HU224410B1 - Peptid- és adjuvánsalapú gyógyszerkészítmény immunmodulációra - Google Patents

Abstract

A találmány olyan gyógyszerkészítményre vonatkozik, amely egy vagytöbb antigénpeptidet, fehérjét vagy fehérjefragmenst – ahol a peptidekvagy a fehérjékből, illetve fehérjefragmensekből származó megfelelőpeptidek a kezelendő egyén által expresszált legalább egy MHC-molekulakötőhelyére illenek és ahhoz kötődni képesek – és egy, a következőcsoportból kiválasztott adjuvánst – poliarginin, polilizin,poliornitin, amely poliaminosavak előnyösen 15–500 polimerizációsfokúak, hisztonok, protaminok, polietilén-iminek – vagy a nevezettadjuvánsok keverékét és/vagy konjugált formáit tartalmaz, ahol azadjuváns a peptidek, fehérjék vagy fehérjefragmensek a kezelendő egyénsejtjeihez való kötődését növelő, és/vagy a peptidek a kezelendő egyénantigénprezentáló sejtjeibe való belépését elősegítő, és ezáltal apeptidek, fehérjék vagy fehérjefragmensek immunmodulátor-képességétfokozó hatású. A találmány szerinti gyógyszerkészítményektumorvakcinaként alkalmazhatók.

Description

A találmány az immunmoduláció területére vonatkozik.

A jelen találmány egy terápiás vakcina továbbfejlesztése a tumorsejtek alapján, amely lényegében a következő feltételeken alapul: a tumorsejtek és a normálsejtek között fennálló kvalitatív és kvantitatív különbségek; elsődlegesen az immunrendszer rendelkezik azzal a képességgel, hogy ezeket a különbségeket felismerje; az immunrendszer - vakcinákkal történő aktív specifikus immunizáláson keresztül - stimulálható ahhoz, hogy a tumorsejteket ezeknek a különbségeknek az alapján felismerje és kilökődésüket előidézze.

Ahhoz, hogy egy tumorellenes válasz létrejöjjön, legalább két feltételnek kell teljesülnie: először a tumorsejteknek olyan antigéneket kell kifejezni, amelyek a normálsejteken nem vagy csak bizonyos határok között fordulnak elő, hogy az immunrendszer által egy kvalitatív megkülönböztetés a normál- és tumorszövet között lehetséges legyen; másodszor az immunrendszernek megfelelő mértékben aktiváltnak kell lennie ahhoz, hogy ezekre az antigénekre reagálni tudjon. A tumorsejtek immunterápiájánál lényeges hátrány azok csekély immungenicitása, mindenekelőtt emberekben.

Korábban felfedeztek tumorasszociált és tumorspecifikus antigéneket, amelyek ilyen neoepitópokat fejeznek ki, és ezáltal potenciális célhelyeknek kell lenniük az immunrendszer támadására. Hogy az immunrendszernek mégsem sikerült ezeket a neoepitópokat expresszáló tumorokat eliminálnia, ezt nem lehet ezek után egyértelműen a neoepitópok hibájának tulajdonítani, hanem ez arra enged következtetni, hogy ezekre a neoepitópokra adott immunológiai válasz nem kielégítő.

A rákok immunterápiájára celluláris alapon két általános stratégiát fejlesztettek ki: egyrészről az adoptív immunterápiát, amely a tumorreaktív T-limfociták in vitro expanziójára és a betegekben ezek ismételt bevezetésére szolgál; másrészről az aktív immunterápiát, amely tumorsejteket alkalmaz azzal az elvárással, hogy ezáltal új vagy felerősített immunválaszok válthatók ki a tumorantigénekre, amelyek szisztémás tumorválaszhoz vezetnek. Az aktív immunterápia alapján különböző típusú tumorvakcinákat állítottak elő; így például besugárzott tumorsejteket alkalmaztak, amelyeket immunstimuláló adjuvánsokkal, mint például Corynebacterium parvum vagy Bacillus Calmette Guerin (BCG) kevertek össze, hogy a tumorantigének elleni immunreakciót kiváltsák (Oettgen és Old, 1991).

Az utóbbi években mindenekelőtt genetikailag módosított tumorsejteket alkalmaznak a rák elleni aktív immunterápiához. Ezekről a különböző kezdeményezésekről, melyek során a tumorsejteket - tekintettel egy felerősített immungenicitásra a különböző gének bevezetésével - elidegenítették, áttekintést adnak Zatloukal és munkatársai (1993). Az eddig bevezetett stratégiák egyikében olyan tumorsejteket alkalmaznak, amelyeket genetikailag úgy módosítottak, hogy citokineket képesek termelni.

A tumorantigének és tumorasszociált antigének (TAs), valamint az ezekből levezetett peptidek [például melyeket Wölfel és munkatársai, 1994a) és 1994b), Carrel és munkatársai, 1993, Lehmann és munkatársai, 1989, Tibbets és munkatársai, 1993, vagy a WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 és WO 95/00159 számú PCT-beli közrebocsátási iratokban leírtak] azonosítása és izolálása volt az előfeltétele egy további stratégiának, amelyben a tumorantigéneket mint immunogéneket alkalmazzák tumorvakcinákban, éspedig mind fehérjék, mind peptidek formájában. Boon és munkatársai, 1992; Boon és munkatársai, 1994; Boon és munkatársai, 1995; van Peel és munkatársai, 1995; Van dér Eynde, 1995, munkáiból ismertté vált, hogy a malignus melanoma tumorantigénből levezetett peptidek MHC-l-kapcsoltságban vannak jelen. Egy tumorantigéneket tartalmazó tumorvakcinával, mint ilyennel, eddig mégsem sikerült kielégítő immungenicitást elérni, hogy egy celluláris immunválaszt kiváltsunk, ami a tumorantigéneket hordozó tumorsejtek eliminálásához szükséges lenne (Marchard és munkatársai, 1995). Ahhoz, hogy elérjük, hogy az antigént bemutató sejtek („antigen-presenting cell”, „APC”) által definiált peptidantigének a felszínükön jelen legyenek, azt ajánlották, hogy a peptidek „pulzáljanak”, ami azonban a sejtek peptidekkel való hatástalan terhelését eredményezte (Tykocinski és munkatársai, 1996); azt is kimutatták, hogy adjuvánsokkal történő együttadás az immunválaszt csak feltételesen fokozta (Oettgen és Old, 1991).

Az aktív immunterápia harmadik stratégiája a tumorvakcinák hatékonyságának fokozására a xenogenizált (elidegenített) autológ tumorsejteken alapul. Ez a koncepció azon a feltevésen alapszik, hogy az immunrendszer reagál azokra a tumorsejtekre, amelyek egy idegen fehérjét expresszálnak, és hogy ennek a reakciónak a során egy immunválasz jön létre ugyanazon tumorantigének ellen, amelyek a vakcina tumorsejtjei által jelen vannak.

A specifikus immunválasz szabályozásában központi szerepet játszik egy trimolekuláris komplex, amely az alábbi komponensekből áll: T-sejt-antigénreceptorból, az MHC-molekulából („Major Histocompatibility Complex”) és ennek ligandjából, amely egy fehérjéből levezetett peptidfragmens.

Az MHC-molekulák (illetve az ennek megfelelő humán molekulák, a HLA-k) peptidreceptorok, amelyek szigorú specifitással nagyszámú különböző ligand kötődését engedik meg. Ennek előfeltétele az allélspecifikus peptidmotívum, amely a következő specifitási kritériumokkal rendelkezik: a peptidek - az MHC-halotípustól függetlenül - egy meghatározott hosszúsággal rendelkeznek, az MHC-l-halotípusnál rendszerint 8-10 aminosavrésszel. Tipikusan a két aminosavpozíció egy úgynevezett „horpadás”-t („Anker”) hoz létre, amelybe csak egyes, szoros rokonságban álló oldalláncokat tartalmazó aminosavak vagy aminosavmaradékok illeszkedhetnek be. A pepiidben a horpadást képező aminosavak pontos helyzete és azok tulajdonságai határozzák meg a különböző MHC-halotípusokat. A peptidligandok C-terminálisa gyakran egy alifás vagy egy telített maradék. Az ilyen MHC-l-peptidligand-motí2

HU 224 410B1 vumok eddig a H-2K^d, K^b, K^k, K^km1, D^b, HLA-A*0201, A‘0205 és B*2705 halotípusokra váltak ismertté.

A sejteken belüli fehérjeforgalom keretében szabályos, degenerált és idegen géntermékek, például virális fehérjék vagy tumorantigének, kis peptidek bomlanak szét; ezek közül egyesek az MHC-molekulák számára potenciális ligandokká válnak. Ezáltal adva van a feltétel ezeknek az MHC-molekulák révén történő bemutatására és ennek következtében egy sejtes immunválasz kiváltására, melynek során még nincs felderítve az egyes esetekben, hogy milyen peptidek termelődnek MHC-ligandokként a sejtekben.

Az idegen vagy idegenné tett fehérjék és ezek fragmensei is az immunglobulinokon keresztül, amelyek a humorális immunválaszban szerepet játszanak, felismerhetők, megköthetők és eltávolíthatók. Ez érvényes az összes tumorantigénre is: a tumorasszociált MUCI, CEA és HER2/új példáján bebizonyították, hogy az immunglobulinok, amelyek ezekre a fehérjékre specifitást mutatnak, képesek a fehérjehordozó sejteket felismerni és megölni. Ahhoz, hogy egy tumorantigén-specifikus humorális immunválaszt kiváltsanak, ezért az MUCI és CEA különböző formáit mint immunogéneket [például rekombináns poxvírusvektorokban, lásd Bronte és munkatársai: J. Immunoi. 154, 5282 (1995)] állatmodellekben és klinikai előkísérletekben kipróbálták.

A jelen találmány keretében a fenti megfontolásokat továbbvezettük és egy celluláris tumorvakcina kifejlesztésénél alkalmaztuk: mialatt az immunrendszer a nem malignus, normál testi sejteket tolerálja, a szervezet reagál a normális sejtekre egy immunvédelemmel, ha azok, például vírusfertőzés következtében, testidegen fehérjéket szintetizálnak. Ennek az az oka, hogy az MHC-molekulák az idegen peptideket bemutatják, amelyek a testidegen fehérjékből származnak. Ezáltal az immunrendszer regisztrálja, hogy ezekkel a sejtekkel valami nemkívánatos, idegen történik. Az antigént bemutató sejtek, azaz APC-k (ezekhez számítjuk a makrofágokat, dendritikus sejteket, Langerhans-sejteket, B-sejteket, valamint esetleg a nemrég felfedezett bifenotípusos sejteket, amelyek mind a B-sejtek, mind a makrofágok tulajdonságaival rendelkeznek; Tykonicinski és munkatársai, 1996) aktiválódnak, egy újfajta, specifikus immunitás generálódik és a sejtek eliminálódnak.

Bár a tumorsejtek tartalmazzák a mindenkori tumorspecifikus tumorantigéneket, azonban mint ilyenek elégtelenek vakcinákhoz, mivel csekély immungenicitásuk miatt az immunrendszer nem vesz róluk tudomást. Ha a tumorsejtet nem egy idegen fehérjével, hanem egy idegen pepiiddel terheljük meg, akkor ennek a sejtnek a tumorantigénjei is hozzáadódnak az idegen peptidekhez és mint idegeneket érzékeli az immunrendszer. így egy pepiiddel történő elidegenítéssel elérhetjük, hogy az idegen peptid által kiváltott immunválasz a tumorantigének ellen irányuljon.

A tumorsejtek csekély immungenicitása nemcsak kvalitatív, hanem kvantitatív problémát is jelent. Egy tumorantigénből levezetett peptidnél ez azt jelentheti, hogy bár az MHC-molekulák bemutatják, azonban olyan koncentrációban, amely túl kicsiny ahhoz, hogy egy sejtes celluláris tumorspecifikus immunválaszt kiváltson. A tumorsejtekre tumorspecifikus peptidek számának megemelésével kellene ezáltal ugyancsak a tumorsejtek elidegenítését előidézni, ami a celluláris immunválasz kiváltásához vezet. Ezért azt javasolták, hogy a tumorantigén, illetve az ebből levezetett peptid azáltal legyen a sejtfelszínén bemutatva, hogy azt egy, az illető fehérjét, illetve peptidet kódoló DNS-sel transzferálják, amint azt a WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 és WO 95/00159 számú nemzetközi közrebocsátási iratokban ismertették.

A 195 43 649.0 számú német szabadalmi bejelentésben egy celluláris vakcinát ismertetnek, amely aktív komponensként tumorsejteket tartalmaz, amelyek egy vagy több pepiiddel úgy vannak megterhelve, hogy a beteg immunrendszere a tumorsejteket a peptidekkel kontextusban (kapcsoltságban) mint idegeneket felismeri, és egy celluláris immunválasz képződik. A peptidek lényeges tulajdonsága az, hogy ligandjai a beteg MHC-halotípusának. A beteg immunrendszere ezáltal képes a peptideket mint idegeneket felismerni, mivel egyrészt „idegen peptidek” vagy „xenopeptidek” lehetnek, azaz különböznek azokból a fehérjékből levezetett peptidektől, amelyeket a beteg tumorsejtjei expresszálnak. A peptidek egy másik kategóriája olyan tumorantigénekből van levezetve, amelyeket a beteg sejtjei expresszálnak. Ezek azáltal fokozzák a immungenicitást, hogy a vakcina tumorsejtjeire nézve olyan koncentrációban vannak jelen, amely magasabb, mint ugyanannak a pepiidnek a koncentrációja a beteg tumorsejtjeire nézve.

A jelen találmány célkitűzése az volt, hogy egy új, immunmodulátor hatású gyógyszerkészítményt, különösen vakcinát állítsunk elő.

Továbbvive a 195 43 649.0 német szabadalmi bejelentésben ismertetett celluláris vakcina koncepcióját, a jelen találmány keretében olyan gyógyszerkészítményeket fejlesztettünk ki, amelyek immunmodulátor hatású peptideket tartalmaznak a sejtekkel nem kontextusban, hanem egy adjuvánssal együtt, hogy egy patogén kórokozó elleni celluláris és/vagy humorális, előnyösen egy szisztémás immunválaszt, illetve egy antitumorválaszt váltsunk ki, illetőleg erősítsünk fel, vagy toleranciát indukáljunk az autoimmun hatású fehérjék ellen.

Meglepő módon azt találtuk, hogy bizonyos adjuvánsok, például polikationok, melyekről először 1965ben mutatták ki, hogy a sejtekben a fehérjék transzportját képesek növelni (Ryser és munkatársai, 1965; Ryser és munkatársai, 1978; Shen és munkatársai, 1981), a peptidek immungenicitását fokozzák.

A fentiek alapján a találmány egy gyógyszerkészítményre vonatkozik, amely egy vagy több immunmodulátor hatású peptidet, fehérjét vagy fehérjefragmenst tartalmaz egy adjuvánssal együtt. Az összetétel azzal jellemezhető, hogy az adjuváns azzal a képességgel rendelkezik, hogy a peptid, illetőleg fehérje vagy fehérjefragmens kötődését a kezelendő egyén sejtjein, illetve a sejtekbe történő belépését fokozza, és ezáltal a

HU 224 410 Β1 peptid, illetve fehérje vagy fehérjefragmens immunmodulátor-hatásának felerősödését idézi elő.

