BG62999B1 - Анти туморна ваксина и метод за нейното получаване - Google Patents
Анти туморна ваксина и метод за нейното получаване Download PDFInfo
- Publication number
- BG62999B1 BG62999B1 BG102439A BG10243998A BG62999B1 BG 62999 B1 BG62999 B1 BG 62999B1 BG 102439 A BG102439 A BG 102439A BG 10243998 A BG10243998 A BG 10243998A BG 62999 B1 BG62999 B1 BG 62999B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- cells
- tumor
- patient
- peptide
- peptides
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 10
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 title abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 222
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 120
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 151
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 121
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 120
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 71
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 69
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 49
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 23
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 16
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 15
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 15
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 claims 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 9
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 9
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 9
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 8
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 8
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 5
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 4
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 201000004449 Diamond-Blackfan anemia Diseases 0.000 description 3
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 3
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100030525 Gap junction alpha-4 protein Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N Leu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 108010081053 MUT 2 peptide Proteins 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 108010015408 connexin 37 Proteins 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010072094 gp100(280-288) melanoma antigen peptide Proteins 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 2
- QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic anhydride Chemical compound FC(F)(F)C(=O)OC(=O)C(F)(F)F QAEDZJGFFMLHHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940030325 tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- NUKQEEMKQGMUQH-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(N)=N NUKQEEMKQGMUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010014597 HLA-B44 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000997835 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK1 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 1
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033438 Tyrosine-protein kinase JAK1 Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001420 alkaline earth metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000021 endosomolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 108700008272 transferrin-polylysine conjugate Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Устройството и методът намират приложение за атравматично безиглено въвеждане на частици от терапевтично средство или на генетичен материал в тъкан на жив организъм през покривния му слой кожа. С тяхсе постига стерилност на доставяните частици и намаляване на загубите им. Устройството се състои от горно цилиндрично тяло с резервоар (10) за газ подналягане и еднопосочен клапан (25). Горното цилиндрично тяло е свързано разглобяемо с първа тръбна част (11), в която е оформена камера (12), чието долно дъно е изпълнено като разкъсваема мембрана (20), закрепена неподвижно по периметъра си към дюза. Последната е монтирана разглобяемо към първата тръбна част (11) и съдържа предварително приготвенакапсула с доза частици. Капсулата е образувана отпериферно свързани еластично неразрушимо блистерно гнездо (21) и покривен слой (22), между които сапоместени частиците (23). Капсулата е установена в дюзата, свързана с камерата (12). По метода предварително установените в капсулата и намиращи се всъстояние на покой частици (23) се задвижват и регулируемо се ускоряват чрез газ под налягане и се изхвърлят към повърхностния слой на живата тъкан. Задвижването на частиците (23) се осъществява чрезударна вълна, създадена от ударно въздействие на газа под налягане върху външната повърхнина на блистерното гнездо (21) на капсулата, при което тази повърхнина преминава от първа вдлъбната във втораизпъкнала стабилна позиция.
Description
Област на техниката
Изобретението се отнася за антитуморна ваксина и до метод за нейното получаване. Ваксината съдържа туморни клетки, поне част от които върху клетъчната си повърхност имат най-малкото един хаплотип от главния комплекс на тъканната съвместимост I (MHC-I). Туморните клетки са натоварени с един или повече пептиди, свързани с молекулата на MHC-I по такъв начин, че в контекста на пептидите се разпознават от имунната система на пациента като чужди и предизвикват клетъчен имунен отговор. Натоварването се извършва в присъствието на поликатиони, като полилизин.
Предшестващо състояние на техниката
Разработването на една терапевтична ваксина на основата на туморни клетки по същество почива върху следните предпоставки. Между туморните клетки и нормалните клетки съществуват качествени или количествени различия. Имунната система има способност да разпознава тези разлики и може чрез активна специфична имунизация с ваксини да се стимулира към разпознаване на туморните клетки на основата на тези различия и да предизвика тяхното отхвърляне.
За предизвикването на противотуморен отговор трябва да се изпълнят най-малкото две предпоставки. Първо туморните клетки трябва да експресират антигени или неоепитопи, които не се срещат върху нормалните клетки. Второ имунната система трябва да бъде активирана по съответен начин, за да реагира срещу тези антигени. Едно съществено препятствие в имунотерапията на тумори представлява тяхната слаба имуногенност, преди всичко у хората. Това е изненадващо дотолкова, доколкото би могло да се очаква, че големият брой генетични изменения в малигнените клетки би трябвало да доведат до появата на пептидни неоепитопи, които в контекста на молекулите от MHC-I биха се разпознали от цитотоксичните Т-лимфоцити.
По-рано бяха открити туморасоциирани и туморспецифични антигени, които са такива неоепитопи и поради това би трябвало да са потенциални прицели за атака от страна на имунната система. Фактът, че въпреки това имунната система не успява да елиминира туморите, които експресират тези неоепитопи, очевидно се дължи не на липсата на неоепитопи, а на това, че имунният отговор срещу тези неоантигени е недостатъчен.
За имунотерапия на рак бяха разработени две общи стратегии на клетъчна основа. От една страна, това е “осиновителната” имунотерапия, която си служи с размножаване на реагиращи срещу тумори Т-лимфоцити in vitro и тяхното повторно въвеждане в пациентите, а от друга страна, това е активната имунотерапия, която употребява туморни клетки, с очакването, че с това срещу туморните антигени ще се предизвикват или нови, или засилени имунни отговори, с които да се създаде съответният системен противотуморен отговор.
На основата на активната имунотерапия се произвеждат различни видове туморни ваксини. Пример за това са облъчени туморни клетки, които се смесват с имуностимулиращи адюванти като Corynebacteium parvum или Bacillus Calmette Guerin (BCG), за да се предизвикат имунни реакции срещу туморните антигени (Oettgen & Old, 1991).
През последните години за активна имунотерапия на рака са използвани предимно генетично модифицирани туморни клетки, при което въведените в туморните клетки чужди гени попадат в три категории.
Една от тях използва туморни клетки, които са генетично модифицирани така, че да произвеждат цитокини. Локалното съвместяване на туморни клетки и цитокинов сигнал формира стимул, който предизвиква противотуморен имунитет. Преглед на използването на тази стратегия е направен от Pardoll, 1993; Zatloukal et al., 1993 и Dranoff & Mulligan, 1995.
В експериментални животински модели беше показано, че силен противотуморен имунитет генерират туморни клетки, които са генетично модифицирани да секретират цитокини като IL-2, GM-CSF или IFN-γ или да експресират ко-стимулиращи молекули (Dranhoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1995). При човек, в който туморът вече е забележимо напреднал и който е развил толерантност спрямо тумора, е значително по-трудно да се обхване напълно каскадата от сложни взаимодействия, така че да може да протече една ефективна противотуморна реакция. Все още не е показано каква е действителната ефективност на туморните ваксини, секретиращи цитокини, за приложение при хората.
Една друга категория гени, чрез която туморните клетки се променят с оглед употребата им като туморни ваксини, кодират т.нар. аксесоарни (добавъчни) белтъци или accessory proteins. Целта на тази добавка се състои в това туморните клетки да започнат да функционират като антиген-представящи клетки, т.е. Neo-APCs, за да могат директно да предизвикат образуването на туморспецифични Тлимфоцити. Пример за такава добавка е описан от Ostrand-Rosenberg, 1994.
Идентифицирането и изолирането на туморни антигени (TAs), респ. на техни производни пептиди, например съгласно Wolfel et al., 1944 а) и 1944 b); Carrel et al., 1993, Lehmann et al., 1989, Tibbets et al., 1993 или съгласно описанието в публикуваните международни заявки WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159) беше предпоставка за използването на туморни антигени като имуногенни за туморни ваксини както под формата на белтъци, така и на пептиди. Една туморна ваксина под формата на туморни антигени обаче не е достатъчно имуногенна, за да предизвика клетъчен имунен отговор, за да елиминира туморните клетки, носещи туморни антигени. Съвместното прилагане с адюванти също предлага ограничени възможности за усилване на имунния отговор (Oettgen & Old, 1991).
Трета стратегия на активната имунотерапия за повишаване ефективността на туморните ваксини се основава на ксеногенизирани (направени чужди) автоложни туморни клетки. В основа на тази концепция лежи допускането, че имунната система реагира срещу туморни клетки, които експресират чужд белтък, и че в хода на тази реакция се предизвиква имунен отговор и срещу онези туморни антигени (TAs), които се предоставят от туморните клетки във ваксината.
Преглед на тези различни подходи, при които чрез въвеждане на различни гени се извършва ксеногенизиране на туморни клетки с оглед повишаване на имуногенността, е направен от Zatloukal et al. 1993.
Централна роля в регулирането на спе цифичния имунен отговор играе един тримолекулен комплекс, състоящ се от компонентите: Т-клетъчен антигенен рецептор, молекула на МНС (Major Histocompatibility Complex, т.е. Главен комплекс на тъканната съвместимост) и техния лиганд, който представлява пептиден фрагмент, получен от белтък.
Молекулите на МНС-I, респ. съответните човешки молекули, HLAs, представляват пептидни рецептори, които позволяват строго специфичното свързване на милиони различни лиганди. Предпоставка за това са алелспецифичните пептидни мотиви, които отговарят на следните критерии за специфичност: в зависимост от хаплотипа на МНС-I пептидите имат определена дължина, по правило осем до десет аминокиселинни остатъци. Две от аминокиселинните позиции обикновено представляват т.нар. “котва” и могат да се заемат от една единствена аминокиселина или от аминокиселинни остатъци с близкородствени странични вериги. Точното място на “котвените” аминокиселини в пептида и изискванията за техните свойства варират в зависимост от хаплотипа на MHC-I. С-краят на пептидните лиганди обикновено е алифатен или зареден остатък. Такива алелспецифични мотиви на пептидните лиганди от МНС-I досега са известни за Н-2К0, Кь, Кк, Кк“‘, D+, HLA-A*0201, А*0205 и В*2705.
