及其類似動物)，尤其人類。本文描述之方法適用於人類治療及獸醫應用。

如本文所用，片語「有需要之受試者」包括受益於投與本文描述之組合物( 例如，本揭示案之抗ROR1 CAR T細胞)，以便例如改善與本文所述疾病或病症( 例如，癌症)相關之一或多個症狀的受試者，諸如哺乳動物受試者。

如本文所用之術語「治療」、「治療」，或「治療」係指， 例如，疾病或病狀之嚴重程度之減少；疾病過程之持續時間之減少；與疾病或病狀相關之一或多個症狀改善或消除；向患有疾病或病狀之受試者提供有益效應，而不一定治癒疾病或病狀。術語亦包括預防或阻止疾病或病狀或其症狀。在一些態樣中，術語「治療」或「治療」意謂在受試者中誘導針對抗原之免疫反應。

如本文所用之術語「預防」、「預防」，及其變異體係指部分或完全延緩疾病、病症及/或病狀之發作；部分或完全延緩特定疾病、病症，及/或病狀之一或多個症狀、特徵，或臨床表現之發作；部分或完全延緩特定疾病、病症，及/或病狀之一或多個症狀、特徵，或表現之發作；部分或完全延緩特定疾病、病症及/或病狀之進展；及/或降低患上與疾病、病症，及/或病狀相關之病變的風險。在一些態樣中，防止某一結果經由預防性治療來達成。

如本文所用，術語「治療有效量」為足以在有需要之受試者中產生所需治療效果、藥理及/或生理效應的構成本文揭示之組合物之試劑或醫藥化合物( 例如，本揭示案之抗ROR1 CAR T細胞)的量。

治療有效量可為「預防有效量」，因為預防可被視為治療。如本文所用，「預防」係指用於防止疾病或病狀之發作，或防止或延緩與疾病或病狀相關之症狀的治療或作用過程。如本文所用，「預防」係指為了保持健康狀況及防止疾病或病狀發作，或防止或延緩與疾病或病狀相關之症狀所採取的措施。 ROR1

如本揭示案顯而易知，本文所述多核苷酸包含編碼特異性結合至ROR1之嵌合結合蛋白( 例如，CAR)的核苷酸序列。受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)在大約57%的患有三陰性乳癌(TNBC)之患者及42%的患有非小細胞肺癌(NSCLC)腺癌之患者中過度表現(Balakrishnan 2017)，並且代表嵌合抗原受體(CAR)T細胞之非常有吸引力的標靶。受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1陽性(ROR1 ⁺)實體腫瘤可用抗ROR1 CAR T細胞來安全地靶向(Specht 2020)；然而，功效受到限制，部分地歸因於在輸注於患有惡性實體腫瘤之患者中之後，CAR T細胞展現耗竭或功能不良。另外，實體腫瘤具有限制免疫治療劑，諸如CAR T細胞之抗腫瘤活性的免疫抑制屏障(Newick 2016，Srivastava 2018，Martinez 2019)。不希望受任何一種理論束縛，表現本文所述抗ROR1嵌合結合蛋白之細胞經修飾以便過度表現轉錄因子c-Jun並且與在此項技術中可利用之其他抗ROR1細胞相比，對於耗竭更有抵抗力並且展現經改良之效應物功能。

在一些態樣中，編碼本揭示案之CAR，亦即，抗ROR1 CAR的核苷酸序列包含抗原結合域，包括抗體或其抗原結合片段( 例如，ScFv)，其特異性結合至腫瘤抗原， 例如，蛋白激酶諸如酪胺酸蛋白激酶上之抗原決定基。

在一些態樣中，腫瘤抗原為酪胺酸蛋白激酶跨膜受體「ROR1」，亦稱為神經營養酪胺酸酶激酶，受體相關1(NTRKR1)。人類胺基酸及核酸序列可發現於公用資料庫，諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot中。例如，人類ROR1之同功型1及2前驅物之胺基酸序列可分別發現於登錄號NP_005003.2及NP_001077061.1中，並且編碼其之mRNA序列可分別發現於登錄號NM_005012.3及NM_001083592.1中。如本文所用，「ROR1」包括包含突變之蛋白， 例如，全長野生型ROR1之點突變、片段、插入、缺失及接合變異體。在一些態樣中，CAR之抗原結合部分識別並且結合ROR1蛋白之胞外域內之抗原。在一些態樣中，ROR1蛋白在癌細胞上表現。

ROR1為受體酪胺酸激酶樣孤兒受體(ROR)家族之成員。在人類中，ROR1由 ROR1基因編碼。由此基因編碼之蛋白為受體酪胺酸激酶，其調節中樞神經系統中之生長並且在癌細胞之轉移中具有作用。ROR1被視為缺少顯著催化活性並且與非典型Wnt信號轉導途徑相互作用的假激酶。ROR1之增加表現與癌症， 例如，與B細胞慢性淋巴球性白血病相關。ROR1在循環腫瘤細胞中高度表現並且促進胰臟癌細胞之入侵(Xu等人, 2018, Mol. Med. Rep. 18:5087-5094)。類似於其在卵巢癌中之作用，ROR1亦似乎促進子宮內膜癌中之腫瘤進展(Henry等人，2018，Gynecol. Oncol. 148:576-584)。ROR1在上皮腫瘤中表現( 例如，在多個上皮癌症組織結構中高度表現)並且在卵巢癌、三陰性乳癌，及肺癌之子集中均勻地表現(Balakrishnan等人，2017, Clin, Cancer Res. 23:3061-3071)。ROR1表現亦與結腸直腸癌患者中之淋巴結轉移正相關(Zhou等人，2017，Oncotarget 8:32864-32872)。ROR1 CAR T及ADC研究之先前臨床資料報告在非人類靈長類動物中沒有中靶偏離腫瘤毒性並且沒有顯著毒性。另外，如在本文中證明，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞 在活體外及 活體內均表現出抗腫瘤功效。具體而言，在長期刺激之後( 例如， 在活體外)觀察到經改良之細胞介素產生、延長的細胞毒性，及減少之耗竭相關基因表現概況，並且在NSCLC小鼠異種移植模型中，顯示經改良之抗腫瘤功效。 c-Jun

如本文所描述，在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸( 例如，包含編碼嵌合結合蛋白，例如，CAR之核苷酸序列)包含編碼c-Jun蛋白之額外核苷酸序列。在一些態樣中，本文提供之多核苷酸為多順反子多核苷酸，其中多核苷酸編碼包括c-Jun及CAR之多種蛋白及在一些態樣中，一或多種額外蛋白(例如，安全開關蛋白諸如EGFRt)。在某些態樣中，本文提供之多核苷酸編碼嵌合多肽( 例如，嵌合結合蛋白)，其包含c-Jun多肽及ROR1結合蛋白。在一些態樣中，此嵌合多肽可包括可裂解連接子以使得在轉譯之後，c-Jun多肽及ROR1結合蛋白經裂解成單獨運作蛋白。

在人類中，c-Jun蛋白藉由位於染色體1(負鏈取向之GenBank登錄號NC_000001.11之核苷酸58,780,791至58,784,047)上之 JUN基因來編碼。 JUN基因，及其編碼蛋白之同義詞為已知的並且包括「Jun原致癌基因，AP-1轉錄因子次單元」、「v-Jun鳥類肉瘤病毒17致癌基因同源物」、「轉錄因子AP-1」、「Jun致癌基因」、「AP-1」、「Jun活化域結合蛋白」、「p39」及「增強子結合蛋白AP1」。野生型人類c-Jun蛋白序列為331個胺基酸長度。野生型人類c-Jun之胺基酸及核酸序列分別提供於表1及2中。

野生型人類c-Jun(UniProt識別符：P05412-1)蛋白序列為331個胺基酸長度(SEQ ID NO：1)。胺基酸及核酸序列分別在表1及2中示出。表 1.c-Jun蛋白序列

c-Jun (UniProt: P05412-1) (SEQ ID NO: 1)

MTAKMETTFYDDALNASFLPSESGPYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLT SPDVGLLKLA SPELERLIIQSSNGHITTTPTPTQFLCPKNVTDEQEGFAEGFVRALAELHSQNTLPSVTSAAQPVNGAGMVAPAVASVAGGSGSGGFSASLHSEPPVYANLSNFNPGALSSGGGAPSYGAAGLAFPAQPQQQQQPPHHLPQQMPVQHPRLQALKEEPQTVPEMPGETPPLSPIDMESQERIKAERKRMRNRIAASKCRKRKLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVNSGCQLMLTQQLQTF

表 2.c-Jun核酸序列

野生型 JUN(GenBank登錄號NM_002228.4) (SEQ ID NO: 2) * 編碼區域加粗體並且大寫

gctcagagttgcactgagtgtggctgaagcagcgaggcgggagtggaggtgcgcggagtcaggcagacagacagacacagccagccagccaggtcggcagtatagtccgaactgcaaatcttattttcttttcaccttctctctaactgcccagagctagcgcctgtggctcccgggctggtgtttcgggagtgtccagagagcctggtctccagccgcccccgggaggagagccctgctgcccaggcgctgttgacagcggcggaaagcagcggtacccacgcgcccgccgggggaagtcggcgagcggctgcagcagcaaagaactttcccggctgggaggaccggagacaagtggcagagtcccggagccaacttttgcaagcctttcctgcgtcttaggcttctccacggcggtaaagaccagaaggcggcggagagccacgcaagagaagaaggacgtgcgctcagcttcgctcgcaccggttgttgaacttgggcgagcgcgagccgcggctgccgggcgccccctccccctagcagcggaggaggggacaagtcgtcggagtccgggcggccaagacccgccgccggccggccactgcagggtccgcactgatccgctccgcggggagagccgctgctctgggaagtgagttcgcctgcggactccgaggaaccgctgcgcacgaagagcgctcagtgagtgaccgcgacttttcaaagccgggtagcgcgcgcgagtcgacaagtaagagtgcgggaggcatcttaattaaccctgcgctccctggagcgagctggtgaggagggcgcagcggggacgacagccagcgggtgcgtgcgctcttagagaaactttccctgtcaaaggctccggggggcgcgggtgtcccccgcttgccacagccctgttgcggccccgaaacttgtgcgcgcagcccaaactaacctcacgtgaagtgacggactgttct ATGACTGCAAAGATGGAAACGACCTTCTATGACGATGCCCTCAACGCCTCGTTCCTCCCGTCCGAGAGCGGACCTTATGGCTACAGTAACCCCAAGATCCTGAAACAGAGCATGACCCTGAACCTGGCCGACCCAGTGGGGAGCCTGAAGCCGCACCTCCGCGCCAAGAACTCGGACCTCCTCACCTCGCCCGACGTGGGGCTGCTCAAGCTGGCGTCGCCCGAGCTGGAGCGCCTGATAATCCAGTCCAGCAACGGGCACATCACCACCACGCCGACCCCCACCCAGTTCCTGTGCCCCAAGAACGTGACAGATGAGCAGGAGGGCTTCGCCGAGGGCTTCGTGCGCGCCCTGGCCGAACTGCACAGCCAGAACACGCTGCCCAGCGTCACGTCGGCGGCGCAGCCGGTCAACGGGGCAGGCATGGTGGCTCCCGCGGTAGCCTCGGTGGCAGGGGGCAGCGGCAGCGGCGGCTTCAGCGCCAGCCTGCACAGCGAGCCGCCGGTCTACGCAAACCTCAGCAACTTCAACCCAGGCGCGCTGAGCAGCGGCGGCGGGGCGCCCTCCTACGGCGCGGCCGGCCTGGCCTTTCCCGCGCAACCCCAGCAGCAGCAGCAGCCGCCGCACCACCTGCCCCAGCAGATGCCCGTGCAGCACCCGCGGCTGCAGGCCCTGAAGGAGGAGCCTCAGACAGTGCCCGAGATGCCCGGCGAGACACCGCCCCTGTCCCCCATCGACATGGAGTCCCAGGAGCGGATCAAGGCGGAGAGGAAGCGCATGAGGAACCGCATCGCTGCCTCCAAGTGCCGAAAAAGGAAGCTGGAGAGAATCGCCCGGCTGGAGGAAAAAGTGAAAACCTTGAAAGCTCAGAACTCGGAGCTGGCGTCCACGGCCAACATGCTCAGGGAACAGGTGGCACAGCTTAAACAGAAAGTCATGAACCACGTTAACAGTGGGTGCCAACTCATGCTAACGCAGCAGTTGCAAACATTTtgaagagagaccgtcgggggctgaggggcaacgaagaaaaaaaataacacagagagacagacttgagaacttgacaagttgcgacggagagaaaaaagaagtgtccgagaactaaagccaagggtatccaagttggactgggttgcgtcctgacggcgcccccagtgtgcacgagtgggaaggacttggcgcgccctcccttggcgtggagccagggagcggccgcctgcgggctgccccgctttgcggacgggctgtccccgcgcgaacggaacgttggacttttcgttaacattgaccaagaactgcatggacctaacattcgatctcattcagtattaaaggggggagggggagggggttacaaactgcaatagagactgtagattgcttctgtagtactccttaagaacacaaagcggggggagggttggggaggggcggcaggagggaggtttgtgagagcgaggctgagcctacagatgaactctttctggcctgccttcgttaactgtgtatgtacatatatatattttttaatttgatgaaagctgattactgtcaataaacagcttcatgcctttgtaagttatttcttgtttgtttgtttgggtatcctgcccagtgttgtttgtaaataagagatttggagcactctgagtttaccatttgtaataaagtatataatttttttatgttttgtttctgaaaattccagaaaggatatttaagaaaatacaataaactattggaaagtactcccctaacctcttttctgcatcatctgtagatactagctatctaggtggagttgaaagagttaagaatgtcgattaaaatcactctcagtgcttcttactattaagcagtaaaaactgttctctattagactttagaaataaatgtacctgatgtacctgatgctatggtcaggttatactcctcctcccccagctatctatatggaattgcttaccaaaggatagtgcgatgtttcaggaggctggaggaaggggggttgcagtggagagggacagcccactgagaagtcaaacatttcaaagtttggattgtatcaagtggcatgtgctgtgaccatttataatgttagtagaaattttacaataggtgcttattctcaaagcaggaattggtggcagattttacaaaagatgtatccttccaatttggaatcttctctttgacaattcctagataaaaagatggcctttgcttatgaatatttataacagcattcttgtcacaataaatgtattcaaataccaa

或者，適用於本揭示案之c-Jun可為突變體人類c-Jun，只要突變體c-Jun不影響突變體拯救功能不良(耗竭)T細胞之能力。在一些態樣中，突變體c-Jun包含與野生型c-Jun之C端胺基酸殘基(例如，C端50、75、100、150、200，或250或更多個殘基)、C端部分(例如，四分之一、三分之一，或二分之一)或C端域(例如，ε、bZIP，及其C端之胺基酸)的至少約70%(例如，至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%)序列一致性。在一些態樣中，野生型c-Jun之N端胺基酸殘基(例如，N端50、75、100，或150或更多個)、N端部分(例如，四分之一、三分之一，或二分之一)或N端域(例如，δ、轉錄活化域，及其N端之胺基酸)缺失、突變，或以其他方式失活。

在一些態樣中，c-Jun在其轉錄活化域及/或其δ域中包含失活突變(例如，取代、缺失，或插入)。在一些態樣中，c-Jun包含S63A及S73A突變中之一者或兩者(該等位置如上加雙下劃線)。在一些態樣中，如與野生型人類c-Jun相比，c-Jun具有殘基2與102之間或殘基30與50之間的缺失。

在一些態樣中，c-Jun多肽包含截短c-Jun多肽，如WO2019/118902所揭示，其明確以全文引用方式併入本文。在一些態樣中，c-Jun多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在某些態樣中，c-Jun多肽包含SEQ ID NO：1闡述之胺基酸序列。

在一些態樣中，本文揭示之c-Jun核苷酸序列可使用在此項技術中已知之任何方法來密碼子最佳化。 參見，例如，美國公開案第2011/0081708 A1號、第2014/0244228 A1號，及第2019/0325989 A1號，各自以全文引用方式併入本文。例如，在某些態樣中，本文揭示之c-Jun核苷酸序列之密碼子經最佳化以便與野生型核苷酸序列( 亦即，SEQ ID NO：2)相比，改變( 例如，增加或減少)以下參數中之一或多者：(i)密碼子適應指數( 亦即，密碼子使用偏好)，(ii)鳥嘌呤-胞嘧啶(GC)核苷酸含量，及(iii)其組合。

不受任何一種理論束縛，在一些態樣中，此密碼子最佳化可增加由核苷酸序列編碼之蛋白之表現。因此，在一些態樣中，與用野生型核苷酸序列( 亦即，SEQ ID NO：2)轉染之細胞中之對應表現相比，本揭示案之密碼子最佳化c-Jun核苷酸序列在細胞中轉染時能夠增加所編碼c-Jun蛋白之表現。

在一些態樣中，c-Jun多肽在細胞中過度表現時能夠防止及/或減少細胞( 例如，抗ROR1 CAR T細胞)之耗竭。不希望受任何一種理論束縛，在一些態樣中，過度表現c-Jun之細胞為耗竭抗性的，由此解決接受性細胞療法( 例如，CAR T細胞療法)之進展的主要障礙。在某些態樣中，與參考細胞( 例如不過度表現c-Jun之細胞)相比，對於耗竭之抗性增加至少約0.01倍、至少約0.02倍、至少約0.03倍、至少約0.04倍、至少約0.05倍、至少約0.06倍、至少約0.07倍、至少約0.08倍、至少約0.09倍、至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.3倍、至少約0.4倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。在一些態樣中，與參考細胞( 例如，未經修飾以便增加c-Jun表現之對應耗竭細胞)相比，耗竭細胞( 例如，免疫細胞)中之c-Jun多肽之過度表現可減少耗竭至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。

免疫細胞諸如T細胞中之c-Jun之過度表現藉由例如減輕或防止T細胞功能不良(例如，T細胞耗竭)來有助於保持細胞之活化狀態。本發明工程化免疫細胞諸如T細胞展現針對帶有ROR1之腫瘤細胞的持續、有效細胞毒性。如與不過度表現c-Jun之T細胞相比，本發明工程化T細胞顯示T細胞耗竭之較少跡象及持續並且起作用更長時間之效應細胞之增加跡象。

如本文所用，術語「過度表現(overexpression/overexpress)」(或其語法變異體)係指與參考細胞相比增加之表現(在基因水準及/或蛋白水準下)。如本揭示案顯而易知，在一些態樣中，例如與未經修飾以便過度表現c-Jun之對應細胞( 例如，存在於天然界中之對應T細胞)相比，本文所述細胞( 例如，T細胞)經修飾以使得其過度表現c-Jun。在一些態樣中，與對應細胞相比，本揭示案之細胞中之c-Jun多肽之表現增加。在一些態樣中，與對應細胞相比，c-Jun多肽之表現增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更多。修飾細胞以便過度表現c-Jun之示例性方法在本揭示案中別處提供。

在某些態樣中，本文所述抗ROR1 CAR工程化細胞( 亦即，過度表現c-Jun)具有一或多種耗竭標誌物，包括但不限於TIGIT、PD-1、TNFRSF9、顆粒酶A(GZMA)，及CD39之減少表現。此類標誌物( 例如，耗竭標誌物)之表現可在大量群體中藉由流式細胞術，使用整體RNASeq轉錄體分析來量測或在某些態樣中，個別細胞轉錄體分析可使用單一細胞RNASeq來執行。在某些態樣中，與參考細胞( 例如，未經工程化以便過度表現c-Jun之對應抗ROR1 CAR T細胞)相比，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR工程化T細胞中之一或多種標誌物( 例如，耗竭標誌物)之表現減少至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍，或至少約100倍或更多。在一些態樣中，與參考細胞中之對應表現相比，本文所述免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之一或多種標誌物( 例如，耗竭標誌物)之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。

在某些態樣中，與參考細胞( 例如，未經工程化以便過度表現c-Jun之對應抗ROR1 CAR T細胞)相比，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR工程化T細胞( 例如，本文所述細胞)中之TIGIT之表現減少至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍，或至少約100倍或更多。在一些態樣中，與參考細胞中之對應表現相比，本文所述免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之TIGIT之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。

在某些態樣中，與參考細胞( 例如，未經工程化以便過度表現c-Jun之對應抗ROR1 CAR T細胞)相比，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR工程化T細胞( 例如，本文所述細胞)中之PD-1之表現減少至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍，或至少約100倍或更多。在一些態樣中，與參考細胞中之對應表現相比，本文所述免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之PD-1之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。

在某些態樣中，與參考細胞( 例如，未經工程化以便過度表現c-Jun之對應抗ROR1 CAR T細胞)相比，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR工程化T細胞( 例如，本文所述細胞)中之CD39之表現減少至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍，或至少約100倍或更多。在一些態樣中，與參考細胞中之對應表現相比，本文所述免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之CD39之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。

在一些態樣中，與參考細胞( 例如，未經工程化以便過度表現c-Jun之對應細胞)相比，本文所述免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之TNFRSF9之表現減少至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍，或至少約100倍或更多。在一些態樣中，與參考細胞中之對應表現相比，本文所述免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之TNFRSF9之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。

在一些態樣中，與參考細胞( 例如，未經工程化以便過度表現c-Jun之對應細胞)相比，本文所述免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之GZMA之表現減少至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍，或至少約100倍或更多。在一些態樣中，與參考細胞中之對應表現相比，本文所述免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之GZMA之表現減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。

在一些態樣中，如與不過度表現c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，本文所述免疫細胞( 例如，經修飾以便包含CAR、截短EGFRt，及過度表現c-Jun多肽)之群體包含減少數目之TIGIT陽性免疫細胞。在一些態樣中，與參照群體相比，抗原刺激之後存在於群體中之TIGIT陽性免疫細胞之數目減少至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%，或至少約60%。在一些態樣中，在抗原刺激之後，免疫細胞之群體包含少於約15%、少於約14%、少於約13%、少於約12%、少於約11%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%，或少於約5%之TIGIT陽性免疫細胞。在某些態樣中，在14天持續抗原刺激之後，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體具有不超過約5%、約6%、約7%、約8%、約9%，或約10% TIGIT陽性細胞。在一些態樣中，在14天持續抗原刺激之後，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體具有不超過約5%-10%、約5%-15%、約8%-12%，或約8%-15% TIGIT陽性細胞。在此方面，工程化T細胞諸如CD4+或CD8+ T細胞之群體內之%TIGIT陽性細胞可使用流式細胞術來量測。

在某些態樣中，在約14天持續刺激之後，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體具有不超過約2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10% PD1陽性細胞。在一些態樣中，在14天持續抗原刺激之後，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體具有不超過約2%-5% PD1陽性細胞。在此方面，CD4+及/或CD8+ CAR ⁺c-Jun ⁺T細胞之群體內之% PD1陽性細胞可使用在此項技術中已知之方法諸如流式細胞術來量測。

在某些態樣中，在14天持續刺激之後，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體具有不超過約20%-60% CD39陽性細胞。在一些態樣中，在14天持續刺激之後，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體具有不超過約20%-40%或25%-45%或30%-40% CD39陽性細胞。CAR ⁺c-Jun ⁺T細胞之群體內之CD39陽性細胞百分比可使用在此項技術中已知之方法諸如流式細胞術來量測。

在一些態樣中，如與不過度表現c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，本文所述免疫細胞( 例如，經修飾以便包含CAR、截短EGFRt，及過度表現c-Jun多肽)之群體包含減少數目之TNFRSF9陽性免疫細胞。在一些態樣中，與參照群體相比，抗原刺激之後，存在於群體中之TNFRSF9陽性免疫細胞之數目減少至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%，或至少約70%。在一些態樣中，抗原刺激之後，免疫細胞之群體包含少於約5%、少於約4.5%、少於約4%、少於約3.5%，或少於約2%之TNFRSF9陽性免疫細胞。

在一些態樣中，如與不過度表現c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，本文所述免疫細胞( 例如，經修飾以便包含CAR、截短EGFRt，及過度表現c-Jun多肽)之群體包含減少數目之GZMA陽性免疫細胞。在一些態樣中，與參照群體相比，抗原刺激之後，存在於群體中之GZMA陽性免疫細胞之數目減少至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%，或至少約20%。在一些態樣中，抗原刺激之後，免疫細胞之群體包含少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%，或少於約10%之GZMA陽性免疫細胞。

