TW514530B

TW514530B - Tumor vaccines and methods for their production

Info

Publication number: TW514530B
Application number: TW085114455A
Authority: TW
Inventors: Walter Gm Schmidt; Max L Birnstiel; Tamas Schweighoffer; Peter Steinlein; Michael Buschle
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1995-11-23
Filing date: 1996-11-23
Publication date: 2002-12-21
Also published as: TR199800912T2; RO115275B1; JP2000502052A; CN1202931A; PL188537B1; WO1997019169A1; UY24430A1; BG102439A; BG62999B1; AU7694796A; NZ322910A; AR004341A1; CO4520254A1; AU720131B2; CZ158998A3; EE9800161A; BR9611466A; HUP0000318A2; US20020085997A1; EE03778B1

Description

514530 五、發明説明（本發明是有關腫瘤疫苗。以腫瘤細胞爲基礎之治療性疫苗，其發展基本上依下列條件而定··在腫瘤細胞及正常細胞間有定性或定量上之差異；免疫系統基礎上可確認這些差異；免疫系統利用這2 差異可被刺激-利用疫苗之活性特異的免疫接種_以確認腫瘤細胞並使其被排斥。爲了達成抗腫瘤反應，至少有兩種狀況必須滿足：首先，腫瘤細胞必須可表現抗原或新一表位，其係正常細胞中不會發生的。其次，免疫系統必須因此被活化以與這些抗原反應。腫瘤免疫治療中一個嚴重的阻礙是其低的免疫原性，特別是在人類。這是令人驚訏的，因爲吾等儘可預期在惡性細胞中有大量的遣傳變化導致肽新表位之形成，，其在與胞毒性T-淋巴細胞之MHC-I-分子接觸時可被確認。近來，已發現有腫瘤相關的及腫瘤特異的抗原，其構成此新一表位且因此應構成可爲免疫系統侵襲之潛在的標的。事貪上免疫系統雖然如此但不會成功地消除腫瘤（其表現這些新表位），其很明顯的並非因缺乏新表位而是因爲事實上對這些新抗原之免疫反應是不適當的。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 在細胞基礎上對癌症之免疫治療，有二個一般策略已發展出來··在一方面，繼承性免疫療法，其利用腫瘤一反應性T -淋巴細胞之試管内表現及其再引入病人體内；另一方面，自動免疫療法，其使用腫瘤細胞並預期對腫瘤抗原可生成新的或更有力的免疫反應，造成全身性腫瘤反應。以自動免疫療法爲基礎之腫瘤疫苗可以各種方式製備： -4 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 514530

經濟部中央標準局員工消費合作社印製

一個貫例包括將經照射之腫瘤細胞與免疫刺激劑佐劑混合 ’如小棒桿菌或卡介苗（bcg)以謗生拮抗腫瘤抗原之免疫反應（Oettgen and Old，1991)。近年來特別是遺傳上經修飾之腫瘤細胞已被利用於拮抗癌症之自動免疫療法中，可引入腫瘤細胞之外來基因可分成三大類：其中之一使用經遺傳修飾之腫瘤細胞以產生細胞動素。腫瘤細胞及細胞動素訊號之同時發生想必可提供一個啓動抗-腫瘤免疫力之刺激物。關於此策略應用之總覽可見

Pardoll，1993，Zatloukal et al.，1993，and Dranoff and

Mulligan，1995。已可於實驗動物模式中示出經遺傳修飾之腫瘤細胞，可分泌細胞動素，如IL-2，GM-CSF或IFN-r或可表現共刺激分子，以產生強力的抗-腫瘤免疫力（Dran〇ff et al，1993 Zatloukal et al.，1995)。然而對於已有實質腫瘤且已發展對腫瘤之耐性之個體，基本上更難以偵測完全的複合物作用聯級使有效的腫瘤反應可發生。另一類基因，將腫瘤細胞被修飾以充作腫瘤疫苗使用的係可指導合成所謂的輔助蛋白質者；此方式之目的是使腫瘤細胞轉化成抗原-呈現細胞（neo-APCs)以令彼可直接產生腫瘤特異的T -淋巴細胞。此類型的方式實例由〇sti^nd Rosenberg，1994描述。腫瘤抗原（TAs)或由彼衍生之肽之鑑定及分離，如下列户斤述：W5lfeletal.，1994 a)及 1994 b); Carrel etal，1993 -5- 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ---^------·ι衣—I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂- 0 I I i - 514530 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 )

Lehmann et al·，1989, Tibbets et al·，1993，或已發表之國際案 WO 92/20356， WO 94/05304， WO 94/23031， WO 95/00159，就蛋白質型式及肽型式而言，均是利用腫瘤抗原充作腫瘤疫苗中免疫原之先決條件。然而，呈腫瘤抗原型式之腫瘤疫苗，就如此而言並不具足夠的免疫原性可啓動消除攜有腫瘤抗原之腫瘤細胞所必要之細胞免疫反應；佐劑之共同投予對加強免疫反應僅提供有限的可能性 (Oettgen and Old, 1991) 〇爲了增加腫瘤疫苗效力的自動免疫療法之第三策略，是以異種化的（異源化）之自體腫瘤細胞爲基礎。此概念來自以下推測，即免疫系統與可表現外來蛋白質之腫瘤細胞反應’且在此反應過程中也激起免疫反應以拮抗這些腫，瘤抗原（TAs)，其由疫苗之腫瘤細胞所呈現。這些各種方式之總結，其中腫瘤細胞基於有更強免疫原性目的而引入各種基因使異源化，示於Zati〇ukal et al.: 1993 〇在特異免疫反應調控中，扮演中樞角色的是一個三分子複合物’包括Τ -細胞-抗原受體之組份，μ H C (主組織相容性複合體）分子及其配體，其爲衍生自蛋白質的一個肽片段。 MHC-I分子（或相當的人類分子，hlAs)爲一種肽受體，可以迫切的特異性與無數不同的配體結合。此中之先決條件由等位基因·特異的肽主題所提供，其具有以下之特異性準則：依MHC-I單倍體而定，肽具有明確的長度，此長 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

