RU2206329C2 - Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ и способ его получения - Google Patents
Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2206329C2 RU2206329C2 RU98111622/14A RU98111622A RU2206329C2 RU 2206329 C2 RU2206329 C2 RU 2206329C2 RU 98111622/14 A RU98111622/14 A RU 98111622/14A RU 98111622 A RU98111622 A RU 98111622A RU 2206329 C2 RU2206329 C2 RU 2206329C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- peptide
- tumor
- tumor cells
- peptides
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 title abstract 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title abstract 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 226
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 169
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 114
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 65
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 65
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 49
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 26
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 23
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 19
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 19
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 14
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 10
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims description 3
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 3
- AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N Leu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N 0.000 claims description 3
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 claims description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims 22
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims 22
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 claims 4
- LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N Glu-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 2
- ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims 2
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 claims 2
- 101100025811 Caenorhabditis elegans hch-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 claims 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 32
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 104
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 10
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 9
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 7
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- -1 rare-earth metal ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N Ala-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- FENSZYFJQOFSQR-FIRPJDEBSA-N Phe-Phe-Ile Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FENSZYFJQOFSQR-FIRPJDEBSA-N 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound CN=C(N)NN=O DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBOKASXZHPZFRZ-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-indole-4,6-diamine Chemical compound N1C2=CC(N)=CC(N)=C2C=C1C1=CC=CC=C1 UBOKASXZHPZFRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N Glu-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- JHSRJMUJOGLIHK-GUBZILKMSA-N Glu-Met-Glu Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N JHSRJMUJOGLIHK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IBYOLNARKHMLBG-WHOFXGATSA-N Gly-Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IBYOLNARKHMLBG-WHOFXGATSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 description 1
- 241000696272 Gull adenovirus Species 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241001289721 Lethe Species 0.000 description 1
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000011224 anti-cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 108700008272 transferrin-polylysine conjugate Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940030325 tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается иммуностимулятора, вызывающего специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ, и способа его получения. Иммуностимулятор содержит опухолевые клетки, по меньшей мере, часть которых имеет на клеточной поверхности, как минимум, один гаплотип ГКГ-I больного и которые были нагружены таким образом одним или несколькими пептидами, связывающими молекулу ГКГ-I, что упомянутые опухолевые клетки узнаются как чужеродные в окружении с пептидами иммунной системой больного и вызывают клеточный иммунный ответ. Нагрузка происходит в присутствии поликатиона, такого как полилизин. Преимущество изобретения заключается в повышении противоопухолевой активности. 2 с. и 24 з.п.ф-лы, 5 ил., 1 табл.
Description
Разработка терапевтической вакцины на основе опухолевых клеток базируется по существу на следующих принципах: имеются качественные или количественные различия между опухолевыми клетками и нормальными клетками; иммунная система в принципе обладает способностью распознавать эти различия; иммунная система может быть стимулирована путем активной специфической иммунизации вакцинами таким образом, чтобы на основании этого узнавать эти различия и способствовать их отторжению.
Для того чтобы добиться противоопухолевого ответа, должны быть выполнены, по меньшей мере, два условия: во-первых, опухолевые клетки должны выражать антигены или неоэпитопы, которые не существуют в нормальных клетках. Во-вторых, иммунная система должна быть соответственно активирована, чтобы реагировать на эти антигены. Существенным препятствием при иммунотерапии опухолей является их низкая иммуногенность, прежде всего у людей. Это более удивительно, чем можно было ожидать, так как большое число генетических изменений злокачественных клеток должно было приводить к образованию пептидных неоэпитопов, которые узнаются в окружении с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ-I) цитотоксическими Т-лимфоцитами.
Ранее были обнаружены ассоциированные с опухолью и специфичные к опухоли антигены, которые представляют такие неоэпитопы и поэтому должны были быть потенциальными целями для атаки иммунной системы. То, что иммунной системе все-таки не удается устранить опухоли, которые эти эпитопы выражают, может, очевидно, происходить не из-за недостатка неоэпитопов, а потому что иммунологический ответ на эти неоантигены недостаточен.
Для иммунотерапии рака на клеточной основе были разработаны две общие стратегии: с одной стороны, воспринимаемая иммунотерапия, которая служит in vitro распространению реактивных к опухоли Т-лимфоцитов и их повторному введению больным; с другой стороны, активная иммунотерапия, которая использует опухолевые клетки в ожидании, что при этом вызываются либо новые, либо усиленные иммунные ответы против опухолевых антигенов, которые приводят к системному опухолевому ответу.
Противоопухолевые вакцины, составляющие основу активной иммунотерапии, получали различными способами; примером этого являются облученные опухолевые клетки, которые перемещают с помощью иммуностимулирующих адъювантов, как, например, Corynebacterium parvum или Bacillus Calmette Guerin (BCG), чтобы вызвать иммунные реакции против опухолевых антигенов (Oettgen и Old, 1991).
В последние годы были использованы прежде всего генетически модифицированные опухолевые клетки для активной противораковой иммунотерапии, причем введенные в опухолевые клетки чужеродные гены относятся к трем категориям.
Некоторые использованные для этого опухолевые клетки модифицируют генетически, чтобы продуцировать цитокины. Местное сосуществование опухолевых клеток и цитокинового сигнала должны дать стимул, вызывающий противоопухолевый иммунитет. Обзор, относящийся к применению этой стратегии, представили Pardoll, 1993, Zatloukal и др., 1993, и Dranoff и Mulligan, 1995.
Что касается опухолевых клеток, которые были изменены генетически, чтобы секретировать цитокины, например интерлейкин-2 (IL-2), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или γ-интерферон (IFN-γ), или чтобы выразить состимулирующие молекулы, на экспериментальных моделях животных было показано, что они генерируют сильный противоопухолевый иммунитет (Dranoff и др., 1993; Zatloukal и др., 1995). У человека с обнаруживаемой уже при осмотре опухолью и с развившейся толерантностью к опухоли существенно более сложно, однако, полностью охватить каскады комплексных взаимодействий так, чтобы могла происходить эффективная противоопухолевая реакция. Фактическая эффективность секретирующих цитокин противоопухолевых вакцин для применения на людях еще не доказана.
Другая категория генов, с помощью которых изменяются опухолевые клетки, имея в виду их использование в качестве противоопухолевой вакцины, кодирует так называемые добавочные белки; цель этой постановки задачи состоит в том, что для того, чтобы опухолевые клетки функционировали в представляющих антигены клетках (нео-АПК), заставить их непосредственно генерировать специфичные к опухоли Т-лимфоциты. Пример подобного подхода описывается у Ostrand-Rosenberg, 1994.
Идентификация и выделение опухолевых антигенов (ОА) или производных от них пептидов, описанные, например, Wölfel и др., 1994 а) и 1994 б); Carrel и др. , 1993, Lehmann и др., 1989, Tibbets и др., 1993, или в опубликованных международных заявках на патенты 92/20356, 94/05304, 94/23031, 95/00159, явились предпосылкой для того, чтобы использовать опухолевые антигены в качестве иммуногенов для противоопухолевых вакцин как в виде белков, так и в виде пептидов. Противоопухолевая вакцина в виде опухолевых антигенов как таковых не является, однако, удовлетворительным иммуногеном, чтобы вызвать клеточный иммунный ответ, как это было бы необходимо для элиминирования несущих опухолевый антиген опухолевых клеток; также совместное применение адъювантов предоставляло только относительную возможность для усиления иммунного ответа (Oettgen и Old, 1991).
Третья стратегия активной иммунотерапии для повышения эффективности противоопухолевых вакцин базируется на ксеногенизированных (превратившихся в чужеродные) аутологичных опухолевых клетках. В основе этой концепции лежит предположение, что иммунная система реагирует на опухолевые клетки, которые выражают чужеродный белок, и что в ходе этой реакции вызывается также иммунный ответ против тех опухолевых антигенов (ОА), которые представляются опухолевыми клетками вакцины.
Обзор этих различных вариантов, при которых опухолевые клетки в расчете на усиленную иммуногенность превращаются в чужеродные путем введения различных генов, представлен Zatloukal и др., 1993.
Центральную роль при регуляции специфичного иммунного ответа играет тримолекулярный комплекс, состоящий из компонентов, включающих рецептор антигенов Т-лимфоцитов, молекулу ГКГ и его лиганд, который является происходящим от белка пептидным фрагментом.
Молекулы ГКГ-I (или соответствующие человеческие молекулы, антигены лейкоцитов человека /HLA/) являются пептидными рецепторами, которые при строгой специфичности позволяют осуществить связывание миллионов различных лигандов. Условие для этого предоставляют специфичные к аллелям пептидные мотивы, которые обнаруживают следующие критерии специфичности: пептиды имеют в зависимости от гаплотипа ГКГ-I определенную длину, как правило, от восьми до десяти аминокислотных остатков. Обычно два из положений аминокислот представляют так называемый "якорь", они могут быть заняты отдельной аминокислотой или остатками аминокислот с похожими боковыми цепями. Точное расположение якорных аминокислот в пептиде и требование к их свойствам варьируются гаплотипами ГКГ-I. С-конец пептидных лигандов часто является алифатическим или заряженным остатком. Такие специфичные к аллелям мотивы пептидных лигандов для ГКГ-I до сих пор известны среди прочего для Н-2Кd, Кb, Кk, Кkml, Db, HLA-A*0201, А*0205 и В*2705.
В рамках обмена белка внутри клетки регулярные, дегенерированные и чужеродные генные продукты, например вирусные белки или опухолевые антигены, разлагаются в мелкие пептиды; при этом получают некоторые потенциальные лиганды для молекул ГКГ-I. Таким образом, имеется предпосылка для их представления молекулами ГКГ-I и, как следствие, появление клеточного иммунного ответа, причем до сих пор еще в отдельности не выяснено, как пептиды продуцируются в клетке в качестве лигандов ГКГ-I.
Подход, который использует этот механизм для отчуждения опухолевых клеток, в расчете на усиление иммунного ответа, состоит в том, что опухолевые клетки обрабатывают химическими мутагенами, как, например N-метил-N'-нитрозогуанидин. Это должно привести к тому, что опухолевые клетки мутированных вариантов являют собой происходящие от клеточных белков неоантигены, которые представляют чужеродные генные продукты (Van Pel и Boon, 1982). Так как, однако, мутагенные явления случайно распределяются через геном и, кроме того, чтобы ожидать, что отдельные клетки в результате различных мутагенных явлений также представляют различные неоантигены, этот способ трудно контролировать в качественном и количественном отношении.
При другом подходе опухолевые клетки превращают в чужеродные в результате того, что их подвергают трансфекции генами одного или нескольких чужеродных белков, например геном чужеродной молекулы ГКГ-I или белков ГКГ отличающегося гаплотипа, который затем содержится в определенной форме на клеточной поверхности (заявка на европейский патент 0569678; Plautz и др., 1993; Nabel и др. , 1993). Этот подход основывается на вышеупомянутом положении, что опухолевые клетки, когда они вводятся в виде вакцины из клеточной массы, распознаются как чужеродные с помощью выраженного белка или происходящих от него пептидов или что в случае экспрессии аутологичных молекул ГКГ-I с помощью повышенного количества молекул ГКГ-I на клеточной поверхности оптимизируется представление опухолевого антигена. Изменение опухолевых клеток с помощью чужеродного белка может привести к тому, что клетки представляются в окружении ГКГ происходящими от чужеродного белка пептидами и изменение от "самого себя" к "чужому" происходит в рамках узнавания комплекса ГКГ-пептид. Узнавание белка или пептида как чужеродного имеет последствием то, что в ходе иммунного узнавания вырабатывается иммунный ответ не только по отношению к чужеродному белку, но также и по отношению к собственным опухолевым антигенам опухолевых клеток. В ходе этих процессов активируются представляющие антиген клетки (АПК), которые подвергают процессингу имеющиеся в опухолевой клетке вакцины белки (включая ОА) в пептиды и используют в качестве лигандов для их собственных молекул ГКГ-I и ГКГ-II. Активированные, нагруженные пептидом АПК переходят в лимфатические узлы, где некоторые немногие из простых Т-лимфоцитов узнают в АПК происходящие от ОА пептиды и могут их использовать в качестве стимула для клоновой экспансии, другими словами, для генерации специфичных к опухоли цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-клеток-хелперов.