A továbbiakban általánosságban, az egyszerűség kedvéért, az említett immunmodulátor hatású peptidek, fehérjék vagy fehérjefragmensek képviselőire mint „peptidekre” hivatkozunk. A „peptid” fogalom nem kifejezetten csak a ligandokra vonatkozik, hanem nagyobb fehérjefragmensekre vagy fehérjékre is, amelyekből a peptidet levezettük, illetve amelyekből egy celluláris bomlási termék képződött.

Az „immunmodulátor hatás” alatt egyrészről egy celluláris és/vagy humorális, előnyösen szisztémás immunreakció kiváltását vagy felerősítését értjük. Ebben a kiviteli formában hat egy találmány szerinti gyógyszerkészítmény mint vakcina. Egyik előnyös kiviteli formában a peptidligandok legalább egy olyan MHC-molekula ligandjai, amelyet a kezelendő egyén expresszál.

A humán MHC-molekulákat a következőkben a nemzetközi szokás szerint humán leukocita antigéneknek „HLA” („Humán Leucocyte Antigén”) nevezzük.

A „celluláris immunválasz” alatt mindenekelőtt a citotoxikus T-sejtes immunitást értjük, amely a citotoxikus CD8-pozitív T-sejtek és a CD4-pozitív helper T-sejtek keletkezésének következtében a tumorsejtek vagy a patogén kórokozó által megtámadott sejtek pusztulását okozza.

A „humorális immunválasz” alatt olyan immunglobulinok termelését értjük, amelyek a tumorsejteket vagy a patogén kórokozókból levezetett struktúrákat szelektíven felismerik, és ennek következtében más rendszerekkel együtt, mint például komplement, ADCC (Antibody dependent Cytotoxicity, antitestfüggő citotoxicitás) vagy fagocitózis, ezeknek a tumorsejteknek, illetve a patogén kórokozóknak vagy az ezek által megtámadott sejteknek a pusztulását okozzák.

A vakcina által tartalmazott peptidet egy antigénből vezetjük le, illetve fehérjék esetében maga egy antigén, amely ellen egy celluláris és/vagy humorális immunválasz kell hogy kiváltódjon. Ezt úgy érjük el, hogy a T-sejtek, illetőleg egyéb citotoxikus effektorsejtek, a betegség kórokozóit, illetve azokat a tumorsejteket, amelyek az antigént hordozzák, felismerik, és/vagy antitestek termelődnek.

A kórokozók, például baktériumok, vírusok, paraziták elleni immunizáláshoz olyan fehérjéket, illetve peptideket alkalmaznak, amely ugyanannak a kórokozónak a fehérjéje, illetve abból van levezetve. Ennélfogva mindenekelőtt alkalmasak azok a fehérjék, amelyeket ennek a kórokozónak magas általános mutációs rátája nem érint. Irodalomban ismertetett példák közé tartozik a HPV16/17 (humán papillomavírus; Feltkamp és munkatársai, 1995), hepatitis B-vírus core antigén (Vitiello és munkatársai, 1995), Plasmodium Bergheii (Widmann és munkatársai, 1992), influenzavírus-nukleoprotein, hepatitis C-vírus.

A találmány egyik kiviteli alakjában a fehérje - tekintettel egy antitumorválasz kiváltására - egy tumorantigén, illetve egy tumorantigénből levezetett peptid, amikor a gyógyszerkészítményt mint tumorvakcinát alkalmazzuk. Ebben az esetben, a vakcina terápiás alkalmazásánál a peptidet egy olyan tumorantigénből vezetjük le, amelyet a beteg tumorsejtjei expresszálnak. Ezek a tumorantigének, például azok, melyek egy betegből származnak, túl kis mennyiségben expresszálódnak ahhoz, hogy a tumorsejtek mint idegenek felismerhetők legyenek.

A beteg tumorantigénjei a diagnózis és terápiás terv folyamán standard módszerekkel meghatározhatók: a tumorantigének egyszerű módon immunhisztokémiai módszerrel antitestek segítségével kimutathatók. Ha a tumorantigének enzimek, például tirozinázok, enzimassay segítségével mutathatjuk ki azokat. Tumorantigéneknél ismert szekvenciákkal RT-PCR-módszereket kivitelezhetünk (Boon T. és munkatársai, 1994; Coulie P. G. és munkatársai, 1994; Weynants P. és munkatársai, 1994). További kimutatási módszerek a meghatározandó tumorantigénre specifikus CTL-eken alapuló assay-k. Ilyenfajta módszereket írtak le Hérin és munkatársai, 1987; Coulie és munkatársai, 1993; Cox és munkatársai, 1994; Rivoltini és munkatársai, 1995; Kawakami és munkatársai, 1995; valamint a WO 94/14459 számú közrebocsátási iratban, ezekről az irodalmi helyekről különféle tumorantigének, illetve azokból levezetett peptidepitópok kivehetők, melyek a jelen találmány keretében felhasználhatók; példák találhatók továbbá a nemrég megjelent összefoglaló cikkekben (von Rosenberg, 1996 és Henderson és Finn, 1996). A felhasználható tumorantigénekre vonatkozóan a találmány semmiféle korlátozást nem tartalmaz.

Egy tumorvakcina, amely egy tumorantigént, illetve egy tumorantigénből levezetett peptidet tartalmaz, terápiás alkalmazáson kívül, profilaktikus célból is beadható. A profilaktikus alkalmazásnál célszerű egy peptidkeveréket használni, amelyet a gyakran előforduló tumorantigének képviselőiből vezetünk le. A találmány szerinti tumorvakcina terápiás alkalmazásánál egy vagy több peptidet alkalmazunk, melyektől várható, hogy azok a beteg tumorantigénjében vagy -antigénjeiben előfordulnak.

A találmány szerinti tumorvakcina egy autológ tumorsejteken alapuló celluláris vakcinával ellentétben azzal az előnnyel rendelkezik, hogy azoknak a betegeknek is, akik viszonylag a betegség korai stádiumában (stádium I és II) vannak, terápiás hasznot jelent, akiknél egy celluláris vakcina előállításához kielégítő mennyiségű tumorsejt nem áll rendelkezésre.

A találmány egyik előnyös kiviteli alakjában a peptid, tekintettel egy celluláris immunválasz kiváltására, a vakcinálandó egyén MHC-I- vagy MHC-ll-szubtípusára van hangolva; a peptid tehát egy olyan szekvenciával rendelkezik, vagy egy olyan szekvenciát tartalmaz, amely a peptid kötődését az MHC-molekulán szavatolja.

Egy további előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti gyógyszerkészítmény, tumorvakcinaként történő felhasználási formában, az immunstimulátor hatású polipeptiden kívül tartalmaz előnyösen egy citokint. A találmány előnyös kiviteli alakjában citokinként interleukin 2-t (IL-2) vagy GM-CSF-et alkalmazunk, például kb. 1000 egység dózisban; további példák citokinekre

HU 224 410 Β1 az IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IFN-ω, TNF-a; valamint ezek kombinációja, például IL-2+IFN-y, IL-2+IL—4, IL-2+TNF-a vagy TNF-a+IFN-γ.

A találmány egyik kiviteli alakjában a gyógyszerkészítmény arra szolgál, hogy toleranciát idézzen elő azon fehérjék, illetve fragmenseik ellen, amelyek az autoimmunindukált betegségeket kiváltják, tehát autoimmunbetegségek terápiájához is alkalmazható. A találmánynak ebben a kiviteli formájában alkalmazott peptideket olyan fehérjékből vezetjük le, amelyek az autoimmunbetegségeket okozzák.

Ezzel ellentétben a találmány tumorvakcinaként vagy mint patogén kórokozó elleni vakcinaként történő felhasználásához, amelynél a peptidek az eredeti fehérje (tumorantigén, illetve a patogén fehérje) egy szakaszával lényegében oly módon vannak összehangolva, hogy a peptid „eredeti antigén”-ként ismerhető fel, azokat az autoimmunbetegségek kezelésére használt peptideket alkalmazzuk, amelyek az eredeti fehérje aminosavszekvenciájához képest kritikus különbségeket mutatnak. Bár ezek a peptidek az „Anker”-pozíciójuk alapján megkötődnek az MHC-molekulán, azonban szekvenciájukban mutációkat hordoznak, amelyek következtében ezek a peptidek antagonistaként funkcionálnak, és az aktivált, specifikus T-sejteket ismét lekapcsolják (Kersh és Allén, 1996).

Peptidantagonistaként alkalmasak a „természetes” antagonisták is, amelyeket a vírusokban fedeztek fel (Bertoletti és munkatársai, 1994), valamint azok az antagonisták, melyeket a szisztémás kutatás során, például peptidkönyvtárak átvizsgálásánál találtak. Peptidantagonistákra például szolgálnak azok a peptidek, melyek a T-sejteket kiolthatják, amelyek specifikusak a mielin bázisfehérjére, ezek hatékonyságát állatkísérletekben kipróbálták (Brocke és munkatársai, 1996).

Egy celluláris immunválaszt kiváltó pepiidnek egy MHC-molekulához kell kötődnie. Ahhoz, hogy a betegekben az immunválasz kiváltódjon, a kezelendő egyénnek a repertoárjában egy megfelelő HLA-molekulával kell ehhez rendelkeznie. A beteg HLA-szubtípusának a meghatározása ezáltal, tekintettel egy celluláris immunválasz kiváltására, egy lényeges előfeltétele a peptid hatékony felhasználásának ebben a betegben.

A beteg HLA-szubtípusát standard módszerekkel, mint például mikrolimfotoxicitási teszttel (Practical Immunology, 1989) meghatározhatjuk. Ez a teszt azon az elven alapszik, hogy a beteg véréből izolált limfocitákat először antiszérummal vagy egy bizonyos HLA-molekula elleni monoklonális antitesttel nyúlkomplement (C) jelenlétében elegyítjük. A pozitív sejteket lizáljuk, és egy indikátorban felvesszük, miközben a nem károsodott sejtek nem színeződnek el.

Egy beteg HLA-I- vagy HLA-ll-halotípusának meghatározásához az RT-PCR-módszert („Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction”) is kivitelezhetjük (Curr. Prot. Mól. Bioi. 2. és 15. kötet). Ehhez a beteg vérét eltávolítjuk, és abból az RNS-t izoláljuk. Ezt a RNS-t először reverz transzkripciónak vetjük alá, melynek során a beteg cDNS-e keletkezik. A cDNS szolgál matricaként a polimeráz-láncreakcióban olyan primerpárokkal, amelyek egy DNS-fragmens specifikus amplifikációját okozzák, amely fragmens egy bizonyos HLA-halotípushoz tartozik. Ha agaróz-gélelektroforézis után megjelenik egy DNS-sáv, a beteg expresszálja a megfelelő HLA-molekulát. Ha nem jelenik meg, a beteg erre nézve negatív.

A találmány szerint felhasznált peptid definícióját egy HLA-molekula határozza meg tekintettel az ankeraminosavaira és hosszúságára; a meghatározott ankerpozíciók és a hosszúság biztosítja azt, hogy egy peptid a beteg adott HLS-molekulájának peptidkötő barázdájába beleillik. Ez azzal a következménnyel jár, hogy az immunrendszer stimulálódik, és egy celluláris immunválasz jön létre, amely - egy tumorantigénből levezetett peptid esetében - a beteg tumorsejtjei ellen irányul.

A peptidek, melyek a jelen találmány keretében felhasználásra alkalmasak, nagy kötésszélességben rendelkezésre állnak. Szekvenciájukat a természetesen előforduló immunogén fehérjékből, illetve azok celluláris lebomlási termékeiből, például virális vagy bakteriális peptidek, tumorantigénekből vezethetjük le, vagy olyan peptidantagonisták lehetnek, amelyeket autoimmunbetegségek által indukált fehérjékből vezetünk le.

Az alkalmas peptideket például az irodalomból ismert peptidszekvenciájuk alapján választhatjuk ki.

Tekintettel egy celluláris immunválasz kiváltására, a peptideket például Rammensee és munkatársai, 1993, Rammensee és munkatársai, 1995, Fáik és munkatársai, 1991 által az eltérő HLA-motívumokra leírtak alapján, különböző eredetű immunogén fehérjéből levezetett peptidként definiálhatjuk, amelyek a mindenkori HLA-szubtípusok molekuláinak kötőhorpadásába beleillenek.

Azon peptidek esetén, amelyek egy immunogén hatású fehérje részszekvenciájával rendelkeznek, a már ismert vagy adott esetben még meghatározandó polipeptidszekvenciák alapján szekvencialevezetéssel, tekintetbe véve a HLA-specifikus követelményeket, lehet megállapítani, hogy mely peptidek az alkalmas jelöltek. Például alkalmasnak bizonyultak Rammensee és munkatársai, 1993, Fáik és munkatársai, 1991 és Rammensee és munkatársai, 1995, által, valamint a WO 91/09869 (HIV-peptid) számú közrebocsátási iratban leírt peptidek, továbbá tumorantigénekből levezetett peptidek, melyeket a WO 95/00159 számú és WO 94/05304 számú közrebocsátási iratokban ismertettek. Ezeken az irodalmi helyeknek a kitanítására és ezekben a peptidekkel összefüggésben idézett cikkekre példaképpen hivatkozunk. A legelőnyösebb jelöltek közé azok a peptidek számítanak, amelyek immungenicitását már kimutatták, tehát olyan peptidek, amelyek ismert immunogénekből, például virális vagy bakteriális fehérjékből vannak levezetve.

Originális peptidek helyett, amelyek az MHC-I vagy MHC-II molekulák kötőbarázdájába belepasszolnak, tehát olyan peptidek, melyek a természetes fehérjékből változtatás nélkül származnak, előfordulhatnak variációk az originális peptidszekvencia alapján megadott minimális követelmények alapján az ankerpozíciókat

HU 224 410 Β1 és hosszvariációkat illetően, amennyiben ezeken a variációkon keresztül a peptid hatékony immungenicitása, ami a kötőaffinitásából az MHC-molekulán és a T-sejt-receptorokat stimuláló képességéből tevődik össze, nemcsak nem károsodik, hanem előnyösen fokozódik is. Ebben az esetben tehát a találmány szerint mesterséges peptideket alkalmazunk, amelyeket egy MHC-molekulán a kötőképesség követelményeinek megfelelően terveztünk meg. így például kiindulva a H2-K-ligandokból a Leu Phe Glu Alá Ile Glu Gly Phe Ile (LFEAIEGFI) aminosavakat, amelyek semmilyen ankeraminosavat nem képviselnek, úgy változtattuk meg, hogy a Phe Phe Ile Gly Alá Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI) szekvenciájú peptidet kapjuk; ezenkívül a 9-es pozícióban lévő Ile ankeraminosavat helyettesíthetjük Leu-val. Az MHC-I-, illetve MHC-ll-ligandok, illetőleg ezek variációja epitópjainak meghatározását Rammensee és munkatársai, 1995, által leírt elvek alapján végezhetjük. A peptid hossza megfelel az MHC-I molekulára hangolás esetében előnyösen egy 8-10 aminosavból álló minimálszekvenciának a szükséges ankeraminosavakkal. Az MHC-ll-kötésmotívum, amely új aminosavakon keresztül van elbújtatva, az ankerpozícíók degenerációjának magas fokát mutatja. A közelmúltban, kiindulva az MHC-II molekula röntgen-struktúranalíziséből, módszereket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé tették az MHC-ll-kötésmotívum pontos analízisét és ebből kifolyólag a peptidszekvencia variációit (Rammensee és munkatársai, 1995 és az ott idézett eredeti irodalmak).