五、發明説明（4 ) 度通¥由8至1〇個胺基酸。典型而言，胺基酸位置中的2個爲所謂的，，固定處"，其僅可爲具有極相關側鏈之單一胺基酸或胺基酸群所占據。固定用胺基酸在肽中之確實位置及建立在其特性上之必要條件依]^111(：_1_單倍體而變化。肽配體之C-末端經常是一個脂族或荷電基團。此等位基因-特異的MHC-I·肽-配體主題，迄今是已知的，尤其是H_2Kd， K ’ K ’ Kkml，Db，HLA-A*0201，A*0205及B*2705。在細胞内蛋白質轉化作用範圍内，規則的，簡併的及外來的基因產物，如病毒蛋白質或腫瘤抗原，瓦解成少的肽，其中某些構成MHC-I分子潛在的配體。此點對於MHC-分子對彼之呈現提供先決條件，且結果啓動細胞免疫反應，雖然尚未清楚解釋肽如何在細胞内呈Mhc-Ι配體般產製。利用此機制異源化腫瘤細胞以強化免疫反應的一個方式包括以謗變化學物處理腫瘤細胞，如N•甲基-：^_亞硝基胍。預计此可造成腫瘤細胞呈現出衍生自細胞蛋白質經突變，交體之新-抗原’構成外來的基因產物（Van pel and B〇〇n， 1982)。然而，由於謗變事件在整個基因體中任意分佈，且另外某些細胞預期由於不同的謗變事件結果可呈現不同的新抗原，就定性及定量觀點而言此過程實難以控制。另一個兴源化腫瘤細胞的方式是以一個以上外來蛋白質之基因轉感於彼，如不同單倍體之外來MHC-I分子或MHC 虫白貝’其再以在細胞表面上之形式出現（EP-A2 0 569 678; Plautz et al·，1993; Nabel et al.，1993)。此方式之基礎在於上述之想法，即腫瘤細胞當經由所表現之蛋白質或衍本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(]10Χ297公釐) 514530 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（自彼之肽被確認爲外來者時（此時以完整的細胞疫苗型式才又丁）’或在自體MHC-I分子表現事件中，腫瘤抗原之呈現可由細胞表面MHC-I分子數目之增加使更臻完善。以外來蛋白質處理修飾腫瘤細胞，可使細胞呈現出源自MHC環境中外來蛋白質之肽，且由，，本身”修飾變化成”外來者，，發生在MHC-肽複合物確認之範圍内。將蛋白質或肽確認爲外來者表示在免疫確認過程中，所產生之免疫反應不僅拮抗外來的蛋白質，也拮抗屬於腫瘤細胞之腫瘤抗原。在此過程中，抗原-呈現細胞（APCs)被活化；其可將在疫苗腫瘤細胞内發生之蛋白質（包括TAs)處理修飾以形成肽，且充作配體應用於本身之MHC-I及MHC-II分子。經活化之充滿肽之APCs可移動至淋巴結，在此一些不成熟的T-淋巴細胞可確認源自APCs上ΤΑ之肽，且可應用彼充作純學擴大之刺激物-換言之以產生腫瘤特異的CTLs及T-輔助細胞。本發明目的是提出一種以異源化腫瘤細胞爲基礎之新穎的腫瘤疫苗，利用彼可啓動有效的細胞抗-腫瘤免疫反應〇在解決此問題上，以下考量爲基礎前題：鑒於非惡性正常身體細胞可爲免疫系統所忍受，身體與正常細胞之反應係利用若此細胞合成對身體而言爲外來者之蛋白質時之免疫反應，例如，由於病毒感染之結果。此點的理由在於 MHC-I分子可呈現源自夕卜來蛋白質之夕卜來的肽。因此，免疫系統記錄著在此細胞内已發生某些非欲求的且異源的事件。細胞被消除，APCs被活化且新的特異免疫力被產生以 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ----^---^------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tr -I I I m 514530 A7 _ B7 五、發明説明（6 ) 拮抗可表現外來蛋白質之細胞。一般公認腫瘤細胞含有討論中腫瘤特異的腫瘤抗原，但爲無效率的疫苗，因爲其低的免疫原性使得免疫系統將之忽略掉。若與已知方式相反的，腫瘤細胞被充滿以外來的肽而非外來的蛋白質，加上外來的肽細胞本身之腫瘤抗原可爲此細胞視爲外來的。經由肽之異源化，其意圖是指令外來的肽以啓動細胞免疫反應拮抗腫瘤抗原。腫瘤細胞低免疫原性之理由並非一個定性問題而是定量問題。對於衍自腫瘤抗原之肽，其意味著其確實爲MHC-I 分子所呈現，但濃度太低不足以啓動細胞腫瘤-特異的免疫反應。因此增加腫瘤細胞上腫瘤特異性肽之數目也可造成腫瘤細胞之異源化，使得可啓動細胞免疫反應。本意圖和以下方式是相反的，其中腫瘤抗原或衍生自彼等之肽基於其已爲指導合成討論中之蛋白質或肽之DNA所轉感之事實而呈現在細胞表面，如圖際案WO 92/20356，WO 94/05304，WO 94/23031 及WO 95/00159所述，此中提出一種可啓動有效的免疫反應而同時更易於操作之疫苗。經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Mandelboim et al·，1994及 1995提出 RMA-S細胞與衍生自腫瘤抗原之肽共培育，以啓動細胞免疫反應拮抗爲病人天然的相當的腫瘤抗原。稱之爲RMA-S之細胞（KSrre et al·， 1986)爲Mandelboim et al.提出應用於腫瘤免疫接種中，係假設可作用如APCs。其有一個特殊特點即其在細胞表面上之HLA分子由於細胞TAP機制之缺失結果是空白的（抗原性肽之運輸；負責肽之處理修飾及其與HLA分子之結合）。 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 514530 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（因此，細胞可充填以肽且因此可同時作用如呈現用載體以供外側提供之肽所用。所達成的抗-腫瘤作用基礎是對呈現在細胞之肽啓動免疫反應，其在與腫瘤細胞抗原性目綠未有任何直接接觸下提供至免疫系統。本發明是有關可投予至患者之腫瘤疫苗，其中含有腫瘤細胞且其本身可在HLA環境中呈現衍生自腫瘤抗原之肽，且其中至少有一些在細胞表面具有至少一個病人的MHCd-單倍體’且其充滿有一個以上的肽a)及/或b)，如此在與病人免疫系統之肽接觸下腫瘤細胞被視爲外來者，且啓動細胞免疫反應，這些肽 a) 作用如MHC-I-單倍體之配體，其爲病人及疫苗中腫瘤細胞所共有的，且與衍自由病人細胞所表現之蛋白質之肤是不同的，或 b) 作用如MHC-I-單倍體之配體，其爲病人及疫苗中腫瘤細胞所共有的，且係衍生自由病人細胞所表現之腫瘤抗原，且在疫苗腫瘤細胞上發生之濃度高於由與病人腫瘤細胞上表現的相同腫瘤抗原衍生之肽之濃度。人類MHC分子在下夂中依據國際慣例也稱爲HLA(人類白血球抗原）。所謂’’細胞免疫反應’’表示胞毒性T-細胞免疫，其由於產生腫瘤特異的胞毒性CD8-陽性T-細胞及CD4-陽性輔助丁_細胞，造成腫瘤細胞之瓦解。依據本發明得自腫瘤細胞自之疫苗，其有效主要是依據以下事實，即腫瘤細胞上出現之腫瘤抗原供應之免疫活性 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 514530 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（8 ) 由肽所加強。下文中a)型肽也稱爲”外來的肽”或”異種肽”。在本發明一個具體實例中，疫苗的腫瘤細胞是自體的。其係取自欲接受治療之患者，且細胞於活體外以肽或肽a) 及/或b)處理，視所需滅活再投予至患者。（產生自體腫瘤疫苗之方法述於WO 94/21808，其内容爲此中所指）。在本發明一個具體實例中，腫瘤細胞是同種異體的，即其並非示自接受治療的患者。當涉及經濟考量時，使用同種異體細胞特別好；針對各個個別患者產製個別疫苗是費力且吓貝的’再者問題在個別患者活體外之腫瘤細胞培養中發生’結果是產製之腫瘤細胞數目不足以製備疫苗。以同種異體腫瘤細胞時應牢記其必需要符合患者之HLA_亞型〇當使用a)類之外來肽時，在同種異體腫瘤細胞例子中，此中有一種以上細胞株之細胞，其中至少一個細胞株可表現至少一個且較好多個腫瘤抗原是與欲治療患者之腫瘤抗原相同的，即腫瘤疫苗符合病人之腫瘤適應症。此可確保由MHC-I-呈現之外來的肽對疫苗腫瘤細胞啓動之細胞免疫反應，造成腫瘤特異的CTLs及T_輔助細胞之擴大，也可直接拮抗病人之腫瘤細胞，因其表現出和疫苗細胞相同之腫瘤抗原。若舉例言之，依據本發明之腫瘤疫苗是被用來治療顯示出Her2/neu-突變作用之乳癌轉移患者時（Aured et ^，MM; Peopoles et al.? 1994; Yoshino et al.9 1994 a); Stein et al -11 - 本紙張尺度適财關家標M規格（210x1^17 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) «衣. 、11 514530 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -12- 五、發明説明（q ) 1994; Yoshino et al.5 1994 b); Fisk et al.5 1995; Han et al., 1995)所使用之疫苗應含有與患者HLA-單倍體符合之同種異體腫瘤細胞，其也表現出如腫瘤抗原之經突變的 Her2/neu。近來，已分離出許多腫瘤抗原，且已澄清其與一種以上癌症之關聯。此種腫瘤抗原的其他實例有ras (Fenton et al.5 1993; Gedde Dahl et al.? 1992; Jung et al.? 1991; Morishita et al.，1993; Peace et al·，1991; Skipper et al·, 1993) MAGE-腫瘤抗原（Boon et al.，1994; Slingluff et al.，1994; Van der Bruggen et al·，1994; WO 92/20356);各種腫瘤抗原之總覽也可見於Carrel et al.，1993。病人之腫瘤抗原通常在以標準方法起算診斷及治療計劃之過程中決定，利用CTLs對欲偵測之腫瘤抗原有特異性爲基礎之分析法。這些分析法述於如：H0rin et al·，1987; Coulie et al·，1993; Cox et al·，1994; Rivoltini et al·，1995; Kawakami et al.，1995 ;且也述於 WO 94/14459 ;這些參考文獻中也揭示各種腫瘤抗原及衍自彼之肽表位。發生在細胞表面之腫瘤抗原也可以以抗體爲基礎之免疫分析法偵測。若腫瘤抗原爲酵素，如酪胺酸酶，其可利用酵素分析法偵測。在本發明另一具體實例中，可使用自體及同種異體腫瘤細胞之混合物之疫苗之起始物。本發明此具體實例於病人所表現之腫瘤抗原爲未知的或僅部份鑑定及/或同種異體的腫瘤細胞僅表現某些病人腫瘤抗原時特別有用。加入經由外來肽處理過之自體腫瘤細胞，將可能可確保疫苗中至本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS )从規格（2]Ι()χ297公餐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 514530 A7 __B7 五、發明説明（1〇 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 少某些腫瘤細胞含有最大可能數目的病人先天的腫瘤抗原。同種異體腫瘤細胞爲在一個以上MHC-I-單倍體上符合患者之細胞。 a)及b)型之肽依據與MHC_I分子結合之需要而定義，就其序列而言是病人的HLA亞型的欲給予疫苗者。決定病人之HLA-亞型因此構成選擇或設計適合的肽時最重要的先決條件。當依據本發明之腫瘤疫苗以自體腫瘤細胞型式使用時， HLA-亞型由於HLA分子之特異性結果可自動地獲得，此爲在病人身上遺傳學決定的。利用標準方法，如微量-淋巴毒性試驗（MLC試驗，混合的淋巴細胞培養）（Practical Immunol., 1989)可價測病人的HLA亞型。MLC試驗的原則是將分離自病人血液之淋巴細胞是與拮抗特異HLA分子之抗血清或單株抗體，於兔子補體（C)存在下混合。陽性細胞再溶解並吸收指示劑染劑，由是未受損的細胞保持未受染色。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 RT-PCR也可用來決定病人的HLA-單倍體（Curr. Prot. Mol Biol. Chapters 2及15)。爲了進行此，對病人採血並由其中分離RNA。此RNA先接受逆轉綠作用，生成cDNA。以 cDNA爲聚合酶鏈反應之基質，加上引子對下可使代表某一 HLA-單倍體之DNA片段特異地擴大。若瓊脂糖凝膠電泳後出現一個DNA帶，病人即可表現相當的HLA分子。若帶未出現，病人則呈陰性反應。對各個患者預期至少會出現二個帶。 _zJiz_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 514530 A7 B7 五、發明説明（ 11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^本發/月以同種異體疫苗型式使用時，所使用的細胞至少木些付合病人至少一個HLA-亞型。爲使依據本發明的疫苗達到最大可能應用目的，較好以不同細胞株之混合物爲起始物，最常見的是可表現二或三個不同的亞型者’且要特別考慮單倍體HLA-A1及HLA-A2。利用以可表現这些單倍體之同種異體腫瘤細胞之混合物爲·基礎之疫苗，將可4選大族群之病人；以此方式約可涵蓋7〇%的歐洲人口（Machiewicz et al·，1995)。所應用之肽，其依據本發明利用HL A-亞型之定義係就其固定胺基酸及其長度而定義；明確的固定位置及長度可確保肽和討論中之HL A分子之肽結合叉符合，且呈現在腫瘤細胞之表面而形成疫苗，如此細胞可被視爲外來者。，此意味著免疫系統可被刺激，且可謗生細胞免疫反應以拮抗病人之腫瘤細胞。基於本發明目的，適合充作a)類外來肽之肽可在大範圍中應用。其序列可衍生自自然生成的免疫原蛋白質或其細胞瓦解產物，如病毒或細菌性肽，或來自病人以外之腫瘤抗原。適合的外來肽可在文獻中已知之肽序列基礎上選擇，如利用由 Rammensee et al·，1993，Falk et al·，1991 所述之肽，針對不同的HLA特徵，由各種來源的免疫原性蛋白質中衍生，其符合各種HLA-亞型分子之結合叉。對於具有蛋白質部份序列之肽（且此蛋白質有免疫原活性），利用已知或可能仍需開發之多肽序列將可能發展出適合的候選者之肽 -14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·«衣·

