KR20120030380A - 암 항원 헬퍼 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 WT1 단백질 유래의 연속하는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 WT1 펩티드이며, MHC 클래스 II 분자와 결합하여 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드 및 이것들을 포함하는 의약 조성물 등에 관한 것이다.

Description

암 항원 헬퍼 펩티드 {CANCER ANTIGEN HELPER PEPTIDE}
본 발명은 WT1 헬퍼 펩티드, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩티드에 의해 유도되는 WT1 특이적 헬퍼 T 세포 및 이것들을 포함하는 암 치료/예방용 의약 조성물 등에 관한 것이다. 또한, 본원은 2009년 4월 23일에 출원된 일본 특허 출원 제2009-105286호에 대하여 우선권을 주장하는 것이며, 일본 특허 출원 제2009-105286호의 전체 내용을 본원에 인용하는 것이다.
WT1 유전자(Wilms' tumor 1 gene; 윌름 종양 1 유전자)는 소아의 신장암인 윌름 종양의 책임 유전자로서 동정된 유전자이며(비특허문헌 1 및 2), 징크 핑거 구조를 갖는 전사 인자이다. 당초, WT1 유전자는 암 억제 유전자인 것으로 여겨졌지만, 그 후의 연구(비특허문헌 3 내지 6)에 의해 조혈기 종양이나 고형암에 있어서는 오히려 암 유전자로서 기능하는 것이 시사되었다.
WT1 유전자가 많은 악성 종양에서 고발현하고 있기 때문에, 변이가 없는 자기 단백질인 WT1 유전자 산물의 생체 내에서의 면역원성의 유무가 검증되어 왔다. 그 결과, 종양 세포에서 고발현하고 있는 WT1 유전자 유래의 단백질은 세포내 프로세싱에 의해 단편화되고, 생성된 펩티드가 MHC 클래스 I 분자와 복합체를 형성하여 세포 표면에 제시되는 것 및 이러한 복합체를 인식하는 세포 상해성 T 세포(이하, CTL이라고도 함)가 WT1 펩티드 예방 접종에 의해 유도될 수 있는 것이 밝혀졌다(비특허문헌 7 내지 9). 또한, WT1 펩티드 또는 WT1 cDNA에 의해 면역된 마우스는 이식된 WT1 유전자 발현 종양 세포를 높은 확률로 거절하지만(비특허문헌 7 및 10), WT1 유전자를 내재적으로 발현하고 있는 정상 조직은 유도된 CTL에 의해 상해받지 않는 것도 시사되었다(비특허문헌 7). 이제까지 마우스뿐만 아니라 인간에 있어서도 WT1 특이적 CTL의 유도가 가능하고, 이러한 CTL이 WT1 유전자를 고발현하는 종양 세포에 대해서는 상해 활성을 갖지만, WT1 유전자를 내재적으로 발현하는 정상 세포에는 상해 활성을 갖지 않을 가능성이 강하게 시사되었다(비특허문헌 7, 10 내지 14).
한편, CTL이 효율적으로 유도되기 위해서는 암 항원에 특이적인 헬퍼 T 세포의 존재가 중요하다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 15). 헬퍼 T 세포(CD4 양성 T 세포)는 항원 제시 세포의 MHC 클래스 II 분자와 항원 펩티드의 복합체를 인식하여 유도, 증식 및 활성화된다. 활성화된 헬퍼 T 세포는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, 또는 인터페론(IFN)과 같은 사이토카인을 생산하여 B 세포 및 그 밖의 T 세포의 서브세트의 증식, 분화 및 성숙을 촉진한다. 이것으로부터 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 항원 펩티드는, 헬퍼 T 세포의 유도를 통하여 CTL 등을 효율적으로 활성화하여 면역 기능을 증진한다고 생각되었다(비특허문헌 16). 이제까지 WT1에 관해서는 MHC 클래스 II 분자의 HLA-DRB1*0401 및 HLA-DRB1*0405에 결합하는 항원 펩티드(비특허문헌 17 및 특허문헌 1)만이 보고되어 있어, 그 밖의 서브타입에 대한 항원 펩티드를 발견할 필요가 있었다.
국제 공개 제2005/045027호 공보
Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29; 61(7): 1257-69. Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9; 60(3): 509-20. Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181: 151-212. Review. Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1; 87(7): 2878-84. Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15; 91(8): 2969-76. Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May; 23(5): 499-505. Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15; 164(4): 1873-80. Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995 Jun; 145: 167-77. Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb; 12(2): 237-8. Tsuboi A et al., J Clin Immunol. 2000 May; 20(3): 195-202. Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb; 51(2): 99-107. Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1): 286-93. Gao L et al., Blood. 2000 Apr 1; 95(7): 2198-203. Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1): 286-93. Cancer. Res. 62: 6438, 2002. J. Immunol. Immunother., 24: 195, 2001. Cancer. Immunol. Immunother. 51: 271, 2002
따라서, 본 발명의 해결 과제는 광범위한 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩티드에 의해 유도되는 WT1 헬퍼 T 세포 및 이것들을 포함하는 암 치료/예방용 의약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 행하였다. 그리고, 본 발명자들은 WT1 단백질을 코딩하는 연속하는 아미노산 서열의 일부를 갖는 펩티드가 암 항원 헬퍼 펩티드로서 기능하는 것, 즉 항원 제시 세포 상에서 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 제시되어, WT1 특이적인 헬퍼 T 세포를 유도하는 것을 발견하고, 이것들을 암의 치료/예방용 의약 조성물로서 이용하는 것이 가능한 것을 나타내었다.
즉, 본 발명은
(1) WT1 단백질 유래의 연속하는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이며, 상기 아미노산 서열이
(a) 서열 번호 3에 나타내는 아미노산 서열;
(b) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열;
(c) 서열 번호 5에 나타내는 아미노산 서열; 및
(d) (a) 내지 (c)에 나타내는 아미노산 서열에서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 또는 결실 또는 부가된 아미노산 서열
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩티드이고, MHC 클래스 II 분자와 결합하여 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드,
(2) 아미노산 서열이 서열 번호 3에 나타내는 아미노산 서열인, (1)에 기재된 펩티드,
(3) MHC 클래스 II 분자가 DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*0802, DRB1*0803, DRB1*0901, DRB1*1201, DRB1*1403, DRB1*1501, DRB1*1502, DPB1*0201, DPB1*0202, DPB1*0402, DPB1*0501, DPB1*0901, DQB1*0301, DQB1*0302, DQB1*0401, DQB1*0501, DQB1*0601, DQB1*0602 및 DRB5*0102로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, (1) 또는 (2)에 기재된 펩티드,
(4) MHC 클래스 II 분자가 DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*1502, DPB1*0201, DPB1*0202 및 DQB1*0601로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, (1) 또는 (2)에 기재된 펩티드,
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
(6) (5)에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터,
(7) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, 또는 (5)에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대한 항체,
(8) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, (5)에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 (6)에 기재된 벡터를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물,
(9) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, (5)에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 (6)에 기재된 벡터의 유효량을, (3) 또는 (4)에 기재된 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에 투여하는 것을 특징으로 하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법,
(10) 암을 치료 또는 예방하기 위한, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, (5)에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 (6)에 기재된 벡터의 용도,
(11) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 (3) 또는 (4)에 기재된 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는, 항원 제시 세포,
(12) 미숙 항원 제시 세포를 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드의 존재 하에서 배양하여, 상기 미숙 항원 제시 세포로부터 상기 펩티드를 (3) 또는 (4)에 기재된 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, 항원 제시 세포의 유도 방법,
(13) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 의해 유도되는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포,
(14) 말초혈 단핵구를 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드의 존재 하에서 배양하여, 상기 말초혈 단핵구로부터 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 유도 방법,
(15) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 필수 구성 성분으로서 포함하는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하기 위한 키트,
(16) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, (5)에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 (6)에 기재된 벡터를 필수 구성 성분으로서 포함하는, 암을 예방 또는 치료하기 위한 키트,
(17) (3) 또는 (4)에 기재된 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에서의 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 결정하는 방법이며,
(a) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 상기 대상 유래 시료와 반응시키고; 이어서
(b) 상기 시료에 포함되는 사이토카인의 존재 또는 양을 조사하는 공정을 포함하는 방법
을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*0802, DRB1*0803, DRB1*0901, DRB1*1201, DRB1*1403, DRB1*1501, DRB1*1502, DPB1*0201, DPB1*0202, DPB1*0402, DPB1*0501, DPB1*0901, DQB1*0301, DQB1*0302, DQB1*0401, DQB1*0501, DQB1*0601, DQB1*0602 및 DRB5*0102와 같은 다종류의 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 WT1 헬퍼 펩티드 및 이것들을 포함하는 암의 치료/예방용 의약 조성물 등이 얻어지므로, 매우 광범위한 대상(특히, 일본인의 대부분이 상기 분자를 가짐)에 있어서의 생체 내 및 시험관 내에서의 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 유도가 가능하게 된다. 또한, 본 발명에 의해 WT1 특이적 헬퍼 T 세포가 유도되기 때문에, WT1을 고도로 발현하는 암에서 T 세포나 B 세포를 효과적으로 활성화할 수 있다.