Adott esetben a peptidet a C- és/vagy N-terminálisán meghosszabbíthatjuk, amennyiben ez a hosszabbítás a kötőképességét az MHC-molekulán károsan nem befolyásolja, illetőleg a meghosszabbított peptid a minimálszekvenciára cellulárisan processzálódhat.

A találmány egyik kiviteli formájában a peptid negatív töltésű. Ebben a kiviteli alakban a peptidet negatív töltésű aminosavakkal meghosszabbíthatjuk, vagy negatív töltésű aminosavakat a peptidbe beépíthetünk, előnyösen azokra a helyekre, amelyek a specifikus CTL-ek vagy ankeraminosavak általi felismeréshez nem szükségesek, azzal a céllal, hogy a peptid elektrosztatikus kötődését egy polikationos adjuvánson, mint például polilizin, elérhessük.

A találmány egyik kiviteli formájában az antigén nem egy peptid, hanem egy fehérje vagy fehérjefragmens, illetőleg fehérjék vagy fehérjefragmensek keverékének formájában van. A jelen találmány keretein belül olyan nagyobb fehérjefragmensek, illetve egész fehérjék alkalmasak, amelyek szavatolják, hogy a beteg APC-inek beadása után azokhoz a peptidekhez processzálnak, amelyek az MHC-molekulára illeszkednek.

A fehérje egy antigén, illetve tumorantigén, amelyből a processzálás után kapott törésdarabok származnak. Ebben a kiviteli formában az adjuváns arra szolgál, hogy a sejtek, különösen az APC-k (például dendritikus sejtek vagy makrofágok) terhelését („transloading”) tumorantigénekkel, illetve fragmensekkel lehetővé tegye vagy fokozza. Az így felvett fehérjék, illetve fehérjefragmensek a sejtek által processzálódnak, és ennek következtében képesek az immuneffektorsejtekkel

MHC-kapcsoltságban (kontextus) megjelenni, és ezáltal egy immunválaszt kiváltani vagy azt felerősíteni (Braciale és Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski és

Rock, 1995; York és Rock, 1996).

A találmány egyik kiviteli alakja, amelyben a fehérjék, illetve nagyobb fehérjefragmensek antigénként fordulnak elő, azzal az előnnyel rendelkezik, hogy a beteg HLA-típusától csak csekély mértékben függ, mert a fehérje több törésdarabban processzálódik, és ezáltal nagyobb variabilitást biztosít tekintettel a peptid „passform”-jára.

A fehérjék és fehérjefragmensek átadása esetében a processzált végtermékek azonosítását kémiai analízissel (a processzált fragmensek Edman-lebontása vagy tömegspektrometriája) vagy biológiai vizsgálati módszerekkel (az APC-k azon T-sejteket stimuláló képessége, amelyek a processzált fragmensekre specifikusak) végezhetjük.

Azoknak a peptidjelölteknek a kiválasztását, amelyek egy celluláris immunválasz kiváltására alkalmasak, lényegében több lépcsőben végezzük: általában a jelölteket, célszerűen szériavizsgálatokban, először egy peptidkötő tesztben az MHC-molekulán való kötőképességükre teszteljük.

Ehhez megfelelő vizsgálati módszerek a peptidek azon képességén alapulnak, hogy az üres MHC-molekulákat stabilizálni tudják, amint azt például Stuber és munkatársai, 1994, és Mclntyre és munkatársai, 1996, leírták. Ehhez a peptidet olyan sejtekre visszük fel, amelyek abban a helyzetben vannak, hogy a mindenkori MHC-molekulát expresszálják, azonban egy genetikai hiba miatt az endogén peptidek nem tudnak MHC-kapcsoltságban kötődni. Ilyen típusú alkalmas sejtvonalak az RMA-S- (egér) és T2- (humán) sejtvonal, illetőleg ezek transzficiált variánsai. Ekkor az adott peptid által stabilizált MHC-molekula kimutatható, előnyösen átfolyásos citometrián alapuló FACS-analízis (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage™ User's Guide, 1994; CELL Quest™ User’s Guide, 1994) segítségével. A stabil MHC-molekulákat egy megfelelő anti-MHC-antitesttel és egy fluoreszkáló anyaggal, például FITC-vel jelzett második (például poliklonális) antitesttel kimutatjuk. Az átfolyásban ezután az egyes sejteket egy lézerrel meghatározott hullámhosszon gerjesztjük; és a kibocsátott fluoreszcenciát mérjük, ami a sejtekhez kötődő peptidmennyiségtől függ.

A kötött peptidmennyiség meghatározására szolgáló további módszer a Scatchard-Plot, melyet Sette és munkatársai, 1994, ismertettek. Ehhez olyan peptidet használunk, amelyet például l¹²⁵-tel jeleztünk, és egy éjszakán át izolált vagy rekombináns úton előállított MHC-molekulákkal 4 °C-on különböző meghatározott koncentrációjú pepiiddel inkubálunk. A peptid nemspecifikus kölcsönhatásának meghatározásához néhány mintához a nem jelzett peptid feleslegét hozzáadjuk, amely a jelzett peptid nemspecifikus kölcsönhatását megakadályozza. Végül a nemspecifikusan kötött peptidet eltávolítjuk, például gélkromatográfiával. A megkötött peptid mennyiségét ezután egy szcintillációs

HU 224 410 Β1 számlálóban a kibocsátott radioaktivitás alapján határozzuk meg. Az így kapott adatok kiértékelését standard módszerekkel végezzük.

Az MHC/peptid kölcsönhatás jellemzésére, az MHC-ligandok analizálására szolgáló módszerekről és a peptidkötési vizsgálatokról, melyeket a találmány keretében alkalmazunk, áttekintést adtak Rammensee és munkatársai, 1995.

A jó kötőképességgel rendelkező peptidjelölteket a következő lépésben immunogenicitásukra vizsgáljuk meg.

Egy celluláris immunválasz kiváltását peptidspecifikus CTL-ek kimutatása révén állapíthatjuk meg, például a Current Protocols in Immunology 3. kötetében leírtak segítségével, vagy Blomberg és munkatársai, 1993, által leírt módszerekkel. Egy celluláris immunválasz jelenlétére egy további bizonyítékot akkor kapunk, ha T-sejtek távollétében egy kísérleti állatban (amit úgy érünk el, hogy az állatot olyan antitesttel kezeljük, melyek CD4- vagy CD8-sejt-hiányosak) semmiféle immunválasz nem lép fel (Current Protocols in Immunology, 3. kötet).

A celluláris immunválaszt egy immunizált állatban a „delayed-type hypersensitivity” (késleltetett típusú hiperszenzitivitási, DTH) reakció kimutatása által is igazolhatunk. Ehhez a peptideket egerek talpába injekciózzuk, miután a beinjekciózott hely duzzadását mérjük (Grohman és munkatársai, 1995; Pucetti és munkatársai, 1994).

Egy humorális immunválasz indukálása olyan peptidek által, melyek a szervezet számára idegen antigének, illetve a kezelendő szervezet által igen kis koncentrációban expresszált antigének, meghatározható a szérumban lévő specifikus antitestek kimutatásával. A szérumban az antitestek meghatározására szolgáló alkalmas módszer az enzimkapcsolt immunassay (ELISA). Ennek segítségével az immunizáláshoz felhasznált peptidre kötődött specifikus antitestek egy színreakcióval kimutathatók. Egy alternatív módszer a Western-blot-analízis, melyben a specifikus szérumantitestek egy membránon immobilizált peptidre kötődnek. A megkötött antitesteket végül itt is színreakcióval mutatjuk ki (referenciák mindkét módszerhez: Current Protocols in Immunology. Kiadó: Coligan és munkatársai, 1991).

Az idegen antigénekkel, például virális eredetű, történő vakcinálás után mindenekelőtt antitestek képződése várható. Azt azonban nem lehet kizárni, hogy specifikus antitestek a mutált vagy túlexpresszált peptidek ellen, amelyeket celluláris tumorantigénekből vezettünk le, ne képződjenek. Ilyen antitestek által okozott tumorszéttörés után az immunrendszer más komponensei által, így például komplement, citotoxicitástól független antitest (ADCC) vagy a makrofágok fagocitózisa, a tumorsejteken antitestkötődés tudna végbemenni (Roitt I. M., Brostoff J., Male D. K.: Immunology, Churchill Livingstone).

Egy peptiddel kiváltott celluláris immunválasz megjelenését, melyet olyan fehérjéből vezettünk le, melynek immunogén hatása nem ismert, tesztelhetjük például Rivoltini és munkatársai, 1995, vagy Kawakami és munkatársai, 1994a, által leírt módon. Ehhez szükség van olyan T-sejtekre, amelyek a kívánt peptidet fel tudják ismerni, ha azt az MHC-molekulák bemutatják. Tumorsejtekből származó peptidek esetében megfelelő T-sejteket nyerhetünk tumorbeszűrődéses limfocitákból (TIL-ek), ahogyan Kawakami és munkatársai, 1994b, leírták; idegen peptidek esetében ilyen T-sejteket analóg módon perifériás vérből nyerhetünk. A T-sejteket sejtvonalakkal, például T2 (Alexander és munkatársai, 1989) vagy RMA-S (Kárre és munkatársai, 1986), amelyeket a mindenkori peptiddel összekevertünk, inkubáljuk és lizáljuk ezeket, úgyhogy egy immunogén peptidről van szó.

Egy további lehetőség az MHC-hez kötődő peptidjelöltek immungenicitásának tesztelésére abban áll, hogy a peptidek kötődését a T2-sejteken vizsgáljuk. Egy ilyen teszt a T2-sejtek (Alexander és munkatársai, 1989) vagy RMA-S-sejtek (Karre és munkatársai, 1986) azon sajátosságán alapul, hogy hibát hordoznak a TAP-peptid-transzportmechanizmusban, és csak akkor jelennek meg stabil MHC-molekulák, ha felveszik azokat a peptideket, amelyek MHC-kapcsoltságban vannak. Ha ehhez a teszthez például T2-sejteket vagy RMA-S-sejteket használunk, akkor ezeket egy HLA-génnel, például HLA-A1- és/vagy HLA-A2-génnel stabilan transzficiáljuk. Ha a sejteket jó HLA-ligandoknak bizonyuló peptidekkel elegyítjük, amelyekben azok így HLA-kontextusban vannak jelen, hogy az immunrendszer által idegenként felismerhetők legyenek, akkor az ilyen peptidek abban az irányban hatnak, hogy a HLA-molekulák a sejtfelszínén szignifikáns mennyiségben jelenjenek meg. A sejtfelszínről a HLA-k kimutatása, például monoklonális antitestek segítségével, lehetővé teszi a megfelelő peptid azonosítását (Malnati és munkatársai, 1995; Sykulev és munkatársai, 1994). Itt is célszerűen alkalmazunk egy ismert, jó HLA-kötő képességgel rendelkező standard peptidet.

Tekintve a találmány szerinti gyógyszerkészítmények széles felhasználhatóságát, előnyösen több peptid keverékét alkalmazzuk, melyek közül mindegyik egy, a másik MHC-molekulára kötődhet, előnyösen a leggyakrabban előforduló MHC-szubtípusok közül egyre, kettőre vagy háromra. A peptidkeveréken alapuló vakcinával, amelyek képesek a halotípusokat megkötni, széles betegnépességet védhetünk meg.

A találmány egy másik kiviteli alakjában a vakcina több peptidszekvenciával rendelkezhet. A felhasznált peptideket ebben az esetben egyrészt azáltal különböztetjük meg, hogy eltérő HLA-szubtípusokhoz kötődnek. Ezáltal elérhetjük, hogy egy betegeknek vagy egy nagyobb betegcsoportnak több, illetve az összes HLA-szubtípusát felöleljük.

Egy további, adott esetben kiegészítő variabilitás a felhasznált peptideket tekintve abban áll, hogy a peptidek, amelyek egy bizonyos HLA-szubtípushoz kötődnek, megkülönböztethetők a HLA-kötésre nem képes szekvenciájuk alapján, amelyben azokat például ugyanannak a patogén kórokozónak vagy eltérő kórokozóknak a különböző fehérjéiből vezetjük le. Ilyen

HU 224 410 Β1 variációk által elérhetjük az immunválasz, illetve különböző kórokozókkal szembeni immunizálás stimulálásának fokozását.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményben a hatásos peptid mennyiségét széles határok között változtathatjuk. A peptid mennyisége mindenekelőtt a beadási módtól és az adott kiszerelési formától függ. A peptid beadható mennyisége általában 1,0 pg és kb. 1000 pg közötti, előnyösen kb. 10 pg és kb. 500 pg közötti mennyiség. A beadást egyszer vagy többször megismételhetjük, többszöri beadáskor célszerűen legalább háromszor. Különösen terápiás felhasználásnál a beadást időközönként (például 1*hetente - 1*havonta) egy kiadós hosszú időtartam alatt valósíthatjuk meg aszerint, amit a beteg sajátos immunstátusa, illetve a betegség lefutása megkövetel.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket ex vivő is felhasználhatjuk: egy lehetséges ex vivő beadás abban áll, hogy az APC-ket, például dendritikus sejteket ex vivő tenyésztjük, ezt a sejttenyészetet a találmány szerinti készítménnyel inkubáljuk, és az APC-ket, melyek most a peptidet MHC-kontextusban mutatják be, a kezelendő egyénnek beadjuk. Ehhez a felhasználási lehetőséghez az irodalomból ismert módszereket alkalmazhatjuk, például melyeket Porgador és Gliboa, 1995; Young és Inabe, 1996, leírtak.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményben alkalmazott adjuváns azzal a sajátossággal bír, hogy a peptid belépését a sejtekbe, illetve a peptid kötődését a beteg sejtjein megkönnyíti, és a peptid immungenicitását fokozza. Az adjuváns például a célsejtek, melyeket a peptidnek el kell érnie, membránjait legalább átmenetileg átjárhatóvá teszi, hogy ezen a módon a peptidet a sejtekbe továbbítsa. Ezért előnyös lehet, de nem feltétlenül szükséges, hogy a peptid az adjuvánsra kötődjön, például az elektronegatív peptid és polikationos adjuváns közötti elektrosztatikai köcsönhatásokon keresztül. A peptid importja a sejtekbe azáltal is végbemehet, hogy a peptidnek a sejtmembránhoz való térbeli közelsége alapján sikerülhet ezen keresztül jutni, mihelyt ennek átjárhatóságát az adjuváns biztosítja. Az adjuváns hatás azon is alapulhat, hogy a peptidnek a sejtekbe történő felvételhez szükséges kritikus koncentrációját a sejtfelszínen megemeli, vagy hogy a fagocitózist vagy a peptid folyadéktranszportját (pinocitózis) a sejtekbe megvalósítja.

Meglepő módon azt találtuk, hogy adjuváns jelenlétében nemcsak a peptid sejtekbe történő felvétele fokozódik, hanem a peptid immunmodulátor-hatása is fokozódik, amely az MHC-molekulák általi korrekt peptidbemutatásnak tulajdonítható.

Egyik előnyös kiviteli alakban az adjuváns alapjában véve minden olyan membránpermeabilizáló anyag lehet, amely a nukleinsavak sejtekbe történő transzportjához alkalmazható; ezzel összefüggésben hivatkozunk például a WO 93/19768 számú PCT-beli közzétételi iratra, amelyben az ilyen anyagokat megnevezik.

A találmány előnyös kiviteli módjában az adjuváns egy bázikus poliaminosav vagy bázikus poliaminosavak keveréke.