、1T 514530 A7 __B7 五、發明説明（12 ) ，其中在序列比較上要考慮hla_特異性要求。適合的肽實例可見於如：Rammensee et al·，1993，Falk et al·，1991，及 Rammensee，1995及 WO 91/09869 (HIV肽）；衍生自腫瘤抗原之肽特別描於已發表的國際專利案WO 95/00159及WO 94/05304中。因此以這些參考文獻之揭示列爲此中參考，且此中列出之文獻與肽有關。異種肽之較佳候選者爲其免疫原性已證明之肽，即，衍生自已知免疫原之肽，如病毒或細菌性蛋白質。此種類型的肽以其免疫原性之理由在MLC試驗上呈現紫色反應。若不採用原先的肽，即未變地衍自天然蛋白質之肽，將可依所需進行變化，利用關於固定位置及長度之最小要求，特別是在原先肽序列之基礎上；在此例中，因此依據本發明使用合成的肽，其依據和MHC-I配體有關之要求而設計。因此，例如，由 H2-Kd-配體 Leu Phe Glu Ala lie Glu Gly Phe lie (LFEAIEGFI)開始，將可變化非固定胺基酸之胺基酸，如此得到序列爲Phe Phe lie Gly Ala Leu Glu Glu lie (FFIGALEEI)之肽；再者，在第9位置之固定胺基酸lie 可以Leu替代。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 衍生自腫瘤抗原之肽，即來自於腫瘤細胞上表現之蛋白質，且其不出現在相當的未轉形細胞上或僅以顯著較低的濃度出現，可如a)及/或b)型肽酸在本發明範圍内使用。肽之長度較好相當於與MHC-I分子結合所必要的8至10個胺基酸之最小序列，加上必要的固定胺基酸。若欲求時’ 肽也可在C-及/或N-末端處加長，只要其不致干擾結合力 ___ -15-_ 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇'乂297公釐） 514530 A7 ___ __ B7 五、發明説明（13 ) - ^~ 即可，即所伸展之肽可在細胞層次時處理修飾至最小序列 Ο 原則上’肽候選者在許多階段中針對其作爲外來肽之適合性而選擇：大體而言，候選者先在肽結合試驗中針對其與MHC-I分子之結合力進行測試，較好是一系列試驗。一個檢視的適合方法是，如以流動細胞計數爲基礎之 FACS分析（Flow Cytometry，1989; FACS Vantage TM TJser，s Guide，1994; CELL QuestTM User’s Guide，1994)。肽上標記螢光染料，如以FITC(異硫氰酸螢光素），並應用至可表現 MHC-I分子之腫瘤細胞。在流動中，個別的細胞爲某波長下之激光所刺激；偵測所射出之螢光並依結合至細胞之肽量而定。經濟部中央標準局員工消費合作社印製