В основе представленного изобретения лежит задача приготовления новой противоопухолевой вакцины на базе превращенных в чужеродные клеток опухоли, с помощью которой может быть вызван активный клеточный противоопухолевый иммунный ответ.
При решении поставленной задачи исходили из следующих соображений: в то время как иммунная система толерантна к незлокачественным нормальным клеткам организма, организм реагирует иммунной защитой на нормальную клетку, когда она, например, вследствие вирусной инфекции синтезирует чужеродные организму белки. Причина этого заключается в том, что молекулы ГКГ-I представляют чужеродные пептиды, которые происходят от чужеродных организму белков. И, как следствие, иммунная система отмечает, что нечто нежелательное, чуждое происходит с этой клеткой. Клетка ликвидируется, АПК активируются и генерируется новый специфический иммунитет против выражающих чужеродные белки клеток.
Хотя опухолевые клетки и содержат соответствующие специфичные к опухоли опухолевые антигены, они, однако, сами по себе недостаточные вакцины, так как из-за незначительной иммуногенности они игнорируются иммунной системой. Если опухолевую клетку нагружают в отличие от известных приготовлений не чужеродным белком, а чужеродным пептидом, то дополнительно к чужеродным пептидам собственные опухолевые антигены клетки также различаются этой клеткой как чужеродные. Путем отчуждения пептидом должно стать возможным, чтобы вызванный чужеродными пептидами клеточный иммунный ответ направлялся против опухолевых антигенов.
Причина недостаточной иммуногенности опухолевых клеток не может быть только качественной проблемой, но является и количественной.
Для происходящего от опухолевого антигена пептида это может означать, что, хотя он и представляется молекулами ГКГ-I, однако, в такой концентрации, которая слишком незначительна, чтобы вызвать клеточный специфичный к опухоли иммунный ответ. Повышение количества специфичных к опухоли пептидов в опухолевой клетке должно было, таким образом, также способствовать превращению опухолевой клетки в чужеродную, что приводит к возникновению клеточного иммунного ответа. В отличие от вариантов, при которых опухолевый антиген или происходящий от него пептид так представлялся на поверхности клетки, что он подвергался трансфекции с помощью ДНК, кодирующей соответствующий белок или пептид, как описано в опубликованных международных заявках на патенты 92/20356, 94/05304, 94/23031 и 95/00159, следовало бы подготовить такую вакцину, которая при однократном получении вызывает эффективный иммунный ответ.
Mandelboim и др. , 1994 и 1995, предложили инкубировать клетки RMA-S с пептидами, происходящими от опухолевых антигенов, чтобы при этом вызвать клеточный иммунный ответ против соответствующих аутогенных опухолевых антигенов. Из предложенных Mandelboim и др. для вакцинирования опухоли клеток принимаются обозначенные RMA-S ((Kärre и др., 1986), чтобы они могли выполнять функции АПК. Они характеризуются такой особенностью, что их молекулы HLA на клеточной поверхности свободны, благодаря дефекту в клеточном механизме транспорта антигенных пептидов (ТАП-механизм, ответственный за процессинг пептидов и их связывание при молекулах HLA). При этом в распоряжении находятся клетки для нагрузки пептидом, они также действуют как бы в качестве представленного носителя для введенного извне пептида. Направленное противоопухолевое действие основывается на возникновении иммунного ответа против представленного в клетках пептида, который предлагается иммунной системе без непосредственного окружения антигенным составом опухолевой клетки.
Изобретение относится к противоопухолевой вакцине для введения больному, состоящей из опухолевых клеток, которые представляются производными от опухолевых антигенов пептидами в окружении HLA и, по меньшей мере, часть которых имеет, как минимум, один гаплотип ГКГ-I больного на клеточной поверхности, и которые были нагружены одним или несколькими пептидами а) и/ или б) таким образом, что опухолевые клетки в окружении с пептидами узнаются как чужеродные иммунной системой больного и вызывают клеточный иммунный ответ, причем пептиды
а) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и отличаются от пептидов, являющихся производными белков, которые выражаются клетками больного, или
б) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и происходят от опухолевых антигенов, которые выражаются клетками больного и находятся в опухолевых клетках вакцины в концентрации, которая выше, чем концентрация пептида, происходящего от того же самого опухолевого антигена, который выражался в опухолевых клетках больного.
а) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и отличаются от пептидов, являющихся производными белков, которые выражаются клетками больного, или
б) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и происходят от опухолевых антигенов, которые выражаются клетками больного и находятся в опухолевых клетках вакцины в концентрации, которая выше, чем концентрация пептида, происходящего от того же самого опухолевого антигена, который выражался в опухолевых клетках больного.
Молекулы ГКГ человека в соответствии с международными традициями в дальнейшем обозначаются также HLA (антиген лейкоцитов человека).
Под понятием " клеточный иммунный ответ" следует понимать опосредованный цитотоксическими Т-лимфоцитами иммунитет, который вследствие генерирования специфичных к опухоли цитотоксических позитивных к CD8 Т-лимфоцитов и позитивных к CD4 Т-хелперов вызывает разрушение опухолевых клеток.
Действие вакцины из опухолевых клеток согласно изобретению основывается прежде всего на том, что иммуногенное действие имеющегося в опухолевых клетках запаса опухолевых антигенов усиливается пептидом.
Пептиды типа а) в дальнейшем обозначают тоже как "чужеродные пептиды" или "ксенопептиды".
В одном из вариантов осуществления изобретения опухолевые клетки вакцины аутологичны. Причем речь идет о клетках, которые берутся у подвергающегося лечению больного, обрабатываются ex vivo пептидом (пептидами) а) и/или б), при необходимости инактивируются и затем опять вводятся больному. (Способы получения аутологичных противоопухолевых вакцин описываются в международной заявке на патент 94/21808, где ссылаются на их открытие).
В одном из вариантов осуществления изобретения опухолевые клетки являются аллогенными, то-есть они не принадлежат подвергающемуся лечению больному. Применению аллогенных клеток прежде всего отдают предпочтение тогда, когда играют роль экономические соображения; получение индивидуальных вакцин для каждого отдельного больного требует затрат труда и денег, кроме того, возникают трудности с отдельными больными при ex vivo культивировании опухолевых клеток, так как не получают достаточно большого количества опухолевых клеток, чтобы можно было приготовить вакцину. В случае аллогенных опухолевых клеток следует учитывать, что они должны подходить подтипу HLA больного.
При использовании чужеродных пептидов категории а) речь идет в случае аллогенных опухолевых клеток о клетках одной или нескольких клеточных линий, из которых, как минимум, одна линия клеток выражает, как минимум, один, предпочтительно несколько, опухолевых антигенов, которые идентичны опухолевым антигенам подвергающегося лечению больного, то-есть противоопухолевая вакцина соответствует признакам опухоли больного. Вследствие этого обеспечивается то, что вызванный представленным ГКГ-I чужеродным пептидом в опухолевых клетках вакцины клеточный иммунный ответ, который приводит к распространению специфичных к опухоли цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-хелперов, направляется также против опухолевых клеток больного, так как они выражают такой же опухолевый антиген, как и клетки вакцины.
Например, если нужно подвергнуть лечению противоопухолевой вакциной согласно изобретению больную раком молочной железы с метастазами, которые обнаруживают мутацию Her2/neu (Allred и др., 1992; Peopoles и др., 1994; Yoshino и др., 1994 a); Stein и др., 1994; Yoshino и др., 1994 б); Fisk и др., 1995; Наn и др., 1995), вводят в качестве вакцины аллогенные, согласованные с гаплотипом HLA больного опухолевые клетки, которые тоже выражают мутированный Her2/neu в качестве опухолевого антигена. Ранее выделяли многочисленные опухолевые антигены и выясняли их связь с одним или несколькими раковыми заболеваниями. Известны другие примеры подобных опухолевых антигенов (Fenton и др. , 1993; Gedde Dahl и др., 1992; Jung и др., 1991; Morishita и др., 1993; Peace и др. , 1991; Skipper и др., 1993), опухолевых антигенов MAGE (Boon и др., 1994; Slingluff и др., 1994; van der Bruggen и др., 1994; международная заявка на патент 92/20356); обзор различных опухолевых антигенов в добавление к этому приводит Carrel и др., 1993.
В таблице приводится обзор известных, применяемых в рамках изобретения опухолевых антигенов и производных от них пептидов.
Опухолевые антигены больного определяют в общем стандартными способами в ходе установления диагноза и плана лечения, например с помощью анализов на основе цитотоксических Т-лимфоцитов со специфичностью к определяющему опухолевому антигену. Такие анализы были среди прочего описаны Hérin и др., 1987; Coulie и др., 1993; Сох и др., 1994; Rivoltini и др., 1995; Kawakami и др. , 1995, а также в международной заявке на патент 94/14459; эти литературные источники также включают различные опухолевые антигены или происходящие от них пептидные эпитопы. Возникающие на поверхности клеток опухолевые антигены могут быть также обнаружены с помощью иммунных анализов на основе антител. Когда опухолевые антигены являются ферментами, например тирозиназами, они могут быть обнаружены с помощью ферментных анализов.
В другом варианте осуществления изобретения может быть использована смесь аутологичных и аллогенных опухолевых клеток в качестве исходного материала для вакцины. Этот вариант осуществления изобретения находит, в частности, применение, когда выраженные больным опухолевые антигены неизвестны или только неполностью охарактеризованы и/или когда аллогенные опухолевые клетки выражают только часть опухолевых антигенов больного. Путем примешивания аутологичных, обработанных чужеродным пептидом опухолевых клеток обеспечивается то, что, по меньшей мере, часть опухолевых клеток вакцины содержит насколько возможно большое количество опухолевого антигена собственно больного. В случае аллогенных опухолевых клеток речь идет о таких, которые в одном или нескольких гаплотипах ГКГ-I совпадают с таковыми для больного.
Пептиды типа а) и б) в соответствии с требованием связываться с молекулой ГКГ-I определяют в отношении их последовательности с помощью подтипа HLA больного, которому должна вводиться вакцина. Определение подтипа HLA больного представляет, таким образом, одно из важнейших условий для выбора или построения подходящего пептида.
При применении противоопухолевой вакцины согласно изобретению в виде аутологичных опухолевых клеток автоматически проистекает подтип HLA через генетически детерминированную специфичность молекулы HLA больного. Подтип HLA больного может быть определен стандартными способами, как, например, с помощью микротеста лимфотоксичности (MLC-тест, MLC = смешанная культура лимфоцитов) (Practical Immunol., 1989). MLC-тест основывается на принципе смешивания выделенных из крови больного лимфоцитов сначала с антисывороткой или моноклональным антителом против определенной молекулы HLA в присутствии кроличьего комплемента (С). Положительные клетки подвергают лизису и окрашивают с помощью индикаторного красителя, в то время, как неповрежденные клетки остаются неокрашенными.
Для определения гаплотипа HLA больного можно также использовать полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) (Curr. Prot. Mol. Biol. , глава 2 и 15). Для этого у больного берут кровь и выделяют из нее РНК. Эту РНК подвергают сначала обратной транскрипции, благодаря чему образуется кДНК больного. кДНК служит матрицей для ПЦР с праймерными парами, которые специфически способствуют амплификации фрагмента ДНК, относящегося к определенному гаплотипу HLA. Наблюдаемая полоса ДНК при электрофорезе в агарозном геле свидетельствует о том, что больной выражает соответствующую молекулу HLA. Если полосы не наблюдают, значит больной в отношении этого негативен. Для каждого больного ожидаются, по меньшей мере, две полосы.
При применении изобретения в виде аллогенной вакцины используют клетки, из которых, по меньшей мере, часть согласуется, как минимум, с одним подтипом HLA больного. Принимая во внимание по возможности широкую используемость вакцины согласно изобретению, целесообразно исходить из смеси различных линий клеток, которые выражают два или три различных наиболее часто представленных подтипа HLA, причем, в частности, имеются в виду гаплотипы HLA-А1 и HLA-A2. С помощью вакцины на основе смеси аллогенных опухолевых клеток, выражающих эти гаплотипы, можно охватить широкую популяцию больных; таким образом, можно защитить около 70% европейского населения (Mackiewicz и др., 1995).