在某些態樣中，如與不過度表現c-Jun之T細胞之對照群體相比，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體分泌至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍、至少約100倍、至少約125倍，或至少約150倍更多的IL-2、INF-γ，及/或TNFα。在某些態樣中，如與不過度表現c-Jun之工程化T細胞之對照群體相比，在以1:1、1:5、1:10及/或1:20 E:T比率來持續抗原刺激的第0天及/或第14天，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體表現至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍，或至少約100倍或更多的IL-2、INF-γ，及/或TNFα。細胞介素分泌可使用在此項技術中已知之方法諸如ELISA或MSD分析來量測。

在某些態樣中，如與不過度表現c-Jun之工程化T細胞之對照群體相比，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體表現出至少約2倍、至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍，或至少約250倍或更高的經增強之殺滅效率，例如，如藉由曲線下面積(AUC)來定量。

在某些態樣中，如與不過度表現c-Jun之工程化T細胞之對照群體相比，如本文所述過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞之群體表現出至少相等或至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約125倍、至少約150倍、至少約200倍、至少約225倍、至少約250倍、至少約300倍、至少約400倍，或至少約500倍或更大的經增強之響應於抗原之增殖。抗原誘導增殖可使用在此項技術中已知之增殖檢定，諸如本文所述檢定來測試。

適用於量測本文所述細胞( 例如，抗ROR1 CAR T細胞)之一或多個性質諸如耗竭、細胞表型、持久性、細胞毒性及/或殺滅、增殖、細胞介素釋放，及基因表現概況的檢定在此項技術中為已知的並且包括，例如，流式細胞術、細胞內細胞介素染色(ICS)、IncuCyte免疫細胞殺滅分析、Meso Scale Discovery (MSD)或類似檢定、持續抗原刺激檢定、連續抗原刺激檢定(類似於持續抗原刺激檢定，但是不隨著每次再刺激循環來重新設定E:T細胞比率)、整體及單一細胞RNAseq(參見 例如，Fron Genet.2020；11:220；2019 Bioinformatics 35:i436-445；2019 Annual Review of Biomed. Data Sci.2:139-173)、細胞毒性/殺滅檢定、ELISA、西方墨點法及諸如在本文中描述或如例如在Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., 1999-2021)中或在別處中描述之其他標準分子及細胞生物學方法。 EGFRt

在一些態樣中，本文所述本發明之多核苷酸( 例如，包含編碼嵌合結合蛋白，例如，CAR之核苷酸序列)進一步包含編碼截短表皮生長因子受體(EGFRt)之核苷酸序列。因此，在某些態樣中，本揭示案之多核苷酸編碼嵌合多肽( 例如，嵌合結合蛋白)，其包含(i)c-Jun多肽、(ii)ROR-1結合蛋白( 例如，抗ROR1 CAR)，及(iii)EGFRt。

表皮生長因子受體(EGFR)為受體酪胺酸激酶，其結合EGF家族之配位體，從而活化多個信號轉導級聯以便將細胞外提示轉化成合適細胞反應。如本文所用，「截短表皮生長因子受體」或「EGFRt」僅包含全長EGFR蛋白( 例如，SEQ ID NO：3)之部分序列。在一些態樣中，EGFRt包含EGFR胞外域III及IV及EGFR跨膜域，但是缺少EGFR胞外域I及II及EGFR細胞內序列。

在一些態樣中，本文所述EGFRt另外包含近膜域。如本文所用，術語「近膜域」係指直接在跨膜域之C端的細胞表面蛋白( 例如，EGFR)之細胞內部分。不受任何一種理論束縛，在一些態樣中，添加近膜域可增加由本揭示案之多核苷酸來編碼之蛋白之表現。因此，在一些態樣中，EGFRt包含胞外域、跨膜域，及細胞內域之前三個胺基酸。在一些態樣中，EGFRt包含EGFR域III、EGFR域I、跨膜域，及胺基酸Arg-Arg-Arg)(SEQ ID NO：3；參見表3)。表3. EGFRt胺基酸序列

EGFRt (SEQ ID NO: 3)

RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRR

如本揭示案顯而易知，包含編碼EGFRt之核苷酸序列向本揭示案之多核苷酸( 例如，包含編碼嵌合結合蛋白，例如，CAR之核苷酸序列)提供某些優勢。

在一些態樣中，EGFRt可充當殺滅開關。在一些態樣中，當身體中不再需要工程化細胞( 例如，本文所述過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)，可將醫藥級抗EGFR抗體諸如西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)，或奈昔妥珠單抗(necitumumab)投與患者，由此移除工程化細胞，例如，經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)，及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。

在一些態樣中，EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。在某些態樣中，EGFRt包含SEQ ID NO：3闡述之胺基酸序列。 間隔基

在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸( 例如，包含編碼嵌合結合蛋白，例如，CAR之核苷酸序列)包含一或多個編碼間隔基之核苷酸序列。如本文所用之術語「間隔基」係指能夠將兩個隔開部分共價連接在一起的多肽序列：例如，嵌合結合蛋白( 例如，CAR)之抗原結合域及跨膜域。在一些態樣中，本文揭示之嵌合結合蛋白( 例如，CAR)包含特異性結合至ROR1之抗體或其抗原結合部分與跨膜域之間的間隔基。

在一些態樣中，間隔基衍生自免疫球蛋白( 例如，衍生自鉸鏈區域或環區域)。在某些態樣中，此等間隔基包含例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE，或IgM鉸鏈區域、其片段(單獨或藉由額外序列， 例如，CH1或CH2區域序列來加帽)，或來自IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE，或IgM鉸鏈區域之片段之組合。在一些態樣中，間隔基包含例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE，或IgM恆定域環區域、其片段(單獨或封端額外序列， 例如，相鄰β鏈)，或組合片段IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE，或IgM環區域。在一些態樣中，本揭示案之間隔基包含鉸鏈區衍生序列、環區域衍生序列，或其組合。

因此，在一些態樣中，本揭示案提供編碼嵌合多肽( 例如，嵌合結合蛋白，例如，CAR)之多核苷酸，其中CAR包含(i)抗原結合域( 例如，抗ROR1 scFv)、(ii)跨膜域，及(iii)細胞內域。在某些態樣中，本文中之多核苷酸進一步編碼(iv)c-Jun多肽及(v)EGFRt肽。在某些態樣中，本文所述多核苷酸亦編碼包含衍生自人類免疫球蛋白(Ig)鉸鏈區及/或環區域之胺基酸序列的一或多個間隔基，及視情況連接子(例如，富含gly-ser之連接子)，其中間隔基位於抗原結合域與跨膜域之間。在一些態樣中，本揭示案提供包含編碼本揭示案之CAR之轉殖基因的重組核酸構築體。本揭示案亦提供藉由本文揭示之多核苷酸序列或載體中之一或多者來編碼的CAR。在一些態樣中，本揭示案之CAR被設計成標準CAR、分體CAR、關斷CAR、接通CAR、第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR、第四代CAR，或第五代CAR。

術語「本揭示案之間隔基「及「Ig衍生間隔基」可互換使用以便係指 (i) 「鉸鏈區衍生間隔基」，亦即，包含衍生自位於人類免疫球蛋白之CH1與CH2恆定域之間之鉸鏈區例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE，或IgM之胺基酸序列，及視情況來自相鄰CH1及/或CH2域之一或多個胺基酸，或其組合的間隔基(例如，多個串聯鉸鏈區衍生間隔基)； (ii) 「環區域衍生間隔基」，亦即，包含衍生自人類免疫球蛋白之恆定域之環區域例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE，或IgM之胺基酸序列，及視情況來自相鄰b-鏈之一或多個胺基酸，或其組合的間隔基(例如，多個串聯環區域衍生間隔區)；或， (iii) 其組合(例如，兩個或兩個以上串聯鉸鏈區衍生間隔基及環區域衍生間隔基)。

在一些態樣中，本揭示案之術語間隔基係指選自由以下組成之群之免疫球蛋白重鏈的之子序列：人類IgA1 (Uniprot: P01876，IGHA1_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定α 1；SEQ ID NO: 5)、人類IgA2 (Uniprot P01877，IGHA2_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定α 2；SEQ ID NO: 6)、鼠科IgG2A (Uniprot P01665，GCAM_MOUSE，免疫球蛋白γ 2A鏈C區域；SEQ ID NO: 7)、人類IgG1 (Uniprot P01857，IGHG1_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 1；SEQ ID NO: 8)、人類IgG2 (Uniprot P01859，IGHG2_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 2；SEQ ID NO: 9)、人類IgG3 (Uniprot P01860，IGHG3_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 3；SEQ ID NO: 10)、人類IgG4 (Uniprot P01861，IGHG4，免疫球蛋白重鏈恆定γ 4；SEQ ID NO: 11)、人類IgD (Uniprot P01880，IGHD_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定δ；SEQ ID NO: 12)、人類IgE (Uniprot P01854，IGHE_HUMAN，免疫球蛋白重恆定鏈ε；SEQ ID NO: 13)；或IgM (Uniprot P01871，IGHM_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定µ；SEQ ID NO: 14)，其中子序列包含CH1-CH2鉸鏈區或其一部分。在一些態樣中，子序列進一步包含CH1及/或CH2恆定域之相鄰部分。

在一些態樣中，本揭示案之術語間隔基係指選自由以下組成之群之免疫球蛋白重鏈的之子序列：人類IgA1 (Uniprot: P01876，IGHA1_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定α1；SEQ ID NO: 5)、人類IgA2 (Uniprot P01877，IGHA2_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定α2；SEQ ID NO: 6)、鼠科IgG2A (Uniprot P01665，GCAM_MOUSE，免疫球蛋白γ 2A鏈C區域；SEQ ID NO: 7)、人類IgG1 (Uniprot P01857，IGHG1_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 1；SEQ ID NO: 8)、人類IgG2 (Uniprot P01859，IGHG2_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 2；SEQ ID NO: 9)、人類IgG3 (Uniprot P01860，IGHG3_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定γ 3；SEQ ID NO: 10)、人類IgG4 (Uniprot P01861，IGHG4，免疫球蛋白重鏈恆定γ 4；SEQ ID NO: 11)、人類IgD (Uniprot P01880，IGHD_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定δ；SEQ ID NO: 12)、人類IgE (Uniprot P01854，IGHE_HUMAN，免疫球蛋白重恆定鏈ε；SEQ ID NO: 13)，或IgM (Uniprot P01871，IGHM_HUMAN，免疫球蛋白重鏈恆定µ；SEQ ID NO: 14)，其中子序列包含來自恆定域之環區域或其一部分。在一些態樣中，子序列進一步包含β-鏈之相鄰部分。

在一些態樣中，本揭示案之CAR間隔基包含IgG2鉸鏈例如鼠科IgG2A鉸鏈衍生CAR間隔基之序列、由該序列組成，或基本上由該序列組成，例如，間隔基1，例如，KPCPPCKCP(SEQ ID NO：15)。

在一些態樣中，本揭示案之間隔基與SEQ ID NO：15闡述之序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，本揭示案之CAR間隔基包含與SEQ ID NO：15闡述之序列中任一者一致的序列，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10個胺基酸取代以外。在一些態樣中，胺基酸取代為保守胺基酸取代。在一些態樣中，胺基酸取代包含至少一個非保守胺基酸取代。

在一些態樣中，本揭示案之間隔基包含SEQ ID NO：15闡述之序列，其中間隔基序列進一步包含視情況選用之可撓性連接子( 例如，GGGSG(SEQ ID NO：16)之連接子)。因此，在一些態樣中，本揭示案之間隔基包含間隔基序列(例如，SEQ ID NO：15)及視情況選用之C端或N端可撓性連接子。在一些態樣中，本文揭示之任何視情況選用之可撓性連接子( 例如，富含gly/ser之連接子)可附加至間隔基之C端及/或N端。

因此，在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸包含編碼嵌合結合蛋白( 例如，CAR)之核苷酸序列，其包含(i)ROR1結合蛋白；(ii)間隔基；及(iii)編碼EGFRt之核苷酸。在一些態樣中，多核苷酸包含CAR，其包含(i)ROR1結合蛋白，該蛋白包含有包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的輕鏈可變區(VL)；(ii)包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的間隔區；及(iii)編碼截短EGF受體(EGFRt)之核苷酸序列。如在本揭示案中別處進一步描述，在一些態樣中，ROR1結合部分之VH包含SEQ ID NO：44並且ROR1結合部分之VL包含SEQ ID NO：48。在一些態樣中，EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。 信號肽

如本文所描述，在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸( 例如，包含編碼嵌合結合蛋白，例如，CAR的核苷酸序列)亦包含編碼信號肽之核苷酸序列。信號肽可促進所編碼蛋白之細胞表面表現，然後可隨後自成熟蛋白質上裂解。

在此項技術中已知之任何合適信號肽可用於本揭示案。信號肽之非限制性實例提供於表4中(如下)。在某些態樣中，信號肽衍生自人類Igκ。在一些態樣中，信號肽包含與SEQ ID NO：17(MVLQTQVFISLLLWISGAYG)闡述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在某些態樣中，信號肽包含SEQ ID NO：17(MVLQTQVFISLLLWISGAYG)闡述之胺基酸序列。在一些態樣中，信號肽衍生自GM-CSF。在某些態樣中，此信號肽包含與SEQ ID NO：18(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP)闡述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，信號肽包含SEQ ID NO：18(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP)闡述之胺基酸序列。

在一些態樣中，本文所述多核苷酸包含單一信號肽( 例如，SEQ ID NO：17或18)。在一些態樣中，多核苷酸包含多個信號肽( 例如，至少兩個、三個、四個，或更多個)。在某些態樣中，本文所述多核苷酸編碼嵌合多肽( 例如，嵌合結合蛋白，例如，CAR)其中CAR包含(i)抗原結合域( 例如，抗ROR1 scFv)、(ii)跨膜域，及(iii)細胞內域。在某些態樣中，本文中之多核苷酸進一步編碼(iv)c-Jun多肽及(v)EGFRt多肽。在某些態樣中，本文中之多核苷酸亦編碼一或多個信號肽( 例如，表4中闡述之彼等)。表 4：信號肽序列

來源	序列
EGFR	MRPSGTAGAALLALLAALCPASRA (SEQ ID NO: 19)
GM-CSF	MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 18)
人類Ig κ	MVLQTQVFISLLLWISGAYG (SEQ ID NO: 17)
人類CD33	MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 20)

連接子

在一些態樣中，本發明之任何CAR間隔基可包含視情況選用之N端連接子及/或視情況選用之C端連接子。在一些態樣中，連接子可連接本文所述CAR之任何組分。此項技術中已知之可撓性連接子序列可用作視情況選用之連接子。在一些態樣中，視情況選用之連接子為根據式[(Gly)n-Ser]m(SEQ ID NO：21)之甘胺酸/絲胺酸連接子，其中n為1至100之任何整數並且m為1至100之任何整數。在一些態樣中，甘胺酸/絲胺酸連接子根據式[(Gly)x-(Ser)y]z(SEQ ID NO：22)，其中x為1至4之整數，y為0或1，並且z為1至50之整數。在一些態樣中，視情況選用之連接子包含序列(G)n (SEQ ID NO：23)，其中n可為1至100之整數。在一些態樣中，視情況選用之連接子可包含序列(GlyAla)n (SEQ ID NO：24)，其中n為1與100之間之整數。

在一些態樣中，視情況選用之連接子之序列為GGGG (SEQ ID NO：25)。在一些態樣中，視情況選用之連接子之序列為GGGSG (SEQ ID NO: 26)。

在一些態樣中，視情況選用之連接子包含序列(GGGSG)n (SEQ ID NO：27)。在一些態樣中，視情況選用之連接子包含序列(GGGGS)n (SEQ ID NO：28)。在一些態樣中，視情況選用之連接子可包含序列(GGGS)n (SEQ ID NO：29)。在一些態樣中，視情況選用之連接子可包含序列(GGS)n (SEQ ID NO：30)。在此等情況下，n可為1至100之整數。在其他情況下，n可為1至20之整數， 亦即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或20。在一些態樣中n為1至100之整數。

視情況選用之連接子之實例包括但不限於 例如，GSGSGS (SEQ ID NO: 31)、GGSGG (SEQ ID NO: 32)、SGGSGGS (SEQ ID NO: 33)、GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 34)、GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 35)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 63)，或GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 36)。

在一些態樣中，視情況選用之連接子包含序列PGG。在一些態樣中，視情況選用之連接子包含除了甘胺酸及絲胺酸以外的額外胺基酸。在一些態樣中，視情況選用之連接子包含1、2、3、4，或5個非gly/非ser胺基酸。在一些態樣中，Gly/Ser連接子包含至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%，或至少95%甘胺酸或絲胺酸胺基酸。

在一些特定態樣中，視情況選用之連接子為1與10之間之胺基酸長度。在一些態樣中，視情況選用之連接子為約5與約10之間、約10與約20之間、約20與約30之間、約30與約40之間、約40與約50之間、約50與約60之間、約60與約70之間、約70與約80之間、約80與約90之間，或約90與約100之間的胺基酸長度。

在一些態樣中，連接子為不可裂解連接子，以使得連接子及本文提供之多核苷酸之不同組分( 例如，c-Jun及嵌合結合蛋白)表現為單一多肽。在某些態樣中，連接子為可裂解連接子。如本文所用，術語「可裂解連接子」係指包含裂解位點，以使得當表現時可選擇性地裂解以便產生兩個或兩個以上產物的連接子。在一些態樣中，連接子選自P2A連接子、T2A連接子、F2A連接子、E2A連接子、弗林蛋白酶裂解位點，或其任何組合( 參見以下表5)。在一些態樣中，連接子進一步包含GSG連接子序列。在一些態樣中，適用於本揭示案之連接子包含內部核糖體進入位點(IRES)，以使得在轉譯期間產生藉由第一及第二基因編碼之單獨多肽。可用於本揭示案之連接子之額外描述提供於例如WO 2020/223625 A1及US 2019/0276801 A1中，其各自以全文引用方式併入本文。表 5：連接子序列

P2A	ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 37)
T2A	EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)
F2A	VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 39)
E2A	QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 40)
弗林蛋白酶裂解位點	RAKR (SEQ ID NO: 41)

在一些態樣中，連接子包含P2A連接子。在一些態樣中，連接子包含與SEQ ID NO：37闡述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO：37闡述之胺基酸序列。

在一些態樣中，連接子包含T2A連接子。在一些態樣中，連接子包含與SEQ ID NO：38闡述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO：38闡述之胺基酸序列。

在一些態樣中，連接子包含F2A連接子。在一些態樣中，連接子包含與SEQ ID NO：39闡述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO：39闡述之胺基酸序列。

在一些態樣中，連接子包含E2A連接子。在一些態樣中，連接子包含與SEQ ID NO：40闡述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO：40闡述之胺基酸序列。

在一些態樣中，連接子包含有包含弗林蛋白酶裂解位點之胺基酸序列。在一些態樣中，連接子包含與SEQ ID NO：41闡述之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，連接子包含SEQ ID NO：41闡述之胺基酸序列。 抗原結合域

在一些態樣中，由本揭示案之多核苷酸編碼的嵌合結合蛋白( 例如，CAR)之抗原結合域包含lg NAR、Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、單鏈可變片段(scFv)、雙scFv、(scFv)2、微小抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、胞內抗體、二硫化物穩定化Fv蛋白(dsFv)、單抗體，或奈米抗體。在某些態樣中，抗原結合域為scFv。在一些情況下，scFv可根據在此項技術中已知之方法(參見，例如，Bird等人, (1988) Science 242:423-426及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)來製備。ScFv分子可藉由使用可撓性多肽連接子將VH及VL區域連接在一起來產生。scFv分子包含具有最佳化長度及/或胺基酸組成之連接子( 例如，Ser-Gly連接子)。連接子長度可極大地影響scFv之可變區如何折疊及相互作用。事實上，若使用較短多肽連接子( 例如，5-10胺基酸之間)，則防止鏈內折疊。亦需要鏈間折疊來使兩個可變區結合在一起以便形成功能性抗原決定基結合位點。對於連接子取向及大小之實例，參見， 例如，Hollinger等人1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、美國專利申請公開案第2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號，及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號，其以引用方式併入本文。

scFv可包含其VL與VH區域之間的例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50，或更多個胺基酸殘基之連接子。連接子序列可包含任何天然存在之胺基酸。在一些態樣中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在一些態樣中，連接子序列包含甘胺酸及絲胺酸重複序列之集合諸如(Gly ₄Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數(SEQ ID NO：42)。在一些態樣中，連接子可為(Gly ₄Ser) ₄(SEQ ID NO：43)或(Gly ₄Ser) ₃(SEQ ID NO：36)，或以上揭示之任何富含gly-ser之連接子。

連接子長度之變化可保持或增強活性，從而在活性研究中產生極好功效。

在一些態樣中，抗原結合域或其他部分或整個CAR之胺基酸序列可經修飾， 例如，本文所述胺基酸序列可例如藉由保守取代來修飾。具有相似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中定義，包括鹼性側鏈( 例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈( 例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電之極性側鏈( 例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈( 例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈( 例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈( 例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。

示例性抗ROR1 CAR在Hudecek等人Clin. Cancer Res. 19.12(2013):3153-64中描述，其以全文引用方式併入本文。在一些態樣中，包含抗ROR1 CAR的本揭示案之CAR T細胞如Hudecek等人所描述(例如，如Hudecek等人第3155頁，第一完整段落所描述，其以全文引用方式併入本文)來產生，其中Hudecek揭示之間隔基藉由本揭示案之CAR間隔基來置換。在一些態樣中，本揭示案之抗ROR1 CAR包括包含2A2、R11，及R12抗ROR1單株抗體之VH及/或VL序列的抗體或其片段，如Hudecek等人在連接第3154-55頁之段落；Baskar等人MAbs 4(2012):349-61；及Yang等人PLoS ONE 6(2011):e21018中所描述，其以引用方式併入本文其全文。

在一些態樣中，本揭示案之抗原結合域能夠與抗ROR1抗體， 例如，R12抗體交叉競爭。R12抗體序列在表6中示出。在一些態樣中，適用於本揭示案之抗原結合域結合至R12抗體之相同抗原決定基。如熟習此項技術者顯而易知，在此項技術中已知之任何抗ROR1抗體可用於本揭示案。此類抗體之非限制性實例包括Hudecek，等人Clin. Cancer Res. 19.12(2013):3153-64；Baskar等人MAbs 4(2012):349-61；及Yang等人PLoS ONE 6(2011):e21018；US 9,316,646 B2；及US 9,758,586 B2所描述之2A2及R11抗體；其各自以全文引用方式併入本文。表 6. R12抗體CDR

R12 VH (SEQ ID NO: 44)	QEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISS
R12 VH CDR1 (SEQ ID NO: 45)	AYYMS
R12 VH CDR2 (SEQ ID NO: 46)	TIYPSSGKTYYATWVNG
R12 VH CDR3 (SEQ ID NO: 47)	DSYADDGALFNI
R12 VL (SEQ ID NO: 48)	ELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG
R12 VL CDR1 (SEQ ID NO: 49)	TLSSAHKTDTID
R12 VL CDR2 (SEQ ID NO: 50)	GSYTKRP
R12 VL CDR3 (SEQ ID NO: 51)	GADYIGGYV

在一些態樣中，本揭示案之抗原結合域包含R12抗體之VH CDR3。在一些態樣中，本揭示案之抗原結合域包含R12抗體之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。在一些態樣中，本揭示案之抗原結合域包含R12抗體之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2，及VL CDR3。在一些態樣中，本揭示案之抗原結合域， 例如，R12 scFv，包含R12抗體之VH及VL。在一些態樣中，R12 scFv藉由IgG2連接子，例如，間隔基1(SEQ ID NO：15)，及視情況連接子SEQ ID NO：16來連接至跨膜域。

在一些態樣中，ROR1結合抗體或其抗原結合部分包含與SEQ ID NO：52具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些態樣中，靶向ROR1的本揭示案之CAR包含靶向ROR1之抗體或其片段( 例如，單鏈可變片段(scFv))，包括2017年9月12日發佈之美國專利第US9316646B2號或2016年4月19日發佈之第US9758586B2號所描述之抗體，其各自以全文引用方式併入本文。

在一些態樣中，本揭示案之CAR包含抗原結合域、跨膜域，及細胞內域，其中抗原結合域及跨膜域藉由包含KPCPPCKCP(SEQ ID NO：15)之CAR間隔基及視情況SEQ ID NO：16之連接子來連接，並且其中抗原結合域包含R12抗體之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2，及VL CDR3， 例如，R12抗體之VH及VL。

在一些態樣中，抗ROR1抗原結合抗體片段( 例如，scFv)偶聯或融合至生物活性分子，例如以便形成本揭示案之CAR，其嚮導免疫細胞， 例如，T細胞以便向表現ROR1之細胞作出響應。