도 1은 3종 펩티드(mWT135, mWT186 및 mWT1294)를 펄스하여 제조한 각 펩티드 특이적 T 세포주를 각 펩티드에 의해 자극한 후에 세포 증식을 측정한 결과를 나타낸다. 도면 중, -는 펩티드 자극 없음을 나타낸다.
도 2는 3종 펩티드(mWT135, mWT186 및 mWT1294)를 펄스하여 제조한 각 펩티드 특이적 T 세포주를 항 MHC 클래스 I 또는 II 항체의 존재 하에서 각각의 대응하는 펩티드에 의해 자극한 후에 세포 증식을 측정한 결과를 나타낸다. 도면 중, -는 펩티드 자극 없음을 나타낸다. 종축의 cpm은 1분당 카운트를 나타낸다.
도 3은 C1498 세포, 3종 펩티드(mWT135, mWT186 및 mWT1294)를 펄스한 C1498 세포 및 WT1 단백질을 강제 발현시킨 C1498 세포에 의한, 각각의 대응하는 WT1 펩티드 특이적 T 세포주의 세포 증식을 측정한 결과를 나타낸다. 종축의 cpm은 1분당 카운트를 나타낸다.
도 4는 3종 펩티드(mWT135, mWT186 및 mWT1294)를 펄스하여 제조한 각 펩티드 특이적 T 세포주에서의 IFN-γ 생산능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 3종 펩티드(mWT135, mWT186 및 mWT1294)의 CTL 세포 상해 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 흑색 동그라미는 WT1126 펩티드(MHC 클래스 I 구속성 펩티드)를 펄스한 RMAS 세포를 이용하여 행한 실험의 결과를 나타낸다. 백색 동그라미는 컨트롤 RMAS 세포를 이용하여 행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 6은 종양 이식 실험에 있어서, 종양 이식과 면역을 행한 시계열적인 개략도를 도시한다. 마우스에의 WT1 발현 백혈병 세포의 피하 이식 후 7, 14, 21일째에 mWT135 헬퍼 펩티드에 의한 면역을 실시하고, 29일째에 해부를 행하였다. 하향의 백색 화살표는 컨트롤(PBS)을 피내 투여(IFA/30㎕)한 시기를 나타낸다. 하향의 흑색 화살표는 mWT135 헬퍼 펩티드를 피내 투여(50μM/IFA/30㎕)한 시기를 나타낸다.
도 7은 mWT135 헬퍼 펩티드에 의해 면역된 마우스에서의 종양의 크기 및 무병이었던 마우스의 개체수의 비율을 나타낸다. mWT135 헬퍼 펩티드에 의해 면역된 마우스에서는 10마리 중 4마리가 무병이었다. 한편, 컨트롤에 의해 면역된 마우스에서는 무병인 마우스가 9마리 중 존재하지 않았다.
도 8은 mWT135 헬퍼 펩티드에 의해 면역된 마우스에서의 무병 생존율을 나타낸다.
도 9는 mWT135 헬퍼 펩티드에 의해 면역된 마우스에서의 CTL의 세포 상해 활성을 나타낸다. 흑색 동그라미는 mWT1126 펩티드(MHCI 펩티드)를 펄스한 RMAS 세포를 이용하여 행한 실험의 결과이다. 백색 동그라미는 컨트롤 RMAS 세포를 이용하여 행한 실험의 결과를 나타낸다. () 안의 숫자는 종양 직경 mm를 나타낸다.
도 10은 컨트롤 마우스에서의 mWT1 특이적 CTL의 세포 상해 활성을 나타낸다. 흑색 동그라미는 mWT1126 펩티드(MHCI 펩티드)를 펄스한 RMAS 세포를 이용하여 행한 실험의 결과이다. 백색 동그라미는 컨트롤 RMAS 세포를 이용하여 행한 실험의 결과를 나타낸다. ( ) 안의 숫자는 종양 직경 mm를 나타낸다.
도 11은 mWT135 펩티드의 투여에 의한 mWT1126 펩티드 특이적 CTL의 세포 상해 활성(좌측 도면) 및 WT1126 4량체 양성 T 세포의 비율(우측 도면)을 나타낸다.
도 12는 각 MHC 클래스 II 분자를 갖는 건강한 사람의 말초혈 단핵구에서의 WT135 펩티드 자극에 의한 세포 증식의 측정 결과를 나타낸다.
도 13은 Responder(DRB1*0101/0405, DPB1*0201/0402, DQB1*0401/0501 양성의 건강한 사람(건강한 사람 A) 유래의 PBMC)를, Stimulator(DRB1*0405/0901, DPB1*0201/0501, DQB1*0303/0401 양성의 건강한 사람(건강한 사람 B) 유래의 PBMC)에 의해 처리한 경우에 있어서의 세포 증식의 측정 결과를 나타낸다. 종축은 도입된 3H-티미딘량(cpm)을 나타낸다. 횡축은 첨가한 각종 항체의 종류(첨가없음, 항 HLA-DR 항체, 항 HLA-DP 항체 및 항 HLA-DQ 항체)를 나타낸다.
도 14는 Responder(DRB1*0101/0405, DPB1*0201/0402, DQB1*0401/0501 양성의 건강한 사람(건강한 사람 A) 유래의 PBMC)를, Stimulator(DRB1*0405/0803, DPB1*0202/0501, DQB1*0401/0601 양성의 건강한 사람(건강한 사람 G) 유래의 PBMC)에 의해 처리한 경우에 있어서의 세포 증식의 측정 결과를 나타낸다. 종축은 도입된 3H-티미딘량(cpm)을 나타낸다. 횡축은 첨가한 각종 항체의 종류(첨가없음, 항 HLA-DR 항체, 항 HLA-DP 항체 및 항 HLA-DQ 항체)를 나타낸다.
도 15는 Responder(DRB1*0101/0405, DPB1*0201/0402, DQB1*0401/0501을 갖는 건강한 사람(건강한 사람 A) 유래의 PBMC)를, Stimulator(DRB1*0101/0803, DPB1*0501/-, DQB1*0501/0601 양성의 건강한 사람(건강한 사람 H) 유래의 PBMC)에 의해 처리한 경우에 있어서의 세포 증식의 측정 결과를 나타낸다. 종축은 도입된 3H-티미딘량(cpm)을 나타낸다. 횡축은 첨가한 각종 항체의 종류(첨가없음, 항 HLA-DR 항체, 항 HLA-DP 항체 및 항 HLA-DQ 항체)를 나타낸다.
도 16은 Responder(DRB1*0405/0803, DPB1*0202/0501, DQB1*0401/0601 양성의 건강한 사람(건강한 사람 G) 유래의 PBMC)를, Stimulator(DQB1*0601 유전자를 도입한 L 세포)에 의해 처리한 경우에 있어서의 IFN-γ 생산능의 측정 결과를 나타낸다. 종축은 T 세포 중의 IFN-γ량의 비율을 나타낸다. 횡축은 WT135 펩티드에 의한 펄스의 유무(+ 또는 -)를 나타낸다.
도 17은 Responder(DRB1*1502/1502, DPB1*0201/0901, DQB1*0601/0601 양성의 건강한 사람(건강한 사람 D) 유래의 PBMC)를, Stimulator(Responder와 동일한 건강한 사람 유래의 PBMC)에 의해 처리한 경우에 있어서의 세포 증식의 측정 결과를 나타낸다. 종축은 도입된 3H-티미딘량(cpm)을 나타낸다. 횡축은 첨가한 각종 항체의 종류(첨가없음, 항 HLA-DR 항체, 항 HLA-DP 항체 및 항 HLA-DQ 항체)를 나타낸다.
도 18은 Responder(DRB1*0101/1501, DPB1*0201/0402, DQB1*0501/0602 양성의 건강한 사람(건강한 사람 I) 유래의 PBMC)를, Stimulator(Responder와 동일한 건강한 사람 유래의 PBMC)에 의해 처리한 경우에 있어서의 IFN-γ 생산능의 측정 결과를 나타낸다. 종축은 T 세포 중의 IFN-γ량의 비율을 나타낸다. 횡축은 WT135 펩티드에 의한 펄스의 유무(+ 또는 -)를 나타낸다.
본 발명은 하나의 양태에 있어서, 마우스 또는 인간 WT1 단백질 유래의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 관한 것이다. WT1 유전자는, 예를 들면 백혈병, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 림프종 등의 조혈기 종양, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등의 고형암에서 고도로 발현된다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 WT1 유전자를 발현하는 암의 세포에 많이 존재한다.