Определение применяемых согласно изобретению пептидов через подтип HLA характеризует их относительно их якорных аминокислот и их длины; определенные якорные положения и длина гарантируют, что пептиды подходят друг к другу в линии связывания пептидов соответствующих молекул HLA так, чтобы быть представленными на клеточной поверхности образующих вакцину опухолевых клеток таким образом, что клетки узнаются как чужеродные. Вследствие этого стимулируется иммунная система и вызывается клеточная иммунная реакция также против опухолевых клеток больного.
Пептиды, которые в рамках представленного изобретения являются подходящими в качестве чужеродных пептидов согласно категории а), имеются в распоряжении в широком диапазоне. Их последовательность может происходить от встречающихся в природе иммуногенных белков или их клеточных продуктов расщепления, например вирусных или бактериальных пептидов, или от чужеродных больному опухолевых антигенов.
Подходящие чужеродные пептиды могут, например, быть выбраны на основе известных в литературе пептидных последовательностей, например, описанных Rammensee и др., 1993, Falk и др., 1991, для различных мотивов HLA, на основе производных пептидов от иммуногенных белков различного происхождения, которые подходят друг другу в линиях связывания молекул соответствующих подтипов HLA. Для пептидов, имеющих частичную последовательность белка с иммуногенным действием, можно на основе уже известной или при необходимости еще требующих определения полипептидных последовательностей твердо установить путем регулирования последовательностей, учитывая специфичные к HLA требования, какие пептиды являются подходящими кандидатами. Примеры подходящих пептидов встречаются, например, у Rammensee и др., 1993, Falk и др., 1991, и у Rammensee и др., 1995, а также в международной заявке на патент 91/09869 (ВИЧ-пептиды); производные от опухолевых антигенов пептиды были среди прочих описаны в опубликованных международных заявках на патенты 95/00159, 94/05304. Имеются ссылки на публикации этих литературных источников и цитируемые в них статьи, связанные с пептидами.
Предпочтительными кандидатами для ксенопептидов являются пептиды, иммуногенность которых уже была продемонстрирована, а также пептиды, являющиеся производными известных иммуногенов, например, вирусных или бактериальных белков. Подобные пептиды демонстрируют на основе их иммуногенности сильную реакцию в MLC-тесте.
Вместо того, чтобы применять подлинные пептиды, а также неизмененные, происходящие от природных белков, можно на основании указанных минимальных требований к последовательности подлинного пептида в отношении якорных положений и длины использовать любые варианты, в этом случае применяются также синтетические пептиды согласно изобретению, которые получают в соответствии с требованиями к лиганду ГКГ-I. Так могут, например, исходя из лиганда для типа H2-Kd Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile (LFEAIEGFI), быть изменены аминокислоты, не являющиеся якорными аминокислотами, чтобы получить пептид с последовательностью Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI); кроме того, якорная аминокислота Ilе в положении 9 может быть замещена Leu.
Пептиды, происходящие от опухолевых антигенов, а также от белков, которые выражаются в опухолевой клетке и которые не содержатся в соответствующей нетрансформированной клетке или содержатся в значительно уменьшенной концентрации, могут применяться в рамках представленного изобретения как пептиды типа а) и/или типа б).
Длина пептида соответствует предпочтительно в отношение связывания на молекуле ГКГ-I требуемой минимальной последовательности от 8 до 10 аминокислот с необходимыми якорными аминокислотами. При необходимости пептид может быть удлинен также по С- и/или N-концу, если это удлинение не наносит вреда связывающей способности, или удлиненный на минимальную последовательность пептид может участвовать в клеточном процессинге.
В одном из вариантов осуществления изобретения пептид может быть удлинен с помощью отрицательно заряженных аминокислот или можно вставить отрицательно заряженные аминокислоты в пептид и по другим положениям, чем положения якорных аминокислот, чтобы достигнуть электростатического связывания пептида на поликатионе, например полилизине.
Под понятие "пептиды" в рамках представленного изобретения подпадают в соответствии с определением также более длинные фрагменты белков или полные белки, для которых гарантировано, что после применения АПК они превращаются в пептиды, которые подходят молекуле ГКГ.
В этом варианте осуществления изобретения антиген, таким образом, вставляется не в виде пептида, но в виде белка или фрагмента белка или в виде смеси белков или фрагментов белков. Белок представляет антиген или опухолевый антиген, от которого происходят полученные после процессинга фрагменты. Относящиеся к клеткам белки или фрагменты белков подвергаются процессингу и могут после этого в окружении ГКГ представлять иммуноэффекторные клетки и, таким образом, вызывать или усиливать иммунный ответ (Braciale и Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski и Rock, 1995; York и Rock, 1996).
В случае применения белков или белковых фрагментов можно подтвердить идентичность конечных продуктов после процессинга с помощью химического анализа (деградация по Эдману или масс-спектрометрия фрагментов после процессинга; сравните обзорную статью Rammensee и др., 1995, а также цитируемые в ней оригинальные источники) или биологических анализов (способность АПК к стимуляции Т-лимфоцитов, специфичных к процессированным фрагментам).
Выбор кандидатов в пептиды с точки зрения их пригодности в качестве чужеродных пептидов происходит в принципе в несколько этапов: в общем, целесообразно для серийных исследований сначала проверить кандидаты в тесте по связыванию пептида на способность связываться с молекулой ГКГ-I.
Подходящим способом исследования является, например, основывающийся на проточной цитометрии анализ, использующий установку для сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS-анализ)(Flow Cytometry, 1989; FACS VantageTM User's Guide, 1994; CELL QuestTM User's Guide, 1994). Причем пептид метят флуоресцентным красителем, например флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), и вносят в опухолевые клетки, которые выражают соответствующую молекулу ГКГ-I. При протекании отдельные клетки подвергаются воздействию лазерного луча определенной длины волны; измеряют испускаемую флуоресценцию, она зависит от количества связанного клеткой пептида.
Другим способом определения связанного количества пептида является Скэтчард-блот. Для этого используют пептид, меченный 125J или ионами редкоземельных металлов (например, европием). Клетки нагружают при 4oС различными определенными концентрациями пептида от 30 до 240 минут. Для определения неспецифичного обменного взаимодействия пептида с клетками прибавляют к отдельным пробам избыток немеченого пептида, который препятствует специфическому взаимодействию меченого пептида. Затем клетки промывают, при этом удаляется неспецифичный ассоциированный с клетками материал. Количество связанного клеткой пептида устанавливают теперь либо в сцинтилляционном счетчике на основании измеренной радиоактивности, либо в подходящем для измерения долгоживущей флуоресценции фотометре. Обработку полученных таким образом данных производят стандартными способами.
При втором подходе кандидаты с подходящими свойствами для связывания испытываются на их иммуногенность.
Иммуногенность ксенопептидов, происходящих от белков, чье иммуногенное действие неизвестно, может, например, быть исследована с помощью MLC-теста, пептиды, используемые в этом тесте, который также целесообразно проводить в серии с различными пептидами, причем в качестве стандарта целесообразно применять пептид с известным иммуногенным действием, вызывают особенно сильную реакцию и пригодны для рассматриваемого изобретения.
Другая возможность испытания связывающих ГКГ-I пептидных кандидатов на их иммуногенность состоит в том, чтобы исследовать связывание пептидов при Т2-лимфоцитах. Подобный тест основывается на характерной особенности Т2-лимфоцитов (Alexander и др., 1989) или клеток RMA-S (Kärre и др., 1986) участвовать в недостаточном количестве в механизме транспорта антигенный пептид - пептид и сначала, кроме того, представлять стабильные молекулы ГКГ-I. когда на них наносят пептиды, которые представляются в окружении ГКГ-I. Для теста используют, например, Т2-лимфоциты или клетки RMA-S, которые стабильно подвергаются трансфекции с помощью гена HLA, например генов HLA-A1 и/или HLA-A2. Если клетки нагружают пептидами, которые являются хорошими лигандами ГКГ-I, так как они так представляются в окружении ГКГ-I, что могут узнаваться иммунной системой как чужеродные, то такие пептиды способствуют тому, что молекулы HLA обнаруживаются в значительном количестве на клеточной поверхности. Доказательство наличия антигенов лимфоцитов человека на клеточной поверхности, например, с помощью моноклональных антител позволяет идентифицировать подходящие пептиды (Malnati и др., 1995; Sykulev и др., 1994). В этом случае также целесообразно применить стандартный пептид с известной хорошей способностью к связыванию HLA или ГКГ.
В одном варианте осуществления изобретения аутологичная или аллогенная опухолевая клетка вакцины может иметь несколько ксенопептидов с различными последовательностями. Примененные пептиды могут в данном случае, с одной стороны, так отличаться, что они связываются при различных подтипах HLA. Этим может достигаться то, что охватываются некоторые или все подтипы HLA больного или большой группы больных. Вакцину вводят в форме, полученной после облучения.
Другая, при необходимости дополнительная изменчивость в отношении представленных в опухолевой клетке ксенопептидов может состоять в том, что пептиды, связанные с определенным подтипом HLA, различаются относительно их, не являющейся важной для связывания HLA, последовательности тем, что они, например, происходят от белков различного происхождения, например вирусных и/ или бактериальных белков. От одной такой изменчивости, которая предоставляет вакцинированному организму большой диапазон при отчуждении, можно ожидать усиления стимуляции иммунного ответа.
В варианте осуществления изобретения, когда противоопухолевая вакцина состоит из смеси аллогенных опухолевых клеток различных клеточных линий, а также при необходимости дополнительно из аутологичных опухолевых клеток, могут все без исключения опухолевые клетки быть обработаны одинаковым/одинаковыми пептидом/пептидами или опухолевые клетки различного происхождения могут также иметь в каждом случае различные ксенопептиды.
В рамках проведенных исследований по представленному изобретению применяли в качестве чужеродного пептида типа а) вирусный пептид с последовательностью Leu Glu Ala Ile Glu Gly Phe , происходящий от гемагглютинина вируса гриппа и являющийся лигандом для типа H2-Кd; якорные аминокислоты подчеркнуты.
С помощью этого встречающегося в природе вирусного пептида в качестве чужеродного пептида была получена противоопухолевая вакцина и испытана на животной модели (модель меланомы и модель рака толстого кишечника).
Другой вирусный пептид с последовательностью Ala Ser Asn Glu Met Glu Thr , который происходит от нуклеопротеина вируса гриппа и является лигандом гаплотипа HLA-1 H2-Kb (Rammensee и др., 1993; якорные аминокислоты подчеркнуты), был использован для получения противоопухолевой вакцины; защитное действие вакцины было подтверждено на другой модели меланомы.
Была получена другая вакцина таким образом, что опухолевые клетки превращались в чужеродные с помощью чужеродного пептида с последовательностью Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI). При этом речь идет о синтетическом, неизвестном ранее в природе пептиде. Поэтому при выборе последовательности было важно, чтобы выполнялись требования относительно пригодности в качестве лиганда для молекулы ГКГ-I типа Н2-Кd. Пригодность пептида для того, чтобы вызвать противоопухолевый иммунитет согласно концепции активной иммунотерапии, была подтверждена на раке толстого кишечника мыши СТ-26 ( сингенный для мышиного штамма Balb/c).
В другом варианте осуществления изобретения противоопухолевая вакцина может содержать, кроме того, аутологичные и/или аллогенные опухолевые клетки и/или фибробласты, которые подвергаются трансфекции с помощью цитокиновых генов. В международной заявке на патент 94/21808, а также в работе Schmidt и др. , 1995 (на эту публикацию ссылаются), описываются эффективные противоопухолевые вакцины, которые были получены по способу транспорта ДНК, обозначенному как "трансферрин-трансфекция", с помощью экспрессирующего IL-2 вектора (этот способ основывается на опосредованном рецептором эндоцитозе и использует клеточный лиганд, конъюгированный с поликатионом, как, например, полилизин, в частности трансферрин, для образования комплекса с ДНК, а также эндосомолитически эффективный реагент, например аденовирус).
Предпочтительно смешивают обработанные пептидом опухолевые клетки и выражающие цитокин клетки в соотношении 1:1. Когда, например, смешивают секретирующую IL-2 вакцину, которая продуцирует 4.000 единиц IL-2 на 1•106 клеток, с 1•106 обработанных пептидом опухолевых клеток, можно полученную таким образом вакцину использовать для двух обработок, причем допускается оптимальная дозировка от 1.000 до 2.000 единиц IL-2 (Schmidt и др., 1995).