在一些態樣中，本揭示案之嵌合抗原受體(CAR)( 亦即，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR)包含被稱為UC-961(西姆單抗(Cirmtuzumab))之抗ROR1單株抗體或其抗原結合部分。參見， 例如，臨床試驗標識符第NCT02222688號。西姆單抗可用於治療癌症，諸如慢性淋巴球性白血病(CLL)、卵巢癌，及黑素瘤。參見， 例如，Hojjat-Farsangi等人PLoS One. 8(4): e61167；及NCT02222688。 信號傳導、跨膜、共刺激域

在一些態樣中，藉由本揭示案之多核苷酸來編碼之嵌合結合蛋白( 例如，CAR)之細胞內域包含信號轉導域，諸如衍生自CD3 ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b，或CD66d之域。在一些態樣中，CAR進一步包含共刺激域，諸如衍生自2B4、HVEM、ICOS、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、ICOS(CD278)、糖皮質激素誘導腫瘤壞死因子受體(GITR)、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C，或B7-H3之域。在一些態樣中，CAR包含4-1BB共刺激域。在一些態樣中，4-1BB共刺激域包含SEQ ID NO：53闡述之序列。

在一些態樣中，藉由本揭示案之多核苷酸來編碼之嵌合結合蛋白( 例如，CAR)包含跨膜域(TM)，諸如選自由以下組成之群的域：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、PD1、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152，及CD154。跨膜域可衍生自天然或重組來源。當來源為天然來源時，該域可衍生自任何膜結合或跨膜蛋白質。在一些態樣中，每當本揭示案之CAR結合至標靶時，跨膜域能夠向細胞內域進行信號轉導。

在一些態樣中，跨膜域可至少包括例如以下之跨膜區：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C，或CD19。

在一些態樣中，TM域衍生自CD8a、CD2、CD4、CD28、CD45、PD1、CD152，或其任何組合。在一些態樣中，TM域衍生自CD28。在一些態樣中，TM域包含與SEQ ID NO：54具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在某些態樣中，TM域包含SEQ ID NO：54闡述之胺基酸序列。

在一些態樣中，藉由本揭示案之多核苷酸編碼之嵌合結合蛋白( 例如，CAR)進一步包含編碼共刺激域， 例如，本文所述共刺激域的序列。在一些態樣中，共刺激域包含以下各者之共刺激域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、Lck結合缺失CD28(ICA)、、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TILR2、TILR4、TILR7、TILR9、Fc受體γ鏈、Fc受體ε鏈、與CD83特異性結合之配位體，或其任何組合。

在一些態樣中，本揭示案之嵌合結合蛋白( 例如，CAR)(例如，抗ROR1 CAR)進一步包含編碼細胞內信號轉導域， 例如，本文所述細胞內信號轉導域的序列。在一些態樣中，細胞內信號轉導域包含CD3 ζ活化域、CD3δ活化域、CD3ε活化域、CD3η活化域、CD79A活化域、DAP 12活化域、FCER1G活化域、DAP10/CD28活化域、ZAP70活化域，或其任何組合。在一些態樣中，細胞內信號轉導域包含CD3 ζ活化域。在一些態樣中，CD3 ζ活化域包含與SEQ ID NO：55具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在某些態樣中，細胞內信號轉導域包含SEQ ID NO：55闡述之序列。

在一些態樣中，本揭示案之嵌合結合蛋白( 例如，CAR)( 例如，靶向ROR1之CAR)的跨膜域包括藉由連接子來連接至嵌合結合蛋白( 例如，CAR)之細胞內域的跨膜域。

在一些態樣中，細胞內信號轉導域包含4-1BB共刺激域。在一些態樣中，4-1BB共刺激域包含與SEQ ID NO：53具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在某些態樣中，4-1BB共刺激域包含SEQ ID NO：53闡述之序列。

如以上揭示內容顯而易知，在一些態樣中，本文所述多核苷酸包含(自5'至3')(i)編碼c-Jun多肽之第一核苷酸序列，(ii)編碼第一連接子( 例如，P2A連接子)之第二核苷酸序列，(iii)編碼第一信號肽( 例如，hIgκ)之第三核苷酸序列，(iv)編碼抗原結合域( 例如，抗ROR1 scFv)之第四核苷酸序列，(v)編碼第二連接子( 例如，GGGSG；SEQ ID NO：16)之第五核苷酸序列，(vi)編碼間隔基( 例如，IgG2鉸鏈衍生間隔基)之第六核苷酸序列，(vii)編碼跨膜域( 例如，CD28)之第七核苷酸序列，(viii)編碼共刺激域( 例如，4-1BB)之第八核苷酸序列，(ix)編碼細胞內信號轉導域( 例如，CD3ζ)之第九核苷酸序列，(x)編碼第三連接子( 例如，P2A連接子)之第十核苷酸序列，(xi)編碼第二信號肽(例如，GMCSFRαSP)之第十一核苷酸序列，及(xii)編碼EGFRt之第十二核苷酸序列。 雙特異性 CAR

在一些態樣中，本揭示案之CAR為雙特異性CAR。因此，在一些態樣中，編碼本揭示案之CAR之多核苷酸至少編碼雙特異性CAR( 例如，靶向第一抗原及第二抗原之CAR)的多肽。

在一些態樣中，本揭示案之CAR之抗原結合域為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體具有對於不超過兩個抗原之特異性。雙特異性抗體分子藉由具有對於第一抗原決定基之結合特異性的第一免疫球蛋白可變域序列及具有對於第二抗原決定基之結合特異性的第二免疫球蛋白可變域序列來表徵。在一些態樣中，第一及第二抗原決定基在同一抗原， 例如，同一蛋白(或多聚體蛋白之次單元)上。在一些態樣中，第一及第二抗原決定基重疊。在一些態樣中，第一及第二抗原決定基不重疊。在一些態樣中，第一及第二抗原決定基在不同抗原， 例如，不同蛋白(或多聚體蛋白之不同次單元)上。

在一些態樣中，雙特異性抗體分子包含具有對於第一抗原決定基之結合特異性的重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列及具有對於第二抗原決定基之結合特異性的重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列。在一些態樣中，雙特異性抗體分子包含具有對於第一抗原決定基之結合特異性的半抗體及具有對於第二抗原決定基之結合特異性的半抗體。在一些態樣中，雙特異性抗體分子包含具有對於第一抗原決定基之結合特異性的半抗體，或其片段及具有對於第二抗原決定基之結合特異性的半抗體，或其片段。在一些態樣中，雙特異性抗體分子包含具有對於第一抗原決定基之結合特異性的scFv，或其片段及具有對於第二抗原決定基之結合特異性的scFv，或其片段。

在某些態樣中，抗體分子為多特異性( 例如，雙特異性或三特異性)抗體分子。產生雙特異性或異二聚體抗體分子之方案在此項技術中為已知的。

在雙特異性抗體分子之各抗體或抗原結合抗體片段( 例如，scFv)內，VH可在VL上游或下游。在一些態樣中，上游抗體或抗體片段( 例如，scFv)被配置成其VH(VH ₁)在其VL(VL ₁)上游並且下游抗體或抗體片段( 例如，scFv)被配置成其VL(VL ₂)在其VH(VH ₂)上游，以使得整個雙特異性抗體分子具有配置VH ₁-VL ₁-VL ₂-VH ₂。在一些態樣中，上游抗體或抗體片段( 例如，scFv)被配置成其VL(VL ₁)在其VH(VH ₁)上游並且下游抗體或抗體片段( 例如，scFv)被配置成其VH(VH ₂)在其VL(VL ₂)上游，以使得整個雙特異性抗體分子具有配置VL ₁-VH ₁-VH ₂-VL ₂。視情況，連接子安置在兩個抗體或抗體片段( 例如，scFv)之間， 例如，若構築體被配置成VH ₁-VL ₁-VL ₂-VH ₂，則連接子在VL ₁與VL ₂之間，或若構築體被配置成VL ₁-VH ₁-VH ₂-VL ₂，則連接子在VH ₁與VH ₂之間。連接子可為如本文所述連接子， 例如，(Gly ₄Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5，或6， 例如，4(SEQ ID NO：43)。通常，兩個scFv之間之連接子應足夠長來避免兩個scFv之域之間的錯配。視情況，連接子安置在第一scFv之VL與VH之間。視情況，連接子安置在第二scFv之VL與VH之間。在具有多個連接子之構築體中，任何兩個或兩個以上連接子可相同或不同。因此，在一些態樣中，雙特異性CAR包含如本文所述配置中的VL、VH，及視情況一或多個連接子。

在一些態樣中，抗體分子為具有位於第一腫瘤抗原( 例如，ROR1)上之第一抗原決定基及位於第二抗原， 例如，CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b，或CD79a上之第二抗原決定基的雙特異性抗體分子。在一些態樣中，雙特異性抗體結合至第一抗原決定基，其中第一抗原決定基位於CD19上，並且結合至第二抗原決定基，其中第二抗原決定基位於CD20上。在一些態樣中，雙特異性抗體結合至第一抗原決定基，其中第一抗原決定基位於CD19上，並且結合至第二抗原決定基，其中第二抗原決定基位於CD22上。在一些態樣中，雙特異性抗體結合至第一抗原決定基，其中第一抗原決定基位於CD20上，並且結合至第二抗原決定基，其中第二抗原決定基位於CD22上。在某些態樣中，抗體分子為具有對於第一B細胞抗原決定基之第一結合特異性及對於另一B細胞抗原之第二結合特異性的雙特異性抗體分子。例如，在一些態樣中，雙特異性抗體分子具有對於第一B細胞抗原決定基， 例如，對於ROR1之第一結合特異性，及對於CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b，或CD79a B細胞抗原決定基中之一或多者之第二結合特異性。

在一些態樣中，第二抗原選自由以下組成之群：ROR1、HER2、AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL- 13Ra2、間皮蛋白、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、鄰乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆莢蛋白、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT- 2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、生存蛋白及端粒酶、PCTA- 1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶反轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分，及其任何組合。 可誘導表現構築體

在一些態樣中，編碼如本文所述CAR(例如，抗ROR1 CAR)、c-Jun，及/或EGFRt之本文中之多順反子多核苷酸的表現藉由組成性啟動子， 例如，立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子、延長生長因子-1α(EF-1α)、猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、鳥類白血病病毒啟動子、Epstein-Barr病毒立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、以及人類基因啟動子諸如但不限於肌動蛋白啟動子、泛素啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子，及肌酸激酶啟動子來調控。然而，藉由本揭示案之多核苷酸來編碼之多肽( 例如，抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt)之表現之調控不限於使用組成性啟動子。

因此，在一些態樣中，藉由本文所述多核苷酸來編碼之蛋白(例如，抗ROR1 CAR、c-Jun、EGFRt蛋白、信號肽，及/或間隔基)之表現為可誘導的。術語「可誘導」係指存在「可誘導啟動子」 亦即，當與編碼或指定基因產物， 例如，本揭示案之CAR、c-Jun、EGFRt之多核苷酸可操作地連接時，導致實質上僅當對應於啟動子之誘導因子存在於細胞中時，基因產物在細胞中得以產生的核苷酸序列。使用可誘導啟動子提供能夠在需要此表現時啟動可操作連接之多核苷酸序列的表現，或在不需要該表現時關閉該表現的分子開關。可誘導啟動子之實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子，及四環素啟動子。

在一些態樣中，編碼本揭示案之CAR、c-Jun，及/或EGFRt之多核苷酸包含「組織特異性」啟動子， 亦即，當與編碼或指定基因產物， 例如，本揭示案之CAR之多核苷酸可操作地連接時，導致大致上僅當細胞為對應於啟動子的組織類型之細胞時，基因產物在細胞中得以產生的核苷酸序列。載體

本揭示案亦提供載體，其包含可操作地連接至調節元件的編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun，及EGFRt蛋白(亦即，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)之多核苷酸。在一些態樣中，編碼本揭示案之CAR、c-Jun、EGFRt之多順反子多核苷酸為DNA分子，或RNA分子。

在一些態樣中，載體為轉移載體。術語「轉移載體」係指包含分離核酸( 例如，本揭示案之多核苷酸)並且可用於將分離核酸遞送至細胞內部的組合物。許多載體在此項技術中為已知的，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關之多核苷酸、質體，及病毒。因此，術語「轉移載體」包含自主複製質體或病毒。術語亦應理解為進一步包括促進將核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，例如像多聚離胺酸化合物、脂質體，及其類似化合物。病毒轉移載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體，及其類似載體。

在一些態樣中，載體為表現載體。術語「表現載體」係指包含重組多核苷酸( 例如，本揭示案之多肽)之載體，該多核苷酸包含可操作連接至待表現之核苷酸序列之表現控制序列。在一些態樣中，表現載體為多順反子表現載體。表現載體包含足以用於表現之順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞或活體外表現系統供應。表現載體包括併入重組多核苷酸之所有在此項技術中已知之載體，包括黏接質體、質體( 例如，裸或包含於脂質體中)及病毒( 例如，慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒，及腺相關病毒)。

在一些態樣中，載體為病毒載體、哺乳動物載體，或細菌載體。在一些態樣中，載體選自由以下組成之群：腺病毒載體、慢病毒、Sendai病毒載體、桿狀病毒載體、Epstein Barr病毒載體、乳多空病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、混合載體，及腺相關病毒(AAV)載體。

在一些態樣中，腺病毒載體為第三代腺病毒載體。ADEASY™為產生腺病毒載體構築體之迄今最普及方法。該系統由兩種類型之質體組成：穿梭(或轉移)載體及腺病毒載體。將所關注之轉殖基因選殖至穿梭載體中、驗證、並且用限制酶PmeI來線性化。然後將此構築體轉型至ADEASIER-1細胞中，其為含有PADEASY™之BJ5183大腸桿菌細胞。PADEASY™為含有病毒產生必不可少的腺病毒基因之∼33Kb腺病毒質體。穿梭載體及腺病毒質體具有匹配左及右同源性臂，促進轉殖基因在腺病毒質體中之同源重組。亦可用超螺旋PADEASY™及穿梭載體來共轉型標準BJ5183，但是此方法產生非重組腺病毒質體之更高背景。然後，將重組腺病毒質體針對大小及適當限制消化模式來驗證，以便確定轉殖基因插入腺病毒質體中，並且其他重組模式未發生。一旦驗證，重組質體用PacI線性化以便產生側接有ITR之線性dsDNA構築體。將293或911細胞用線性化構築體來轉染，並且可在約7-10天後收穫病毒。除了此方法以外，在提交本申請案時在此項技術中已知的產生腺病毒載體構築體之其他方法可用於實踐本文揭示之方法。

在一些態樣中，病毒載體為反轉錄病毒載體， 例如，慢病毒載體( 例如，第三或第四代慢病毒載體)。術語「慢病毒」係指反轉錄病毒科之屬類。慢病毒由於能夠傳染非分裂細胞而在反轉錄病毒之中為獨特的；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其為基因遞送載體之最有效方法之一。HIV、SIV，及FIV均為慢病毒之實例。術語「慢病毒載體」係指衍生自慢病毒基因組之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)所提供的自身失活慢病毒載體。可用於臨床中之慢病毒載體之其他實例包括但不限於例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX™載體系統及其類似載體。非臨床類型之慢病毒載體亦可利用並且為熟習此項技術者已知的。

慢病毒載體通常在暫態轉染系統中產生，其中細胞株用三個單獨質體表現系統轉染。此等包括轉移載體質體(HIV前病毒之部分)、包裝質體或構築體，及具有不同病毒之異源囊膜基因( env)的質體。將載體之三個質體組分置於包裝細胞中，然後插入HIV殼中。載體之病毒部分含有插入序列以使得病毒不能在細胞系統內部複製。當前第三代慢病毒載體僅編碼九種HIV-1蛋白(Gag、Pol、Rev)中之三種，其自單獨質體中表現，避免重組介導的可複製病毒之產生。在第四代慢病毒載體中，反轉錄病毒基因組進一步減少(參見， 例如，TAKARA® LENTI-X™第四代包裝系統)。

在一些態樣中，本揭示案包含有包含多核苷酸序列之慢病毒載體，該序列編碼：(i)包含SEQ ID NO：52之R12 scFv；(ii)c-Jun多肽；(iii)截短EGF受體(EGFRt)。

在一些態樣中，本揭示案包含有包含多核苷酸序列之載體(例如，慢病毒載體)，該序列編碼：(i)包含SEQ ID NO：52之R12 scFv；(ii)c-Jun多肽；(iii)截短EGF受體(EGFRt)；(iv)跨膜域；(v)細胞內信號轉導域；(vi)細胞內共刺激信號轉導區域。在一些態樣中，載體(例如，慢病毒載體)包含特異性結合至ROR1之抗體或其抗原結合部分與TM域之間的間隔基。在一些態樣中，載體(例如，慢病毒載體)包含間隔基，其進一步包含連接子。在一些態樣中，載體(例如，慢病毒載體)包含編碼c-Jun多肽與CAR肽之間之連接子的多核苷酸序列。在一些態樣中，載體(例如，慢病毒載體)包含編碼CAR肽與EGFRt肽之間之連接子的多核苷酸序列。因此，在某些態樣中，本文所述載體包含多核苷酸，其包含(自5'至3') (i)編碼c-Jun多肽之第一核苷酸序列，(ii)編碼第一連接子( 例如，P2A連接子)之第二核苷酸序列，(iii)編碼信號肽( 例如，hIgκ)之第三核苷酸序列，(iv)編碼抗原結合域( 例如，抗ROR1 scFv)之第四核苷酸序列，(v)編碼第二連接子( 例如，GGGSG；SEQ ID NO：16)之第五核苷酸序列，(vi)編碼間隔基( 例如，IgG2鉸鏈衍生間隔基)之第六核苷酸序列，(vii)編碼跨膜域( 例如，CD28)之第七核苷酸序列，(viii)編碼共刺激域( 例如，4-1BB)之第八核苷酸序列，(ix)編碼細胞內信號轉導域( 例如，CD3ζ)之第九核苷酸序列，(x)編碼第三連接子( 例如，P2A連接子)之第十核苷酸序列，(xi)編碼信號肽(例如，GMCSFRαSP)之第十一核苷酸序列，及(xii)編碼EGFRt之第十二核苷酸序列。

在一些態樣中，非病毒方法可用於將包含編碼本揭示案之CAR及其他多肽之多核苷酸的核酸遞送至受試者之細胞或組織。在一些態樣中，非病毒方法包括使用轉位子。在一些態樣中，使用非病毒遞送方法允許將細胞， 例如，T或NK細胞重新編程，及將細胞直接輸注至受試者中。在一些態樣中，藉由使用CRISPR/Cas系統及基因組型式替代物諸如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)，及兆鹼基大範圍核酸酶(MN)，包含本揭示案之多核苷酸的核酸序列可插入靶細胞( 例如，T細胞)或宿主細胞( 例如，用於重組表現CAR多肽之細胞)的基因組中。

在一些態樣中，藉由使用雙順反子或多順反子表現載體，本揭示案之構築體(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)可在細胞中表現。在一些態樣中，雙順反子或多順反子載體包括但不限於，(1)融合至多個開放閱讀框之多個啟動子；(2)將剪接信號插入開放閱讀框之間；其表現受單一啟動子驅動的蛋白融合物；(3)在藉由構築體來表現之蛋白之間插入蛋白水解位點(自身裂解肽，例如，P2A)；及(iv)插入內部核糖體進入位點(IRES)。

在一些態樣中，本文中之構築體之多個蛋白單元在單一開放閱讀框(ORF)中表現，由此產生具有多個蛋白單元之單一多肽，其中至少一個單元為CAR並且一個單元為本揭示案之c-Jun多肽。在一些態樣中，含有高效率裂解位點之胺基酸序列或連接子安置在藉由本文所述表現構築體來表現之各蛋白之間。如本文所用，高裂解效率定義為大於50%、大於70%、大於80%，或大於90%之轉譯蛋白經裂解。裂解效率可藉由西方墨點分析來量測。

高效率裂解位點之非限制性實例包括豬鐵士古病毒-1 2A(P2A)、FMDV 2A(在本文中縮寫為F2A)；馬鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)；及明脈扁刺蛾病毒2A(T2A)、細胞質多角體病病毒2A(BmCPV2A)及軟化病病毒2A(BmIFV2A)，或其組合。在一些態樣中，高效率裂解位點為P2A。高效率裂解位點在Kim等人(2011) High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice. PLoS ONE 6(4): el8556中描述，其內容以引用方式併入本文。

在一些態樣中，P2A包含或由衍生自豬鐵士古病毒-1之自身裂解肽序列(登錄#QKV27547.1，胺基酸#1-22(SEQ ID NO：56))組成。在一些態樣中，P2A序列經密碼子最佳化及密碼子歧化以便防止重組。在一些態樣中，P2A序列安置在本文揭示之多核苷酸之c-Jun及抗ROR1 CAR部分之後(例如，C端)。在一些態樣中，P2A在多肽水準下裂解。

在一些態樣中，多個蛋白在單一開放閱讀框(ORF)中表現，並且在強啟動子控制下表現。在一些態樣中，啟動子包括骨髓增生性肉瘤病毒增強子、負控制區域缺失，dl587rev引子結合位點取代(MND)啟動子、EF1a啟動子、泛素啟動子。

在一些態樣中，本揭示案之載體進一步包含附加基因。在一些態樣中，附加基因為非免疫原性選擇工具、追蹤標誌物，或自殺基因。在一些態樣中，附加基因為截短EGFR基因(EGFRt)。可根據本文所述態樣來使用之截短EGFR (EGFRt)基因之實例包括SEQ ID NO：3。 多核苷酸修飾

在一些態樣中，編碼本揭示案之蛋白(例如，c-Jun、抗ROR1 CAR，及/或EGFRt)之多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)可包含至少一個化學修飾核鹼基、糖、主鏈，或其任何組合。因此，編碼本揭示案之蛋白的多核苷酸可包含一或多個修飾。在一些態樣中，編碼本揭示案之CAR、c-Jun及/或EGFRt的多核苷酸包含至少一個核苷酸類似物。在一些態樣中，藉由使用IVT(活體外轉錄)或化學合成來引入之至少一個核苷酸類似物選自由以下組成之群：2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE-RNA)單體、2'-氟-DNA單體、2'-O-烷基-RNA單體、2'-胺基-DNA單體、鎖核酸(LNA)單體、cEt單體、cMOE單體、5'-Me-LNA單體、2'-(3-羥基)丙基-RNA單體、阿拉伯核酸(ANA)單體、2'-氟-ANA單體、失水己糖醇核酸(HNA)單體、嵌入核酸(INA)單體，及該等核苷酸類似物中之兩個或兩個以上的組合。在一些態樣中，最佳化核酸分子包含至少一個主鏈修飾，例如，硫代磷酸酯核苷酸間鍵。

在一些態樣中，編碼本揭示案之蛋白( 例如，抗ROR1、c-Jun，及/或EGFRt)的多核苷酸可在末端位置處，例如，藉由在相對於5’及/或3’端之位置1、2、3處引入M(2′-O-甲基)、MS(2′-O-甲基3′硫代磷酸酯)，或MSP(2′-O-甲基3’硫代PACE，膦醯基乙酸酯)修飾，或其組合來化學修飾。

編碼本揭示案之c-Jun，CAR及/或EGFRt蛋白的修飾多核苷酸(亦即，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)不一定沿著分子之整個長度均勻地修飾。不同核苷酸修飾及/或主鏈結構可存在於核酸中之各個位置處。一般技藝人士認識到核苷酸類似物或其他修飾可位於核酸之任何位置處以使得核酸之功能大致上不降低。修飾亦可為5'或3'端修飾。核酸可含有最小一個及最大100%修飾核苷酸，或任何介入百分比，諸如至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或至少約99%修飾核苷酸。

在一些態樣中，編碼本揭示案之CAR、c-Jun及/或EGFRt的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)可包括修飾來防止藉由內核酸酶及核酸外切酶之快速降解。修飾包括但不限於例如(a)末端修飾， 例如，5'端修飾(磷酸化去磷酸化、偶聯、反向鍵等)，3'端修飾(偶聯、DNA核苷酸、反向鍵等)，(b)鹼基修飾， 例如，置換成經修飾之鹼基、穩定化鹼基、去穩定化鹼基，或與擴大的搭配物譜系鹼基配對的鹼基，或偶聯鹼基，(c)糖修飾( 例如，在2'位置或4'位置處)或糖之置換，以及(d)核苷間鍵修飾，包括磷酸二酯鍵之修飾或置換。