* _«衣！ ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本百C 另一個決走肽結合量的方法是Scatchard blot作圖。使用標以I125或稀土金屬離子（如銪）之肽。細胞在4°C下以各種明確濃度的肽充填30至240分鐘。爲了決定肽與細胞之非特異性交互作用，加過量未經標記之肽至某些樣品中，避免經標記肽特異的交互作用。之後洗滌細胞移去任何非特異的與細胞有關之物質。再決定與細胞結合之肽量，或在液體閃燦計數中利用射出之放射活性，或在計光計中進行 (此適用於偵測使長期長的螢光）。如此得到的數據再利用標準方法評估。在第二步驟中，測試有良好結合特性之候選者之免疫原性。由其免疫原活性未知之蛋白質中衍生之異源肽之免疫原本紙張尺度適用中國國家瓦( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514530 A7 B7 五、發明説明（14 ) 性，可利用如MLC試驗測試。可在此試驗中謗生特殊紫色反應之肽（較好也可以不同的肽連續進行，且此中以具已知免疫原活性之肽爲標準品）適用於本發明目的。針對免疫原性測試MHC-I-結合肽候選者的另一個可能方式包括檢視肽與T2細胞之結合。此種試驗之一是以T2細胞 (Alexander et al_，1989)或 RMA-S·細胞（KSrre et al·，1986)之特有本質爲基礎，其在TAP肽運送機制中有缺失且當應用至出現在MHC-I環境中之肽時才呈現穩定的MHC-I分子。 T2細胞或RMA-S細胞以HLA基因穩定地轉感，如以HLA_ A1及/或HLA-A2基因，應用於試驗中。若細胞爲是MHC-I 良好配體之肽所影響，即呈現在MHC-I環境下使免疫系統將其視爲外來者，這些肽將使HLA分子大量出現在細胞表面。偵測細胞表面上之HLAs，如利用單株抗體，將可確定出適合的肽（Malnati et al·，1995; Sykulev et al·，1994)。再次，已知具有良好HLA-或MHC-結合力之標準肽可適當地使用。在本發明一個具體實例中，疫苗之自體或同種異體腫瘤細胞可有許多具不同序列之異源肽。在此例中，所使用之肽可互異，在另一方面其可與不同的HLA亞型結合。在此方式中，可偵測病人許多的或所有的HLA亞型。疫苗以經照射型式投予。關於出現在腫瘤細胞之異源肽另一個可能的額外的變化性可包括以下事實，即與特定HLA亞型結合之肽，其序列有異此對與HLA結合並非具決定性的，係衍生自如不同來 __-17-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

、1T 514530 A7 五、發明説明（ 15 經濟部中央標準局員工消費合作社印製源之虫白、，例如來自病毒及/或細菌蛋白質。此類型之變化性’其提供經接種有機體更廣大的異源化範圍，預期可強化免疫反應之刺激。在本發明一個具體實例中，腫瘤疫苗包括各種細胞株之同種異體腫瘤細胞之混合物，及可能有額外的自體腫瘤細胞，所有的腫瘤細胞可經相同的肽處理或不同來源之腫瘤細胞也有不同的異源肽。在本發明範圍内進行之實驗中，以衍生自流感病毒血球凝集素且爲H2-Kd_配體之病毒肽（其有序列Leu phe Glu Ala lie Glu Gly Phe h)爲a)型之外來肽；其中固定胺基酸於底下劃線。在以自然生成之病毒肤爲外來肤下可產生腫瘤疫苗，且其在動物模式中進行測試（黑色素瘤模式及結腸癌模式）。另一個具有 Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met序列之病毒肽，其衍生自流感病毒之核蛋白且爲HLA-1 -單倍體 H2-Kb之配體（Rammensee et ai，1993 ;固定胺基酸於底下劃線）可用來產生腫瘤疫苗；疫苗之保護作用在另一個黑色素瘤模式中證實。另一個疫苗之產生是將具有Phe Phe lie Gly Ala Leu Glu Glu lie (FFIGALEEI)序列之外來肽異源化腫瘤細胞而成。此爲一種合成的肽，迄今尚未在自然界中找到。當選擇序列時，應小心以滿足充作H2-Kd型MHC-I分子配體在適用性方面之要求。肽產生抗-腫瘤免疫力之通用性，依據自動免疫療法之概念於鼠類結腸癌CT-26中證實（爲老鼠 -18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇><297公釐） ---^-------衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?! I ! 1 丄、發明説明（

Balb/c系之同源）。 /在本^明另一具體實例中，腫瘤疫苗也可含有自體及/ 或同種異體之腫瘤細胞及/或以細胞動素基因所轉感之纖、隹母細胞。W0 94/21808及Schmidt et al·，1995(對此已有入參考文獻中）描述利用IL_2表現載體在已知爲，，鐵傳遞蛋白 ίΐ”之〇ΝΑ運送方法中產生有效率的腫瘤疫苗（此方法以受體一調升之細胞攝粒作用爲基礎，亦使用系田胞配體，特別是鐵傳遞蛋白，共軛以多陽離子如多賴胺酸以複合dna ，及内囊胞溶解之活性作用物，如腺病毒）。較好，經肽處理之腫瘤細胞及表現細胞動·素之細胞，以 1:1比例混合。例如，若可在每1χ1〇6細胞中產生4,〇〇〇單位IL-2炙IL-2疫苗與丨χ 106經肽處理之腫瘤細胞混合，如此得到之疫苗可用於二次處理，假定最佳劑量爲1，〇〇〇至 2,000單位的 iL-2(Schmidt et al·，1995)。將細胞動素疫苗與經肽處理之腫瘤細胞混合，有益的是將可混合此二疫苗型式之作用。細胞之處理及依據本發明疫苗之調和可以傳統方式進行，如在 Biologic Therapy 〇f Cancer，1991，或 WO 94/21808 中所述。依據另一方面，本發明是有關產製由腫瘤細胞組成之腫瘤疫苗以投予至患者之方法。依據本發明此方法之特性在於腫瘤細胞在HLA環境下本身可呈現出衍自腫瘤抗原之肽，且其中至少某些可表現至少一種病人之MHC-I-單倍體，細胞以一個以上的肽處理本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐 ^ ----衣— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514530 A7 B7 五、發明説明（17) ，其 a) 充作MHOI-單倍體之配體，其爲病人及疫苗之腫瘤細胞所共通的，且與由病人細胞所表現之蛋白質所衍生之肽不同，或者其 b) 充作MHC-I-單倍體之配體，其爲病人及疫苗之腫瘤細胞所共通的，且竹生自由病人細胞所表現之腫瘤抗原〇腫瘤細胞於一種以上的a)及/或b)肽培育一段時間及一定量’並在有機聚陽離子存在下，如此肽可結合至腫瘤細胞，以此方式可爲病人之免疫系統視爲外來者，並啓動細胞免疫反應。肽之量較好每1 X 105至2 X 107細胞有約50微克至約16〇微克。右使用b)類之肤’濃度也可更高。關於這些肽基本上其在疫苗腫瘤細胞上之濃度應高於病人腫瘤細胞上之肽濃度（衍自相同之腫瘤抗原）相異程度達疫苗之腫瘤細胞被視爲外來者並謗生細胞免疫反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製適合的聚陽離子包括同系之有機聚陽離子，如聚賴胺酸，聚精胺酸，聚鳥胺酸或有二個以上不同的正電荷胺基酸之兴質的聚陽離子，同時這些聚陽離子可有不同的鏈長以及非肽類的合成聚陽離子，如聚乙撑亞胺，聚陽離子本質 4天然的DNA_結合蛋白質如組織蛋白或魚精蛋白或其同系物或片段，及精胺或亞精胺。適用於本發明目的的有機聚陽離子也包括聚陽離子脂質（Fdgner et & 1994