A poliaminosavak polimerizációs foka széles tartományban változhat, kb. 5-kb. 1000, előnyösen kb. 15 és kb. 500 között.

A találmány keretében előnyösen alkalmazható adjuváns a poliarginin. Egy további előnyös adjuváns a polilizin.

Továbbá alkalmazhatunk megfelelő, különösen polikationos, szerves vegyületeket (bázikus aminosavakat), így például poliornitint, hisztont, protamint, polietilén-imint vagy ezek keverékét.

Az adjuvánst - adott esetben - egy celluláris liganddal, például transzferrinnel, gp120-szal, LDL-lel (low density lipoprotein), alfa-fetuinnal, EGF (epidermal growth factor)-peptidekkel vagy egyéb celluláris ligandok egyik képviselőjével, melyeket a DNS transzportjára receptorközvetített endocitózis segítségével a WO 93/07283 számú közzétételi iratban leírtak, szénhidrátokkal, például mannóz vagy fukóz (makrofágok ligandjai) vagy sejtfelszíni fehérjék elleni antitestekkel vagy antitestfragmensekkel konjugálhatunk.

Adott esetben a polikationos adjuvánsok, például poliarginin vagy polilizin, melyeket adott esetben egy celluláris liganddal konjugáltunk, egy DNS-komplex összetevői lehetnek, például egy plazmid-DNS formájában.

A DNS mentes lehet a funkcionális fehérjéket kódoló szekvenciáktól, ebben az esetben a DNS egy üres plazmid.

A találmány egyik megvalósítási módjában a DNS tartalmaz immunmodulátor fehérjéket, előnyösen citokineket, mint például IL—2, interferon, GM-CSF, kódolószekvenciákat.

Ahhoz, hogy a bázikus poliaminosavak által közvetített peptidtranszport mechanizmusát megvizsgáljuk, a találmány keretein belül a laktátdehidrogenáz (LDH)-felszabadulást mértük. Mialatt a poliargininnel kezelt mintákban a felszabadított LDH-t gyakorlatilag nem tudtuk kimutatni, a polilizinnel inkubált sejtek felülúszójában magas LDH-koncentrációkat mértünk. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a polilizin hatása a sejtmembrán permeabilizációjára végbemehetett.

Anélkül, hogy bármiféle elméleti megállapításokat tennénk, a találmány szerinti gyógyszerkészítmények hatása valószínűleg abban áll, hogy a peptid az adjuváns segítségével bejut a célsejtekbe vagy megkötődik azokon a sejteken, amelyek a bőr endodermális rétegében előfordulnak. A célsejtek az úgynevezett antigénbemutató sejtek, amelyek a peptidet, adott esetben processzálás (utólagos átalakulás) után, a B- és/vagy T-sejteknek bemutatják. Ilyen célsejtek például a makrofágok, fibroblasztok, keratinociták, Langerhans-sziget sejtjei, dendritikus sejtek vagy B-sejtek.

A találmány keretében azt is megvizsgáltuk, hogy vajon a kis peptideket bázikus poliaminosavak vagy polikationok glikozilált formáinak jelenlétében a makrofágszerű antigénbemutató sejtek (APC-k) fokozott mennyisége felveszi-e. Az alkalmazott cukorrészekről ismert, hogy azokat a makrofágok a receptorközvetített endocitózis során felveszik. (Az APC-kről feltételezik,

HU 224 410 Β1 hogy azokban a sejttípusokban in vivő képződnek, amelyek a peptideket felveszik és a többi immunsejtnek bemutatják. Az in vitro kísérletekből kapott eredmények, amelyek azt mutatják, hogy a tesztelt adjuvánsok jelenlétében az APC-k a peptidantigének megemelkedett mennyiségét endocitálják, azt bizonyítják, hogy ezek az adjuvánsok in vivő is alkalmasak arra, hogy a peptidek bemutatását - ellentétben a citotoxikus effektorsejtekkel -, valamint azok aktiválását fokozzák, ami összességében egy felerősített immunválaszhoz vezet szemben a targetmolekulát tartalmazó vakcinákkal.)

Adjuvánsként a komponenseket részecske formában is alkalmazhatjuk, adott esetben kiegészítőként hozzáadva a fent említett adjuvánsokhoz. Részecskeként alapvetően azok az anyagok alkalmasak, amelyeket a peptidszintézishez oszloptöltetként alkalmazunk, például Kiesel-gél vagy szintetikus gyanták, amennyiben azok fiziológiailag elfogadhatók és amelyekből részecskék állíthatók elő, továbbá elegendően kicsinyek ahhoz, hogy a sejtekbe bejussanak. Részecske formájú adjuvánsok segítségével a peptid magas helyi koncentrációi érhetők el, ami a sejtekbe történő felvételüket megkönnyíti.

A felhasznált adjuváns milyenségét, egy celluláris liganddal, illetve DNS-felesleggel történő módosításának célszerűségét, valamint az adjuváns szükséges mennyiségét a pepiidhez viszonyítva egyes esetekben empirikusan meghatározhatjuk, például néhány kiválasztott peptid-adjuváns aránnyal, ami elvileg tovább kiterjeszthető, titrálás segítségével meghatározhatjuk.

Az adjuvánsok tesztelését elvileg ugyanazokkal a módszerekkel végezhetjük, mint amilyeneket a peptidek tesztelésére megadtunk, adott esetben több lépésben.

Egy adjuváns azon képességét, hogy egy peptid kötődését és/vagy internalizálását az APC-ken növeli-e, például egy lépésben mérhetjük, amikor az APC-ket fluoreszcens anyaggal jelzett peptidekkel és adjuvánsokkal inkubáljuk. Egy, az adjuváns által megnövelt felvételt, illetve kötődést összehasonlítva olyan sejtekkel, amelyek a peptidet csak önmagában tartalmazzák, átfolyási citometria segítségével határozhatunk meg.

A második lépésben a tesztelendő adjuvánsokat in vitro vizsgáljuk meg arra, hogy egy APC-n lévő peptid bemutatásában az adjuváns jelenléte egyáltalán játszik-e és milyen mértékben játszik szerepet, ahol a fenti, peptid tesztelésére leírt módszerek szerint a sejteken az MHC-koncentrációt mérhetjük.

Az adjuváns hatékonyságának vizsgálatára egy további lehetőség az in vitro modellrendszer alkalmazása. Ennél az APC-ket adjuvánssal és peptiddel együtt inkubáljuk, és egy T-sejt-klónnak, amely a felhasznált peptidet specifikusan felismeri, relatív aktiválódását mérjük (Coligan és munkatársai, 1991; Lopez és munkatársai, 1993).

A formulázás hatékonyságát a celluláris immunválaszon keresztül is kimutathatjuk, egy „késleltetett típusú hiperszenzitivitási (DTH)-reakció kimutatásával immunizált állatokban.

Végül a formulázás immunmodulátor hatását mértük kísérleti állatokban. Ehhez az úgynevezett előre gyártott tumormodelleket alkalmazhatjuk, melyeknél az immunsejtek által felismert peptidszekvenciák ismertek. A peptidet és az adjuvánst különböző arányokban tartalmazó vakcinákat, a peptidet az adjuvánshoz és az összmennyiséghez viszonyítva, adunk be. A tumornövekedés előtti védelem egy tumorvakcina hatásosságának mértéke.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket parenterálisan, topikusan, orálisan vagy lokálisan adhatjuk be. Előnyösen azokat parenterálisan, például szubkután, intradermálisan vagy intramuszkulárisan adjuk be, előnyösen szubkután vagy intradermálisan, hogy mindenekelőtt a bőrsejteket (keratinociták, fibroblasztok), dendritikus sejteket, Langerhans-sejteket vagy makrofágokat mint célsejteket elérjék. A tumorterápia keretében a tumorvakcinák intratumorálisan is beadhatók.

A találmány szerinti készítmények parenterális beadás céljára általánosságban egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, előnyösen egy vizes hordozóban, mint a peptid és az adjuváns oldatai vagy szuszpenziói fordulnak elő. Vizes hordozókként például a vizet, pufferolt vizet, sóoldatot (0,4%-os), glicinoldatot (0,3%-os), hialuronsavat és hasonló ismert hordozókat alkalmazhatunk. Vizes hordozók mellett szóba jöhetnek az oldószerek is, mint például dimetil-szulfoxid, propilénglikol, dimetil-formamid és ezek elegyei. A készítmény ezeken kívül gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokat, például pufferanyagokat, valamint szervetlen sókat is tartalmazhat, hogy a normál ozmotikus nyomást és/vagy hatékony liofilizálását biztosítsuk. Ilyenfajta adalékokra például szolgálhatnak a nátrium- és káliumsók, például kloridok és foszfátok, szacharóz, glükóz, fehérjehidrolizátumok, dextrán, poli(vinil-pirrolidon) vagy polietilénglikol. A készítményeket a szokásos technikák segítségével sterilizálhatjuk, például sterilszűréssel. A készítményt ebben a formában közvetlenül letölthetjük vagy liofilizáljuk, és felhasználás előtt egy steril oldattal összekeverjük.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények egyik előnyös kiviteli alakban topikus készítmények, például dermális, illetve transzdermális beadás céljára. A gyógyszerkészítmények például poliakrilsav- vagy poliakrilamid-alapú hidrogélek (mint például Dolobene®, Merckle), vagy polietilénglikol (PEG) hordozóval készített kenőcsök, mint a standardkenőcs DAB 8 (50% PEG 300, 50% Peg 1500), vagy emulziók, mindenekelőtt „víz az olajban” típusú, illetve „olaj a vízben” típusú mikroemulziók formájában lehetnek, melyekhez adott esetben liposzómákat is hozzáadunk. Síkosítóanyagokként („Schlepper”) úgynevezett szulfoxidszármazékokat, így dimetil-szulfoxidot (DMSO) vagy decil-metil-szulfoxidot (decil-MSO), valamint transcutolt (dietilénglikol-monoetil-éter) vagy ciklodextrint, továbbá pirrolidonokat, például 2-pirrolidont, N-metil-2-pirrolidont, 2-pirrolidon-5-karbonsavat vagy biológiailag lebontható N-(2-hidroxi-etil)-2-pirrolidont és ezek zsír9

HU 224 410 Β1 sav-észtereit, karbamidszármazékokat, például dodecil-karbamid, 1,3-didodecil-karbamid és 1,3-difenil-karbamid, terpéneket, például D-limonén, menthon, a-terpinol, carvol, limonen-oxid vagy 1,8-cineol, tartalmazhatnak.

További előnyös felhasználási formák az aeroszolok, például orrspray-k vagy inhalációs beadás céljára.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket liposzómák segítségével is beadhatjuk, emulziók, habok, micellák, oldhatatlan egyrétegek, foszfolipiddiszperziók, lamelláris rétegek és hasonlók formájában. Ezek szállítókként szolgálnak ahhoz, hogy a peptideket célirányosan egy bizonyos szövethez elszállítsák, például a limfoid szövethez vagy tumorszövethez, illetőleg a peptidek féléletidejét meghosszabbítsák.

Amikor a találmány szerinti készítményeket topikus beadásra formulázzuk, ezek UV-abszorbereket is tartalmazhatnak, hogy például profilaktikus felhasználásnál a melanomával szemben egyidejűleg mint napvédő szerek is hatásosak legyenek.

A szakember a megfelelő segédanyagokat és formulázásokat standard kézikönyvekből, mint például „Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990, át tudja venni.

Az ábrák ismertetése

1. ábra: DBA/2 egerek vakcinálása mastozytom

P815 ellen KYQAVTTTL peptiddel

2. ábra: DBA/2 egerek vakcinálása mastozytom

P815 ellen SYFPEITHI peptiddel

3. ábra: DBA/2 egerek vakcinálása mastozytom

P815 ellen SYFPEITHI peptiddel

4. ábra: DBA/2 egerek vakcinálása melanoma

M-3 ellen egy peptidkevérekkel

5. ábra: DBA/2 egerek vakcinálása melanoma

M-3 ellen topikális beadás útján

6. ábra: DBA/2 egerek vakcinálása melanoma

M-3 metasztázísok ellen

7. ábra: M-3 mikrometasztázisokat hordozó egerek gyógyulása egy peptidkeverékkel történő vakcinálás után

8. ábra: sejtek polilizinközvetített terhelése tirozinázzal

9. ábra: vakcinálás utáni T-sejt-aktiválás terápiás modellben (vakcináit állatok lépsejtjei által történő IFN-y-felszabadítás mint az Μ-3-sejtekre adott reakció)

10. ábra: vírusellenes immunitás indukálása ASNENMETM influenza-nukleokapszidpeptid és fukozilált polilizinadjuváns segítségével (CTL-aktiválás)

11. ábra: peptidek kötődésének felerősítése

APC-ken bázikus poliaminosavakkal

12. ábra: sejtmembrán permeabilizálása bázikus poliaminosavakkal (LDH-felszabadulás a sejtek polilizinnel vagy poliargininnel történő kezelését követően)

13. ábra: peptidek internalizálása poliargininnel

14. ábra: peptidek transzportja a csontvelőből származó antigént bemutató sejtekbe

15. ábra: peptidek transzportjának fokozása az antigént bemutató sejtekbe polikationos poliaminosavak és hisztonok segítségével

16. ábra: transzporthatékonyság bázikus aminosavak polimerizációs fokának függvényében

17. ábra: peptidek transzportja alacsony molekulatömegű poliargininnel

18. ábra: transzporthatékonyság befolyásolása a peptidterhelés függvényében

Az alábbi példákban - hacsak másképp nem adjuk meg - a következő anyagokat és módszereket alkalmaztuk.

A) Sejtek

a) Sejtvonalak

A Cloudman S91 egér-melanomasejtvonalat (klón M-3; ATCC CCL 53.1), a P815 mastozytom-sejtvonalat (ATCC TIB 64) és a P388D1 monocita-makrofág-sejtvonalat (ATCC TIB 63) az ATCC-től szereztük be. A sejteket magas glükóztartalmú DMEM-tápközegben („High Glucose DMEM, Life Technologies) tenyésztettük, melyet 10% FCS-sel, 2 mM L-glutaminnal és 20 pg/ml gentamicinnel egészítettünk ki. A sejteket rutinszerűen teszteltük mikoplazma-szennyezésre (PCR-Mycoplasma Detection Kit, Stratagene).

Az RMA/S egér-limfómasejtvonalat Kárre és munkatársai, 1996, és Ljunggren és munkatársai, 1990, írták le.

b) Csontvelőből származó antigént bemutató sejtek (APC)

Először DBA/2 egerek felsőcombcsontjait átöblítettük. A csontvelősejteket magas glükóztartalmú DMEM-tápközegben, amely 10% FCS-t, 5% lószérumot, 2 mM L-glutamint és 20 pg/ml gentamicint tartalmazott, 200 egység/ml egér-GM-CSF (Li és munkatársai, 1989, Genzyme, Cambridge, MA, USA) tenyésztettük. Az első öt nap alatt minden 24 órában a tápközeg kétharmadát kicseréltük, hogy a nem adherált granulocitákat és B-sejteket eltávolítsuk (Inaba és munkatársai, 1992). Mind az adherált mind a szabad rátapadó sejteket PBS/5 mM EDTA-val történő inkubálás során a 8. és 10. nap között összegyűjtöttük, és lyukanként 3*10⁴ sejtet vittünk fel egy 8 üreges mikroszkóptárgylemez mélyedéseibe (Nunc, Roskilde, Dánia). A sejtek több mint 90%-a pozitív reakciót mutatott F4/80 antitesttel (Endogén, Cambridge, MA, USA).