適用於本文描述之方法的本揭示案之合成、修飾多核苷酸(亦即，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)的特定實例包括但不限於含有修飾或非天然核苷酸間鍵之多核苷酸。具有修飾核苷酸間鍵之合成、修飾多核苷酸尤其包括在核苷間鍵中不具有磷原子的多核苷酸。在一些態樣中，合成、修飾多核苷酸在其核苷間鍵中具有磷原子。

修飾核苷酸間鍵之非限制性實例包括具有正規3'-5'鍵之硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯包括3'-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯、次膦酸酯、胺基磷酸酯包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷醯酯、硫代胺基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯，及硼酸磷酸酯，此等鍵之T-5'鍵聯類似物，及具有反向極性之彼等鍵，其中相鄰成對之核苷單元呈3'-5'至5'-3'或T-5'至5'-T連接。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。

其中不包含磷原子之修飾核苷酸間鍵具有由短鏈烷基來形成之核苷酸間鍵或環烷基核苷酸間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基核苷酸間鍵，或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷酸間鍵。此等鍵包括具有以下各者的鍵：嗎啉基鍵(部分地由核苷之糖部分來形成)；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸及碸主鏈；甲乙醯及硫代甲乙醯主鏈；亞甲基甲乙醯及硫代甲乙醯主鏈；含有烯烴之主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及具有混合N、O、S及CH ₂組成部分之其他鍵。

在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)可藉由引入一或多個同義密碼子變化來密碼子最佳化。如本文所用，術語「密碼子最佳化」、「密碼子經最佳化」及其語法變異體係指藉由置換同義密碼子來修飾核酸之一級序列以便增加其轉譯效率。因此，密碼子最佳化包含轉換用於多核苷酸中之密碼子而不改變其編碼之胺基酸序列，通常極大地增加密碼子最佳化基因所編碼的蛋白之豐度，因為其通常移除「罕見」密碼子並且將其用豐富密碼子來置換，或移除具有較低tRNA補給速率之密碼子與具有較高tRNA補給速率之密碼子。此密碼子最佳化可，例如，(i)改良重組蛋白表現中之蛋白產率，或(ii)改良編碼本文揭示之結合分子之mRNA或DNA之穩定性、半衰期，或其他合意性質，其中將此mRNA或DNA投與有需要之受試者。

本揭示案之多核苷酸之編碼序列(例如，c-Jun、抗ROR1 CAR或EGFRt)中之一或多者可使用在提交本申請案時在此項技術中已知的任何方法來密碼子最佳化。

在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸( 例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)經序列最佳化。如本文所用，術語「序列最佳化」係指修飾核酸之序列以便引入增加其轉譯效率之特徵，移除減少其轉譯效率之特徵，或通常改良與 活體內投與之後的表現功效相關之性質。此類性質包括但不限於改良核酸穩定性( 例如，mRNA穩定性)、增加目標組織中之轉譯功效、減少所表現截短蛋白之數目、改良所表現蛋白之折疊或防止錯誤折疊、減少表現產物之毒性、減少由表現產物導致的細胞死亡，或增加及/或降低蛋白聚集。

本揭示案涵蓋整個構築體之修飾 例如，CAR、c-Jun、EGFRt構築體之各個域之一或多個胺基酸序列之修飾以便產生在功能上等效分子。構築體可經修飾以便保持本文揭示之起始表現構築體(諸如SEQ ID NO：58提供之構築體)的至少約70%、至少約71%、至少約72%、至少約73%、至少約74%、至少約75%、至少約76%、至少約77%、至少約78%、至少約79%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%，或至少約99%一致性。本揭示案亦涵蓋構築體之特定區域之修飾，該等修飾例如導致CAR，或c-Jun域或EGFRt構築體之一或多個CDR之一或多個胺基酸序列的修飾，從而產生在功能上等效分子。細胞

本揭示案亦提供包含本揭示案之多核苷酸構築體(亦即，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)的遺傳修飾細胞。在一些態樣中，c-Jun、抗ROR1 CAR，及EGFRt藉由經遺傳修飾以便表現該構築體之細胞來重組表現，其中細胞包含編碼本揭示案之c-Jun、CAR或EGFRt之多核苷酸序列或載體中之一或多者。

在一些態樣中，本文揭示之遺傳修飾細胞用編碼本揭示案之蛋白組分(例如，抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt)的多核苷酸或載體來轉染。術語「轉染」(或等效術語「轉型」及「轉導」)係指將外源核酸， 例如，編碼本揭示案之蛋白( 例如，抗ROR1、c-Jun，及/或EGFRt)之多核苷酸或載體轉移或引入宿主細胞， 例如，T細胞之基因組中的過程。「轉染」細胞為用外源核酸， 例如，編碼本揭示案之蛋白之多核苷酸或載體來轉染、轉型或轉導之細胞。該細胞包括原代標的細胞及其子代。

在一些態樣中，本文所述細胞用轉錄活化劑修飾，該活化劑能夠誘導及/或增加所關注蛋白質( 例如，c-Jun)在細胞中之內源性表現。如本文所用，術語「轉錄活化劑」係指增加基因或一組基因之轉錄的蛋白( 例如，藉由結合至核酸序列之增強子或啟動子近端元件並且由此誘導其轉錄)。可用於本揭示案之此類轉錄活化劑之非限制性實例包括：基於轉錄活化劑樣效應物(TALE)之轉錄活化劑、基於鋅指蛋白(ZFP)之轉錄活化劑、基於規律間隔重複短迴文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關蛋白(Cas)系統之轉錄活化劑，或其組合。 參見，例如，Kabadi 等人， Methods69(2): 188-197 (Sep. 2014)，其以全文引用方式併入本文。

在一些態樣中，本文所述細胞用基於CRISPR/Cas系統之轉錄活化劑，諸如CRISPR活化(CRISPRa)來修飾。 參見，例如，Nissim 等人， Molecular Cell54: 1-13 (May 2014)，其以全文引用方式併入本文。CRISPRa為一種類型的CRISPR工具，其包括使用缺少內核酸酶活性但是保持結合至其嚮導RNA及標靶DNA核酸序列之能力的經修飾Cas蛋白。可用於本揭示案之此等修飾Cas蛋白之非限制性實例在此項技術中為已知的。 參見，例如，Pandelakis 等人， Cell Systems10(1): 1-14 (Jan. 2020)，其以全文引用方式併入本文。在一些態樣中，修飾Cas蛋白包含修飾Cas9蛋白(在此項技術中亦被稱為「dCas9」)。在一些態樣中，修飾Cas蛋白包含修飾Cas12a蛋白。在一些態樣中，適用於本揭示案之修飾Cas蛋白結合至嚮導多核苷酸( 例如，小嚮導RNA)(「修飾Cas-嚮導複合物」)，其中嚮導多核苷酸包含與編碼所關注蛋白質( 例如，c-Jun)之核酸序列之區域互補的識別序列。在一些態樣中，嚮導多核苷酸包含與編碼所關注蛋白質之內源性核酸序列之啟動子區域互補的識別序列。在一些態樣中，一或多種轉錄活化劑附接至修飾Cas-嚮導複合物( 例如，修飾Cas蛋白之N及/或C端)，以使得當將修飾Cas-嚮導複合物引入細胞中時，一或多種轉錄活化劑可結合至核酸序列之調節元件( 例如，啟動子區域)，並且由此誘導及/或增加所編碼蛋白( 例如，c-Jun)之表現。在一些態樣中，一或多種轉錄活化劑可結合至內源性基因之調節元件( 例如，啟動子區域)，並且由此誘導及/或增加所編碼蛋白( 例如，c-Jun)之表現。可使用的常見一般活化劑之非限制性示例性實例包括RNAP、VP16、VP64及p65之Ω次單元。 參見，例如，Kabadi及Gersbach， Methods69: 188-197 (2014)，其以全文引用方式併入本文。

在一些態樣中，一或多種轉錄抑制劑( 例如，Kruppel相關盒域(KRAB))可附接至修飾Cas-嚮導複合物( 例如，修飾Cas蛋白之N及/或C端)，以使得在引入細胞中時，一或多種轉錄抑制劑可抑制或減少基因之轉錄，例如，諸如可干擾c-Jun之表現之彼等( 例如，Bach2)。 參見，例如，US20200030379A1及Yang 等人， J Transl Med19:459 (2021)，其各自以全文引用方式併入本文。在一些態樣中，適用於本揭示案之修飾Cas蛋白可附接至一或多種轉錄活化劑及一或多種轉錄抑制劑。

不受任何一種理論束縛，在一些態樣中，此類修飾Cas蛋白之使用可允許所關注基因之條件性轉錄及表現。例如，在一些態樣中，細胞( 例如，T細胞)經修飾以便包含配位體結合蛋白( 例如，抗ROR1 CAR)，其連接至蛋白酶( 例如，菸草蝕刻病毒(TEV))及靶向c-Jun之啟動子區域的單一嚮導RNA(sgRNA)。在一些態樣中，細胞經修飾以便進一步包含T細胞活化銜接因子(LAT)，其經由連接子( 例如，TEV-可裂解連接子)來複合至附接至轉錄活化劑之經修飾Cas蛋白( 例如，dCas9-VP64-p65-Rta轉錄活化劑(VPR))。在配位體結合蛋白活化後，修飾Cas蛋白經釋放以便細胞核定位並且有條件地及可逆誘導c-Jun之表現。Yang 等人， J Immunother Cancer9(增刊2): A164 (2021)，其以全文引用方式併入本文。

如熟習此項技術者顯而易知，在一些態樣中，本文所述細胞使用多個方法之組合來修飾。例如，在一些態樣中，細胞用外源本文所述多核苷酸( 例如，編碼c-Jun蛋白、ROR1結合蛋白，及EGFRt)來修飾。在一些態樣中，此細胞進一步用能夠增加內源性c-Jun蛋白之表現的外源性轉錄活化劑( 例如，CRISPRa)來修飾。不受任何一種理論束縛，在一些態樣中，此組合方法可允許免疫細胞具有甚至更大水準之c-Jun蛋白表現( 例如，藉由外源核苷酸序列來編碼並且藉由免疫細胞來內源性地表現)。

如本揭示案顯而易知，本文所述免疫細胞展現與參考細胞( 例如，存在於天然界中之對應細胞)相比，極好的一或多個性質。例如，在一些態樣中，與參考細胞相比，本文提供之免疫細胞。

除非另外指示，一或多個外源核苷酸序列及/或轉錄活化劑可使用在此項技術中已知之任何合適方法來引入細胞中。將一或多個外源核苷酸序列遞送至細胞之合適方法之非限制性實例包括：轉染(亦稱為轉型及轉導)、電穿孔、非病毒遞送、病毒轉導、脂質奈米粒子遞送，及其組合。

在一些態樣中，細胞( 例如，T細胞)用本揭示案之載體， 例如，腺相關病毒(AAV)載體或慢病毒載體來轉染。在一些此類態樣中，細胞可穩定地表現本揭示案之蛋白。

在一些態樣中，細胞(例如，T細胞)用編碼本揭示案之蛋白(例如，抗ROR1、c-Jun，及/或EGFRt)的核酸，例如，mRNA、cDNA、DNA來轉染。在此類態樣中，細胞可瞬時表現本揭示案之蛋白。例如，RNA構築體可直接轉染至細胞中。產生用於轉染之mRNA的方法涉及用特別設計引子來活體外轉錄(IVT)模板，隨後添加聚A，以便產生含有3′及5′未轉譯序列(UTR)、5′帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、待表現之核酸，及通常50-2000個鹼基長度之聚A尾的構築體。由此產生之RNA可有效地轉染不同種類之細胞。在一些態樣中，該模板包含CAR、c-Jun、EGFRt，及本揭示案之其他蛋白的序列。在某些態樣中，RNA載體藉由電穿孔來轉導至T細胞中。

在一些態樣中，本文所述蛋白( 例如，CAR多肽及c-Jun多肽)之編碼序列可安置於分開表現構築體上。在一些態樣中，本文所述蛋白( 例如，CAR多肽、c-Jun蛋白，及若存在之EGFRt)之編碼序列可安置於單一表現構築體上。編碼序列可安置於構築體上之一或多個表現盒中，各盒為其自身的轉錄單元(例如，具有其自身啟動子及聚腺苷酸化位點及其他轉錄控制元件)。在某些態樣中，三個編碼序列( 例如，分別編碼CAR、c-Jun，及EGFRt)可安置於單一表現盒(例如，三順反子表現盒)上，其中三個編碼序列在共有啟動子下轉錄。

在一些態樣中，細胞為免疫效應細胞。如本文所用，術語「免疫效應細胞」係指涉及免疫反應， 例如，促進免疫效應物反應的細胞。「免疫效應物功能」或「免疫效應物反應」係指例如免疫效應細胞的增強或促進靶細胞之免疫攻擊的功能或反應。 例如，免疫效應物功能或反應係指促進靶細胞之殺滅或抑制其生長或增殖的T或NK細胞之性質。在T細胞的情況下，一級刺激及共刺激為免疫效應物功能或反應之實例。

術語「效應物功能」係指細胞之特殊功能。例如T細胞之效應物功能可為細胞溶解活性及輔助活性，包括分泌細胞介素。CAR之細胞內信號轉導域可產生促進含有CAR之細胞， 例如，CAR T細胞之免疫效應物功能的信號。 例如，CAR T細胞中之免疫效應物功能之實例包括細胞溶解活性及輔助活性，包括分泌細胞介素。在一些態樣中，細胞內信號域為轉導效應物功能信號並且嚮導細胞執行特殊功能的CAR之部分。雖然可使用整個細胞內信號轉導域，但是在許多情況下不需要使用整個鏈。就使用細胞內信號轉導域之截短部分而言，此截短部分可代替完整鏈來使用，只要其轉導效應物功能信號。因此，術語細胞內信號轉導域意欲包括足以轉導效應物功能信號的細胞內信號轉導域之任何截短部分。

在一些態樣中，細胞內信號轉導域可包含一級細胞內信號轉導域。示例性一級細胞內信號轉導域包括衍生自導致一級刺激，或抗原依賴性刺激之分子的域。在一些態樣中，細胞內信號轉導域可包含共刺激細胞內域。示例性共刺激細胞內信號轉導域包括衍生自導致共刺激信號，或不依賴於抗原之刺激之分子的域。例如，在CAR T細胞的情況下，一級細胞內信號轉導域可包含T細胞受體之細胞質序列，並且共刺激細胞內信號轉導域可包含來自輔受體或共刺激分子之細胞質序列。

一級細胞內信號轉導域可包含被稱為基於免疫受體酪胺酸之活化模體或ITAM的信號轉導模體。含有ITAM之一級細胞質信號轉導序列之實例包括但不限於衍生自CD3 ζ、FcR γ、共同FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε Rib)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (「ICOS」)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10及DAP12之序列。

免疫效應細胞之實例包括， 例如，T細胞， 例如，α/βT細胞及γ/ΔT細胞、B細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、肥胖細胞，及骨髓性衍生吞噬細胞。先天淋巴樣細胞(ILC)為衍生自共同淋巴祖細胞(CLP)並且屬於淋巴譜系的一組先天免疫細胞。因為缺少重組活化基因(RAG)，此等細胞藉由不存在抗原特異性B或T細胞受體來定義。ILC不表現骨髓性或樹突細胞標誌物。ILC具有不同生理功能；一些功能與輔助T細胞類似的，同時該組亦包括細胞毒性NK細胞。因此，在一些態樣中，經遺傳修飾來表現本揭示案之CAR的細胞為, 例如T細胞、NK細胞、NKT細胞，或ILC細胞。

T細胞可獲自許多來源，包括末梢血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜腔積液、脾臟組織，及腫瘤。

本揭示案之工程化免疫細胞之來源可為待治療之患者(亦即，自體細胞)或來自不為待治療之患者的供體(例如，同種異體細胞)。在一些態樣中，工程化免疫細胞為工程化T細胞。本文中之工程化T細胞可為CD4 ⁺CD8 ^-(亦即，CD4單一陽性)T細胞、CD4 ^-CD8 ⁺(亦即，CD8單一陽性)T細胞，或CD4 ⁺CD8 ⁺(雙重陽性)T細胞。在功能上，T細胞可為細胞毒性T細胞、輔助T細胞、天然殺手T細胞、抑制T細胞，或其混合物。待工程化之T細胞可為自體或同種異體的。

原代免疫細胞，包括原代T細胞，可獲自許多組織來源，包括末梢血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜腔積液、脾臟組織，及/或腫瘤組織。白血球，包括PBMC，可藉由熟知技術例如FICOLL™分離及白血球分離而自其他血球分離。白血球分離產物通常含有淋巴球(包括T及B細胞)、單核球、顆粒球，及其他有核白血球。T細胞進一步自其他白血球分離，例如藉由經由PERCOLL™梯度之離心或逆流離心淘析。T細胞之特定亞群，諸如CD3 ⁺、CD25 ⁺、CD28 ⁺、CD4 ⁺、CD8 ⁺、CD45RA ⁺、GITR ⁺，及CD45RO ⁺T細胞，可藉由正向或負向選擇技術(例如，使用基於螢光或基於磁性之細胞分選)來進一步分離。例如，T細胞可藉由與諸如Dynabeads®、CELLection ^TM、DETACHaBEAD ^TM(Thermo Fisher)或MACS®細胞分離產品(Miltenyi Biotec)之各種商購抗體偶聯珠粒中之任一者一起培養足以正向選擇所需T細胞或負向選擇來移除不當細胞的一段時間期限來分離。

在一些情況下，自體T細胞獲自直接癌症治療之後之癌症患者。觀察到在某些癌症治療，尤其削弱免疫系統的治療之後，治療之後不久收集之T細胞之品質可具有離體擴增及/或在離體工程化之後植入的經改良能力。

不論在遺傳修飾之前或之後，T細胞可通常使用如例如美國專利5,858,358；5,883,223；6,352,694；6,534,055；6,797,514；6,867,041；6,692,964；6,887,466；6,905,680；6,905,681；6,905,874；7,067,318；7,144,575；7,172,869；7,175,843；7,232,566；7,572,631；及10,786,533所描述之方法來活化並擴增，該等專利各自明確全部以引用方式併入本文。總體上，T細胞可藉由與表面接觸來 活體外或離體擴增，該表面具有與其附接的刺激CD3/TCR複合物相關信號之試劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子的配位體。特定言之，T細胞群體可諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段，或固定於表面上之抗CD3抗體接觸，或藉由與鈣離子載體結合在一起的蛋白激酶C活化劑(例如，苔蘚蟲素)接觸來加以刺激。對於T細胞表面上之附加分子之共刺激，可使用結合附加分子之配位體。例如，T細胞群體可在適合於刺激T細胞之增殖的條件下，與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。為了刺激CD4 ⁺T細胞或CD8 ⁺T細胞之增殖，可使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。

細胞培養條件可包括以下中之一或多者：特定培養基、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑例如營養物、胺基酸、抗生素、離子，及/或刺激因子諸如細胞介素、趨化介素、抗原、結合搭配物、融合蛋白、重組可溶性受體，及被設計來活化該等細胞之任何其他試劑。在一些態樣中，培養條件包括添加IL-2、IL-7及/或IL-15。

在一些態樣中，待工程化之細胞可為在工程化之後，分化至成熟T細胞的富潛能或多潛能細胞。此等非T細胞可為同種異體的並且可為例如人類胚胎幹細胞、人類誘導富潛能幹細胞，或造血幹細胞或祖細胞。為了便於描述，富潛能及多潛能細胞在本文中共同地被稱為「祖細胞」。

當使用同種異體細胞，在某些態樣中，其經工程化以便減少移植物抗宿主排斥反應(例如，藉由敲除內源性 B2M及/或 TRAC基因)。 醫藥組合物

本揭示案亦提供適合於投與受試者之醫藥組合物，其包含：本文揭示之組合物， 例如，編碼本揭示案之蛋白(例如，c-Jun、抗ROR1 CAR、EGFRt)的多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1構築體)，包含編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun及EGFRt蛋白之多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)的載體，或包含編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun及EGFRt蛋白之多核苷酸構築體或載體的遺傳修飾細胞。

醫藥組合物通常包含：編碼或包含本揭示案之抗ROR-1 CAR、c-Jun及EGFRt蛋白之多核苷酸、載體，或細胞及呈適合於投與受試者之形式的醫藥學上可接受賦形劑或載劑。醫藥學上可接受之賦形劑或載劑藉由所投與之特定組合物，以及藉由用於投與組合物之特定方法來部分地確定。

本揭示案提供醫藥組合物，其包含用本文所述表現構築體(例如，本文所述c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)來修飾之工程化T細胞。醫藥組合物可包含適合於在引入患者之前保持細胞之健康狀況的醫藥學上可接受之載劑。

在一些態樣中，工程化細胞可自培養基中收穫，並且以治療有效量來洗滌並且濃縮至載劑中。示例性載劑包括鹽水、緩衝鹽水(例如，磷酸鹽緩衝鹽水)、生理鹽水、水、漢克斯溶液、林格氏溶液、Nonnosol-R (Abbott Labs)、Plasma-Lyte A(R) (Baxter Laboratories, Inc., Morton Grove, IL)、甘油、乙醇，及其組合。較佳該載劑為等滲的。在一些態樣中，載劑可補充有諸如人類血清白蛋白(HSA)或其他人類血清組分、5%葡萄糖或右旋糖之成分。額外等滲劑包括多元糖醇包括三元或更高糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇，或甘露醇亦可包含在內。

醫藥T細胞組合物可以治療有效量來全身(例如，經由靜脈內或門靜脈注射)或局部(例如，經由腫瘤內注射)投與癌症患者。在一些態樣中，諸如靶向ROR1之組合物用於治療患有已知表現ROR1之腫瘤的患者。在一些態樣中，諸如靶向ROR1之組合物用於治療患有選自以下之癌症的患者：轉移性黑素瘤、非小細胞肺癌、骨髓瘤、食管癌、滑膜肉瘤、胃癌、乳癌、肝細胞癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌，及膀胱癌。如本文所用，術語「治療(treatment/treating)」係指在所治療受試者中獲得有益或所需結果的方法。此等結果包括但不限於：減輕由疾病產生的一或多個症狀、減弱疾病程度(例如，減少腫瘤體積)、穩定疾病(例如，防止或延緩疾病惡化)、防止或延緩疾病擴散(例如，轉移)、防止或延緩疾病再發或復發、改善疾病狀態、提供疾病之好轉(部分或全部)、降低治療疾病所需要之一或多種其他藥物的劑量、改良生活品質、恢復體重，及/或延長存活(例如，總體存活或無進展存活)。

組合物之治療有效量係指足以達成所需臨床端點的工程化T細胞之數目。在一些態樣中，治療有效量含有大於約10 ⁴、大於約10 ⁵、大於約10 ⁶、大於約10 ⁷、大於約10 ⁸，或大於約10 ⁹個工程化細胞。

在一些態樣中，醫藥組合物包含有效治療或預防疾病或病狀之量，諸如治療有效或預防有效量之細胞。在一些態樣中，治療或預防功效藉由定期評定所治療受試者來監測。對於幾天或更長時間內之重複投與，根據病狀，治療將重複直至出現所需疾病症狀抑制。然而，其他劑量方案可為有用的並且可加以確定。所需劑量可藉由組合物之單次推注投與、藉由組合物之多次推注投與，或藉由組合物之連續輸注投與來遞送。

存在包含本揭示案之CAR之醫藥組合物的多種合適調配物(參見， 例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.第18版(1990))。醫藥組合物通常無菌地並且完全符合美國食品藥品管理局之所有良好製造規範(GMP)條例來配製。

在某些態樣中，醫藥組合物在醫藥學上可接受之載劑中與一或多種額外治療劑一起共同投與。在一些態樣中，包含本文所述多核苷酸( 例如，編碼抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt)之醫藥組合物在投與額外治療劑之前投與。在某些態樣中，包含本揭示案之多核苷酸( 例如，編碼抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt)的醫藥組合物在投與額外治療劑之後投與。在進一步態樣中，包含本揭示案之多核苷酸( 例如，編碼抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt)的醫藥組合物與額外治療劑同時投與。

可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者( 例如動物或人類)無毒性，且包括：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苄烷銨；氯化本索寧；苯酚、丁醇，或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸，或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖，或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖，或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物( 例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。

載劑或稀釋劑之實例包括但不限於水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液，及5%人類血清白蛋白。此等介質及化合物用於醫藥學上活性物質之用途在此項技術中為熟知的。除非任何習知介質或化合物與本揭示案之組合物( 例如，多核苷酸、載體，或細胞)不相容，否則涵蓋其在組合物中之用途。適應症

在一些態樣中，本文揭示之組合物( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)可用於治療疾病或病狀， 例如，增殖性疾病諸如癌症或惡性腫瘤或癌前期病狀諸如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或早期白血病。