본 발명의 펩티드는 서열 번호 2에 나타내는 인간 WT1 단백질 유래의 연속하는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이며, 이하에 나타내는 MHC 클래스 II 분자와의 결합능을 유지하고, WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 유도능을 갖는 펩티드이다. 본 발명의 펩티드는 상기 특징을 갖는 한, 그 아미노산 서열 및 길이는 특별히 한정되지 않지만, 펩티드가 지나치게 길면 단백 분해 효소의 작용을 받기 쉬워지고, 지나치게 짧으면 펩티드 수용홈에 잘 결합할 수 없다. 본 발명의 펩티드의 길이는 바람직하게는 10 내지 25 아미노산, 보다 바람직하게는 15 내지 21 아미노산, 더욱 바람직하게는 16 내지 20 아미노산, 예를 들면 17 아미노산, 18 아미노산 또는 19 아미노산이다. 본 발명의 펩티드의 구체예는 서열 번호 3에 나타내는 아미노산 서열; 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열; 서열 번호 5에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 또한, 본 발명의 펩티드는 상기 펩티드의 변이체도 포함한다. 변이체는, 예를 들면 상기 중 하나의 아미노산 서열에서 수개, 예를 들면 1 내지 9개까지, 바람직하게는 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환, 또는 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함할 수도 있다. 펩티드 중의 아미노산의 치환은 어느 위치에서 어느 종류의 아미노산과의 사이에서 행해질 수도 있다. 보존적인 아미노산 치환이 바람직하다. 예를 들면, Glu 잔기를 Asp 잔기로, Phe 잔기를 Tyr 잔기로, Leu 잔기를 Ile 잔기로, Ala 잔기를 Ser 잔기로, His 잔기를 Arg 잔기로 치환할 수도 있다. 아미노산의 부가 또는 결실은 펩티드 중의 N 말단 및 C 말단에서 행하는 것이 바람직하지만, 서열 내부에서 행해질 수도 있다. 본 발명의 펩티드의 바람직한 구체예는 서열 번호 3을 갖는다. 단, 상기 중 어느 펩티드라도 MHC 클래스 II 분자와의 결합능을 유지하고, WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 유도능을 갖는 것이 조건으로 된다. 여기서, 본 발명의 펩티드가 결합하는 MHC 클래스 II 분자는 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP 중 어느 서브 클래스에 속하는 것이어도 된다. 바람직하게는 DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*0802, DRB1*0803, DRB1*0901, DRB1*1201, DRB1*1403, DRB1*1501, DRB1*1502, DPB1*0201, DPB1*0202, DPB1*0402, DPB1*0501, DPB1*0901, DQB1*0301, DQB1*0302, DQB1*0401, DQB1*0501, DQB1*0601, DQB1*0602 및 DRB5*0102로 이루어지는 군으로부터 선택되는 분자이다. 보다 바람직하게는 DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*1403, DRB1*1502, DPB1*0201, DPB1*0202, DPB1*0901, DQB1*0301, DQB1*0601 또는 DRB5*0102이고, 가장 바람직하게는 DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*1502, DPB1*0201, DPB1*0202 또는 DQB1*0601이다. 본 명세서에서는 MHC 클래스 II 분자와의 결합능을 유지하고, WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 유도능을 갖는 펩티드를 WT1 헬퍼 펩티드라고 한다. 또한, 하기의 실시예에서는 서열 번호 3에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 WT135 펩티드, WT135 헬퍼 펩티드 또는 WT135 펩티드라고도 한다.
본 발명의 펩티드는 또한 서열 번호 1에 나타내는 마우스 WT1 단백질 유래의 연속하는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이며, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열의 제9 위치의 아미노산 잔기가 류신으로 치환된 펩티드(서열 번호 6); 또는 서열 번호 5에 나타내는 아미노산 서열의 제11 위치의 아미노산 잔기가 세린으로 치환된 펩티드(서열 번호 7)일 수도 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7에 나타내는 아미노산 서열에서 수개, 예를 들면 1 내지 9개까지, 바람직하게는 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환, 또는 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩티드를 포함할 수도 있다. 하기의 실시예에서는 서열 번호 6에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 mWT186 펩티드 또는 mWT186 헬퍼 펩티드라고도 하며, 서열 번호 7에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 mWT1294 펩티드 또는 mWT1294 헬퍼 펩티드라고도 한다.
본 발명의 펩티드는 WT1 단백질 유래이며, 상기의 연속하는 아미노산 서열로 이루어질 수도 있고, 이것들을 포함하는 것일 수도 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는, 예를 들면 상기 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 그 자체일 수도 있고, 또는 상기 아미노산 서열을 포함하는 WT1 단백질 또는 그의 일부일 수도 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 상기 아미노산 서열의 수식체일 수도 있다. 상기 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기를 공지된 방법으로 수식할 수 있다. 그러한 수식체는, 예를 들면 펩티드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄 중의 관능기에 에스테르화, 알킬화, 할로겐화, 인산화, 술폰화, 아미드화 등을 실시한 것일 수도 있다. 또한, 상기 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단에 여러가지 물질을 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 아미노산, 펩티드, 그들의 아날로그 등을 결합시킬 수도 있다. 본 발명의 펩티드에 이들 물질이 결합하고 있는 경우, 이들 물질이 예를 들면 생체 내 효소 등에 의해, 또는 세포내 프로세싱 등의 과정에 의해 처리되고, 최종적으로 상기 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 생성하는 것일 수도 있으며, MHC 클래스 II 분자와의 복합체로서 세포 표면에 제시됨으로써 헬퍼 T 세포 유도 효과를 얻을 수 있다. 이들 물질은 본 발명의 펩티드의 용해성을 조절하는 것일 수도 있고, 내프로테아제 작용 등 그 안정성을 향상시키는 것일 수도 있고, 또한 예를 들면 소정의 조직ㆍ기관에 특이적으로 본 발명의 펩티드를 운반하는 것과 같은 것일 수도 있고, 또는 항원 제시 세포의 도입 효율을 증강시키는 작용 등을 갖는 것일 수도 있다. 이들 물질은 또한 CTL 유도능을 증대시키는 것, 예를 들면 본 발명의 펩티드 이외의 헬퍼 펩티드일 수도 있다.
본 발명의 펩티드의 수식체는, 그의 N 말단 아미노산의 아미노기, 또는 C 말단 아미노산의 카르복실기가 수식된 것일 수도 있다. N 말단 아미노산의 아미노기의 수식기로서는, 예를 들면 1 내지 3개의 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 페닐기, 시클로알킬기, 아실기를 들 수 있고, 아실기의 구체예로서는 탄소수 1 내지 6의 알카노일기, 페닐기에 의해 치환된 탄소수 1 내지 6의 알카노일기, 탄소수 5 내지 7의 시클로알킬기에 의해 치환된 카르보닐기, 탄소수 1 내지 6의 알킬술포닐기, 페닐술포닐기, 탄소수 2 내지 6의 알콕시카르보닐기, 페닐기에 의해 치환된 알콕시카르보닐기, 탄소수 5 내지 7의 시클로알콕시에 의해 치환된 카르보닐기, 페녹시카르보닐기 등을 들 수 있다. C 말단 아미노산의 카르복실기를 수식한 펩티드로서는, 예를 들면 에스테르체 및 아미드체를 들 수 있고, 에스테르체의 구체예로서는 탄소수 1 내지 6의 알킬에스테르, 페닐기에 의해 치환된 탄소수 0 내지 6의 알킬에스테르, 탄소수 5 내지 7의 시클로알킬에스테르 등을 들 수 있고, 아미드체의 구체예로서는 아미드, 탄소수 1 내지 6의 알킬기의 1개 또는 2개에 의해 치환된 아미드, 페닐기에 의해 치환된 탄소수 0 내지 6의 알킬기의 1개 또는 2개에 의해 치환된 아미드, 아미드기의 질소 원자를 포함하여 5 내지 7원환의 아자시클로알칸을 형성하는 아미드 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드의 수식체는 탄소-탄소 결합, 탄소-질소 결합, 탄소-황 결합 등의 펩티드 결합 이외의 결합에 의해 아미노산 잔기가 결합한 것일 수도 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 1 또는 그 이상의 D-체 아미노산을 포함하고 있을 수도 있다.
본 발명의 펩티드 및 상기에서 설명한 본 발명의 변이체 및 수식체는 예시이며, 당업자라면 용이하게 그 변화를 상정하여 제조하고 효과를 조사하여 사용할 수 있다.
본 발명의 펩티드는, 당해 기술 분야에서 통상 이용되는 방법 또는 그들의 변법을 이용하여 합성할 수 있다. 이러한 합성 방법은, 예를 들면 문헌 [Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩티드 합성, 마루젠(주), 1975; 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주), 1985; 의약품의 개발 속 제14권ㆍ펩티드 합성, 히로까와 서점, 1991] 등에 기재되어 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여 유전자 공학적 수법을 이용하여 제조할 수도 있다. 이러한 유전자 공학적 수법은 당업자에게 주지의 것이다. 이들 수법은 전술한 바와 같이 문헌에 기재된 방법(Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory(1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS(1985))이나 후술하는 방법 등에 준하여 행할 수 있다.