В рамките на белтъчната обмяна вътре в клетката нормалните, изродени и чужди генни продукти, например вирусни белтъци или туморни антигени, се разграждат до малки пептиди; някои от тях са потенциални лиганди за молекулите от МНС-I. Това е предпоставка за тяхното представяне от молекулите на МНС и като следствие от това за предизвикването на клетъчен имунен отговор, макар че все още не е подробно изяснено, как в клетката пептидите се произвеждат като лиганди за MHC-I.
Един подход, който използва този механизъм за ксеногенизиране на туморни клетки, за да се усили имунният отговор, се състои в това, туморните клетки да се обработят с химични мутагени, като М-метил-ЬГ-нитрозогуанидин. Като резултат трябва да се получат туморни клетки, представящи неоантигени, произлезли от мутантните варианти на клетъчните белтъци, които са чужди генни продукти (Van Pel & Boon, 1982). Този метод обаче е трудно да се контролира в количествено и качествено отношение, тъй като мутагенните събития са разпределени случайно в генома и освен това се очаква, че отделните клетки в резултат на различните мутагенни събития ще представят различни неоантигени.
Друг подход ксеногенизира туморни клетки чрез трансфекцията им с гени за един или повече чужди белтъци, например за чужда MHC-I-молекула или за МНС-белтъци от различни хаплотипове, които след това се появяват върху клетъчната повърхност (ЕР-А2 0 569 678; Plautz et al., 1993; Nabel et al., 1993). Този подход почива на посочената представа, че когато туморните клетки се прилагат под формата на ваксина от цели клетки, те се разпознават като чужди благодарение на експресираните белтъци, респ. на техните производни пептиди; или че в случай на експресията на автоложни MHC-I-молекули представянето на туморните антигени се оптимизира чрез повишаване броя на MHC-I-молекулите върху клетъчната повърхност. Изменението на туморните клетки с чужд белтък може да доведе до представянето на пептиди от чуждия белтък в контекста на МНС, при което промяната от “собствено” към “чуждо” се извършва в рамките на разпознаването МНС-пептиден комплекс. Резултатът при разпознаването на един белтък или пептид като чужд се състои в това, че в хода на имунното разпознаване се произвежда имунен отговор не само срещу чуждия белтък, но и срещу туморните антигени, присъщи на туморните клетки. В хода на този процес се активират антигенпредставящите клетки (Antigen Presenting Cells, APCs), които процесират до пептиди белтъците (инклузивни TAs), срещащи се в туморната клетка на ваксината, и ги използват като лиганди за собствените си МНС-I и MHC-I-молекули. Активираните, натоварени с пептиди APCs, мигрират в лимфните възли, където само малка част от Т-лимфоцити разпознават пептидите върху APCs, произлизащи от ТА, и могат да ги използват като стимул за клонална експанзия с други думи за генерирането на тумор-специфични CTLs и на Т-клетки-помощници.
Същност на изобретението
Задачата на изобретението се състои в приготвянето на нова антитуморна ваксина на основата на ксеногенизирани туморни клетки, с помощта на която може да се предизвика ефективен клетъчен противотуморен отговор.
Съгласно изобретението задачата е решена, като се основава на известния факт, че докато немалигнените, нормални телесни клетки се толерират от имунната система, срещу една нормална клетка тялото реагира чрез имунна защита тогава, когато тя, например в резултат на вирусна инфекция, синтезира чужди за тялото белтъци. Причината за тази реакция е в представянето на чужди пептиди от MHC-I-молекулите, които произлизат от чуждите за тялото белтъци. В резултат имунната система регистрира факта, че с тази клетка се е случило нещо нежелано и схващано като чуждо. Клетката се отстранява, APCs се активират и се образува нов, специфичен имунитет срещу клетките, експресиращи чужди белтъци.
Въпреки че туморните клетки съдържат дадените туморспецифични туморни антигени, като такива те не са надеждни ваксини, тъй като в резултат на тяхната слаба имуногенност се пренебрегват от имунната система. Ако обаче противно на известните подходи една туморна клетка се натовари не с чужд белтък, а с чужд пептид, тогава освен чуждите пептиди, като чужди тази клетка ще възприема и собствените си туморни антигени. Чрез ксеногенизирането с пептид би трябвало да може да се постигне насочване на предизвикания от чуждите пептиди клетъчен имунен отговор срещу туморните антигени.
Причината за слабата имугенност на туморните клетки не може да представлява качествен, а количествен проблем. За пептид, произлязъл от туморен антиген, това може да означава, че той все пак се представя от MHCI-молекулите, обаче в концентрация, която е твърде ниска, за да предизвика клетъчен тумор-специфичен имунен отговор. Повишаване броя на туморспецифичните пептиди върху туморната клетка би трябвало също така да осъществи ксеногенизиране на туморната клетка, което води до предизвикването на клетъчен имунен отговор. Би трябвало да се приготви ваксина, която при опростено производство да предизвиква ефикасен имунен отговор, в противовес на подходите, при които туморният антиген, респ., неговият производен пептид, се представят върху клетъчната повърхност чрез трансфекцията на туморните клетки с ДНК, която кодира въпросния белтък, респ.
пептид, както е описано във WO 92/20356, WO/9405304, WO 94/23031 и W095/00159.
В патент на Mandelboim et al., 1994 и 1995 е предложено, RMA-S-клетки да се инкубират с пептиди, производни на туморните антигени, за да се предизвика чрез това клетъчен имунен отговор срещу собствените туморни антигени на пациента. За клетките, предложени от Mandelboim et al. за туморно ваксиниране с означението RMA-S (Karre et al., 1986), се приема, че могат да изпълняват функцията на APCs. Те имат тази особеност, че техните HLA-молекули върху клетъчната повърхност са свободни в резултат на дефект в клетъчния механизъм за транспорт на антигенни пептиди (TAP-механизъм, “Transport of Antigenic Peptides”), отговорен за процесирането на пептидите и тяхното свързване с HLA-молекулите. По този начин клетките са на разположение на натоварването им с пептид, следователно те функционират едновременно и като представящ вектор за въведения отвън пептид. Постигнатото противотуморно действие се основава на предизвикването на имунен отговор срещу представения върху клетките пептид, който се предлага на имунната система, без да е в непосредствен контекст с антигенния репертоар на туморната клетка.
Изобретението се отнася до антитуморна ваксина за приложение при пациенти, състояща се от туморни клетки, които представят в контекста на HLA пептиди, произлезли от туморните антигени. Поне част от тези клетки имат върху повърхността си най-малкото един MHC-I-хаплотип на пациента и са натоварени с един или повече пептиди а) и/или б) по такъв начин, че туморните клетки в контекст с пептидите се разпознават от имунната система на пациента като чужди и се предизвиква клетъчен имунен отговор, при което пептидите функционират по следния начин.
a) като лиганди за MHC-I-хаплотип, който е общ за пациента и за туморните клетки на ваксината, като са различни от пептидите, произлезли от белтъци, които се експресират от клетки на пациента, или
b) като лиганди за MHC-I-хаплотип, който е общ за пациента и за туморните клетки на ваксината, като са производни на туморни антигени, които се експресират от клетки на пациента и са в концентрация върху туморните клетки на ваксината, която е по-висока от концентрацията на пептид, производен на същите туморни антигени, експресиращи се върху туморните клетки на пациента.
Човешките МНС-молекули по-нататък ще се означават като HLA (Human Leucocyte Antigen), както е прието в международната практика.
Под “клетъчен имунен отговор” трябва да се разбира цитотоксичният Т-клетъчен имунитет, който в резултат на образуването на туморспецифични цитотоксични CDS-положителни Т-клетки и СО4-положителни Т-клеткипомощници осъществява разрушаване на туморните клетки.
Действието на ваксината от туморни клетки съгласно изобретението се основава преди всичко на факта, че имуногенното действие на наличния върху туморните клетки запас от туморни антигени се подсилва чрез пептида.
Пептидите от типа а) по-нататък ще се означават и като “чужди пептиди” или “ксенопептиди”.
В едно приложение на изобретението туморните клетки на ваксината са автоложни. При това става въпрос за клетки, които се вземат от пациента, който ще се лекува, третират се ex vivo с пептид (и) а) и/или б), в дадени случаи се инактивират и след това отново се въвеждат в пациента. (Методи за получаването на автоложни туморни ваксини са описани във WO 94621808, използван за справка).
В едно приложение на изобретението туморните клетки са алогенни, т.е. те не произлизат от лекувания пациент. Предимство на употребата на алогенни клетки се дава преди всичко поради икономически съображения. Производсвото на индивидуални ваксини за всеки отделен пациент е трудоемко и скъпо. Освен това при отделните пациенти се появяват трудности при култивирането на туморни клетки ех vivo, така че туморните клетки не се получават в достатъчно голям брой, за да може да се произведе ваксина. За алогенните туморни клетки трябва да се обърне внимание, че те трябва да съответстват на HLA-субтипа на пациента.
В случай на употреба на чужди пептиди от категорията а) при туморните клетки става въпрос на клетки от една или повече клетъчни линии, от които поне една клетъчна линия експресира поне един, за предпочитане повече туморни антигени, които са еднакви с туморните антигени на пациента, който ще се лекува, т.е. туморната ваксина се съгласува с туморните индикации на пациента. Това осигурява насочване на клетъчния имунен отговор, предизвикан от MHC-I представените чужди пептиди върху туморните клетки на ваксината и водещ до експанзия на туморспецифични клетки и на Т-клетки-помощници и към туморните клетки на пациента, тъй като те експресират същите туморни антигени, както и клетките на ваксината.