「癌症」係指一組涵蓋較廣的以體內異常細胞之不受控制之生長為特徵的各種增殖疾病。不受調控之細胞分裂及生長導致侵入鄰近組織的惡性腫瘤之形成，並亦可能藉由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部位。如本文所用，術語「增殖」病症或疾病係指一或多個細胞亞群在多細胞生物中之不當細胞增殖，導致對於多細胞生物之損害(亦即，不適或預期壽命減少)。例如，如本文所用，增殖病症或疾病包含腫瘤性病症及其他增殖病症。如本文所用，「贅瘤」係指導致異常組織生長的任何形式之失調或不受調控細胞生長，不論惡性或良性。因此，「贅瘤性細胞」包括具有失調或不受調控細胞生長的惡性及良性細胞。在一些態樣中，癌症為腫瘤。如本文所用，「腫瘤」係指所有贅瘤性細胞生長及增殖，不論惡性或良性，及所有癌前期及癌性細胞及組織。

在一些態樣中，過度表現c-Jun之工程化抗ROR1 CAR T細胞可用於治療ROR1陽性的復發或難治性惡性實體腫瘤。在某些態樣中，待治療之疾病為乳癌，諸如三陰性乳癌，或非小細胞肺癌。在一些態樣中，疾病為實體或液體腫瘤。在一些態樣中，癌症為胰臟癌。在一些態樣中，疾病為血液學癌症。在一些態樣中，血液學癌症為白血病。

在一些態樣中，本文揭示之組合物( 例如，經工程化以便表現編碼本揭示案之c-Jun及CAR之多核苷酸的細胞、包含編碼本揭示案之c-Jun及CAR之多核苷酸的載體、本揭示案之c-Jun及CAR，或表現本揭示案之c-Jun及CAR的細胞，例如，CAR T細胞)用於在有需要之受試者中減少或降低腫瘤大小或抑制腫瘤生長。在一些態樣中，腫瘤為癌瘤(亦即，上皮來源之癌症)。在一些態樣中，腫瘤，例如，選自由以下組成之群：胃癌、胃食管連接部癌(GEJ)、食管癌、結腸直腸癌、肝癌(肝細胞癌，HCC)、卵巢癌、乳癌、NSCLC、膀胱癌、肺癌、胰臟癌、頭頸癌、淋巴瘤、子宮癌、腎臟或腎癌、膽管癌、前列腺癌、睾丸癌、尿道癌、陰莖癌、胸腺癌、直腸癌、腦癌(神經膠質瘤及膠質母細胞瘤)、宮頸癌、腮腺癌、喉癌、甲狀腺癌、腺癌、神經母細胞瘤、黑素瘤，及默克爾細胞癌。

「癌症」或「癌症組織」可包括各個階段之腫瘤。在某些態樣中，癌症或腫瘤為階段0，以使得，例如，癌症或腫瘤處於發育的非常早期並且尚未轉移。在一些態樣中，癌症或腫瘤為階段I，以使得，例如，癌症或腫瘤尺寸相對較小，未擴散至相鄰組織中，並且尚未轉移。在一些態樣中，癌症或腫瘤為階段II或階段III，以使得，例如，癌症或腫瘤大於階段0或階段I，並且其生長至相鄰組織中但是其尚未轉移，除了可能轉移至淋巴結以外。在一些態樣中，癌症或腫瘤為階段IV，以使得，例如，癌症或腫瘤已經轉移。階段IV亦可被稱為晚期或轉移性癌症。

在一些態樣，癌症可以包括但不限於腎上腺皮質癌、晚期癌症、肛門癌、再生障礙性貧血、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨轉移、腦瘤、腦癌、乳癌、兒童期癌症、原發性不明之癌症、Castleman病、宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、Ewing腫瘤家族、眼癌、膽囊癌、胃腸道類癌瘤、胃腸道間質瘤、妊娠滋養細胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、腎細胞癌、喉及下嚥癌、急性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓單核球白血病、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺類癌瘤、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、陰莖癌、垂體瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、成人軟組織肉瘤、基底及鱗狀細胞皮膚癌、黑色素瘤、小腸癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、威爾姆氏瘤及癌症治療引起之繼發性癌症。

在一些態樣中，腫瘤為實體腫瘤。「實體腫瘤」包括但不限於肉瘤、黑素瘤、癌瘤，或其他實體腫瘤癌。「肉瘤」係指由類似於胚胎結締組織之物質組成並且通常由嵌入纖絲狀或均勻物質中之緊密填充細胞組成的腫瘤。肉瘤包括但不限於軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、肺泡軟組織肉瘤、釉質母細胞肉瘤、葡萄狀肉瘤、綠色肉瘤、絨毛膜癌、胚胎肉瘤、威爾姆氏腫瘤肉瘤、子宮內膜肉瘤、間質肉瘤、尤文肉瘤、筋膜肉瘤、纖維母細胞肉瘤、巨細胞肉瘤、顆粒球性肉瘤、霍奇金肉瘤、特發性多發性色素性出血性肉瘤、B細胞免疫母細胞肉瘤、淋巴瘤、T細胞免疫母細胞肉瘤、Jensen肉瘤、Kaposi肉瘤、Kupffer細胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間充質肉瘤、骨旁肉瘤、網狀細胞肉瘤、勞斯肉瘤、漿囊性肉瘤、滑膜肉瘤或毛細管擴張性肉瘤。

術語「黑素瘤」係指由皮膚及其他器官之黑素細胞系統產生的腫瘤。黑素瘤包括例如肢端小痣性黑素瘤、無黑素黑素瘤、良性幼年黑素瘤、Cloudman黑素瘤、S91黑素瘤、Harding-Passey黑素瘤、幼年黑素瘤、惡性雀斑樣黑色素瘤、惡性黑素瘤、轉移性黑素瘤、結節性黑素瘤、甲下黑素瘤或淺表擴散性黑素瘤。

術語「癌瘤」係指傾向於浸潤周圍組織並且引起轉移的由上皮細胞組成之惡性新生物。示例性癌包括例如腺泡癌、腺泡狀癌、腺囊性癌、腺樣囊性癌、腺瘤性癌、腎上腺皮質癌、肺泡癌、肺泡細胞癌、基底細胞癌、基底樣細胞癌、基底樣癌、基底鱗狀細胞癌、支氣管肺泡癌、細支氣管癌、支氣管癌、腦樣癌、膽管細胞癌、絨毛膜癌、膠樣癌、粉刺癌、子宮體癌、篩狀癌、鎧甲狀癌、皮膚癌、圓柱形癌、圓柱形細胞癌、導管癌、硬膜癌、胚胎癌、腦樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮癌、外生性癌、潰瘍性癌、纖維癌、明膠狀癌、膠狀癌、巨細胞癌、巨細胞癌、腺癌、顆粒細胞癌、毛基質癌、血樣癌、肝細胞癌、Hurthle細胞癌、透明細胞癌、腎上腺樣癌、嬰兒胚胎癌、原位癌、表皮內癌、上皮內癌、Krompecher癌、Kulchitzky細胞癌、大細胞癌、豆狀癌、豆狀細胞癌、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓樣癌、髓質癌、黑色素癌、痣癌、黏液素癌、黏液癌、黏細胞癌、黏液表皮樣癌、黏液性癌、黏液癌、黏液瘤樣癌、鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化癌、類骨質癌、乳頭狀癌、門靜脈周圍癌、浸潤前癌、刺細胞癌、漿狀癌、腎細胞癌、儲備細胞癌、肉瘤癌、施耐德癌、硬癌、陰囊癌、印戒細胞癌、單純癌、小細胞癌、茄類癌、球形細胞癌、梭形細胞癌、海綿狀細胞癌、鱗狀癌、鱗狀細胞癌、串狀癌、毛細血管擴張癌、毛細血管瘤、移行細胞癌、結節性皮癌、結節癌、疣狀癌或絨毛狀癌。

可用本文揭示之組合物(例如，經工程化以便表現編碼本揭示案之c-Jun及CAR之多核苷酸的細胞、包含編碼本揭示案之c-Jun及CAR之多核苷酸的載體、本揭示案之c-Jun及CAR，或表現本揭示案之c-Jun及CAR的細胞，例如，CAR T細胞)治療之額外癌症包括例如白血病、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、小細胞肺腫瘤、原發性腦腫瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰島素瘤、惡性類癌、膀胱癌、癌前皮膚病變、睾丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、神經母細胞瘤、神經內分泌癌、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血症、宮頸癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、前列腺癌、苗勒管癌、卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌或子宮乳頭狀漿液性癌。方法

本揭示案亦提供使用本文所述組合物( 例如，編碼c-Jun及抗ROR1 CAR之多核苷酸；包含多核苷酸之載體；或用載體來轉導之細胞，諸如如本文所述過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)中之一或多者用於接受性療法的方法。雖然以下提供之揭示內容主要涉及投與細胞( 例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)，熟習此項技術者顯而易知所描述方法可達成向受試者投與本文所述的任何其他組合物( 例如，編碼c-Jun及抗ROR1 CAR之多核苷酸或包含多核苷酸之載體)。

在一些態樣中，本揭示案提供刺激受試者之T細胞介導的對於靶細胞群體或組織之免疫反應的方法，包括向受試者投與有效量的表現抗ROR1 CAR並且過度表現本揭示案之c-Jun多肽的細胞。亦提供在有需要之受試者中提供抗腫瘤免疫力的方法，該方法包括向受試者投與有效量的表現抗ROR1 CAR並且過度表現本揭示案之c-Jun多肽之細胞給受試者。

本揭示案亦提供一種治療有需要之受試者中之癌症的方法，其包括向受試者投與有效量的表現抗ROR1 CAR並且過度表現本揭示案之c-Jun多肽的細胞。在一些態樣中，治療癌症之方法包括向有需要之受試者投與免疫細胞，其過度表現c-Jun多肽並且包含嵌合抗原受體(CAR)及截短EGF受體(EGFRt)，其中CAR對於在腫瘤中表現之抗原具有特異性。此免疫細胞之非限制性實例在整個本揭示案中描述。如本揭示案顯而易知，此等方法可適用於治療與ROR1表現相關之任何癌症。此等癌症之非限制性實例在本揭示案中別處提供。

如在本文中證明，在一些態樣中，向受試者投與本文所述經修飾之免疫細胞( 例如，過度表現c-Jun多肽並且包含CAR( 例如，抗ROR1 CAR)及EGFRt)可減少或減輕癌症之一或多個症狀或態樣。例如，在一些態樣中，與參照腫瘤大小相比，投與本文所述經修飾之免疫細胞可導致腫瘤大小降低。在一些態樣中，參照腫瘤大小包括：(i)投與之前的腫瘤大小，(ii)未接受投與( 例如，接受不過度表現c-Jun多肽之對應免疫細胞之投與)的對應受試者中之腫瘤大小，或(iii)同時(i)及(ii)。在一些態樣中，與參照腫瘤大小相比，投與本文提供之經修飾之免疫細胞可減少受試者中之腫瘤之大小至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。

在一些態樣中，投與本文所述經修飾之免疫細胞可改良受試者之存活持續時間。在一些態樣中，與參照存活持續時間相比，存活持續時間增加至少約一週、至少約兩週、至少約三週、至少約一個月、至少約兩個月、至少約三個月、至少約四個月、至少約五個月、至少約六個月、至少約七個月、至少約八個月、至少約九個月、至少約10個月、至少約11個月，或至少約一年。在一些態樣中，參照存活持續時間包含未接受投與( 例如，接受不過度表現c-Jun多肽之對應免疫細胞之投與)的對應受試者之存活持續時間。

如在本揭示案中別處進一步描述，在一些態樣中，與參考細胞( 例如，未經修飾以便過度表現c-Jun之對應細胞)相比，本文所述經修飾之免疫細胞展現殺滅腫瘤細胞之改良能力。因此，在一些態樣中，本文提供殺滅腫瘤細胞之方法，包括使腫瘤細胞與免疫細胞接觸，該等細胞過度表現c-Jun多肽並且包含嵌合抗原受體(CAR)及截短EGF受體(EGFRt)，其中CAR對於在腫瘤細胞中表現之抗原具有特異性。此等免疫細胞之非限制性實例在整個本揭示案中提供。在一些態樣中，與參考細胞( 例如，如本文所述未經修飾之對應細胞)相比，腫瘤細胞之殺滅增加至少約0.5倍、1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。

如本揭示案顯而易知，與參考細胞( 例如，未經修飾以便過度表現c-Jun之對應細胞)相比，本揭示案之修飾免疫細胞展現各種極好性質。例如，在一些態樣中，在用抗原刺激時，本文所述修飾細胞能夠生產增加量之細胞介素( 例如，IFN-γ、IL-2，或兩者)。因此，在一些態樣中，本文提供增加響應於抗原刺激之藉由免疫細胞之細胞介素之產生的方法，包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準。在一些態樣中，ROR-1結合蛋白特異性地結合至與R12抗體相同之抗原決定基。在一些態樣中，與對應免疫細胞相比，響應於抗原刺激的細胞介素之產生增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。在一些態樣中，細胞介素之產生增加至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%，或至少約100%或更大。

在一些態樣中，與參考細胞( 例如，未經修飾以便過度表現c-Jun之)對應免疫細胞相比，本文所述經修飾之免疫細胞展現響應於抗原刺激之增加增殖。因此，本文亦提供增加響應於抗原刺激之免疫細胞增殖的方法，包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準。在一些態樣中，ROR-1結合蛋白特異性地結合至與R12抗體相同之抗原決定基。在一些態樣中，與對應免疫細胞相比，在修飾之後，響應於抗原刺激之免疫細胞之增殖增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。在一些態樣中，增殖增加至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%，或至少約100%或更大。

如本揭示案顯而易知，本文提供的方法亦可用於增加響應於持續抗原刺激之免疫反應之一或多個效應物功能。可改良之效應物功能之非限制性實例包括以下能力：(i)殺滅腫瘤細胞(ii)在進一步抗原刺激後產生細胞介素，或(iii)同時(i)及(ii)。在一些態樣中，此方法包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準。在一些態樣中，ROR-1結合蛋白特異性地結合至與R12抗體相同之抗原決定基。

在一些態樣中，如與對應免疫細胞相比，修飾之後，免疫細胞保持效應物功能達抗原刺激檢定之至少一個、至少兩個，或至少三個額外循環。

在一些態樣中，與對應免疫細胞相比，在修飾之後，免疫細胞之效應物功能增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。在一些態樣中，效應物功能增加至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%，或至少約100%或更大。

在一些態樣中，本文提供之方法亦可用於減少或防止持續抗原刺激之後的免疫細胞( 例如，T細胞)之耗竭。在一些態樣中，此方法包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準。在一些態樣中，ROR-1結合蛋白特異性地結合至與R12抗體相同之抗原決定基。

在一些態樣中，如與對應免疫細胞相比，修飾之後，響應於持續抗原刺激，免疫細胞表現：(i)與耗竭相關之基因之降低水準，(ii)與活化相關之基因之增加水準，或(iii)同時(i)及(ii)。此等基因之非限制性實例在本揭示案中別處描述。

本揭示案亦提供製備用於療法的細胞，例如過度表現c-Jun多肽之抗ROR1 CAR T細胞之群體的方法，包括將自受試者分離之細胞群體用本揭示案之多核苷酸或載體來轉導。在一些態樣中，轉導包括將細胞在合適條件下培養。

本揭示案亦提供在經診斷患有癌症之受試者中產生基因工程改造化細胞之持續群體的方法，該方法包括向受試者投與經基因工程改造化以便表現抗ROR1 CAR並且過度表現本揭示案之c-Jun多肽的細胞。不受任何一種理論束縛，如在本揭示案中別處描述，c-Jun之過度表現可有助於減少或防止耗竭，以使得與參考細胞( 例如，未經修飾以便過度表現c-Jun之對應細胞)相比，當將本揭示案之經修飾之免疫細胞投與受試者時，其能夠在受試者中持續更長時間。在一些態樣中，當投與受試者時，本揭示案之經修飾之免疫細胞能夠在受試者中持續比對應免疫細胞長至少約1週、至少約2週、至少約三週、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月，或至少約1年或更長。因此，在一些態樣中，與投與參照受試者之對應免疫細胞相比，投與之後約1個月存在於受試者中之經修飾之免疫細胞之數目大至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍，或至少約10倍。在一些態樣中，投與之後約2個月，與參照受試者中之對應免疫細胞相比，經修飾之免疫細胞中之數目大至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍，或至少約10倍。在一些態樣中，投與之後約3個月，與參照受試者中之對應免疫細胞相比，經修飾之免疫細胞中之數目大至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍，或至少約10倍。在一些態樣中，投與之後約4個月，與參照受試者中之對應免疫細胞相比，經修飾之免疫細胞中之數目大至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍，或至少約10倍。在一些態樣中，投與之後約5個月，與參照受試者中之對應免疫細胞相比，經修飾之免疫細胞中之數目大至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍，或至少約10倍。在一些態樣中，投與之後約6個月，與參照受試者中之對應免疫細胞相比，經修飾之免疫細胞中之數目大至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍，或至少約10倍。在一些態樣中，投與之後約7個月，與參照受試者中之對應免疫細胞相比，經修飾之免疫細胞中之數目大至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍，或至少約10倍。在一些態樣中，投與之後約8個月，與參照受試者中之對應免疫細胞相比，經修飾之免疫細胞中之數目大至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍，或至少約10倍。

本揭示案亦提供在經診斷患有癌症之受試者中擴增基因工程改造化細胞( 例如，T細胞)之群體的方法，該方法包括向受試者投與經基因工程改造化以便表現抗ROR1 CAR並且過度表現本揭示案之c-Jun多肽的細胞( 例如，T細胞)。在一些態樣中，細胞為T細胞， 例如，自體T細胞。在一些態樣中，T細胞為異源T細胞。在本文揭示之方法之一些態樣中，受試者為人類受試者。

在一些態樣中，與投與包含抗ROR1 CAR(例如不過度表現c-Jun)代替本揭示案之CAR的對應組合物之後觀察到的介白素分泌相比，投與包含本揭示案之抗ROR1 CAR(例如c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)之組合物導致介白素(例如介白素-2)分泌增加至少約0.01倍、至少約0.02倍、至少約0.03倍、至少約0.04倍、至少約0.05倍、至少約0.06倍、至少約0.07倍、至少約0.08倍、至少約0.09倍、至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.3倍、至少約0.4倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。

在一些態樣中，與投與包含抗ROR1 CAR(例如不過度表現c-Jun)代替本揭示案之CAR的對應組合物之後觀察到的干擾素(例如干擾素-γ)分泌相比，投與包含本揭示案之抗ROR1 CAR(例如c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)之組合物導致干擾素(例如干擾素-γ)分泌增加至少約0.01倍、至少約0.02倍、至少約0.03倍、至少約0.04倍、至少約0.05倍、至少約0.06倍、至少約0.07倍、至少約0.08倍、至少約0.09倍、至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.3倍、至少約0.4倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。

在一些態樣中，與投與包含抗ROR1 CAR(例如不過度表現c-Jun)代替本揭示案之CAR的對應組合物之後觀察到的TNF α分泌相比，投與包含本揭示案之抗ROR1 CAR(例如c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)之組合物導致TNF α分泌增加至少約0.01倍、至少約0.02倍、至少約0.03倍、至少約0.04倍、至少約0.05倍、至少約0.06倍、至少約0.07倍、至少約0.08倍、至少約0.09倍、至少約0.1倍、至少約0.2倍、至少約0.3倍、至少約0.4倍、至少約0.5倍、至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。

在一些態樣中，本揭示案提供作為藥物來使用的本揭示案之多核苷酸、載體、CAR、組合物、套組、細胞，或醫藥組合物。在一些態樣中，本揭示案提供作為用於治療有需要之受試者之癌症的藥物來使用的本揭示案之多核苷酸、載體、CAR、組合物、套組、細胞，或醫藥組合物。在一些態樣中，本揭示案提供用於治療有需要之受試者之癌症的本揭示案之多核苷酸、載體、CAR、組合物、套組、細胞，或醫藥組合物。在一些態樣中，本揭示案提供本揭示案之多核苷酸、載體、CAR、組合物、套組、細胞，或醫藥組合物用於製造藥物的用途。在一些態樣中，本揭示案提供本揭示案之多核苷酸、載體、CAR、組合物、套組、細胞，或醫藥組合物用於製造供治療有需要之受試者之癌症之藥物的用途。

本揭示案亦提供用於治療需要CAR療法之受試者的包含多核苷酸構築體(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)之組合物、包含構築體(例如，編碼c-Jun、CAR或EGFRt)之載體，或包含構築體或載體之遺傳修飾細胞。本揭示案亦提供作為藥物來使用的包含本揭示案之多核苷酸構築體(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)之組合物、包含多核苷酸構築體之載體，或包含編碼c-Jun、CAR，或EGFRt之多核苷酸或載體的遺傳修飾細胞。亦提供作為需要CAR療法之受試者之癌症之治療劑來使用的包含本揭示案之多核苷酸構築體(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)之組合物、包含多核苷酸構築體之載體，或包含編碼c-Jun、CAR，或EGFRt之多核苷酸或載體的遺傳修飾細胞。亦提供用於製造供治療需要CAR療法之受試者之癌症之藥物的包含多核苷酸構築體(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)之組合物，包含編碼c-Jun、CAR，或EGFRt之多核苷酸的載體，或包含編碼c-Jun、CAR，或EGFRt之多核苷酸或載體的遺傳修飾細胞。

在一些態樣中，本揭示案提供製備表現嵌合抗原受體之細胞的方法，包括將細胞用本文揭示之多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)來轉染。在一些態樣中，細胞包括T細胞、B細胞、調控T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、幹細胞、誘導多能幹細胞，及其任何組合。

在一些態樣中，本揭示案提供擴增表現嵌合抗原受體之細胞的方法，包括在合適條件下培養包含本文揭示之多核苷酸或本文揭示之載體或本文揭示之多肽的細胞。

在一些態樣中，本文揭示之治療方法進一步包括投與至少一種額外治療劑。在一些態樣中，額外治療劑包括化療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子之活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法，或其任何組合。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑包括抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗GITR抗體、抗TIM3抗體，或其任何組合。套組

本揭示案亦提供套組，或製品，其包括(i)編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt蛋白的一或多個多核苷酸(例如，c-Jun-抗ROR1 CAR構築體)，編碼一或多個本文所述多核苷酸( 例如，抗ROR1 CAR、c-Jun，及/或EGFRt)的一或多個載體，或包含該(等)多核苷酸或該(等)載體之組合物，及視情況(ii)使用說明書， 例如，根據本文揭示之方法的使用說明書。

本揭示案亦提供套組，其包括(i)經遺傳修飾來表現本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun，及EGFRt蛋白的細胞， 亦即，包含編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun多肽，及/或EGFRt蛋白之一或多個多核苷酸，或包含一或多個本文所述多核苷酸之一或多個載體的細胞( 例如，T細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞，或ILC細胞)，或包含細胞之醫藥組合物，及視情況(ii)使用說明書。

在一些態樣中，套組或製品包括一或多個容器中的編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun多肽，及/或EGFRt蛋白之至少一個多核苷酸或載體，經遺傳修飾來表現本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun多肽，及/或EGFRt蛋白的細胞，或包含本文揭示之多核苷酸、載體，或細胞之組合物( 例如，醫藥組合物)。

在一些態樣中，套組或製品包括編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun多肽，及EGFRt蛋白的至少一個多核苷酸或載體，經遺傳修飾來表現本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun，及EGFRt的細胞，或包含本文揭示之多核苷酸、載體，或細胞的組合物( 例如，醫藥組合物)，及視情況手冊。

熟習此項技術者容易認識到本揭示案之多核苷酸、載體、細胞，及組合物，包含本揭示案之多核苷酸、載體，或細胞之醫藥組合物，或其組合可容易併入在此項技術中熟知之既定套組格式中之一者中。

在一些態樣中，套組或製品包括容器( 例如，玻璃小瓶)中之呈乾燥形式之例如編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun多肽，及EGFRt蛋白之多核苷酸或載體，或包含多核苷酸、載體之組合物( 例如，醫藥組合物)，及視情況具有溶劑之小瓶。

在一些態樣中，套組或製品包括至少一個容器中的例如編碼本揭示案之抗ROR1 CAR、c-Jun肽，及EGFRt蛋白之多核苷酸或載體，或包含多核苷酸、載體的組合物( 例如，醫藥組合物)，及具有轉染試劑的另一個或更多個容器。 ***