본 발명의 펩티드 또는 그의 후보 펩티드가 상기 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 헬퍼 T 세포를 유도하는 것은, 예를 들면 문헌 [Cancer Immunol. Immunother. 51: 271(2002)]에 기재된 방법 등의 공지된 방법이나, 본 명세서의 실시예에 기재된 방법 등에 의해 조사할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 헬퍼 T 세포(CD4 양성 T 세포)를 활성화하기 때문에, CTL의 분화의 유도나 유지 및 마크로파지 등의 이펙터 세포의 활성화 작용을 발휘하므로, 본 발명의 펩티드는 효율적인 암의 치료 또는 예방에 사용 가능하다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 헬퍼 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(이하, WT1 폴리뉴클레오티드라고도 함)에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA일 수도 있고, RNA일 수도 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은, 상기 WT1 헬퍼 펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 결정할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 DNA 또는 RNA 합성 방법, PCR법 등에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에는, 해당 폴리뉴클레오티드의 상보 서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이며 본 발명의 펩티드와 동등한 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 여기서 「엄격한 조건 하에서 혼성화한다」에 관하여, 여기서 사용되는 혼성화는, 예를 들면 문헌 [Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T. 저서, 분자 클로닝 제2판(Molecular Cloning 2nd edition), 콜드 스프링 하버 라보라토리 발행(Cold Spring Harbor Laboratory press)] 등에 기재되는 통상의 방법에 준하여 행할 수 있다. 또한, 「엄격한 조건 하」란, 예를 들면 6×SSC(1.5M NaCl, 0.15M 시트르산 삼나트륨을 포함하는 용액을 10×SSC로 함), 50% 포름아미드를 포함하는 용액 중에 45℃에서 혼성을 형성시킨 후, 2×SSC에 의해 50℃에서 세정하는 조건(Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6) 등을 들 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터(이하, WT1 발현 벡터라고도 함)에 관한 것이다. 발현 벡터의 종류, 상기 폴리뉴클레오티드 서열 이외에 포함되는 서열 등은, 해당 발현 벡터를 도입하는 숙주의 종류, 목적 등에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 예를 들면, 숙주가 대장균인 경우, 벡터로서는 pUC118, pUC119, pBR322, pCR3 등의 플라스미드 벡터, λZAPII, λgt11 등의 파지 벡터를 들 수 있다. 숙주가 효모인 경우, 벡터로서는 pYES2, pYEUra3 등을 들 수 있다. 숙주가 곤충 세포인 경우에는 pAcSGHisNT-A 등을 들 수 있다. 숙주가 동물 세포인 경우에는 pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV, pRc/CMV 등의 플라스미드 벡터나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 들 수 있다. 상기 벡터는 발현 유도 가능한 프로모터, 시그널 서열을 코딩하는 유전자, 선택용 마커 유전자, 터미네이터 등의 인자를 적절하게 가질 수도 있다. 또한, 단리 정제가 용이해지도록 티오레독신, His 태그, 또는 GST(글루타티온 S-트랜스페라아제) 등과의 융합 단백질로서 발현하는 서열이 부가되어 있을 수도 있다. 이 경우, 숙주 세포내에서 기능하는 적절한 프로모터(lac, tac, trc, trp, CMV, SV40 초기 프로모터 등)를 갖는 GST 융합 단백질 벡터(pGEX4T 등)나, Myc, His 등의 태그 서열을 갖는 벡터(pcDNA3.1/Myc-His 등), 또한 티오레독신 및 His 태그와의 융합 단백질을 발현하는 벡터(pET32a) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터를 대상에 투여하고, 생체 내에서 WT1 헬퍼 펩티드를 생산시키고, 그에 의해 유도된 WT1 특이적 헬퍼 T 세포는 각종 사이토카인(예를 들면, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 또는 인터페론(IFN) 등)을 생산하여 B 세포 및 그 밖의 T 세포의 증식, 분화, 성숙을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 WT1 발현 벡터를 이용하여 MHC 클래스 I 분자를 갖고, 또한 WT1 고발현인 종양 세포를 특이적으로 상해할 수 있다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 헬퍼 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 항체(이하, WT1 항체라고도 함)에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 된다. 이들 항체의 제조 방법은 이미 주지이며, 본 발명의 항체도 이들 통상법에 따라 제조할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12 내지 11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. 등 편, Cold Spring Harber Laboratory Press 출판 New York 1989).
본 발명은 상기 WT1 헬퍼 펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드 또는 WT1 발현 벡터를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물에 관한 것이다. WT1 유전자는, 예를 들면 백혈병, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 림프종 등의 조혈기 종양, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등의 고형암에서 고도로 발현되기 때문에, 본 발명의 의약 조성물을 WT1 유전자를 발현하고 있는 암의 치료 또는 예방을 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물이 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에 투여되면, 상기 의약 조성물에 포함되는 WT1 헬퍼 펩티드에 의해 유도된 WT1 특이적 헬퍼 T 세포는, 각종 사이토카인(예를 들면, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 또는 인터페론(IFN) 등)을 생산하고, B 세포 및 그 밖의 T 세포의 서브세트의 증식, 분화, 성숙을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 펩티드를 이용하여 MHC 클래스 I 분자를 갖고, 또한 WT1 고발현인 종양 세포를 특이적으로 상해할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 유효 성분으로서의 상기 WT1 헬퍼 펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드 또는 WT1 발현 벡터 이외에, 예를 들면 담체, 부형제 등을 포함할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 WT1 헬퍼 펩티드는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하기 때문에, 그 유도 효율을 증강시키기 위하여 본 발명의 의약 조성물은 적당한 아쥬반트를 포함하거나, 또는 적당한 아쥬반트와 함께 투여될 수도 있다. 바람직한 아쥬반트로서는, 예를 들면 완전 또는 불완전 프로인트 아쥬반트, 수산화알루미늄 등을 들 수 있지만 이것들에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 유효 성분으로서 상기 WT1 헬퍼 펩티드 이외의 공지된 암 항원 펩티드, 예를 들면 WT1 특이적 CTL을 유도하는 WT1126 펩티드 등을 함께 포함할 수도 있다(Oka et al, Cancer immunotherapy targeting Wilms' tumor gene WT1 product. Journal of Immunology, 164: 1873-1880, 2000 및 Oka et al. Human cytotoxic T-lymphocyte responses specific for peptides of the wild-type Wilms' tumor gene(WT1) product. Immunogenetics, 51: 99-107, 2000).