Ако една пациентка например, която страда от метастази на рак на гърдата, проявява и мутацията Her2/neu (Allred et al., 1992; Peopoles et al., 1994; Yoshino et al., 1994 a) Stein et al., 1994; Yoshino et al., 1994 b) Fisk et al., 1995; Han et al., 1995), трябва да се лекува с туморната ваксина от настоящото изобретение, като ваксина се използват алогенни, съответстващи на HLA-хаплотипа на пациента туморни клетки, които също експресират мутиралия Her2/neu като туморни антигени. Порано бяха изолирани множество туморни антигени и беше изяснена тяхната зависимост от едно или повече ракови заболявания. Други примери за такива туморни антигени са ras (Fenton et al., 1993; Gedde Dahl et al., 1992; Jung et al., 1991; Morishita et al., 1993; Peace et al., 1991; Skipper et al., 1993), туморните антигени MAGE (Boon et al., 1994; Slilngluff et al., 1994; van der Bruggen et al., 1994; WO 92/ 20356; освен това обзор на различни туморни антигени е даден от Carrel et al., 1993.
Преглед на известни туморни антигени и техни производни пептиди, приложими в рамките на изобретението, е направен в таблицата.В хода на поставянето на диагнозата и лечебния план туморните антигени на пациента се определят най-общо чрез стандартни методи, например с помощта на тестове на основата на CTLs, специфични за туморния антиген, който се определя. Подобни тестове са описани от Herin et al., 1987; Coulie et al., 1993; Cox et al., 1994; Rivoltini et al., 1995; Kawakami et al., 1995; както и във WO 94/14459; в тези литературни източници може да се направи справка и за различни туморни антигени, респективно за техни производни пептиди. Туморните антигени, появяващи се върху клетъчната повърхност, могат да се докажат също и с имуноанализи на основата на антитела.
Когато туморните антигени са ензими, например тирозинази, те могат да се докажат с ензимни тестове.
В друго приложение на изобретението като изходен материал за ваксината може да се използва смес от автоложни и алогенни туморни клетки. Към използване на това приложение на изобретението се прибягва особено тогава, когато туморните антигени, експресирани от пациента, са неизвестни или само частично охарактеризирани и/или когато алогенните туморни клетки експресират само една част от туморните антигени на пациента. Чрез прибавянето на автоложни, третирани с чуждия пептид туморни клетки, се постига това, че поне една част от туморните клетки на ваксината съдържа по възможност повече туморни антигени, присъщи на пациента. При алогенните туморни клетки става въпрос за такива, които се съгласуват с пациента по един или повече от MHC-I хаплотиповете.
Съгласно изискването да се свързват с MHC-I молекула пептидите от типове а) и Ь) според тяхната последователност се дефинират чрез HLA-субтипа на пациента, на който трябва да се приложи ваксината. По този начин определянето на HLA-субтипа на пациента е важна предпоставка за избора, респ. конструкцията на подходящ пептид.
При прилагането на туморната ваксина на изобретението под формата на автоложни туморни клетки HLA-субтипът се проявява автоматично чрез специфичността на HLA-молекулата, която при пациента е генетично детерминирана. HLA-субтипът на пациента може да се определи чрез стандартни методи, като микротеста за лимфотоксичност (MLC-тест, смесени лимфоцитни култури) (Practical Immunol., 1989). MLC-тестът почива на следния принцип: лимфоцити, изолирани от пациента, найнапред се смесват с антисерум или с моноклонално антитяло срещу определена HLA молекула в присъствието на заешки комплемент (С). Положителните клетки се лизират и поемат индикаторно багрило, докато неувредените клетки остават неоцветени.
За определянето на HLA-субтипа на даден пациент може да се използва и RT-PCR (Curr. Prot. Mol. Biol. Kapitel 2 & 15). За тази цел от пациента се взема кръв и се изолира РНК. Тази РНК най-напред се подлага на обратна транскрипция, при което се образува кДНК на пациента, която служи като матрица за полимеразната верижна реакция с двойка праймери, които осъществяват специфична амплификация на фрагмент ДНК, който отговаря за един определен HLA-хаплотип. Ако след електрофореза в агарозен гел се появи ивица ДНК, това означава, че пациентът експресира съответната HLA-молекула. Ако ивицата не се появи, пациентът е отрицателен за нея. За всеки пациент се очакват най-малко две ивици.
При прилагането на изобретението под формата на алогенна ваксина се използват клетки, поне част от които съответства най-малко на един HLA-субтип на пациента. С оглед на една възможно най-широка приложимост на ваксината на изобретението умишлено се изхожда от смес на различни клетъчни линии, които експресират два или три различни, найчесто срещащи се HLA-субтипове, при което се съблюдават особено хаплотиповете HLAА1 и HLA-A2. С една ваксина на основата на смес от алогенни клетки, които експресират тези хаплотипове, може да се обхване широка популация от пациенти; така могат да се покрият около 70% от европейското население (Mackiewicz et al., 1995).
Дефиницията на използваните съгласно изобретението пептиди чрез HLA-субтипа ги определя в зависимост от техните “котвени” аминокиселини и тяхната дължина; определена “котвена” позиция и дължина осигуряват напасването на пептидите в пептидсвързващата бразда на дадена HLA молекула, с което се представят върху клетъчната повърхност на туморните клетки, образуващи ваксината, по такъв начин, че клетките се разпознават като чужди. Това води до стимулиране на имунната система и до получаването на клетъчна имунна реакция и срещу туморните клетки на пациента.
Като чужди пептиди съгласно категория а) в рамките на настоящото изобретение са подходящи пептиди, които са широко разпространени. Тяхната последователност може да бъде изведена от срещащите се в природата имуногенни белтъци, респ., техните разградни продукти в клетката, например от вирусни или бактериални пептиди или от чужди за пациента туморни антигени.
Подходящи чужди пептиди могат да се изберат например, на основата на известните в литературата пептидни последователности; например на базата на описаните от Rammensee et al., 1993, Falu et al., 1991, за различни HLA мотиви; от пептидни производни на имуногенни белтъци с различен произход, които пасват на свързващата бразда в молекулата на даден HLA-субтип. За пептиди, които са част от белтъци с имуногенно действие, може да се установи, кои от тях представляват подходящи кандидати чрез сравняване на последователностите им с вече известни или в някои случаи чакащи определяне полипептидни последователности, като се имат предвид специфичните за HLA изисквания. Примери за подходящи пептиди се намират напр., у Rammensee et al., 1993, Falau et al., 1991, и Rammensee, 1995; както и във WO 91/09869 /HIV-пептиди); пептиди, производни на туморни антигени, са описани в публикуваните международни патентни заявки WO 95/00159, WO 94/05304. Публикуваните литературни източници и цитираните в тях статии във връзка с пептидите са използвани за справка.
Подходящи ксенопептиди са пептиди, чиято имуногенност е вече показана, следователно това са пептиди, които произлизат от известните имуногени, например вирусни или бактериални белтъци. На основата на своята имуногенност такива пептиди показват силна реакция в MLC-тест.
Вместо да се използват оригинални пептиди, т.е. пептиди, които се получават от природните белтъци в непроменен вид, в тях могат да се извършат известни изменения като се имат предвид минималните изисквания по отношение позицията на “котвата” и дължината в оригиналната пептидна последователност; в този случай следователно се използват изкуствени пептиди, които съгласно изобретението са проектирани в съответствие с изискванията към даден MHC-I-лиганд. Например е възможно, като се изхожда от лиганда на Н2-К*1 Leu Phe Glu Ala He Glu Gly Phe He (LFEAIEGFI), да се променят аминокиселините, които не са “котвени” аминокиселини, за да придобие пептидът последователността Phe Phe He Gly Ala Leu Glu Glu He (FFIGALEEI), освен това “котвената” аминокиселина в позиция 9 може да се замени с Leu.
В рамките на настоящото изобретение като пептиди от тип а) и/или от тип Ь) могат да се използват пептиди, които са получени от туморни антигени, т.т. от белтъци, които се експресират в туморна клетка и които не се появяват в съответната нетрансформирана клетка или се синтезират в значително ниска концентрация.
Дължината на пептида съответства предимно на минималната последователност от 8 до 10 аминокиселини със задължителните “котвени” аминокиселини, които се изискват за свързване с молекулата от MHC-I. В някои случаи пептидът мое да се удължи откъм Си/или N-края дотолкова, доколкото това удължаване не засяга способността за свързване, респ. удължението на минималния пептид може да се процесира в клетката.
За да се постигне електростатично свързване на пептида с поликатион, като полилизин, в едно приложение на изобретението пептидът може да се удължи с отрицателно заредени аминокиселини; или възможно е отрицателно заредени аминокиселини да се включат в пептида и това да стане дори в позиции, различни от тези на “котвените” аминокиселини.
В рамките на настоящото изобретение в понятието “пептиди” съгласно определението се включват също и по-големи белтъчни фрагменти, респективно цели белтъци, за които има гаранция, че след представянето им от APCs ще се процесират до пептиди, които съответстват на МНС молекулата.
В това приложение антигенът не се използва под формата на пептид, а като белтък или белтъчен фрагмент, респективно като смес от белтъци или белтъчни фрагменти. Белтъкът е антиген, респ. туморен антиген, от който произлизат получените след процесирането фрагменти. Поетите от клетките белтъци, респективно белтъчни фрагменти, се процесират и могат след това в контекста на МНС да се представят на имуноефекторните клетки и с това да предизвикат имунен отговор, респективно да го подсилят (Braciale & Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowsui & Rock, 1995; York & Rock, 1996).
В случай на използване на белтъци или белтъчни фрагменти идентичността на процесираните крайни продукти може да се докаже чрез химичен анализ (Edman-Abbau или масспектрометрия на процесираните фрагменти; виж обзорната статия на Rammensee et al., 1995, както и цитираната в нея оригинална литература) или чрез биологични тестове (способност на APCs да стимулират Т-клетки, които са специфични за процесираните фрагменти).