При комбинации цитокиновой вакцины с обработанными пептидом опухолевыми клетками может быть выгодно объединено действие обоих типов вакцины.
Обработку клеток, а также приготовление готовой лекарственной формы вакцины согласно изобретению осуществляют обычным способом, как, например, описано в работе "Биологическая терапия рака", 1991, или в международной заявке на патент 94/21808.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения противоопухолевой вакцины, состоящей из опухолевых клеток, для введения больному.
Способ в соответствии с изобретением отличается тем, что опухолевые клетки, которые представляются производными от опухолевых антигенов пептидами в окружении HLA и, по меньшей мере, часть которых выражает, как минимум, один гаплотип ГКГ-I больного, обрабатывают одним или несколькими пептидами, которые
а) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и отличаются от пептидов, происходящих от белков, которые выражаются клетками больного или которые
б) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и происходят от опухолевых антигенов, которые выражаются клетками больного,
причем опухолевые клетки инкубируют с одним или несколькими пептидами а) и/или б) до тех пор и в таком количестве в присутствии органического поликатиона, пока пептиды свяжутся на опухолевых клетках таким образом, что они в окружении с опухолевыми клетками узнаются как чужеродные иммунной системой больного и вызывают клеточный иммунный ответ.
а) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и отличаются от пептидов, происходящих от белков, которые выражаются клетками больного или которые
б) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и происходят от опухолевых антигенов, которые выражаются клетками больного,
причем опухолевые клетки инкубируют с одним или несколькими пептидами а) и/или б) до тех пор и в таком количестве в присутствии органического поликатиона, пока пептиды свяжутся на опухолевых клетках таким образом, что они в окружении с опухолевыми клетками узнаются как чужеродные иммунной системой больного и вызывают клеточный иммунный ответ.
Количество пептида составляет преимущественно от примерно 50 мкг до примерно 160 мкг на 1•105 - 2•107 клеток. В случае использования пептида категории б) концентрация может также быть выше. Для этих пептидов важно, чтобы их концентрация в опухолевых клетках вакцины по отношению к концентрации пептида, происходящего от того же самого опухолевого антигена, в опухолевых клетках больного до такой степени увеличивалась, чтобы опухолевые клетки вакцины узнавались как чужеродные и вызывали клеточный иммунный ответ.
Подходящими поликатионами считаются гомологичные органические поликатионы, как, например, полилизин, полиаргинин, полиорнитин, или гетерологичные поликатионы с двумя или несколькими различными положительно заряженными аминокислотами, причем эти поликатионы могут иметь различную длину цепей, далее непептидные синтетические поликатионы, как полиэтиленимин, природные, связывающие ДНК белки поликатионного характера, например гистоны или протамины, или их аналоги, или их фрагменты, а также спермин или спермидины. Подходящими органическими поликатионами в рамках представленного изобретения считаются также липиды в виде поликатионов (Felgner и др., 1994; Loeffler и др. , 1993; Remy и др., 1994; Behr, 1994), которые, среди прочего, имеются в продаже, как трансфектам, липофектамин или липофектин.
В качестве поликатиона вставляют предпочтительно полилизин (пЛ), длина цепи которого составляет от примерно 30 до примерно 300 остатков лизина.
Необходимое количество поликатиона по отношению к пептиду может быть определено, в частности, эмпирически. В случае использования полилизина и ксенопептидов категории а) соотношение масс пЛ: пептид составляет предпочтительно примерно от 1:4 до примерно 1: 12.
Продолжительность инкубирования составляет в общем от 30 минут до 4 часов. Она еще регулируется в зависимости от того, к какому моменту времени достигается максимальная нагрузка пептидом; за степенью нагрузки можно следить с помощью анализа, использующего установку для сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS-анализ), и таким способом определяют необходимую продолжительность инкубирования.
В другом варианте осуществления изобретения вставляют полилизин в, как минимум, частично конъюгированной форме. Предпочтительно часть полилизина используется в конъюгированной с трансферрином (ТФ) форме (конъюгат трансферрина-полилизина, ТФпЛ, сюда также относятся данные, на которые ссылаются в международной заявке на патент 94/21808), причем массовое соотношение пЛ: ТФпЛ составляет около 1:1.
Вместо трансферрина полилизин может быть конъюгирован с другими белками, например с описанными в международной заявке на патент 94/21808 в качестве факторов интернализации клеточными лигандами.
При необходимости обработку опухолевых клеток проводят еще в присутствии ДНК. Целесообразно, чтобы ДНК существовала в виде плазмиды, предпочтительно плазмиды, независимой от последовательностей, которые кодируют функциональные эукариотные белки, а также в виде контрольного вектора. Как ДНК может быть использована в принципе каждая применяемая обычно функционально полученная плазмида.
Соотношение количества ДНК и поликатиона, при необходимости частично конъюгированного с белком, например пЛ, ТФпЛ или смеси пЛ и ТФпЛ, составляет предпочтительно примерно от 1:2 до примерно 1:5.
Продолжительность инкубирования, количество и вид поликатиона по отношению к числу опухолевых клеток и/или количеству пептида или, вернее, какая часть поликатиона или с каким белком выгодно конъюгируется, преимущество присутствия ДНК или ее количество могут быть определены эмпирически. Для этого варьируют отдельные параметры способа и пептиды в идентичных условиях доставляют в опухолевые клетки и контролируют, насколько эффективно пептиды связываются на опухолевых клетках. Для этого подходящим способом является FACS-анализ.
Способ по изобретению пригоден, кроме обработки опухолевых клеток, также и для обработки других клеток.
Вместо опухолевых клеток аутологичные, а также собственные фибробласты больного или клетки линий клеток фибробластов, которые либо согласуются с подтипом HLA больного, либо подвергаются трансфекции соответствующим геном ГКГ-I, могут быть нагружены согласно способу по изобретению одним или несколькими пептидами, происходящими от опухолевых антигенов, которые выражаются опухолевыми клетками больного. Обработанные таким образом и облученные фибробласты могут сами по себе или в смеси с обработанными пептидом опухолевыми клетками быть применены в качестве противоопухолевой вакцины.
В другом варианте осуществления изобретения вместо фибробластов способом согласно изобретению могут быть обработаны дендритные клетки. Дендритные клетки являются АПК кожи, они могут быть на выбор нагружены in vitro, т.е. выделенные у больного клетки смешивают in vitro с одним или несколькими пептидами, причем пептиды происходят от опухолевых антигенов больного и связываются на молекуле ГКГ-I или ГКГ-II больного. В другом варианте осуществления изобретения эти клетки также in vivo могут быть нагружены пептидом. Для этого инъецируют комплексы из пептида, поликатиона и при необходимости ДНК предпочтительно внутрикожно, поскольку дендритные клетки особенно часто обнаруживаются в коже.
В рамках представленного изобретения получали комплекс из пептида с ТФпЛ или пЛ для переноса в клетки СТ-26 и с ТФпЛ и нефункциональной плазмидой (контрольный вектор) для переноса в клетки М-3. В системе СТ-26 было твердо установлено, что подвергнутая отчуждению с помощью пептида облученная противоопухолевая вакцина генерировала эффективный иммунитет против опухоли: 75% вакцинированных мышей могли элиминировать симптоматику опухоли, которая у всех контролируемых животных, либо не получавших вакцины, либо получавших вакцину без ксенопептида, приводила к образованию опухоли. В системе М-3 такой же ксенопептид в условиях, обнаруживающих еще более высокую вероятность образования опухоли для организма, испытывали в эксперименте, повторявшем ситуацию для людей. Мышей с метастазами вакцинировали облученными клетками М-3 с ксенопептидом. У 87,5% вакцинированных таким образом мышей смогли исчезнуть метастазы, в то же время всем необработанным мышам и 7 из 8 мышей с опухолями вводили вакцину без ксенопептида.
Кроме того, было твердо установлено, что величина системного иммунного ответа при использовании противоопухолевой вакцины зависит от способа, с помощью которого пептид доставляется в опухолевые клетки. Когда пептид поставляли клеткам с помощью полилизина/трансферрина, эффект был более четко выражен, чем тогда, когда клетки инкубировали 24 часа с пептидом ("импульсы"). Также мало эффективной была адъювантная добавка пептида к облученным вакцинам. При трансферрин-трансфекции может быть гарантировано либо эффективное поступление пептида в клетки, либо это еще способствует такой нагрузке полилизином/трансферрином, чтобы пептид оставался прикрепленным на клеточной мембране таким образом, чтобы физически находиться близко к молекуле ГКГ-I и чтобы он затем мог с ней связаться, причем, чтобы он мог на основании его сильного сродства вытеснить более слабо связанные клеточные пептиды.
Описание чертежей
Фиг.1а-в: FACS-анализ клеток М-3, обработанных чужеродным пептидом.
Фиг.1а-в: FACS-анализ клеток М-3, обработанных чужеродным пептидом.
Фиг.1г: Микрофотографии обработанных ФИТЦ-пептидом клеток М-3.
Фиг.2а,б: Излечение мышей DBA/2 с метастазами М-3-меланомы с помощью вакцины из нагруженных чужеродным пептидом клеток М-3.
Фиг. 3а: Титрование чужеродного пептида для получения противоопухолевой вакцины.
Фиг. 3б: Сравнение противоопухолевой вакцины из нагруженных чужеродным пептидом опухолевых клеток с секретирующей IL-2 противоопухолевой вакциной.
Фиг. 4а: Защита мышей Balb/c путем предварительной иммунизации вакциной из нагруженных чужеродным пептидом клеток рака толстого кишечника.
Фиг.4б: Изучение участия Т-лимфоцитов в системном иммунитете.
Фиг. 5: Защита мышей C57BL/6J путем предварительной иммунизации вакциной из нагруженных чужеродным пептидом клеток меланомы.
В следующих далее примерах применяли, если не указано иначе, следующие материалы и способы.
Линия клеток мышиной меланомы Cloudman S91 (клон М-3; Американская коллекция типовых культур /АКТК/ CCL 53.1) была приобретена в АКТК.
Линия клеток меланомы B16-F10 (Fidler и др., 1975) была приобретена в депозитарии опухолей Диагностического Центра Опухолей (ДЦО) Национального Института Здоровья США (НИЗ США).
Получение конъюгатов трансферрин-полилизин, содержащих ДНК трансфекционных комплексов, было проведено, как описано в международной заявке на патент 94/21808.
Пептиды LFEAIEGFI, FFIGALEEI, LPEAIEGFG и ASNENMETM были синтезированы в синтезаторе для пептидов (модель 433 А с монитором обратной связи, фирма Эпплайд Байесистемс, Фостер Сити, Канада) при использовании тентагеля S РНВ (Рапп, Тюбинген) в качестве твердой фазы по способу с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонильной (Fmoc) защиты (активация HBTU, фастмокTM, масштаб 0 : 25 ммолей). Пептиды растворяли в 1М триэтиламмонийацетате (ТЭАА), рН 7,3, и очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на колонке Видак С-18. Последовательности устанавливали с помощью времяпролетной масс-спектрометрии на приборе "Лазермат" фирмы MAT (Финниган, Сан-Хосе, Канада).
Испытание эффективности противораковой вакцины на ее защитное действие в отношении образования метастазов ("Терапевтическая мышиная модель"), а также испытание на профилактической мышиной модели проводили в соответствии с описанным в международной заявке на патент 94/21808 протоколом, причем в качестве мышиной модели использовали модель DBA/2 и модель Balb/c.
Пример 1. Сравнительный FACS-анализ клеток М-3, которые были обработаны различными способами с помощью чужеродного пептида.
Для этого исследования, которое представлено на фиг.1, ксенопептид LFEAIEGFI доставляли в клетки М-3 один раз с комплексами ТФпЛ/ДНК ("транснагрузка"; фиг.1а), один раз клетки инкубировали с пептидом ("импульсы"; фиг. 1б) и один раз пептид адъювантно примешивали к клеткам (фиг.1в).