Loeffler et al·，1993; Remy et al.，1994; Behr, 1994)其可買經濟部中央標準局員工消費合作社印策川:)川 A7 ---- B7 __ 五、發明説明（18 ) 知·到’尤其有以下商品名稱：transfectam(轉感胺） lipofectamine(脂感胺）或 lip〇fectin(脂感素）。聚陽離子中較好使用約30至300個賴胺酸基團鏈長度之聚賴胺酸（pL)。和肽有關之聚陽離子需求量可靠實驗來決定。若使用聚賴胺及a)類之異源肽，則pL:肽之重量比例較好約1:4至約 1:12 〇培育時間通常由30分鐘至4小時。當到達肽最大電荷時依時間而定，荷電程度可以FACS分析追踪，且如此可決定必要的培育時間。在本發明另一具體實例中，所使用的聚賴胺酸爲至少部份共軛型。較好，某些聚賴胺酸呈與鐵傳遞蛋白（Tf)共軛之型式（即鐵傳遞蛋白-聚賴胺酸共軛物，TfpL，其參考見 \¥〇94/218〇8之揭示），0[:丁€0[之重量比例較好爲約1:1。若不與鐵傳遞蛋白共軛，聚賴胺酸也可與其他的蛋白質共轭，如在WO 94/21 808中被稱爲内化因子之細胞配體。若必要時，腫瘤細胞之處理可在DNA存在下進行。DNA 較好呈質體型式，較好是無可指導合成功能性眞核細胞蛋白質之序列之質體，即呈空白載體型式。理論上目前任何具有功能且可獲得之質體均可充作DNA。 DNA和聚陽離子關聯下之含量較好約1:2至約1:5，且其中後者視所需與蛋白質部份共軛，如在pL，TfpL或pL及 TfpL混合物之關聯下。在腫瘤細胞量及/或肽量之關聯下，聚陽離子之培育期 __ -21 - 本紙張尺度適用巾國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公襲） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·«衣· 514530 A7 ----B7 五、發明説明（19 ) 、’量及本質，聚陽離子是否與蛋白質共軛以及以何比例與之八軛或何種蛋白質爲最佳共軛者，以及DN A存在之優點及其用量均可以實驗方式決定。爲了達到此點，可變化方法中個別的變數，且在另外相同的條件下將月太應用至腫瘤細胞，並檢查肽如何有效率地結合至腫瘤細胞上。進行此點的一個適合的方法是FACS分析。依據本I明之方法不僅適於處理腫瘤細胞，也可用於處理其他的細胞。除了腫瘤細胞外，自體的纖維母細胞，即爲病人先天的，或來自纖維母細胞株之細胞，其或是符合病人之HLA_ 亞型或已用相當的MHCdS團轉感，均可依據本發明方法以一個以上衍生自腫瘤抗原（其由病人之腫瘤細胞所表現) 之肽所充填。如此經處理及照射的纖維母細胞可如此被應用或與經肽處理之腫瘤細胞混合充作腫瘤疫苗。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —：—：---— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在另一具體實例中，除了纖維母細胞，樹突細胞可以本發明方法處理。樹突細胞爲皮膚的APCs ;其依所需可於試管内被充填，即自病人分離出之細胞於試管内與一個以上的肽混合，肽係衍生自病人之腫瘤抗原且可與病人之 MHC-I或MHC-II分子結合。在另一具體實例中，這些細胞也可於活體内爲肽所充滿。爲了達到此點，肽，聚陽離子及視所需的DNA之複合物較好皮内注入，因樹突細胞特別常見於皮膚中。在本發明範圍内，肽與TfpL或pL複合以轉移至CT_26細胞内，及與TfpL及非功能性質體（空載體）複合以轉移至M_ ______ - 22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）〜 *-- 514530 第85114455號專利申請案中文說明書修正頁(89年2月）

Ifi 須請委員明示，本案修正後是否變更原實質内經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（2〇 ) 3細胞。在CT-26系統中頃發現以肽異源化之經照射的腫瘤疫苗可產生有效率的抗腫瘤免疫力：75%經免疫的老鼠可消除會在所有對照組動物中形成腫瘤的腫瘤挑戰，此對照組或未給予疫苗或可予無異源肽之疫苗。在m_3系統中，相同的異源肽在為適合人體中定位而建立之實驗中測試，就腫瘤而言所在之條件甚至對有機體更為嚴格。有轉移的老鼠以異源化且經照射之M_3細胞免疫接種。如此接種的老鼠中有87.5%可消除轉移，而所有未處理的老鼠\及7/8給丁典異源肽之疫苗之老鼠均有腫瘤病痛。也發現’腫瘤疫苗之全身性免疫反應程度依肽應用至腫瘤細胞之方法而定。當肽經聚賴胺酸/鐵傳遞蛋白投予至細胞，作用可較細胞與肽共培育24小時（”脈衝，，）還更顯著。混合肽及經照射疫苗之佐劑也不足夠。鐵傳遞蛋白感染似乎對於肽攝入細胞内可確保更有效率，或者充填以聚賴胺酸/鐵傳遞蛋白似乎可使肽保持粘附在細胞膜上，因此與MHC-I分子身體上更接近且之後可與之結合，且有置換細胞肽之可能性，其則由於強的親和力而微弱的結合。 . 附圖說明圖la-lc : M-3細胞以外來肽處理後之FACS-分析圖Id : M-3細胞以FITC肽處理後之顯微像片圖2 : 利用充填以外來肽之M-3細胞疫苗治療有M_3黑色素瘤轉移之DBA/2老鼠圖3a·針對腫瘤疫苗產製之外來肽之滴定圖3b :充填以外來肽之腫瘤細胞腫瘤疫苗與可分泌IL-2之 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