Изборът на пептиди с оглед на тяхната пригодност като чужди пептиди се извършва по принцип в повече стъпки. Най-общо те се изпитват в серийни опити на тест по пептидно свързване за тяхната способност да се свързват с молекула на MHC-I.
Подходящ метод за изследване представлява например основаващият се на проточната цитометрия FACS-анализ (Flow Cytometry, 1989, FACS Vantage TM User’s Guide, 1994; CELL Quest TM User’s Guide, 1994). В този случай пептидът се бележи с флуоресцентно багрило, например FITC (флуоресцинизотиоцианат) и се нанася върху туморни клетки, които експресират дадена МНС-I молекула. В потока отделни клетки се възбуждат с лазер с определена дължина на вълната; излъчената флуоресценция се измерва и тя зависи от количеството пептидни фрагменти, свързани с клетката.
Друг метод за определяне на свързаните пептидни фрагменти е описан от Scatchard-Biot. Работи се с пептид, който е белязан с J125 или с йони на редки алкалоземни метали (напр. европий). При 4°С клетките се натоварват с различни, дефинирани концентрации пептид за 30 до 240 min. За определяне на неспецифичното взаимодействие на пептида с клетките към някои проби се прибавя излишък от набелязан пептид, който потиска специфичното взаимодействие на белязания пептид. Накрая клетките се измиват, за да се отстранят неспецифично свързаните с клетките вещества. Количеството на клетъчно свързания пептид след това се измерва или със сцинтилационен брояч въз основа на излъчваната радиоактивност или чрез фотометър, приспособен за измерване на дълготрайна флуоресцензия. Оценката на така получените данни се извършва чрез стандартни методи.
Във втора стъпка за имуногенност се изпитват пептиди, показали добри качества на свързване.
Имуногенността на ксенопептиди, които са получени от белтъци, чието имуногенно дйствие е неизвестно, може да се тестува например в MLC тест. Подходящи пептиди за настоящото изобретение са пептидите, които пре дизвикват особено силна реакция в този тест, който също умишлено се провежда в серия с различни пептиди, при което преднамерено се използва пептид с известно имуногенно действие като стандарт.
Друга възможност за тестуването на пептидни, свързващи MHC-I, за тяхната имуногенност се състои в изследване свързването на пептидите с Т2-клетки. Такъв тест се основава на особеното свойство на Т2-клетките (Alexander et al., 1989) или на RMA-S-клетките (Karre et al., 1986) да имат дефект в транспортния механизъм за антигенните пептиди (TAP-механизъм) и да представят стабилни MHC-I молекули едва тогава, когато върху тях се нанесат пептиди, които се представят в контекста на MHC-I. За теста се използват, например Т2-клетки или RMA-S-клетки, които са стабилно трансфектирани с ген за HLA, например с ген за HLA-A1 и/или за HLA-A2. Ако клетките се натоварят с пептиди, които са добри лиганди за MHC-I, при което в контекста на MHC-I те се представят по такъв начин, че да могат да се разпознаят от имунната система като чужди, то такива пептиди предизвикват появата на HLA молекули върху клетъчната повърхност в значително количество. Доказването на HLAs върху клетъчна повърхност, например чрез моноклонални антитела, позволява идентифицирането на подходящи пептиди (Malnati et al., 1995; Sykulev et al., 1994). Тук също е целесъобразно да се използва стандартен пептид с известна добра способност за свързване с HLA, респективно с МНС.
В едно приложение на изобретението една автоложна или алогенна туморна клетка на ваксината може да има повече ксенопептиди с различна последователност. Използваните в този случай пептиди могат от своя страна да се различават до такава степен, че да се свързват с различни HLA-субтипове. С това се постига обхващането на повече, респективно на входни HLA-субтипове на един пациент или на една по-голяма група от пациенти. Ваксината се прилага след облъчване.
Друга, в някои случаи допълнителна вариабилност по отношение на представяните върху туморната клетка ксенопептиди, може да се състои в различие между пептидите, които се свързват с един определен HLA субтип, но не по техните последователности, компетентни за свързването на HLA, а дължащо се на полу чаването им от белтъци с различен произход, например от вирусни и/или бактериални белтъци. От една такава вариабилност, която предлага на ваксинирания организъм по-широка възможност за ксеногенизиране, може да се очаква засилване на стимулирането на имунния отговор.
В приложението на изобретението, при което туморната ваксина се състои от смес на алогенни туморни клетки от различни клетъчни линии, а в някои случаи и от допълнителни автоложни туморни клетки, сходните туморни клетки могат да бъдат третирани със същия/ същите пептид (и), респективно туморните клетки от различен произход могат да имат в даден момент и различни ксенопептиди.
В опитите, произвеждани в рамките на настоящото изобретение, като чужд белтък от тип а) е използван вирусен пептид с последователността Leu Phe Glu Ala lie Glu Gly Phe lie, която се извежда от хемаглутинина на грипен вирус и представлява Н2-К“-лиганд; “котвените” аминокиселини са подчертани.
С този природно срещан вирусен пептид като чужд пептид беше произведена туморна ваксина и тестирана в животински модел (модел на меланома и модел на рак на дебелото черво).
Един друг вирусен пептид с последователността Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met, която се извежда от нуклеопротеина на грипен вирус и представлява лиганд на HLA1-хаплотипа Н2-Кь (Rammenensee etal., 1993; “котвените аминокиселини са подчертани) беше използвана за производството на туморна ваксина; предпазното действие на ваксината беше потвърдено в друг модел на меланома.
Беше получена друга ваксина, в която туморните клетки бяха ксеногенизирани с чужд пептид с последователността Phe He Gly Ala Leu Glu Glu He (FFIGALEEI). Това е синтетичен, неизвестен досега в природата пептид. При избора на последователността е следено за това, да са изпълнени изискванията за нейната пригодност като лиганд за МНС-молекула от типа H2-Kd. Способността на пептида да произвежда противотуморен имунитет съгласно концентрацията за активна имунотерапия е потвърдена на миши карцином на дебелото черво СТ-26 (сингенен за мишена линия Balb/c).
В друго приложение на изобретението антитуморната ваксина освен това може да съ държа автоложни и/или алогенни туморни клетки и/или фибробласти, които са трансфектирани с гени за цитокини. във WO 94/21808 както и от Schmodt et al., 1995 (публикацията е използвана за справка) са описани ефикасни туморни ваксини, които са получени с вектор за експресия на 11-2 чрез метода за транспорт на ДНК, означаван като “трансферинфекция” (този метод се основава на опосредствена от рецептор ендоцитоза и използва клетъчен лиганд, конюгиран с поликатион като полилизин, най-вече трансферни, за комплексирането на ДНК, както и агент с ендозомолитично действие като аденовирус).
Предпочита се третираните с пептид туморни клетки и клетките, експресиращи цитокина, да се смесят в отношение 1:1. Ако например една IL-2 ваксина, която произвежда 4000 единици IL-2 на 1 х 10‘ клетки, се смеси с 1 х 106 туморни клетки, третирани с пептид, получената ваксина може да се използва за двукратно приложение, при което за оптимална доза се приемат от 1000 до 2000 единици IL-2 (Schmidt et al., 1995).
Чрез комбиниране на цитокиновата ваксина с туморните клетки, обработени с пептид, могат да се обединят предимствата от действието на тези два типа ваксини.
Приготвянето на клетките, както и съставянето на ваксината от изобретението, се извършват по традиционен начин, както например е описано в Biologic Therapy of Cancer, 1991, или във WO 94/21808.
В друг аспект изобретението се отнася до метод за производство на антитуморна ваксина, състояща се от туморни клетки и предназначена за приложение в пациент.
Методът съгласно изобретението се характеризира с това, че туморните клетки (които представят пептидни деривати на туморните антигени в контекста на HLA и от които поне една част експресира най-малко един МНС-хаплотип на пациента, се обработват с един или повече пептиди, които функционират по следния начин:
a) като лиганди за МНС- хаплотип, който е общ за пациента и за туморните клетки на ваксината, и са различни от пептидите, произлезли от белтъци, които се експресират от клетки на пациента, или
b) като лиганди за МНС-I хаплотип, който е общ за пациента и за туморните клетки на ваксината, и са производни на туморни антигени, които се експресират от клетки на пациента, при което туморните клетки се инкубират с един или повече от пептидите а) и/или Ь) толкова дълго и в такова количество в присъствието на поликатиони, докато пептидите се свържат с туморните клетки по такъв начин, че в контекста на туморните клетки да се разпознаят като чужди от имунната система на пациента и да предизвикват клетъчен имунен отговор.
Количеството на пептида възлиза предимно на около 50 pg от около 160 pg на 1 х 10s до 2 х 10’ клетки. Когато се използва пептид а), концентрацията може да бъде и по-висока. За тези пептиди е съществено концентрацията им върху туморните клетки на ваксината по отношение концентрацията на даден пептид върху туморните клетки на пациента, който е получен от същите туморни антигени, да е повисока, така че туморните клетки на ваксината да се разпознават като чужди и да предизвикват клетъчен имунен отговор.
Към подходящите поликатиони се отнасят хомоложни органични поликатиони като полилизин, полиаргинин, полиорнитин или хетероложни поликатиони с две или повече различни положително заредени аминокиселини, при което тези поликатиони могат да имат различна дължина на веригата, освен това и непептидни синтетични поликатиони като полиетиленимин, природни ДНК-свързващи белтъци с поликатионна природа като хистони или протамини, респективно техни аналози или фрагменти, както и спермин или спермидин. Към поликатионите, приложими в рамките на настоящото изобретение, се причисляват също и поликатионни липиди (Feigner et al., 1994; Loeffier et al., 1993; Remy et al., 1994; Behr, 1994), които са достъпни като търговски препарати трансфектам, липофектамин или липофектин.