Для транснагрузки смешивали 160 мкг меченного ФИТЦ ксенопептида LFEAIEGFI или немеченого контрольного пептида с 3 мкг ТФ-пЛ, 10 мкг пЛ и 6 мкг psp65 (фирма Бëрингер Маннхайм, без липополисахаридов /ЛПС/) в 500 мкл буфера, представляющего сбалансированный солевой раствор Хенкса (ССРХ-буфер). Через 30 минут при комнатной температуре вышеупомянутый раствор прибавляли в бутыль с клеточной культурой Т 75 с 1,5•106 клетками М-3 в 20 мл модифицированной по Дюльбекко среды Игла (МДСИ) (10% околоплодная сыворотка теленка /ОСТ/, 20 мМ глюкоза) и инкубировали при 37oС. Через 3 часа клетки дважды промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР), растворяли в ЗФР/2мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) и повторно суспендировали для FACS-анализа в 1мл ЗФР/5% OCT.
Пульсацию клеток с пептидом проводили с 1-2•106 клетками в 20 мл МДСИ с 450 мкг пептида (меченного ФИТЦ или немеченого) в течение 3 часов при 37oС.
Для адъювантного примешивания перед FACS-анализом 106 растворенных в бутыли для культуры клеток инкубировали со 100 мкг меченного ФИТЦ пептида в 1 мл ЗФР/ 5% ОСТ 30 минут при комнатной температуре. Клетки после обмена промывали ЗФР/5% ОСТ и еще раз анализировали. FACS-анализ проводили с использованием прибора "FACS Vantage" (Бектон Дикинсон), оснащенного аргоновым лазером мощностью 5 Вт, установленным на 100 мВт при 488 нм, согласно предписанию изготовителя. Результат FACS-анализа представлен на фиг.1а-в. На фиг. 1г показаны микрофотографии цитоцентрифугированных клеток М-3: верхний рисунок представляет клетки, которые получали пептид с помощью комплекса ("транснагрузка"), на нижнем рисунке представлены клетки, которые были проинкубированы с пептидом ("импульсы"). Для контрастного окрашивания ядра применяли 4,6-диамино-2-фенилиндол (ДАФИ).
Клетки М-3, которые были нагружены с помощью содержащего пептид комплекса, показали сдвиг флуоресценции почти на 20% по сравнению с необработанными или обработанными только полилизином клетками, что указывает на эффективный перенос пептида в клетки с помощью комплекса ТФпЛ/ДНК (фиг.1а). Инкубирование с пептидом (импульсы) было менее эффективным, что выразилось в сдвиге в сторону уменьшения флуоресценции только на 10%, что практически не обнаруживали при флуоресцентной микроскопии (фиг.1г). В случае адъювантного примешивания пептид тратился после стадии промывки (фиг.1в), что поэтому означает, что связывание пептида было, в крайнем случае, незначительным.
Пример 2. Лечение мышей DBA/2 с метастазами меланомы вакциной из нагруженных чужеродным пептидом клеток меланомы ("терапевтическая мышиная модель").
а) Получение противоопухолевой вакцины из клеток М-3
160 мкг ксенопептида LFEAIEGFI смешивали с 3 мкг ТФпЛ, 10 мкг пЛ и 6 мкг psp65 (без ЛПС) в 500 мкл ССРХ-буфера. Через 30 минут выдержки при комнатной температуре вышеупомянутый раствор прибавляли в бутыль с клеточной культурой Т 75 с 1,5•106 клетками М-3 в 20 мл МДСИ (10% ОСТ, 20 мМ глюкоза) и инкубировали при 37oС. Через 3 часа клетки помещали в 15 мл свежей среды и инкубировали в течение ночи при 37oС в 5% углекислом газе. За 4 часа до применения клетки облучали дозой в 20 грей. Обработку вакцины осуществляли, как описано в международной заявке на патент 94/21808.
160 мкг ксенопептида LFEAIEGFI смешивали с 3 мкг ТФпЛ, 10 мкг пЛ и 6 мкг psp65 (без ЛПС) в 500 мкл ССРХ-буфера. Через 30 минут выдержки при комнатной температуре вышеупомянутый раствор прибавляли в бутыль с клеточной культурой Т 75 с 1,5•106 клетками М-3 в 20 мл МДСИ (10% ОСТ, 20 мМ глюкоза) и инкубировали при 37oС. Через 3 часа клетки помещали в 15 мл свежей среды и инкубировали в течение ночи при 37oС в 5% углекислом газе. За 4 часа до применения клетки облучали дозой в 20 грей. Обработку вакцины осуществляли, как описано в международной заявке на патент 94/21808.
б) Эффективность противоопухолевой вакцины
Мышей DBA/2 в возрасте 6-12 недель с пятидневным метастазом (приобретенным в результате подкожной инъекции 104 живых клеток М-3) обрабатывали дважды на протяжении недели противоопухолевой вакциной путем подкожной инъекции (доза: 105 клеток на животное). В эксперименте участвовало 8 мышей. Результат исследования представлен на фиг.2а; показано, что 7 из 8 животных после введения вакцины, которая содержала в опухолевых клетках загруженный с помощью комплексов ТФпЛ/ДНК пептид, были излечены. В сравнительных исследованиях применялась вакцина, в которой пептид LFEAIEGFI (400 мкг или 4 мг) вводился в клетки путем инкубирования (3 ч при 37oС; "импульсы"). Из животных, которые получали вакцину с 400 мкг пептида, у трех из восьми не обнаружили опухоли, вакцина из клеток, обработанных 4 мг пептида, излечила только одно из восьми животных. Контролем служили одни облученные клетки М-3, а также клетки, которые нагружались комплексами без пептида (в каждом случае у 1/8 животных не наблюдали опухолей). В группе контрольных животных, где не проводили никакой обработки, у всех животных развились опухоли.
Мышей DBA/2 в возрасте 6-12 недель с пятидневным метастазом (приобретенным в результате подкожной инъекции 104 живых клеток М-3) обрабатывали дважды на протяжении недели противоопухолевой вакциной путем подкожной инъекции (доза: 105 клеток на животное). В эксперименте участвовало 8 мышей. Результат исследования представлен на фиг.2а; показано, что 7 из 8 животных после введения вакцины, которая содержала в опухолевых клетках загруженный с помощью комплексов ТФпЛ/ДНК пептид, были излечены. В сравнительных исследованиях применялась вакцина, в которой пептид LFEAIEGFI (400 мкг или 4 мг) вводился в клетки путем инкубирования (3 ч при 37oС; "импульсы"). Из животных, которые получали вакцину с 400 мкг пептида, у трех из восьми не обнаружили опухоли, вакцина из клеток, обработанных 4 мг пептида, излечила только одно из восьми животных. Контролем служили одни облученные клетки М-3, а также клетки, которые нагружались комплексами без пептида (в каждом случае у 1/8 животных не наблюдали опухолей). В группе контрольных животных, где не проводили никакой обработки, у всех животных развились опухоли.
Чтобы, с одной стороны, исследовать актуальность способа получения вакцины, а, с другой стороны, изучить пептидную последовательность, была проведена другая серия исследований; в этих экспериментах использовали высокоонкогенный вариант клеток М-3. В испытаниях, где изучали значение способа обработки, получали вакцину, в которой пептид нагружали в клетки не посредством полилизина-трансферрина, но исключительно адъювантно подмешивали к клеткам. Для контроля пептидной последовательности якорные аминокислоты пептида в положениях 2 и 9, а именно фенилаланин и изолейцин, замещали пролином или глицином, что приводило к пептиду Leu Pro Glu Ala Ile Glu Gly Phe Gly (LPEAIEGFG); этому пептиду не хватало способности к связыванию H2-Кd. Образование метастазов контролировали, как минимум, один раз в неделю. Результат этого исследования можно наблюдать на фиг.2б. Вакцина, полученная путем нагрузки клеток LFEAIEGFI с помощью комплексов ТФпЛ/ДНК, излечивала 6 из 8 животных. Напротив, опухоли развились у 7 из 8 животных, которые получали вакцину, для которой к клеткам примешивали исключительно пептид LFEAIEGFI или которая состояла из клеток, которые нагружались с помощью комплексов ТФпЛ/ДНК измененным, не связывающимся при HLA-мотиве, пептидом LPEAIEGFG. В контрольной группе, где обработка велась только облученными клетками М-3 или вообще не проводили никакой обработки, у всех животных развились опухоли.
в) Изучение влияния количества пептида в вакцине
Были получены, как описано в а), содержащие пептид комплексы, которые содержали либо 50, 5, либо 0,5 мкг активного пептида LFEAIEGFI, и этим нагружали клетки М-3. Сравнением служила секретирующая IL-2 вакцина, которая секретировала оптимальную дозу IL-2 (см. г). Эту вакцину вводили мышам DBA/2 с пятидневным метастазом. Вакцина с 50 мкг пептида излечивала 6 из 8 мышей, с 5 мкг излечивала 4 из 8 животных, так же, как секретирующая IL-2 вакцина, в то время как вакцина, содержащая 0,5 мкг, излечивала только двух из 8 животных. Это исследование представлено на фиг.3а.
Были получены, как описано в а), содержащие пептид комплексы, которые содержали либо 50, 5, либо 0,5 мкг активного пептида LFEAIEGFI, и этим нагружали клетки М-3. Сравнением служила секретирующая IL-2 вакцина, которая секретировала оптимальную дозу IL-2 (см. г). Эту вакцину вводили мышам DBA/2 с пятидневным метастазом. Вакцина с 50 мкг пептида излечивала 6 из 8 мышей, с 5 мкг излечивала 4 из 8 животных, так же, как секретирующая IL-2 вакцина, в то время как вакцина, содержащая 0,5 мкг, излечивала только двух из 8 животных. Это исследование представлено на фиг.3а.
Пример 3. Сравнение содержащей чужеродный пептид вакцины с противоопухолевой вакциной из секретирующих IL-2 опухолевых клеток на профилактической мышиной модели.
В сравнительных испытаниях две группы исследуемых животных (по 8 мышей в каждой) были предварительно дважды иммунизированы в течение одной недели, с одной стороны, описанной в примере 2а вакциной, с другой стороны, вакциной из секретирующих IL-2 клеток М-3 (полученной согласно протоколу, описанному в международной заявке на патент 94/21808, доза IL-2 составляет 2.000 единиц на животное). Через неделю после последней вакцинации, судя по повышенному количеству опухолевых клеток, были установлены контралатеральные опухоли ("контрольное заражение"; доза представлена на фиг.3б). Обнаружилось, что предварительная иммунизация противоопухолевой вакциной согласно изобретению превосходила обработку секретирующей IL-2 вакциной: простые мыши, вакцинированные секретирующей IL-2 вакциной, были защищены только против одной дозы в 105 живых, высокоонкогенных клеток (M-3-W). Эффективность этой вакцины была, однако, исчерпана при контрольном заражении 3•105 клетками, в то время как опухолевые нагрузки такого масштаба были успешно преодолены животными, которые предварительно подверглись иммунизации вакциной из нагруженных чужеродным пептидом опухолевых клеток.
Пример 4. Защита мышей Balb/с путем предварительной иммунизации вакциной из нагруженных чужеродным пептидом клеток рака толстого кишечника ("профилактическая мышиная модель").
а) Получение вакцины СТ-26
160 мкг ксенопептида LFEAIEGFI или FFIGALEEI смешивали с 12 мкг пЛ или с 3 мкг ТФпЛ и 10 мкг пЛ и подвергали реакции комплексообразования в течение 30 минут при комнатной температуре в 500 мкл ССРХ-буфера, затем переносили в бутыль с клеточной культурой Т 75 с 1,5•106 клетками СТ-26 в 4 мл МДСИ (10% ОСТ, 20 мМ глюкоза), затем инкубировали при 37oС в 5% углекислом газе. Через 4 часа клетки промывали ЗФР, смешивали с 15 мл свежей среды и инкубировали в течение ночи при 37oС в 5% углекислом газе. За 4 часа до применения клетки облучали дозой в 100 грей. Обработку вакцины осуществляли, как описано в международной заявке на патент 94/21808.
160 мкг ксенопептида LFEAIEGFI или FFIGALEEI смешивали с 12 мкг пЛ или с 3 мкг ТФпЛ и 10 мкг пЛ и подвергали реакции комплексообразования в течение 30 минут при комнатной температуре в 500 мкл ССРХ-буфера, затем переносили в бутыль с клеточной культурой Т 75 с 1,5•106 клетками СТ-26 в 4 мл МДСИ (10% ОСТ, 20 мМ глюкоза), затем инкубировали при 37oС в 5% углекислом газе. Через 4 часа клетки промывали ЗФР, смешивали с 15 мл свежей среды и инкубировали в течение ночи при 37oС в 5% углекислом газе. За 4 часа до применения клетки облучали дозой в 100 грей. Обработку вакцины осуществляли, как описано в международной заявке на патент 94/21808.