본 발명의 의약 조성물은 또한 공지된 암 항원 펩티드와 조합하여 투여될 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 의약 조성물을 투여하기 전 또는 후에, 공지된 암 항원 펩티드, 예를 들면 WT1126 펩티드를 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도함으로써 B 세포나 그 밖의 T 세포를 활성화한다고 하는 특징을 갖기 때문에, 공지된 암 항원 펩티드를 투여함으로써 유도된 CTL의 활성을 보다 증강하여 치료 효과를 현저하게 상승시키는 것이 가능하다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 방법은 질환의 종류, 대상의 상태, 표적 부위 등의 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 투여 방법은, 예를 들면 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 경비 투여, 경구 투여 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 또한, 상기 투여 방법은 림프구 요법 또는 DC(수상 세포) 요법일 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 펩티드의 양, 의약 조성물의 제형, 투여 횟수 등은 질환의 종류, 대상의 상태, 표적 부위 등의 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있지만, 1회당의 펩티드 투여량은 통상 0.0001mg 내지 1000mg, 바람직하게는 0.001mg 내지 10000mg이다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, 유효량의 상기 의약 조성물을 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에 투여하는 것을 특징으로 하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 치료 또는 예방되는 암은 WT1 유전자를 발현하는 것이면 어느 것이어도 되며, 예를 들면 백혈병, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 림프종 등의 조혈기 종양, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등의 고형암을 포함한다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, 암을 치료 또는 예방하기 위한, 상기 WT1 헬퍼 펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드 또는 WT1 발현 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물을 제조하기 위한 WT1 헬퍼 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 폴리뉴클레오티드 또는 WT1 발현 벡터를 포함하는 의약 조성물을 제조하기 위한 WT1 폴리뉴클레오티드 또는 WT1 발현 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 헬퍼 펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드 또는 WT1 발현 벡터를 함유하는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 세포는, 예를 들면 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등의 숙주 세포를 상기 발현 벡터를 이용하여 형질 전환시킴으로써 제조할 수 있다. 숙주 세포에의 발현 벡터의 도입 방법은 여러가지 방법을 적절하게 선택하여 이용할 수 있다. 형질 전환된 세포를 배양하고, 생산된 WT1 헬퍼 펩티드를 회수ㆍ정제함으로써 본 발명의 펩티드를 제조할 수도 있다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포(예를 들면, 수상 세포, B-림프구, 마크로파지 등)에 관한 것이다. 본 발명의 항원 제시 세포는 상기 WT1 헬퍼 펩티드에 의해 유도된다. 본 발명의 항원 제시 세포를 이용함으로써 WT1 특이적 헬퍼 T 세포가 효율적으로 유도된다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 미숙 항원 제시 세포를 WT1 헬퍼 펩티드의 존재 하에서 배양하여, 상기 미숙 항원 제시 세포로부터 WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, WT1 헬퍼 펩티드를 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포의 유도 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서의 미숙 항원 제시 세포는 성숙하여 항원 제시 세포, 예를 들면 수상 세포, B-림프구, 마크로파지 등으로 될 수 있는 세포를 말한다. 미숙 항원 제시 세포가 유래하는 대상은, 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 것이면 어느 것이어도 된다. 미숙 항원 제시 세포는, 예를 들면 말초혈 단핵구 등에 포함되어 있기 때문에, 이러한 세포를 상기 WT1 헬퍼 펩티드의 존재 하에서 배양할 수도 있다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포를, 상기 MHC 클래스 II 분자와 동일한 분자를 갖는 대상에 투여하는 것을 특징으로 하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 항원 제시 세포의 투여 방법은 질환의 종류, 대상의 상태, 표적 부위 등의 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 해당 방법은, 예를 들면 정맥내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 경비 투여, 경구 투여 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, 암을 예방 또는 치료하기 위한 방법이며,
(a) 시료와 WT1 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 2)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열을 갖는 핵산 또는 상기 WT1 헬퍼 펩티드를 반응시키고,
(b) 상기 시료 중에 포함되는 WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포를 얻고,
(c) 상기 항원 제시 세포를 상기 MHC 클래스 II 분자와 동일한 분자를 갖는 대상에 투여하는
공정을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서의 시료는 림프구 또는 수상 세포가 포함되어 있을 가능성이 있으면 어느 것이어도 되며, 예를 들면 혈액 등의 대상 유래 시료, 세포 배양액 등을 들 수 있다. 상기 방법에서의 반응은 일반적인 수법을 이용하여 행해질 수 있으며, 바람직하게는 전기 천공을 이용하여 행해진다. 항원 제시 세포의 취득은 당업자에게 기지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 각 공정에서의 시료 중의 세포의 배양 조건은 당업자가 적절하게 결정할 수 있다. 항원 제시 세포의 투여 방법은 전술한 것과 같을 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 헬퍼 펩티드에 의해 유도되는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포에 관한 것이다. 본 발명의 헬퍼 T 세포는 WT1 헬퍼 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체를 인식하여 유도, 증식 및 활성화된다. 활성화된 WT1 특이적 헬퍼 T 세포는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 또는 인터페론(IFN)과 같은 사이토카인을 생산하여, B 세포 및 그 밖의 T 세포의 서브세트의 증식, 분화, 성숙을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 헬퍼 T 세포를 이용하여 MHC 클래스 I 분자를 갖고, 또한 WT1 고발현인 종양 세포를 특이적으로 상해할 수 있다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, 말초혈 단핵구를 WT1 헬퍼 펩티드의 존재 하에서 배양하여, 상기 말초혈 단핵구로부터 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 유도 방법에 관한 것이다. 말초혈 단핵구가 유래하는 대상은, 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖고 있으면 어느 것이어도 된다. 말초혈 단핵구를 WT1 헬퍼 펩티드의 존재 하에서 배양함으로써, 말초혈 단핵구 중의 헬퍼 T 세포 전구 세포로부터 WT1 특이적 헬퍼 T 세포가 유도된다. 본 발명에 의해 얻어진 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에 투여함으로써 대상의 조혈기 종양, 고형암을 치료 또는 예방할 수 있다. 여기서, 본 명세서에서의 말초혈 단핵구에는 항원 제시 세포의 전구체인 미숙 항원 제시 세포(예를 들면, 수상 세포, B-림프구, 마크로파지 등의 전구체)가 포함되는 것으로 하고, 미숙 항원 제시 세포는 예를 들면 말초혈 단핵구 등에 포함되어 있기 때문에, 이러한 세포를 상기 WT1 헬퍼 펩티드의 존재 하에서 배양할 수도 있다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 헬퍼 펩티드를 필수 구성 성분으로서 포함하는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하기 위한 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 키트는 상기 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 유도 방법에 이용된다. 본 발명의 키트는 상기 WT1 헬퍼 펩티드 외에, 예를 들면 말초혈 단핵구의 취득 수단, 아쥬반트, 반응 용기 등을 포함하고 있을 수도 있다. 일반적으로는 키트에는 취급 설명서를 첨부한다. 본 발명의 키트를 이용하여 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 효율적으로 유도할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에 투여하는 것을 특징으로 하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 투여 방법은 질환의 종류, 대상의 상태, 표적 부위 등의 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 투여 방법은, 예를 들면 정맥내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 경비 투여, 경구 투여 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 WT1 헬퍼 펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드 또는 WT1 발현 벡터를 필수 구성 성분으로서 포함하는, 암을 예방 또는 치료하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 상기 WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는 키트이다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 필수 구성 성분 외에, 예를 들면 시료의 취득 수단, 반응 용기 등을 포함하고 있을 수도 있다. 일반적으로는 키트에는 취급 설명서를 첨부한다. 본 발명의 키트를 이용하여 WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포를 효율적으로 얻을 수 있고, 이 항원 제시 세포를 투여함으로써 암의 치료 또는 예방에 이용할 수 있다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에서의 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 결정하는 방법이며,
(a) 상기 WT1 헬퍼 펩티드와 상기 MHC 클래스 II 분자의 복합체를 상기 대상 유래 시료와 반응시키고; 이어서
(b) 상기 시료에 포함되는 상기 복합체를 인식하는 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 조사하는
공정을 포함하는 방법에 관한 것이다. 대상 유래 시료는 림프구가 포함되어 있을 가능성이 있으면 어느 것이어도 되며, 예를 들면 혈액, 림프액 등의 체액, 조직 등을 들 수 있다. WT1 헬퍼 T 세포와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는, 예를 들면 비오틴스트렙토아비딘법 등의 당업자에게 기지된 방법을 이용하여, 예를 들면 4량체, 5량체 등의 형태로 되어 있을 수도 있다. 이러한 복합체를 인식하는 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양은 당업자에게 기지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 이 양태에 있어서 상기 복합체는 표지된 것일 수도 있다. 표지로서는 형광 표지, 방사성 표지 등의 공지된 것을 사용할 수 있다. 표지함으로써 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양의 결정이 용이하면서 신속하게 된다. 본 발명의 이 양태의 방법을 이용하여 암의 진단, 예후 진단 등이 가능하게 된다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에서의 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 결정하기 위한 WT1 헬퍼 펩티드와 상기 MHC 클래스 II 분자의 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 WT1 헬퍼 펩티드와 상기 MHC 클래스 II 분자의 복합체를 포함하는, 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에서의 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에서의 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 결정하는 방법이며,
(a) 상기 WT1 헬퍼 펩티드를 상기 대상 유래 시료와 반응시키고; 이어서
(b) 상기 시료에 포함되는 사이토카인의 존재 또는 양을 조사하는
공정을 포함하는 방법에 관한 것이다. 대상 유래 시료는 림프구가 포함되어 있을 가능성이 있으면 어느 것이어도 되며, 예를 들면 말초혈 단핵구, 혈액, 체액, 조직 등을 들 수 있고, 바람직하게는 말초혈 단핵구이다. 상기 공정 (a)에서의 반응은 상기 WT1 헬퍼 펩티드를 상기 대상 유래 시료 중에서 일반적인 수법을 이용하여 행할 수 있다. 각 공정에서의 시료 중의 세포의 배양 조건은 당업자가 적절하게 결정할 수 있다. 시료에 포함되는 사이토카인의 존재 또는 양은 당업자에게 기지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 사이토카인은 인터페론 γ, 인터루킨 10 등의 헬퍼 T 세포에 의해 유도될 수 있는 것일 수도 있다. 본 발명의 이 양태에 있어서, 상기 사이토카인은 표지된 것일 수도 있다. 표지로서는 형광 표지, 방사성 표지 등의 공지된 것을 사용할 수 있다. 상기 사이토카인의 존재 또는 양을 지표로 함으로써, WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 용이하면서 신속하게 조사하는 것이 가능하게 된다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, WT1 헬퍼 펩티드와 상기 MHC 클래스 II 분자의 복합체를 이용하여 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 얻는 방법이며,
(a) 시료와 복합체를 반응시키고,
(b) 상기 시료 중에 포함되는 상기 복합체를 인식하는 헬퍼 T 세포를 얻는
공정을 포함하는 방법에 관한 것이다. WT1 헬퍼 펩티드와 상기 MHC 클래스 II 분자의 복합체에 대해서는 전술한 바와 같다. 시료는 림프구가 포함되어 있을 가능성이 있으면 어느 것이어도 되며, 예를 들면 혈액 등의 대상 유래 시료, 세포 배양액 등을 들 수 있다. 복합체를 인식하는 헬퍼 T 세포의 취득은, 예를 들면 FACS, MACS 등 당업자에게 기지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 얻어진 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 배양하여 여러가지의 암의 치료 또는 예방에 이용하는 것도 가능하게 된다.