Като поликатион се предпочита използването на полилизин (pL) с дължина на веригата от около 30 до около 300 лизинови остатъци.
Необходимото количество поликатион по отношение на пептида може да се определи емпирично. В случай на използване на полилизин и на ксенопептиди от категория а) отношението на масата pL: пептид се предпочита да бъде около 1:4 до около 1:12.
Продължителността на инкубация възлиза най-общо на 30 min до 4 h. Тя се определя от това в кой момент от време се постига максимално свързване с пептида; степента на свързване може да се проследи чрез FACSанализ и по този начин да се определи необходимата продължителност на инкубация.
В друго приложение на изобретението полилизинът се използва в поне частично конюгирана форма. За предпочитане е част от полилизина да бъде в конюгирана форма с трансферни (Tf) (конюгат трансферин-полилизин TfpL, справка за това може да се намери също в публикацията на WO 94/21808), при което отношението на масите pL:TfpL възлиза предимно на около 1:1.
Вместо с трансферни, полилизинът може да бъде конюгиран с други белтъци, например с описаните във WO 94/21808 като интернализиращи фактори клетъчни лиганди.
Освен това в някои случаи обработката на туморните клетки се извършва в присъствието на ДНК. ДНК обикновено е плазмид, за предпочитане плазмид, който не съдържа последователности, които кодират функционални еукариотни белтъци, следователно свободен вектор. Като ДНК по принцип може да се използва всеки използван в практиката, функционално съхранен плазмид.
Количеството ДНК по отношение на поликатиона, в някои случаи конюгиран с пептид, напр., отнесено към pL, TfpL или към смес от pL с TfpL, се предпочита да възлиза приблизително на 1:2 до 1:5.
Продължителността на инкубацията, количеството и видът на поликатиона по отношение броя на туморните клетки и/или количеството пептид, могат да се определят емпирично в зависимост от това дали поликатионът е конюгиран и, ако да - в коя част и с кой белтък се предпочита това да стане, предимството на присъствието на ДНК, респ., нейното количество. За тази цел отделните параметри на метода се променят, като пептидите се инкубират при иначе идентични условия с туморните клетки и се изследва ефективността на свързване на пептидите с туморните клетки. Подходящ метод за тази цел представлява FACS-анализът.
Методът от изобретението е подходящ освен за обработка на туморни клетки, също и за обработка на други клетки.
Съгласно метода от изобретението с един или повече пептиди, получени от туморни антигени, които се експресират от туморните клетки на пациента, могат да се обработват, вместо туморни клетки, автоложни, т.е. присъщи на пациента фибропласти, или клетки от фибробластни клетъчни линии, които или съответстват на KLA-субтипа на пациента или са трансфектирани със съответния MHC-I-ген. Така обработените и облъчени фибробласти могат като такива или в смес с туморни клетки, обработени с пептид, да се използват като туморна ваксина.
В друго приложение на изобретението съгласно неговия метод могат да се обработват, вместо фибропласти, дендритни клетки. Дендритните клетки са APCs на кожата; те могат по избор да се обработват in vitro, т.е. изолирани от пациента клетки се смесват in vitro с един или повече пептиди, при което пептидите са производни на туморни антигени на пациента и свързват молекула от MHC-I или МНС-П на пациента. В друго приложение тези клетки могат да се натоварят с пептид също in vivo. За тази цел се инжектират, за предпочитане интрадермално, комплексите от пептид, поликатион и в някои случаи ДНК, тъй като в кожата дендритните клетки се срещат особено често.
Съгласно изобретението пептидът е комплексиран с TfpL или pL за въвеждане в клетки СТ-26 или с TfpL и нефункционален плазмид (освободен вектор) за въвеждане в клетки М-З. В системата СТ-26 е установено, че туморната ваксина, ксеногенизирана с пептида и облъчена, генерира ефективен противотуморен имунитет: 75% от инжектираните мишки успяват да елиминират туморната “зараза, която във всички контролни животни, неваксинирани или ваксинирани с ваксина без ксенопептида, води до образуването на тумори. В системата М-З същият ксенопептид е установен при условия на още по-голяма строгост относно образуването на тумори в организма и чрез експериментален подход, наподобяващ ситуацията при хората. Мишки с метастази се инжектират с кнесогенизирани, облъчени клетки М-З. 87,5% от така облъчените мишки успяват да елиминират туморите, докато всички нетретирани мишки и 7 от 8-те мишки, инжектирани с ваксина без ксенопептид, развиват ту62999 мори.
Освен това е установено, че степента на системния имунен отговор срещу туморната ваксина зависи от метода, чрез който пептидът се свързва с туморните клетки. Когато пептидът се подава на клетките чрез полилизин/трансферин, ефектът е значително по-изразен, отколкото когато клетките се инкубират с пептида 24 h. Също и адювантното смесване на пептида с облъчените ваксини е слабо ефективно. Чрез трансферинфекцията би трябвало или да се осигури едно по-ефективно приемане на пептида от клетките или пък натоварването с полилизин/трансферин има това действие, че пептидът остава закачен за клетъчната мембрана и с това се довежда във физическа близост с молекулите на MHC-I, след което може да се свърже с тях, при което на основата на своя силен афинитет той (пептидът) може да измести клетъчните пептиди, които са по-слабо свързани.
Описание на приложените фигури
Фигура la-с представлява FACS анализ на клетки М-З, обработени с чужд пептид;
фигура Id- микроснимки на клетки М-З, обработени с FITC-пептид;
фигура 2а,b - лекуване на мишки DBA/ 2 с меланомни метастасзи чрез ваксина от клетки М-З, обработени с чужд пептид;
фигура За- титруване на чужд пептид за производството на ту морна ваксина;
фигура ЗЬ - сравняване на туморна ваксина от туморни клетки, обработени с чужд пептид, с туморна ваксина, секретираща IL-2;
фигура 4а - профилактика на мишки Balb/с чрез предварителна имунизация с ваксина с клетки на рак на дебелото черво, обработени с чужд пептид;
фигура 4Ь- изследване на участието на Т-клетки в системния имунитет;
фигура 5 - профилактика на мишки C57BL/6J чрез предварителна имунизация с ваксина от меланомни клетки, обработени с чужд пептид.
В следващите примери се използват следните материали и методи, освен ако не е отбелязано друго.
Примери за изпълнение на изобретението
Мишата меланомна клетъчна линия Cloudman S91 клон М-З; ATCC No. CCL.53.1) е АТСС.
Меланомната клетъчна линия B16-F-10 (Fidler et al., 1975) е получена от туморната сбирка DCT на NIH.
Получаването на конюгати трансферинполилизин от комплекси за трансфекция, съдържащи ДНК, се извършва, както е описано във WO 94/21808.
Пептидите LFEAIEGFI, FFLGALEEI, LPEAIEGFG и ASNENMETM са синтезирани с пептиден синтезатор (модел 433 А с монитор за обратна връзка, Applied Biosystems, Foster City, Canada) при използването на TentaGel S PHB (Rapp, Tubingen) като твърда фаза по Fmoc-метода (активиране с HBTU, FastmocTM, скала 0:25 mmol). Пептидите се разтварят в 1 М TFAA, pH 7,3 и се пречистват чрез обратнофазова хроматография на колона Vydac С 18. Последователностите се потвърждават чрез масспектрометрия на MAT Lasermat (Finnigan, San Jose, Canada).
Тестуването на ефективността на раковата ваксина за нейното предпазно действие срещу образуването на метастази (“терапевтични миши модел”), както и тестуването в профилактичен миши модел се извършват съгласно протокола, описан във WO 94/21808, при което като миши модел се използват моделът BDA/2 и моделът Balb/c.
Пример 1. Сравнителен FACS-анализ на клетки М-З, обработени чрез различни методи с чужд пептид.
За това изследване, което е представено на фиг.1, се използва ксенопептидьт LFEAIEGFI, който се нанася върху клетки М-З веднъж с комплекси TfpL/ДНК (“Transloading”; фиг.1а), веднъж клетките се инкубират с пептида (“Pulsen”; фиг.1Ь) и веднъж пептидът се смесва адювантно с клетките.
За транснатоварването (“Transloading”) в 500 μΐ Н BS-буфер се смесват 10 pg ксенопептид LFEAIEGFI, белязан с FITC, респ., небелязан контролен пептид, с 3 pg трансферинполилизин (TfpL), 10 pg pL и 6 pg psp65 (Boehringer Mannheim, свободен от липополи12 захариди (LPS). След 30 min на стайна температура разтворът се прехвърля в матрак за клетъчни култури Т 75 с 1,5 х 10‘ клетки М-З в 20 ml среда DMEM (100 FCS, 20 тМ гликоза) и се инкубира на 37°С. След 3 h клетките се промиват двукратно с PBS, отделят се с РВС/2 mM EDTA и се ресуспендират в 1 ml РВС 5% FCS за FACS анализа.
Пулсирането (“Pulsen”) на клетките с пептида се провежда с 1-2 х 106 клетки в 20 в DMEM и 450 g пептид (белязан с FITC, респ., небелязан) в продължение на 3 h на 37°С.
За адювантното смесване преди FACS анализа от културалните матрици се отделят 106 клетки и се инкубират в 30 min на стайна температура със 100 pg пептид, белязана с FITC, в 1 ml PBS/5% FCS. След отстраняването на PBS/5% FCS клетките се промиват и се анализират още веднъж. FACS анализът се провежда чрез употребата на апарати FACS Vantage (Becton Dickinson), окомплектовани c аргонов лазер 5W, настроени на 100 mV при 488 nm съгласно предписанията на производителя. Резултатът от FACS анализа е представен на фиг. 1а до 1с. фиг. Id показва микроснимки на цитоцентрофугирани клетки М-З; като горната картина показва клетки, които са получили пептида чрез комплекса (“Transloading”), а долната картина показва клетки, които са били инкубирани (“Pulsen”) с пептида. За контрастно оцветяване на ядрата се използва DAPI.