б) Испытание активности противораковой вакцины на ее защитное действие против контрольного заражения СТ-26
Мышей Balb/c в возрасте 6-12 недель дважды в течение недели вакцинировали путем подкожных инъекций (доза клеток: 105/мышь). В эксперименте в каждую группу входило 8 мышей (или 7 мышей при исследовании, когда для нагрузки клеток использовали пЛ). Через неделю после последней вакцинации в контралатеральные опухоли вводили 5•104 родительских клеток СТ-26. Сравнительные исследования, в которых вакцину получали другим способом, нежели с помощью комплексов из ТФпЛ/ДНК, проводили, так же, как и контрольные, как описано в примере 2. Развитие опухоли контролировали, как минимум, раз в неделю. Результат для пептида LFEAIEGFI можно видеть на фиг.4а; шесть из восьми животных были защищены. В случае пептида FFIGALEEI (не показано на фиг.4а, были защищены 4 из 8 животных).
Мышей Balb/c в возрасте 6-12 недель дважды в течение недели вакцинировали путем подкожных инъекций (доза клеток: 105/мышь). В эксперименте в каждую группу входило 8 мышей (или 7 мышей при исследовании, когда для нагрузки клеток использовали пЛ). Через неделю после последней вакцинации в контралатеральные опухоли вводили 5•104 родительских клеток СТ-26. Сравнительные исследования, в которых вакцину получали другим способом, нежели с помощью комплексов из ТФпЛ/ДНК, проводили, так же, как и контрольные, как описано в примере 2. Развитие опухоли контролировали, как минимум, раз в неделю. Результат для пептида LFEAIEGFI можно видеть на фиг.4а; шесть из восьми животных были защищены. В случае пептида FFIGALEEI (не показано на фиг.4а, были защищены 4 из 8 животных).
в) Участие Т-лимфоцитов в действии противоопухолевой вакцины
Чтобы обнаружить участие Т-лимфоцитов в вызванном СТ-26 - вакциной системном иммунитете, в другом опыте за 24 часа до вакцинирования удаляли клетки CD4+ путем внутривенной инъекции 500 мкг моноклонального антитела GK1.5 (AKTK TIB 207), клетки CD8+ удаляли путем внутривенной инъекции 500 мкг моноклонального антитела 2.43 (AKTK TIB 210). Позитивная контрольная группа получала вакцину без удаления клеток CD4+ и клеток CD8+. Результат испытания представлен на фиг. 4б: участие Т-лимфоцитов проявляется в том, что у всех животных, чьи Т-лимфоциты были удалены, развились опухоли.
Чтобы обнаружить участие Т-лимфоцитов в вызванном СТ-26 - вакциной системном иммунитете, в другом опыте за 24 часа до вакцинирования удаляли клетки CD4+ путем внутривенной инъекции 500 мкг моноклонального антитела GK1.5 (AKTK TIB 207), клетки CD8+ удаляли путем внутривенной инъекции 500 мкг моноклонального антитела 2.43 (AKTK TIB 210). Позитивная контрольная группа получала вакцину без удаления клеток CD4+ и клеток CD8+. Результат испытания представлен на фиг. 4б: участие Т-лимфоцитов проявляется в том, что у всех животных, чьи Т-лимфоциты были удалены, развились опухоли.
Пример 5. Защита мышей C57BL/6J путем предварительной иммунизации вакциной из нагруженных чужеродным белком меланомных клеток ("профилактическая мышиная модель").
В этом примере в качестве исследуемых мышей использовали мышей штамма C57BL/6J (каждый раз по 8 животных в группе). В качестве меланомных клеток были использованы сингенные для используемого мышиного штамма клетки B16-F10 (НИЗ США, ДЦО, депозитарий опухолей; Fidler и др., 1975).
Животных всех исследуемых групп дважды за период в неделю вакцинировали путем подкожных инъекций 105 клетками B16-F10 на мышь.
В серии исследований получали вакцину таким образом, что облученные клетки B16-F10 нагружали пептидом с последовательностью ASNENMETM, как описано в примере 2 для вакцины из клеток М-3.
В параллельных исследованиях применялись секретирующие IL-2 или GM-CSF клетки B16-F10 (полученные согласно протоколу, описанному в международной заявке на патент 94/21808) в качестве вакцины для предварительной иммунизации; вакцина продуцировала 1.000 единиц IL-2 или 200 нг GM-CSF на животное.
Контрольная группа получала для предварительной иммунизации облученные и в остальном необработанные клетки B16-F10.
Через неделю после последней вакцинации подопытным животным прививали опухоль с помощью 1•104 живых, облученных клеток B16-F10 и затем следили за ростом опухоли.
Результат исследования представлен на фиг.5; нагруженные чужеродным пептидом опухолевые клетки продемонстрировали наилучшее защитное действие в отношении образования опухоли.
Литература
Alexander, J. и др., 1989, Immunogenetics 29, 380
Allred, D.C. и др., 1992, J. Clin. Oncol. 10 (4), 599-605
Behr, J.P., 1994, Bioconjug-Chem., сентябрь-октябрь, 5(5), 382-9
Biologic Therapy of Cancer, Редакторы: DeVita, V.T.Jr., Hellman, S.
Alexander, J. и др., 1989, Immunogenetics 29, 380
Allred, D.C. и др., 1992, J. Clin. Oncol. 10 (4), 599-605
Behr, J.P., 1994, Bioconjug-Chem., сентябрь-октябрь, 5(5), 382-9
Biologic Therapy of Cancer, Редакторы: DeVita, V.T.Jr., Hellman, S.
Rosenberg, S.A., издательство J.B. Lippincott Company, Филадельфия, Нью-Йорк, Лондон, Хагерстаун
Boon, Т., 1993, Spektrum der Wissenschaft (май), 58-66
Boon, Т. и др., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 337-65
Braciale,T.J. и Braciale, V.L., 1991, Immunol. Today 12, 124-129
Carrel, S. и Johnson, J.P., 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389
Coligan, J. E. , Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H., Shevach, Falk, К. и др., 1991, Nature 351, 290-296
Coulie, P.G. и др., 1992, Int. J. Cancer, 50, 289-297
Coulie, P. G. , Lehmann, F., Lethe, В., Herman, J., Lurquin, C., Andrawiss, M. и Boon, T. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7976-80
Cox, A.L. и др., 1994. Science 264, 5159, 716-9
Current Protocols im Molecular Biology, 1995, ответственный редактор: Ausubel F.M. и др., John Wiley & Sons, Inc.
Boon, Т., 1993, Spektrum der Wissenschaft (май), 58-66
Boon, Т. и др., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 337-65
Braciale,T.J. и Braciale, V.L., 1991, Immunol. Today 12, 124-129
Carrel, S. и Johnson, J.P., 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389
Coligan, J. E. , Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H., Shevach, Falk, К. и др., 1991, Nature 351, 290-296
Coulie, P.G. и др., 1992, Int. J. Cancer, 50, 289-297
Coulie, P. G. , Lehmann, F., Lethe, В., Herman, J., Lurquin, C., Andrawiss, M. и Boon, T. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7976-80
Cox, A.L. и др., 1994. Science 264, 5159, 716-9
Current Protocols im Molecular Biology, 1995, ответственный редактор: Ausubel F.M. и др., John Wiley & Sons, Inc.
Dranoff, G. и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3539-3543
Dranoff, G. и Mulligan, R.C., 1995, Advances in Immunology 58, 417
Falk, К. и др., 1991, Nature 351, 290-296
Felgner, J.H. и др., 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561
Fenton, R.G. и др., 1993, J. Natl. Cancer Inst. 85, 16, 1294-302
Fisk, В. и др., 1995, J. Exp. Med. 1881, 2109-2117
Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Cell Biology, 1989, том 33, ответственные редакторы: Darzynkiewicz, Z. и Crissman, H.A.
Dranoff, G. и Mulligan, R.C., 1995, Advances in Immunology 58, 417
Falk, К. и др., 1991, Nature 351, 290-296
Felgner, J.H. и др., 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561
Fenton, R.G. и др., 1993, J. Natl. Cancer Inst. 85, 16, 1294-302
Fisk, В. и др., 1995, J. Exp. Med. 1881, 2109-2117
Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Cell Biology, 1989, том 33, ответственные редакторы: Darzynkiewicz, Z. и Crissman, H.A.
Gedde Dahl, T. и др., 1992, Hum. Immunol. 33, 4, 266-274
Guarini, А. и др., 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1, 57-64
Han, X.K. и др., 1995, PNAS 92, 9747-9751
Справочник: FACS VantageTM User's Guide, апрель 1994, Бектон Дикинсон
Справочник: CELL Quest TM Software User's Guide, июнь 1994, Бектон Дикинсон
Herin. и др., 1987. Int. J. Cancer, 39, 390
Hock, Н. и др., 1993, Cancer Research 53, 714-716
Houbiers, J. G., Nijman, H. W., van der Burg, S.H., Drijfhout, J. W.,
Kenemans, P., van de Velde, C. J., Brand, A., Momburg, F., Kast, W.M. и Melief, C. J. (1993). Eur. J. Immunol. 23, 2072-7
Huang, A. Y. C. и Pardoll, D.M. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9730-5 Jung, S. и др., 1991, J. Exp. Med. 173, 1, 273-6
Kawakami, Y. и др., 1995, The Journal of Immunol. 154, 3961-3968
Karre, К.. и др., 1986, Nature 319, 20. февр., 675
Kovacsovics Bankowski, M. и Rock, K..L., 1995, Science 267, 243-246
Lehmann, J.M. и др., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895
Lethe, В. и др., 1992, Eur. J. Immunol. 22, 2283-2288 Lill, N.L., Tevethia, M. J., Hendrickson, W.G. и Tevethia, S. S. (1992). J. Exp. Med. 176, 449-57
Loeffler, J.-P. и др., 1993, Methods Enzymol. 217, 599-618
Mackiewicz, А. и др., 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811
Malnati, M.S. и др., 1995, Science 267, 1016-1018
Mandelboim, О. и др., 1994, Nature 369, 5. май, 67-71
Mandelboim, O. и др., 1995, Nature Medicine 1, 11, 1179-1183
Morishita. R. и др., 1993, J. Clin. Invest. 91, 6, 2580-5
Nabel, G.J. и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11307-11311
Noguchi, Y., Chen, Y. Т. и Old, L. J. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3171-3175
Oettgen, H. F. и Old, L. J., 1991, Biologic Therapy of Cancer, под редакцией: DeVita, V. Т. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., издательство J.B. Lippincott Company, Филадельфия, Нью-Йорк, Лондон, Хагерстаун, 87-119
Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727
Pardoll, D. M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310 Practical Immunology, редакторы: Leslie Hudson и Frank C. Hay, научные публикации Blackwell, Оксфорд, Лондон, Эдинбург, Бостон, Мельбурн
Peace, D. J. и др., 1991, J. Immunol. 146, 6. 2059-65
Peoples, G.E. и др., 1994, J. Immunol. 152, 10, 4993-9
Plautz, G.E. и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649
Rammensee, H. G. и др., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35-44
Rammensee, H. G., 1995, Current Opinion in Immunology 7, 85-96
Rammensee, H. G. , Friede, Т. и Stepvanovic, S. (1995). Immunogenetics 41, 178-228
Remy, J. S. и др., 1994, Bioconjug-Chem., ноябрь-декабрь, 5(6), 647-54
Rivoltini, L. и др., 1995, The Journal of Immunology 154, 2257-2265
Robbins, P. P., el Gamil, M., Li, Y. F., Topalian, S.L., Rivoltini, L., Sakaguchi, K. . , Appella, E., Kawakami, Y. и Rosenberg, S. A. (1995). J. Immunol. 154, 5944-50
Robbins и Rosenberg. (1996). J. EXP. MED. 183, 1185-92.