따라서, 본 발명은 또한 WT1 헬퍼 펩티드와 상기 MHC 클래스 II 분자의 복합체를 이용하여 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 얻는 방법에 의해 얻을 수 있는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 WT1 헬퍼 펩티드와 상기 MHC 클래스 II 분자의 복합체를 포함하는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 얻기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 특이적 헬퍼 T 세포, WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포, 또는 상기 WT1 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 진단 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 WT1 특이적 헬퍼 T 세포가 본 발명의 진단 방법에 이용된다. 예를 들면, 상기 헬퍼 T 세포, 항원 제시 세포 또는 항체를 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상 유래의 시료와 인큐베이션하거나, 또는 상기 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에 투여하고, 다음에 상기 헬퍼 T 세포, 항원 제시 세포 또는 항체의 예를 들면 위치, 부위, 양 등을 결정함으로써 암의 진단이 가능하게 된다. 상기 헬퍼 T 세포, 항원 제시 세포 또는 항체는 표지된 것일 수도 있다. 이러한 표지를 붙임으로써 본 발명의 진단 방법을 효율적으로 실시할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 상기 WT1 특이적 헬퍼 T 세포, WT1 헬퍼 펩티드를 상기 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포, 또는 WT1 헬퍼 펩티드에 대한 항체 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 항체를 필수 구성 성분으로서 포함하는, 암의 진단용 키트에 관한 것이다.
이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적이면서 상세하게 설명하지만, 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 이해해서는 안된다.
<실시예 1>
MHC 클래스 II 분자에 결합하는 후보 WT1 펩티드의 선택
MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드 서열을 탐색하기 위하여, Rammensee 등에 의해 개시된 방법을 이용하였다(Rammensee et al, Immunogenetics 41: 178-228, 1995). 구체적으로는 표 중의 우단에 기재된 프로그램과 Rammensee 등의 법칙을 병용함으로써 선택하였다. 이 방법에 의해 WT135 펩티드에 관해서는 표 1 및 2, WT186에 관해서는 표 3 및 4, WT1294 펩티드에 관해서는 표 5 및 6에 나타내는 펩티드 서열까지 압축하였다. 표 1 내지 6 중, 좌단의 열은 후보 펩티드 서열로서의 「적성」을 나타내고, ○의 수가 많을수록 Rammensee 등의 법칙에 대하여 적성이 높은 것을 나타낸다. 무(無) 표시는 그다지 적성이 없는 것을 나타낸다. 또한, 표 1 내지 6의 「MHC 클래스 II 분자에 결합하는 후보 펩티드 서열」의 열에서의 [ ] 안은, 그 중에 열거된 아미노산군으로부터 1개의 아미노산을 선택할 수 있는 것을 나타낸다. 예를 들면, [FLM]으로 표기한 경우에는 아미노산 F, L, M 중 어느 1개의 아미노산인 것을 의미한다. 또한, [VYI(AL)]로 표기한 경우에는 아미노산 V, Y, I 중 어느 1개의 아미노산이거나, 또는 A, L 중 어느 1개의 아미노산이거나, 어느 한쪽을 의미한다. x는 어떠한 아미노산이어도 되는 것을 나타낸다. 우단의 열에는 후보 펩티드 서열을 열거하는 데 이용한 프로그램의 「프로그램명」을 기재한다.
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Figure pct00005
Figure pct00006
이어서, 표 1 내지 6 중에서 후보로 되는 WT1 펩티드를 육안으로 선택하고, 하기 표 7에 나타내는 펩티드를 MHC 클래스 II 분자의 바람직한 후보 펩티드로 동정하고, 하기와 같이 이들 펩티드에 대하여 실제의 기능을 해석하였다.
Figure pct00007
WT1 펩티드 특이적 세포주의 제조 및 세포 증식능의 측정
우선, 상기 WT1 펩티드를 불완전 프로인트 아쥬반트(몬타나이드 ISA51)에 의해 에멀전화하고, 100μg/마우스 상당량의 WT1 펩티드를 마우스의 피내에 접종하였다. 이 면역을 1주일마다 3회 행하고, 최종 면역의 1주일 후에 비장을 취출하여 비장세포를 제조하였다. 이 비장세포를 각 마우스의 면역에 이용한 것과 동일한 WT1 펩티드에 의해 펄스하고, 방사선 조사한 비면역 마우스의 비장세포를 stimulator로서 이용하여 10일 간격으로 3회 자극한 후, 4회째의 자극을 표 7에 기재된 각 펩티드(WT135, WT186 또는 WT1294 펩티드)에 의해 펄스하고, 방사선 조사한 비면역 마우스의 비장세포를 stimulator로서 이용하여 3H 도입 실험에 의해 각 stimulator에 대한 증식 반응을 측정하였다. 컨트롤 펩티드로서 WT1 펩티드와는 무관한 OVA(난백 알부민) 펩티드를 이용하였다. 그 결과, WT135 펩티드, WT186 펩티드 또는 WT1294 펩티드에 의해 면역된 마우스의 비장세포는 각각 WT135 펩티드, WT186 펩티드 또는 WT1294 펩티드를 펄스한 stimulator에 반응하여 증식하였다(도 1의 A 내지 C).
전술한 바와 같이, 각 WT1 펩티드를 펄스하고, 방사선 조사한 비면역 마우스의 비장세포를 이용하여 시험관 내에서 10일 간격으로 3회 자극한 후, 4회째의 자극을 전술한 각 펩티드에 의해 펄스하고, 방사선 조사한 비면역 마우스의 비장세포를 stimulator로서 이용하여 증식 반응을 측정할 때에, 배양액에 MHC 클래스 I 항체(Db 항체) 또는 MHC 클래스 II 항체(Ab 항체)를 첨가하여 3H의 도입을 측정하였다. 그 결과, WT135 펩티드, WT186 펩티드 및 WT1294 펩티드를 각각 펄스한 stimulator에 대한 증식 반응이 MHC 클래스 II 항체의 첨가에 의해 억제되었다(도 2의 A 내지 C).
전술한 바와 같이, 각 WT1 펩티드를 펄스하고, 방사선 조사한 비면역 마우스의 비장세포를 이용하여 시험관 내에서 10일 간격으로 3회 자극한 후, 방사선 조사한 WT1 단백질을 발현하지 않는 C1498 세포, 전술한 각 WT1 펩티드를 펄스한 C1498 세포, 또는 WT1 유전자를 도입하여 WT1 단백질을 발현하도록 한 C1498 세포를 stimulator로서 이용하여 증식 반응을 3H의 도입에 의해 측정하였다. 그 결과, 생체 내에서 면역된 WT1 펩티드와 동일한 WT1 펩티드에 의해 펄스한 C1498 세포 및 WT1 유전자가 도입되어 WT1 단백질을 발현하도록 된 C1498 세포에 대해서는 증식 반응을 일으켰다(도 3). 이것은 WT135 펩티드, WT186 펩티드 및 WT1294 펩티드가 내재성의 WT1 단백질의 세포내 프로세싱에 의해 생산되고, MHC 클래스 II 분자 상에 제시되는 것을 명확하게 하였다. 이상으로부터 이들 3종의 WT1 펩티드는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드인 것이 시사되었다.
IFNγ 생산능의 측정
전술한 바와 같이, 각 WT1 펩티드를 펄스하고, 방사선 조사한 비면역 마우스의 비장세포를 이용하여 시험관 내에서 10일 간격으로 3회 자극한 후, 배양 상청 중의 IFN-γ와 IL-4의 농도를 ELISA 키트(BIOSOURCE Immunoassay Kit, Invitrogen)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 2마리의 별개의 마우스의 비장세포는, 각 WT1 펩티드를 펄스하고, 방사선 조사한 비면역 마우스의 비장세포에 반응하여 인터페론 γ를 생산하였지만, 인터루킨 4를 거의 생산하지 않았다(도 4). 이것은 이들 3종류의 WT1 펩티드가 Th1 타입의 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하는 것을 명확하게 한다.