Клетките М-З, които са били натоварени с комплекса, съдържащ пептида, показват изместване на флуоресценцията с около 20% в сравнение н нетретираните клетки или с третираните само с полилизин, което е указание за ефективен пренос на пептида върху клетките чрез комплекса TfpL/ДНК (фиг. 1а). Инкубирането с пептид (“Pulsen”) е по-малко ефективно, което се отразява в изместването на флуоресцензията само с 10%, а това във флуоросцентната микроскопия е практически недостоверно (фиг.Id). В случая на адювантното смесване пептидът изчезва след стъпката на промиване (фиг.1с), което означава, че свързването на пептида е твърде незначително.
Пример 2. Лечение на мишки DBA/2 с меланомни метастази чрез ваксина от меланомни клетки, натоварени с чужд пептид (“терапевтичен миши модел”).
а) Получаване на туморна ваксина от клетки М-З
160 gg ксенопептид LFEAIEGFI се смесва с 3 gg трансферинполилизин (TfpL), 10 gl р4 и 6 gg psp65 (свободен от PLS) в матрак за клетъчни култури Т 75 с 1,5 х 106 клетки М-З в 20 ml среда DMEM (10% FCS, 20 mM гликоза) и се инкубира на 37°С. След 3 h клетките се смесват с 15 ml прясна среда и се инкубират през нощта на 37°С и при 5% СО2 4 h преди прилагането клетките се облъчват с 20 Gy. Приготвянето на ваксината се извършва, както е описано в патент WO 94/21808.
Ь) Ефективност на туморната ваксина
Мишки Balb/c на възраст 6-12 седмици с петдневни метастази (получени чрез подкожна инжекция на 104 живи клетки М-З) в разстояние на една седмица се инжектират подкожно два пъти с туморната ваксина (доза: 105 клетки/животно). В експеримента са включени 8 животни. Резултатът от опитите е представен на фиг.2а; оказва се, че 7 от 8-те животни оздравяват след прилагане на ваксината, получена чрез натоварване на туморните клетки с пептида чрез комплексите TfpL/ДНК. В сравнителни опити се използва ваксина, в която пептидът LFEAIEGFI ( 400 gg 4 mg) е бил натоварен върху клетките чрез инкубиране (3 h на 37°С; “Pulsen”). Туморите изчезват в 3 от 8-те животни, ваксинирани с 400 mg пептид, докато от ваксината, състояща се от клетки, обработени с 400 mg пептид, оздравява само 1 от 8-те животни. Контролите представляват само облъчени клетки М-З, както и клетки, които са били натоварени с комплексите без пептид (и в двата случая 1 /8 от животните се освобождават от туморите). В групата контролни животни, които не са подложени на никакво третиране, всички животни развиват тумори.
За да се изследват, от една страна адекватността на метода за получаването на ваксината, а от друга- тази на пептидната последователност, се провежда друга серия опити. В тези експерименти се използва високотуморогенен вариант на клетките М-З. В опитите, в които се тестува значението на метода на обработка, се получава ваксина, в която пептидът се натоварва върху клетките не чрез полилизин-трансферин, а само адювантно се смесва с клетките. За контрола на пептидната последователност “котвените” аминокиселини на пептида в позиции 2 и 9, а именно фенилаланин и изолевцин, се заместват с пролин, респ., глицин, което има за резултат пептида Leu Pro Glu Ala He Glu Gly Phe Gly (LPEAIEGFG); на този пептид му липсва способността за свързване с H2-Kd. Образуването на метастази се контролира поне един път на седмица. Резултатът от тези опити може да се види във фиг.2Ь. Ваксината, получена чрез натоварване на клетките с LFEAIEGFI посредством комплексите TfpL/ДНК, лекува 6 от 8 животни. Съответно тумори развиват 7 от 8-те животни, ваксинирани с ваксина, в която пептидът LFEAIEGFI само се смесва с клетките, респ., която се състои от клетки, натоварени чрез комплексите TfpL/ДНК с променения, несвързващ се с HLAмотива пептид LPEAIEGFG. В контролната група, която е била третирана само с облъчени клетки М-З, респ., която изобщо не е третирана, всички животни развиват тумори.
с) Изследване влиянието на количеството пептид във ваксината
Комплекси, съдържащи пептид, се получават, както е описано в подточка а), и съдържат 50,5 или 0,5 gg от активния пептид LFEAIEGFI, и с тях се натоварват клетки М-
3. За контрола служи ваксина с IL-2, която секретира оптималната доза IL-2 (виж пример 3). С тази ваксина се инжектират мишки DBA/ 2 с петдневни метастази. Ваксината с 50 pg пептид лекува 6 от 8 мишки, тази с 5 pg 4 от 8, както и ваксината с IL-2, докато съдържащата 0,5 pg ваксина лекува само 2 от 8 животни. Този опит е представен във фиг.За.
Пример 3. Сравняване на ваксина, съдържаща чужд пептид, с туморна ваксина от туморни клетки, секретиращи IL-2, в профилактичен миши модел
В сравнителните опити две групи опитни животни (във всяка от 8) се имунизарат предварително в разстояние на една седмица два пъти, от една страна с ваксината, описана в пример 2а), а от друга - с ваксина от клетки М-З, секретиращи IL-2 (получена съгласно протокола, описан във WO 94/ 21808, доза IL-2 2000 единици на животно). Една седмица след последното ваксиниране се предизвиква образуването на контролни тумори с нарастващ брой туморни клетки (“заразяване”; доза е дадена във фиг. ЗЬ). Оказва се, че предварителната имунизация с туморната ваксина на изобретението превъзхожда третирането с ваксината, съдържаща IL-2 мишки, инжектирани с ваксината от IL-2, се предпазват само от доза 10s живи високотуморогенни клетки (M-3-W). Капацитетът на тази ваксина обаче се изчерпва при заразяване с 3 х 105 клетки, в същото време успешно се преодолява туморно обременяване от този мащаб в животни, които са били предварително имунизирани с ваксина от томурни клетки, натоварени с чужд пептид.
Пример 4. Профилактика на мишки Balb/ с чрез предварителна имунизация с ваксина от клетки на рак на дебелото черво, натоварени с чужд пептид (“профилактичен миши модел”)
a) Получаване на ваксина СТ-26
160 pg ксенопептид LFEAIEGFI, респ., FFIGA4EEI, се смесва с 12 pg pL, респ., с 3 pg трансферин-полилизин плюс 10 pg полилизин и се комплексират 30 min на стайна температура в 500 pl HBS-буфер, след това се прехвърлят в матрак за клетъчни култури Т 75 с
1,5 х 106 клетки СТ-26 в 4ml среда DMEM (10% FCS, 20 mM гликоза), накрая се инкубира на 37°С и 5% СО2. 4 h преди прилагането клетките се облъчват със 100 (Gy). Изработването на ваксината се извършва, както е описано във WO 94/21808.
b) Тестуване ефективността на раковата ваксина за нейното предпазно действие срещу “заразяване” с СТ-26.
Balb/c мишки на възраст 6-12 седмици се ваксинират два пъти в разстояние на една седмица чрез подкожна инжекция (клетъчна доза: 105/мишка). В експеримента всяка група се състои от 8 мишки (респ.,7 мишки в опита, при който за натоварването на клетките се използва pL). Една седмица след последната имунизация се предизвиква образуването на контралатерални тумори с 5 х 104 парентални клетки СТ-26. Сравнителните опити, в които ваксината се получава по друг начин, а не чрез комплексите от TfpL/ДНК, както и контролите, се залагат както е описано в пример 2. Нарастването на туморите се контролира най-малко един път седмично. Резултатът за пептида LFEAIEGFI може да се види във фиг.4а; предпазват се 6 от 8 животни. В случая на пептида FFIGALEEI (не е показан във фиг.4а, се предпазват 4 от 8 животни).
c) Участие на Т-клетки в действието на туморната ваксина
За да се докаже участието на Т-клетки в системния имунитет, предизвикан от ваксината с СТ-26, в следващ опит 24 h преди ваксинирането СО4+-клетките се отстраняват чрез ί
интравенозна инжекция на 500 pg моноклонално антитяло GK1.5 (АТСС TIB 207), CD8+клетките чрез интравенозна инжекция на 500 pg моноклонално антитяло 2.43 (АТСС TIB 210). Положителна контролна група се ваксинира 5 без СО4+-клетките и CD8+ клетките да са били отстранени. Резултатът от опитите е представен във фиг.4Ь: Участието на Т-клетките си проличава от това, че животните с отстранени Т-клетки развиват тумори. 10
Пример 5. Профилактика на миши C57BL/ 6J чрез предварителна имунизация с ваксина от меланомни клетки, натоварени с чужд пептид (“профилактичен миши модел”)
В този пример като опитни животни се 15 използват мишки от линията C57BL/6J (във всяка група по 8 животни). Като меланомни клетки се използват клетките B160F10F (NIH DCT Tumor Depository; Filder et al., 1975), които са сингенни с използваната миша линия. 20 Животните от всички опитни групи се ваксинират два пъти в разстояние на една седмица чрез подкожна инжекция на 105 клетки B16-F10 на мишка:
В една опитна серия се получава ваксината, в която облъчени клетки B16-F10 се натоварват с пептида с последователност ASNENMETM, както е описано в пример 2 за ваксината от клетки М-З.
В паралелни опити като ваксина за предварителна имунизация се използват B16-F10 клетки, секретиращи IL-2, респ., GM-CSF (получени съгласно описания във WO 94/21808 протокол); ваксината произвежда 1000 единици IL-2, респ., 200 ng GM-CSF на животно.
Контролна група животни се имунизира предварително с облъчени, но нетретирани по друг начин клетки B16-F10.