Guarini, А. и др., 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1, 57-64
Han, X.K. и др., 1995, PNAS 92, 9747-9751
Справочник: FACS VantageTM User's Guide, апрель 1994, Бектон Дикинсон
Справочник: CELL Quest TM Software User's Guide, июнь 1994, Бектон Дикинсон
Herin. и др., 1987. Int. J. Cancer, 39, 390
Hock, Н. и др., 1993, Cancer Research 53, 714-716
Houbiers, J. G., Nijman, H. W., van der Burg, S.H., Drijfhout, J. W.,
Kenemans, P., van de Velde, C. J., Brand, A., Momburg, F., Kast, W.M. и Melief, C. J. (1993). Eur. J. Immunol. 23, 2072-7
Huang, A. Y. C. и Pardoll, D.M. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9730-5 Jung, S. и др., 1991, J. Exp. Med. 173, 1, 273-6
Kawakami, Y. и др., 1995, The Journal of Immunol. 154, 3961-3968
Karre, К.. и др., 1986, Nature 319, 20. февр., 675
Kovacsovics Bankowski, M. и Rock, K..L., 1995, Science 267, 243-246
Lehmann, J.M. и др., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895
Lethe, В. и др., 1992, Eur. J. Immunol. 22, 2283-2288 Lill, N.L., Tevethia, M. J., Hendrickson, W.G. и Tevethia, S. S. (1992). J. Exp. Med. 176, 449-57
Loeffler, J.-P. и др., 1993, Methods Enzymol. 217, 599-618
Mackiewicz, А. и др., 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811
Malnati, M.S. и др., 1995, Science 267, 1016-1018
Mandelboim, О. и др., 1994, Nature 369, 5. май, 67-71
Mandelboim, O. и др., 1995, Nature Medicine 1, 11, 1179-1183
Morishita. R. и др., 1993, J. Clin. Invest. 91, 6, 2580-5
Nabel, G.J. и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11307-11311
Noguchi, Y., Chen, Y. Т. и Old, L. J. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3171-3175
Oettgen, H. F. и Old, L. J., 1991, Biologic Therapy of Cancer, под редакцией: DeVita, V. Т. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., издательство J.B. Lippincott Company, Филадельфия, Нью-Йорк, Лондон, Хагерстаун, 87-119
Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727
Pardoll, D. M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310 Practical Immunology, редакторы: Leslie Hudson и Frank C. Hay, научные публикации Blackwell, Оксфорд, Лондон, Эдинбург, Бостон, Мельбурн
Peace, D. J. и др., 1991, J. Immunol. 146, 6. 2059-65
Peoples, G.E. и др., 1994, J. Immunol. 152, 10, 4993-9
Plautz, G.E. и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649
Rammensee, H. G. и др., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35-44
Rammensee, H. G., 1995, Current Opinion in Immunology 7, 85-96
Rammensee, H. G. , Friede, Т. и Stepvanovic, S. (1995). Immunogenetics 41, 178-228
Remy, J. S. и др., 1994, Bioconjug-Chem., ноябрь-декабрь, 5(6), 647-54
Rivoltini, L. и др., 1995, The Journal of Immunology 154, 2257-2265
Robbins, P. P., el Gamil, M., Li, Y. F., Topalian, S.L., Rivoltini, L., Sakaguchi, K. . , Appella, E., Kawakami, Y. и Rosenberg, S. A. (1995). J. Immunol. 154, 5944-50
Robbins и Rosenberg. (1996). J. EXP. MED. 183, 1185-92.
Schmidt, W. и др., май 1995, Рrос. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4711-4714
Skipper, J. и Stauss, H. J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5, 1493-8
Slingluff, С. L. и др., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 733-740
Stein, D. и др., 1994, EMBO-Journal, 13, 6, 1331-40
Stuber, G. , Leder, G. H. , Storkus, W. Т., Lotze, M. Т., Modrow, S., Szekely, L. , Wolf, H. , Klein, E., Karre, К. и Klein, G. (1994). Eur. J. Immunol. 24, 765-768
Sykulev, Y. и др., 1994, Immunity 1, 15-22
Theobald, M., Levine, A. J. и Sherman, L. A. (1995) PNAS 92, 11993-7
Tibbets,L.M. и др., 1993, Cancer, январь 15., том 71, 2, 315-321
van der Bruggen, Р. и др., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 9, 2134-40, международный стандартный серийный номер: 0014-2980
Van Pel, А. и Boon, Т., 1982, Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4718-4722
Wolfel, T. и др., 1994 a), Int. J. Cancer 57, 413-418
Wolfel, Т. и др., 1994 б), Eur. J. Immunol. 24, 759-764
Wolfel, Т., Hauer, M., Schneider, J., Serrano, M., Wolfel, C., Klehmann Hieb, E., De Plaen, E., Hankeln, Т., Meyer zum Buschenfelde, K. H. и Beach, D. (1995). Science 269, 1281-4
York, I.A. и Rock, K. L., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14, 369-396
Yoshino, I. и др., 1994 a), J. Immunol. 152, 5, 2393-400
Yoshino, I. и др., 1994 б), Cancer Res., 54, 13, 3387-90
Zatloukal, К. и др., 1993, Gene 135, 199-20
Zatloukal, К. и др., 1995, J. Immun. 154, 3406-3419e
Skipper, J. и Stauss, H. J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5, 1493-8
Slingluff, С. L. и др., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 733-740
Stein, D. и др., 1994, EMBO-Journal, 13, 6, 1331-40
Stuber, G. , Leder, G. H. , Storkus, W. Т., Lotze, M. Т., Modrow, S., Szekely, L. , Wolf, H. , Klein, E., Karre, К. и Klein, G. (1994). Eur. J. Immunol. 24, 765-768
Sykulev, Y. и др., 1994, Immunity 1, 15-22
Theobald, M., Levine, A. J. и Sherman, L. A. (1995) PNAS 92, 11993-7
Tibbets,L.M. и др., 1993, Cancer, январь 15., том 71, 2, 315-321
van der Bruggen, Р. и др., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 9, 2134-40, международный стандартный серийный номер: 0014-2980
Van Pel, А. и Boon, Т., 1982, Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4718-4722
Wolfel, T. и др., 1994 a), Int. J. Cancer 57, 413-418
Wolfel, Т. и др., 1994 б), Eur. J. Immunol. 24, 759-764
Wolfel, Т., Hauer, M., Schneider, J., Serrano, M., Wolfel, C., Klehmann Hieb, E., De Plaen, E., Hankeln, Т., Meyer zum Buschenfelde, K. H. и Beach, D. (1995). Science 269, 1281-4
York, I.A. и Rock, K. L., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14, 369-396
Yoshino, I. и др., 1994 a), J. Immunol. 152, 5, 2393-400
Yoshino, I. и др., 1994 б), Cancer Res., 54, 13, 3387-90
Zatloukal, К. и др., 1993, Gene 135, 199-20
Zatloukal, К. и др., 1995, J. Immun. 154, 3406-3419e
Claims (26)
1. Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ, отличающийся тем, что он включает аутологичные и/или аллогенные опухолевые клетки, содержащие антигены, которые идентичны опухолевым подвергающегося лечению организма, при этом, по меньшей мере, часть опухолевых клеток имеет, как минимум, один гаплотип ГКГ-1 (ГКГ - главный комплекс гистосовместимости) организма на клеточной поверхности, и опухолевые клетки нагружены одним или несколькими пептидами а) и/или б) таким образом, что опухолевые клетки вместе с пептидами распознаются как чужеродные иммунной системой организма и вызывают клеточный иммунный ответ, причем пептиды а) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-1, одинакового для организма и опухолевых клеток иммуностимулятора, и отличаются от пептидов, являющихся производными белков, экспримируемых клетками организма, или б) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-1, одинакового для организма и опухолевых клеток иммуностимулятора, и происходят от опухолевых антигенов, экспримируемых клетками организма и находящихся в опухолевых клетках иммуностимулятора в концентрации, которая выше, чем концентрация пептида, происходящего от того же самого опухолевого антигена, экспримируемого в опухолевых клетках организма.
2. Иммуностимулятор по п.1, отличающийся тем, что аллогенные опухолевые клетки являются клетками одной или нескольких линий клеток, из которых, по меньшей мере, одна линия клеток экспримирует, как минимум, один, предпочтительно несколько опухолевых антигенов, идентичных опухолевым антигенам подвергающегося лечению организма.
3. Иммуностимулятор по п. 1, отличающийся тем, что пептид а) и/или б) означает лиганд для Н2-Кd или Н2-Кb.
4. Иммуностимулятор по п.1 или 3, отличающийся тем, что пептид а) происходит от встречающегося в природе иммуногенного белка или его продукта расщепления в клетке, или от вирусного, или бактериального белка.
5. Иммуностимулятор по п.4, отличающийся тем, что пептид происходит от белка вируса гриппа.
6. Иммуностимулятор по п.5, отличающийся тем, что пептид имеет последовательность Leu Phe Glu Аlа IIe Glu Gly Phe IIe или Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met.
7. Иммуностимулятор по п.1, отличающийся тем, что пептид а) происходит от чужеродного организму опухолевого антигена.
8. Иммуностимулятор по п.1, отличающийся тем, что пептид является синтетическим пептидом.
9. Иммуностимулятор по п.8, отличающийся тем, что пептид имеет последовательность Phe Phe IIe Gly Ala Leu Glu Glu IIe.
10. Иммуностимулятор по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что опухолевые клетки обработаны несколькими пептидами с различными последовательностями.
11. Иммуностимулятор по п.10, отличающийся тем, что пептиды различаются тем, что они связываются с различными субтипами HLA.
12. Иммуностимулятор по одному из пп.1-12, отличающийся тем, что пептиды различаются в отношении их последовательности, не имеющей важное значение для связывания с HLA.
13. Иммуностимулятор по одному из пп.1-12, отличающийся тем, что он дополнительно содержит опухолевые клетки, которые подвергаются трансфекции цитокиновым геном.
14. Иммуностимулятор по п. 13, отличающийся тем, что цитокин является интерлейкином-2 (IL-2) и/или γ-интерфероном (IFN-γ).
15. Иммуностимулятор по одному из пп.1-14, отличающийся тем, что он дополнительно содержит фибропласты, обработанные пептидом 6).
16. Иммуностимулятор по одному из пп.1-15, отличающийся тем, что он дополнительно содержит дендритные клетки, обработанные пептидом б) и/или связывающимся с молекулой ГКГ-II пептидом.
17. Способ получения иммуностимулятора, вызывающего специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ, содержащего опухолевые клетки, вводимого в организм, отличающийся тем, что содержащие антигены, идентичные опухолевым антигенам подвергающегося лечению организма, опухолевые клетки, по меньшей мере, часть которых экспримирует, как минимум, один гаплотип ГКГ-I организма, обрабатывают одним или несколькими пептидами, которые а) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-1, одинакового для организма и опухолевых клеток иммуностимулятора, и отличаются от пептидов, происходящих от белков, экспримируемых клетками организма, или б) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-1, одинакового для организма и опухолевых клеток иммуностимулятора, и происходят от опухолевых антигенов, экспримируемых клетками организма, причем опухолевые клетки инкубируют с одним или несколькими пептидами а) и/или б) до тех пор и в таком количестве в присутствии органического поликатиона, пока пептиды не будут связаны с опухолевыми клетками таким образом, что они вместе с опухолевыми клетками распознаются иммунной системой организма как чужеродные и вызывают клеточный иммунный ответ.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что в качестве поликатиона используют полилизин.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что используют полилизин, длина цепи которого составляет примерно от 30 до 300 остатков лизина.
20. Способ по одному из пп.17-19, отличающийся тем, что поликатион используют, как минимум, в частично конъюгированной форме.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что поликатион конъюгирован с трансферрином.
22. Способ по пп.17-20, отличающийся тем, что клетки обрабатывают в присутствии ДНК.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что ДНК является плазмидой.
24. Способ по п.22 или 23, отличающийся тем, что отношение ДНК к поликатиону, при необходимости частично конъюгированному с белком, составляет примерно от 1:2 до 1:5.
25. Способ по одному из пп.22-24, отличающийся тем, что клетки являются клетками меланомы.
26. Способ по п.17, отличающийся тем, что пептид а) и/или б) используют в количестве от примерно 50 мкг до примерно 160 мкг на 1•105 до 2•107 клеток.