B) Peptidszintézis

A peptideket egy peptidszintetizátorban (Modell 433 A Feedback-monitorral, Applied Biosystems, Foster City, Kanada) TentaGel S PHB felhasználásával (Rapp, Tübingen) mint szilárd fázissal Fmoc-módszer szerint (HBTU-aktiválás, Fastmoc™, méretarány 0:25 mmol) szintetizáltuk. A peptideket 1 M TEAA-ban, pH 7,3 feloldottuk, és reverz kromatográfia segítségével egy Vydac C18 oszlopon tisztítottuk. A szekvenciákat egy MÁT lézermatban (Finnigan, San Jose, Kanada) „repülőidő’’-tömegspektrometria segítségével határoztuk meg.

HU 224 410 Β1

C) Az alkalmazott peptidek listája

1. táblázat

Peptidelnevezés	Szekvencia	Hozzá tartozó antigén	Aminosavszámozás a fehérében	MHC-haplotípus
kpepl17	SYFPEITHI	tirozin-kináz JAKI	355-363	H2-Kd
kpepl18	KYQAVTTTL	Tum-P198	14-22	H2-Kd
Kpepl62	GPPHSNNFGY	Tum-P35B	4-13	H2-Dd
Kpepl63	ISTQNHRAL	P91A	12-20	H2-Ld
Kpepl64	LPYLGWLVF	P815	35-43	H2-Ld
kpepl43	RYAEDYEEL	trp-1		H2-Kd
kpepl45	PYLEQASRI	tirozináz		H2-Kd
kpepl46	YYVSRDTLL	tirozináz		H2-Kd
kpepl50	YYSVKKTFL	trp-1		H2-Kd
	ASNENMETM	influenza-nukleokap- szid-peptid		H2-Kd

Peptidkeverékek l-es peptidkeverék M-3 melanoma elleni vakcinához: kpep143, kpep145, kpep146, kpep150.

Ill-as peptidkeverék mastozym P815 elleni vakcinához: kpep117, kpep118, Kpep162, Kpep163, Kpep164.

D) Vakcinák előállítása

D1) Egyes peptidvakcinák

a) Az egyes kontroll-peptidvakcinákat adjuváns nélkül állítottuk elő, amelyek a peptidet 1 mg/ml koncentrációban PBS-ben tartalmazták. Az inkubációs idő az injekcióig 4 óra volt szobahőmérsékleten.

b) Egyes peptidvakcinákat adjuvánsként polilizinnel állítottunk elő (ha az alábbiakban másként nem adjuk meg, 200 lánchosszúságú polilizint alkalmaztunk), amelyekben a peptidet és polilizint a megadott mennyiségekben HBS-ben összekevertük. Az inkubációs idő az injekcióig 4 óra volt szobahőmérsékleten.

i) Ahhoz, hogy 16 pg peptidhatóanyagot tartalmazó vakcinát kapjunk, 11,8 pg polilizint 160 pg kpep117 peptiddel 1 ml HBS összetérfogatban összekevertünk.

ii) Ahhoz, hogy egy 100 pg hatékony peptidet tartalmazó vakcinát nyerjünk, 74 pg polilizint összekevertünk 1 mg kpep117 peptiddel 1 ml HBS összetérfogatban.

c) Egyes peptid-kontrollvakcinákat állítottunk elő inkomplett Freund-adjuvánssal (IFA), amelyekben a peptidet és az IFA-t a megadott mennyiségekben emulgeáltuk. Az inkubációs idő az injekcióig 30 perc volt szobahőmérsékleten.

i) Egy 16 pg hatékony peptidet tartalmazó kontrollvakcina előállításához 192 pg kpep117 peptidet 600 pl HBS-ben 600 pl IFA együtt emulgeáltunk.

ii) Egy 100 pg hatékony peptidet tartalmazó kontrollvakcina előállításához 1,2 mg kpepl 17 peptidet 600 pl HBS-ben 600 pl IFA-val együtt emulgeáltunk.

D2) Peptidkeverékek, mint vakcinák

a) Az l-es peptidkeverék, mint adjuváns nélküli kontrollvakcina, a kpep143, kpep145, kpep146, kpepl 50 peptidek mindegyikéből 250 pg-ot tartalmazott 1 ml PBS össztérfogatban.

b) A Ill-as peptidkeverék, mint adjuváns nélküli kontrollvakcina a kpepl 17, kpepl 18, Kpep162, Kpep163, Kpep164 peptidek mindegyikéből 250 pg-ot tartalmazott 1 ml PBS össztérfogatban.

c) Az l-es peptidkeverék-vakcinát adjuvánsként polilizinnel állítottuk elő, amelyben 1 mg l-es peptidkeveréket (amely minden egyes peptidből 250 pg-ot tartalmazott) 74 pg polilizinnel HBS-ben összekevertünk. Az inkubációs idő az injekcióig 4 óra volt szobahőmérsékleten.

d) A Ill-as peptidkeverék-vakcinát adjuvánsként polilizinnel állítottuk elő, amelyben 1,25 mg Ill-as peptidkeveréket (amely minden egyes peptidből 250 pg-ot tartalmazott) 93 pg polilizinnel HBS-ben összekevertünk. Az inkubációs idő az injekcióig 4 óra volt szobahőmérsékleten.

e) Az l-es peptidkeverék kontrollvakcinát adjuvánsként inkomplett Freund-adjuvánssal állítottuk elő, amelyben 1,2 mg l-es peptidkeveréket (amely minden egyes peptidből 300 pg-ot tartalmazott) 600 pl HBS-ben 600 pl IFA-val emulgeáltunk. Az inkubációs idő az injekcióig 30 perc volt szobahőmérsékleten.

f) A Ill-as peptidkeverék kontrollvakcinát adjuvánsként inkomplett Freund-adjuvánssal állítottuk elő, amelyben 1,5 mg Ill-as peptidkeveréket (amely minden egyes peptidből 300 pg-ot tartalmazott) 600 pl HBS-ben 600 pl IFA-val emulgeáltunk. Az inkubációs idő az injekcióig 30 perc volt szobahőmérsékleten.

HU 224 410 Β1

g) Helyi beadás céljára adjuvánsként polilizint tartalmazó vakcinát állítottunk elő úgy, hogy 1 mg l-es peptidkeveréket (amely minden egyes pepiidből 250 pg-ot tartalmazott) 74 pg polilizinnel 4 órán keresztül inkubáltunk HBS-ben 400 pl össztérfogatban.

h) Helyi (topikus) beadáshoz adjuváns nélküli kontrolivakcinát állítottunk elő úgy, hogy 1 mg l-es peptidkeveréket (amely minden egyes peptidből 250 pg-ot tartalmazott) 200 pl össztérfogatban 1,8 g DOLOBENE (Merckle) hidrogélbe bekevertünk.

i) Fukózzal kapcsolt polilizin előállítását (lánchosszúság: 240, illetve 200) MacBroom és munkatársai, 1992, által leírt módszer szerint végeztük, melynek során körülbelül 40%-os szubsztitúciót lehetett elérni (a kiindulási anyagokat a β-L-fukopiranóz-fenil-izotiocianátot és a polilizint a Sigma cégtől szereztük be).

j) Amikor transzferrin/polilizin konjugátumot (a WO 93/07283 számú közrebocsátási iratban leírtak szerint állítottuk elő) alkalmaztunk, a mennyiségeket úgy állítottuk be, hogy a polilizin abszolút mennyisége 75 pg pro mg peptid legyen. Amikor plazmid-DNS-t (üres plazmid pSP65, LPS-mentes, Boehringer Mannheim) komplexbe integráltunk, az arányok a következők voltak: 37,5 pg DNS/75 pg polilizin/1 mg peptid. Abban az esetben, ha 160 pg helyett 1 mg peptidet alkalmaztunk, az egyéb faktorok mennyiségét ugyanezzel a faktorral (6,25) csökkentettük.

E) Injekciós vakcinák

A szubkután injekció előtt az egereket, csoportonként 8 állatot, egy izolált légkamrában narkotizáltuk. 3,5 perces Halothan-kezelés után (4% oxigénben, átfolyási sebesség 4) az egerek kb. 1 percig elkábultak; ebben az időben a vakcinát szubkután beinjekcióztuk.

Az intraperitoneális injekciót sikerült érzéstelenítés nélkül beadni. Az injekciós térfogat minden vakcina esetében 100 pl volt állatonként, ami megfelel 100 pg egyes peptidnek vagy l-es peptidkeveréknek állatonként. A lll-as peptidkeverék esetén egerenként 125 pg összes peptidmennyiséget adtunk be.

F) A vakcina helyileg történő (topikus) alkalmazása Egerenként 200 mg kenőcsöt, amely 100 pg peptidet vagy 125 pg l-es peptidkeveréket tartalmazott, a leborotvált állatok bőrébe bedörzsöltünk, éspedig az egész háton és a füleken.

G) A vakcina alkalmazása tumornövekedés ellen egérmodellben

A rákvakcinák hatékonyságának tesztelésére szolgáló vizsgálati módszer a profilaktikus vagy terápiás egérmodellben megfelel - ha másképp nem jelezzük - a WO 94/21808 számú közrebocsátási iratban leírt elvnek, ahol egérmodellként a DBA/2-modellt alkalmazzuk.

1. példa

DBA/2 egerek vakcinálása mastozytom P815 ellen

160 pg KYQAVTTTL szekvenciájú peptidet (kpepl 18), melyet Lethe és munkatársai által 1992-ben leírt P815 tumorantigénből vezettünk le, és megfelel a H2-K egyik ligandjának, 11,8 pg polilizin 300-zal 500 pl HBS-ben összekevertünk, és 4 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltunk. Ezután 500 pl EBSS-t (Earl-féle pufferolt sóoldat) adtunk hozzá. A kapott keverékek 100 pl-ét 8 egérnek egyhetes időközökben szubkután beadtuk. Ezen előimmunizálás után még egy további hét elteltével a tumorokat behelyeztük, amikor is minden egeret a P815 mastozytom-sejtvonal 5*10^{1 * * 4} sejtjével (ATCC Nr. TIB 64; ezek a sejtek azt a tumorantigént expresszálják, amelyből a P185 peptidet levezettük) 100 pl EBSS-ben kontralaterálisan injekcióztunk. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit mutatjuk be az 1. ábrán (telített négyzet).

Egy párhuzamos kísérletben 200 pg peptidet 500 pl HBS-sel elkevertünk, és végül 500 pl Freund-adjuvánssal emulgeáltunk. A kapott emulzió minden egyes 100 pl-ével 8 egeret előimmunizáltunk, és végül P815 tumorsejtekkel beoltottuk, mint a fentiekben megadtuk (1. ábra: telített kör).

Egy további párhuzamos kísérlethez egy celluláris tumorvakcinát állítottunk elő az alábbiak szerint.

160 pg kpepl 18 peptidet 3 pg transzferrin-polilizinnel (TfpL), 10 pg pL-lel és 6 pg psp65 plazmiddal (LPS-mentes) 500 pl HBS-pufferben összekevertünk. 30 perc állás után szobahőmérsékleten a fenti oldatot egy T75 sejttenyésztő lombikban NIH3T3 allogén fibroblasztsejtvonal (ATCC Nr. CRL 1658) 1,5*10⁶ sejtjével 20 ml DMEM-médiumban (10% FCS, 20 mM glükóz) 37 °C-on inkubáltunk. Három óra múlva a sejteket friss tápközeggel helyettesítettük, és egy éjszakán át 37 °C-on és 5% CO₂ jelenlétében inkubáltuk. A beadás előtt 4 órával a sejteket 20 Gy-vel besugároztuk. A vakcina feldolgozását a WO 94/21808 közrebocsátási iratban leírtak szerint végeztük. Ezzel a vakcinával az előimmunizálást egyhetes időközökben 10⁵ sejttel végeztük; egy héttel később tumorbehelyezést hajtottunk végre, amint a fentiekben leírtuk (1. ábra: telített háromszög). Amint az ábrán látható, az a vakcina, amely a peptidet és polilizint együttesen tartalmazta, biztosította a legjobb védelmet az egereknek a tumorképződéssel szemben.

2. példa

DBA/2 egerek vakcinálása mastozytom P815 ellen egyes vakcinákkal

a) Három peptidvakcinát, amely a kpepl 17 peptidet önmagában (2a. ábra) vagy a kpepl 17 peptidet IFA-ban emulgeálva (2b. ábra) vagy a kpepl 17 peptidet polilizinadjuvánssal (lánchossz: 240) (2c. ábra) tartalmazta, P815 tumor elleni védőhatásra teszteltünk. Az injekciós térfogat minden esetben 100 pl; az injekciót szubkután (se.) vagy intraperitoneálisan (ip.) alkalmaztuk. A naiv egerek szolgáltak negatív kontrollként, egy egész sejtes vakcina, amely GM-CSF-et szekretáló P815-sejtekből állt, szolgált pozitív kontrollként (P815-GM-CSF; állatonként 10⁵ sejt 100 pl-ben szubkután beinjekciózva). Minden kísérleti csoport 8 állatból állt, melyeken 7 napos időközönként három vakcinálási végeztünk. Egy héttel az utolsó vakcinálás

HU 224 410 Β1 után az állatok egy kontralaterális tumorfertőzést kaptak 5*10^{3 4} P815-sejtekkel. Az állatokat naponta megszemléltük, a tumor megjelenését egyhetes időközökben kontrolláltuk.

A kpepl 17 peptid polilizin adjuvánssal együtt mutatta a legjobb tumorellenes hatást, amikor állatonként 100 pg szubkután injekciót adtunk (8 állat közül 3 védetté vált). Ez a hatás megközelítőleg olyan jó, mint amit a teljes sejtes vakcinával sikerült elérni (8 állatból 4 védetté vált). 16 pg peptid polilizinnel együtt kevésbé hatásos (2 állat lett védett), azonban egyértelműen jobb, mint a 100 pg peptid PBS-ben (2a. ábra, nincs védőhatás). Ha IFA-ban emulgeáljuk is a célpeptidet, nincs olyan hatás, amelyet polilizinnel együtt kaptunk (2c. ábra).

b) Egy további, P815 mastozytommodellben végzett kísérletben két módosítatlan, különböző lánchosszúságú polilizint hasonlítottunk össze egymással, egy rövidebb, csak 16 lizinmaradékot tartalmazót (pL16) és egy hosszabb, 240 maradékot (pL240). A kontrollcsoport állataiba 100 pg kpepl 17 peptidet injekcióztunk vagy PBS-ben oldva vagy IFA-ben emulgeálva. Két GM-CSF-et szekretáló celluláris kontrollvakcinát alkalmaztunk pozitív kontrollként [vö. a)], melyek közül az első vakcinát stabil transzficiált P815-sejtekből, és a második vakcinát tranziens transzfekció segítségével, Wagner és munkatársai, 1992, által leírt AVET módszer felhasználásával kaptuk. Mindkét egész sejtes vakcina összesen nyolc állatból négy, illetve öt állatnak nyújtott védelmet. A peptidalapú vakcinák, melyek csak pepiidből vagy IFA-ban emulgeált peptidből álltak, semmiféle védőhatást nem mutattak; minden állatban kifejlődtek tumorok nem sokkal a tumorsejtek behelyezése után. Ha azonban a peptidet polilizinnel együtt adtuk be, a peptidvakcina megvédte az állatokat a tumor kifejlődése ellen: nyolc közül két állat volt védett, ha a hosszú polilizint (pL240) alkalmaztuk, és nyolc közül négy állat a rövid polilizin esetében. Ezek az eredmények, melyek a 3. ábrán láthatók, azt mutatják, hogy az egyes peptidek, ha azokat adjuvánsként polilizinnel együtt adjuk be, hatékony antitumorvédelmet biztosítanak, amely összemérhető az egyik leghatékonyabb citokinszekretáló egész sejtes vakcinával, melyre az irodalomban az antitumorvakcinálásban standardként hivatkoznak (Dranoff és munkatársai, 1993; Schmidtés munkatársai, 1995).