除非另外指示，否則本揭示案之實踐使用細胞生物學、細胞培養物、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA以及免疫學之習知技術，此等技術在此項技術之技能範圍內。此類技術在文獻中有充分說明。參見例如Sambrook等人編(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover編(1985) DNA Cloning, 第I卷及第II卷；Gait編(1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編(1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編(1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning；專著，Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller及Calos編(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人編, Methods In Enzymology, 第154卷及第155卷；Mayer及Walker編(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir及Blackwell編, (1986) Handbook Of Experimental Immunology, 第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)；)；Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications，第2版CRC Press (2007)及Ausubel等人 (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)。

提供以下實例用來說明而非用來限制。實例表7. c-Jun-抗ROR1 CAR序列

c-Jun-抗ROR1 CAR
SEQ ID NO	描述	序列
57	完整序列 1,198aa	MTAKMETTFYDDALNASFLPSESGPYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVGLLKLASPELERLIIQSSNGHITTTPTPTQFLCPKNVTDEQEGFAEGFVRALAELHSQNTLPSVTSAAQPVNGAGMVAPAVASVAGGSGSGGFSASLHSEPPVYANLSNFNPGALSSGGGAPSYGAAGLAFPAQPQQQQQPPHHLPQQMPVQHPRLQALKEEPQTVPEMPGETPPLSPIDMESQERIKAERKRMRNRIAASKCRKRKLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVNSGCQLMLTQQLQTFGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMVLQTQVFISLLLWISGAYGQEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTGGGGSGKPCPPCKCPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRR
1	c-Jun 331aa aa 1-331	MTAKMETTFYDDALNASFLPSESGPYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVGLLKLASPELERLIIQSSNGHITTTPTPTQFLCPKNVTDEQEGFAEGFVRALAELHSQNTLPSVTSAAQPVNGAGMVAPAVASVAGGSGSGGFSASLHSEPPVYANLSNFNPGALSSGGGAPSYGAAGLAFPAQPQQQQQPPHHLPQQMPVQHPRLQALKEEPQTVPEMPGETPPLSPIDMESQERIKAERKRMRNRIAASKCRKRKLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVNSGCQLMLTQQLQTF
59	P2A裂解之後的 c-Jun(剩餘部分裝盒)	MTAKMETTFYDDALNASFLPSESGPYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVGLLKLASPELERLIIQSSNGHITTTPTPTQFLCPKNVTDEQEGFAEGFVRALAELHSQNTLPSVTSAAQPVNGAGMVAPAVASVAGGSGSGGFSASLHSEPPVYANLSNFNPGALSSGGGAPSYGAAGLAFPAQPQQQQQPPHHLPQQMPVQHPRLQALKEEPQTVPEMPGETPPLSPIDMESQERIKAERKRMRNRIAASKCRKRKLERIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVNSGCQLMLTQQLQTFGSGATNFSLLKQAGDVEENPG
56	P2A 22aa aa 332-353	GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
17	hIgK 20aa aa 354-373	MVLQTQVFISLLLWISGAYG
60	P2A裂解之後的hIgK	PMVLQTQVFISLLLWISGAYG. (P2A剩餘殘基加雙下劃線
52	scFv 248aa aa 374-621	QEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTG
16	連接子 5aa aa 622-626	GGGSG
15	間隔基1 9aa aa 627-635	KPCPPCKCP
54	CD28跨膜域 28aa aa 636-663	MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
53	4-1BB 42aa aa 664-705	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
55	CD3z 112aa aa 706-817	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
61	P2A裂解之後的CD3z	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (連接子-P2A剩餘部分裝盒)
56	SG連接子 - P2A 21aa aa 819-838	SG-ATNFSLLKQAGDVEENPGP
18	GMCSFR-α-SP 22aa aa 839-860	MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
62	GMCSFR-α-SP P2A裂解之後	PMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (P2A剩餘殘基加雙下劃線
3	EGFRt 338aa aa 860-1,198	RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRR
58	完整序列(具有啟動子) 4,022個核苷酸	TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGATCAGAACCTCTTACGAGTCGGCTAGCGCCGCCACCATGACAGCCAAGATGGAAACCACATTCTACGACGACGCCCTGAACGCCTCATTCCTGCCTTCTGAGAGCGGACCTTACGGCTACAGCAATCCTAAGATCCTGAAACAGAGCATGACCCTTAACCTGGCTGATCCTGTTGGAAGCCTGAAACCTCACCTGAGAGCCAAAAACAGCGACCTGCTCACCAGCCCTGATGTGGGCCTGCTGAAGCTGGCCTCTCCAGAGCTGGAACGGCTGATCATCCAGAGCAGCAACGGCCACATCACAACCACCCCTACCCCTACACAATTCCTGTGCCCTAAGAACGTGACCGACGAGCAGGAGGGCTTCGCCGAAGGCTTTGTGCGGGCCCTGGCAGAACTGCACTCTCAGAACACCCTGCCTAGCGTGACCTCCGCCGCCCAGCCTGTCAACGGCGCCGGAATGGTGGCCCCTGCCGTGGCTTCTGTGGCCGGCGGCAGCGGCAGCGGCGGATTCAGCGCCTCTCTGCACTCTGAGCCTCCTGTCTACGCCAATCTGTCTAATTTCAACCCCGGAGCCCTGTCCAGCGGCGGCGGAGCTCCTAGCTACGGCGCTGCTGGACTGGCCTTCCCCGCCCAGCCCCAGCAACAGCAGCAGCCTCCACACCACCTGCCCCAGCAGATGCCCGTGCAGCACCCTAGACTGCAGGCCCTGAAGGAAGAACCCCAAACAGTGCCTGAGATGCCTGGCGAGACACCTCCACTGAGCCCCATCGACATGGAAAGCCAGGAGCGGATCAAGGCCGAGAGAAAGAGAATGCGGAACAGAATCGCCGCTAGCAAGTGCAGAAAGCGGAAGCTGGAAAGAATCGCCAGACTGGAAGAGAAGGTGAAGACCCTGAAAGCCCAAAATAGCGAGCTGGCCAGCACCGCCAACATGCTGCGGGAACAGGTGGCCCAGCTGAAGCAGAAGGTGATGAACCACGTGAACTCTGGTTGTCAGCTGATGCTGACCCAGCAGCTCCAGACCTTCGGCTCCGGTGCAACGAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGAGATGTTGAGGAAAATCCAGGTCCCATGGTCTTGCAGACTCAAGTATTTATATCCCTTTTGCTCTGGATCTCTGGAGCTTACGGCCAGGAACAGCTCGTCGAAAGCGGCGGCAGACTGGTGACACCTGGCGGCAGCCTGACCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCGACTTCAGCGCCTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGATCGCCACCATCTACCCCAGCAGCGGCAAGACCTACTACGCCACCTGGGTGAACGGACGGTTCACCATCTCCAGCGACAACGCCCAGAACACCGTGGACCTGCAGATGAACAGCCTGACAGCCGCCGACCGGGCCACCTACTTTTGCGCTCGGGACAGCTACGCCGACGACGGCGCCCTGTTCAACATCTGGGGCCCTGGCACCCTGGTGACAATCTCTAGCGGCGGAGGCGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGAGCTGGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTGTGTCTGCTGCCCTGGGAAGCCCTGCCAAGATCACCTGTACCCTGAGCAGCGCCCACAAGACCGACACCATCGACTGGTATCAGCAGCTGCAGGGCGAGGCCCCCAGATACCTGATGCAGGTGCAGAGCGACGGCAGCTACACCAAGAGGCCAGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGATCTAGCTCTGGCGCCGACCGCTACCTGATCATCCCCAGCGTGCAGGCCGATGACGAGGCCGATTACTACTGTGGCGCCGACTACATCGGCGGCTACGTGTTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTGACCGGTGGCGGAGGTTCAGGCAAACCGTGCCCTCCGTGCAAGTGTCCTATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGGTCCGGAGCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAATTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGCAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAGGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGACCCACAAGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAAGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAGCATGGACAGTTTTCTCTTGCTGTCGTGAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGCCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGCGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGATTGCGTGTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAAGGCGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAACGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGCCGAAGGTGA
64	MND啟動子	TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGC

實例 1 ：分析過度表現 c-Jun 之抗 ROR1 CAR T 細胞殺滅腫瘤細胞之能力

為了開始表徵本文所述抗ROR1 CAR T細胞( 例如，過度表現c-Jun)之ROR1依賴性生物活性，評定CAR T細胞殺滅腫瘤細胞之能力。簡言之，將過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(在本文中稱為「c-Jun過度表現抗ROR1 CAR T細胞」)與經由規律間隔重複短迴文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關蛋白9(Cas9)來敲除人類ROR1之ROR1 ⁺NSCLC細胞株(「H1975」)或H1975(「H1975-ROR1KO」)共培養。作為比較，不裂解腫瘤細胞的未轉導「mock」T細胞( 亦即，不表現抗ROR1 scFv)，及不過度表現c-Jun之「對照」抗ROR1 CAR T細胞亦與H1975或H1975-ROR1KO細胞共培養。H1975及H1975-ROR1KO細胞均表現NucLight Red(NLR；核限制性mKate2)，以使得未裂解細胞可加以定量。將不同CAR T細胞以1:1之效應物與標靶(E:T)細胞比率培育120小時。

如圖1A示出，與對照抗ROR1 CAR T細胞類似，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞以ROR1表現依賴性方式來介導腫瘤細胞之細胞溶解。重要地，未觀察到藉由抗ROR1 CAR T細胞對於標靶陰性H1975-ROR1敲除細胞之殺滅(圖1B)。此等結果證明與更傳統抗ROR1 CAR T細胞( 例如，不過度表現c-Jun)相比，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞同樣有效殺滅腫瘤細胞。實例 2 ：分析過度表現 c-Jun 之抗 ROR1 CAR T 細胞產生選擇性細胞介素分泌的能力

為了進一步表徵本文所述抗ROR1 CAR T細胞之功能性能力，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞或對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)以1:1之效應物與標靶(E:T)細胞比率24小時，與H1975或H1975-ROR1KO腫瘤細胞共培養24小時。然後，收集來自不同培養條件之上清液以便進行IL-2及IFN-γ定量。細胞介素之濃度使用Meso Scale Discovery (MSD) U-Plex來量測。

如圖2A及2C示出，響應於ROR1抗原，對照抗ROR1 CAR T細胞及過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞均產生大量IL-2及IFN-γ。然而，細胞介素產生在過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞中大得多。當在H1975-ROR1KO細胞存在下培養時(圖2B及2D)，對照抗ROR1 CAR T細胞或過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T不分泌細胞介素。

共同地，此等資料證明過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞之選擇性生物活性，因為過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞僅以抗原依賴性方式來裂解腫瘤細胞及分泌細胞介素。另外，與不過度表現c-Jun之對照抗ROR1 CAR-T細胞相比，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR-T細胞的標靶依賴性細胞介素分泌得以增強。實例 3 ：分析過度表現 c-Jun 之抗 ROR1 CAR T 細胞之細胞介素依賴性增殖

為了判定是否c-Jun之過度表現對抗ROR1 CAR T細胞對於細胞介素之敏感性具有任何效應，對照抗ROR1 CAR T細胞(例如，不過度表現c-Jun)及過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞分別在以下條件中之一者下，在Grex 24孔板(1 x 10 ⁶細胞/孔)中培養：(i)僅T細胞培養基(OpTmizer基礎培養基、OpTmizer細胞補充物、免疫細胞血清替代物、2 mM L麩醯胺酸酸、1×GlutaMAX)，(ii)補充有200 IU/ml之IL-2的T細胞培養基，或(iii)補充有1200 IU/ml IL-7及200 IU/mL IL-15的T細胞培養基。未轉導(「mock」)細胞亦在此等條件下培養並且用作對照。在第7天及第14天，將各培養條件下之T細胞之總數計數，並且然後將來自第7天之細胞以1x10 ⁶細胞/孔來重新接種以便用於後續培養循環。在檢定之整個持續時間內保持各樣品之培養基條件。

如圖3A示出，在不存在細胞介素時，T細胞中沒有一個能夠擴增。與在細胞介素支援下瞬時擴增至有限數目的mock或對照抗ROR1 CAR T細胞相比，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞表現出在整個研究中保持的極好增殖能力(圖3B及3C)。此等結果進一步證明c-Jun之過度表現可改良抗ROR1 CAR T細胞之各種功能性質( 例如，細胞介素敏感性)。實例 4 ：分析在長期抗原刺激之後， c-Jun 過度表現對於抗 ROR1 CAR T 細胞之抗腫瘤性質的效應

在慢性感染及癌症中，T細胞可經由持續抗原刺激而變得耗竭，導致諸如細胞溶解活性及細胞介素分泌之T細胞效應物功能的逐漸損失。因此，為了評估是否在延長的抗原刺激之後，c-Jun之過度表現對於抗ROR1 CAR T細胞之效應物功能具有任何效應，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞及對照抗ROR1 CAR T細胞(例如，不過度表現c-Jun)藉由重複暴露於ROR1 ⁺A549 NSCLC腫瘤細胞來長期刺激。藉由每2天，以1:1 E:T比率用新鮮靶細胞來重新塗覆CAR T細胞，確保長期抗原暴露。長期刺激後第7天，將CAR T細胞收集並且與A549-NLR (E:T細胞比率1:1)或H1975-NLR(E:T 1:5)共培養。靶細胞之裂解藉由追蹤相對於檢定設置之時間0 h來正規化之總NLR強度來評估。收集24-h上清液以便藉由MSD來進行IFN-γ、IL-2，及TNF-α定量。

如圖4A示出，與對照抗ROR1 CAR T細胞(例如，不過度表現c-Jun)相比，甚至在重複抗原刺激之後，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞能夠有效地裂解ROR1 ⁺腫瘤細胞。類似地，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞亦產生增加水準之至少IFN-γ(圖4B)。此等結果證明c-Jun之過度表現可有助於CAR T細胞在長期抗原刺激存在下保持效應物功能。實例 5 ：分析長期刺激的過度表現 c-Jun 之抗 ROR1 CAR T 細胞中之耗竭相關轉錄概況

為了進一步理解c-Jun過度表現對於T細胞耗竭之效應，對於來自7天長期刺激時間點之CAR ⁺T細胞(n=3個供體，在圖5A中描述)執行整體RNA測序並且鑑別在對照抗ROR1 CAR T細胞(例如，不過度表現c-Jun)與過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞之間差異性表現的基因。使用來自文獻(Beltra JC, 等人, Immunity. 2020;52(5):825-841.e8；Zhang L, 等人, Nature. 2018;564(7735):268-272)之T細胞耗竭模型之基因集，對於差異表現基因的基因集富集分析(GSEA)顯示，在過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞中下調的基因對於在(Texterm_UP [來自Beltra 2020之基因集]及Tex_multiTumors [來自Zhang 2018之基因集])中上調的基因集而言為顯著富集的。相反地，在過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞中上調的基因對於含有T細胞增殖基因之基因集(TexProg2_UP [來自Beltra 2020之基因集])及在終末耗竭表型方面下調之基因集(Texterm_DOWN[來自Beltra 2020之基因集])而言為顯著富集的(圖5A)。總之，此等資料指示c-Jun對於減少耗竭基因表現印記及保持與T細胞增殖相關之基因之表現的效果。

為了更好理解c-Jun之效果，亦對於2個供體中之第7天CAR ⁺T細胞執行單細胞轉錄體及抗原決定基之細胞索引(CITE)-seq(圖5B-圖5D)。基於轉錄(及蛋白)概況的細胞之聚類有助於鑑別其中細胞主要基於文獻之耗竭標誌物來富集的叢集3(圖5B)。隨著添加c-Jun，叢集3之頻率在兩個供體中降低，示出c-Jun對於耗竭之效應(圖5D)。另外，對於更大分化/活化標誌物(諸如4-1BB，顆粒酶A[GZMA](圖5C))來富集之叢集0及5(圖5B)亦隨著添加c-Jun而在頻率方面降低(圖5D)。實例 6 ：分析過度表現 c-Jun 之抗 ROR1 CAR T 細胞對於表現低水準 ROR1 之 NSCLC 細胞株的反應性

為了評估是否c-Jun過度表現對於抗ROR1 CAR T細胞識別抗原具有任何效應，將過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞及對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)與經工程化來表現不同水準細胞表面ROR1之H1975細胞共培養(圖6)。具有不同強度之一組突變腦心肌炎病毒內部核糖體進入位點元件用於控制人類ROR1在廣泛範圍內之相對表現並且引入H1975-ROR1KO細胞株(Koh 2013. PLoS One, 8(12):e82100.doi:10.1371)中。按照細胞株之ROR1之表現水準表示為幾何MFI(圖6)。將細胞在148小時之過程中共培養，並且在各個時間點，計數NLR陽性細胞之總數並且相對於時間點0 h之計數來正規化，以便計算正規化標靶殺滅。初始抗原刺激後24小時，收集上清液並且IL-2及IFN-γ之量亦使用Meso Scale Discovery (MSD) U-Plex來定量。

如圖7示出，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞及對照抗ROR1 CAR T細胞(例如，不過度表現c-Jun)以類似比率來裂解H1975細胞，不論ROR1抗原密度為何。在將IL-2及IFN-γ水準定量時，觀察到類似結果(圖8A及8B)。此等結果表明c-Jun過度表現實質上不改變抗ROR1 CAR T細胞發揮效應物功能所需要的抗原密度臨限值。實例 7 ：分析過度表現 c-Jun 之抗 ROR1 CAR T 細胞之活體內抗腫瘤功效

為了評估是否c-Jun之過度表現亦可改良 活體內CAR T細胞之各種功能性質，在異種移植物動物模型中測試過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞之抗腫瘤活性。簡言之，將腫瘤細胞( 亦即，ROR1陽性H1975 NSCLC細胞株)皮下植入NOD scidγ；NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠的側腹。當腫瘤達到約100 mm ³時，向小鼠靜脈內輸注以下中之一者：(i)未轉導mock T細胞、(ii)對照抗ROR1 CAR T細胞(例如，不過度表現c-Jun)，或(iii)過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞。抗腫瘤活性藉由使用卡尺量測腫瘤體積來評定並且治療相關毒性藉由量測動物體重來評定。另外，T細胞之擴增使用T細胞輸注之後24小時開始每週收集之末梢血液的流式細胞術來評定總計6週。

如圖9A及9C示出，用對照抗ROR1 CAR T細胞(例如，不過度表現c-Jun)來治療之動物似乎最初控制腫瘤生長但是最終死於腫瘤，其中僅約40%動物存活至實驗結束。相比之下，用過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(例如，過度表現c-Jun)來治療之動物顯示顯著更大腫瘤控制並且在實驗之整個持續時間內存活。與經改良之抗腫瘤資料一致，與對照抗ROR1 CAR T細胞(例如，不過度表現c-Jun)相比，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(例如，過度表現c-Jun)亦表現出大得多的持久性及擴增(圖10)。此等結果證實先前 活體外資料並且證明與更傳統抗ROR1 CAR T細胞( 例如，不過度表現c-Jun)相比，本文所述過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞展現改良得多的抗腫瘤效應。實例 8 ：臨床開發

進行被設計來評估過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞在患有ROR1陽性復發及/或難治性TNBC及NSCLC之患者中之安全性、PK，及抗腫瘤活性的FIH、階段1、單臂、開放標籤、劑量遞增及擴展、多中心研究。階段1研究之主要目標為評估過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞在患有復發/難治性TNBC及NSCLC之患者中之安全性及耐受性，並且測定過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞之RP2D。階段1研究之次要目標為評估過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞之抗腫瘤活性及評估過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞在末梢血液樣品中之PK(例如，擴增及持久性)。 建議階段 1 設計

此為被設計來評估過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞在患有復發及/或難治性TNBC及NSCLC之患者中之安全性、PK，及抗腫瘤活性的單臂、開放標籤、劑量遞增及擴展、多中心研究。在劑量遞增階段期間，僅登記患有TNBC之參與者；在擴展階段期間，登記TNBC及NSCLC研究群組兩者。

除了其他合格性標準以外，患有包括檢查點抑制劑及亞伯杉烷之2種療法失敗之TNBC，或患有包括EGFR ⁺及ALK ⁺疾病靶向療法之2種療法失敗之NSCLC的免疫組織化學ROR1陽性之參與者適合於登記。滿足所有合格性標準之參與者登記並且經歷白血球分離以便實現產物產生。成功產物製造之後，參與者進入治療階段並且接受1個治療循環。治療循環包括使用氟達拉濱及環磷醯胺進行淋巴耗竭化學療法3天，隨後以方案規定劑量水準中之一者來IV投與單一劑量之細胞產物。在淋巴耗竭化學療法完成之後幾天投與細胞產物，除非在與醫學監查員討論之後，臨床或後勤形勢需要將此時間更改至較晚日期。

在投與細胞產物之後，針對安全性、疾病狀態、額外抗癌療法，及存活，跟蹤參加者長達2年。要求接受過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞的所有參與者在此研究完成或中止時參加所發起的長期隨訪(LTFU)研究。

圖 1A及 1B示出本文所述抗ROR1 CAR T細胞(例如，過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞)選擇性裂解表現ROR1之NSCLC腫瘤細胞。以1:1之效應物與標靶(E:T)細胞比率，將Mock(未轉導)T細胞、對照R12 (例如，不表現c-Jun) CAR T細胞，或c-Jun-R12 CAR T細胞與表現NucLight Red (NLR；核限制性mKate2)的表現ROR1之NSCLC腫瘤細胞(「H1975」) ( 圖 1A)或缺少ROR1表現之NSCLC腫瘤細胞(「H1975-ROR1KO」) ( 圖 1B)共培養120小時。隨著時間的推移(x軸)來計數NLR陽性細胞之總數並且相對於時間點0 h之計數來正規化，以便計算正規化標靶殺滅(y軸)。圖 2A 、 2B 、 2C，及 2D示出c-Jun過度表現增強抗ROR1 CAR T細胞之ROR1依賴性細胞介素分泌，但是不增加緊張性信號轉導。以1:1之效應物與標靶(E:T)細胞比率，將Mock(未轉導)T細胞、對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)，或過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞與表現ROR1之NSCLC腫瘤細胞( 圖 2A 及 2C)或缺少ROR1表現之NSCLC腫瘤細胞( 圖 2B 及 2D)共培養24小時，在此時點，收集來自共培養孔之上清液以便用於細胞介素定量。IL-2( 圖 2A 及 2B)及IFN-γ( 圖 2C 及 2D)之濃度使用Meso Scale Discovery (MSD) U-Plex來量測。圖2A-2D示出之結果來自三個獨立供體( 亦即，供體1、供體2，及供體3)。圖 3A ， 3B，及 3C示出c-Jun過度表現增強抗ROR1 CAR T細胞的細胞介素依賴性增殖能力。Mock(未轉導) T細胞、對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)，或過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞個別地在Grex 24孔板中用基礎T-細胞培養基( 圖 3A)、T-細胞培養基 + 200 IU/ml IL-2 ( 圖 3B)，或T-細胞培養基 + 1200 IU/ml IL-7 + 200 IU/mL IL-15 ( 圖 3C)來培養。在第0天，針對各個條件，將1百萬個細胞接種並且每7天，並且將細胞計數並且重新接種1百萬個細胞。總細胞數目(y軸)示出各次擴增結束時之實際T細胞數目。圖 4A及 4B示出在長期暴露於表現ROR1之NSCLC腫瘤細胞株之後，c-Jun過度表現延長抗ROR1 CAR T細胞的細胞溶解活性及IFN-γ分泌。對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)或過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞藉由暴露於ROR1+ A549 NSCLC腫瘤細胞7天來長期刺激。藉由每2天，以1:1 E:T比率用新鮮靶細胞來重新塗覆CAR T細胞，確保長期抗原暴露。長期刺激後第7天，將CAR T細胞收集並且與A549-NLR (E:T細胞比率1:1)或H1975-NLR(E:T 1:5)共培養。靶細胞之裂解藉由追蹤相對於檢定設置之時間0 h來正規化之總NLR強度來評估( 圖 4A)。收集24-h上清液以便藉由MSD來進行IFN-γ、IL-2，及TNF-α定量( 圖 4B)。n = 3個供體(D13814、D15195，及D15842)。圖 5A 、 5B 、 5C，及 5D示出在長期抗原刺激之後，c-Jun過度表現減少抗ROR1 CAR T細胞中之耗竭相關轉錄概況。所示結果來自2個供體中之單細胞CITE-seq(使用Seurat)。圖 5A示出長期刺激之後第7天過度表現c-Jun之±CAR+ T細胞之間的基因差異表現之基因集富集(fgsea)。圖 5B示出來自單一細胞之過度表現c-Jun之±CAR+細胞之均勻流形逼近及投影。各點表示投影至2維空間上之細胞。在添加c-Jun時具有遞減頻率之叢集(叢集0、3，及5)之標誌物及對應頻率得以示出( 參見箭頭)。叢集3包含主要針對基於文獻之耗竭標誌物來富集之細胞。叢集0及5包含主要針對基於文獻之T細胞分化/活化標誌物(例如，TIGIT、TNFRSF9、顆粒酶A)來富集之細胞。圖 5C示出2維空間之圖5B之過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞之TIGIT(第1圖)、CD137(TNFRSF9；第2圖)，及顆粒酶A(GZMA；第3圖)之表現。圖 5D示出針對耗竭標誌物(叢集3)及分化/活化標誌物(0，5)來富集之叢集0、3及5隨著添加c-Jun而在頻率方面降低(細胞之百分比降低)。圖 6示出工程化NSCLC細胞株H1975上之不同ROR1表現水準。具有不同強度之一組突變腦心肌炎病毒內部核糖體進入位點元件用於控制人類ROR1在廣泛範圍內之相對表現並且引入缺少ROR1表現之H1975細胞株中。按照細胞株(x軸)之ROR1之表現水準表示為幾何MFI(y軸)。圖 7示出c-Jun過度表現不改變抗ROR1 CAR T細胞針對表現低水準ROR1之NSCLC細胞株之細胞溶解活性所需要的抗原密度臨限值。將Mock(未轉導)T細胞、對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)，或過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞與表現NLR及不同水準之ROR1 (如圖6所描述)的NSCLC細胞株(H1975)培養148小時，在此期間計數NLR陽性細胞之總數並且相對於時間點0 h之計數來正規化，以便計算正規化標靶殺滅(4個供體；效應物與標靶[E:T]比率 = 1:16)。ROR1敲除及ROR1-低表現細胞分別展示於左上及右上圖中。ROR1-低-中及ROR1-中表現細胞分別展示於左中及右中圖中。ROR1-中-高及ROR1-高表現細胞分別展示於左下及右下圖中。圖 8A及 8B示出c-Jun過度表現實質上不改變響應於表現低水準ROR1之H1975 NSCLC細胞株的抗ROR1 CAR T細胞之細胞介素分泌所需要的抗原密度臨限值。Mock(未轉導)T細胞(圓形)、對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)(正方形)，或過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(三角形)在含有表現不同水準ROR1(如圖6所描述)之H1975細胞的孔中培養24小時，在此時點，收集來自孔之上清液以便進行IL-2( 圖 8A)及IFN-γ( 圖 8B)定量。濃度使用Meso Scale Discovery (MSD) U-Plex(4個供體；效應物與標靶[E:T]比率 = 1:1)來量測。圖 9A 、 9B ，及 9C提供本文所述抗ROR1 CAR T細胞( 例如，過度表現c-Jun)之抗腫瘤效應的比較。皮下植入有人類ROR1陽性H1975 NSCLC細胞之動物用單一劑量(4×10 ⁶個細胞)之以下中之一者來靜脈內治療：(i)高劑量之mock(未轉導)T細胞，(ii)對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)，及(iii)過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞。然後，動物之腫瘤大小( 圖 9A)、體重( 圖 9B)，及存活( 圖 9C)在投與CAR T細胞後之各個時間點評定。圖 10示出帶有H1795腫瘤之NSG小鼠中之抗ROR1 CAR T細胞之持久性。如示出，動物接受單一靜脈內投與以下中之一者：(i)mock (未轉導)T細胞(圓形)，(ii)對照抗ROR1 CAR T細胞( 亦即，不過度表現c-Jun)(三角形)，及(iii)過度表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(菱形)。然後，在投與後各個時間點，收集末梢血液並且每mL血液之CAR T細胞之數目使用流式細胞術來定量。