Приоритет по пунктам и признакам:
23.11.95 - по пп.1, 2, 4, 5, 7, 8 - 26;
п.3 - в части пептида, представляющего собой лиганд для Н2-Кd;
п. 6 - в части пептида с последовательностью Leu Phe Glu Аlа IIe Glu Gly Phe IIe относятся к приоритету от 23.11.1995, п. 3 - в части пептида, представляющего собой лиганд для Н2-Кb;
24.02.1996 - п.6 в части пептида с последовательностью Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met.
23.11.95 - по пп.1, 2, 4, 5, 7, 8 - 26;
п.3 - в части пептида, представляющего собой лиганд для Н2-Кd;
п. 6 - в части пептида с последовательностью Leu Phe Glu Аlа IIe Glu Gly Phe IIe относятся к приоритету от 23.11.1995, п. 3 - в части пептида, представляющего собой лиганд для Н2-Кb;
24.02.1996 - п.6 в части пептида с последовательностью Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19543649.0 | 1995-11-23 | ||
DE19543649A DE19543649C2 (de) | 1995-11-23 | 1995-11-23 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
DE19607044A DE19607044A1 (de) | 1996-02-24 | 1996-02-24 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
DE19607044.9 | 1996-02-24 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98111622A RU98111622A (ru) | 2000-05-20 |
RU2206329C2 true RU2206329C2 (ru) | 2003-06-20 |
Family
ID=26020603
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98111622/14A RU2206329C2 (ru) | 1995-11-23 | 1996-11-21 | Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ и способ его получения |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20020085997A1 (ru) |
EP (1) | EP0866851A1 (ru) |
JP (1) | JP2000502052A (ru) |
KR (1) | KR19990067653A (ru) |
CN (1) | CN1202931A (ru) |
AR (1) | AR004341A1 (ru) |
AU (1) | AU720131B2 (ru) |
BG (1) | BG62999B1 (ru) |
BR (1) | BR9611466A (ru) |
CA (1) | CA2238176A1 (ru) |
CO (1) | CO4520254A1 (ru) |
CZ (1) | CZ158998A3 (ru) |
EE (1) | EE03778B1 (ru) |
HU (1) | HUP0000318A3 (ru) |
NO (1) | NO982329D0 (ru) |
NZ (1) | NZ322910A (ru) |
PL (1) | PL188537B1 (ru) |
RO (1) | RO115275B1 (ru) |
RU (1) | RU2206329C2 (ru) |
SK (1) | SK66998A3 (ru) |
TR (1) | TR199800912T2 (ru) |
TW (1) | TW514530B (ru) |
UY (2) | UY24367A1 (ru) |
WO (1) | WO1997019169A1 (ru) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2556128C2 (ru) * | 2003-08-25 | 2015-07-10 | ЮниВэкс, ЭлЭлСи | Профилактическая противораковая вакцина |
US11504421B2 (en) | 2017-05-08 | 2022-11-22 | Gritstone Bio, Inc. | Alphavirus neoantigen vectors |
US11591619B2 (en) | 2019-05-30 | 2023-02-28 | Gritstone Bio, Inc. | Modified adenoviruses |
RU2803566C2 (ru) * | 2017-05-08 | 2023-09-15 | Гритстоун Био, Инк. | Неоантигенные векторы на основе альфавируса |
US11771747B2 (en) | 2020-08-06 | 2023-10-03 | Gritstone Bio, Inc. | Multiepitope vaccine cassettes |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RS50101B (sr) | 1996-02-24 | 2009-01-22 | Boehringer Ingelheim International Gmbh., | Farmaceutski preparati za imunomodulaciju |
US6187307B1 (en) | 1997-01-31 | 2001-02-13 | Research Corporation Technologies, Inc. | Cancer immunotherapy with semi-allogeneic cells |
ES2232845T3 (es) * | 1997-08-22 | 2005-06-01 | Science Park Raf S.P.A. | Vacunacion tumoral mediante la utilizacion de celulas autologas o celulas presentadoras de antigeno (apc) relacionadas con hla transducidas con un antigeno tumoral y un antigeno ajeno capaz de producir una reaccion inmune. |
AU3102799A (en) * | 1998-03-20 | 1999-10-11 | Genzyme Corporation | Enhanced anti-tumor immunity |
US7014848B1 (en) | 1998-03-20 | 2006-03-21 | Genzyme Corporation | Enhanced anti-tumor immunity |
FR2807661A1 (fr) * | 2000-04-14 | 2001-10-19 | Univ Nantes | Agent et procede pour la simulation de lymphocytes t specifiques et lymphocytes t obtenus |
CA2476995A1 (en) * | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Kyogo Itoh | Method of detecting cellular immunity and application thereof to drugs |
GB0209896D0 (en) | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
CN1315536C (zh) * | 2002-09-13 | 2007-05-16 | 李进 | 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物 |
GB0224442D0 (en) | 2002-10-21 | 2002-11-27 | Molmed Spa | A delivery system |
US7674456B2 (en) * | 2004-06-14 | 2010-03-09 | Charles Wiseman | Breast cancer cell lines and uses thereof |
WO2006105255A2 (en) * | 2005-03-29 | 2006-10-05 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Cancer vaccines and therapeutic methods |
ATE461214T1 (de) * | 2005-09-05 | 2010-04-15 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Tumor-assoziierte peptide, welche an unterschiedliche menschliche leukozytenantigene der klasse ii binden |
US20090004213A1 (en) * | 2007-03-26 | 2009-01-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Combination therapy using active immunotherapy |
US8765148B2 (en) | 2010-02-19 | 2014-07-01 | Valneva Austria Gmbh | 1C31 nanoparticles |
CN104662171B (zh) * | 2012-07-12 | 2018-07-13 | 普瑟姆尼股份有限公司 | 个性化癌症疫苗和过继免疫细胞治疗 |
US20240156869A1 (en) * | 2021-03-12 | 2024-05-16 | T-Cure Bioscience, Inc. | Methods of enhancing diversity of hla haplotype expression in tumors to broaden tumor cell susceptibility to tcr-t therapy |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
EP0569678A3 (en) * | 1992-03-13 | 1994-10-26 | Yeda Res & Dev | Double transfectants of MHC genes as cellular vaccines for immunoprevention of tumor metastasis. |
-
1996
- 1996-11-19 UY UY24367A patent/UY24367A1/es not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 NZ NZ322910A patent/NZ322910A/xx unknown
- 1996-11-21 SK SK669-98A patent/SK66998A3/sk unknown
- 1996-11-21 WO PCT/EP1996/005126 patent/WO1997019169A1/de not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 CA CA002238176A patent/CA2238176A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-21 PL PL96326756A patent/PL188537B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 KR KR1019980703681A patent/KR19990067653A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 JP JP9519395A patent/JP2000502052A/ja not_active Abandoned
- 1996-11-21 BR BR9611466A patent/BR9611466A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 CZ CZ981589A patent/CZ158998A3/cs unknown
- 1996-11-21 RO RO98-00985A patent/RO115275B1/ro unknown
- 1996-11-21 HU HU0000318A patent/HUP0000318A3/hu unknown
- 1996-11-21 US US09/077,214 patent/US20020085997A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-21 CN CN96198493A patent/CN1202931A/zh active Pending
- 1996-11-21 RU RU98111622/14A patent/RU2206329C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 EP EP96939870A patent/EP0866851A1/de not_active Withdrawn
- 1996-11-21 AU AU76947/96A patent/AU720131B2/en not_active Ceased
- 1996-11-21 TR TR1998/00912T patent/TR199800912T2/xx unknown
- 1996-11-21 EE EE9800161A patent/EE03778B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-11-22 CO CO96061701A patent/CO4520254A1/es unknown
- 1996-11-22 AR ARP960105291A patent/AR004341A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-11-23 TW TW085114455A patent/TW514530B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-01-03 UY UY24430A patent/UY24430A1/es not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-05-08 BG BG102439A patent/BG62999B1/bg unknown
- 1998-05-22 NO NO982329A patent/NO982329D0/no unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ECSENBACH and FELDMAN. Genes and antygenes controlling tumer metastasis, Hematology and blood transfusion, Modern Trends in human Leukemia IV, ed R. Neth et al., 1985, рр. 499-507. * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2556128C2 (ru) * | 2003-08-25 | 2015-07-10 | ЮниВэкс, ЭлЭлСи | Профилактическая противораковая вакцина |
US11504421B2 (en) | 2017-05-08 | 2022-11-22 | Gritstone Bio, Inc. | Alphavirus neoantigen vectors |
US11510973B2 (en) | 2017-05-08 | 2022-11-29 | Gritstone Bio, Inc. | Alphavirus antigen vectors |
RU2803566C2 (ru) * | 2017-05-08 | 2023-09-15 | Гритстоун Био, Инк. | Неоантигенные векторы на основе альфавируса |
US11591619B2 (en) | 2019-05-30 | 2023-02-28 | Gritstone Bio, Inc. | Modified adenoviruses |
US11771747B2 (en) | 2020-08-06 | 2023-10-03 | Gritstone Bio, Inc. | Multiepitope vaccine cassettes |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SK66998A3 (en) | 1998-12-02 |
EP0866851A1 (de) | 1998-09-30 |
EE9800161A (et) | 1998-12-15 |
HUP0000318A2 (hu) | 2000-06-28 |
CN1202931A (zh) | 1998-12-23 |
CO4520254A1 (es) | 1997-10-15 |
PL326756A1 (en) | 1998-10-26 |
BG102439A (en) | 1999-01-29 |
NO982329D0 (no) | 1998-05-22 |
HUP0000318A3 (en) | 2002-02-28 |
UY24367A1 (es) | 2000-10-31 |
WO1997019169A1 (de) | 1997-05-29 |
AR004341A1 (es) | 1998-11-04 |
AU7694796A (en) | 1997-06-11 |
JP2000502052A (ja) | 2000-02-22 |
BR9611466A (pt) | 1999-05-18 |
UY24430A1 (es) | 1997-07-01 |
US20020085997A1 (en) | 2002-07-04 |
AU720131B2 (en) | 2000-05-25 |
TR199800912T2 (xx) | 1998-08-21 |
CZ158998A3 (cs) | 1999-06-16 |
KR19990067653A (ko) | 1999-08-25 |
NZ322910A (en) | 2000-05-26 |
EE03778B1 (et) | 2002-06-17 |
BG62999B1 (bg) | 2001-01-31 |
RO115275B1 (ro) | 1999-12-30 |
PL188537B1 (pl) | 2005-02-28 |
TW514530B (en) | 2002-12-21 |
CA2238176A1 (en) | 1997-05-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2206329C2 (ru) | Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ и способ его получения | |
CA2243559C (en) | Pharmaceutical composition for immunomodulation | |
Minev et al. | Insertion signal sequence fused to minimal peptides elicits specific CD8+ T-cell responses and prolongs survival of thymoma-bearing mice | |
US9132178B2 (en) | Cytotoxic T lymphocyte inducing immunogens for prevention treatment and diagnosis of cancer | |
KR20120030380A (ko) | 암 항원 헬퍼 펩티드 | |
IL184273A (en) | Use of entraining and amplifying compositions in the manufacture of a medicament for immunization and a set of immunogenic compositions for inducing an immune response in a mammal | |
Faure et al. | Long‐lasting cross‐presentation of tumor antigen in human DC | |
IL309716A (en) | B*44-restricted peptides for use in immunotherapy for the treatment of cancer and derived methods | |
CA3153470A1 (en) | Antigenic peptides for prevention and treatment of b-cell malignancy | |
US9597384B2 (en) | Semi-allogenic anti-tumour vaccine with HLA haplo-identical antigen-presenting cells | |
Palmowski et al. | The use of HLA class I tetramers to design a vaccination strategy for melanoma patients | |
US20220062397A1 (en) | Vaccines targeting neoepitopes | |
Berinstein | Overview of therapeutic vaccination approaches for cancer | |
MXPA98003930A (en) | Vaccines against tumors and procedure for your producc | |
van de Ven-van Balken | Allogeneic autophagosome-enriched composition for the treatment of disease | |
DE19543649C2 (de) | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
JPWO2020260898A5 (ru) | ||
Jonasch | Melanoma vaccination: state-of-the-art and experimental approaches | |
JP2018520152A (ja) | 免疫原性プレプロカルシトニンペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20041122 |