3. példa

DBA/2 egerek vakcinálása mastozytom P815 ellen tumorvakcinákkal, melyek P815 peptidet vagy P815 peptidek keverékét tartalmazzák A vakcinák előállításánál az alábbi peptideket alkalmaztuk: kpepl 18 (100 pg pro injekció); lll-as peptidkeverék (kpepl17, kpepl18, kpep162, kpep163, kpepl 64), amely tartalmazta az összes eddig ismert P815 peptidet; injekciónként 25 pg-ot minden egyes peptidből. Pozitív kontrollként GM-CSF-et szekretáló P815-sejteket alkalmaztunk.

Az előkísérletekben a kpepl 17 peptid mutatta a legjobb védőhatást a P815-tumor kifejlődésével szemben, ha 100 pg peptidet polilizinnel (7,5 pg polilizin/100 pg peptid, megfelel a standard arányoknak; polilizin lánchosszúsága=200) együtt alkalmaztunk. A kpepl 17 kisebb mennyisége (16 pg) esetén gyengébb hatást észleltünk. Ebben a példában állatonként 100 pg kpepl 18 peptidet injektáltunk, éspedig egyszer csak polilizinnel (B csoport), egyszer transzferrin-polilizinnel (C csoport) és egyszer transzferrin-polilizin/DNS-sel (D csoport). Kontrollként kpepl 18-at IFA-val alkalmaztunk. Ebben a kísérletben a kpepl 18 önmagában semmi védőhatást nem mutatott a tumor kifejlődésével szemben.

A 4. példában kivitelezett kísérletek azt mutatják, hogy egy vakcina, amely melanomapeptidekből egy peptidkeveréket tartalmaz, védőhatással bír melanoma ellen. Ezért ebben a példában megvizsgáltuk, hogy vajon a peptidkeverék-koncepció alkalmazható-e a P815-re is.

A lll peptidkeveréket egyszer csak polilizinnel (E csoport), egyszer transzferrin-polilizinnel (F csoport) és egyszer transzferrin-polilizin/DNS-sel (G csoport) együtt adtuk be. Kontrollként a lll-as peptidkeveréket IFA-ban alkalmaztuk. Negatív kontrollként naiv egereket használtunk; pozitív kontrollként GM-CSF-transzficiált P815-sejteket (10⁵ sejt pro egér).

Ebben a példában lefolytatott kísérletekben kifejlődött - a többi kísérlettel összehasonlítva - egy korábban nem tipikus dolog: a pozitív kontrollcsoportban (GM-CSF-szekretáló sejtek) minden állatban kifejlődtek tumorok nem sokkal a tumor beoltása után, ahol ezen tumorok legtöbbje éppen olyan gyorsan el is tűnt, mint ahogy keletkezett. Ennek egyik lehetséges magyarázata az, hogy a tumor egy kis ideig növekedett, mielőtt elhalt volna. Egy második lehetséges magyarázat az lenne, hogy a tumorként diagnosztizált daganatot nem a tumor növekedése idézte elő, hanem egy erős immunsejt-infiltráció (granuloma). Mivel az állatokat nem öltük le, az okokat nem tudtuk pontosan megállapítani; mindenesetre a beoltott tumorok végül eltűntek. Egy további érdekes eredményt a G csoportban kaptunk, ahol az állatokat a lll-as peptidkeverék és polilizin kombinációjával kezeltük. Minden állatban kifejlődtek tumorok, azonban kettőben közülük a tumoros daganat (illetve a immunsejt-infiltráció) nagysága viszonylag csekély volt, nem híztak, és az egerek nem néztek ki betegnek. Ezt a két állatot nem öltük le, hanem megfigyelés alatt tartottuk. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a tumorok kilenc héttel a tumorbeültetés után már nem voltak kimutathatók, ez egy eddig nem megfigyelt eredmény. A nyolc állat közül kettő végül elpusztította a tumorterhét. A tumorok széttörését a kpepl 17 peptidkeverékre lehetett visszavezetni, a 2. példa analógiája alapján, ahol nyolc állatból kettő 16 pg kpepl 17-tel és nyolc állatból három 100 pg kpepl 17-tel védetté vált. A védőhatást azonban a keverék több mint egy peptidjével is ki lehetett váltani.

4. példa

DBA/2 egerek melanoma M-3 elleni védelme egy peptidkeveréket tartalmazó tumorvakcinával történő előimmunizálással

Egy profilaktikus vakcinát alkalmaztunk, amely melanomapeptidek keverékét (l-es peptidkeverék, D2 bekezdés) tartalmazta.

HU 224 410 Β1

Az előimmunizálási protokollt, valamint a tumorok beoltását a 2. példában leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy a tumorbeoltás Μ-3-sejtekkel történt (10⁵ sejt pro állat). Kontrollvakcinaként egy egész sejtes, Μ-3-sejtekből álló vakcinát használtunk, amely optimális mennyiségű IL-2-t (1000-2000 egység pro 10⁵ sejt) szekretált, és amelyet Schmidt és munkatársai, 1995, által leírtak szerint állítottunk elő. A megválasztott kísérleti körülmények között ez a vakcina 100%-os védelmet biztosított (4. ábra). A kísérleti állatok 4 csoportját a peptidkeveréket tartalmazó vakcinával kezeltük. Két csoport vagy se. vagy ip. IFA-ban emulgeált peptidet kapott. A másik két csoport vagy se. vagy ip. kapta a peptideket polilizinnel együtt (pL240).

A 4. ábra bemutatja az adjuvánsként pL240 polilizint tartalmazó peptidvakcinák védőhatását; a kezelt egerek 50%-a az Μ-3-tumorfertőzéssel szemben védelmet biztosított összehasonlítva a kezeletlen állatokkal, amelyekben gyorsan szolid tumorok fejlődtek ki. Ezt a hatást akkor tudtuk elérni, amikor a peptid/polilizin vakcinát szubkután injekcióztuk be vagy hidrogél formájában a bőrre vittük fel (5. ábra). A másik három kontrollcsoportban, amelyeket peptid/polilizin vakcinákkal ip. vagy IFA-ban peptidekkel kezeltünk, a vakcinák lényegében hatástalanok voltak. Itt a beoltott tumorok nem lökődtek ki, és a tumorok a kezeletlen kontroliokkal összehasonlítva csak csekély késleltetéssel növekedtek. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy egy peptidkeveréket tartalmazó vakcina antitumor-védőhatást biztosít, ha polilizint is tartalmaz. A kiválasztott kísérleti körülmények között ezek a peptidvakcinák csak félig olyan hatásosak, mint a celluláris IL-2-vakcina, amely a megjelent, rövid közleményekkel egybevágóan (Zatloukal, 1993, Zatloukal, 1995), egészen 100%-os védelmet nyújt a 10⁵ élő Μ-3-sejttel beoltott állatokban.

5. példa

DBA/2 egerek védelme Μ-3-metasztázisokkal szemben

a) Egy terápiás vakcinát készítettünk, amely melanomapeptidek keverékét tartalmazta (l-es peptidkeverék, leírva D2 bekezdésben). Egyhetes időközönként három vakcinálást (se.) végeztünk. Az első vakcinálást 5 nappal a metasztázisok kiváltása után, ennélfogva ez volt egy ötnapos metasztázis elleni oltás. 1,2*10⁴ Μ-3-sejtet metasztázisok kiváltására beinjekcióztunk, ehhez a WO 94/21808 számú közrebocsátási iratban és Schmidt és munkatársai, 1996, által leírt protokollt alkalmaztuk.

Vakcinaként az l-es peptidkeveréket használtuk: adjuváns nélkül (pepmixl PBS), adjuvánsként IFA-val (IFA pepmixl) vagy fukózzal módosított polilizinnel (fpL pepmixl). A kontrollcsoportok semmilyen vakcinát sem kaptak (naiv) vagy a 4. példában felhasznált IL-2-t termelő M-3 egész sejtes vakcinát. A 6. ábrán látható, hogy a legjobb védelmet abban a csoportban értük el, amelyet adjuvánsként a fukózzal módosított polilizint tartalmazó l-es peptidkeverékkel kezeltünk (6a. ábra). Az egerek 50%-a képes volt kilökni a metasztázisokat (4/8). Ez a kezelés sokkal hatásosabb, mint az egész sejtes vakcina, amely az egereknek csak 30%-ában biztosított védelmet (3/9). Az IFA-t tartalmazó vagy adjuváns nélküli vakcina csupán csak késleltette a tumorhoz tartozó metasztázisok kinövését (6b. ábra).

b) Egy további, terápiás modellben végzett kísérletben egy olyan vakcina védőhatását vizsgáltuk, amely az l-es peptidkeveréket tartalmazta, és amelyet szubkután adtunk be. A kontrollcsoportok a peptidkeveréket PBS-ben kapták (adjuváns nélkül) vagy IFA-ban. Adjuvánsként módosítatlan polilizin 240-et alkalmaztunk. Ezenkívül adjuvánsként fukózzal módosított polilizint (fpl200) használtunk. Kontrollként az állatok egy csoportját IL-2-t expresszáló celluláris vakcinával kezeltük ebben a kísérletben. Amint a 7a. ábrán látható, a peptid/polilizin vakcinák az Μ-3-metasztázisok kezelésében hatásosak. Szignifikáns gyógyulási arányt értünk el ebben a kísérletben a fukózzal módosított polilizinnel. Ennél a kezelésnél az állatok 50%-ában a metasztázisok kilökődtek, összehasonlítva az IL-2-vakcinával, amely ebben az esetben az állatok 70%-ában gyógyulást, azaz jobb eredményt produkált.

c) Egy további kísérletben terápiás modellben azt vizsgáltuk, hogy miként hat a polikationok változtatása és módosítása a tumorellenes hatásra. Ennélfogva a nem módosított és fukózzal módosított polilizin 200 mellett a rövid, nem módosított polilizin pL16-ot, a hosszú polilizin pL450-et és egy további polikationt, nevezetesen a poliarginint (pArg720) teszteltük. Pozitív kontrollként egy celluláris, optimális mennyiségű (>10 ng pro 10⁵ sejt)) GM-CSF-et szekretáló Μ-3-vakcinát alkalmaztunk (Schmidt, 1995). Ebben a kísérletben is a kontrollcsoportok a peptidkeveréket IFA-ban vagy minden adjuváns nélkül kapták. Amint az 5b. példában is, a legjobb hatást adjuvánsként a fukóz-polilizin-tartalmú vakcinával értük el (7b. ábra). Ebben a csoportban az állatok 40%-a kilökte a metasztázisokat, összehasonlítva a rövid polilizin pL16-ot kapott csoporttal, ahol 30%-ban. Azon a csoporton kívül, amely a peptidet poliargininnel együtt kapta, az állatok többi csoportja, melyeket peptidvakcinával kezeltünk, csak rövid ideig késleltette a tumorok keletkezését. A nem módosított poliarginin ebben a kísérletben éppolyan hatásos volt, mint fukózzal módosított polilizin, ez a metasztázisok kilökődéséhez vezetett négy állatban a tíz közül.

A 7c. ábra ennek a poliargininnel elért effektusnak az ismétlését mutatja be egy független kísérletben. Itt is látható, hogy a poliargininnel és peptidkeverékkel történő együttes vakcinálás nyolc kezelt állatból négyben tumorellenes hatású.

6. példa

Sejtek „transzloading”-ja tirozinázzal polilizinadjuváns alkalmazása során

Ez a példa kísérletként szolgál annak bemutatására, hogy a polilizin adjuvánsként alkalmas a nagyobb fehérjefragmensekkel vagy teljes fehérjékkel bíró sejtek megterhelésére, melynek során sejtként helyettesítő Μ-3-sejteket alkalmaztunk.

HU 224 410 Β1

A sejtek terheléséhez legelőször 160 gg FITC-jelzett tirozinázt (EC 1.14.18.1; Sigma) 3 gg polilizinnel (pL240) összekevertünk, és 3 órán keresztül inkubáltunk. Ezután a kapott oldatot hozzáadtuk egy T75 sejttenyésztő lombikban lévő 2*10⁶ Μ-3-sejthez és 37 °C-on inkubáltuk. Ezt követően a sejteket kétszer PBS-sel mostuk, PBS/2 mM EDTA-val leoldottuk, és 1 ml PBS/5% FCS-ben FACS-analízishez felvettük. A 8. ábra bemutatja az Μ-3-sejtek terhelését tirozinázzal (a bal oldali görbe mutatja a kontrollt, a jobb oldali a tirozinázterhelést).

7. példa

T-sejt-aktiválás meghatározása immunizálás után terápiás modellben

Miután a peptid/polikation vakcinák terápiás egérmodellben (vö. 5. példa) egyértelműen hatást mutattak, megvizsgáltuk, vajon ezek a kezelések a T-sejtek aktiválásához is vezetnek-e. Erre a célra vakcináit állatok lépsejtjeinek szülő-M-3-sejtekkel való együttinkubálása utáni citokinszekrécióját használtuk fel markerként (Kawakami és munkatársai, 1994b).

A vakcináit és kezeletlen állatokból egysejt-lépszuszpenziót készítettünk, ezt követően eritrocitalizátumot hipotóniás pufferrel (0,15 NH₄CI, 1 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Az adherált sejteket eltávolítottuk, amelyben 3*10® lépsejtet pro ml DMEM-tápközegben (10% FCS) Petri-csészékben 90 percig 37 °C-on inkubáltunk. A nem adherált sejteket óvatosan lepipettáztuk és 1*10³ szülősejttel különböző mennyiségi arányban együtt tenyésztettük. A sejteket 200 gl DMEM-tápközegben (10% FCS), 2 ml L-glutamin és 20 pg/ml gentamicin jelenlétében egy 96 lyukú lapos fenekű szövettenyésztő lemezen tenyésztettük. A 9. napon 100 gl felülúszót learattunk, és egy kereskedelemben kapható ELISA-Kit (Endogén, Cambridge, MA, USA) segítségével a mindenkori IFN-y-tartalmat a gyártó előírásai szerint eljárva megmértük. Azt találtuk, hogy kilencnapi inkubálás után csak a vakcináit állatok lépsejtjei szekretáltak nagyobb mennyiségű IFN-y-t a tápközegbe, míg a kezeletlen állatok lépsejtjeinek és az Μ-3-sejteknek az együtt-tenyésztése gyakorlatilag semmilyen mérhető IFN-y-t nem eredményezett. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 9. ábrán mutatjuk be.

8. példa

Antivirális immunitás indukálása ASNENMETM influenza-nukleokapszidpeptid és fukozilált polilizin mint adjuváns alkalmazásával

Egy vakcinát állítottunk elő, amely minden 1 mg ASNENMETM peptidre 75 gg fpLys-t tartalmazott. A vakcinát egyszeri injekcióban adtuk be (lásd Módszerek rész), amikor állatonként 100 gg peptidet és 7,5 gg fpLys-t injekcióztunk be. A kontrollok 100 gg peptidet önmagában (PBS) tartalmazó injekciót, illetve semmilyen injekciót sem kaptak (naiv kontroll).