*1T 514530 A7 B7 五、發明説明（21 ) 腫瘤疫苗之比較圖4a :將來自結腸腫瘤細胞且充填有外來肽之疫苗預免疫接種Balb/c老鼠之保護作用圖4b ·· T-細胞在全身性免疫力參與上之檢視圖5 : 將充填以外來肽之黑色素瘤細胞疫苗預先免疫接種C57BL/6J老鼠之保護作用在下文實例中，除非另有所示使用以下材料及方法：鼠類黑色素瘤細胞株Cloudman S91(純系M-3; ATCC No. CCL 53.1)得自 ATCC。黑色素瘤細胞株 B16-F10 (Fidler et al·，1975)得自 NIH DCT腫瘤寄存所。自含有DNA之轉感複合物中製備鐵傳遞蛋白-聚賴胺酸-共軛物，依WO 94/21808所述進行。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 肽 LFEAIEGFI，FFIGALEEI，LPEAIEGFG及ASNENMETM 利用Fmoc方法（HBTU活化作用，FastmocTM，規模0:25毫莫耳）在肽合成儀上合成（433 A機型有回輸追踪器，Applied Biosystems，Foster City，Canada)利用 TentaGel S PHB (Rapp， Tiibingen)爲固相。肽溶於 1 Μ TEAA，pH 7.3 中，在 Vydac C1 8管柱上以逆相層析純化。序列以MAT Lasermat之刮板時間質量分光計證實（Finnigan，San Jose, Canada)。測試癌症疫苗拮抗轉移形成之保護作用之效力Γ治療老鼠模式’，），並進行預防性老鼠模式中之測試，並利用WO 94/21808中所述之步驟，且以DBA/2模式及Balb/c模式爲老鼠模式。 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） 514530 A7 _B7 五、發明説明（22 ) 實例1 在各種方法下以外來肽處理M_3細胞之比較性FACS分析於此檢視中，此示於圖1中，外源肽LFEAIEGFI或以 TfpL/DNA複合物施加至M-3細胞（轉裝填：la)，或在另一狀況下將細胞與肽共培育（脈衝，圖lb)，最後是肽呈佐劑型式加至細胞（圖lc)。於轉裝填中，160微克經FITC-標記之異源肽LFEAIEGFI 或未經標記之對照肽，混合以3微克鐵傳遞蛋白-聚賴胺酸 (TfpL)，10微克 pL及 6微克 psp65 (Boehringer Mannheim，無 LPS)於500微升HBS緩衝溶液中。經在環境溫度下30分鐘後，上述溶液加至T 75細胞培養燒瓶内，其中有1.5 X 106 M-3細胞並在20毫升DMEM培養基中（10% FCS，20 mM葡萄糖）且在3 7°C下培育。3小時後，細胞以PBS洗二次，利用 PBS/2 mM EDTA移除再懸浮於1毫PBS/5% FCS中以進行 FACS分析。肽脈衝至細胞内則利用1-2 X 1〇6細胞於20毫升加有450微克肽之DMEM(經FITC標記或未標記）進行，於37°C下歷3小時。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 至於佐劑之混合，在FACS分析前，將自培養燒瓶中移除之106細胞與100微克經FITC-標記之肽在1毫升PBS/5% FCS 中以環境溫度更培育30分鐘。於PBS/5% FCS替換後，細胞洗滌並再分析。依據廠商指示利用FACS優越裝置（Becton， Dickinson)，其中裝配有5 W氬激光，且設定在1〇〇毫瓦， 488毫微米，進行FACS分析。FACS分析結果示於圖la至lc ~ ____1251___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 514530 五、發明説明（23 圖1 d示出細胞離心之M-3細胞之顯微像片複合物給予肽之細胞（轉裝填），而下圖上圖爲利用示出與肽共培育之經濟部中央標準局員工消費合作社印製細胞（脈衝）。DAPI用來對染核。已用含有肽之複合物充填之M-3細胞和夫以單獨的聚賴胺酸處理的細胞比較下處理的細胞或平又下’前者有幾年次方之螢光位移’顯示利用TfpL/DNA複合物肽可有效地轉移至細胞（圖la)。肤之培育（脈衝）較無效率，光位移僅1G的1次方中纟出，〃勞光顯微•㈣是j 測知的（圖1 d)。在佐劑混合之例子φ J 丁甲，於洗滌步驟後肽會消失（圖1 c)，顯不肽之結合大部份是可忽略的。實例2 以充填外來肽（黑色素瘤細胞疫苗治療有黑&素瘤轉移之 DBA/2老鼠（治療性老鼠模式） a) 自M-3細胞中製備腫瘤疫苗 160微克異源肽LFEAIEGFI與3微克鐵傳遞蛋白_聚賴胺酸 (TfpL)，10微克PL及6微克psp65(無LPS)於500微升HBS緩衝溶液中混合。在環境溫度中30分鐘後，上述溶液加至丁 75細胞培養燒瓶中，其内細胞於2〇毫升 DMEM培養基（10%FCS，20mM葡萄糖），並在37χ：下培育。3小時後，細胞與15毫升新鮮培養基混合，再於5%c〇\ 下培育於37 C —夜。於投藥前4小時，細胞以2〇 Gy照射。疫苗依WO 94/21808所述製備。 b) 腫瘤疫苗之效力有5天轉移之6-12週大的DBA/2老鼠（由皮下注射104活的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、訂· 514530 A7 B7 五、發明説明（24 ) M-3細胞而產生），在1週間隔下處理2次，即皮下注射腫瘤疫苗（劑量：1〇5細胞/動物）。實驗中有8隻老鼠。實驗結果示於圖2a，很明顯的8隻動物中有7隻在投予疫苗後治療，其中係將肽以TfpL/DNA複合物方式充填至腫瘤細胞内。在比較實驗中，所使用之疫苗係以培育方式（37°C下3小時；’’脈衝’’）將肽LFEAIEGFI(400微克或4毫克）施加至細胞。在給予400微克肽之疫苗例中，8隻中有3隻動物仍無腫瘤；而疫苗中之細胞以4毫克肽處理者則在8隻動物中僅治療1隻。對照組則包括本身爲經照射之M-3細胞，及細胞充填以無肽之複合物（在各例中1/8動物保持無腫瘤）。於對照組動物中，並未接受任何型式之治療下所有動物均發展出腫瘤。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了檢視關聯性，在一方面是產製疫苗之方法而另一面是肽序列，於是進行另一系列實驗；在這些實驗中，使用高度致腫瘤性M_3細胞變型。在實驗中，其中測試處理方法之意義，所產製之疫苗内肽並未經由聚賴胺酸-鐵傳遞蛋白充填至細胞内，但僅如佐劑般與細胞混合。至於肽序列之對照組，在第2及9位置上之固定胺基酸，即苯丙胺酸及異白胺酸，分別以脯胺酸及甘胺酸置換，生成肽Leu Pro Glu Ala lie Glu Gly Phe Gly (LPEAIEGFG)；此肽缺乏與 H2-Kd結合之能力。轉移形成至少每週追踪一次。這些試驗的結果示於圖2b。利用TfpL/DNA複合物將LFEAIEGFI充填至細胞内而產生之疫苗，可治癒8隻動物中的6隻。另一方面，若給予的疫苗係肽LFEAIEGFI僅與細胞單純混合， -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 514530 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 ____ B7___五、發明説明（25 ) 或所含之細胞利用TfpL/DNA複合物將經修飾之肽， LPEAIEGFG(其並未與HLA特色結合）充填入内，則8隻動物中有7隻會發展腫瘤。於對照組中，僅以經照射的Μ·3細胞處理，或根本未接受治療，則所有動物均發展成腫瘤。 c)檢視疫苗中肽量之作用如a)中所述，製備含肽之複合物，其含有50，5或0.5微克有效的肽LFEAIEGFI，且以此充填M-3細胞。以可分泌最適量IL-2之IL-2疫苗（見d))作比較。此疫苗用來免疫已有 5天轉移之DBA/2老鼠。含有50微克肽之疫苗可治療8隻動物中的6隻，含5微克者則8隻中之4隻，就同IL-2疫苗一般，而含有0.5微克之疫苗在8隻動物中僅治療2隻。此實驗示於圖3 a中。實例3 在預防性老鼠模式中，含有外來肽之疫苗與來自IL_2分泌性腫瘤細胞之腫瘤疫苗的比較在比較試驗中，2組實驗動物（各8隻）以一週爲間隔先免疫二次，一次爲實例2a)所述之疫苗，且另一次爲il-2分泌性1^_3細胞之疫苗（依WO 94/21808中所述的製備，IL-2劑量每隻動物2,000單位）。於最後一次免疫接種後一週，定出對測腫瘤，並有增量之腫瘤細胞（”挑戰”；劑量示於圖 3b))。頃發現依據本發明以腫瘤疫苗免疫接種優於以IL_2 疫苗處理：自然的老鼠，以IL_2疫苗免疫接種，僅可保護拮抗1〇5活的，高度致腫瘤性細胞（M_3-W)。然而，以3 X 105細胞挑戰則會消損此疫苗之能力，由是此程度之腫瘤 ______ _ 28 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇><297公董） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 訂 J— · 514530 A7 B7 五、發明説明（26 ) 負擔已可由充填以外來肽之腫瘤細胞疫苗先前免疫接種動物而成功地克服。實例4 以充填有外來肽之結腸癌細胞之疫苗預先免疫接種而保護 Balb/c老鼠（"預防性老鼠模式”） a) CT-26疫苗之製備 160微克外源肽LFEAIEGFI或FFIGALEEI，混合以12微克的pL或3微克鐵傳遞蛋白-聚賴胺酸加上10微克聚賴胺酸，並在環境溫度下於500微升HBS緩衝溶液中複合30分鐘，之後轉移至T 75細胞培養燒瓶内，其中有1.5 X 106 CT_26 細胞於4毫升DMEM培養基中（10% FCS，20 mM葡萄糖），再於37°C，5% C02下培育。經4小時後，細胞以PBS洗滌，與15毫升新鮮培養基混合，再於37°C及5% (：02下培育一夜。於投藥前4小時，細胞以100 Gy照射。疫苗如WO 94/21808所述地製備。 b) 測試癌症疫苗保護拮抗CT-26挑戰之效力經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Balb/c老鼠6-12週大，以一週爲間隔皮下注射免疫接種二次（細胞劑量：105/老鼠）。各組有8隻老鼠（或在以pL充填至細胞之實驗中採用7隻老鼠）。於最後一次免疫接種後一週，利用5 X 104親代CT-26細胞施於對側腫瘤。比較試驗中疫苗以TfpL/DNA複合物之外之方法製備，加上對照組均依實例2所述進行。每週至少檢查一次腫瘤之生長。關於肽LFEAIEGFI之結果可見於圖4a; 8隻動物中6隻受保護。於肽FFIGALEEI例中（未示於圖4a)，8隻中4隻受保護 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 514530 A7 B7 五、發明説明（27 ) c)在腫瘤疫苗活性中τ細胞之參與爲了偵測T-細胞在由CT-26疫苗所帶來之全身性免疫力中之參與角色，在另一實驗中，於免疫接種前24小時，靜脈内注入500微克單株抗體GK1.5 (ATCC TIB 207)而移出 CD4 +細胞，及靜脈内注入500微克單株抗體2 43 (ATCC TIB 210)而移出CD8 +細胞。陽性對照組給予未消除CD4+細胞及CD8 +細胞之疫苗。試驗結果示於圖仆。T-細胞之參與由以下事實顯示，即所有移去τ_細胞之動物均發展腫瘤。實例5 以充填有外來肽之黑色素瘤細胞之疫苗預先免疫接種而保護（C57BL/6J老鼠（”預防性老鼠模式”）在此實例中，C56BL/6J之老鼠充作實驗動物（各組有8隻動物）。所使用之黑色素瘤爲B16-F10細胞（NIH DCT腫瘤寄存所；Fidler et al·，1975)其與所使用之老鼠爲同基因。所有實驗組之動物均以一週爲間隔免疫接種二次，每隻老鼠皮下注射105B16-F10細胞：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在一個試驗系列中，疫苗之產製係將序列ASNENMETM 之肽充填至經照射之B16-F10細胞内，如實例2對來自M-3 細胞之疫苗所述一般。於平行實驗中，以可分泌IL-2之B16-F10細胞或GM-CSF( 以WO 94/21808所述之步驟製備）充作預先免疫接種之疫苗 ;疫苗在每隻動物可產生l5〇00單位的IL-24 2〇〇毫微克的 GM-CSF。 -I- I — —1--- -30- 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) μ規格（21〇><297公釐） 514530 A7 B7 五、發明説明（28 ) 對照組動物則接受經照射但未處理之B16_F 10細胞以爲預先免疫接種。於最後一次免疫接種後一週，利用1 X 1〇4活的，經照射的B16-F10細胞在實驗動物中建立腫瘤，再追踪腫瘤的生長。這些實驗的結果示於圖5 ;充填以外來肽之腫瘤細胞呈現插抗腫瘤形成之最佳保護作用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} '訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514530 A7 __________B7 五、發明説明（29 ) 參考文獻