          <![CDATA[<110>  美商萊爾免疫藥物股份有限公司(LYELL IMMUNOPHARMA, INC.)]]>
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          Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 
                  35                  40                  45              
          Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 
                  275                 280                 285             
          Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe 
                          325                 330     
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          <![CDATA[<400>  2]]>
          gctcagagtt gcactgagtg tggctgaagc agcgaggcgg gagtggaggt gcgcggagtc       60
          aggcagacag acagacacag ccagccagcc aggtcggcag tatagtccga actgcaaatc      120
          ttattttctt ttcaccttct ctctaactgc ccagagctag cgcctgtggc tcccgggctg      180
          gtgtttcggg agtgtccaga gagcctggtc tccagccgcc cccgggagga gagccctgct      240
          gcccaggcgc tgttgacagc ggcggaaagc agcggtaccc acgcgcccgc cgggggaagt      300
          cggcgagcgg ctgcagcagc aaagaacttt cccggctggg aggaccggag acaagtggca      360
          gagtcccgga gccaactttt gcaagccttt cctgcgtctt aggcttctcc acggcggtaa      420
          agaccagaag gcggcggaga gccacgcaag agaagaagga cgtgcgctca gcttcgctcg      480
          caccggttgt tgaacttggg cgagcgcgag ccgcggctgc cgggcgcccc ctccccctag      540
          cagcggagga ggggacaagt cgtcggagtc cgggcggcca agacccgccg ccggccggcc      600
          actgcagggt ccgcactgat ccgctccgcg gggagagccg ctgctctggg aagtgagttc      660
          gcctgcggac tccgaggaac cgctgcgcac gaagagcgct cagtgagtga ccgcgacttt      720
          tcaaagccgg gtagcgcgcg cgagtcgaca agtaagagtg cgggaggcat cttaattaac      780
          cctgcgctcc ctggagcgag ctggtgagga gggcgcagcg gggacgacag ccagcgggtg      840
          cgtgcgctct tagagaaact ttccctgtca aaggctccgg ggggcgcggg tgtcccccgc      900
          ttgccacagc cctgttgcgg ccccgaaact tgtgcgcgca gcccaaacta acctcacgtg      960
          aagtgacgga ctgttctatg actgcaaaga tggaaacgac cttctatgac gatgccctca     1020
          acgcctcgtt cctcccgtcc gagagcggac cttatggcta cagtaacccc aagatcctga     1080
          aacagagcat gaccctgaac ctggccgacc cagtggggag cctgaagccg cacctccgcg     1140
          ccaagaactc ggacctcctc acctcgcccg acgtggggct gctcaagctg gcgtcgcccg     1200
          agctggagcg cctgataatc cagtccagca acgggcacat caccaccacg ccgaccccca     1260
          cccagttcct gtgccccaag aacgtgacag atgagcagga gggcttcgcc gagggcttcg     1320
          tgcgcgccct ggccgaactg cacagccaga acacgctgcc cagcgtcacg tcggcggcgc     1380
          agccggtcaa cggggcaggc atggtggctc ccgcggtagc ctcggtggca gggggcagcg     1440
          gcagcggcgg cttcagcgcc agcctgcaca gcgagccgcc ggtctacgca aacctcagca     1500
          acttcaaccc aggcgcgctg agcagcggcg gcggggcgcc ctcctacggc gcggccggcc     1560
          tggcctttcc cgcgcaaccc cagcagcagc agcagccgcc gcaccacctg ccccagcaga     1620
          tgcccgtgca gcacccgcgg ctgcaggccc tgaaggagga gcctcagaca gtgcccgaga     1680
          tgcccggcga gacaccgccc ctgtccccca tcgacatgga gtcccaggag cggatcaagg     1740
          cggagaggaa gcgcatgagg aaccgcatcg ctgcctccaa gtgccgaaaa aggaagctgg     1800
          agagaatcgc ccggctggag gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg     1860
          cgtccacggc caacatgctc agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaacc     1920
          acgttaacag tgggtgccaa ctcatgctaa cgcagcagtt gcaaacattt tgaagagaga     1980
          ccgtcggggg ctgaggggca acgaagaaaa aaaataacac agagagacag acttgagaac     2040
          ttgacaagtt gcgacggaga gaaaaaagaa gtgtccgaga actaaagcca agggtatcca     2100
          agttggactg ggttgcgtcc tgacggcgcc cccagtgtgc acgagtggga aggacttggc     2160
          gcgccctccc ttggcgtgga gccagggagc ggccgcctgc gggctgcccc gctttgcgga     2220
          cgggctgtcc ccgcgcgaac ggaacgttgg acttttcgtt aacattgacc aagaactgca     2280
          tggacctaac attcgatctc attcagtatt aaagggggga gggggagggg gttacaaact     2340
          gcaatagaga ctgtagattg cttctgtagt actccttaag aacacaaagc ggggggaggg     2400
          ttggggaggg gcggcaggag ggaggtttgt gagagcgagg ctgagcctac agatgaactc     2460
          tttctggcct gccttcgtta actgtgtatg tacatatata tattttttaa tttgatgaaa     2520
          gctgattact gtcaataaac agcttcatgc ctttgtaagt tatttcttgt ttgtttgttt     2580
          gggtatcctg cccagtgttg tttgtaaata agagatttgg agcactctga gtttaccatt     2640
          tgtaataaag tatataattt ttttatgttt tgtttctgaa aattccagaa aggatattta     2700
          agaaaataca ataaactatt ggaaagtact cccctaacct cttttctgca tcatctgtag     2760
          atactagcta tctaggtgga gttgaaagag ttaagaatgt cgattaaaat cactctcagt     2820
          gcttcttact attaagcagt aaaaactgtt ctctattaga ctttagaaat aaatgtacct     2880
          gatgtacctg atgctatggt caggttatac tcctcctccc ccagctatct atatggaatt     2940
          gcttaccaaa ggatagtgcg atgtttcagg aggctggagg aaggggggtt gcagtggaga     3000
          gggacagccc actgagaagt caaacatttc aaagtttgga ttgtatcaag tggcatgtgc     3060
          tgtgaccatt tataatgtta gtagaaattt tacaataggt gcttattctc aaagcaggaa     3120
          ttggtggcag attttacaaa agatgtatcc ttccaatttg gaatcttctc tttgacaatt     3180
          cctagataaa aagatggcct ttgcttatga atatttataa cagcattctt gtcacaataa     3240
          atgtattcaa ataccaa                                                    3257
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          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  表皮生長因子受體蛋白opt (EGFRopt)]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile 
                      20                  25                  30          
          Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe 
                  35                  40                  45              
          Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr 
              50                  55                  60                  
          Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile 
                      100                 105                 110         
          Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp 
              130                 135                 140                 
          Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu 
                          165                 170                 175     
          Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser 
                      180                 185                 190         
          Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu 
                  195                 200                 205             
          Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln 
              210                 215                 220                 
          Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro 
                          245                 250                 255     
          His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr 
                      260                 265                 270         
          Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His 
                  275                 280                 285             
          Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro 
              290                 295                 300                 
          Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg 
                          325                 330                 335     
          Arg Arg 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          000
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          <![CDATA[<211>  353]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot: P01876, IGHA1_HUMAN, 免疫球蛋白重鏈恒定α1]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 
                          85                  90                  95      
          Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser 
                  115                 120                 125             
          Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys 
                      180                 185                 190         
          Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr 
                  195                 200                 205             
          Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn 
              210                 215                 220                 
          Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser 
                          245                 250                 255     
          Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro 
                      260                 265                 270         
          Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly 
                  275                 280                 285             
          Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp 
              290                 295                 300                 
          Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro 
                          325                 330                 335     
          Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys 
                      340                 345                 350         
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  340]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot P01877, IGHA2_HUMAN, 免疫球蛋白重鏈恒定α2]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr 
          1               5                   10                  15      
          Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln Asp 
                          85                  90                  95      
          Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro 
                      100                 105                 110         
          Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr 
                      180                 185                 190         
          Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln 
                          245                 250                 255     
          Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro 
                      260                 265                 270         
          Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala 
                  275                 280                 285             
          Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His 
              290                 295                 300                 
          Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp 
                          325                 330                 335     
          Gly Thr Cys Tyr 
                      340 
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  398]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot P01665, GCAM_MOUSE, 免疫球蛋白γ2A鏈C區域]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly 
                  35                  40                  45              
          Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser 
              50                  55                  60                  
          Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile 
                          85                  90                  95      
          Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val 
              130                 135                 140                 
          Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 
                      180                 185                 190         
          Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 
                  195                 200                 205             
          Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 
              210                 215                 220                 
          Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 
                          245                 250                 255     
          Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 
                      260                 265                 270         
          Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 
                  275                 280                 285             
          Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 
              290                 295                 300                 
          Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Leu Asp Leu Asp Asp Val Cys Ala 
                          325                 330                 335     
          Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile 
                      340                 345                 350         
          Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Ser Val Thr 
                  355                 360                 365             
          Leu Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Glu Leu Lys Gln 
              370                 375                 380                 
          Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala 
          385                 390                 395             
          <![CDATA[<210>  8]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot P01857, IGHG1_HUMAN, 免疫球蛋白重鏈恒定γ1]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot P01859, IGHG2_HUMAN, 免疫球蛋白重鏈恒定γ2]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
              130                 135                 140                 
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 
                      180                 185                 190         
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
                      260                 265                 270         
          Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
                  275                 280                 285             
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325     
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  377]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot P01860, IGHG3_HUMAN, 免疫球蛋白重鏈恒定γ3]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 
                      100                 105                 110         
          Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 
                  115                 120                 125             
          Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 
              130                 135                 140                 
          Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      180                 185                 190         
          Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 
                  195                 200                 205             
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              210                 215                 220                 
          Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                          245                 250                 255     
          Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 
                      260                 265                 270         
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 
                  275                 280                 285             
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
              290                 295                 300                 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                          325                 330                 335     
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 
                      340                 345                 350         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 
                  355                 360                 365             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot P01861, IGHG4, 免疫球蛋白重鏈恒定γ4]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                          245                 250                 255     
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 
              290                 295                 300                 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 
                          325         
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  384]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot P01880, IGHD_HUMAN, 免疫球蛋白重鏈恒定δ]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg 
          1               5                   10                  15      
          His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly 
                      20                  25                  30          
          Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu 
                          85                  90                  95      
          Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro 
                      100                 105                 110         
          Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala 
                  115                 120                 125             
          Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val 
                      180                 185                 190         
          Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly 
                  195                 200                 205             
          Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser 
              210                 215                 220                 
          Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro 
                      260                 265                 270         
          Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala 
                  275                 280                 285             
          Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile 
              290                 295                 300                 
          Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala 
                          325                 330                 335     
          Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala 
                  355                 360                 365             
          Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys 
              370                 375                 380                 
          <![CDATA[<210>  13]]>
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          <![CDATA[<223>  Uniprot P01854, IGHE_HUMAN, 免疫球蛋白重恒定鏈ε]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu 
                  35                  40                  45              
          Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp 
                          85                  90                  95      
          Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro 
                  115                 120                 125             
          Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser 
                          165                 170                 175     
          Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys 
                  195                 200                 205             
          Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro 
              290                 295                 300                 
          His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly 
                          325                 330                 335     
          Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro 
                      340                 345                 350         
          Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe 
              370                 375                 380                 
          Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln 
                          405                 410                 415     
          Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 
                      420                 425             
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  453]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Uniprot P01871, IGHM_HUMAN, 免疫球蛋白重鏈恒定μ]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp 
                      20                  25                  30          
          Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser 
                  35                  40                  45              
          Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg 
                  115                 120                 125             
          Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile 
              130                 135                 140                 
          Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr 
                          165                 170                 175     
          Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln 
                      180                 185                 190         
          Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln 
                  195                 200                 205             
          Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val 
              210                 215                 220                 
          Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn 
                      260                 265                 270         
          Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala 
                  275                 280                 285             
          Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr 
              290                 295                 300                 
          Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro 
                          325                 330                 335     
          Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu 
                      340                 345                 350         
          Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg 
                  355                 360                 365             
          Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro 
              370                 375                 380                 
          Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala 
                          405                 410                 415     
          His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser 
                      420                 425                 430         
          Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr 
                  435                 440                 445             
          Ala Gly Thr Cys Tyr 
              450             
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  間隔物1]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類Igκ信號肽]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Tyr Gly 
                      20  
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GM-CSF信號肽]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Phe Leu Leu Ile Pro 
                      20          
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EGFR信號肽]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala 
                      20                  
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類CD33信號肽]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  2]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  其中Gly可以1至100之整數重複。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  其中序列可以1至100之整數重複。]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Gly Ser 
          1       
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  2]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (0)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  其中Ser可以1至100之整數重複。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  其中Gly可以1至4之整數重複。]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  其中序列可以1至50之整數重複。]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Gly Ser 
          1       
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  1]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  其中Gly可在1至100之間重複。]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Gly 
          1   
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  2]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  其中Gly Ala可在1與100之間重複。]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Gly Ala 
          1       
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Gly Gly Gly Gly 
          1               
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  其中序列可以1與100之間之整數重複。]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  其中序列可以1與100之間之整數重複。]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  其中序列可以1與100之間之整數重複。]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Gly Gly Gly Ser 
          1               
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  其中序列可以1與100之間之整數重複。]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Gly Gly Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Gly Ser Gly Ser Gly Ser 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P2A]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 
          1               5                   10                  15      
          Pro Gly Pro 
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  T2A]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro 
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  F2A]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Glu Ser Asn Pro Gly Pro 
                      20          
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  E2A]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Asn Pro Gly Pro 
                      20  
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  弗林蛋白酶裂解位點]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Arg Ala Lys Arg 
          1               
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  其中序列可以等于或大于1之正整數重複]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VH]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val 
              50                  55                  60                  
          Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VH CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Ala Tyr Tyr Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VH CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VH CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VL]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met 
                  35                  40                  45              
          Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VL CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VL CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VL CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  248]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 scFv]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val 
              50                  55                  60                  
          Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr 
                      180                 185                 190         
          Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala 
              210                 215                 220                 
          Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly 
                          245             
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  42]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB共刺激域]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
          1               5                   10                  15      
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 
                  35                  40          
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28跨膜域]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 
                      20                  25              
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3ζ活化域]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  p2A]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 
                      20              
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  1198]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  c-jun-抗ROR1 CAR]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 
                  35                  40                  45              
          Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 
                  275                 280                 285             
          Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe Gly Ser Gly Ala Thr 
                          325                 330                 335     
          Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 
                      340                 345                 350         
          Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile 
                  355                 360                 365             
          Ser Gly Ala Tyr Gly Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu 
              370                 375                 380                 
          Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 
                          405                 410                 415     
          Gly Leu Glu Trp Ile Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr 
                      420                 425                 430         
          Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala 
                  435                 440                 445             
          Gln Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg 
              450                 455                 460                 
          Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly 
                          485                 490                 495     
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val 
                      500                 505                 510         
          Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp 
              530                 535                 540                 
          Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val Gln 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
                          565                 570                 575     
          Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val Gln 
                      580                 585                 590         
          Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly 
                  595                 600                 605             
          Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly Gly Gly Gly 
              610                 615                 620                 
          Ser Gly Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Met Phe Trp Val Leu 
          625                 630                 635                 640 
          Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val 
                          645                 650                 655     
          Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 
                      660                 665                 670         
          Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 
                  675                 680                 685             
          Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 
              690                 695                 700                 
          Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 
                          725                 730                 735     
          Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 
                      740                 745                 750         
          Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 
                  755                 760                 765             
          Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 
              770                 775                 780                 
          Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 
          785                 790                 795                 800 
          Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 
                          805                 810                 815     
          Arg Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 
                      820                 825                 830         
          Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu 
                  835                 840                 845             
          Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys 
              850                 855                 860                 
          Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala 
          865                 870                 875                 880 
          Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu 
                          885                 890                 895     
          His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro 
                      900                 905                 910         
          Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile 
                  915                 920                 925             
          Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu 
              930                 935                 940                 
          His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His 
          945                 950                 955                 960 
          Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly 
                          965                 970                 975     
          Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly 
                      980                 985                 990         
          Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn  Thr Ile Asn Trp Lys  Lys Leu Phe 
                  995                 1000                 1005             
          Gly Thr  Ser Gly Gln Lys Thr  Lys Ile Ile Ser Asn  Arg Gly Glu 
              1010                 1015                 1020             
          Asn Ser  Cys Lys Ala Thr Gly  Gln Val Cys His Ala  Leu Cys Ser 
              1025                 1030                 1035             
          Pro Glu  Gly Cys Trp Gly Pro  Glu Pro Arg Asp Cys  Val Ser Cys 
              1040                 1045                 1050             
          Arg Asn  Val Ser Arg Gly Arg  Glu Cys Val Asp Lys  Cys Asn Leu 
              1055                 1060                 1065             
          Leu Glu  Gly Glu Pro Arg Glu  Phe Val Glu Asn Ser  Glu Cys Ile 
              1070                 1075                 1080             
          Gln Cys  His Pro Glu Cys Leu  Pro Gln Ala Met Asn  Ile Thr Cys 
              1085                 1090                 1095             
          Thr Gly  Arg Gly Pro Asp Asn  Cys Ile Gln Cys Ala  His Tyr Ile 
              1100                 1105                 1110             
          Asp Gly  Pro His Cys Val Lys  Thr Cys Pro Ala Gly  Val Met Gly 
              1115                 1120                 1125             
          Glu Asn  Asn Thr Leu Val Trp  Lys Tyr Ala Asp Ala  Gly His Val 
              1130                 1135                 1140             
          Cys His  Leu Cys His Pro Asn  Cys Thr Tyr Gly Cys  Thr Gly Pro 
              1145                 1150                 1155             
          Gly Leu  Glu Gly Cys Pro Thr  Asn Gly Pro Lys Ile  Pro Ser Ile 
              1160                 1165                 1170             
          Ala Thr  Gly Met Val Gly Ala  Leu Leu Leu Leu Leu  Val Val Ala 
              1175                 1180                 1185             
          Leu Gly  Ile Gly Leu Phe Met  Arg Arg Arg 
              1190                 1195             
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  4022]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA構築體]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca gagagacagc       60
          agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag      120
          aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc      180
          cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga      240
          gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga      300
          actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata      360
          aaagagccca caacccctca ctcggcgcga tcagaacctc ttacgagtcg gctagcgccg      420
          ccaccatgac agccaagatg gaaaccacat tctacgacga cgccctgaac gcctcattcc      480
          tgccttctga gagcggacct tacggctaca gcaatcctaa gatcctgaaa cagagcatga      540
          cccttaacct ggctgatcct gttggaagcc tgaaacctca cctgagagcc aaaaacagcg      600
          acctgctcac cagccctgat gtgggcctgc tgaagctggc ctctccagag ctggaacggc      660
          tgatcatcca gagcagcaac ggccacatca caaccacccc tacccctaca caattcctgt      720
          gccctaagaa cgtgaccgac gagcaggagg gcttcgccga aggctttgtg cgggccctgg      780
          cagaactgca ctctcagaac accctgccta gcgtgacctc cgccgcccag cctgtcaacg      840
          gcgccggaat ggtggcccct gccgtggctt ctgtggccgg cggcagcggc agcggcggat      900
          tcagcgcctc tctgcactct gagcctcctg tctacgccaa tctgtctaat ttcaaccccg      960
          gagccctgtc cagcggcggc ggagctccta gctacggcgc tgctggactg gccttccccg     1020
          cccagcccca gcaacagcag cagcctccac accacctgcc ccagcagatg cccgtgcagc     1080
          accctagact gcaggccctg aaggaagaac cccaaacagt gcctgagatg cctggcgaga     1140
          cacctccact gagccccatc gacatggaaa gccaggagcg gatcaaggcc gagagaaaga     1200
          gaatgcggaa cagaatcgcc gctagcaagt gcagaaagcg gaagctggaa agaatcgcca     1260
          gactggaaga gaaggtgaag accctgaaag cccaaaatag cgagctggcc agcaccgcca     1320
          acatgctgcg ggaacaggtg gcccagctga agcagaaggt gatgaaccac gtgaactctg     1380
          gttgtcagct gatgctgacc cagcagctcc agaccttcgg ctccggtgca acgaacttca     1440
          gcctgctgaa gcaggccgga gatgttgagg aaaatccagg tcccatggtc ttgcagactc     1500
          aagtatttat atcccttttg ctctggatct ctggagctta cggccaggaa cagctcgtcg     1560
          aaagcggcgg cagactggtg acacctggcg gcagcctgac cctgagctgc aaggccagcg     1620
          gcttcgactt cagcgcctac tacatgagct gggtccgcca ggcccctggc aagggactgg     1680
          aatggatcgc caccatctac cccagcagcg gcaagaccta ctacgccacc tgggtgaacg     1740
          gacggttcac catctccagc gacaacgccc agaacaccgt ggacctgcag atgaacagcc     1800
          tgacagccgc cgaccgggcc acctactttt gcgctcggga cagctacgcc gacgacggcg     1860
          ccctgttcaa catctggggc cctggcaccc tggtgacaat ctctagcggc ggaggcggat     1920
          ctggtggcgg aggaagtggc ggcggaggat ctgagctggt gctgacccag agcccctctg     1980
          tgtctgctgc cctgggaagc cctgccaaga tcacctgtac cctgagcagc gcccacaaga     2040
          ccgacaccat cgactggtat cagcagctgc agggcgaggc ccccagatac ctgatgcagg     2100
          tgcagagcga cggcagctac accaagaggc caggcgtgcc cgacaggttc agcggatcta     2160
          gctctggcgc cgaccgctac ctgatcatcc ccagcgtgca ggccgatgac gaggccgatt     2220
          actactgtgg cgccgactac atcggcggct acgtgttcgg cggaggcacc cagctgaccg     2280
          tgaccggtgg cggaggttca ggcaaaccgt gccctccgtg caagtgtcct atgttctggg     2340
          tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc gtggccttca     2400
          tcatcttttg ggtgaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta     2460
          tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag     2520
          aagaaggagg atgtgaactg cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc     2580
          agcagggcca gaatcagctg tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg     2640
          tcctggataa gcggagaggc cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc     2700
          cccaggaagg cctgtataac gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga     2760
          tcggcatgaa gggcgagcgg aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt     2820
          ccaccgccac caaggatacc tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaaggtccg     2880
          gagccactaa cttctccctg ttgaaacaag caggggatgt cgaagagaat cccgggccaa     2940
          tgcttctcct ggtgacaagc cttctgctct gtgaattacc acacccagca ttcctcctga     3000
          tcccacgcaa agtgtgcaac ggaataggta ttggtgaatt taaggactca ctctccataa     3060
          atgctacgaa tattaaacac ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc     3120
          tgccggtggc atttaggggt gactccttca cacatactcc tcctctggac ccacaagaac     3180
          tggatattct gaaaaccgta aaggaaatca cagggttttt gctgattcaa gcttggcctg     3240
          aaaacaggac ggacctccat gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc     3300
          agcatggaca gttttctctt gctgtcgtga gcctgaacat aacatccttg ggattacgct     3360
          ccctcaagga gataagtgat ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg     3420
          caaatacaat aaactggaaa aaactgtttg ggacctccgg ccagaaaacc aaaattataa     3480
          gcaacagagg cgaaaacagc tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc     3540
          ccgagggctg ctggggcccg gagcccaggg attgcgtgtc ttgccggaat gtcagccgag     3600
          gcagggaatg cgtggacaag tgcaaccttc tggaaggcga gccaagggag tttgtggaga     3660
          actctgagtg catacagtgc cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca     3720
          caggacgggg accagacaac tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg     3780
          tcaagacctg cccggcagga gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag     3840
          acgccggcca tgtgtgccac ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag     3900
          gtcttgaagg ctgtccaacg aacgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg     3960
          gggccctcct cttgctgctg gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg cgccgaaggt     4020
          ga                                                                    4022
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  352]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P2A裂解之後的c-Jun]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 
                  35                  40                  45              
          Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 
                  275                 280                 285             
          Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe Gly Ser Gly Ala Thr 
                          325                 330                 335     
          Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 
                      340                 345                 350         
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P2A裂解之後的hIgK]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          Pro Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ser Gly Ala Tyr Gly 
                      20      
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  133]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P2A裂解之後的CD3z]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Asn Pro Gly Pro 
              130             
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P2A裂解之後的GMCSFR-α-SP]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro 
                      20              
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ser 
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  386]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(artificial sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MND啓動子]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca gagagacagc       60
          agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag      120
          aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc      180
          cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga      240
          gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga      300
          actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata      360
          aaagagccca caacccctca ctcggc                                           386