RMA-S egér-limfómasejteket egy éjszakán át szérummentes tápközegben 26 °C-on 10 pg/ml ASNENMETM peptiddel inkubáltunk.

Tíz nappal a vakcinálás után a vakcináit állatokból lépsejteket izoláltunk, ezeket a peptiddel terhelt RMA-S sejtekkel 5:1 arányban összekevertük, és 5 napon keresztül tovább inkubáltuk (Stuber és munkatársai, 1994). A felülúszó effektorlépsejtek számát a különböző kultúrákban meghatároztuk, ezután a sejteket CTL-aktivitás meghatározása céljából standard 4 órás európiumfelszabadító assay (Blomberg és munkatársai, 1993) segítségével RMA-S sejtekkel különböző arányokban összekevertük, amelyeket előzőleg ASNENMETM peptiddel és európium-keláttal elegyítettünk. Amint a 10. ábrán látható, ebben a kísérletben specifikus immunitást csak a peptiddel és fpLys-zel vakcináit állatokban értünk el, abban az esetben azonban nem, ha a peptidet önmagában adtuk.

9. példa

Különböző bázikus poliaminosavak azon képességének vizsgálata, hogy milyen mértékben fokozzák a peptidek intemalizálását és/vagy kötődését az APC-ken

Ezekben a vizsgálatokban egy fluoreszcens assay-t alkalmaztunk: az LFEAIEGFI szekvenciával rendelkező (MHC Kd-korlátozott) modell-peptidantigént fluoreszcein-izotiocianát (FITC) fluoreszcens színezékkel a gyártó (Molecular Probes) utasításai szerint jelöltünk. Az FITC-vel jelölt peptid felvételét, illetve kötődését önmagában („pulzált”) vagy különböző koncentrációjú bázikus aminosavakkal (16-490 lánchosszúságú polilizin, 15-720 lánchosszúságú poliarginin) együtt a P388D1 MHC Kd-korlátozott monocita-makrofág-sejtvonalon átfolyásos citometria segítségével mértük. Ehhez 1*10® P388D1 sejtet 1 ml tápközeg végtérfogatban (DMEM/10% FCS) centrifugacsövecskékben 5 gg FITC-jelölt peptiddel önmagában vagy egy peptid- és poliaminosavkeverékkel 30 percig 37 °C-on inkubáltunk, és ezt követően intenzíven mostunk, hogy a szabad peptidet eltávolítsuk. A poliaminosavakat 50, 25, 12, 6 és 3 gg/ml tápközeg koncentrációban adtuk az 5 gg FITC-jelölt peptidet tartalmazó tápközeghez. A különböző minták relatív fluoreszcens intenzitását összehasonlítottuk, hogy a peptid felvételének és/vagy kötődésének hatékonyságát kiértékeljük. Ennek a kísérletnek eredményei a 11. ábrán láthatók; a kísérleteket mindenkor 25 gg pL450-nel, illetve pArg450-nel végeztük. A megválasztott körülmények között a poliarginin kb. ötször hatásosabbnak bizonyult a polilizinnél.

10. példa

Az APC-k általi peptidfelvétel mechanizmusának vizsgálata

A peptideket az APC-k egy specifikus mechanizmuson keresztül, mint például makropinocitózis vagy receptorközvetített endocitózis (Lanzavecchia, 1996) veszik fel. Egy alternatív mechanizmus abban állhat, hogy a poliaminosavak a sejtmembránt áthatolhatóvá teszik, és ezáltal a peptidek diffúziója a tápközegből a citoplazmába lehetővé válik.

a) Hogy vajon a sejtmembrán permeabilizálása végbemegy-e, olyan vizsgálatot végeztünk, amelyben

HU 224 410 Β1 a laktátdehidrogenáz (LDH) citoplazmatikus enzim felszabadulását mértük izotóniás körülmények között P388D1-sejtek poliaminosavakkal (polilizin vagy poliarginin) történő inkubálása után egy kereskedelemben kapható Kit (Cytotox 96, Promega. Madison, Wisconsin, USA) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. A 12a. ábrában kapott eredmények alapján feltételezhető, hogy a pLys hatása abban áll, hogy a sejtmembránt átjárhatóvá teszi, ami az izotóniás körülmények között felszabaduló citoplazmatikus enzim magasabb koncentrációiban fejeződik ki. Ezzel ellentétben a poliarginines kezelés után (12b. ábra) gyakorlatilag semmi LDH-t nem lehetett kimutatni. Összehasonlítva azokat a mintákat, amelyeket poliaminosavakkal önmagukban kezeltünk, azokkal a mintákkal, amelyeket polilizin és peptidből álló vagy poliarginin és peptidből álló keverékkel kezeltünk, az LDH-felszabadulásban semmi különbséget sem lehetett megállapítani. A csak peptiddel végzett inkubálás után mérhető LDH-aktivitás nem volt kimutatható.

b) Annak eldöntésére, hogy bázikus poliaminosavak jelenlétében vagy távollétében az FTIC-jelölt peptidek internalizálása végbemegy-e, Midoux és munkatársai, 1993, által nyilvánosságra hozott elvet vizsgáltuk meg: a sejtekből az internalizált részecskék az endoszómába transzportálódnak. Összehasonlítva a citoplazmával vagy a sejttenyészet-tápközeggel, melyek neutrális pH-értékkel rendelkeznek, ezek a szervecskék kb. 5-ös savanyú pH-értékkel bírnak. Az FITC által kibocsátott fluoreszkálás erősen pH-függő. Egy olyan környezetben, ahol az endoszómákban található pH-feltételekkel azonosak uralkodnak, a fluoreszcencia elnyomott. Ezért mutatnak az FTIC-jelölt peptidek, amelyek az endoszómákba felvett sejtekből származnak, csökkent fluoreszcenciát. Monenzin hozzáadásakor az endoszómák alacsony pH-értéke neutralizálódik, ami az internalizált FITC-jelölt peptidek mérhetően felerősödött fluoreszcenciájához vezet.

A sejteket poliargininből (átlagosan 100 000 molekulatömeg, lánchossz 490) és fluoreszkáló anyaggal jelölt peptidből álló keverékkel inkubáltuk 4 °C-on vagy 37 °C-on. A 37 °C-on inkubált minták egy aliquotját visszatartottuk, és az átfolyásos citometria analízis előtt 4 °C-on monenzinnel kezeltük.

Azt találtuk, hogy az APC-k meghatározott bázikus aminosavakkal mint például polilizinnel (pLys) vagy poliargininnel (pArg) történő inkubálása a peptid kötődését vagy felvételét az APC-ken fokozta.

Amint a 13. ábrából látható, azokban a sejtekben, amelyeket peptiddel önmagában és monenzinnel kezeltünk, a fluoreszcencia csak csekély mértékű felerősödését lehetett megfigyelni. Ezzel ellentétben azokban a mintákban, melyeket monenzinnel és egy poliargininből és peptidből álló keverékkel kezeltünk, a fluoreszcenciaszignál erősen megnőtt. Semmi peptidfelvételt nem lehetett megfigyelni, ha a mintákat 4 °C-on inkubáltuk. A fluoreszcencia szignifikáns felerősödése a monenzinkezelés után arra vezethető vissza, hogy a peptidek pArg-gal történő terhelése ahhoz vezet, hogy ezek a sejteken belül a vezikulumokban felhalmozódnak (akkumulálódnak) (Midoux és munkatársai, 1993; 13. ábra). Amint várható volt, a polilizinnel terhelt minták monenzines kezelése után a fluoreszcencia csak csekély növekedését figyeltük meg. A polilizinnel történő terhelés 4 °C-on a fluoreszcencia mérhető felerősödését okozta, ami egy további utalás arra, hogy a polilizin hatása főképpen a sejtmembránok permeabilizálására vezethető vissza (12b. ábra).

11. példa

Az APC-k rövid peptidekkel történő terhelésének vizsgálata

Csontvelőből származó, GM-CSF-fel kapott APC-ket egy fluoreszcens anyaggal jelölt peptid plusz polilizin (pL200; Sigma) kombinációjával vagy a peptiddel önmagában fluoreszcens mikroszkóp segítségével vizsgáltunk. A peptidfelvétel mikroszkópos bizonyítására az APC-ket tárgylemezre vittük fel, és 40 pg fluoreszceinnel jelölt LFEAIEGFI peptiddel önmagában vagy 50 pg/ml polilizinnel (pL200) együttesen és 40 pg/ml LFEAIEGFI peptiddel 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. Kimerítő mosás után a sejteket 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk, anti-Fadenttel (Dako, Glostrup, Dánia) befedtük, és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk (Zeiss). A magokat 4,6-diamidino-2-fenil-indollal (DAPI; Sigma) ellenfestettük. A 14. ábrán bemutatjuk a fluoreszcens mikrofotográfiákat, melyek világosan bizonyítják a peptiddel és polilizinnel inkubált sejtek (A) fokozott peptidfelvételét, szemben a csak peptiddel inkubált sejtekével (B). Mialatt a fluoreszcencia azoknál a sejteknél, amelyeket csak önmagában peptiddel kezeltünk („pulzált”), csak szétszórtan és részecskeszerűen lép fel, addig intenzív fluoreszcencia mutatkozott a polilizin jelenlétében peptiddel terhelt sejtekben nem lokalizáltam hanem általában egyenletesen az egész sejtben elosztva.

12. példa

Sejtek peptiddel való terhelésének kvantitatív meghatározása átfolyásos citometria segítségével („Transloading assay)

a) Miután a 11. példában bemutatott kísérletekből látható, hogy az APC-k a kis peptiddel történő terhelésre kiváló célsejtek, in vitro FACS assay-t kiviteleztünk, hogy a peptidvakcina számára alkalmas adjuvánsokat azonosítsuk. Ez az assay a fluoreszcensjelölt peptidek gyors, kvantitatív tesztelését teszi lehetővé; modellpeptidként az LFEAIEGFI szekvenciával rendelkező peptidet alkalmaztuk. Ezekben a kísérletekben APC-ként a P388D1-egérsejtvonalat használtuk. 1χ10⁶ sejtet magas glükóztartalmú és 10% FCS-t tartalmazó DMEM-tápközegben 1 ml végtérfogatban 30 percig 37 °C-on 5 pg peptiddel 5 nmol/ml fluoreszcein-végkoncentrációnál inkubáltunk. A sejteket vagy peptiddel önmagában vagy peptid és polikation kombinációjával vagy peptid és hisztonok kombinációjával emelkedő koncentrációban (3-50 pg/ml), amint a 15. ábrán megadtuk, kezeltük. A következő vegyületeket alkalmaztuk: A: poliornitin (átlagos molekulatömeg 110 000, lánchossz: 580); B: arginingazdag hiszton; C: lizingazdag

HU 224 410 Β1 hiszton; D: poliarginin (átlagos molekulatömeg 100 000, lánchossz: 490); E: polilizin (átlagos molekulatömeg 94 000, lánchossz: 450). Előkísérletekben meghatároztuk, hogy egy 30 perces inkubációs idő adja a maximális peptidfelvételt. Hosszabb kezelés (4, 5 illetve 8 óra) nem eredményezte a fluoreszcens szignál szignifikáns növekedését. Analízis előtt a sejteket nagytérfogatú, 0,2% BSA-t tartalmazó PBS-sel mostuk. Ezután a sejteket 1 ml jéghideg PBS/0,2% BSAban felvettük, és átfolyásos citometria segítségével 10 (FACScan; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) megvizsgáltuk.

A poliarginin és polilizin bizonyultak a leghatásosabb adjuvánsoknak; a poliornitin a megválasztott körülmények között citotoxikus hatást mutatott. A poliargi- 15 nin és polilizin általi peptidfelvétel fokozása korrelációban van a koncentrációval (15d. és 15e. ábra); a felvétel a lánchosszal növekszik (16. ábra).

Megfigyeltük, hogy a poliarginin a kontroliokkal szemben ezerszeresen (10³) fokoz egy szélesebb alkat- 20 más koncentrációtartományban, mint a polilizin, amely 10²-nál kisebb maximális fokozást mutatott, és hogy minden alkalmazott lánchosszúságnál a fehérjék transzportja hatásosabb volt, mint polilizin esetében (16. ábra); a poliarginin lehetővé tett egy hatékony transzportot 25 olyan alacsony koncentrációknál is, mint 3 pg/ml, miközben a polilizin koncentrációjának nagyobbnak kellett lenni 25 pg/ml-nél ahhoz, hogy a fluoreszcencia szignifikáns fokozását kiváltsa (15d., e. ábra).

b) Ahhoz, hogy megállapítsuk, vajon a peptidtranszporthoz mi a lánchosszúság alsó határa, különböző lánchosszúságú poliarginineket (10-30 maradék) szintetizáltunk, és megvizsgáltuk azon képességüket, hogy a polikationok magas koncentrációknál a peptidtranszportot fokozzák-e (17. ábra). Ezekhez a kísérletekhez az LFEAIEGFI pepiidet alkalmaztuk, a vizsgált poliarginineket 100 pg/ml koncentrációban használtuk.

Egy peptidtranszport-fokozást - ha csekély mértékűt is - már a legrövidebb tesztelt poliargininnél megfigyeltünk.

c) A bázikus aminosavak pozitív töltésű molekulák. Ezért feltehető, hogy a negatív töltéssel rendelkező peptidek elektrosztatikus kölcsönhatások révén ezeket a polikationokat megköthetik, ami valószínűleg egy fokozott peptidfelvételhez vezet. Hogy ezt a hipotézist igazoljuk, összehasonlítottuk a kationos poliaminosavak azon képességét, hogy a rövid peptideket a töltésüktől függően a P388D1-sejtekre felvegyék. Az alábbi

2. táblázatban megadjuk az alkalmazott negatív töltésű peptideket, amelyek mind az MHC-l-kötéshez szükséges feltételeknek eleget tesznek (Rammensee és munkatársai, 1995). Az 1. peptid az egér-TRP-ből („tyrosinase related protein’-tirozinázzal rokon fehérje) lett levezetve, a 2. peptid az influenzahemagglutininből (Schmidt és munkatársai, 1996) származik, a 3. peptid az egértirozinázból, a 4. peptid a P198-tumorantigénből, az 5. peptid a béta-galaktozidázból (Gavin és munkatársai, 1993).

2. táblázat

Szekvencia	Mól. tömeg	Mól. tömeg fluoreszcein	Töltés	Töltés+fluoreszcein
YAEDYEEL	1031	1389	4*negatív	6*negatív
LFEAIEGFI	1038	1396	2* negatív	4*negat(v
IFMNGTMSQV	1127	1485	neutrális	2«negatív
KYQAVTTTL	1024	1382	1 «pozitív	1 «negatív
TPHPARIGL	961	1319	2*pozitív	neutrális

A peptid fluoreszceinnel történő jelölésére alkalmazott módszerek szerint két negatív töltést vezettünk be. Azt találtuk, hogy poliargininnél végzett inkubálás után leghatékonyabban a legmagasabb számú negatív töltéssel bíró peptidek (5 nmol pro minta) transzportálódtak a P388D1-sejtekbe, ami azt bizonyítja, hogy egy, a peptid és polikation közötti ionos kölcsönhatás még tovább fokozta a peptidtranszportot a sejtekbe (18. ábra). Mindazonáltal azokkal a sejtekkel összehasonlítva, amelyeket csak peptidekkel kezeltünk, neutrális peptid esetén is polikationok jelenlétében nagyobb mennyiség került felvételre. Az egyedül peptiddel történő kezelés minden vizsgált peptidnél közel azonos fluoreszcenciaszignált eredményezett; a 18. ábrán megadottakból a „peptid önmagában”-t az LFEAIEGFI peptiddel kapott fluoreszcenciaszígnál képviseli.