Alexander, J. et al·, 1989,工mmunogenetics 29, 380

Allred, D.C. et al.,1992, J. Clin· Oncol. 10 (4), 599-605

Behr, J.P·, 1994, Bioconjug-Chem·, Sept-Oct, 5(5), 382-9

Biologic Therapy of Cancer, Editors： DeVita, V.T.Jr·, Heilman, S·, Rosenberg, S.A·, Verlag J.B· Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown

Boon, T·, 1993, Spektrum der Wissenschaft (May), 58-66

Boon, T. et al·, 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 337-65

Carrel, S. and Johnson, J.P·, 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389

Coligan, J.E., Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H., Shevach, Falk, K. et al·, 1991, Nature 351, 290-296

Coulie, P.G. et al·, 1992, Int· J· Cancer, 50, 289-297

Cox, A.L. et al·, 1994, Science 264, 5159, 716-9

Current Protocols in Molecular Biology, 1995,

Publisher： Ausubel F.M·, et al·, John Wiley &

Sons, Inc.

Dranoff, G· et al·, 1993, Proc. Natl· Acad. Sci. USA 90, 3539-3543

Dranoff, G. and Mulligan, R.C., 1995, Advances in Immunology 58, 417

Falk, K. et al·, 1991, Nature 351, 290-296

Feigner, J.H. et al·, 1994, J. Biol· Chem. 269, 2550-2561

Fenton, R.G. et al., 1993, J· Natl. Cancer Inst. 85, 16, 1294-302

Fisk, B. et al·, 1995, J. Exp. Med. 1881, 2109-2117

Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Cell Biology, 1989, Vol. 33, Publisher： Darzynkiewicz, Z. and Crissman, H,A. -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）；：衣— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、訂 i m In 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 514530 A7 _____B7_ 五、發明説明（3〇 )

Gedde Dahl, T. et al·, 1992, Hum Immunol. 33, 4, 266-74 Guarini, A. et al·, 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1, 57-64

Han, X.K. et al·, 1995, PNAS 92, 9747-9751 Handbook: FACS Vantage ™ Users Guide, April 1994, Becton Dickinson

Handbook： CELL Quest ™ Software User*s Guide, _

June 1994, Becton Dickinson Herin M. et al·, 1987, Int. J. Cancer, 39, 390 Hock, H. et al·, 1993, Cancer Research 53, 714-716 Jung, S. et al·, 1991, J· Exp· Med. 173, 1, 273-6 Kawakami, Y. et al·, 1995, The Journal of Immunol. 154, 3961-3968

Karre, K. et al·, 1986, Nature 319, 20. Feb·, 675 Lehmann, J.M. et al·, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895

Lethe, B. et al·, 1992, Eur· J. Immunol. 22, 2283-2288 Loeffler, J.-P· et al·, 1993, Methods Enzymol. 217, 599-618

Mackiewicz, A. et al·, 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811

Malnati, M.S. et al·, 1995, Science 267, 1016-1018 Mandelboim, O. et al·, 1994, Nature 369, 5.May, 67-71 Mandelboim, O. et al·, 1995, Nature Medicine 1, 11, 1179-1183

Morishita, R. et al·, 1993, J. Clin. Invest· 91, 6, 2580-5

Nabel, G. J. et al·, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11307-11311

Oettgen, H.F. and Old, L.J., 1991, Biologic Therapy of Cancer, Editors： DeVita, V.T.Jr., Heilman, S·, Rosenberg, S.A., Verlag J.B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown, 87-119 Ostrand-Rosenberg, S·, 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727

Pardoll, D.M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310 Practical Immunology, Editors： Leslie Hudson and Frank -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 x 297公釐） (請先Μ·讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 JI. 514530 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（31 ) C. Hay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne Peace, D.J. et al·, 1991, J. Immunol. 146, 6, 2059-65 Peoples, G.E. et al·, 1994, J. Immunol. 152, 10, 4993-9 Plautz, G.E· et al·, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649

Rammensee, H.G. et al·, 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35-44