Една седмица след последната имунизация в опитните животни се предизвиква образуването на тумори чрез 1x10* живи облъчени клетки B16-F10 и след това се проследява туморният растеж.
Резултатът от опитите е представен във фиг.5; туморните клетки, натоварени с чуждия пептид, показват най-добро профилактично действие по отношение на образуването на тумори.
ТАБЛИЦА
| Пептидна | МНО-хаплотид | антиген | литература |
| последовател ност | |||
| SPSYVYHQF | Ld | др70. ендогенен MuLV | Huang & Pardoll, 1996 |
| FEQNTAQA | Кь | конексин37 | Mandelboim etal., 1994 |
| FEQNTAQA | Кь | конексин37 | Mandelboim etal., 1994 |
| SYFPEITHI | Kd | JAK1 | Rammensee etal., 1995 |
| EADPTGHSY | HLA-A1 | MAGE-1 | Rammensee etal.,, 1995 |
| EVDPIGHLY | HLA-A1 | MAGE-3 | Rammensee etal., 1995 |
| YMNGTMSQV | HLA-A2+ HLA-AO201 | тирозиназа | Rammensee etal., 1995 |
| MLLALLYCL | HLA-AO201 | тирозиназа | Rammensee etal., 1995 |
| AAGIGILTV | HLA-A0201 | Melan A/Mart1 | Rammensee etal., 1995 |
| YLEPGPVTA | HLA-AO201 | pmell7/gp100 | Rammensee etal., 1995 |
| ILDGTATLRL | HLA-AO201 | pmei!7/gp100 | Rammensee etal., 1995 |
| SYLDSGIHF | HLA-A24 | 0-катенин | Robbins etal., 1996 |
ТАБЛИЦА (продължение)
| AINNYAQKL CKGVNKEYL QGINNLDNL NLDNLRDYL | Db | голям антиген на SV-40 | Lili etal., 1992 |
| EEKLIVVLF | HLA-B44 | MUM-1 | Coulie eta!., 1995 |
| ACDPHSGHFV | HLA-A2 | мутирал CDK4 | Wolfel etal., 1995 |
| AYGLDFYIL | HLA-A24 | р15,неизвестна функция | Robbins et al., 1995 |
| KTWGQYWQW YLEPGPVTA | HLA-A2 | дрЮО | Kawakami & Rosenberg, 1995 |
| HMTEVVRHC | HLA-A2 | мутирал р53 | Houbiers etal., 1993 |
| KYICNSSCM | Kd | мутирал р53 | Noguchi etal., 1994 |
| GLAPPQHEI LLGRNSEEM | HLA-A2 | мутирал р53 | Stuber etal., 1994 |
| LLPENNVLSPL RMPEAAPPV LLGRNSFEV | HLA-A2 | див тип р53 | Theoblad etal., 1995 |
| LLGRDSFEV | HLA-A2 | мутирал р53 | Theoblad etal., 1995 |
Патентни претенции
Claims (31)
1. Антитуморна ваксина за приложение при пациенти, характеризираща се с това, че съдържа туморни клетки, които представят пептиди, производни на туморни антигени, в контекста на HLA, от които клетки поне една част имат върху клетъчната си повърхност най-малкото един MHC-I-хаплотип на пациента и които са натоварени с един или повече пептиди а) и/или Ь) по такъв начин, че в контекста с пептидите туморните клетки се разпознават като чужди от имунната система на пациента и предизвикват клетъчен имунен отговор, при което пептидите:
a) функционират като лиганди за МНСI-халпотип, който е общ за пациента и за туморните клетки на ваксината, и са различни от пептиди, производни на белтъци, които се експресират от клетки на пациента, или
b) функционират като лиганди за MHCI-хаплотип, който е общ за пациента и за туморните клетки на ваксината, и са производни на туморни антигени, които се експресират от клетки на пациента, и се явяват в концентрация върху туморните клетки на ваксината, която е по-висока от концентрацията на пептид, производен на същите туморни антигени, експресиращи се върху туморните клетки на пациента.
2. Антитуморна ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа автоложни туморни клетки.
3. Антитуморна ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа алогенни туморни клетки.
4. Антитуморна ваксина съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че алогенните туморни клетки са клетки на една или повече клетъчни линии, от които поне една клетъчна линия експресира поне един, за предпочитане повече туморни антигени, които са идентични с туморните антигени на пациента, който ще се лекува.
5. Антитуморна ваксина съгласно една от претенциите от 1 до 4, характеризираща се с това, че се състои от смес на автоложни и алогенни клетки.
6. Антитуморна ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че пептидът а) е производен на природно срещащ се имуногенен белтък, респ., на негов клетъчен разграден продукт.
7. Антитуморна ваксина съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че пептидът а) е производен на вирусен белтък.
8. Антитуморна ваксина съгласно претенция 7, характеризираща се с това, че пептидът е производен на белтък от грипен вирус.
9. Антитуморна ваксина съгласно претенция 6, характеризираща се с това, че пептидът а) е производен на бактериален белтък.
10. Антитуморна ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че пептидът а) е производен на туморен антиген, чужд за пациента.
11. Антитуморна ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че пептидът а) представлява синтетичен пептид.
12. Антитуморна ваксина съгласно претенциите от 1 до 11, характеризираща се с това, че туморните клетки са обработени с пептиди с различна последователност.
13. Антитуморна ваксина съгласно претенция 12, характеризираща се с това, че пептидите се различават по това, че се свързват с различни HLA-субтипове.
14. Антитуморна ваксина съгласно претенция 13, характеризираща се с това, че пептидите се различават по последователност, която не е отговорна за свързването им с HLA.
15. Антитуморна ваксина съгласно една от претенциите от 1 до 14, характеризираща се с това, че съдържа и туморни клетки и/или фибробласти, които са трансфектирани с цитокинов ген.
16. Антитуморна ваксина съгласно претенция 15, характеризираща се с това, че цитокинът е IL-2 и/или IFN-γ.
17. Антитуморна ваксина съгласно една от претенциите от 1 до 16, характеризираща се с това, че съдържа фибробласти, които са обработени с един или повече пептиди, производни на туморни антигени, които се експресират от пациента.
18. Антитуморна ваксина съгласно една от претенциите от 1 до 17, характеризираща се с това, съдържа и дендритни клетки, които са обработени с един или повече пептиди, производни на туморни антигени, които се експресират от пациента и които се свързват с молекула от MHC-I или МНС-П.
19. Метод за получаване на антитуморна ваксина, съдържаща туморни клетки, за приложение при пациент, характеризиращ се с това, че туморни клетки, които представят в контекста на HLA производни на туморни антигени пептиди и от които поне една част експресира поне един MHC-I-хаплотип, се обработват с един или повече пептиди, които
a) функционират като лиганди за MHCI-хаплотип, който е общ за пациента и за туморните клетки на ваксината, и са различни от пептиди, производни на белтъци, които се експресират от клетки на пациента, или
b) функционират като лиганди за MHCI-хаплотип, който е общ за пациента и за туморните клетки на ваксината, и са производни на туморни антигени, които се експресират от клетки на пациента, при което туморните клетки се инкубират с един или повече от пептидите а) и/или Ь) толкова дълго и в такова количество в присъствието на поликатиони, докато пептидите се свържат с туморните клетки по такъв начин, че в контекста на туморните клетки да се разпознаят като чужди от имунната система на пациента и да предизвикат клетъчен имунен отговор.
20. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че дендритни клетки се обработват и в присъствието на органичен поликатион с един или повече пептиди, производни на туморни антигени, които се експресират от пациента и които се свързват с молекула от MHC-I или МНС-П, след което дентритните клетки се смесват с туморните клетки.
21. Метод съгласно претенция 19 или 20, характеризиращ се с това, че като поликатион се използва полилизин.
22. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че се използва полилизин с дължина на веригата от около 30 до около 300 лизинови остатъка.
23. Метод съгласно една от претенциите от 19 до 22, характеризиращ се с това, че поликатионът се използва в поне частично конюгирана форма.
24. Метод съгласно една от претенциите 23, характеризиращ се с това, че поликатио нът е конюгиран с трансферни.
25. Метод съгласно една от претенциите от 19 до 23, характеризиращ се с това, че клетките се обработват и в присъствието на ДНК.
26. Метод съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че ДНК е плазмид.
27. Метод съгласно претенция 25 или 26, характеризиращ се с това, че отношението на ДНК към поликатиона, понякога частично конюгиран с белтък, е приблизително от 1:2 до 1:5.
28. Метод съгласно една от претенциите от 25 до 27, характеризиращ се с това, че туморните клетки са меланомни клетки.
29. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че пептидът а) и/или Ь) се използва в количество приблизително от 50 до 160 pg на 1 х 103 до 2 х 10’ клетки.
5
30. Приложение на методите съгласно една от претенциите 19, 21 до 27 и 29 към фибробласти, при което се използват един или повече пептиди, които са производни на туморни антигени и се експресират от пациента.