실시예 2
WT1 특이적 세포 상해성 T 세포(CTL)의 측정
WT1126 펩티드(MHC 클래스 I) 단독, WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)+WT135 펩티드(MHC 클래스 II), WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)+WT186 펩티드(MHC 클래스 II), 또는 WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)+WT1294 펩티드(MHC 클래스 II)에 의해 마우스를 3회 면역시킨 후, 마우스의 비장세포를 제조하였다. 다음에, 이 비장세포를 WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)를 이용하여 시험관 내에서 1회 자극 후 6일째에 WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)를 펄스한 RMAS 세포를 표적 세포로 이용하여 세포 상해 활성을 측정하였다. 컨트롤의 표적 세포로서는 WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)를 펄스하고 있지 않은 RMAS 세포를 이용하였다. 그 결과, WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)+WT1 헬퍼 펩티드(MHC 클래스 II)에 의해 면역된 마우스의 비장세포는, WT1126 펩티드(MHCI 클래스 I) 단독으로 면역시킨 마우스의 비장세포에 비하여 보다 강하게 WT1 특이적 세포 상해성 T 세포를 유도하였다(도 5). 이것은 3종류의 WT1 펩티드(MHC 클래스 II)가 WT1 특이적 헬퍼 펩티드인 것을 실증하였다.
실시예 3
종양 이식 실험
WT1 발현 C1498 백혈병 세포를 1마리의 마우스당 2.5×105개의 비율로 마우스의 피하에 이식하고, 그 1주일 후부터 매주 1회, 총 3회, WT135 헬퍼 펩티드 50μg/마우스를 프로인트 불완전 아쥬반트와 함께 피내 투여하였다(도 6). 컨트롤로서는 WT135 헬퍼 펩티드 대신에 생리 식염수를 프로인트 불완전 아쥬반트와 함께 피내 투여하였다. 계속적으로 피하의 종양 직경을 측정함과 함께, 피하 이식 후 29일까지의 무병 생존율을 산정하였다. 그 결과, 컨트롤군에서는 모든 마우스에서 종양이 확대되었지만, 한편 WT135 헬퍼 펩티드(MHC 클래스 II)의 면역군에서는 10마리 중 4마리에서 종양의 증식이 완전히 억제되었다(도 7). WT135 헬퍼 펩티드 면역군과 컨트롤군의 사이에 유의차(p<0.05)가 확인되었다(도 8). 이것은 WT135 헬퍼 펩티드(MHC 클래스 II)가 생체 내에서 종양 면역을 유도하는 능력을 갖는 WT1 펩티드인 것을 실증하였다.
다음에, 상기의 실험 개시 후 29일째의 마우스를 해부하여 비장을 적출하고, 비장세포를 이용하여 WT1 특이적 면역 응답을 해석하였다. 간단히 설명하면, WT135 헬퍼 펩티드(MHC 클래스 II) 면역군 및 컨트롤군의 마우스의 해부 시에 비장을 적출하여 비장세포를 제조하였다. 이 비장세포를 WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)에 의해 1회 자극하고, 그 6일 후에 WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)를 펄스한 RMAS 세포를 표적 세포로 하여 이 비장세포의 세포 상해 활성을 측정하였다. 컨트롤로서는 RMAS 세포를 표적 세포로 하여 이 비장세포의 세포 상해 활성을 측정하였다. 그 결과, WT135 헬퍼 펩티드(MHC 클래스 II) 면역군의 마우스는 4마리 모두 WT1 특이적 세포 상해성 T 세포가 유도되어 있었다(도 9). 한편, 컨트롤군의 마우스 3마리에서는 WT1 특이적 세포 상해성 T 세포가 매우 약하게 유도되어 있었다(도 10). 1마리에서는 WT1 특이적 세포 상해성 T 세포의 유도는 보이지 않았다. 명확히 WT135 헬퍼 펩티드(MHC 클래스 II) 면역군에 비하여 WT1 특이적 세포 상해성 T 세포의 유도가 낮았다(도 9 및 10). 이것은 WT135 클래스 II 헬퍼 펩티드의 투여에 의해 WT1 특이적 헬퍼 T 세포가 유도되고, 이 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 작용에 의해 이식한 종양 세포가 발현되는 WT1 단백질에 면역 응답하여 유도된 WT1 특이적 세포 상해성 T 세포가 생체 내에서 강하게 증폭한 것을 나타내고 있으며, 이 결과는 WT135 헬퍼 펩티드의 유용성을 실증하였다.
이어서, 상기의 WT135 헬퍼 펩티드(MHC 클래스 II) 면역군 및 컨트롤군의 마우스에서의 특이적 용해도에 대하여 해석하였다. 간단히 설명하면, 상기 실험에 의해 WT1126 펩티드(MHC 클래스 I)를 펄스한 RMAS 세포를 표적 세포로 하였을 때의 세포 용해율(%)로부터 RMAS 세포를 표적 세포로 하였을 때의 세포 용해율(%)을 뺀 세포 용해도(%)를 특이적 용해도(%)로 하였다(도 11의 좌측 도면). 또한, 상기에서 제조한 비장세포와, 형광 표지한 WT1 4량체(H-2Db WT1 Tetramer-RFMPNAPYL-PE)를 4℃에서 20분간 인큐베이션하여 세정한 후, 형광 표지한 CD3 항체, CD8 항체에 의해 염색하고, 재세정하여 FACS에 의해 해석하였다. CD3 양성, CD8 양성, WT1 4량체 양성 세포를 WT1 특이적 세포 상해성 T 세포로 하였다(도 11의 우측 도면). 그 결과, WT135 헬퍼 펩티드(MHC 클래스 II) 면역군의 마우스의 비장세포에서는, 컨트롤군의 마우스의 비장세포에 비하여 유의하게 높게(p<0.05) WT1 특이적 세포 상해성 T 세포가 유도되어 있었다(도 11).
실시예 4
인간에 있어서의 WT1 특이적 세포 상해성 T 세포(CTL)의 증식능의 측정
도 12에 나타내어지는 DRB1, DPB1, DQB1 또는 DRB5 서브 클래스 분자를 갖는 건강한 사람 6명으로부터 말초혈 단핵구를 제조하였다. 이 말초혈 단핵구에 WT135 헬퍼 펩티드를 첨가하여 1주일간 배양한 후, 이들 말초혈 단핵구를 WT135 헬퍼 펩티드에 의해 펄스하고, 방사선 조사한 동일인의 말초혈 단핵구를 stimular로서 1주마다 총 4회 자극하여 6일째에 3H의 도입을 측정하였다. 건강한 사람 6명 전원에 있어서, 말초혈 단핵구가 WT135 헬퍼 펩티드에 반응하여 증식하였다(도 12). 이것은 WT135 헬퍼 펩티드가 표기의 HLA 클래스 II 분자에 결합하여 증식 반응을 야기하는 기능을 갖는 것을 나타내었다. 또한, 표 8에 나타낸 바와 같이, 마우스 WT186 펩티드 및 WT1294 펩티드는 인간 WT186 펩티드(서열 번호 4) 및 WT1294 펩티드(서열 번호 5)와 사각으로 둘러싼 펩티드의 위치에서 아미노산 서열이 1개 다르다.
Figure pct00008
실시예 5
WT1 35 펩티드의 HLA 클래스 II 분자 구속성
또한, WT135 펩티드의 HLA 클래스 II 분자 구속성을 조사하기 위하여, 이하에 간결하게 설명되는 바와 같이 당업자간에서 주지의 방법에 의해 실험을 행하였다. 우선, 건강한 사람(DRB1*0101/0405, DPB1*0201/0402, DQB1*0401/0501 양성의 건강한 사람(이하, 건강한 사람 A라고 함)) 유래의 말초혈 단핵구(PBMC)를 WT135 펩티드에 의해 5회 자극하여 Responder를 조정하였다. 이어서, HLA 클래스 II 타입이 다른 별도의 건강한 사람(DRB1*0405/0901, DPB1*0201/0501, DQB1*0303/0401 양성의 건강한 사람(건강한 사람 B라고 함)) 유래의 말초혈 단핵구(PBMC)에 WT135 펩티드를 펄스하여 Stimulator로 하고, 세포의 증식(도입된 3H-티미딘량(cpm))을 측정하였다. 이 측정 시, 항체의 첨가없음, 항 HLA-DR 항체의 첨가(+a-DR), 항 HLA-DP 항체의 첨가(+a-DP), 또는 항 HLA-DQ 항체의 첨가(+a-DQ)의 조건 하에서 측정을 행하였다. Responder와 Stimulator의 양쪽에서 양성을 나타내는 공통의 HLA 클래스 II 타입이 WT135 펩티드의 구속성을 나타낸다. 실험 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 항 DR 항체를 첨가한 조건 하에서 증식이 억제되고, 건강한 사람 A와 B에 있어서 DRB1*0405가 공통이기 때문에 WT135 펩티드가 DRB1*0405 구속성인 것이 나타내어졌다.