Rammensee, H.G·, 1995, Current Opinion in Immunology 7, 85-96

Remy, J.S. et al·, 1994, Bioconjug-Chem., Nov-Dec, 5(6), 647-54

Rivoltini# L. et al·, 1995, The Journal of Immunology 154, 2257-2265

Schmidt, W. et al·, May 1995, Proc. Natl. Adac· Sci. USA, 92, 4711-4714

Skipper/ J·, and Stauss, H.J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5, 1493-8

Slingluff, C.L. et al·, 1994, Current Opinion in Immunology 6, 733-740

Stein, D. et al·, 1994, EMBO-Journal， 13, 6, 1331-40 Sykulev, Y. et al·, 1994, Immunity 1, 15-22 Tibbets, L.M. et al·, 1993, Cancer, Jan· 15·, ν〇1·71, 2, 315-321 van der Bruggen, P. et al·, 1994, Eur. J· Immunol. 24, 9, 2134-40 Issn: 0014-2980

Van Pel, A. and Boon, T., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4718-4722 W51fel# T. et al·, 1994 a), Int. J. Cancer 57, 413-418 WSlfel, T· et al·, 1994 b), Eur· J· Immunol· 24, 759-764

Yoshino, I· et al·, 1994 a), J. Immunol. 152, 5, 2393-400

Yoshino, I· et al·, 1994 b), Cancer Res·, 54, 13, 3387-90

Zatloukal, K· et al·, 1993, Gene 135， 199-20 Zatloukal, K· et al·, 1995, J· Imrnun· 154, 3406-3419 -34- 泰紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims

514530 第085114455號專利申請案中文申請專利範圍修正本(91年10月） A8 B8 C8 D8

橋无六、申請專利範圍 1. 一種可投予至患者之腫瘤疫苗，其特徵在於其含有腫瘤細胞’其本身在HLA環境中可呈現衍生自腫瘤抗原之肽且其中至少某些在細胞表面上有至少一種病人之MHC-I-單倍體，且其已充填以一種以上的肽a)及/或b )，如此腫瘤細胞可為患者之免疫系統視為外來者，此就肽而言，並啟動細胞免疫反應，肽 a)充作MHC-I-單倍體之配體，其為病人及疫苗腫瘤細胞所共通的，且與由病人細胞表現之蛋白質所衍生之肤不同，或 fc)充作MHC-I-單倍體之配體，其為病人及疫苗腫瘤細胞所共通的，且衍生自由病人細胞所表現之腫瘤抗原’且存在於疫苗腫瘤細胞之濃度高於由與病人腫瘤細胞表現的一樣的腫瘤抗原衍生之肽濃度。 2·根據申請專利範圍第丨項之腫瘤疫苗，其特徵在於其中含有自體腫瘤細胞。 3·根據申請專利範圍第1項之腫瘤疫苗，其特徵在於其中含有同種異基因腫瘤細胞。 4_根據申請專利範圍第3項之腫瘤疫苗，其特徵在於同種異基因的腫瘤細胞為一種以上的細胞株，其中至少一個細胞株可表現至少一種，較好數種腫瘤抗原，其和欲治療患者之腫瘤抗原是相同的。 5·根據申请專利範圍第1至4項中任一項之腫瘤疫苗，其特徵在於其由自體及同種異基因細胞之混合物所組成的。 6·根據申請專利範圍第1項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽a) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A8 B8 C8 申請專利範圍或b)是H2-Kd-配體。 7.根據申請專利範圍第i項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽“ 或b)是H2-Kb_配體。 8·根據申請專利範圍第丨，6或7項之腫瘤疫苗，其特徵在於肤a)係衍生自自然生成之免疫原蛋白質或其細胞瓦解產物。 9·根據申請專利範圍第8項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽幻係衍生自病毒蛋白質。瓜根據申請專利範圍第9項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽係衍生自流感病毒蛋白質。 H·根據申請專利範圍第1 〇項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽具有以下序列：Leu Phe Glu Ala lie Glu Gly Phe lie。 12·根據申請專利範圍第i 〇項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽具有以下序列：Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met。 13.根據申請專利範圍第8項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽a) 係衍生自細菌蛋白質。 14·根據申請專利範圍第1項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽a) 係衍生自病人外來之腫瘤抗原。 15.根據申請專利範圍第1項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽a) 是一種合成的肽。 16·根據申請專利範圍第1 5項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽具有以下序列·· Phe Phe lie Gly Ala Leu Glu Glu lie。 17·根據申請專利範圍第i至4項中任一項之腫瘤疫苗，其特徵在於腫瘤細胞已用許多不同序列的肽處理過。 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝_ 訂

A8 B8 C8

18. 根據申請專利範圍第17項之腫瘤疫苗，其特徵在於肽相異處在於可與不同的HLA-亞型結合。 19. 根據申請專利範圍第17項之腫瘤疫苗，纟特徵在於肢互異之處在於其序列，此點對HLA_結合並非具決定性。根據申明專利範圍第1至4項中任一項之腫瘤疫苗，其特徵在於其也含有為細胞動素基因轉感之腫瘤細胞。 21·根據申請專利範圍第2〇項之腫瘤疫苗，其特徵在於細胞動素是IL-2及/或IFN-r。 22· 一種產製含有腫瘤細胞可投予至患者之腫瘤疫苗之方法，此方法的特徵在於腫瘤細胞本身於HLA環境下可呈現出衍生自腫瘤抗原之肽，且其中至少某些可表現病人至少一種MHC-I·單倍體，方法中將其以一種以上的肽處理，其 a) 作用如MHC-I-單倍體之配體，此為病人及疫苗腫瘤細胞所共通的，且與衍生自由患者細胞表現之蛋白質之肽不同，或 b) 作用如MHC-I-單倍體之配體，此為病人及疫苗之腫瘤細胞所共通的，且衍生自由病人細胞表現之腫瘤抗原，腫瘤細胞與一種以上肽a)及/或b)培育一段時間及一定量，並在有機聚陽離子之存在下，如此肽可結合至腫瘤細胞且以此方式其可為病人的免疫系統視為外來者，此就腫瘤細胞而言’並可啟動細胞免疫反應。 23.根據申請專利範圍第2 2項之方法，其特徵在於所使用的 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) )14530 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍聚陽離子為聚賴胺酸。 24·根據申請專利範圍第2 3項之方法，其特徵在於使用鏈長約30至約3〇〇個賴胺酸基團之聚賴胺酸。 25. 根據申請專利範圍第2 2至2 4項之方法，其特徵在於所使用的聚陽離子呈至少部份共軛型。 26. 根據申請專利範圍第2 5項之方法，其特徵在於聚陽離子係與鐵傳遞蛋白共軛。 27·根據申請專利範圍第2 2至2 4項中任一項之方法，其特徵在於細胞也於DNA存在下處理。 28.根據申請專利範圍第2 7項之方法，其特徵在於DNa是一種質體。 29·根據申請專利範圍第2 7項之方法，其特徵在於dna與聚陽離子之比例為約1:2至約1:5，其中後者視所需與蛋白質部份共軛。 3〇·根據申請專利範圍第22項之方法，其特徵在於肽約及/或 b)之用量為每1 x 105至2 X 1〇7細胞中有約5〇微克至約160 微克。 31. —種可投予至患者之腫瘤疫苗，其特徵在於其含有纖維母細胞，其在細胞表面上有至少一種病人之MHC-I -單倍體’且其已於試管中，在有機多陽離子之存在下填充以一或多個該病患腫瘤抗原之肽。 32· —種可投予至患者之腫瘤疫苗，其特徵在於其含有樹突細胞’其已於試管中，在有機多陽離子存在下填充以一或多個該病患腫瘤抗原之肽及/或可與病患MHC-II分子 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 514530 A8 B8 C8 D8 、申請專利範園結合之肽。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）