31. Приложение на методите съгласно претенциите 19, 21 до 27 и 29 към дендритни клетки, при което се използват един или повече пептиди, които са производни на туморни антигени и се свързват с молекула от MHC-I или МНС-П на пациента.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19543649A DE19543649C2 (de) | 1995-11-23 | 1995-11-23 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE19607044A DE19607044A1 (de) | 1996-02-24 | 1996-02-24 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| PCT/EP1996/005126 WO1997019169A1 (de) | 1995-11-23 | 1996-11-21 | Tumorvakzine und verfahren zu ihrer herstellung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG102439A BG102439A (bg) | 1999-01-29 |
| BG62999B1 true BG62999B1 (bg) | 2001-01-31 |
Family
ID=26020603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG102439A BG62999B1 (bg) | 1995-11-23 | 1998-05-08 | Анти туморна ваксина и метод за нейното получаване |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020085997A1 (bg) |
| EP (1) | EP0866851A1 (bg) |
| JP (1) | JP2000502052A (bg) |
| KR (1) | KR19990067653A (bg) |
| CN (1) | CN1202931A (bg) |
| AR (1) | AR004341A1 (bg) |
| AU (1) | AU720131B2 (bg) |
| BG (1) | BG62999B1 (bg) |
| BR (1) | BR9611466A (bg) |
| CA (1) | CA2238176A1 (bg) |
| CO (1) | CO4520254A1 (bg) |
| CZ (1) | CZ158998A3 (bg) |
| EE (1) | EE03778B1 (bg) |
| HU (1) | HUP0000318A3 (bg) |
| NO (1) | NO982329D0 (bg) |
| NZ (1) | NZ322910A (bg) |
| PL (1) | PL188537B1 (bg) |
| RO (1) | RO115275B1 (bg) |
| RU (1) | RU2206329C2 (bg) |
| SK (1) | SK66998A3 (bg) |
| TR (1) | TR199800912T2 (bg) |
| TW (1) | TW514530B (bg) |
| UY (2) | UY24367A1 (bg) |
| WO (1) | WO1997019169A1 (bg) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CO4600681A1 (es) † | 1996-02-24 | 1998-05-08 | Boehringer Ingelheim Pharma | Composicion farmaceutica para la modulacion inmunitaria |
| DE69839273T2 (de) * | 1997-01-31 | 2009-03-05 | Edward P. Chicago Cohen | Krebsimmuntherapie mit semi-allogenen zellen |
| ES2232845T3 (es) * | 1997-08-22 | 2005-06-01 | Science Park Raf S.P.A. | Vacunacion tumoral mediante la utilizacion de celulas autologas o celulas presentadoras de antigeno (apc) relacionadas con hla transducidas con un antigeno tumoral y un antigeno ajeno capaz de producir una reaccion inmune. |
| EP1064390A4 (en) * | 1998-03-20 | 2002-06-12 | Genzyme Corp | IMPROVED ANTI-TUMOR IMMUNITY |
| US7014848B1 (en) | 1998-03-20 | 2006-03-21 | Genzyme Corporation | Enhanced anti-tumor immunity |
| FR2807661A1 (fr) * | 2000-04-14 | 2001-10-19 | Univ Nantes | Agent et procede pour la simulation de lymphocytes t specifiques et lymphocytes t obtenus |
| US20060035291A1 (en) * | 2001-09-18 | 2006-02-16 | Kyogo Itoh | Method of detecting cellular immunity and application thereof to drugs |
| GB0209896D0 (en) | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
| CN1315536C (zh) * | 2002-09-13 | 2007-05-16 | 李进 | 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物 |
| GB0224442D0 (en) | 2002-10-21 | 2002-11-27 | Molmed Spa | A delivery system |
| RU2556128C2 (ru) * | 2003-08-25 | 2015-07-10 | ЮниВэкс, ЭлЭлСи | Профилактическая противораковая вакцина |
| US7674456B2 (en) * | 2004-06-14 | 2010-03-09 | Charles Wiseman | Breast cancer cell lines and uses thereof |
| CA2603191A1 (en) | 2005-03-29 | 2006-10-05 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Cancer vaccines and therapeutic methods |
| DK1806359T3 (da) * | 2005-09-05 | 2010-06-14 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Tumorassocierede peptider, der bindes promiskuøst til Humant Leukocyt-Antigen (HLA) klasse II molekyler |
| US20090004213A1 (en) | 2007-03-26 | 2009-01-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Combination therapy using active immunotherapy |
| US8765148B2 (en) | 2010-02-19 | 2014-07-01 | Valneva Austria Gmbh | 1C31 nanoparticles |
| EP2872653B1 (en) * | 2012-07-12 | 2019-03-13 | Persimmune, Inc. | Personalized cancer vaccines and adoptive immune cell therapies |
| JP6710004B2 (ja) | 2016-03-15 | 2020-06-17 | Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社 | 免疫療法のためのモニタリングまたは診断ならびに治療剤の設計 |
| PE20191842A1 (es) | 2017-05-08 | 2019-12-31 | Gritstone Oncology Inc | Vectores de neoantigeno de alfavirus |
| CA3140019A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | Gritstone Bio, Inc. | Modified adenoviruses |
| AU2021320896A1 (en) | 2020-08-06 | 2023-03-23 | Gritstone Bio, Inc. | Multiepitope vaccine cassettes |
| US20240156869A1 (en) * | 2021-03-12 | 2024-05-16 | T-Cure Bioscience, Inc. | Methods of enhancing diversity of hla haplotype expression in tumors to broaden tumor cell susceptibility to tcr-t therapy |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
| EP0569678A3 (en) * | 1992-03-13 | 1994-10-26 | Yeda Res & Dev | Double transfectants of MHC genes as cellular vaccines for immunoprevention of tumor metastasis. |
-
1996
- 1996-11-19 UY UY24367A patent/UY24367A1/es not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 WO PCT/EP1996/005126 patent/WO1997019169A1/de not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 NZ NZ322910A patent/NZ322910A/xx unknown
- 1996-11-21 CZ CZ981589A patent/CZ158998A3/cs unknown
- 1996-11-21 JP JP9519395A patent/JP2000502052A/ja not_active Abandoned
- 1996-11-21 EP EP96939870A patent/EP0866851A1/de not_active Withdrawn
- 1996-11-21 RU RU98111622/14A patent/RU2206329C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 HU HU0000318A patent/HUP0000318A3/hu unknown
- 1996-11-21 US US09/077,214 patent/US20020085997A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-21 CA CA002238176A patent/CA2238176A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-21 SK SK669-98A patent/SK66998A3/sk unknown
- 1996-11-21 RO RO98-00985A patent/RO115275B1/ro unknown
- 1996-11-21 TR TR1998/00912T patent/TR199800912T2/xx unknown
- 1996-11-21 AU AU76947/96A patent/AU720131B2/en not_active Ceased
- 1996-11-21 CN CN96198493A patent/CN1202931A/zh active Pending
- 1996-11-21 BR BR9611466A patent/BR9611466A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 KR KR1019980703681A patent/KR19990067653A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 EE EE9800161A patent/EE03778B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 PL PL96326756A patent/PL188537B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-11-22 CO CO96061701A patent/CO4520254A1/es unknown
- 1996-11-22 AR ARP960105291A patent/AR004341A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-11-23 TW TW085114455A patent/TW514530B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-01-03 UY UY24430A patent/UY24430A1/es not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-05-08 BG BG102439A patent/BG62999B1/bg unknown
- 1998-05-22 NO NO982329A patent/NO982329D0/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997019169A1 (de) | 1997-05-29 |
| NO982329D0 (no) | 1998-05-22 |
| KR19990067653A (ko) | 1999-08-25 |
| HUP0000318A3 (en) | 2002-02-28 |
| PL326756A1 (en) | 1998-10-26 |
| RO115275B1 (ro) | 1999-12-30 |
| TW514530B (en) | 2002-12-21 |
| US20020085997A1 (en) | 2002-07-04 |
| AU7694796A (en) | 1997-06-11 |
| AR004341A1 (es) | 1998-11-04 |
| HUP0000318A2 (hu) | 2000-06-28 |
| RU2206329C2 (ru) | 2003-06-20 |
| BR9611466A (pt) | 1999-05-18 |
| CA2238176A1 (en) | 1997-05-29 |
| TR199800912T2 (xx) | 1998-08-21 |
| UY24430A1 (es) | 1997-07-01 |
| CN1202931A (zh) | 1998-12-23 |
| JP2000502052A (ja) | 2000-02-22 |
| EE03778B1 (et) | 2002-06-17 |
| BG102439A (bg) | 1999-01-29 |
| NZ322910A (en) | 2000-05-26 |
| EE9800161A (et) | 1998-12-15 |
| CZ158998A3 (cs) | 1999-06-16 |
| PL188537B1 (pl) | 2005-02-28 |
| CO4520254A1 (es) | 1997-10-15 |
| UY24367A1 (es) | 2000-10-31 |
| AU720131B2 (en) | 2000-05-25 |
| SK66998A3 (en) | 1998-12-02 |
| EP0866851A1 (de) | 1998-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG62999B1 (bg) | Анти туморна ваксина и метод за нейното получаване | |
| Bocchia et al. | Antitumor vaccination: where we stand | |
| Gu et al. | A novel hydrophobized polysaccharide/oncoprotein complex vaccine induces in vitro and in vivo cellular and humoral immune responses against HER2-expressing murine sarcomas | |
| AU2005321904B2 (en) | Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes | |
| HRP970100A2 (en) | Pharmaceutical composition for immunomodulation | |
| US8895017B2 (en) | HER-2 peptides and vaccines | |
| AU2004253479A1 (en) | Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes | |
| KR100850473B1 (ko) | 면역원성이 불량한 항원의 면역원성을 향상시키는 약제조성물 | |
| AU2015233542B2 (en) | A medicament for use in a method of inducing or extending a cellular cytotoxic immune response | |
| Minev et al. | Cancer vaccines: novel approaches and new promise | |
| CA2331378A1 (en) | Vaccination strategy to prevent and treat cancers | |
| Pietersz* et al. | Generation of cellular immune responses to antigenic tumor peptides | |
| Minev | Melanoma vaccines | |
| JP2022516639A (ja) | ネオエピトープを標的とするワクチン | |
| van Elsas et al. | Transfection of IL-2 augments CTL response to human melanoma cells in vitro: immunological characterization of a melanoma vaccine | |
| Butterfield et al. | DNA and dendritic cell-based genetic immunization against cancer | |
| MXPA98003930A (en) | Vaccines against tumors and procedure for your producc | |
| Yang et al. | Peptide Vaccines | |
| Tirosh | Identification of tumor associated antigens and development of new methods for cancer immunotherapy | |
| Bonnefoy et al. | Cancer Vaccine Design: A Novel Bacterial |