Claims

一種編碼包含c-Jun多肽(c-jun)、ROR1結合蛋白及截短EGF受體(EGFRt)之嵌合多肽的多核苷酸。
如請求項1之多核苷酸，其中該c-Jun多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項2之多核苷酸，其中當該嵌合多肽在該細胞中表現時，該c-Jun多肽能夠防止或減少細胞之耗竭。
如請求項中1至3中任一項之多核苷酸，其中該ROR1結合蛋白包含特異性結合至ROR1之嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
如請求項4之多核苷酸，其中該CAR包含特異性結合至ROR1之抗體或其抗原結合部分。
如請求項4或5之多核苷酸，其中該ROR1結合蛋白特異性結合至與R12抗體相同之抗原決定基。
如請求項6之多核苷酸，其中該ROR1結合蛋白包含有包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的輕鏈可變區(VL)。
如請求項7之多核苷酸，其中該VH CDR1包含SEQ ID NO：45，VH CDR2包含SEQ ID NO：46，並且VH CDR3包含SEQ ID NO：47。
如請求項7或8之多核苷酸，其中該VL CDR1包含SEQ ID NO：49，VL CDR2包含SEQ ID NO：50，並且VL CDR3包含SEQ ID NO：51。
如請求項6或7之多核苷酸，其中該ROR1結合部分之VH包含SEQ ID NO：44並且該ROR1結合部分之VL包含SEQ ID NO：48。
如請求項10之多核苷酸，其中該ROR1結合部分包含與SEQ ID NO：52具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項4至11中任一項之多核苷酸，其中該CAR進一步包含跨膜(TM)域。
如請求項12之多核苷酸，其中該TM域衍生自CD8a、CD2、CD4、CD28、CD45、PD1、CD152，或其任何組合。
如請求項12之多核苷酸，其中該TM域衍生自CD28。
如請求項14之多核苷酸，其中該TM域包含與SEQ ID NO：54具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項12至15中任一項之多核苷酸，其中該CAR進一步包含特異性結合至ROR1之抗體或其抗原結合部分與TM域之間的間隔基。
如請求項16之多核苷酸，其中該間隔基衍生自免疫球蛋白鉸鏈區或CD8。
如請求項16之多核苷酸，其中該間隔基包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列。
如請求項16至18中任一項之多核苷酸，其中該間隔基進一步包含連接子。
如請求項19之多核苷酸，其中該連接子包含GGGSG (SEQ ID NO: 16)。
如請求項4至20中任一項之多核苷酸，其中該CAR進一步包含細胞內信號轉導域。
如請求項21之多核苷酸，其中該細胞內信號轉導域包含CD3 ζ活化域、CD3δ活化域、CD3ε活化域、CD3η活化域、CD79A活化域、DAP 12活化域、FCER1G活化域、DAP10/CD28活化域、ZAP70活化域，或其任何組合。
如請求項21之多核苷酸，其中該細胞內信號轉導域包含CD3 ζ活化域。
如請求項23之多核苷酸，其中該CD3 ζ活化域包含與SEQ ID NO：55具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或至少約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項4至23中任一項之多核苷酸，其中該CAR包含細胞內共刺激信號轉導區域。
如請求項25之多核苷酸，其中該細胞內共刺激信號轉導域包含以下各者之共刺激域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、Lck結合缺失CD28(ICA)、OX40、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TILR2、TILR4、TILR7、TILR9、Fc受體γ鏈、Fc受體ε鏈、與CD83特異性結合之配位體，或其任何組合。
如請求項25之多核苷酸，其中該細胞內信號轉導域包含4-1BB共刺激域。
如請求項27之多核苷酸，其中該4-1BB共刺激域包含與SEQ ID NO：53具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或至少約100%序列一致性的胺基酸序列。
一種包含編碼嵌合抗原受體之核苷酸序列的多核苷酸，該嵌合抗原受體包含(i)ROR1結合蛋白、(ii)包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的間隔基、(iii)CD28跨膜蛋白質、(iv)4-1BB共刺激區域，及(v)CD3 ζ活化域。
一種包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列的多核苷酸，該嵌合抗原受體包含(i)包含有包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的輕鏈可變區(VL)的ROR1結合蛋白；(ii)包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列之間隔基；及(iii)編碼截短EGF受體(EGFRt)之核苷酸序列。
如請求項30之多核苷酸，其中該ROR1結合部分之VH包含SEQ ID NO：44並且該ROR1結合部分之VL包含SEQ ID NO：48。
如請求項30或31之多核苷酸，其中該EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項29至32中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸進一步包含編碼c-Jun多肽之核苷酸序列。
如請求項1至28及33中任一項之多核苷酸，其中編碼c-jun多肽之核苷酸序列及編碼CAR之核苷酸序列在同一載體上。
如請求項34之多核苷酸，其中該c-jun多肽及該CAR藉由連接子來連接。
如請求項35之多核苷酸，其中該連接子為可裂解連接子。
如請求項35之多核苷酸，其中該連接子包含P2A連接子、T2A連接子，或其任何組合。
如請求項1至28及33中任一項之多核苷酸，其中編碼c-jun多肽之核苷酸序列及編碼CAR之核苷酸序列在不同載體上。
如請求項1至28及33至38中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸進一步包含編碼截短EGF受體(EGFRt)之核苷酸序列。
如請求項39之多核苷酸，其中編碼截短EGF受體(EGFRt)之核苷酸序列及編碼CAR之核苷酸序列在同一載體上。
如請求項40之多核苷酸，其中該EGFRt及該CAR藉由連接子來連接。
如請求項41之多核苷酸，其中該連接子為可裂解連接子。
如請求項42之多核苷酸，其中該連接子包含P2A連接子、T2A連接子，或其任何組合。
如請求項1至43中任一項之多核苷酸，其中該CAR進一步包含信號肽。
如請求項44之多核苷酸，其中該信號肽衍生自hIgK。
如請求項45之多核苷酸，其中該hIgK信號肽包含如SEQ ID NO：17闡述之胺基酸序列。
如請求項1-46中任一項之多核苷酸，其中該EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項1至47中任一項之多核苷酸，其進一步包含骨髓增生性肉瘤病毒增強子、負控制區域缺失，dl587rev引子結合位點取代(MND)啟動子、EF1a啟動子，及/或泛素啟動子。
如請求項48之多核苷酸，其中該MND啟動子包含與SEQ ID NO：64具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項1至49中任一項之多核苷酸，其包含編碼與SEQ ID NO：58具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列的核苷酸序列。
一種編碼CAR之多核苷酸，其包含編碼與SEQ ID NO：57具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列的核苷酸序列。
一種載體，其包含如請求項1至51中任一項之多核苷酸。
一種藉由如請求項1至51中任一項之多核苷酸或如請求項52之載體來編碼的多肽。
一種嵌合抗原受體(CAR)多肽，其包含(i)ROR1結合抗體或其抗原結合部分、(ii)包含如SEQ ID NO：15中所闡述之胺基酸序列的間隔基、(iii)CD28跨膜蛋白質、(iv)4-1BB共刺激區域，及(v)CD3 ζ活化域。
如請求項54之多肽，其中該ROR1結合抗體或其抗原結合部分特異性結合至與R12抗體相同的抗原決定基。
如請求項55之多肽，其中該ROR1結合抗體或其抗原結合部分包含有包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的重鏈可變區(VH)及包含R12抗體之CDR1、CDR2，及CDR3的輕鏈可變區(VL)。
如請求項56之多肽，其中該VH CDR1包含SEQ ID NO: 45，VH CDR2包含SEQ ID NO: 46，並且VH CDR3包含SEQ ID NO: 47。
如請求項56或57之多肽，其中該VL CDR1包含SEQ ID NO: 49，VL CDR2包含SEQ ID NO: 50，並且VL CDR3包含SEQ ID NO: 51。
如請求項57或58之多肽，其中該ROR1結合抗體或其抗原結合部分之VH包含SEQ ID NO：44並且ROR1結合部分之VL包含SEQ ID NO：48。
如請求項53至59之多肽，其中該ROR1結合抗體或其抗原結合部分包含與SEQ ID NO：52具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項53至60中任一項之多肽，其中該多肽進一步包含跨膜(TM)域。
如請求項61之多肽，其中該CD28 TM域包含與SEQ ID NO：54具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項53至62中任一項之多肽，其中該CD3 ζ活化域包含與SEQ ID NO：55具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或至少約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項53至63中任一項之多肽，其中該4-1BB共刺激域包含與SEQ ID NO：53具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或至少約100%序列一致性的胺基酸序列。
一種包含c-Jun多肽(c-jun)、CAR多肽及截短EGF受體(EGFRt)的嵌合多肽。
如請求項65之嵌合多肽，其中該CAR多肽包括如請求項53至64中任一項。
如請求項65或66之嵌合多肽，其中該c-Jun多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項65至67中任一項之嵌合多肽，其中當該嵌合多肽在該細胞中表現時，該c-Jun多肽能夠防止或減少細胞之耗竭。
如請求項65至68中任一項之嵌合多肽，其中該c-jun多肽及該CAR多肽在同一載體上。
如請求項69之嵌合多肽，其中該c-jun多肽及該CAR多肽藉由連接子來連接。
如請求項70之嵌合多肽，其中該連接子為可裂解連接子。
如請求項71之嵌合多肽，其中該連接子包含P2A連接子、T2A連接子，或其任何組合。
如請求項65至67中任一項之嵌合多肽，其中該c-jun多肽及該CAR多肽在不同載體上。
如請求項65至73之嵌合多肽，其中該截短EGF受體(EGFRt)及該CAR在同一載體上。
如請求項74之嵌合多肽，其中該EGFRt及該CAR藉由連接子來連接。
如請求項75之嵌合多肽，其中該連接子為可裂解連接子。
如請求項76之嵌合多肽，其中該連接子包含P2A連接子、T2A連接子，或其任何組合。
如請求項65至77中任一項之嵌合多肽，其中該EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項65至78中任一項之嵌合多肽，其包含與SEQ ID NO：52具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
一種包含與SEQ ID NO：52具有至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性之胺基酸序列的嵌合多肽。
如請求項65至80中任一項之嵌合多肽，其中該CAR多肽進一步包含信號肽。
如請求項81之嵌合多肽，其中該信號肽衍生自hIgK。
如請求項82之嵌合多肽，其中該hIgK信號肽包含如SEQ ID NO：17闡述之胺基酸序列。
一種經修飾之細胞，其包含如請求項1至51中任一項之多核苷酸、如請求項52之載體、如請求項53至64中任一項之多肽、如請求項65至83中任一項之嵌合多肽，或其任何組合。
一種包含c-jun多肽、嵌合抗原受體(CAR)多肽及截短EGF受體(EGFRt)的經修飾之細胞。
如請求項85之經修飾之細胞，其中該CAR多肽包含如請求項53至64中任一項之多肽。
如請求項85或86之經修飾之細胞，其中該CAR多肽及該EGFRt在該細胞表面上表現。
如請求項84至87中任一項之經修飾之細胞，其中該細胞為免疫細胞。
如請求項88之經修飾之細胞，其中該細胞為T細胞、B細胞、調控T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、幹細胞、誘導多能幹細胞，及其任何組合。
如請求項83至89中任一項之經修飾之細胞，其中該細胞在活體外或離體工程化。
如請求項83至90中任一項之經修飾之細胞，其中該細胞在活體外或離體培養。
如請求項84至91中任一項之經修飾之細胞，其中與未修飾以便包含如請求項1至51中任一項之多核苷酸、如請求項52之載體、如請求項53至64中任一項之多肽，或如請求項65至83中任一項之嵌合多肽的對應細胞相比，該c-Jun多肽之表現增加。
如請求項92之經修飾之細胞，其中與對應細胞相比，c-Jun多肽之表現增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍，或至少約1,000倍或更大。
一種包含c-Jun多肽、嵌合抗原受體(CAR)多肽及截短EGF受體(EGFRt)的免疫細胞之群體，其中如與不包含c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，該群體包含減少數目之TIGIT陽性免疫細胞。
如請求項94之免疫細胞之群體，其中與該參照群體相比，該抗原刺激之後存在於該群體中之TIGIT陽性免疫細胞之數目減少至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%，或至少約60%。
如請求項94或95之免疫細胞之群體，其在該抗原刺激之後，包含少於約15%、少於約14%、少於約13%、少於約12%、少於約11%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%，或少於約5%的TIGIT陽性免疫細胞。
一種包含c-Jun多肽、嵌合抗原受體(CAR)多肽及截短EGF受體(EGFRt)的免疫細胞之群體，其中如與不包含c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，該群體包含減少數目之TNFRSF9陽性免疫細胞。
如請求項97之免疫細胞之群體，其中與該參照群體相比，該抗原刺激之後，存在於該群體中之TNFRSF9陽性免疫細胞之數目減少至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%，或至少約70%。
如請求項97或98之免疫細胞之群體，其在該抗原刺激之後，包含少於約5%、少於約4.5%、少於約4%、少於約3.5%，或少於約2%之TNFRSF9陽性免疫細胞。
一種包含c-Jun多肽、嵌合抗原受體(CAR)多肽及截短EGF受體(EGFRt)的免疫細胞之群體，其中如與不包含c-Jun多肽的對應細胞之參照群體相比，在抗原刺激之後，該群體包含減少數目之GZMA陽性免疫細胞。
如請求項100之免疫細胞之群體，其中與該參照群體相比，該抗原刺激之後，存在於該群體中之GZMA陽性免疫細胞之數目減少至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%，或至少約20%。
如請求項100或101之免疫細胞之群體，其在抗原刺激之後，包含少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%，或少於約10%之GZMA陽性免疫細胞。
如請求項94至102中任一項之免疫細胞之群體，其中該CAR多肽包括如請求項54至64中任一項之CAR多肽。
如請求項94至103中任一項之免疫細胞之群體，其中該c-Jun多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項94至104中任一項之免疫細胞之群體，其中該EGFRt包含與SEQ ID NO：3具有至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或約100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項94至105中任一項之免疫細胞之群體，其中該等免疫細胞包含T細胞、B細胞、調控T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、幹細胞、誘導多能幹細胞，或其組合。
如請求項106之免疫細胞之群體，其中該等免疫細胞為T細胞。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至51中任一項之多核苷酸、如請求項52之載體、如請求項53至64中任一項之多肽、如請求項65至83中任一項之嵌合多肽，或如請求項84至93中任一項之經修飾之細胞及醫藥學上可接受之載劑。
一種製備表現嵌合抗原受體之細胞的方法，其包括將細胞用如請求項1至51中任一項之多核苷酸或如請求項52之載體來轉染。
一種製備表現嵌合抗原受體之細胞的方法，其包括在細胞中表現如請求項53至64中任一項之多肽或如請求項65至83中任一項之嵌合多肽。
如請求項109或110之方法，其中該細胞包括T細胞、B細胞、調控T細胞(Treg)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、幹細胞、誘導多能幹細胞，及其任何組合。
如請求項109至111中任一項之方法，其中該細胞在活體外或離體培養。
一種擴增表現嵌合抗原受體之細胞的方法，其包括在合適條件下培養細胞，該細胞包含如請求項1至51中任一項之多核苷酸或如請求項52之載體或表現如請求項中53至64任一項之多肽或如請求項65至83中任一項之嵌合多肽。
一種治療有需要之受試者之腫瘤的方法，其包括向該受試者投與免疫細胞，其過度表現c-Jun多肽並且包含嵌合抗原受體(CAR)及截短EGF受體(EGFRt)，其中該CAR對於在該腫瘤中表現之抗原具有特異性。
如請求項114之方法，其中該免疫細胞包含如請求項84至93中任一項之經修飾之細胞。
如請求項114或115之方法，其中該腫瘤衍生自癌症，包括乳癌、頭頸癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、甲狀腺癌、食管癌、眼癌、胃癌、胃腸癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，或其組合。
如請求項114至116中任一項之方法，其中該腫瘤為實體腫瘤。
如請求項114至117中任一項之方法，其進一步包括向該受試者投與至少一種額外治療劑。
如請求項118之方法，其中該至少一種額外治療劑包括化療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子之活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法，或其任何組合。
如請求項119之方法，其中該免疫檢查點抑制劑包括抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗GITR抗體、抗TIM3抗體，或其任何組合。
如請求項114至120中任一項之方法，其中與參照腫瘤大小相比，在投與該之後，該腫瘤之大小(腫瘤大小)降低。
如請求項121之方法，其中該參照腫瘤大小包括：(i)投與之前的腫瘤大小，(ii)未接受投與( 例如，接受不過度表現c-Jun多肽之對應免疫細胞之投與)的對應受試者中之腫瘤大小，或(iii)同時(i)及(ii)。
如請求項121或122之方法，其中與該參照腫瘤大小相比，該腫瘤大小降低至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。
如請求項114至123中任一項之方法，其中與參照存活持續時間相比，該投與之後，該受試者之存活持續時間增加。
如請求項124之方法，其中該參照存活持續時間包含未接受投與( 例如，接受不過度表現該c-Jun多肽之對應免疫細胞之投與)的對應受試者之存活持續時間。
如請求項124或125之方法，其中與該參照存活持續時間相比，該存活持續時間增加至少約一週、至少約兩週、至少約三週、至少約一個月、至少約兩個月、至少約三個月、至少約四個月、至少約五個月、至少約六個月、至少約七個月、至少約八個月、至少約九個月、至少約10個月、至少約11個月，或至少約一年。
如請求項114至126中任一項之方法，其中與不過度表現該c-Jun多肽之對應免疫細胞相比，該投與之後，該免疫細胞能夠在該受試者中持續更長時間。
如請求項127之方法，其中該投與之後，該免疫細胞能夠在受試者中持續比對應免疫細胞長至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月，或至少約6個月。
如請求項127或128之方法，其中在該投與之後約一個月、約兩個月、約三個月、約四個月、約五個月、約六個月、約七個月，或約八個月，如與存在於接受該對應免疫細胞之投與的參照受試者中之該對應免疫細胞相比，存在於該受試者中之免疫細胞為約1倍與約10倍之間。
一種殺滅腫瘤細胞之方法，其包括使該等腫瘤細胞與免疫細胞接觸，該等細胞過度表現c-Jun多肽並且包含嵌合抗原受體(CAR)及截短EGF受體(EGFRt)，其中該CAR對於在該等腫瘤細胞中表現之抗原具有特異性。
如請求項129之方法，其中該免疫細胞包含如請求項84至93中任一項之經修飾之細胞。
如請求項129或130之方法，其中與該等腫瘤細胞與不過度表現該c-Jun多肽之對應免疫細胞接觸的參照方法相比，該等腫瘤細胞之殺滅增加。
如請求項131之方法，其中與該參考細胞相比，該等腫瘤細胞之殺滅增加至少約0.5倍、1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。
一種增加響應於抗原刺激之藉由免疫細胞來產生細胞介素的方法，其包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有該c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準，其中該ROR-1結合蛋白特異性結合至與該R12抗體相同之抗原決定基。
如請求項133之方法，其中該細胞介素包括IFN-γ、IL-2，或兩者。
如請求項134或135之方法，其中與對應免疫細胞相比，該修飾之後，響應於該抗原刺激的該細胞介素之產生增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。
如請求項134至136中任一項之方法，其中該細胞介素之產生之增加使用Meso Scale Discovery (MSD) U-Plex檢定來量測。
一種增加響應於抗原刺激之免疫細胞增殖的方法，其包括修飾該免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有該c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準，其中該ROR-1結合蛋白特異性結合至與該R12抗體相同之抗原決定基。
如請求項137之方法，其中與對應免疫細胞相比，該修飾之後，響應於抗原刺激的該免疫細胞之增殖增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。
如請求項137或138之方法，其中增殖增加導致更大數目之該等免疫細胞。
一種增加響應於持續抗原刺激的免疫細胞之效應物功能的方法，其包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有該c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準，其中該ROR-1結合蛋白特異性結合至與該R12抗體相同之抗原決定基。
如請求項140之方法，其中如與對應免疫細胞相比，該免疫細胞保持效應物功能達抗原刺激檢定之至少一個、至少兩個，或至少三個額外循環。
如請求項140或141之方法，其中該效應物功能包括以下能力：(i)殺滅腫瘤細胞(ii)在進一步抗原刺激後產生細胞介素，或(iii)同時(i)及(ii)。
如請求項140至142中任一項之方法，其中如與對應免疫細胞相比，該免疫細胞之效應物功能增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍，或至少約5倍。
一種減少或防止響應於持續抗原刺激的免疫細胞之耗竭的方法，其包括修飾免疫細胞以便(i)表現ROR-1結合蛋白並且(ii)如與未修飾以便具有該c-Jun多肽之增加水準的對應免疫細胞相比，具有c-Jun多肽之增加水準，其中該ROR-1結合蛋白特異性結合至與該R12抗體相同之抗原決定基。
如請求項144之方法，其中如與對應免疫細胞相比，該修飾之後，響應於該持續抗原刺激，該等免疫細胞表現：(i)與耗竭相關之基因之降低水準，(ii)與活化相關之基因之增加水準，或(iii)同時(i)及(ii)。
如請求項133至145中任一項之方法，其中該免疫細胞經修飾以便包含如請求項6至51中任一項之多核苷酸。