이어서, Stimulator로서 건강한 사람 A와 다른 건강한 사람(DRB1*0405/0803, DPB1*0202/0501, DQB1*0401/0601 양성의 건강한 사람(건강한 사람 G라고 함)) 유래의 PBMC를 이용하는 것을 제외하고, 상기 실험과 동일한 조건 하에서 실험을 행하였다. 그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 항 HLA-DR 항체 또는 항 HLA-DP 항체를 첨가한 조건 하에서 증식이 억제되고, 건강한 사람 A와 건강한 사람 G에 있어서 DRB1*0405, DPB1*0201 및 DPB1*0202가 공통이기 때문에(DPB1*0201과 DPB1*0202는 유사성이 높기 때문에 크로스하여 반응하므로 공통으로 간주하였음), WT135 펩티드가 DRB1*0405, DPB1*0201 및 DPB1*0202 구속성인 것이 나타내어졌다.
다음에, Stimulator로서 건강한 사람 A와 다른 건강한 사람(DRB1*0101/0803, DPB1*0501/-, DQB1*0501/0601 양성(건강한 사람 H라고 함)) 유래의 PBMC를 이용하는 것을 제외하고, 상기 실험과 동일한 조건 하에서 실험을 행하였다. 그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 항 HLA-DR 항체를 첨가한 조건 하에서 증식이 억제되고, 건강한 사람 A와 건강한 사람 H에 있어서 DRB1*0101이 공통이기 때문에, WT135 펩티드가 DRB1*0101 구속성인 것이 나타내어졌다.
또한, WT135 펩티드의 구속성을 조사하기 위하여 responder로서 건강한 사람 G 유래의 PBMC를 이용하고, stimulator로서 DQB1*0601 유전자를 도입한 L 세포를 사용하였다. L 세포의 WT135 펩티드를 이용한 펄스의 유무에 의한 IFN-γ량의 차이를 측정하였다. 세포내의 IFN-γ 생산의 비율을 당업자에게 주지된 수법인 FACS를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 WT135 펩티드의 L 세포에의 펄스에 의해 Responder가 활성화되기 때문에, WT135 펩티드가 DQB1*0601 구속성인 것이 나타내어졌다.
다음에, Responder와 Stimulator에 동일 건강한 사람 유래의 PBMC를 이용하여 상기와 마찬가지로 실험을 행하였다. 본 실험에서 이용한 건강한 사람이 갖는 HLA 클래스 II 분자의 종류를 하기 표 9에 정리한다.
(표 9. 본 실험에서 이용한 건강한 사람이 갖는 HLA 클래스 II 분자의 종류)
Figure pct00009
그 결과, 건강한 사람 A 내지 E 유래의 PBMC를 이용하여 실험을 행한 경우, 항 DR 항체 또는 항 DP 항체를 첨가하면, 도입된 3H-티미딘량(cpm)이 감소하기 때문에 증식이 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 건강한 사람 F 유래의 PBMC를 이용한 경우, 항 DR 항체만을 첨가하였더니 증식이 억제되었다. 또한, 건강한 사람 G 유래의 PBMC를 이용한 경우, 항 HLA-DP 항체만을 첨가하였더니 증식이 억제되었다. 건강한 사람 A를 이용한 실험에 의해 WT135 펩티드는 DRB1*0101 또는 0405 및 DPB1*0201 또는 0402에 대하여 구속성인 것이 나타내어졌다. 건강한 사람 B를 이용한 실험에 의해 WT135 펩티드는 DRB1*0405 또는 0901 및 DPB1*0201 또는 0501에 대하여 구속성인 것이 나타내어졌다. 건강한 사람 C를 이용한 실험에 의해 WT135 펩티드는 DRB1*0802 또는 1201 및 DPB1*0201 또는 0501에 대하여 구속성인 것이 나타내어졌다. 건강한 사람 D를 이용한 실험에 의해 WT135 펩티드는 DRB1*1502가 호모접합체이기 때문에 DRB1*1502에 대하여 구속성인 것이 나타내어졌다(도 17). 또한, WT135 펩티드가 DPB1*0201 또는 0901에 대하여 구속성인 것이 나타내어졌다. 건강한 사람 E를 이용한 실험에 의해 WT135 펩티드는 DRB1*0405 또는 0901 및 DPB1*0202 또는 0501에 대하여 구속성인 것이 나타내어졌다. 건강한 사람 F를 이용한 실험에 의해 WT135 펩티드는 DRB1*1403 또는 1502에 대하여 구속성인 것이 나타내어졌다. 건강한 사람 G를 이용한 실험에 의해 WT135 펩티드는 DPB1*0202 또는 0501에 대하여 구속성인 것이 나타내어졌다.
또한, Responder와 Stimulator로서 건강한 사람 I 유래의 PBMC를 이용하여 WT135 펩티드를 이용한 펄스의 유무에 의한 IFN-γ량의 차이를 측정하였다. 세포내의 IFN-γ 생산의 비율을 당업자에게 주지된 수법인 FACS를 이용하여 측정하였다. 그 결과, WT135 펩티드에 의해 펄스함으로써 IFN-γ량의 비율이 현저하게 증가하였다(도 18). 이것은 WT135 펩티드가 DRB1*0101, DRB1*1501, DPB1*0201, DPB1*0402, DQB1*0501 또는 DQB1*0602 중 어느 것에 대하여 구속성인 것을 나타낸다.
본 발명에 의해 다종류의 MHC 클래스 II 분자 구속성의 WT1 펩티드, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이것들을 포함하는 의약 조성물 등이 제공되기 때문에, 의약품 등의 분야, 예를 들면 WT1 유전자를 고도로 발현하고 있는 여러가지 조혈기 종양, 고정암의 예방약, 또는 치료약의 개발, 제조 분야에서 이용 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> International Institute of Cancer Immunology, Inc. <120> Cancer antigen helper peptide <130> 669667 <150> JP 2009-105286 <151> 2009-04-23 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala 20 25 30 Arg Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala 35 40 45 Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Glu Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser 290 295 300 Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430 Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala 435 440 445 Leu <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro 290 295 300 Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430 Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala 435 440 445 Leu <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Leu <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr 1 5 10 15 Leu Val Arg <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe Ser Gly Gln Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr 1 5 10 15 Leu Val Arg <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5

Claims (17)

  1. WT1 단백질 유래의 연속하는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이며, 상기 아미노산 서열이,
    (a) 서열 번호 3에 나타내는 아미노산 서열;
    (b) 서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열;
    (c) 서열 번호 5에 나타내는 아미노산 서열; 및
    (d) (a) 내지 (c)에 나타내는 아미노산 서열에서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 또는 결실 또는 부가된 아미노산 서열
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 펩티드이고, MHC 클래스 II 분자와 결합하여 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 번호 3에 나타내는 아미노산 서열인 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, MHC 클래스 II 분자가 DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*0802, DRB1*0803, DRB1*0901, DRB1*1201, DRB1*1403, DRB1*1501, DRB1*1502, DPB1*0201, DPB1*0202, DPB1*0402, DPB1*0501, DPB1*0901, DQB1*0301, DQB1*0302, DQB1*0401, DQB1*0501, DQB1*0601, DQB1*0602 및 DRB5*0102로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 펩티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, MHC 클래스 II 분자가 DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*1502, DPB1*0201, DPB1*0202 및 DQB1*0601로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드, 또는 제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대한 항체.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드, 제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 제6항에 기재된 벡터를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드, 제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 제6항에 기재된 벡터의 유효량을, 제3항 또는 제4항에 기재된 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에 투여하는 것을 특징으로 하는, 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
  10. 암을 치료 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드, 제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 제6항에 기재된 벡터의 용도.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 제3항 또는 제4항에 기재된 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는, 항원 제시 세포.
  12. 미숙 항원 제시 세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 존재 하에서 배양하여, 상기 미숙 항원 제시 세포로부터 상기 펩티드를 제3항 또는 제4항에 기재된 MHC 클래스 II 분자를 통하여 제시하는 항원 제시 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, 항원 제시 세포의 유도 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드에 의해 유도되는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포.
  14. 말초혈 단핵구를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 존재 하에서 배양하여, 상기 말초혈 단핵구로부터 WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 유도 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 필수 구성 성분으로서 포함하는, WT1 특이적 헬퍼 T 세포를 유도하기 위한 키트.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드, 제5항에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 제6항에 기재된 벡터를 필수 구성 성분으로서 포함하는, 암을 예방 또는 치료하기 위한 키트.
  17. 제3항 또는 제4항에 기재된 MHC 클래스 II 분자를 갖는 대상에서의 WT1 특이적 헬퍼 T 세포의 존재 또는 양을 결정하는 방법이며,
    (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 상기 대상 유래 시료와 반응시키고; 이어서,
    (b) 상기 시료에 포함되는 사이토카인의 존재 또는 양을 조사하는
    공정을 포함하는 방법.
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