IRODALOMJEGYZÉK

Alexander, J. et al., 1989, Immunogenetics 29, 380 Allred, D. C. et al., 1992. J. Clin. Oncol. 10 (4),

599-605

Avrameas, A. et al., 1996, Eur. J. Immunoi. 26, 394-400

Behr, J. P., 1994, Bioconjug-Chem., Sept-Oct, 5(5), 382-9

Bertoletti, A. et al., 1994, Natúré 369, 407-410 Biologic Therapy of Cancer, Editors: De Vita, V. T. Jr.,

Hellman, S., Rosenberg, S. A., Verlag J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown

Blomberg, K. und Ulfstedt, A. C., 1993, J. Immunoi. Methods 160: 27-34

Boon, T., 1992, Adv Cancer Rés. 58, 177-210

HU 224 410 Β1

Boon, T., 1993, Spektrum dér Wissenschaft (Mai), 58-66

Boon, T. et al., 1994, Annu. Rév. Immunoi. 12, 337-65 Boon, T. und van dér Bruggen, P., 1996, J. Exp. Med.

183,725-729

Braciale, T. J. und Braciale, V. L., 1991, Immunoi. Today 12, 124-129

Brocke, S. et al., 1996, Natúré 379 (6563), 343-346

Bronte, etal., 1995, J. Immunoi. 154, 5282

Carrel, S. und Johnson, J. P., 1993, Current Opinion in

Oncology 5, 383-389

Coligan, J. E. et al., 1991, Natúré 351, 290-296 Coligan, J. E. et al., 1991, Current Prot. in Immunoi.,

Wiley, New York

Coulie, P. G. et al., 1992, Int. J. Cancer, 50, 289-297 Coulie, P. G. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

92,7976-80

Coulie, P. G. et al., 1994. J. Exp. Med. 180, 35-42 Cox, A. L. et al., 1994, Science 264, 5159, 716-9 Current Protocols im Molecular Biology, 1995, Herausgeber: Ausubel F. M. et al., John Wiley & Sons., Inc.

Dranoff, G. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3539-3543

Dranoff, G. und Mulligan, R. C., 1995, Advances in Immunology 58, 417

Fáik, K. et al., 1991, Natúré 351, 290-296 Felgner, J. H. et al., 1994, J. Bioi. Chem. 269,

2550-2561

Feltkamp, M. C. et al., 1995, Eur. J. Immunoi. 25 (9), 2638-2642

Fenton, R. G. et al., 1993, J. Natl. Cancer Inst. 85, 16, 1294-302

Fisk, B. etal., 1995, J. Exp. Med. 1881, 2109-2117 Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Cell. Biology,

1989, Vol. 33, Herausgeber: Darzynkiewicz, Z. und Crissman, H. A.

Gedde Dahl, T. et al., 1992, Hűm Immunoi. 33, 4, 266-74

Grohmann, U. et al., 1995, Eur. J. Immunoi. 25, 2797-2802

Guarini, A. et al., 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1,57-64

Han, X. K. et al., 1995, PNAS 92, 9747-9751 Handbuch: FACS Vantage™ User’s Guide, April 1994,

Becton Dickinson

Handbuch: CELL Quest™ Software User’s Guide, June 1994, Becton Dickinson

Henderson, R. A., und Finn, O. J. 1996, Advances in Immunology 62, 217-256

Hérin M. et al., 1987, Int. J. Cancer, 39, 390

Hock, H. et al., 1993, Cancer Research 53, 714-716

Houbiers, J. G. et al., 1993; Eur. J. Immunoi 23,

2072-7.

Huang, A. Y. C., und Pardoll, D. M. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9730-5

Inaba, K. et al., 1992, J. Exp. Med. 176,1693-1702 Jung, S. et al., 1991, J. Exp. Med. 173, 1,273-6 Kawakami, Y. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

91,6458-62

Kawakami, Y. et al., 1994a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

91,9, 3515-9

Kawakami, Y. et al., 1994b, J. Exp. Med. 180, 1,

347- 52

Kawakami, Y. et al., 1995, The Journal of Immunoi.

154, 3961-3968

Karre, K. et al., 1986, Natúré 319, 20. Feb., 675 Kersh, G. J. et al., 1996, Natúré 380 (6574), 495-498 Kovacsovics Bankowski, M. und Rock, K. L., 1995,

Science 267, 243-246

Lanzavecchia, A., 1996, Curr. Opin. Immunoi. 8,

348- 354

Lehmann, J. M. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

86, 9891-9895

Lethe, B. et al., 1992, Eur. J. Immunoi. 22, 2283-2288

Li, H. et al., 1989, J. Exp. Med. 169, 973-986

Lili, N. L., Tevethia, M. J., Hendrickson, W. G., und Tevethia, S. S. (1992). J. Exp. Med. 176, 449-57 Ljunggren, H. G. et al., 1990, Natúré 346: 476-480 Loeffler, J.-P. et al., 1993, Methods Enzymol. 217,

599-618

Lopez, J. A. et al., 1993, Eur. J. Immunoi. 23, 217-223 MacBroom, C. R. et al., 1972, Meth. Enzymol. 28,

212-219

Mackiewicz, A. et al., 1995, Humán Gene Therapy 6,

805-811

Malnati, M. S. et al., 1995, Science 267, 1016-1018 Mandelboim, O. et al., 1994, Natúré 369, 5. May,

67-71

Mandelboim, O. et al., 1995, Natúré Medicine 1,11,

1179-1183

Marchand, M. et al., 1995, Int. J. of Cancer 63, 883-5 Mclntyre, C. A. et al., 1996 Cancer Immunoi. Immunother. 42: 246-250

Midoux, P. et al., 1993, NATO ASI Series H67, 49-64 Morishita, R. et al., 1993, J. Clin. Invest. 91, 6, 2580-5 Nabel, G. J. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,

307-11 311

Noguchi, Y. et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,

3171-3175

Oettgen, H. F. und Old, L. J., 1991, Biologic Therapy of

Cancer, Editors: DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., Verlag J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown, 87-119

Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727

Pardoll, D. M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310 Practical Immunology, Editors: Leslie Hudson and

Frank C. Hay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne

Peace, D. J. et al., 1991, J. Immunoi. 146, 6, 2059-65 Peoples, G. E. et al., 1994, J. Immunoi. 152, 10,

4993-9

Plautz, G. E. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

90, 4645-4649

Porgador, A., Gilboa, E., 1995, J. Exp. Med. 182,

255-260

Puccetti, P. et al., 1995, Eur. J. Immunoi. 24,

1446-1452

HU 224 410 Β1

Rammensee, H. G. et al., 1993, Annu. Rév. Immunoi. 11, 213-44

Rammensee, H. G. et al., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35-44

Rammensee, H. G. et al., 1995, Current Biology 7, 85-96

Rammensee, H. G., 1995, Current Opinion in Immunology 7, 85-96

Rammensee, H. G. et al., 1995, Immunogenetics 41,178-228

Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage 1990, Mack Publishing Company, Easton, Penn. 1990

Remy, J. S. et al., 1994, Bioconjug-Chem., Nov-Dec, 5(6), 647-54

Rennie, J. und Rusting, R., 1996, Scientific American September, 28-30

Rivoltini, L. et al., 1995, The Journal of Immunology 154, 5 2257-2265

Robbins, P. F. et al., 1994, Cancer Rés. 54, 3124-6 Robbins, P. F. et al., 1995, J. Immunoi. 154, 5944-50 Robbins, P. F. und Rosenberg, S. A., 1996, Journ. Exp.

Med. 183,1185-92.

Robbins, P. F. und Kawakami, Y., 1996, Curr Opin Immunoi 8, 628-636

Roitt I. M., Brostoff J., Male D. K. Immunology, Churchill Livingstone

Rosenberg, S. A., 1996, Annual Reviews of Medicine, 47, 481-491

Ryser, H. J. und Hancock, R., 1965, Science 150, 501-503

Ryser, H. J. und Shen, W.C., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3867-3870

Schmidt, W. et al., May 1995, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 92,4711—4714

Schmidt, W. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9759-63

Sette, A. etal., 1994, Mól. Immunoi. 31 (11): 813-822 Shen, W. C. und Ryser. H. J., 1978, Proc. Natl. Acad.,

Sci. USA, 75, 1872-1876

Shen, W. C. und Ryser, H. J., 1979, Mól. Pharmacol. 16, 614-622

Shen, W. C. und Ryser, H. J., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7589-7593

Skipper, J., und Stauss, H. J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5,1493-8

Slingluff, C. L. et al., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 733-740

Stein, D. etal., 1994, EMBO Journal, 13, 6, 1331-40 Stuber, G. etal., 1994, Eur. J. Immunoi. 24, 765-768 Sykulev, Y. et al., 1994, Immunity 1,15-22 Theobald, M., Levine, A. J., und Sherman, L. A. (1995)

PNAS 92, 11993-7

Tibbets, L. M. etal., 1993, Cancer, Jan. 15., Vol. 71,2, 315-321

Tykocinski, M. L. etal., 1996, Am. J. Pathol. 148,1-16 van dér Bruggen, P. et al., 1994, Eur. J. Immunoi. 24,

9, 2134-40 Issn: 0014-2980

Van dér Eynde, B. und Brichard, V. G., 1995, Current Opinion Immunoi. 7, 674-81

Van Pel, A. und Boon, T., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4718-4722

Van Pel, A. et al., 1995, Immunological Reviews 145, 229-250

Vitiello, A. etal., 1995, J. Clin. Inv. 95,1,341-349 Wagner, E. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,

3410-4

Wagner, E. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6099-103

Wang, R. F. et al., 1995, J. Exp. Med. 181,799-804 Weynants, P. etal., 1994, Int. J. Cancer56, 826-829 Widmann, C. etal., 1992, J. Immunoi. Methods 155(1),

95-99

Wölfel, T. et al., 1994 a), Int. J. Cancer 57, 413-418 Wölfel, T. et al., 1994 b), Eur. J. Immunoi. 24, 759-764 York, I. A. und Rock, K. L, 1996, Ann. Rév. Immunoi.

14,369-396

Yoshino, I. et al., 1994 a), J. Immunoi. 152, 5, 2393—400

Yoshino, I. et al., 1994 b), Cancer Rés., 54,13, 3387-90 Young, J. W., Inaba, K„ 1996, J. Exp. Med., 183, 7-11 Zatloukal, K. et al., 1993, Gene 135,199-20 Zatloukal, K. etal., 1995, J. Immun. 154, 3406-3419

Claims (33)

1. Gyógyszerkészítmény, amely egy vagy több antigénpeptidet, fehérjét vagy fehérjefragmenst - ahol a peptidek vagy a fehérjékből, illetve fehérjefragmensekből származó megfelelő peptidek a kezelendő egyén által expresszált legalább egy MHC-molekula kötőhelyére illenek és ahhoz kötődni képesek - és egy, a következő csoportból kiválasztott adjuvánst - poliarginin, polilizin, poliornitin, amely poliaminosavak előnyösen 15-500 polimerizációs fokúak, hisztonok, protaminok, polietilén-iminek - vagy a nevezett adjuvánsok keverékét és/vagy konjugált formáit tartalmazza, azzal jellemezve, hogy az adjuváns a peptidek, fehérjék vagy fehérjefragmensek a kezelendő egyén sejtjeihez való kötődését növelő, és/vagy a peptidek a kezelendő egyén antigénprezentáló sejtjeibe való belépését elősegítő, és ezáltal a peptidek, fehérjék vagy fehérjefragmensek immunmodulátor-képességét fokozó hatású.

2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid, illetve a fehérje vagy fehérjefragmens celluláris lebomlási terméke egy MHC-molekula ligandja.

3. A 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid, illetve a fehérje vagy fehérjefragmens lebomlási terméke egy MHC-I molekula ligandja.

4. A 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid, illetve a fehérje vagy fehérjefragmens lebomlási terméke egy MHC-II molekula ligandja.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy olyan peptidet tartalmaz, amely egy patogén kórokozó fehérjéjéből van levezetve.

HU 224 410B1

6. Az 5. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid egy bakteriális fehérjéből van levezetve.

7. Az 5. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid egy virális fehérjéből van levezetve.

8. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény alkalmazása tumorvakcinaként, azzal jellemezve, hogy a fehérje egy tumorantigén, illetve a fehérjefragmens vagy a peptid, illetve peptidek tumorantigén(ek)ből vannak levezetve.

9. A 8. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény terápiás felhasználásra, azzal jellemezve, a tumorantigén, illetve -antigének olyan tumorantigénekből vannak levezetve, amelyeket a kezelendő egyén expresszál.

10. A 8. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény profilaktikus felhasználásra, azzal jellemezve, hogy a tumorantigének a gyakran fellépő tumorantigénekből levezetett tumorantigének.

11. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a tumorantigén(ek) melanomaantigének.

12. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a megadottakon kívül egy citokint tartalmaz.

13. A 12. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a citokin IL—2, IL—4, IL—12, IFN-alfa, IFN-béta, IFN-gamma, IFN-omega, TNF-alfa, GM-CSF vagy ezek keveréke.

14. A 2-11. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy több peptidet tartalmaz, amelyek abban különböznek, hogy a kezelendő egyén különböző MHC-szubtípusaihoz kötődnek.

15. A 2-14. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy vagy több olyan peptidet tartalmaz, amelyek egy természetesen előforduló immunogén fehérjéből vagy tumorantigénből, illetve ezek celluláris lebomlási termékéből vannak levezetve.

16. A 2-14. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy vagy több olyan peptidet tartalmaz, amelyek különböznek azoktól a peptidektől, amelyek egy természetben előforduló immunogén fehérjé(k)ből vagy tumorantigén(ek)ből, illetve ezek celluláris lebomlási termékéből vagy termékeiből vannak levezetve.

17. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid egy peptidantagonista, amely egy olyan fehérjéből van levezetve, amely autoimmunbetegséget okoz.

18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns polikation formájú.

19. A 18. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid negatív töltésű.

20. A 18. vagy 19. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy bázikus poliaminosav vagy bázikus poliaminosavak keveréke.

21. A 20. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns poliarginin.

22. A 20. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns polilizin.

23. A 18-21. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy celluláris liganddal konjugált.

24. A 23. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a ligand egy szénhidrátmaradék.

25. A 24. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a ligand fukóz.

26. A 23. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a ligand transzferrin.

27. A 18-26. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy még DNS-t is tartalmaz, amely mentes azoktól a szekvenciáktól, amelyek a funkcionális fehérjéket kódolják.

28. A 18-26. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy még DNS-t is tartalmaz, amely egy immunmodulátor fehérjét kódol.

29. A 28. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az immunmodulátor fehérje egy citokin az alábbiak közül: IL—1, IL—4, IL—12, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IFN-ω, TNF-a, GM-CSF vagy ezek keveréke.

30. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény parenterális beadásra.

31. A 30. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid és az adjuváns oldatát vagy szuszpenzióját egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban tartalmazza.

32. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény helyi beadás céljára.

33. A 32. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény hidrogél formájában.